KR20080056554A - 미백활성이 우수한 백삼 에틸아세테이트 분획물을 함유하는피부 미백용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미백활성이 우수한 피부백삼 에틸아세테이트 분획물을 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 신남산을 유효성분으로 하는 피부백삼 에틸아세테이트 분획물을 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 피부백삼 에틸아세테이트 분획물을 함유하여 미백활성이 높으면서도 세포독성이 적은 미백용 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 피부백삼 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 하는 피부 미백용 화장료는 인체 피부에 대한 안전성을 갖는 동시에 우수한 미백효과를 제공할 수 있으므로 피부 미백을 위한 기능성 화장료로서 사용될 수 있는 효과가 있다.

미백, 인삼, 신남산, 백삼, 에틸아세테이트, 분획물

Description

미백활성이 우수한 백삼 에틸아세테이트 분획물을 함유하는 피부 미백용 조성물{Skin Whitening Composition Containing Ethyl Acetate Fraction of White Ginseng with High Whitening Activity}

도 1은 인삼시료의 에틸 아세테이트 분획물 추출과정을 도시한 것이다.

도 2는 인삼시료들 및 인삼에 함유되어 있다고 알려져 있는 미백활성성분으로서, 퀘르세틴, 말톨, p-쿠마르산, 에스큘레틴 및 신남산의 TLC 크로마토 그램이다.

도 3 a~ f는 인삼시료들의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.

도 4는 미백활성성분 및 인삼시료별로 티로시나아제 활성을 저해하는 효과를 확인한 결과 그래프이다.

도 5a 내지 5g는 시료가 포함되지 않은 용매만을 처리한 군의 세포생존율과 멜라닌의 함량을 100%로 세팅한 후, Melanoma B16 세포주에서 세포 생장율 및 멜라닌 생성량에 대한, 코지산, PTU, 신남산, p-쿠마르산, 에스큘레틴, 말톤 및 퀘르세틴 각 화합물의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 6a~e은 시료가 포함되지 않은 용매만을 처리한 군의 세포생존율과 멜라닌의 함량을 100%로 세팅한 후, Melanoma B16 세포에서 세포 생장율 및 멜라닌 생성 량에 대한 각 인삼 EA 분획물의 영향을 나타낸 그래프이다. 도 6a는 건조인삼 동체의 영향, 도 6b는 건조미삼의 영향, 도 6c는 건조 잎의 영향, 도 6d는 백삼의 영향, 도 6e는 홍삼의 영향을 나타낸 것이다.

도 7은 코지산, 신남산 및 피부백삼 시료 농도 각각 1ppm, 10 ppm, 100ppm에서 3일간 처리해주었을 때의 Melanoma B16 세포주 사진을 도시한 것이다.

도 8a에는 신남산, 퀘르세틴, p-쿠마르산, 코지산 각 화합물 10ppm에서의 UV흡수를, 도 8b에서는 인삼시료들의 UV 흡수를 나타내었다.

도 9a 및 도 9b는 UV-B로 색소침착된 갈색 기니아피그 피부의 완전 농축된 피부백삼 에틸아세테이트 분획물 도포 후 색소침착변화를 나타낸 것으로 도 9a는 70% 에탄올 6주 도포후를, 도 9b는 피부백삼 시료가 함유된 70% 에탄올 6주 도포후 사진을 나타낸다.

본 발명은 미백활성이 우수한 피부백삼 에틸아세테이트 분획물을 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 신남산을 유효성분으로 하는 피부백삼 에틸아세테이트 분획물을 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

멜라닌은 자외선 등으로 인한 피부의 손상에 대항하여 생성되며 피부를 보호 하는 작용을 한다. 멜라닌의 생합성 과정은 티로시나아제(Tyrosinase)에 의한 티로신(Tyrosine)의 산화로 시작되어 DOPA와 DOPAchrome 등이 생성된 후 DHICA와 DHI를 거쳐 이루어지며 현재까지 DHI-유멜라닌(DHI-eumelanin), DHICA-유멜라닌(DHICA-eumelanin), 페오멜라닌(Pheomelanin) 등의 3종이 생성되는 것으로 알려져 있다. 피부의 흑화는 피부세포내에 존재하는 멜라닌 생성세포(멜라노사이트: melanocyte)에서 생성된 멜라닌이 각질형성세포(케라티노사이트: keratinocyte)로 전달되어 피부 표피층에 축적되어 일어나게 된다.

피부의 멜라닌 색소 과침착은 기미, 주근깨, 검은반점 등을 일으키는 요인이 되며 이러한 피부의 흑화를 예방 및 개선하기 위하여 코지산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin), 비타민 C(Vitamin C) 유도체 등이 미백제로 개발되었으나 코지산의 경우는 In Vitro상의 티로시나아제 억제효과에 비해 세포상이나 In Vivo상의 멜라 닌 생성억제효과가 미비한 실정이며 또한 장기 사용시 간암을 유발할 수 있다는 보고가 최근에 되어졌다. 또한 알부틴은 하이드로퀴논(hydroquinone)계열이 갖는 세포독성의 문제점이 있으며 비타민 C 역시 화학적 안정성에 대한 문제가 있어 장기 보관이 어려운 문제점이 있다. 따라서 이에 대한 우수한 대체 미백제의 개발이 시급한 실정이다.

미백활성물질의 부작용 등이 발표됨에 따라 그 대체 원료로 여러 천연물 추출물을 이용한 기능성 미백소재에 대한 연구 또한 활발히 진행되어 상백피나 천화분 추출물, 율피, 녹두 등이 미백원료로써 사용되고 있으나 그 효능이나 독성에 대한 확실한 검증이 충분치 못한 현실이다.

인삼 (人蔘, Panax ginseng C.A. Meyer)은 항암효과, 면역기능 강화효과, 노화방지효과, 항스트레스 효과, 항피로 효과 등이 보고되고 있으며 피부와 관련해서는 각질형성세포(케라티노사이트: keratinocyte)의 증식 등의 항노화 관련 연구가 되어 있으나 멜라닌생성세포(멜라노사이트: melanocyte)와 관련된 멜라닌 생성억제효과는 아직까지 보고되고 있지 않다. 그러나 문헌조사에 의하면 인삼에는 티로시아나제 활성 억제물질이 함유되어 있으며 그 예로는 주근에 함유되어 있는 에스큘레틴 (esculetin), 말톨(maltol), p-쿠마르산(p-coumaric acid) 등을, 지상부에는 캠프페롤(kaempferol), 리놀레산(linoleic acid) 등을 들 수 있다.

에스큘레틴 (esculetin) p-쿠마르산 (p-coumaric acid)

퀘르세틴(quercetin) 말톨 (Maltol)

신남산(cinnamic acid)

현재, 인삼 및 산삼배양근의 추출물을 함유한 몇몇 기능성 미용제품이 시판되어 있으나 실질적 효과 보다는 고려인삼의 상징적 이미지를 이용한 경향이 크며 그 임상적 미용 효과는 아직까지 확실히 검증되어 있지 않다.

또한 인삼자체 추출물의 미백활성에 대한 보고는 특별히 없는데, 이는 인삼 총추출 물 상태로는 그 활성이 강하지 못한 이유 때문으로 보인다. 따라서 인삼의 적절한 가공을 통한 멜라닌 생성 억제활성이 높은 성분 및 분획물의 도출과 이의 개량을 통한 미백원료의 확보에 대한 필요성이 제기되었다.

이에 본 발명자들은 인삼으로부터 미백활성이 높은 성분을 함유하는 분획물을 수득하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

결국 본 발명의 목적은 인삼으로부터 미백활성이 높은 성분을 함유하는 분획물을 수득하는 방법 및 그 분획물을 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은

피부 백삼의 탄소수 1 내지 4의 저급 알킬 아세테이트 분획물, 에테르 분획물, 또는 탄소수 1 내지 4의 저급 에테르 분획물로 이루어진 군에서부터 선택된 적어도 하나 이상의 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공한다. 바람직하게는 에틸아세테이트 분획물, 에틸에테르 분획물 또는 에테르 분획물이 가능하며, 에텔아세테이트 분획물이 가장 바람직하다.

백삼은 보통 수삼의 겉껍질을 제거하고 건조하여 제조하나 피부백삼은 수삼의 겉껍질을 제거하지 않고 건조한 것을 말한다.

본 발명에서 상기 피부 백삼의 유기용매 분획물은 피부 백삼의 추출물을 유기용매와 물 용매를 혼합한 후, 얻어진 유기 용매 가용성 분획물을 의미한다.

여기서 상기 추출물은 50~90 % 알콜/증류수 혼합용매로 추출한 추출물이 바람직하다. 상기 알콜은 탄소수 1~4의 저급 알콜이 바람직하다.

상기 추출물은 18~28℃의 온도에서 1~2 시간씩 2~5 반복하여 초음파 추출된 것이 바람직하다

상기 피부 백삼의 유기용매 분획물은 감압 농축후 동결 건조된 상태로 사용되는 것이 바람직하다. 감압농축 조건은 일반적으로 당해 기술분야에서 사용되는 조건이면 가능하며, 예를 들어 감압농축은 50℃이하에서 회전감압농축기를 이용하여 용매를 완전히 증발되도록 1시간 정도 농축시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은

a) 피부 백삼 시료를 마쇄한 후 50~90% 알콜/증류수 혼합용매를 이용하여 추출하는 단계; b) 상기 추출물을 여과하고, 감압농축하는 단계; c) 상기 농축된 추출물을 에틸아세테이트 가용성 분획과 물 가용성 분획으로 나누는 단계; 및 d) 상기 에틸 아세테이트 가용성 분획을 분리하고 감압농축하여 피부 백삼의 에틸 아세테이트 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 따른 피부 백삼의 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 방법에 도 1에 개략적으로 도시되어 있다.

상기 인삼시료 에틸아세테이트 분획물 분리 방법에서, a) 단계의 50~90% 알콜/증류수 혼합용매는 80% 메탄올/증류수 혼합용매를 사용하는 것이 바람직하고, 추출은 초음파 추출법을 이용하며 2~5회 반복 추출하는 것이 바람직하다.

a) 단계에서 얻어진 인삼 추출시료는 와트만 (whatman) 거름종이를 이용하여 감압여과한 후 40oC에서 감압농축하여 용매를 완전히 제거한다. 제조된 인삼농축시료를 3차 증류수에 녹인 후 물 부피와 같은 양의 에틸아세테이트를 가하여 1~2분간 섞은 후 분별깔대기를 사용하여 에틸아세테이트 층을 분리하였다. 에틸아세테이트 층의 분리는 2~4회 반복하여 실시하는 것이 바람직하다. 얻어진 에틸아세테이트 층은 40℃에서 감압농축하여 에틸아세테이트를 완전히 제거하고 소량의 물에 녹인 후 동결건조하여 에틸아세테이트 분획물을 제조한다.

본 발명의 상기 피부 미백용 조성물은 신남산을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 피부 미백용 조성물을 함유하는 피부 미백 화장료 조성물을 제공한다

본 발명에 따른 피부백삼의 EA(에틸 아세테이트) 분획물은 신남산을 유효성분으로서 다량 함유하므로, 뛰어난 티로시나아제 억제활성, 멜라닌 생성세포주에서의 멜라닌 억제활성, UV-방어효과, 기니아 피그 피부에서의 색소침착억제활성를 동시에 나타내어 우수한 미백원료로 사용이 가능하다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예 1:

1) 인삼시료의 준비

충남금산의 인삼농장에서 2005 년 3월 하순경 채취한 수삼 5 kg을 수집하여 표피를 부분적으로 제거하고 증류수로 세척 후 동체, 미삼, 잎 부분으로 나누고 50℃에서 36 시간 열풍건조 하여 백삼시료를 제조하였다. 상기 제조된 인삼시료와의 비교실험을 위한 백삼은 2004 년도에 제조된 피부백삼을 구입 (서울 경동시장구입, 4년근, 1등급, 15뿌리, 충남금산군 제조, 농협중앙회인삼검사소검사필) 하여 사용하였다. 또한 홍삼은 2004 년도에 제조된 것으로 정관장에서 구입하여 사용하였다. 피부백삼은 수삼의 표피를 제거하지 않고 건조한 것을 말하며 피부백삼과 백삼의 성분 및 효능 차이점에 대한 연구는 아직 없으며 다만 피부백삼 제조용 수삼은 표면이 하얀 상등품을 쓴다는 것이 알려진 차이점이다. 백삼의 주요성분으로는 진세노사이드(ginsenoside) Rg1, Rb1 등 사포닌 계열이 알려져 있으며 그밖에 폴리아세틸렌(polyacetylene), 폴리페놀(polyphenol) 계열의 물질들을 함유하고 있다. 백삼의 주요효능으로는 항암효과, 혈액순환 촉진, 기억력 증진효과 등이 보고되어져 있다.

하기 표 1은 상기 방법에 의해 수삼 5kg으로부터 얻은 건조인삼의 각 부위별 무게를 나타낸 것이다.

	동체(main roots)	미삼(root hairs)	잎(leaves)	총량(total)
무게 (g)	900.6	180.1	15.0	1090.7

2): 인삼시료의 분획물 제조

시료의 추출은 상기 실시예 1-1)에서 얻은 건조인삼(이하 '건조인삼')의 동체, 미삼, 잎과 피부백삼 및 홍삼(이하 '인삼시료')을 각각 마쇄한 후 80% 메탄올/증류수 혼합용매를 사용하여 상온에서 1 시간 씩 3 회 반복하여 초음파 추출 하였다. 얻어진 추출액은 여과지로 여과하고 회전 감압 농축기를 이용하여 완전 농축시켜 추출물을 제조하였다. 이후 얻어진 추출물을 에틸 아세테이트(ethyl acetate: 이하 "EA") 가용성 분획과 물 가용성 분획으로 나누었다. 먼저 제조된 완전농축된 80% 메탄올/증류수 혼합용매 추출물을 500ml의 3차 증류수에 녹인 후 동량의 에틸아세테이트를 가하여 1~2분간 흔들고 분별깔대기에 방치한다. 에틸아세테이트층과 물층이 나누어지면 에틸아세테이트 층을 분리하고 이를 2~4회 반복 실시하여 에틸아세테이트 층을 수집한다. 수집된 에틸아세테이트 분획물은 감압농축하고 진공건조하여 용매인 에틸아세테이트를 제거하고 얻어진 잔사를 소량의 물에 녹인 후 동결건조하여 에틸아세테이트 분획시료제조를 완결한다. (도 1 참조)

실험예 1: 인삼 시료의 수율확인 및 성분 확인

실시예 1에서 얻어진 추출물의 수율을 계산하였으며, 각각의 시료의 추출수율은 표 2와 같다.

시료	수율 (80% 메탄올 추출)	수율 (EA 분획 추출)
건조인삼의 동체 (Main roots of dried ginseng)	26.1%	1.31%
건조인삼의 미삼 (Root hair of dried ginseng)	42.7%	2.32%
건조인삼의 잎 (Leaves of dried ginseng)	39.0%	3.82%
피부백삼	26.5%	0.23%
홍삼	31.2%	2.63%

각 수치는 건조 중량으로 %를 의미함.

상기 표 2의 결과로서, 건조인삼의 잎의 분획물의 수율이 가장 높은 것으로 나타났다.

상기 EA 분획물과 물 분획물을 각각 TLC (전개용매: EA/Hexane=1/1, 3회 전개)로 확인하였다. 도 2a 및 도 2b는 각각 인삼에 함유되어 있다고 알려져 있는 미백활성성분으로서, 퀘르세틴, 말톨, p-쿠마르산, 에스큘레틴 및 신남산의 TLC 크로마토 그램과 상기 표 2의 인삼시료들의 TLC 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 2a에서 A: 퀘르세틴 B: 말톨 C: p-쿠마르산 D: 에스큘레틴 E: 신남산 F: 기준 혼합물 G: 건조 동체 (EA 분획) H: 건조 동체 (물 분획) I: 건조 미삼 (EA 분획) J: 건조 미삼 (물 분획) K: 건조 잎 (EA 분획) L: 건조 잎 (물 분획)이고, 도 2b에서 M: 건조 동체 (EA 분획) N: 건조 동체 (물 분획) O: 피부백삼 (EA 분획) P: 피부백삼 (물 분획) Q: 홍삼 (EA 분획) R: 홍삼(물 분획)이다.

도 2a를 통해 부위별로 볼 때 건조인삼 동체와 미삼은 비슷한 패턴을 보였으나 잎은 상이한 패턴을 보였고, 도 2b를 통해 인삼의 종류에 따라서는 건조인삼과 백삼이 비슷한 패턴을 보이면서 약간의 함량적 차이를 보이나, 홍삼은 건조인삼이나 백삼과 상이한 패턴을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 각 인삼시료들을 분획별로 보면, 각각 EA 가용성 분획에 미백활성성분이 전이되었고, 물 가용성 분획에는 미백활성성분이 거의 전이되지 않았다는 사실을 확인할 수 있었다.

또한, 이것으로, 건조인삼 동체와 미삼, 피부백삼의 EA 가용성 분획물이 유사한 성분, 즉 미백활성 성분을 함유하고 있는 것을 알 수 있다.

실험예 2: 인삼 시료별 유효성분 함량 분석

상기 EA 분획에서 확인된 미백활성물질인 퀘르세틴, 말톨, 신남산, p-쿠마르산 및 에스큘레틴의 건조인삼 EA 분획물 중의 함량을 HPLC를 이용하여 정량하였다.

시료액으로서 상기 인삼 EA 분획물은 완전 농축된 추출물을 10 mg/㎖로 메탄올에 녹인 후 0.45㎛ 시린지 필터(syringe filter) (Millipore)로 여과하여 제조하였고 이를 분석용 시료로 사용하였다. HPLC는 Jasco Co. (Japan)의 분석용 LC(liquid chromatography)를 사용하였다. 컬럼은 Bondpack C18 (4 um, 300 × 3.9 mm)을 사용하였고, 이동상은 2% 아세트산이 함유된 물과 0.5% 아세트산이 함유된 50% 아세토니트릴(acetonitrile) 을 구배를 주어 0.8 ㎖/min의 속도로 용출하였다. 컬럼의 온도는 40℃로 유지 하였으며 시료의 검출은 280 nm에서 측정하였다. 모든 시료는 3회 반복 실험하여 평균치를 산출하였고 표준물질과의 이중주입(co-injection)을 실시하여 피크(peak)의 일치를 확인하였다.

도 3 a~ f는 다양한 인삼시료의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 3a는 기준물질로서 말톨(Mal), 에스큘레틴(Esc), 쿠마르산(Cou), 신남산(Cin) 및 퀘르세틴(Que)의 피크를 확인한 것이고, 도 3b는 건조인삼 동체의 피크를 확인한 것이고, 도 3c는 건조 미삼의 피크를 확인한 것이고, 도 3d는 건조인삼 잎의 피크를 확인한 것이고, 도 3e는 피부백삼의 피크를 확인한 것이며, 도 3f는 홍삼의 피크를 확인한 것이다.

도 3에서 보면, 기준물질인 퀘르세틴, 말톨, 신남산, p-쿠마르산 및 에스큘레틴은 메탄올에 녹여 ODS-H80 역상 크로마토그래피를 통해, 앞서 서술한 바와 같은 방법에 기술된 조건으로 용출시켰을 때, 각각 9.2, 13.6, 19.7, 33.8, 34.9 분에서 검출되었다.

건조인삼 EA 분획물의 부위별 미백활성 물질 함량은 표 3에, 건조인삼, 피부백삼 및 홍삼의 함량을 측정한 결과는 표 4에 나타내었다.

시료	에스큘레틴	p-쿠마르산	신남산	퀘르세틴	말톨
동체	0.10%	1.52%	0.10%	0.01이하	0.01이하
미삼	0.09%	0.33%	0.05%	0.01이하	0.01이하
잎	0.64%	0.26%	0.20%	0.16%	0.01이하

시료	에스큘레틴	p-쿠마르산	신남산	퀘르세틴	말톨
건조인삼	0.10%	1.52%	0.10%	0.01이하	0.01이하
피부백삼	0.01이하	0.19%	1.51%	0.24%	0.01이하
홍삼	0.96%	0.07%	0.06%	0.01이하	3.82%

표 3과 표 4에 나타난 바와 같이, 건조 인삼의 부위별로는 동체에서 p-쿠마르산이 1.52% 함유되어 있어, 미삼의 0.33%와 큰 차이를 보였고, 잎에는 에스큘레틴이 0.64%로 가장 많이 함유되어 있었다. 피부백삼에서는 신남산이 1.51% 함유되어 있고, p-쿠마르산은 건조인삼보다 적게 함유되어 있었다. 또한 홍삼은 홍삼의 특이 성분인 말톨을 다량 함유하고 있었으나 다른 성분은 상대적으로 적게 함유하고 있었다.

실시예 3: 미백 활성성분 및 인삼 시료별 미백 활성 확인

1) 미백 활성측정 방법

가. 티로시나아제 활성억제도 측정방법

8.0 mM L-dopa (67 mM 인산염 버퍼 (PH 6.8) 에 녹임) 120 μl 와 메탄올 40 μl에 녹인 여러 농도의 검색시료를 96-웰(well) 마이크로플레이트에 넣고 티로시나아제 (125 U/ml) 40 μl를 가하였다. 37℃에서 20분간 인큐베이션한 후 생성된 도파크롬(dopachrome)의 양을 Elisa 리더를 사용하여 492 nm에서의 흡수도를 측정하였다.

나. 멜라닌 생성 세포주 시험

멜라닌 생성 세포주는 10% FBS(Fetal Bovine Serum)가 함유된 RPMI1640 배지에서 배양시켰다. 100 π 컬쳐 디쉬(culture dish)에 약 5×105 개의 세포가 포함된 세포현탁액을 접종한 후 37℃, 5% CO2 조건에서 융합성(confluent)이 되게 자라게 되면 24 웰 플레이트에 105 cells/well의 농도로 다시 접종하고 24 시간 배양하였다. 웰 당 990 μl의 배지를 매일 갈아주면서 10 μl의 시료를 3 일간 처리(용매: 50% 프로필렌 글리콜(Propylene glycol, 30% EtOH, 20% H2O)한 후 1 일간 더 배양하였다.

멜라닌 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 배지 제거 후 인산염완충식염수(saline, phosphate-buffered: PBS)로 세척하고 곧 1 N NaOH 1 ml를 가하여 멜라닌을 녹인 후 400 nm에서 UV 흡수도를 측정하였다.

세포생존율에 미치는 영향을 측정하기 위하여 배지제거 후 PBS로 세척하고 크라스탈 바이올렛 (크리스탈 바이올렛 0.1%, 10% EtOH, 나머지 PBS)를 200 μl 첨가하였다. 5 분간 상온에서 인큐베이션한 후, 물로 2번 세척하였다. 여기에 EtOH 1 ml를 첨가하여 상온에서 10분간 쉐이킹(shaking)한 후 590 nm에서 UV 흡수도를 측정하였다.

2) 시료별 미백활성 확인

가. 미백활성성분 및 인삼시료별 티로시나아제 활성억제 확인

멜라닌 생성 초기과정에 주요한 역할을 하는 효소인 티로시나아제 활성에 미치는 영향을 상기 1)에 서술한 방법을 이용하여 각 시료별로 측정한 결과는 도 4와 같다.

미백활성 물질 중에서는 에스큘레틴이 200 ppm에서 46.8%의 가장 우수한 티로시나아제 활성억제를 보였고, 퀘르세틴과 신남산 역시 같은 농도에서 각각 36.7%, 34.5%의 저해도를 나타내었다. 인삼시료 EA 분획물은 건조동체와 피부백삼에서 200 ppm 농도 일 때 각각 12.3% 와 13.7% 의 저해활성을 보였다. 이는 에스큘레틴 등 단일활성 물질에 비해 동일 농도에서 비교적 낮은 활성이나 여러 가지 성분이 섞여있는 추출물임을 감안 할 때 유의한 저해활성을 나타냈다고 볼 수 있다. 도 4에서는 건조잎이, 특히 20ppm일 때 피부백삼보다 티로시나아제 저해활성이 약간 좋게 나왔으나 이후 UV-차단효과나 멜라닌 생성세포에서의 활성은 피부백삼이 월등히 우수한 결과를 나타내어 피부백삼이 우수하다는 것을 알 수 있다.

나. 멜라닌 생성세포에서의 멜라닌 생성억제도 확인

미백활성분과 인삼시료들이 마우스 유래의 멜라닌 생성 세포인 Melanoma B16 세포주(한국세포주은행 구입)에서 세포의 생존율과 멜라닌 생성량에 미치는 영향을 측정하기 위해 10% FBS(fetal bovine serum) 과 1% 페니실린-스트렙토마이신, 200 nM의 PMA(Phorbol-12 myristate 13-acetate) 가 함유된 RPMI 1640 배지로 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하여 EtOH / H₂O = 6 / 4 용액에 녹인 대조군의 시료를 1 ug/ml, 10 ug/ml, 100 ug/ml의 농도로 3 일간 처리하였다.

도 5는 생존율과 멜라닌 운반체의 함량이 100%로 초기 세팅되었을 때의 melanoma B16 세포주의 세포 생장율 및 멜라닌 생성량에 대한 각 화합물의 영향을 나타낸 것으로, 대조물질로써 코지산, 양성 대조군으로서 PTU, 신남산, p-쿠마르산, 에스큘레틴, 말톨 및 퀘르세틴의 그래프를 각각 순서대로 도시한 것이다.

도 5에 따르면 양성 대조군인 PTU(Phenyl thiourea)는 100 ug/ml에서 약 25%의 세포독성을 보였으나 멜라닌 생성률을 농도 의존적으로 각각 11.1%, 58.6%, 74.7% 감소 시켰다. 한편 대조물질로써 사용된 코지산(Kojic acid)은 고농도에서 세포독성을 나타냈으며 인삼에 함유된 성분 중에서는 신남산이 큰 세포독성 없이 10 ug/ml 농도에서 17%, 100 ug/ml 농도에서 29%의 멜라닌 생성량을 감소시켰고, 에스큘레틴은 100 ug/ml 농도에서 세포생존률 대비 멜라닌 감소효과를 보였으나 약간의 세포사멸을 일으켰다. 그 외 말톨, p-쿠마르산 및 퀘르세틴은 유의적인 효과를 나타내지 않았다.

도 6은 생존율 및 멜라닌 운반체의 함량이 100%로 초기 세팅되었을 때의 melanoma B16 세포주의 세포 생장율 및 멜라닌 생성량에 대한 각 인삼 EA 분획별 영향을 나타낸 그래프이다. 도 6a는 건조인삼 동체의 영향, 도 6b는 건조미삼의 영향, 도 6c는 건조 잎의 영향, 도 6d는 백삼의 영향, 도 6e는 홍삼의 영향을 나타낸 것이다.

인삼시료는 피부백삼 EA 분획물이 100 ug/ml 농도에서 세포생존률 대비 약 30%의 멜라닌 감소효과를 보였고, 잎의 EA 분획물이 100 ug/ml 농도에서 27%의 감소효과를 나타내었으나, 건조인삼 동체 EA 분획물 및 미삼 EA 분획물과 홍삼 EA 분획물은 높은 세포독성을 나타냈다.

결과를 종합하여 볼 때 인삼시료 중 적은 독성과 가장 뛰어난 활성을 보인 피부백삼의 EA 분획물이 세포독성이 적으면서 멜라닌 감소효과가 우수하여 피부 미백 원료로 가장 적합하다고 할 수 있고, 상기 피부백삼의 EA 분획물은 실시예 2의 2)에서 신남산을 다량함유하고 있다고 확인하였으므로, 피부백삼의 멜라닌 억제활성에는 신남산이 주요한 역할을 한다고 판단할 수 있었다.

이를 토대로 코지산, 신남산 및 피부백삼 시료를 처리해주었을 때의 melnoma B16 세포주를 사진을 통해 확인하여 상기와 같은 판단의 근거를 찾을 수 있었다.

도 7은 코지산, 신남산 및 피부백삼 시료 농도 각각 1ppm, 10 ppm, 100ppm에서 3일간 처리해주었을 때의 melanoma B16 세포 사진을 도시한 것이다. 도 7에 대한 데이터의 해석을 기재하여 주시기 바랍니다. - 활성비교를 위한 기준 미백활성물질인 코지산은 1ppm, 10ppm, 100ppm 처리군 모두에서 큰 세포사멸은 나타나지 않았으나 검은색으로 나타나는 멜라닌 생성량을 유의적으로 줄이지 못하였다. 반면 피부백삼 EA 및 cinnamic acid는 큰 세포사멸 없이 멜라닌 생성량을 농도의존적으로 감소시킴을 확인 할 수 있다.

3) UV-A 와 UV-B 영역 자외선 차단효과 확인

자외선 영역 중 UV-A (350~370 nm) 는 파장이 길어 피부 진피층까지 침투 할 수 있으며 유리를 통과할 수 있는 자외선 영역으로 즉시형 색소침착을 일으킨다. 반면 UV-B(270-290 nm)은 UV-A에 비해 파장이 짧아 피부 깊숙이 침투하지 않지만 에너지가 높아 일광화상을 유발시키며 노출 후 72 시간 이후부터 색소침착이 나타나는 지연형 색소침착을 일으킨다.

시료의 자외선 흡수도 측정은 메탄올에 검색시료를 10 ppm로 녹여 200 nm~600 nm에서 UV 흡수도를 측정하여 실시하였다.

도 8에는 UV-A 및 UV-B 영역에서 각 시료의 UV 흡수를 나타내었다. 200-500 nm 영역의 흡수도를 측정한 결과 100 ug/ml 의 농도의 피부백삼 EA 분획물이 UV-B 영역에서 특징적인 흡수를 나타냈으며 홍삼 EA 분획물은 UV-B 영역에서 약한 흡수를 보였으나 건조잎과 동체에서는 UV-B와 UV-A 영역에서 흡수를 나타내지 않았다. 인삼에 함유된 성분 중에서는 신남산이 UV-B 영역에서 가장 특징적인 흡수를 나타냈고 퀘르세틴은 UV-A 영역과 UV-B 영역에서 약간의 흡수도를 보였다.

4) 브라운 기니아 피그를 이용한 피부색소침착 완화 효과 확인

500 g 내외의 브라운 기니아 피그(brown guinea pig) 암컷의 등 부분을 제모한 후 마취하고 500 mJ의 UV-B를 동일한 부위에 1주일에 한번씩 총 3회 조사하여 색소침착을 유도한 후, 색소침착부위에 각각의 실험시료용액을 1일 1회 6주간 도포하고 색소침착완화정도를 측정하였다.

도 9에는 UV-B로 색소침착된 갈색 기니아피그 피부의 색소침착변화를 나타내었다. 브라운 기니아 피그(Brown guinea pig)의 피부에 UV-B로 색소침착을 유발한 뒤 피부백삼 EA 분획물을 70% 에탄올에 녹여 6 주간 도포한 결과 70% 에탄올만을 도포한 부분에 비하여 색소침착을 유의적으로 완화시킴을 확인할 수 있었다.

이하에서는 본 발명에서 가장 세포독성이 적으면서도 미백활성이 좋은 피부백삼 EA 분획물을 미백 조성물로 사용하여 제조할 수 있는 다양한 제형예를 제시한다. 그러나 본 발명의 범위가 하기 제형예에 한정되지 않음은 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

제형예

[제형예 1] 영양화장수(밀크로션)

하기의 표와 같이 피부백삼 EA 분획물을 함유하는 미백 영양화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

배합성분	중량%
피부백삼 EA 분획물	2.0
스쿠알란	5.0
밀납	4.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	1.5
유동파라핀	0.5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

[제형예 2] 유연화장수(스킨로션)

하기의 표와 같이 피부백삼 EA 분획물을 함유하는 유연화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

배합성분	중량%
피부백삼 EA 분획물	2.0
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	2.0
프로필렌글리콜	2.0
카르복시비닐폴리머	0.1
PEG 12 노닐페닐에테르	0.2
폴리솔베이트 80	0.4
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

[ 제형예 3] 영양크림

하기의 표와 같이 피부백삼 EA 분획물을 함유하는 영양크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

배합성분	중량%
피부백삼 EA 분획물	2.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄세스퀴올리에이트	0.5
PEG60 경화피마자유	2.0
유동파라핀	10.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프락트리글리세라이드	5.0
글리세린	5.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제	적량
색소	적량
향료	적량
정제수	to 100

[ 제형예 4] 팩

하기의 표와 같이 피부백삼 EA 분획물을 함유하는 팩을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

배합성분	중량%
피부백삼 EA 분획물	1.0
폴리비닐알콜	13.0
소듐카르복시메틸셀룰로오스	0.2
글리세린	5.0
알란토인	0.1
에탄올	6.0
PEG 12 노닐페닐에테르	0.3
폴리솔베이트 60	0.3
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

이상 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 피부백삼 에틸아세테이트 분획물을 함유하여 미백활성이 높으면서도 세포독성이 적은 미백용 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 피부백삼 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 하는 피부 미백용 화장료는 인체 피부에 대한 안전성을 갖는 동시에 우수한 미백 효과를 제공할 수 있으므로 피부 미백을 위한 기능성 화장료로서 사용될 수 있는 효과가 있다.

Claims (10)

1. 피부 백삼의 에틸 아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 피부 백삼의 에틸 아세테이트 분획물이 피부 백삼의 추출물을 에틸 아세테이트와 물 용매를 혼합한 후, 얻어진 에틸 아세테이트 가용성 분획물인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 피부 백삼의 추출물이 50~90 % 알콜/증류수 혼합용매로 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 알콜이 메탄올인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
5. 제3항에 있어서, 상기 피부 백삼의 추출물이 18~28℃의 온도에서 1~2 시간씩 2~5 반복하여 초음파 추출된 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 피부 백삼의 에틸 아세테이트 분획물이 감압 농축후 동결 건조된 상태로 사용되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 피부 백삼의 에틸 아세테이트 분획물이

   a) 피부 백삼 시료를 마쇄한 후 메탄올/증류수 혼합용매를 이용하여 추출하는 단계;

   b) 상기 추출물을 여과하고, 감압농축하는 단계;

   c) 상기 농축된 추출물을 에틸 아세테이트 가용성 분획과 물 가용성 분획으로 나누는 단계; 및

   d) 상기 에틸 아세테이트 가용성 분획을 분리하고 감압농축하여 피부 백삼의 에틸 아세테이트 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
8. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 신남산을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 의한 피부 미백용 조성물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백 화장료 조성물.
10. a) 피부 백삼 시료를 마쇄한 후 메탄올/증류수 혼합용매를 이용하여 추출하는 단계;

    b) 상기 추출물을 여과하고, 감압농축하는 단계;

    c) 상기 농축된 추출물을 에틸 아세테이트 가용성 분획과 물 가용성 분획으로 나누는 단계; 및

    d) 상기 에틸 아세테이트 가용성 분획을 분리하고 감압농축하여 피부 백삼의 에틸 아세테이트 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 인삼 추출물의 제조방법.

Images