KR20080056167A - 씨디70에 대한 인간 모노크로날 항체 - Google Patents

씨디70에 대한 인간 모노크로날 항체 Download PDF

Info

Publication number
KR20080056167A
KR20080056167A KR1020087007221A KR20087007221A KR20080056167A KR 20080056167 A KR20080056167 A KR 20080056167A KR 1020087007221 A KR1020087007221 A KR 1020087007221A KR 20087007221 A KR20087007221 A KR 20087007221A KR 20080056167 A KR20080056167 A KR 20080056167A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
seq
variable region
chain variable
human
Prior art date
Application number
KR1020087007221A
Other languages
English (en)
Inventor
조나단 알렉산더 테레트
리-솅 루
데이비드 존 킹
조세핀 엠 카다렐리
친 판
하이춘 후앙
마르코 에이 코치아
Original Assignee
메다렉스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 메다렉스, 인코포레이티드 filed Critical 메다렉스, 인코포레이티드
Publication of KR20080056167A publication Critical patent/KR20080056167A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

본 개시사항은 CD70에 높은 친화도로 특이적으로 결합하는 분리된 모노크로날 항체, 특히 인간 모노크로날 항체를 제공한다. 본 개시사항의 항체를 코드하는 핵산, 본 개시사항의 항체를 발현하기 위한 발현벡터, 숙주세포 빛 발현방법이 또한 제공된다. 본 개시사항의 항체를 포함하는 이뮤노컨쥬게이트, 비스페시픽 분자 및 약학적 조성물 또한 제공된다. 본 개시사항은 또한 암, 자가면역 질환, 염증 및 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공한다.
Figure P1020087007221
항체, 모노크로날, 암, 염증, 치료

Description

씨디70에 대한 인간 모노크로날 항체{HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO CD70}
관련 출원에 대한 크로스 -레퍼런스( Cross - Reference to Related Applications )
본 출원은 2005년 9월 26일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/720,600호, 2005년 10월 13일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/726,695호 및 2005년 12월 8일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/748,827호의 이점, 및 35 U.S.C. § 119(e) 하에 의하여 청구되어진 조기 출원일의 이점 및 그 전체로서 참고로 여기에 편입되어진 모든 내용을 청구한다.
시토킨 수용체 CD27은 세포 성장 및 분화뿐 아니라 어팝토시스 또는 예정된 세포 죽음에서 역할을 하는 종양 괴사 인자 수용체 (TFNR) 상과(上科)의 하나이다. CD27에 대한 리간드는 CD70으로, 이는 리간드들의 종양 괴사 인자 부류에 속한다. CD70은 2개의 퍼텐셜 N-연결 글리코실화 사이트를 포함하는 C-말단 도메인과 20개의 아미노산 친수성 N-말단 도메인을 갖는 193 아미노산 폴리펩티드이다 (Goodwin, R.G. et al. (1993) Cell 73 :447-56; Bowman et al. (1994) Immunol 152:1756-61). 이들의 특성에 기초하여, CD70은 세포 밖의 C-말단 단백질을 갖는 타입 II 트랜스멤브레인 단백질인 것으로 판단되었다.
CD70은 일시적으로는 활성인 것으로 알려졌으며, 휴지하고 있는 T 및 B 림프구 및 수지상의 세포가 아니다 (Hintzen et al. (1994) J Immunol . 152:1762-1773; Oshima et al . (1998) Int . Immunol . 10:517-26; Tesselaar et al . (2003) J Immunol. 170:33-40). 정상 세포 상에 대한 발현에 부가하여, CD70 발현은 신장 세포 암종, 전이성 유방암, 뇌 종양, 백혈병, 임파종 및 비인강 암종을 포함하는 다른 타입의 암에서 보고되어 있다 (Junker et al . (2005) J Urol . 173:2150-3; Sloan et al . (2004) Am J Pathol . 164:315-23; Held-Feindt and Mentlein (2002) Int J Cancer 98:352-6; Hishima et αl.(2000) Am J Surg Pathol . 24:742-6; Lens et al . (1999) Br J Haematol . 106:491-503). 부가적으로, CD70은 DNA 메틸트랜스퍼라제 저해제 또는 ERK 경로 저해제로 처리된 T 세포 상에서 과발현되어 지는 것이 밝혀져, 가능하기로는 약물-유도 및 특발성 낭창을 유도할 수 있다 (Oelke et al. (2004) Arthritis Rheum . 50:1850-60). CD27과 CD70의 상호 작용은 또한 세포-매개 자가면역 질환 및 TNF-알파 생산의 저해에서 역할을 수행하는 것이 제안되어 졌다 (Nakajima et al . (2000) J. Neuroimmunol . 109:188-96).
따라서, CD70은 암, 자가면역 질환 및 CD70 발현으로 특징되어 지는 다양한 다른 질병을 치료하는데 아주 가치 있는 타겟을 나타낸다.
본 발명에서 개시하는 사항은 CD70에 결합하고 그리고 수많은 바람직한 특성을 나타내는 분리된 모노크로날 항체, 특히 인간 모노크로날 항체를 제공한다. 이들 특성은 인간 CD70에 결합하는 높은 친화성을 포함한다. 또한 이 명세서의 항체 및 조성물을 사용하여 다양한 CD70 매개 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
일 측면에 있어서, 본 발명의 상세한 설명은 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위에 관한 것으로, 여기서 항체는 (a) 인간 CD70에 1x10-7 M 또는 그 이하의 KD로 결합하고; 그리고 (b) 신장 세포 암종의 종양 세포 라인에 결합한다.
바람직하기로는, 항체는 786-0 (ATCC Accession No. CRL-1932), A-498 (ATCC Accession No. HTB-44), ACHN (ATCC Accession No. CRL-1611), Caki-1 (ATCC Accession No. HTB-46) 및 Caki-2 (ATCC Accession No. HTB-47)로 구성되는 군에서 선택된 신장 세포 암종의 종양 세포 라인에 결합한다.
비록 대안적인 실시형태의 항체로 뮤어라인 항체, 키메르 항체 또는 인체적응된 항체일 수도 있지만, 바람직하기로는 항체는 인간 항체이다.
보다 바람직한 실시형태에서는, 항체는 인간 CD70에 5.5 x 10-9 M 또는 그 이하의 KD로 결합하거나, 또는 인간 CD70에 3 x 10-9 M 또는 그 이하의 KD로 결합하거나, 또는 인간 CD70에 2 x 10-9 M 또는 그 이하의 KD로 결합하거나, 또는 인간 CD70에 1.5 x 10-9 M 또는 그 이하의 KD로 결합한다.
다른 실시형태에서는, 항체는 786-0 신장 세포 암종의 종양 세포 상에 발현된 CD70에 결합한 후 이들 세포에 의해 체화되어 진다.
다른 실시형태에서는, 항체는 B-세포 종양 세포 라인에 결합한다. 바람직하기로는, B-세포 종양 세포 라인은 Daudi (ATCC Accession No. CCL-213), HuT 78 (ATCC Accession No. TIB-161), Raji (ATCC Accession No. CCL-86) 및 Granta-519 (DSMZ Accession No. 342)로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서는, 본 발명의 개시 사항은 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위를 제공하는 것으로, 여기서 항체는 레퍼런스 항체와 CD70에 대한 결합에 대해 크로스 경쟁하고, 여기서 레퍼런스 항체는: (a) 인간 CD70에 1x10-7 M 또는 그 이하의 KD로 결합하고; 그리고 (b) 신장 세포 암종의 종양 세포 라인에 결합한다.
다양한 실시형태에 있어서, 레퍼런스 항체는:
(a) SEQ ID NO: 1의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 영역; 및
(b) SEQ ID NO:6의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 영역;
을 포함하거나 또는 레퍼런스 항체는:
(a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 영역; 및
(b) SEQ ID NO: 7의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 영역;
을 포함하거나 또는 레퍼런스 항체는:
(a) 중사슬 가변 영역 을 포함하는 의 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO:3; and
(b) 경사슬 가변 영역 을 포함하는 의 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 8
를 포함하거나 또는 레퍼런스 항체는:
(a) SEQ ID NO: 4의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 영역; 및
(b) SEQ ID NO: 9의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 영역;
을 포함하거나 또는 레퍼런스 항체는:
(a) SEQ ID NO: 5의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 영역; 및
(b) SEQ ID NO: 10의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 영역;
을 포함한다.
일 측면에 있어서, 본 발명의 개시 사항은 인간 VH 3-30.3 유전자의 산물이거나 또는 이로부터 유래된 중사슬 가변 영역을 포함하는, 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위에 관한 것으로, 여기서 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다. 본 개시 사항은 또한 인간 VH 3-33 유전자의 산물이거나 또는 이로부터 유래된 중사슬 가변 영역을 포함하는, 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위를 제공하는 것으로, 여기서 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다. 본 개시 사항은 또한 인간 VH 4-61 유전자의 산물이거나 또는 이로부터 유래된 중사슬 가변 영역을 포함하는, 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위를 제공하는 것으로, 여기서 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다. 본 개시 사항은 더욱이 인간 VK L6 유전자의 산물이거나 또는 이로부터 유래된 중사슬 가변 영역을 포함하는, 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위를 제공하는 것으로, 여기서 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다. 본 개시 사항은 더욱이 인간 VK Ll8 유전자의 산물이거나 또는 이로부터 유래된 경사슬 가변 영역을 포함하는, 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위를 제공하는 것으로, 여기서 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다. 본 개시 사항은 더욱이 인간 VK Ll5 유전자의 산물이거나 또는 이로부터 유래된 경사슬 가변 영역을 포함하는, 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위를 제공하는 것으로, 여기서 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다.
바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:11을 포함하는 중사슬 가변 영역 CDRl;
(b) SEQ ID NO:16을 포함하는 중사슬 가변 영역 CDR2;
(c) SEQ ID NO:21을 포함하는 중사슬 가변 영역 CDR3;
(d) SEQ ID NO:26을 포함하는 경사슬 가변 영역 CDRl;
(e) SEQ ID NO:31을 포함하는 경사슬 가변 영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:36을 포함하는 경사슬 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:12를 포함하는 중사슬 가변 영역 CDRl;
(b) SEQ ID NO:17을 포함하는 중사슬 가변 영역 CDR2;
(c) SEQ ID NO:22를 포함하는 중사슬 가변 영역 CDR3;
(d) SEQ ID NO:27을 포함하는 경사슬 가변 영역 CDRl;
(e) SEQ ID NO:32를 포함하는 경사슬 가변 영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:37을 포함하는 경사슬 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:13을 포함하는 중사슬 가변 영역 CDRl;
(b) SEQ ID NO:18을 포함하는 중사슬 가변 영역 CDR2;
(c) SEQ ID NO:23을 포함하는 중사슬 가변 영역 CDR3;
(d) SEQ ID NO:28을 포함하는 경사슬 가변 영역 CDRl;
(e) SEQ ID NO:33을 포함하는 경사슬 가변 영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:38을 포함하는 경사슬 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다;
(a) SEQ ID NO:14를 포함하는 중사슬 가변 영역 CDRl;
(b) SEQ ID NO:19를 포함하는 중사슬 가변 영역 CDR2;
(c) SEQ ID NO:24를 포함하는 중사슬 가변 영역 CDR3;
(d) SEQ ID NO:29를 포함하는 경사슬 가변 영역 CDRl;
(e) SEQ ID NO:34를 포함하는 경사슬 가변 영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:39를 포함하는 경사슬 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:15를 포함하는 중사슬 가변 영역 CDRl;
(b) SEQ ID NO:20을 포함하는 중사슬 가변 영역 CDR2;
(c) SEQ ID NO:25를 포함하는 중사슬 가변 영역 CDR3;
(d) SEQ ID NO:30을 포함하는 경사슬 가변 영역 CDRl;
(e) SEQ ID NO:35를 포함하는 경사슬 가변 영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:40을 포함하는 경사슬 가변 영역 CDR3.
본 개시의 다른 바람직한 항체 또는 이들의 항원 결합 부위는 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:1의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 영역; 및
(b) SEQ ID NO:6의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 영역.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:2의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 영역; 및
(b) SEQ ID NO:7의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 영역.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:3의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 영역; 및
(b) SEQ ID NO:8의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 영역.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:4의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 영역; 및
(b) SEQ ID NO:9의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 영역.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:5의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 영역; 및
(b) SEQ ID NO:10의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 영역.
본 개시의 항체는, 예를 들어 IgGl 또는 IgG4 아이소타이프같은 완전한 길이의 항체일 수 있다. 대안적으로, 항체는 Fab 또는 Fab'2 분획과 같은 항체 분획 또는 단일 사슬 항체일 수 있다.
본 개시 사항은 또한 세포 독소 또는 방사성 동위원소와 같은 치료적 제제와 연게된 본 개시의 항체 또는 이들의 항원-결합 부위를 포함하는 이뮤노컨쥬게이트를 포함한다. 본 개시 사항은 또한 상기 항체 또는 이들의 항원 결합 부위보다 다른 결합 특이성을 갖는 제이의 기능적 부분에 연계된 본 개시의 항체 또는 이들의 항원-결합 부위를 포함하는 비스페시픽 분자를 제공한다.
본 개시의 항체 또는 이들의 항원-결합 부위 또는 이뮤노컨쥬게이트 또는 비스페시픽 분자를 포함하는 조성물 및 약학적으로 허용가능한 담체가 또한 제공된다.
본 개시의 항체 또는 이들의 항원-결합 부위를 코드하는 핵산 분자 또한 본 발명의 개시에 의해 포함되어 질뿐 아니라 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터, 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주세포 및 이러한 숙주세포를 사용하여 항-CD70 항체를 제조하는 방법도 본 발명에 의해 포함된다. 더욱이, 본 발명의 개시사항은 인간 면역글로불린 중 및 경사슬 트랜스유전자를 포함하는 트랜스유전자의 마우스를 제공하고, 여기서 마우스는 본 발명의 항체 뿐 아니라 이러한 마우스로부터 제조된 하이브리도마를 발현하고, 이 하이브리도마는 본 발명의 항체를 생산한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명의 개시사항은 대상에 질병의 예방 또는 치료를 위해 유효량으로 본 발명의 항-CD70 인간 항체를 투여하는 것을 포함하는 CD70을 발현하는 종양 세포의 성장에 의해 특징되는 질병을 치료 또는 예방을 위한 방법을 제공한다. 이 질병은 암, 예를 들어 진장 세포 암종 암이나 림프종일 수 있다.
더 다른 측면에 있어서, 본 개시사항은 자가면역 질환을 치료하기에 유효한 량으로 본 개시사항의 항-CD70 인간 항체를 대상에 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시사항의 다른 특징 및 이점은, 한정하는 것으로 해석되지 않는 다음의 자세한 설명 및 실시예로부터 명백해질 것이다. 본 출원 전체를 통해 인용된 모든 참고문헌, 유전자은행 기재사항, 특허 및 공개된 특허출원의 내용은 레퍼런스로 여기에 명백하게 편입된다.
도 1A는 2H5 인간 모노크로날 항체의 중사슬 가변영역의 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID NO:41) 및 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:1)를 나타낸다. CDRl (SEQ ID NO:11), CDR2 (SEQ ID NO:16) 및 CDR3 (SEQ ID NO:21) 영역이 묘사되고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되었다.
도 1B는 2H5 인간 모노크로날 항체의 경사슬 가변영역의 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID NO:46) 및 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:6)를 나타낸다. CDRl (SEQ ID NO:26), CDR2 (SEQ ID NO:31) 및 CDR3 (SEQ ID NO:36) 영역이 묘사되고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되었다.
도 2A는 10B4 인간 모노크로날 항체의 중사슬 가변영역의 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID NO:42) 및 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:2)를 나타낸다. CDRl (SEQ ID NO:12), CDR2 (SEQ ID NO:17) 및 CDR3 (SEQ ID NO:22) 영역이 묘사되고, V, D 및 J 생식계열 유래가 표시되었다.
도 2B는 10B4 인간 모노크로날 항체의 경사슬 가변영역의 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID NO:47) 및 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:7)를 나타낸다. CDRl (SEQ ID NO:27), CDR2 (SEQ ID NO:32) 및 CDR3 (SEQ ID NO:37) 영역이 묘사되고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되었다.
도 3A는 8B5 인간 모노크로날 항체의 중사슬 가변영역의 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID NO:43) 및 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:3)를 나타낸다. CDRl (SEQ ID NO:13), CDR2 (SEQ ID NO:18) 및 CDR3 (SEQ ID NO:23) 영역이 묘사되고, V, D 및 J 생식계열 유래가 표시되었다.
도 3B는 8B5 인간 모노크로날 항체의 경사슬 가변영역의 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID NO:48) 및 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:8)를 나타낸다. CDRl (SEQ ID NO:28), CDR2 (SEQ ID NO:33) 및 CDR3 (SEQ ID NO:38) 영역이 묘사되고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되었다.
도 4A는 18E7 인간 모노크로날 항체의 중사슬 가변영역의 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID NO:44) 및 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:4)를 나타낸다. CDRl (SEQ ID NO:14), CDR2 (SEQ ID NO:19) 및 CDR3 (SEQ ID NO:24) 영역이 묘사되고, V, D 및 J 생식계열 유래가 표시되었다.
도 4B는 18E7 인간 모노크로날 항체의 경사슬 가변영역의 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID NO:49) 및 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:9)를 나타낸다. CDRl (SEQ ID NO:29), CDR2 (SEQ ID NO:34) 및 CDR3 (SEQ ID NO:39) 영역이 묘사되고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되었다.
도 5A는 69A7 인간 모노크로날 항체의 중사슬 가변영역의 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID NO:45) 및 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:5)를 나타낸다. CDRl (SEQ ID NO:15), CDR2 (SEQ ID NO:20) 및 CDR3 (SEQ ID NO:25) 영역이 묘사되고, V, D 및 J 생식계열 유래가 표시되었다.
도 5B는 69A7 인간 모노크로날 항체의 경사슬 가변영역의 뉴클레오티드 시퀀스 (SEQ ID NO:50) 및 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:10)를 나타낸다. CDRl (SEQ ID NO:30), CDR2 (SEQ ID NO:35) 및 CDR3 (SEQ ID NO:40) 영역이 묘사되고, V 및 J 생식계열 유래가 표시되었다.
도 6은 인간 생식계열 VH 3-30.3 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:51)를 갖는 2H5 및 10B4의 중사슬 가변 영역의 아미노산 시퀀스의 배열을 나타낸다.
도 7은 인간 생식계열 VH 3-33 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:52)를 갖는 8B5 및 18E7의 중사슬 가변 영역의 아미노산 시퀀스의 배열을 나타낸다.
도 8은 인간 생식계열 VH 4-61 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:53)를 갖는 69A7의 중사슬 가변 영역의 아미노산 시퀀스의 배열을 나타낸다.
도 9은 인간 생식계열 VK L6 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:54)를 갖는 2H5의 경사슬 가변 영역의 아미노산 시퀀스의 배열을 나타낸다.
도 10은 인간 생식계열 VK Ll8 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:55)를 갖는 10B4의 경사슬 가변 영역의 아미노산 시퀀스의 배열을 나타낸다.
도 11은 인간 생식계열 VK Ll5 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:56)를 갖는 8B5 및 18E7의 경사슬 가변 영역의 아미노산 시퀀스의 배열을 나타낸다.
도 12는 인간 생식계열 VK L6 아미노산 시퀀스 (SEQ ID NO:54)를 갖는 69A7의 경사슬 가변 영역의 아미노산 시퀀스의 배열을 나타낸다.
도 13은 인간 CD70에 대한 인간 모노크로날 항체가 CD70에 특이적으로 결합하는 것을 입증하는 ELISA 실험의 결과를 나타낸다.
도 14는 항-CD70 인간 모노크로날 항체 2H5가 신장 암종 세포 라인에 결합하는 것을 입증하는 유동세포분석법 실험의 결과를 나타낸다.
도 15A 및 B는 인간 CD70에 대한 인간 모노크로날 항체가 신장 세포 암종 (RCC) 세포 라인에 농도 의존 형식으로 결합하는 것을 입증하는 유동세포분석법 실험의 결과를 나타낸다. (A) 786-0 RCC 세포 라인 (B) A498 RCC 세포 라인.
도 15C는 인간 CD70에 대한 인간 모노크로날 항체가 신장 암종 세포 라인 786-O에 결합하는 것을 입증하는 유동세포분석법 실험의 결과를 나타낸다.
도 15D는 인간 CD70에 대한 HuMAb 69A7 항체가 신장 세포 암종 (RCC) 세포 라인에 농도 의존 형식으로 결합하는 것을 입증하는 유동세포분석법 실험의 결과를 나타낸다.
도 16은 항-CD70 인간 모노크로날 항체 2H5가 인간 림프종세포 라인에 결합하는 것을 입증하는 유동세포분석법 실험의 결과를 나타낸다.
도 17A 및 B는 항-CD70 인간 모노크로날 항체 2H5가 인간 림프종 세포 라인 에 농도 의존 형식으로 결합하는 것을 입증하는 유동세포분석법 실험의 결과를 나타낸다. (A) Raji 림프종 세포 라인 (B) Granta-519 림프종 세포 라인.
도 17C는 인간 CD70에 대한 인간 모노크로날 항체가 Raji 림프종세포 라인에 결합하는 것을 입증하는 유동세포분석법 실험의 결과를 나타낸다.
도 17D는 HuMAbs 2H5 및 69A7이 유사한 결합 에피토프를 공유하는 것을 입증하는 경쟁 유동세포분석법 어세이의 결과를 나타낸다.
도 17E는 인간 CD70에 대한 인간 모노크로날 항체가 Daudi 림프종세포 라인 및 786-0 신장 암종 세포 라인에 결합하는 것을 입증하는 유동세포분석법 실험의 결과를 나타낸다.
도 18은 인간 CD70에 대한 인간 모노크로날 항체가 CD70+ 세포 내로 체화할 수 있는 것을 입증하는 Hum-Zap 체화 실험의 결과를 나타낸다.
도 19A-C는 독소-컨쥬게이트된 인간 모노크로날 항-CD70 항체가 신장 세포 암종 세포 (RCC) 라인을 죽이는 것을 입증하는 세포 증식 어세이의 결과를 나타낸다. (A) Caki-2 RCCs (B) 786-0 RCCs (C) ACHN RCCs.
도 20A-D는 인간 모노크로날 항-CD70 항체가 인간 백혈병 및 림프종세포 라인을 ADCC 의존 형식으로 죽이는 것을 입증하는 항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC) 어세이의 결과를 나타낸다. (A) ARH-77 백혈병 세포 라인 (B) HuT 78 림프종세포 라인 (C) Raji 림프종세포 라인 그리고 (D) CD70을 발현하지 않는 L-540 세포 라인.
도 21은 독소-컨쥬게이트된 인간 모노크로날 항-CD70 항체가 인간 림프종 세 포 라인을 죽이는 것을 입증하는 세포 증식 어세이의 결과를 나타낸다.
도 22A-B는 독소-컨쥬게이트된 인간 모노크로날 항-CD70 항체가 (A) 세 시간 수세로 그리고 (B) 연속적인 수세로 Raji 세포에 세포독성을 나타내는 것을 입증하는 세포 증식 어세이의 결과를 나타낸다.
도 23A-B는 독소 컨쥬게이트된 항-CD70 항체 2H5가 생체 내에서 신장 세포 암종 (RCC) 종양에 직접적인 저해 효과를 가지는 것을 입증하는 생체 내 마우스 종양 모델 연구의 결과를 나타낸다.
도 24A-F는 탈퓨코실화된 인간 모노크로날 항-CD70 항체가 인간 백혈병 세포에 ADCC 의존 형식으로 증가된 세포 독성을 가지는 것을 입증하는 항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC) 어세이의 결과를 나타낸다. (A) ARH-77 세포; (B) MEC-I 세포; (C) 항-CD 16 항체로 처리된 MEC-I 세포; (D) SU-DHL-6 세포; (E) IM-9 세포; (F) HuT 78 세포.
도 25는 인간 모노크로날 항-CD70 항체가 인간 백혈병 세포를 ADCC 농도 의존 형식으로 죽이는 것을 입증하는 항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC) 어세이의 결과를 나타낸다.
도 26은 인간 모노크로날 항-CD70 항체가 인간 백혈병 세포를 ADCC 의존 형식으로 죽이지만 세포 독성이 CDl6에 의존하는 것을 입증하는 항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC) 어세이의 결과를 나타낸다.
도 27은 인간 모노크로날 항-CD70 항체가 인간 활성화 T 세포를 죽이고 효과가 항-CD 16 항체의 부가로 역전되는 것을 입증하는 항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC) 어세이의 결과를 나타낸다.
도 28은 몇몇 인간 모노크로날 항-CD70 항체가 CD27에 CD70의 결합을 차단하고 다른 인간 모노크로날 항-CD70 항체는 CD27에 CD70의 결합을 차단하지 않는 것을 입증하는 블럭킹 어세이의 결과를 나타낸다.
도 29A-B는 자연 항-CD70 항체 2H5로 처리가 생체 내에서 림프종 종양에 대해 직접적 저해 효과를 가지는 것을 입증하는 생체 내 마우스 종양 모델 연구의 결과를 나타낸다. (A) Raji 종양; (B) ARH-77 종양.
도 3OA-C는 독소 컨쥬게이트된 항-CD70 항체 2H5로 처리가 생체 내에서 림프종 종양에 대해 직접적 저해 효과를 가지는 것을 입증하는 생체 내 마우스 종양 모델 연구의 결과를 나타낸다. (A) ARH-77 종양; (B) Granta 519 종양; (C) Raji 종양.
도 31은 항-CD70 항체 69A7이 붉은털 원숭이 CD70+ B 림프종세포 라인 상에 발현된 CD70과 교차반응한다는 것을 나타내는 연구의 결과를 나타낸다.
도 32는 인간 항-CD70 항체가 공지된 마우스 항-인간 CD70 항체의 결합을 차단하는 것을 입증하는 차단 분석의 결과를 나타낸다.
도 33A 및 B는 항-CD70 항체 또는 항체의 비퓨코실화된 형태의 어느 하나로의 처리 결과를 나타낸다. (A) 항-CD70 항체는 복용량 의존 형식으로 CD70 공-자극된 세포 증식을 저해한다. (B) 항-CD70 항체는 복용량 의존 형식으로 CD70 공-자극된 IFN-γ 분비를 저해한다.
도 34A-C는 펩티드 자극 세포 상에 항-CD70 항체 또는 항체의 비퓨코실화된 형태의 어느 하나로의 처리 결과를 나타낸다. (A) 항-CD70 항체는 펩티드 특이적 CD8+ T 세포 팽창을 저해한다. (B) 관찰된 전체 세포 생존성의 유의성 있는 감소가 없다. (C) 관찰된 전체 CD8+ 세포 수의 유의성 있는 감소가 없다.
도 35는 펩티드 특이적 CD8+ T 세포 팽창에 대한 항-CD70 항체의 효과가 항-CD 16 항체의 부가에 의해 차단되어 진다는 것을 나타낸다.
도 36A-B는 독소 컨쥬게이트된 항-CD70 항체 2H5로의 처리가 생체 내에서 신장 암종 종양에 대해 직접 저해하는 효과를 갖는다는 것을 입증하는 생체 내 마우스 종양 모델 연구의 결과를 나타낸다. (A) 786-0 종양; (B) Caki-1 종양.
본 개시된 사항은 분리된 모노크로날 항체에 관한 것이며, 특히 CD70에 높은 친화성으로 특이적으로 결합하는 인간 모노크로날 항체에 관한 것이다. 어떤 실시형태에 있어서, 본 개시 사항의 항체는 특히 중 및 경사슬 생식계열 시퀀스로부터 유래되고 및/또는 특정 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDR 영역과 같은 특정 구조의 형상을 포함한다. 이 개시 사항은 분리된 항체, 이러한 항체를 만드는 방법, 이러한 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트 및 비스페시픽 분자, 그리고 이 개시된 항체, 면역컨쥬게이트 및 비스페시픽 분자를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 이 개시 사항은 또한 암과 같은 질병을 치료하기 위한 것과 같이 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명이 보다 잘 이해되도록 하기 위해서, 용어가 정의된다. 부가적인 정의는 상세한 설명의 전반을 통하여 제시되어 진다.
"시그날 형질도입 경로"는 세포의 일 부분으로부터 세포의 다른 부분으로 신호의 전이에 어떤 역할을 하는 다양한 시그날 형질도입 분자 간에 생화학적 상관관계에 대한 것이다. 여기서 사용된 것으로, 구 "세포 표면 수용체"는, 예를 들어 신호를 수용할 수 있고 그리고 이러한 신호를 세포의 플라즈마 멤브레인을 가로질러 전이할 수 있는 분자 및 복합체를 포함한다. 본 발명의 "세포 표면 수용체"의 예는 CD70 수용체이다.
여기서 언급된 것으로 용어 "항체"는 전 항체 및 항원 결합 분획(예를 들어, "항원-결합 부위")이나 이들의 단일 사슬을 포함한다. "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된 적어도 두 개의 중(H) 사슬 및 두 개의 경(L) 사슬을 포함하는 당단백질 또는 이들의 항원 결합 부위를 언급한다. 각 중사슬은 중사슬 가변영역 (여기서는 VH로 약칭함) 및 중사슬 불변영역을 포함한다. 중사슬 불변영역은 CH1, CH2 및 CH3의 세 도메인을 포함한다. 각 경사슬은 경사슬 가변영역 (여기서는 VL로 약칭함) 및 경사슬 불변영역을 포함한다. 경사슬 불변영역은 하나의 도메인, CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은 과변이성의 영역인, 일명 상보성 결정 영역(CDR)으로 더 세분화될 수 있고, 일명 골격 영역(FR)인 보다 보전적인 영역으로 산재될 수 있다. 각 VH 및 VL은 세 CDR 및 네 FR를 포함하여, 아미노-말단으로부터 카르복시-말단 까지 다음의 순서로 배열되어 진다:FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중 및 경사슬의 가변영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변영 역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보완계의 제일의 성분(Clq)을 포함하여, 숙주 조직 또는 인자에 이뮤노글로불린의 결합을 조절할 수 있다.
여기서 사용된 것으로 용어, 항체의 "항원-결합 부분" (또는 간단하게 "항체 부분")은 항원(예를 들어, CD70)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 또는 그 이상의 분획에 대한 것이다. 항체의 항원-결합 작용은 전-길이 항체의 분획에 의하여 수행되어 질 수 있다는 것이 밝혀져 있다. 항체의 용어 "항원-결합 부분" 내에 포함되어 지는 결합 분획의 예는 (i) Fab 분획으로, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가의 분획; (ii) F(ab')2 분획으로, 힌지 영역에 디설파이드 다리에 의해 연결된 두 개의 Fab 분획을 포함하는 2가의 분획; (iii) 필수적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab인 Fab' 분획(Fundamental Immunology (Paul ed., 3rd ed. 1993) 참고); (iv) VH 및 CHI 영역으로 구성된 Fd 분획; (v) 항체의 싱글 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 분획; (vi) VH 도메인을 구성하는 dAb 분획 (Ward et al, (1989) Nature 341:544-546); 및 (vii) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 더욱이, 비록 Fv 분획의 두 도메인인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의하여 코드되어 지지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 1가의 분자를 형성하기 위하여 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루는 단일 단백질 사슬로서 이들이 제조되어 질 수 있는 합성 링커에 의하여 연결되어 질 수 있다 (단일 사슬 Fv (scFv)로 알려 진 것; 예를 들어, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc . Natl . Acad . ScL USA 85:5879-5883 참고). 이러한 단일 사슬 항체는 또한 항체의 용어 "항원-결합 부분" 내에 포함되어 지도록 의도된다. 이들 항체 분획은 이 분야의 통상인에게 잘 알려진 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 분획은 온전한 항체로서 동일한 방식으로 실용성에 대해 선별되었다.
여기서 사용된 것으로, "분리된 항체"는 다른 항원적 특이성을 갖는 실질적으로 다른 항체가 없는 항체를 언급하기 위한 것이다(예를 들어, CD70에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 CD70 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, CD70에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종으로부터의 CD70 분자와 같이 다른 항원에 교차-반응성을 갖는다. 어떤 실시형태에서는, 분리된 항체가 인간 CD70에 특이적으로 결합하고 그리고 다른 비-인간 CD70 항원과 교차 반응하지 않는다. 더욱이, 분리된 항원은 실질적으로 다른 세포성 물질 및/또는 화합물들이 없다.
여기서 사용된 것으로 용어 "모노크로날 항체" 또는 "모노크로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 언급한다. 모노크로날 항체 조성물은 특정 항원결정인자에 대한 친화성 및 단일 결합 특이성을 나타낸다.
여기서 사용된 것으로 용어 "인간 항체"는 골격 및 CDR 영역 양자가 인간 생식계열 이뮤노글로불린 시퀀스로부터 유래된 다양한 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 더욱이, 만일 항체가 불변 영역을 포함하면, 이 불변 영역은 또한 인간 생식계열 이뮤노글로불린 시퀀스로부터 유래된다. 인간 항체는 천연 또는 합성 수사를 포함하는 후자의 수사를 포함할 수 있다. 본 개시의 인간 항체는 인간 생식계열 이뮤노글로불린 시퀀스에 의해 코드되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 생체 외에서 랜덤 또는 사이트-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체 내에서 체세포돌연변이에 의하여 도입된 돌연변이). 그러나, 여기서 사용된 것으로 용어 "인간 항체"는 마우스와 같은 다른 포유 동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 시퀀스가 인간 골격 시퀀스 상으로 그래프트되어 진 항체를 포함하는 것을 의도하지는 않는다.
용어 "인간 모노크로날 항체"는 골격 및 CDR 영역 양자가 인간 생식계열 이뮤노글로불린 시퀀스로부터 유래된 다양한 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 언급한다. 일 실시형태에서, 인간 모노크로날 항체는 불사 세포에 융합된 인간 중사슬 형질전환 및 경사슬 형질전환을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비인간 동물, 예를 들어, 형질전환 마우스로부터 얻어진 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
여기서 사용된 것으로 용어 "재조합 인간 항체"는 (a) 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 형질전환 또는 트랜스크로모좀이거나 또는 이들로부터 제조된 하이브리도마(하기에 더 기술됨)인 동물(예를 들어, 마우스)로부터 분리된 항체, (b) 인간 항체를 발현하기 위해 변환된 숙주세포로부터, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 분리된 항체, (c) 재조합, 결합 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체 및 (d) 다른 DNA 시퀀스로 인간 이뮤노글로불린 유전자 시퀀스의 유전자 삽입을 포함하는 어떤 다른 수단에 의하여 제조, 발현, 생산 또는 분리된 항체와 같은 재조합 수단 에 의하여 제조, 발현, 생산 또는 분리된 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생산 또는 분리된 모든 인간 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 골격 및 CDR 영역이 인간 생식계열 이뮤노글로불린 시퀀스로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 그러나, 어떤 실시형태에서, 이런 재조합 인간 항체는 생체 외에서 돌연변이 유발되어 질 수 있고(또는, 인간 Ig 시퀀스에 대한 동물 형질전환이 사용될 때는 생체 내에서 체세포돌연변이), 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 시퀀스는, 인간 생식계열 VH 및 VL 시퀀스로부터 유래되고 관련되어질 때 생체 내에서 인간 항체 생식계열 레파토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 시퀀스이다.
여기서 사용된 것으로, "아이소타이프"는 중사슬 불변 영역 유전자에 의해 코드되는 항체 클라스(예를 들어, IgM 또는 IgGl)에 대해 언급한다.
구 "항체 인지 항원" 및 "항원에 특이적인 항체"는 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 여기서 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "인간 항체 유도체류"는 인간 항체의 변형된 형태로, 예를 들어 항체의 컨쥬게이트 및 다른 제제나 항체에 대해 언급한다.
용어 "인체적응된 항체"는 마우스와 같은 다른 포유 동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 시퀀스가 인간 골격 시퀀스 상으로 그래프트되어 진 항체를 언급하기 위한 것이다. 부가적 골격 영역 변형이 인간 골격 시퀀스 내에서 이루어질 수 있다.
용어 "키메르 항체"는 가변 영역 시퀀스가 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 시퀀스가 인간 항체로부터 유래된 항체와 같이 가변 영역 시퀀스가 하나의 종으로부터 유래되고 불변 영역 시퀀스가 다른 종으로부터 유래된 항체를 언급하기 위한 것이다.
여기서 사용된 것으로, "인간 CD70에 특이적으로 결합하는" 항체는 인간 CD70에 5 x 10-8 M 또는 그 이하, 보다 바람직하기로는 1 x 10-8 M 또는 그 이하, 더 바람직하기로는 6 x 10-9 M 또는 그 이하, 더욱 보다 바람직하기로는 3 x 10-9 M 또는 그 이하의 가장 바람직하기로는 2 x 10-9 M 또는 그 이하의 KD로 결합하는 항체를 언급하기 위한 것이다.
여기서 사용된 것으로, 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정한 항체-항원 상호작용의 결합 비율을 언급하기 위한 것이고, 반면 여기서 사용된 것으로, 용어 "Kdis" 또는 "Kd,"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 비율을 언급하기 위한 것이다. 여기서 사용된 것으로, 용어 "KD"는 해리 상수를 언급하기 위한 것으로, 이것은 Ka에 대한 Kd의 비(즉, Kd/Ka)로부터 얻어지고, 몰 농도(M)로 표시된다. 항체에 대한 KD 값은 이 기술 분야에 잘 확립된 방법을 사용하여 결정되어 질 수 있다. 항체의 KD를 결정하기 위한 바람직한 방법은 표면 플라스몬 공조, 바람직하기로는 Biacore® 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 것이다.
여기서 사용된 것으로, IgG 항체에 대한 용어 "높은 친화도"는 타겟 항체에 대해 10-7 M 또는 그 이하, 보다 바람직하기로는 10-8 M 또는 그 이하, 그리고 더 보다 바람직하기로는 10-9 M 또는 그 이하, 그리고 보다 가장 바람직하기로는 10-10 M의 KD를 갖는 항체에 대한 것이다. 그러나, "높은 친화도" 결합은 다른 항체 아이소타이프에 대해 변할 수 있다. 예를 들어, IgM 아이소타이프에 대한 "높은 친화도" 결합은 10-7 M 또는 그 이하, 보다 바람직하기로는 10-8 M 또는 그 이하, 더 보다 바람직하기로는 10-9 M 또는 그 이하의 KD를 갖는 항체를 말한다.
여기서 사용된 것으로, 용어 "대상"은 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 척추동물, 즉 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 어류, 파충류 등과 같은 포유 및 비포유동물을 포함한다.
본 개시 사항의 다양한 측면은 이하의 하부항목에서의 더 상세한 설명으로 기술되어 진다.
항- CD70 항체
본 개시 사항의 항체는 특정한 항체의 기능적 특징 또는 특성으로 특징되어 진다. 예를 들어, 항체는 인간 CD70에 특이적으로 결합한다. 바람직하기로는, 본 개시 사항의 항체는 높은 친화도, 예를 들어 5 x 10-7 M 또는 그 이하, 더 바람직하기로는 5.5xlO-9, 더 더욱 바람직하기로는 3x10-9 또는 그 이하, 보다 더 바람직하기 로는 2x10-9 또는 그 이하 또는 가장 바람직하기로는 1.5xlO-9 또는 그 이하의 KD로 CD70에 결합한다. CD70에 대한 항체의 결합 능을 평가하기 위한 표준 분석은, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블럿, 및 RIA를 포함하는 이 분야에 잘 알려진 것이다. 적절한 분석법은 실시예에 보다 자세하게 기술되어 진다. 항체의 결합 운동학(즉, 결합 친화도) 또한 ELISA, Scatchard 및 Biacore 아날리시스와 같은 이 기술 분야에 알려진 표준 분석법으로 평가되어 질 수 있다. 다른 실시예로서, 본 개시 사항의 항체는 신장 암종 종양 세포 라인, 예를 들어 786-0, A-498, ACHN, Caki-1 또는 Caki-2 세포 라인에 결합할 수 있다. 또 다른 예로서, 본 개시 사항의 항체는 B-세포 종양 세포 라인, 예를 들어 Daudi, HuT 78, Raji 또는 Granta-519 세포 라인에 결합할 수 있다.
모노크로날 항체 2 H5 , 10B4, 8B5, 18 E7 및 69A7
본 개시 사항의 예시된 항체는 인간 모노크로날 항체 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 및 69A7을 포함하고, 실시예 1 및 2에서 기술된 바와 같이 분리되고 그리고 구조적으로 특징되어 진다. 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 및 69A7의 VH 아미노산 시퀀스는 각각 SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 및 5로 나타난다. 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 및 69A7의 VL 아미노산 시퀀스는 각각 SEQ ID NOs:6, 7, 8, 9 및 10으로 나타난다.
이들 항체의 각각이 CD70에 결합할 수 있는 것으로 되면, VH 및 VL 시퀀스는 "혼합되고 매치될 수 있어" 본 개시 사항의 다른 항-CD70 결합 분자를 생산한다. 이러한 "혼합되고 매치된" 항체의 CD70 결합은 상기 및 실시예들에 기술된 결합 어세이(즉, FACS 또는 ELISA)를 사용하여 시험되어 질 수 있다. 바람직하기로는, VH 및 VL 사슬이 혼합되고 매치될 때, 특정한 VH/VL 쌍의 VH 시퀀스가 구조적으로 유사한 VH 시퀀스로 대체된다. 마찬가지로, 바람직하기로는 특정한 VH/VL 쌍으로부터의 VL 시퀀스가 구조적으로 유사한 VL 시퀀스로 대체된다.
따라서, 일 측면에 있어서, 본 개시 사항은 다음을 포함하는 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위를 제공한다:
(a) SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및
(b) SEQ ID NOs:6, 7, 8, 9 및 10으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역;
여기서 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다.
바람직한 중 및 경사슬 조합은 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:1의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 (b) SEQ ID NO:6의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역; 또는
(a) SEQ ID NO:2의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 (b) SEQ ID NO:7의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역; 또는
(a) SEQ ID NO:3의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 (b) SEQ ID NO:8의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역; 또는
(a) SEQ ID NO:4의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 (b) SEQ ID NO:9의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역; 또는
(a) SEQ ID NO:5의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 (b) SEQ ID NO:l0의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명의 개시 사항은 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 및 69A7의 중사슬 및 경사슬 CDR1, CDR2 and CDR3 또는 이들의 조합을 포함하는 항체를 제공한다. 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 및 69A7의 VH CDR1의 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NOs:11, 12, 13, 14 및 15에 각각 나타나 있다. 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 및 69A7의 VH CDR2의 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NOs:16, 17, 18, 19 및 20에 각각 나타나 있다. 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 및 69A7의 VH CDR3의 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NOs:21, 22, 23, 24 및 25에 각각 나타나 있다. 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 및 69A7의 VK CDR1의 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NOs:26, 27, 28, 29 및 30에 각각 나타나 있다. 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 및 69A7의 VK CDR2의 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NOs:31, 32, 33, 34 및 35에 각각 나타나 있다. 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 및 69A7의 VK CDR3의 아미노산 시퀀스는 SEQ ID NOs:36, 37, 38, 39 및 40에 각각 나타나 있다. CDR 영역은 카바트 시스템(Kabat, E. A., et al . (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)을 사용하여 묘사되어 진다.
이들 항체의 각각이 CD70에 결합할 수 있는 것으로 되고 그리고 항원-결합 특이성이 일차적으로 CDRl, CDR2, 및 CDR3 영역에 의하여 제공되어 진다면, VH CDRl, CDR2, 및 CDR3 시퀀스 그리고 Vk CDRl, CDR2, 및 CDR3 시퀀스는 "혼합되고 매치"될 수 있어 (즉, 비록 각 항체는 반드시 VH CDRl, CDR2, 및 CDR3 그리고 Vk CDRl, CDR2, 및 CDR3를 포함하여야 되지만, 다른 항체로부터의 CDRs가 혼합되고 매치될 수 있음) 본 개시 사항의 다른 항-CD70 결합 분자를 생성한다. 이러한 "혼합되고 매치된" 항체의 CD70 결합은 상기 및 실시예들에 기술된 결합 어세이(즉, FACS, ELISA, Biacore 어날리시스)를 사용하여 시험되어 질 수 있다. 바람직하기로는, VH CDR 시퀀스가 혼합되고 매치될 때, 특정한 VH 시퀀스로부터 CDRl, CDR2 및/또는 CDR3 시퀀스가 구조적으로 유사한 CDR 시퀀스(들)로 대체된다. 마찬가지로, Vk CDR 시퀀스가 혼합되고 매치될 때, 특정한 Vk 시퀀스로부터 CDRl, CDR2 및/또는 CDR3 시퀀스가 바람직하기로는 구조적으로 유사한 CDR 시퀀스(들)로 대체된다. 신규한 VH 및 VL 시퀀스는 하나 또는 그 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 시퀀스를 모노크로날 항체 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 및 69A7에 대해 여기서 개시된 CDR 시퀀스로부터 구조적으로 유사한 시퀀스로 치환함에 의해 만들어질 수 있다는 것은 통상적인 기술을 가진 자에게 확실히 명백할 것이다.
따라서, 다른 측면에 있어서, 본 개시 사항은 다음을 포함하는 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공한다:
(a) SEQ ID NOs :11, 12, 13, 14 및 15로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl;
(b) SEQ ID NOs:16, 17, 18, 19 및 20으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2;
(c) SEQ ID NOs:21, 22, 23, 24 및 25로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3;
(d) SEQ ID NOs:26, 27, 28, 29 및 30으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl;
(e) SEQ ID NOs:31, 32, 33, 34 및 35로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NOs:36, 37, 38, 39 및 40으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3;
여기서 항체는 특이적으로 CD70에, 바람직하기로는 인간 CD70에 결합한다.
바람직한 실시형태로는, 항체는 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:11을 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl;
(b) SEQ ID NO:16을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2;
(c) SEQ ID NO:21을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3;
(d) SEQ ID NO:26을 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl;
(e) SEQ ID NO:31을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:36을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3.
다른 바람직한 실시형태로는, 항체는 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:12을 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl;
(b) SEQ ID NO:17을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2;
(c) SEQ ID NO:22을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3;
(d) SEQ ID NO:27을 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl;
(e) SEQ ID NO:32을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:37을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3.
다른 바람직한 실시형태로는, 항체는 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:13을 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl;
(b) SEQ ID NO:18을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2;
(c) SEQ ID NO:23을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3;
(d) SEQ ID NO:28을 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl;
(e) SEQ ID NO:33을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:38을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3.
다른 바람직한 실시형태로는, 항체는 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:14을 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl;
(b) SEQ ID NO:19을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2;
(c) SEQ ID NO:24을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3;
(d) SEQ ID NO:29을 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl;
(e) SEQ ID NO:34을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:39을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3.
다른 바람직한 실시형태로는, 항체는 다음을 포함한다:
(a) SEQ ID NO:15을 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl;
(b) SEQ ID NO:20을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2;
(c) SEQ ID NO:25을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3;
(d) SEQ ID NO:30을 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl;
(e) SEQ ID NO:35을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:40을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3.
CDR3 도메인은, CDRl 및/또는 CDR2 도메인(들)과는 독립적으로, 단독으로 동등한 항원에 대한 항체의 결합 특이성을 결정할 수 있고, 그리고 복수 항체들이 예상대로 공통 CDR3 시퀀스에 기초한 동일한 결합 특이성을 가지고 발생되어 질 수 있다는 것은 이 기술분야에 있어 잘 알려진 것이다. 예를 들어, Klimka et al , British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000) (뮤어라인 항-CD30 항체 Ki-4의 중사슬 가변 도메인 CDR3 만을 사용하여 인체적응된 항-CD30 항체의 생산을 기술함); Beiboer et al , J. Mol . Biol. 296:833-849 (2000) (모체의 뮤어라인 MOC-31 항-EGP-2 항체의 중사슬 CDR3 시퀀스 만을 사용하여 재조합 상피조직의 당간백질-2 (EGP-2)항체를 기술함); Rader et al , Proc . Natl . Acad . ScL U.S.A. 95:8910-8915 (1998) (뮤어라인 항-인테그린 αvβ3 항체 LM609의 중 및 경사슬 가변 CDR3 도메인을 사용하여 인체적응된 항-인테그린 αvβ3 항체의 패널을 기술하고, 여기서 각 구 성 항체는 CDR3 도메인 외측에 명확한 시퀀스를 포함하여 모체의 뮤어라인 항체와 동일한 항원결정인자를 모체의 뮤어라인 항체와 거의 같이 높거나 또는 보다 더 높은 친화도로 결합할 수 있음); Barbas et al . , J. Am . Chem . Soc . 116:2161 -2162 (1994) (CDR3 도메인이 항원 결합에 대해 가장 유의성 있는 기여를 제공하는 것을 기술함); Barbas et al , Proc . Natl . Acad . ScL U.S.A. 92:2529-2533 (1995) (안티-테타너스 톡소이드 Fab의 중사슬 상에 인간 태반 DNA에 대해 세 개의 Fabs (SI-I, SI-40, 및 SI-32)의 중사슬 CDR3 시퀀스의 그라프팅함과 이에 의한 존재하는 중사슬 CDR3를 대체하고 CDR3 도메인 단독으로 결합 특이성을 제공한다는 것을 기술함); 및 Ditzel et al , J. Immunol . 157:739-749 (1996) (단일특이적 IgG 테타너스 톡소이드-바인딩 Fab p313 항체의 중사슬로 단지 모체의 다특이적 Fab LNA3의 중사슬 CDR3의 전이가 모체 Fab의 결합 특이성을 보유하는데 충분하다는 그라프팅 연구를 기술함) 참고. 이들 참고 문헌 각각은 그 전체로서 참고로서 여기에 합체되어 진다.
따라서, 본 개시 사항은 인간 또는 비-인간으로부터 유래된 항체로부터 하나 또는 그 이상의 중 및/또는 경사슬 CDR3 도메인을 포함하는 모노크로날 항체를 제공하며, 여기서 상기 모노크로날 항체는 CD70에 특이적으로 결합할 수 있다. 어떠한 측면 내에서, 본 발명의 개시 사항은 마우스 또는 랫트 항체와 같이 비-인간 항체로부터 하나 또는 그 이상의 중 및/또는 경사슬 CDR3 도메인을 포함하는 모노크로날 항체를 제공하며, 여기서 상기 모노크로날 항체는 CD70에 특이적으로 결합할 수 있다. 몇몇 실시형태로서, 비-인간 항체로부터 하나 또는 그 이상의 중 및/또는 경사슬 CDR3 도메인을 포함하는 이러한 발명의 항체는 (a) 항원결정인자와 경쟁적으로 결합할 수 있고; (b) 항원결정인자에 기능적 특성을 보유하고; (c) 동일한 항원결정인자에 결합하고; 및/또는 (d) 상응하는 모체의 비-인간 항체에 유사한 결합 친화도를 가진다.
다른 측면 내에서, 본 개시 사항은 예를 들어 비-인간 항체로부터 얻어진 인간 항체와 같은 인간 항체로부터 하나 또는 그 이상의 중 및/또는 경사슬 CDR3 도메인을 포함하는 모노크로날 항체를 제공하며, 여기서 인간 항체는 CD70에 특이적으로 결합할 수 있다. 다른 측면 내에서, 본 개시 사항은 예를 들어 비-인간 항체로부터 얻어진 인간 항체와 같은 제일 인간 항체로부터 하나 또는 그 이상의 중 및/또는 경사슬 CDR3 도메인을 포함하는 모노크로날 항체를 제공하며, 여기서 제일 인간 항체는 CD70에 특이적으로 결합할 수 있고 그리고 제일 인간 항체로부터의 CDR3 도메인은 CD70에 대한 결합 특이성을 결한 인간 항체 내에 CDR3 도메인을 대체하여 CD70에 대한 특이적으로 결합할 수 있는 제이의 인간 항체를 발생한다. 몇 가지의 실시형태 내에서, 제일의 인간 항체로부터 하나 또는 그 이상의 중 및/또는 경사슬 CDR3 도메인을 포함하는 본 개시의 항체는 (a) 항원결정인자와 경쟁적으로 결합할 수 있고; (b) 항원결정인자에 기능적 특성을 보유하고; (c) 동일한 항원결정인자에 결합하고; 및/또는 (d) 상응하는 모체의 제일의 인간 항체에 유사한 결합 친화도를 가진다.
특정 생식계열 시퀀스를 갖는 항체
어떤 실시형태에서, 본 개시 사항의 항체는 특정 생식계열 중사슬 이뮤노글 로불린 유전자로부터의 중사슬 가변영역 및/또는 특정 생식계열 경사슬 이뮤노글로불린 유전자로부터 경사슬 가변영역을 포함한다.
예를 들어, 바람직한 실시형태에 있어서, 본 개시사항은 인간 VH 3-30.3 유전자의 산물 또는 이들로부터 유래된 중사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다. 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 본 개시 사항은 인간 VH 3-33 유전자의 산물 또는 이들로부터 유래된 중사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다. 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 본 개시 사항은 인간 VH 4-61 유전자의 산물 또는 이들로부터 유래된 중사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다. 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 본 개시 사항은 인간 VK L6 유전자의 산물 또는 이들로부터 유래된 경사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다. 더욱이 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 본 개시 사항은 인간 VK Ll8 유전자의 산물 또는 이들로부터 유래된 경사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다. 더욱이 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 본 개시 사항은 인간 VK L15 유전자의 산물 또는 이들로부터 유래된 경사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다.
더욱이 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 본 개시 사항은 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하는 것으로, 여기서 항체는:
(a) 인간 VH 3-30.3, 3-33 또는 4-61 유전자 (각각 SEQ ID NOs:51, 52 및 53으로 설정된 아미노산 시퀀스를 코드하는 유전자임)의 산물 또는 이들로부터 유래된 중사슬 가변영역을 포함하고;
(b) 인간 VK L6, Ll8 또는 Ll5 유전자 (각각 SEQ ID NOs:54, 55 및 56으로 설정된 아미노산 시퀀스를 코드하는 유전자임)의 산물 또는 이들로부터 유래된 경사슬 가변영역을 포함하고; 그리고
(c) 항체는 CD70에 특이적으로 결합함.
VH 3-30.3 및 VK L6의 각 VH 및 VK를 갖는 항체의 예는 2H5이다. VH 3-30.3 및 VK Ll8의 각 VH 및 VK를 갖는 항체의 예는 10B4이다. VH 3-33 및 VK L15의 각 VH 및 VK를 갖는 항체의 예는 8B5 및 18E7이다. VH 4-61 및 VK L6의 각 VH 및 VK를 갖는 항체의 예는 69A7이다.
여기서 사용된 것으로, 만일 항체의 가변 영역이 인간 생식계열 이뮤노글로불린 유전자를 사용하는 계로부터 얻어진 것이라면, 인간 항체는 특정 생식계열 시 퀀스의 "산물" 또는 "이들로부터 유래된" 중 또는 경사슬 가변영역을 포함한다. 이러한 계는 흥미있는 항원으로 인간 이뮤노글로불린 유전자를 담지하는 형질전환 마우스를 면역시키거나 또는 흥미있는 항원으로 파아지 상에 디스플레이된 인간 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 생식계열 이뮤노글로불린 시퀀스의 "산물" 또는 "이들로부터 유래된" 인간 항체는 인간 생식계열 이뮤노글로불린의 아미노산 시퀀스에 인간 항체의 아미노산 시퀀스를 비교하고 그리고 인간 항체의 시퀀스에 시퀀스가 가장 밀접한(즉, 최대 % 동일성) 인간 생식계열 이뮤노글로불린 시퀀스를 셀렉팅함에 의해 동정되어 질 수 있다. 특정한 인간 생식계열 이뮤노글로불린 시퀀스의 "산물" 또는 "이들로부터 유래된" 인간 항체는, 예를 들어 자연적으로 발생하는 체세포돌연변이 또는 사이트-지정 돌연변이의 의도적인 유발에 기인하여 생식계열 시퀀스에 대비하여 다른 아미노산을 포함할 수 있다. 그러나, 선택된 인간 항체는 인간 생식계열 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코드된 아미노산 시퀀스에 대해 아미노산 시퀀스에 있어 전형적으로 적어도 90% 동일하고, 그리고 인간 항체를 다른 종의 생식계열 이뮤노글로불린 아미노산 시퀀스 (즉, 뮤어라인 생식계열 시퀀스)에 비교할 때 인간으로 동정하는 아미노산 잔기를 포함한다. 어떤 경우에, 인간 항체는 생식계열 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코드된 아미노산 시퀀스에 대하여 아미노산 시퀀스에 있어서 적어도 95%, 또는 더욱이 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 전형적으로, 특정한 인간 생식계열 시퀀스로부터 유래된 인간 항체는 인간 생식계열 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코드된 아미노산 시퀀스로부터 10개 이하의 아미노산 차이를 보일 것이다. 어떤 경 우에서는, 인간 항체는 생식계열 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코드된 아미노산 시퀀스로부터 5개 이하, 또는 더욱이 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 보일 것이다.
상동 항체
더욱이 다른 실시형태에서, 본 개시사항의 항체는 여기에 기술된 바람직한 항체의 아미노산 시퀀스에 상동성인 아미노산 시퀀스를 포함하는 중 및 경사슬 가변 영역을 포함하고, 여기서 항체는 본 발명의 항-CD70 항체의 바람직한 기능적 특성을 보유한다.
예를 들어, 본 개시 사항은 중사슬 가변영역 및 경사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서:
(a) 중사슬 가변영역은 SEQ ID NOs:l, 2, 3, 4 및 5로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스에 적어도 80% 유사한 아미노산 시퀀스를 포함하고;
(b) 경사슬 가변영역은 SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 9 및 10으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스에 적어도 80% 유사한 아미노산 시퀀스를 포함하고; 그리고
(c) 항체는 CD70에 특이적으로 결합함.
다른 실시형태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 시퀀스는 상기에 설정된 시퀀스에 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사할 수 있다. 상기 설정된 시퀀스의 VH 및 VL 영역에 대해 높은(즉, 80% 또는 그 이상) 유사성을 갖는 VH 및 VL 영역을 가지는 항체는 SEQ ID NOs:41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 및 50을 코드하는 핵산 분자의 돌연변이유발(즉, 사이트-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)에 의해, 그리고 이에 따른 여기에 기술된 작용적 분석법을 사용하여 코드된 변형된 항체에 대한 보유된 작용(즉, 인간 CD70에 5X10-8 M 또는 그 이하의 KD로 결합)을 시험함에 의해 얻어질 수 있다.
여기서 사용된 것으로, 두 아미노산 시퀀스 간에 유사성의 백분율은 두 시퀀스 간의 동일성 백분율에 동등하다. 두 시퀀스 간의 동일성 백분율은 각 갭의 수와 각 갭의 길이를 고려하여 시퀀스에 의하여 공유된 다수의 동일한 위치의 기능(즉, 유사성 % = 동일한 위치의 #/위치의 전체 # x 100)으로, 두 시퀀스의 최적의 배열을 위하여 도입되어 질 필요가 있다. 시퀀스의 비교 및 두 개의 시퀀스 간의 동일성 백분율의 결정은 아래의 비제한적인 실시예에서 기술된 바와 같이, 수학적 알고리즘을 사용하여 수행되어 질 수 있다.
두 아미노산 시퀀스 간의 동일성 백분율은 PAM120 중량 잔기 테이블, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용하여 ALIGN 프로그램 (version 2.0)으로 합체되는 이 메이어와 더블유 밀러(E. Meyers and W. Miller; Comput . Appl . Biosci., 4:11-17 (1988))의 알고리즘을 사용하여 결정되어 질 수 있다. 부가하여, 두 아미노산 시퀀스 간의 동일성 백분율은 브로섬(Blossum) 62 매트릭스나 PAM250 매트릭스와 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하여 GCG 소프트웨어 팩키지(www.gcg.com에서 이용할 수 있음) 내의 GAP 프로그램으로 합체되는 니들맨과 분쉬(Needleman and Wunsch; J. MoI . Biol . 48:444-453 (1970)) 알고리즘을 사용하여 결정되어 질 수 있다.
부가적으로 또는 대안적으로, 본 개시의 단백질 시퀀스는, 예를 들어 관련된 시퀀스를 동정하기 위한 공공 데이타베이스에 대해 검색을 수행하기 위한 "쿼리 시퀀스"로 더욱이 사용될 수 있다. 이러한 검색은 Altschul, et al . (1990) J. MoI. Biol . 215:403-10의 XBLAST 프로그램 (version 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 항체 분자에 유사한 아미노산 시퀀스를 얻기 위하여 XBLAST 프로그램으로, 스코어 = 50, 워드길이 = 3으로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭트 배열을 얻기 위하여, 갭트 BLAST가 Altschul et al , (1997) Nucleic Acids Res . 25(17):3389-3402에 기술된 것과 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 갭트 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램(즉, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. www.ncbi.nlm.nih.gov 참고.
보전적 변이를 갖는 항체
어떤 실시형태에서, 본 개시의 항체는 CDRl, CDR2 및 CDR3 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역과 CDRl, CDR2 및 CDR3 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함하고, 여기서 하나 또는 그 이상의 이들 CDR 시퀀스는 여기에 기술된 바람직한 항체(즉, 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 또는 69A7)나 또는 이들의 보전적 변이에 기초한 특정된 아미노산 시퀀스를 포함하고, 그리고 여기서 항체는 본 발명의 항-CD70 항체의 원하는 작용 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 CDRl, CDR2 및 CDR3 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역과 CDRl, CDR2 및 CDR3 시퀀스를 포함하는 경사슬 가 변영역을 포함하는 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서;
(a) 중사슬 가변영역 CDR3 시퀀스는 SEQ ID NOs:21, 22, 23, 24 및 25의 아미노산 시퀀스; 그리고 이들의 보전적 변이로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하고;
(b) 경사슬 가변영역 CDR3 시퀀스는 SEQ ID NOs:36, 37, 38, 39 및 40의 아미노산 시퀀스; 그리고 이들의 보전적 변이로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하고; 그리고
(c) 항체는 CD70에 특이적으로 결합함.
바람직한 실시형태에서, 중사슬 가변영역 CDR2 시퀀스는 SEQ ID NOs:16, 17, 18, 19 및 20의 아미노산 시퀀스; 그리고 이들의 보전적 변이로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하고; 그리고 경사슬 가변영역 CDR2 시퀀스는 SEQ ID NOs:31, 32, 33, 34 및 35의 아미노산 시퀀스; 그리고 이들의 보전적 변이로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함한다. 다른 바람직한 실시형태에서, 중사슬 가변영역 CDR1 시퀀스는 SEQ ID NOs:11, 12, 13, 14 및 15의 아미노산 시퀀스; 그리고 이들의 보전적 변이로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하고; 그리고 경사슬 가변영역 CDR1 시퀀스는 SEQ ID NOs:26, 27, 28, 29 및 30의 아미노산 시퀀스; 그리고 이들의 보전적 변이로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함한다.
여기서 사용된 것으로, 용어 "보전적 시퀀스 변이"는 아미노산 시퀀스를 포 함하는 항체의 결합 특징이 유의적으로 영향을 받거나 또는 변형하지 않는 아미노산 개변을 언급하기 위한 것이다. 이러한 보전적 변이는 아미노산 치환, 부가 및 결손을 포함한다. 변이는 사이트-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발과 같은 이 분야에 공지된 표준 기술에 의해 본 발명의 항체에 도입되어 질 수 있다. 보전적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 사이드 체인을 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 사이드 체인을 갖는 아미노산 잔기의 과(科)는 이 기술분야에 정의되어 져 있다. 이들 과는 염기성 측쇄(즉, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(즉, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(즉, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(즉, 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-사슬 측쇄(즉, 트레오닌, 발린, 이소류이신) 및 방향성 측쇄(즉, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 영역 내에 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고 그리고 변형된 항체는 여기에 기술된 기능 분석법을 가용하여 보유된 기능(즉, (c)에서 설정된 기능)에 대해 시험되어 질 수 있다.
본 개시사항의 항- CD70 항체와 동일한 항원결정인자에 결합하는 항체
다른 실시형태에서, 본 개시사항은 본 발명의 CD70 모노크로날 항체(즉, 본 발명의 모노크로날 항체의 어떤 하나와 CD70에 결합에 대해 교차-경쟁하는 능력을 갖는 항체)의 어떤 것과 인간 CD70 상에 동일한 항원결정인자에 결합하는 항체를 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 교차-경쟁 연구에 대한 레퍼런스 항체는 모노크로날 항체 2H5 (각각, SEQ ID NOs: 1 및 6에 나타난 것과 같은 VH 및 VL 시퀀스를 가짐) 또는 모노크로날 항체 10B4 (각각, SEQ ID NOs: 2 및 7에 나타난 것과 같은 VH 및 VL 시퀀스를 가짐) 또는 모노크로날 항체 8B5 (각각, SEQ ID NOs: 3 및 8에 나타난 것과 같은 VH 및 VL 시퀀스를 가짐) 또는 모노크로날 항체 18E7 (각각, SEQ ID NOs: 4 및 9에 나타난 것과 같은 VH 및 VL 시퀀스를 가짐) 또는 모노크로날 항체 69A7 (각각, SEQ ID NOs:5 및 10에 나타난 것과 같은 VH 및 VL 시퀀스를 가짐)일 수 있다. 이러한 교차-경쟁 항체는 표준 CD70 결합 분석법으로 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 또는 69A7과 교차-경쟁하는 그 능력에 기초하여 동정되어 질 수 있다. 예를 들어, BIAcore 분석법, ELISA 분석 또는 유동세포분석법이 본 개시 사항의 항체와의 교차-경쟁을 입증하기 위하여 사용될 수 있을 것이다. 인간 CD70에, 예를 들어 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 또는 69A7의 결합을 저해하는 시험 항체의 능력은 시험 항체가 인간 CD70에 대한 결합에 대해 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 또는 69A7와 경쟁할 수 있고, 따라서 인간 CD70 상에 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 또는 69A7과 같은 항원결정인자에 결합한다는 것을 입증한다. 바람직한 실시형태에서, 인간 CD70 상에 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 또는 69A7과 같은 항원결정인자에 결합하는 항체는 인간 모노크로날 항체이다. 이러한 인간 모노크로날 항체는 실시예에서 기술되어 지는 바와 같이 제조되고 분리되어 질 수 있다.
가공되고 변이된 항체
본 개시사항의 항체는 더욱이 변이된 항체를 가공하는 시발 물질로서 여기에 기술된 하나 또는 그 이상의 VH 및/또는 VL 시퀀스를 갖는 항체를 사용하여 제조되어 질 수 있고, 여기서 변이된 항체는 시발 항체로부터 변형된 특성을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 양자의 가변 영역들 (즉, VH 및/또는 VL) 내에서, 예를 들어 하나 또는 그 이상의 CDR 영역 및/또는 하나 또는 그 이상의 골격 영역 내에서 하나 또는 그 이상의 잔기를 변형함에 의하여 가공되어 질 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 항체는 불변영역들 내에서, 예를 들어 항체의 이펙터 기능을 개변하기 위하여 잔기를 변형함에 의하여 가공되어 질 수 있다.
수행되어 질 수 있는 가변 영역을 가공하는 일 형태는 CDR 그래프팅이다. 항체는 여섯의 중 및 경사슬 상보성 결정 영역들 (CDRs) 내에 위치된 아미노산 잔기를 통하여 현저하게 타겟 항원과 상호작용한다. 이러한 이유 때문에, CDR 내에 아미노산 시퀀스가 CDR의 외측의 시퀀스 보다 개개의 항원들 사이에서 보다 다양하다. CDR 시퀀스는 대부분의 항체-항원 상호작용에 원인이 되기 때문에, 다른 특성을 갖는 다른 항원으로부터 골격 시퀀스 상에 그래프트된 특정 자연 발생 항원으로부터의 CDR 시퀀스를 포함하는 발현 벡터를 컨스트럭트함에 의해 특정 자연 발생 항원의 특성을 닮은 재조합 항체를 발현하는 것이 가능하다(즉, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al . (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc . Natl . Acad . See . U.S.A. 86:10029-10033; Winter 의 미국 특허번호 No. 5,225,539, 그리고 Queen 등의 미국 특허번호 Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370. 참고).
따라서, 본 개시 사항의 또 다른 실시형태는 각각 SEQ ID NOs:l 1, 12, 13, 14 및 15, SEQ ID NOs:16, 17, 18, 19 및 20 그리고 SEQ ID NOs:21 , 22, 23, 24 및 25로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRl, CDR2, 및 CDR3 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 각각 SEQ ID NOs:26, 27, 28, 29 및 30, SEQ ID NOs:31, 32, 33, 34 및 35 그리고 SEQ ID NOs:36, 37, 38, 39 및 40으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 CDRl, CDR2, 및 CDR3 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함하는 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분에 속한다. 따라서, 이러한 항체는 모노크로날 항체 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 또는 69A7의 VH 및 VL CDR 시퀀스를 포함하고, 더욱이 이들 항체로부터의 다른 골격 시퀀스도 포함할 수 있다.
이러한 골격 시퀀스는 생식계열 항체 유전자 시퀀스를 포함하는 공공 DNA 데이타베이스 또는 공개된 레퍼런스로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 인간 중 또는 경사슬 가변 영역에 대한 생식계열 DNA 시퀀스는 "VBase" 인간 생식계열 시퀀스 데이타베이스(인터넷 상 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 이용할 수 있음) 뿐 아니라 Kabat, E. A., et al . (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. MoI . Biol. 227:776-798; and Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur . J. Immunol. 24:827-836에서 발견되어 질 수 있고; 이들 각각의 내용은 레퍼런스로 여기에 명백하게 합체되어 진다. 또 다른 예로서, 인간 중 및 경사슬 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 시퀀스는 진뱅크 데이터베이스에서 발견될 수 있다. 예를 들어, HCo7 HuMAb 마우스에서 발견된 다음의 중사슬 생식계열 시퀀스는 다음 진뱅크 수탁번호: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 및 BC070333), 3-33 (NG_0010109 및 NT_024637) 그리고 3-7 (NG_0010109 및 NT_024637)로 이용될 수 있다. 또 다른 예로서, HCo12 HuMAb 마우스에서 발견된 다음의 중사슬 생식계열 시퀀스는 다음 진뱅크 수탁번호: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 및 BC070333), 5-51 (NG_0010109 및 NT_024637), 4-34 (NG_0010109 및 NT_024637), 3-30.3 (CAJ556644) 그리고 3-23 (AJ406678)로 이용될 수 있다.
본 개시사항의 항체에 사용되기 위한 바람직한 골격 시퀀스는 본 발명의 선택된 항체에 의해 사용된 골격 시퀀스에 구조적으로 유사한, 즉 본 발명의 바람직한 모노크로날 항체에 의해 사용된 VH 3-30.3 골격 시퀀스 (SEQ ID NO: 51) 및/또는 VH 3-33 골격 시퀀스 (SEQ ID NO: 52) 및/또는 VH 4-61 골격 시퀀스 (SEQ ID NO: 53) 및/또는 VK L6 골격 시퀀스 (SEQ ID NO: 54) 및/또는 VK Ll8 골격 시퀀스 (SEQ ID NO: 55) 및/또는 VK Ll5 골격 시퀀스 (SEQ ID NO: 56)에 유사한 것들이다. VH CDRl, CDR2, 및 CDR3 시퀀스 그리고 VK CDRl, CDR2, 및 CDR3 시퀀스는 골격 시퀀스가 유도되는 생식계열 이뮤노글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 시퀀스를 가지는 골격 영역 상에 그래프트되어 질 수 있거나, 또는 CDR 시퀀스는 생식계열 시퀀스에 비하여 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함하는 골격 영역 상에 그래프트되어 질 수 있다. 예를 들어, 어떤 경우에는 항체의 항원 결합 능을 유지하거나 또는 고양하기 위하여 골격 영역 내에서 잔기를 변이시키는 것이 유리하다는 것이 밝혀졌다(즉, Queen 등의 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 참고).
다른 타입의 가변 영역 변이는 VH 및/또는 VK CDRl, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 변이하고 이에 의해 대상 항체의 하나 또는 그 이상의 결합 특성(즉, 친화도)을 개선하기 위한 것이다. 사이트-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발은 돌연변이를 도입하기 위해 수행되어 질 수 있고 그리고 항체 결합에 대한 효과 또는 흥미 대상의 다른 기능적 특성이 실시예에 제공되고 여기에서 기술된 것과 같은 생체 외 또는 생체 내 분석법으로 평가될 수 있다. 바람직하기로는 (위에서 기술된 바와 같은) 보전적 변이가 도입된다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결손일 수 있으나, 바람직하기로는 치환이다. 더욱이, 전형적으로 CDR 영역 내에서 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 잔기 이하가 변형된다.
따라서, 다른 실시형태에서, 본 개시사항은 다음을 포함하는 중사슬 가변영 역을 포함하는 분리된 항-CD70 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 제공한다: (a) SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14 및 15로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스, 또는 SEQ ID NOs:11, 12, 13, 14 및 15에 비하여 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 갖는 아미노산 시퀀스를 포함하는 VH CDRl 영역; (b) SEQ ID NOs:16, 17, 18, 19 및 20으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스, 또는 SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19 및 20에 비하여 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 갖는 아미노산 시퀀스를 포함하는 VH CDR2 영역; (c) SEQ ID NOs :21, 22, 23, 24 및 25로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스, 또는 SEQ ID NOs:21, 22, 23, 24 및 25에 비하여 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 갖는 아미노산 시퀀스를 포함하는 VH CDR3 영역; (d) SEQ ID NOs:26, 27, 28, 29 및 30으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스, 또는 SEQ ID NOs:26, 27, 28, 29 및 30에 비하여 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 갖는 아미노산 시퀀스를 포함하는 VK CDR1 영역; (e) SEQ ID N0s:31, 32, 33, 34 및 35로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스, 또는 SEQ ID NOs:31, 32, 33, 34 및 35에 비하여 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 갖는 아미노산 시퀀스를 포함하는 VK CDR2 영역; 및 (f) SEQ ID NOs:36, 37, 38, 39 및 40으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스, 또는 SEQ ID NOs:36, 37, 38, 39 및 40에 비 하여 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 갖는 아미노산 시퀀스를 포함하는 VK CDR3 영역.
본 개시 사항의 가공된 항체는 그 변이가, 예를 들어 항체의 특성을 개선하기 위하여 VH 및/또는 VK 내에 골격 잔기에 대하여 이루어진 것을 포함한다. 전형적으로 이러한 골격 변이는 항체의 면역성을 감소하기 위해 이루어진다. 예를 들어, 하나의 접근법은 상응하는 생식계열 시퀀스에 대해 하나 또는 그 이상의 골격 잔기를 "후위 변이"하는 것이다. 더욱 자세하게는, 체세포돌연변이된 항체는 항체가 유도되어 진 생식계열 시퀀스와 다른 골격 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 잔기는 항체가 유도되어 진 생식계열 시퀀스에 항체 골격 시퀀스를 비교함에 의하여 동정되어 질 수 있다. 이러한 "후위 변이된" 항체는 또한 본 개시된 발명에 포함되어 지는 것으로 의도된다. 예를 들어, 10B4에 대해서, VH의 아미노산 잔기 #2 (FR1 내)는 이소류이신인 반면, 상응하는 VH 3-30.3 생식계열 시퀀스에서의 이 잔기는 발린이다. 골격 영역 시퀀스를 이들의 생식계열 형상으로 되돌리기 위하여, 체세포 돌연변이가, 예를 들어 사이트-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발에 의하여 생식계열 시퀀스에 "후위 변이"되어 질 수 있다 (즉, 10B4의 VH의 FRl의 잔기 2는 이소류이신으로부터 발린으로 "후위 변이"될 수 있음).
다른 예로서, 10B4에 대해서, VH의 아미노산 잔기 #30 (FR1 내)는 글리신인 반면, 상응하는 VH 3-30.3 생식계열 시퀀스에서의 이 잔기는 세린이다. 골격 영역 시퀀스를 이들의 생식계열 형상으로 되돌리기 위하여, 예를 들어 10B4의 VH의 FRl의 잔기 30은 글리신으로부터 세린으로 "후위 변이"될 수 있다.
다른 예로서, 8B5에 대해서, VH의 아미노산 잔기 #24 (FR1 내)는 트레오닌인 반면, 상응하는 VH 3-33 생식계열 시퀀스에서의 이 잔기는 알라닌이다. 골격 영역 시퀀스를 이들의 생식계열 형상으로 되돌리기 위하여, 예를 들어 8B5의 VH의 FRl의 잔기 24는 트레오닌으로부터 알라닌으로 "후위 변이"될 수 있다.
다른 예로서, 8B5에 대해서, VH의 아미노산 잔기 #77 (FR3 내)는 라이신인 반면, 상응하는 VH 3-33 생식계열 시퀀스에서의 이 잔기는 아스파라긴이다. 골격 영역 시퀀스를 이들의 생식계열 형상으로 되돌리기 위하여, 예를 들어 8B5의 VH의 FR3의 잔기 11은 라이신으로부터 아스파라긴으로 "후위 변이"될 수 있다.
다른 예로서, 8B5에 대해서, VH의 아미노산 잔기 #80 (FR3 내)는 세린인 반면, 상응하는 VH 3-33 생식계열 시퀀스에서의 이 잔기는 티로신이다. 골격 영역 시퀀스를 이들의 생식계열 형상으로 되돌리기 위하여, 예를 들어 8B5의 VH의 FR3의 잔기 14는 세린으로부터 티로신으로 "후위 변이"될 수 있다.
다른 예로서, 69 Al에 대해서, VH의 아미노산 잔기 #50 (FR2 내)는 류이신인 반면, 상응하는 VH 4-61 생식계열 시퀀스에서의 이 잔기는 이소류이신이다. 골격 영 역 시퀀스를 이들의 생식계열 형상으로 되돌리기 위하여, 예를 들어 69A7의 VH의 FR2의 잔기 13은 류이신으로부터 이소류이신으로 "후위 변이"될 수 있다.
다른 예로서, 69A7에 대해서, VH의 아미노산 잔기 #85 (FR3 내)는 아르기닌인 반면, 상응하는 VH 4-61 생식계열 시퀀스에서의 이 잔기는 세린이다. 골격 영역 시퀀스를 이들의 생식계열 형상으로 되돌리기 위하여, 예를 들어 69A7의 VH의 FR3의 잔기 18은 아르기닌으로부터 세린으로 "후위 변이"될 수 있다.
다른 예로서, 69A7에 대해서, VH의 아미노산 잔기 #89 (FR3 내)는 트레오닌인 반면, 상응하는 VH 4-61 생식계열 시퀀스에서의 이 잔기는 알라닌이다. 골격 영역 시퀀스를 이들의 생식계열 형상으로 되돌리기 위하여, 예를 들어 69A7의 VH의 FR3의 잔기 22는 트레오닌으로부터 알라닌으로 "후위 변이"될 수 있다.
다른 예로서, 10B4에 대해서, VL의 아미노산 잔기 #46 (FR2 내)는 페닐알라닌인 반면, 상응하는 VL L18 생식계열 시퀀스에서의 이 잔기는 류이신이다. 골격 영역 시퀀스를 이들의 생식계열 형상으로 되돌리기 위하여, 예를 들어 10B4의 VL의 FR2의 잔기 12는 페닐알라닌으로부터 류이신으로 "후위 변이"될 수 있다.
다른 예로서, 69A7에 대해서, VL의 아미노산 잔기 #49 (FR2 내)는 페닐알라닌인 반면, 상응하는 VL L6 생식계열 시퀀스에서의 이 잔기는 티로신이다. 골격 영 역 시퀀스를 이들의 생식계열 형상으로 되돌리기 위하여, 예를 들어 69A7의 VL의 FR2의 잔기 15는 페닐알라닌으로부터 티로신으로 "후위 변이"될 수 있다.
골격 변이의 다른 타입은 T 세포 항원결정인자를 제거하고 이에 의해 항체의 잠재적인 면역원성을 감소하기 위해 골격 영역 내에, 더욱이는 하나 또는 그 이상의 CDR 영역 내에 하나 또는 그 이상의 잔기를 돌연변이하는 것을 포함한다. 이 접근법은 또한 "탈면역화반응"으로 언급되고 그리고 Carr 등에 의한 미국 특허 공개번호 20030153043에 더 자세하게 기술되어 있다.
본 개시사항의 가공된 항체는 또한 항체 상에 T 세포 항원결정인자의 상호작용을 개변하는 아미노산 변이를 통해 면역학적 반응을 증진 또는 감소하기 위한 아미노산 잔기를 형성하는 것들을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,835,550; 6,897,049 및 6,936249 참고).
골격 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변이에 부가 또는 대안적으로, 본 개시 사항의 항체는 Fc 영역 내에 변이를 포함하도록, 전형적으로는, 혈청 반감기, 보체고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존성 세포의 세포독성과 같은 항체의 하나 또는 그 이상의 기능적 특성을 변형하기 위해 가공되어 질 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체는 화학적으로 수사되거나(즉, 하나 또는 그 이상의 화학적인 부분이 항체에 부착되어 질 수 있음) 또는 그의 글리코실화반응을 변형하고 다시 항체의 하나 또는 그 이상의 기능적 특성을 변형하기 위해 수사되어 질 수 있다. 각각의 이들 항체는 아래에 보다 자세하게 기술될 것이다. Fc 영역에서 잔기의 번호 부여는 Kabat의 EU 인덱스의 것이다.
일 실시형태에 있어서, CHl의 힌지 영역은 힌지 영역의 시스테인 잔기의 수가 변형되도록, 즉 증가 또는 감소되도록 수사된다. 이 접근법은 Bodmer 등의 미국 특허번호 No. 5,677,425에 다 자세하게 기술되어 있다. CHl의 힌지 영역에서의 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어 중 및 경사슬의 조합을 용이하게 하거나 또는 항체의 안전성을 증가 또는 감소되도록 변형된다.
다른 실시형태에 있어서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소하도록 변이된다. 보다 자세하게는, 하나 또는 그 이상의 아미노산 돌연변이가, 항체가 본래의 Fc-힌지 도메인 스타필로코실 단백질 A (SpA) 결합에 대해 손상된 SpA를 갖도록 Fc-힌지 분획의 CH2-CH3 도메인 계면 영역 안으로 도입된다. 이 접근법은 Ward 등의 미국 특허번호 No. 6,165,745에 다 자세하게 기술되어 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 항체는 항체의 생물학적 반감기를 증가하도록 변이된다. 다양한 접근법들이 가능하다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 다음의 돌연변이가 도입될 수 있다: Ward에 의한 미국 특허번호 No. 6,277,375호에 기술된 바와 같은 T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가하기 위해, Presta 등에 의한 미국 특허번호 No. 5,869,046 및 6,121,022에 기술된 바와 같이, 항체는 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 두 개의 루프로부터 취해진 샐비지 리셉터 결합 항원결정인자를 포함하도록 CHl 또는 CL 영역 내에서 변형되어 질 수 있다.
더욱이 다른 실시형태에서, Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 대체함에 의해 변형되어 항체의 이펙터 작용을 변형한다. 예를 들 어, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가, 항체가 이펙터 리간드에 대해서는 변형된 친화도를 가지지만 모체 항체의 항원-결합 능을 보유하도록 다른 아미노산 잔기로 치환되어 질 수 있다. 친화도가 변형된 이펙터 리간드는, 예를 들어 보체의 Fc 수용체 또는 Cl 성분일 수 있다. 이 접근법은 Winter 등에 의한 미국 특허번호 Nos. 5,624,821와 5,648,260 양자에 보다 자세하게 기술되어 있다.
다른 예에서, 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가, 항체가 변형된 CIq 결합 및/또는 감소된 또는 소멸된 보체 의존성 세포독성(CDC)을 가지도록 다른 아미노산 잔기로 대체되어 질 수 있다. 이 접근법은 Idusogie 등에 의한 미국 특허번호 No. 6,194,551에 보다 자세하게 기술되어 있다.
또 다른 예에서, 아미노산 위치 231 및 239 내의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 변형되고 이에 의해 여섯 개의 보체에 대한 항체의 능력을 변형한다. 이 접근법은 Bodmer 등에 의한 PCT 공개공보 WO 94/29351에 보다 자세하게 기술되어 있다.
더욱이 또 다른 예에서, Fc 영역은 다음의 위치에 하나 또는 그 이상의 아미노산을 수사함에 의하여 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가하기 위한 및/또는 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC)을 조절하기 위한 항체의 능력을 증가하기 위해 수사되어 질 수 있다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 이 접근법은 Presta 등에 의한 PCT 공개공보 WO 00/42072에 보다 자세하게 기술되어 있다. 더욱이, FcγRl, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgGl 상의 결합 사이트가 지도로 그려지고 그리고 개선된 결합을 갖는 변형체가 기술되어 져 있다 (Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol . Chem. 276:6591-6604 참고). 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339에 대한 특정 돌연변이가 FcγRIII에 대한 결합을 개선하기 위해 나타나 진다. 부가적으로, 다음의 조합 돌연변이가 FcγRIII 결합을 개선하기 위해 나타나 진다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A.
여전히 다른 실시형태에서는 항체의 글리코실화반응이 수사된다. 예를 들어, 글리코실화된 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체는 글리코실화반응을 결한다). 글리코실화반응은, 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화도를 증진하기 위해 변형되어 질 수 있다. 이러한 카르보하이드레이트 변이는, 예를 들어 항체 시퀀스 내의 글리코실화반응의 하나 또는 그 이상의 사이트를 변형함에 의해 성취되어 질 수 있다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 가변 영역 골격 글리코실화반응 사이트의 제거를 초래하고 이에 의하여 그 사이트에서의 글리코실화반응을 제거하는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환이 만들어질 수 있다. 이러한 글리코실화반응은 항원에 대한 항체의 친화도를 증가할 수 있다. 이 접근법은 Co 등에 의한 미국 특허번호 Nos. 5,714,350 및 6,350,861에 보다 자세하게 기술되어 있다.
부가적으로 또는 대안적으로, 증가된 이분할 GlcNac 구조를 갖는 항체 또는 양이 감소된 퓨코실 잔기를 갖는 히포퓨코실화 항체와 같이 변형된 타입의 글리코실화반응을 가지는 항체가 형성되어 질 수 있다. 이러한 변형된 글리코실화반응 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증진하기 위해 입증되어져 있다. 이런 카보하이드레이트 변이는, 예를 들어 변형된 글리코실화반응 머시너리를 갖는 숙주세포에 항체를 발현함에 의해 성취되어 질 수 있다. 변형된 글리코실화반응 머시너리를 갖는 세포들은 이 기술분야에 잘 기술되어져 있고 그리고 여기에 본 개시사항의 재조합 항체를 발현하고 이에 의해 변형된 글리코실화반응을 갖는 항체를 생산하기 위해 숙주세포로 사용되어 질 수 있다. 예를 들어, 세포 라인 Ms704, Ms705, 및 Ms709는 이 Ms 704, Ms705, 및 Ms709 셀 라인에서 발현된 항체가 그들의 카보하이드레이트 상에 퓨코스를 결하도록 퓨코실트랜스퍼라제 유전자인 FUT8 (알파 (1,6) 퓨코실트랜스퍼라제)를 결한다. Ms704, Ms705, 및 Ms709 FUT8-/- 셀 라인들은 두 개의 대체 벡터를 사용하여 CHO/DG44 세포 내에 FUT8 유전자의 타겟된 분열에 의해 만들어 진다(Yamane 등에 의한 미국 특허 공개 번호 No.20040110704 및 Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). 또 다른 예로서, Hanai 등에 의한 EP 1,176,195호는 그 세포 라인에서 발현된 항체가 알파 1,6 결합-관련 효소를 감소하거나 또는 제거함에 의해 히포퓨코실화반응을 나타내도록 퓨코실 트랜스퍼라제를 코드하는 기능적으로 파열된 FUT8 유전자를 갖는 세포 라인을 기술하고 있다. Hanai 등은 또한, 예를 들어 랫트 미엘로마 세포 라인 YB2/0 (ATCC CRL 1662)과 같 이 항체의 Fc 영역에 결합하거나 또는 효소 활성을 갖지 않는 N-아세틸글루코사민에 퓨코스를 부가함에 대한 낮은 효소 활성을 갖는 셀 라인을 기술하고 있다. Presta에 의한 PCT 공개공보 WO 03/035835는 Asn(297)-링커된 탄수화물에 대해 퓨코스가 부착하는 감소된 능력을 갖을 뿐 아니라 그 숙주 세포에서 발현된 항체의 히포글리코실화 반응에서의 결과인 CHO 세포 라인인, Lee 13 세포를 기술하고 있다(또한, Shields, R.L. et al (2002) J. Biol . Chem . 277:26733-26740 참고). Umana 등에 의한 PCT 공개공보 WO 99/54342호는 가공된 세포 라인에서 발현된 항체가 항체의 증가된 ADCC 활성을 초래하는 증가된 이분 GlcNac 구조를 나타내도록 당단백질-수사 글리코실 크랜스퍼라제(즉, 베타 (l,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 가공된 세포 라인을 기술한다(또한, Umana et al. (1999) Nat . Biotech . 17:176-180 참고). 대안적으로, 항체의 퓨코스 잔기는 퓨코시다제 효소를 사용하여 단리하여 버린다. 예를 들어, 퓨코시다제 알파-L-퓨코시다제는 항체로부터 퓨코스 잔기를 제거한다(Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23).
본 발명에서 상찰된 여기에서의 항체의 또 다른 변이는 PEG화반응이다. 항체는, 예를 들어 항체의 생물학적(즉, 혈청) 반감기를 증가하기 위해 PEG화되어 질 수 있다. 항체를 PEG화하기 위하여, 항체 또는 이들의 분획이 전형적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 반응성 에스테르 또는 알데하이드 유도체류와 같은 폴리에틸렌 글리콜과, 하나 또는 그 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 분획에 부착되는 조건 하에서 반응된다. 바람직하기로는, PEG화반응은 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응 성 수용성 폴리머)와 아실화반응 또는 알킬화반응을 통해 수행되어 진다. 여기서 사용된 것으로, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 모노 (Cl-ClO) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드와 같은 다른 단백질을 유도하기 위해 사용되어 지는 PEG의 어떤 형태도 포함하는 것으로 의도된다. 어떤 실시형태에 있어서, PEG화된 항체는 글리코실화 항체이다. 단백질을 PEG화하기 위한 방법은 이 기술 분야에 알려져 있고 그리고 본 발명의 항체에 대하여 적용되어 질 수 있다. 예를 들어, Nishimura 등에 의한 EP 0 154 316 및 Ishikawa 등에 의한 EP 0401 384 참고.
항체 물리적 특성
본 개시사항의 항체는 더욱이 항-CD19 항체의 다양한 물리적 특성에 의해 특징지어 질 수 있다. 이들 물리적 특성에 기초하여 항체의 다른 클라스를 검출하고 및/또는 분화하기 위해 다양한 어세이가 사용될 수 있다.
어떤 실시형태에서, 본 발명의 개시사항의 항체는 경 또는 중사슬 가변 영역 내에 하나 또는 그 이상의 글리코실화반응 사이트를 포함할 수 있다. 가변 영역 내에 하나 또는 그 이상의 글리코실화반응 사이트의 존재는 변형된 항원 결합에 기한 항체의 pK의 변형 또는 항체의 증가된 면역원성을 초래할 수 있을 것이다 (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA and Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099- 109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452- 7: Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706). 글리코실화반응은 N-X-S/T 시퀀스를 포함하는 모티프에서 일어나는 것이 알려져 있다. 가변 영역 글리코실화반응은 Fab를 생산하는 항체를 단리하는 글리코블럿(Glycoblot) 어세이를 사용하여 시험되어 질 수 있고, 그런 다음 과옥소산염 산화 및 시프 염기 형성을 측정하는 어세이를 사용하여 글리코실화반응에 대해 시험한다. 대안적으로, 가변 영역 글리코실화반응은 Fab로부터 당류를 단당류로 단리하고 개개의 당류 함량을 분석하는 디오넥스 라이트 크로마토그라피(Dionex-LC)를 사용하여 시험되어 질 수 있다. 어떤 경우에는, 가변 영역 글리코실화반응을 포함하지 않는 항-CD 19 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이것은 가변 영역에 글리코실화반응 모티프를 포함하지 않는 항체를 선택함에 의해 또는 이 기술 분야에 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 글리코실화반응 모티프 내의 잔기를 변이함에 의해 달성되어 질 수 있다.
바람직한 실시형태에서는, 본 개시사항의 항체는 아스파라긴 아이소머리즘 사이트를 포함하지 않는다. 탈아미드화 또는 이소아스파르트산 효과가 각각 N-G 또는 D-G 시퀀스 상에서 일어날 수 있을 것이다. 탈아미드화 또는 이소아스파르트산 효과는 주 사슬 보다는 곁 사슬 카르복시 말단을 비꼬는 구조로 함에 의해 항체의 안전성을 감소하는 아스파르트산의 창제를 초래한다. 아스파르트산의 창제는 아스파르트산에 대한 시험을 위해 역상 HPLC를 사용하는 이소-퀀트 어세이를 사용하여 측정되어 질 수 있다.
각 항체는 유일한 등전점(pI)을 가질 것이지만, 일반적으로 항체는 6 내지 9.5 사이의 pH 범위로 될 것이다. IgGl 항체에 대한 pI는 전형적으로 7 내지 9.5 사이의 pH 범위로 될 것이고, IgG4 항체에 대한 pI는 전형적으로 6 내지 8 사이의 pH 범위로 될 것이다. 항체는 이 범위 외로 되는 pI를 가질 것이다. 비록 효과가 일반적으로 알려지지는 않았지만, 정상 범위 외의 pI를 갖는 항체는 접혀지지 않고 생체 내의 조건에서 불안정성을 가질 수 있다는 숙고가 있다. 등전점은 pH 기울기를 만들고 증진된 정확성을 위해 레이저 포커싱을 이용할 수 있는 캐필러리 이소일렉트릭 포커싱 어세이를 사용하여 시험되어 질 수 있다 (Janini et al (2002) Electrophoresis 23:1605-11; Ma et al. (2001) Chromatographia 53:S75-89; Hunt et al (1998) J Chromatogr A 800:355-67). 어떤 경우에는, 정상 범위로 되는 pI 값을 포함하는 항-CD 19 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이것은 정상 범위로 되는 pI를 갖는 항체를 선택함에 의하거나 또는 이 기술분야에 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 하전된 표면 잔기를 변이함에 의해 달성될 수 있다.
각 항체는 열적 안정성을 나타내는 용융 온도를 가질 것이다 (Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). 보다 높은 열적 안정성이 생체 내에서 보다 큰 전체 항체 안정성을 나타낸다. 항체의 용융점은 분화적 스캐닝 칼로리메트리를 사용하여 측정되어 질 수 있다 (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52). TM1은 항체의 초기 비접힘의 온도를 나타낸다. TM2는 항체의 완전 비접힘의 온도를 나타낸다. 일반적으로, 본 개시사항의 항체의 TM1은 60℃ 보다 크고, 바람직하기로는 65℃ 보다 크며, 더욱 바람직하기로는 70℃ 보다 큰 것이 바람직하다. 대안적으로, 항체의 열적 안정성은 원편광 이색성 분광분석을 사용하여 측정될 수 있다 (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).
바람직한 실시형태에서, 급속하게 분해되지 않는 항체가 선택되어 진다. 항-CD 19 항체의 분획화는 이 기술분야에서 잘 이해되어 진 것과 같은 캐필러리 일렉트로포르시스 (CE) 및 MALDI-MS를 사용하여 측정되어 질 수 있다 (Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).
다른 바람직한 실시형태에서, 최소한의 응집효과를 가지는 항체가 선택된다. 응집은 원하지 않는 면역 반응 및/또는 변형되거나 바람직하지 않은 약리운동학적 특성을 촉발할 수 있다. 일반적으로 25% 또는 그 이하, 바람직하기로는 20% 또는 그 이하, 보다 바람직하기로는 15% 또는 그 이하, 더 보다 바람직하기로는 10% 또는 그 이하 그리고 더 더욱 보다 바람직하기로는 5% 또는 그 이하의 응집을 갖는 항체가 허용가능할 수 있다. 응집은 사이즈-엑스클루젼 컬럼 (SEC) 고수행성 액체 크로마토그라피(HPLC), 및 단량체, 이량체, 삼량체 또는 다량체를 동정하기 위한 광산란을 포함하는 이 기술분야에서 잘 알려진 몇 가지의 기술에 의하여 측정될 수 있다.
항체를 가공하는 방법
위에서 기술된 바와 같이, 여기에 기술된 VH 및 VK 시퀀스를 갖는 항-CD70 항체는 여기에 부착된 VH 및/또는 VK 시퀀스, 또는 불변 영역(들)을 변이함에 의해 신규한 항-CD70 항체를 만들기 위하여 사용되어 질 수 있다. 따라서, 본 개시사항 의 또 다른 측면에 있어서는, 본 개시사항의 항-CD70 항체, 즉 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 또는 69A7의 구조적 특성은, 인간 CD70에 결합과 같은 본 개시사항의 항체의 적어도 하나의 기능적 특성을 보유하는 구조적으로 관련된 항-CD70 항체를 만들기 위하여 사용된다. 예를 들어, 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 또는 69A7이나 이들의 변이체의 하나 또는 그 이상의 CDR 영역은, 상술한 바와 같이 본 발명의 부가적으로, 재조합적으로-가공된 항-CD70 항체를 만들기 위하여 공지된 골격 영역 및/또는 다른 CDRs과 재조합적으로 조합되어 질 수 있다. 다른 타입의 변이는 이전 부분에서 기술된 것을 포함한다. 가공하는 방법에 대하여 시발 물질로는 여기에 제공된 하나 또는 그 이상의 VH 및/또는 VK 시퀀스 또는 하나 또는 그 이상의 이들의 CDR 영역이다. 가공된 항체를 만들기 위하여서, 실질적으로 여기에 제공된 하나 또는 그 이상의 VH 및/또는 VK 시퀀스 또는 하나 또는 그 이상의 이들의 CDR 영역을 갖는 항체를 제조(즉, 단백질로서 발현)하는 것이 필요하지는 않다. 더욱이, 시퀀스(들)에 포함된 정보는 오리지날 시퀀스(들)로부터 유래된 "제이 세대" 시퀀스(들)을 만들기 위한 시발 물질로서 사용되고 그런 다음 "제이 세대" 시퀀스(들)은 준비되고 단백질로 발현된다.
따라서, 또 다른 실시형태에서는, 본 개시사항은 다음을 포함하는 항-CD70 항체를 제조하는 방법을 제공한다:
(a) 다음을 제공: (i) SEQ ID NOs:11, 12, 13, 14 및 15로 구성된 군으로부터 선택된 CDRl 시퀀스, SEQ ID NOs:16, 17, 18, 19 및 20으로 구성된 군으로부터 선택된 CDR2 시퀀스, 및/또는 SEQ ID NOs:21, 22, 23, 24 및 25로 구성된 군으로부터 선택된 CDR3 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역 항체 시퀀스; 및/또는 (ii) SEQ ID NOs:26, 27, 28, 29 및 30으로 구성된 군으로부터 선택된 CDRl 시퀀스, SEQ ID NOs:31, 32, 33, 34 및 35로 구성된 군으로부터 선택된 CDR2 시퀀스, 및/또는 SEQ ID NOs:36, 37, 38, 39 및 40으로 구성된 군으로부터 선택된 CDR3 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역 항체 시퀀스;
(b) 적어도 하나의 변형된 항체 시퀀스를 만들기 위하여 중사슬 가변영역 항체 시퀀스 및/또는 경사슬 가변영역 항체 시퀀스 내에 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변형; 및
(c) 변형된 항체 시퀀스를 단백질로 발현하는 것.
표준 분자 생물학 기술이 변형된 항체 시퀀스를 제조하고 발현하기 위하여 사용되어 질 수 있다.
바람직하기로는, 변형된 항체 시퀀스(들)에 의해 코드된 항체는 여기에 기술된 항-CD70 항체의 기능적 특성의 하나 또는 몇몇 또는 전부를 보유하는 것으로, 이 기능적 특성은, 여기에 한정되는 것은 아니지만 CD70에 특이적으로 결합하는 것을 포함한다.
변형된 항체의 기능적 특성은 이 기술분야에서 이용할 수 있는 및/또는 실시예에서 제시된 것(즉, 유동세포분석법, 결합 분석법)과 같은 여기에서 기술된 표준 분석법을 사용하여 평가되어 질 수 있다.
본 개시사항의 항체를 가공하는 방법의 실시형태에 있어서, 돌연변이가 시퀀 스를 코드하는 항-CD70 항체의 전부 또는 일부를 따라 랜덤하게 또는 선택적으로 도입되어 질 수 있고, 얻어진 변이된 항-CD70 항체는 결합 활성 및/또는 여기에 기술된 다른 기능적 특성에 대해 스크린되어 질 수 있다. 변이의 방법은 이 기술 분야에 기술되어 있다. 예를 들어, Short에 의한 PCT 공개공보 WO 02/092780은 포화 돌연변이유발, 합성적 결찰 어셈블리 또는 이들의 조합을 사용하는 항체 돌연변이를 유발하고 스크리닝하는 방법을 기술하고 있다. 대안적으로, Lazar 등에 의한 PCT 공개공보 WO 03/074679는 항체의 물리 화학적 특성을 최적화하기 위하여 컴퓨터화된 스크리닝 방법을 사용하는 방법을 기술하고 있다.
본 개시사항의 항체를 코드하는 핵산 분자
본 개시사항의 다른 측면은 본 발명의 항체를 코드하는 핵산 분자에 관한 것이다. 이 핵산은 모든 세포에서, 세포 용융물에, 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 정제 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 다른 세포성 구성분이나 다른 오염물질, 즉 다른 세포성 핵산이나 단백질로부터, 알카린/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그라피, 아가로스 겔 일렉트로포르시스 및 이 분야에 잘 알려진 다른 방법을 포함하는 표준 기술에 의해 정제되어 질 때, "분리된" 또는 "실질적으로 순수"하게 된다. 참고; F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. 본 개시사항의 핵산은, 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고 그리고 고유의 시퀀스를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 개시사항의 핵산은 표준 분자생물학 기술을 사용하여 얻어질 수 있다. 하이브리도마(즉, 아래에 보다 자세히 기술되어 지는 바와 같이 인간 이뮤노글로불린 유전자를 담지하는 형질전환 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현된 항체에 대해, 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 중 및 경사슬을 코드하는 cDNAs는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의하여 수득되어 질 수 있다. 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리로부터 얻어진 항체(즉, 파아지 디스플레이 기술을 사용하여)에 대해서는, 항체를 코드하는 핵산은 라이브러리로부터 회수되어 질 수 있다.
본 개시사항의 바람직한 핵산 분자는 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 또는 69A7 모노크로날 항체의 VH 및 VL 시퀀스를 코드하는 것이다. 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 및 69A7의 VH 시퀀스를 코드하는 DNA 시퀀스는 각각 SEQ ID NOs:41, 42, 43, 44 및 45에 나타나 있다. 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 및 69A7의 VL 시퀀스를 코드하는 DNA 시퀀스는 각각 SEQ ID NOs:46, 47, 48, 49 및 50에 나타나 있다.
일단 VH 및 VL 부분을 코드하는 DNA 분획이 얻어지면, 이들 DNA 분획은, 예를 들어 가변 영역 유전자를 완전-길이의 항체 사슬 유전자로, Fab 분획 유전자로 또는 scFv 유전자로 전환하는 표준 재조합 DNA 기술에 의해 조작되어 질 수 있다. 이들 조작에 있어서, VL- 또는 VH-코드하는 DNA 분획은 항체 불변 영역 또는 가변 링커와 같은 다른 단백질을 코드하는 또 다른 DNA 분획에 조작적으로 연결되어 진다. 여기서 사용된 것으로 용어 "조작적으로 연결된,"은 두 개의 DNA 분획이 이 두 개의 DNA 분획에 의해 코드된 아미노산 시퀀스가 프레임 안에 남아 있도록 연결되어진 것을 의미하기 위한 것이다.
VH 영역을 코드하는 분리된 DNA는 중사슬 불변 영역 (CHl, CH2 및 CH3)을 코드하는 다른 DNA 분자에 VH-코드하는 DNA를 조작적으로 연결함에 의해 완전-길이의 중사슬 유전자로 전환되어 질 수 있다. 인간 중사슬 불변 영역 유전자의 시퀀스는 이 기술 분야에 잘 알려져 있고(즉, Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참고), 그리고 이들 영역을 포괄하는 DNA 분획은 표준 PCR 증폭에 의하여 얻어질 수 있다. 중사슬 불변 영역은 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하기로는 IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4 불변 영역이다. Fab 분획 중사슬 유전자에 대하여, VH-코드하는 DNA는 단지 중사슬 CHl 불변 영역만을 코드하는 다른 DNA 분자에 조작적으로 연결되어 질 수 있다.
VL 영역을 코드하는 분리된 DNA는 경사슬 불변 영역인 CL을 코드하는 다른 DNA 분자에 VL-코드하는 DNA를 조작적으로 연결함에 의해 완전-길이의 경사슬 유전자 (뿐 아니라 Fab 경사슬 유전자)로 전환되어 질 수 있다. 인간 경사슬 불변 영역 유전자의 시퀀스는 이 기술 분야에 잘 알려져 있고(즉, Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참고), 그리고 이들 영역을 포괄하는 DNA 분획은 표준 PCR 증폭에 의하여 얻어질 수 있다. 경사슬 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하기로는 카파 불변 영역이다.
scFv 유전자를 제작하기 위하여, VH- 및 VL-코드하는 DNA 분획이 가변 링커를 코드하는, 즉 아미노산 시퀀스 (GIy4 -Ser)3를 코드하는 다른 분획에, VH 및 VL 시퀀스가 가변 링커에 의하여 연결된 VL 및 VH 영역을 갖는 접촉성 단일-사슬 단백질로 발현되어 질 수 있도록 조작적으로 연결되어 진다 (즉, Bird et al (1988) Science 242:423-426; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al, (1990) Nature 348:552-5541 참고)
본 개시사항의 모노크로날 항체의 생산
본 개시사항의 모노크로날 항체 (mAbs)는 통상적인 모노크로날 항체 방법론, 즉 콜러와 밀스타인(Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495)의 표준 체세포 하이브리드화반응 기술을 포함하는 다양한 기술에 의하여 생산되어 질 수 있다. 비록 체세포 하이브리드화반응 절차가 바람직하지만, 원론적으로는 모노크로날 항체를 생산하기 위한 다른 기술, 즉 B 림프구의 바이러스의 또는 발암의 형질전환이 채용되어 질 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위한 바람직한 동물 계는 뮤어라인 계이다. 마우스에서 하이브리도마 생산은 아주 잘 확립된 절차이다. 용융을 위해 면역화된 비장세 포의 분리를 위한 면역화반응 프로토콜 및 기술은 이 분야에 잘 알려져 있다.용융 파트너(즉, 뮤어라인 미엘로마 세포) 및 용융 과정 또한 잘 알려져 있다.
본 개시사항의 키메르 또는 인체적응된 항체는 상술된 바와 같이 제조된 뮤어라인 모노크로날 항체의 시퀀스에 기하여 제조되어 질 수 있다. 중 및 경사슬 이뮤노글로불린을 코드하는 DNA는 표준 분자생물학 기술을 사용하여 흥미 대상의 뮤어라인 하이브리도마로부터 수득되어 질 수 있고 비-뮤어라인(즉, 인간) 이뮤노글로불린 시퀀스를 포함하도록 가공되어 질 수 있다. 예를 들어, 키메르 항체를 만들기 위해, 뮤어라인 가변 영역들은 이 분야의 공지된 방법을 사용하여 인간 불변 영역들에 연결되어 질 수 있다 (즉, Cabilly 등의 미국 특허번호 No.4,816,567 참고). 인체적응된 항체를 만들기 위해, 뮤어라인 CDR 영역들이 이 분야의 공지된 방법을 사용하여 인간 골격 영역 안으로 삽입되어 질 수 있다 (즉, Winter의 미국 특허번호 No. 5,225,539 및 Queen 등의 미국 특허번호 Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 참고).
바람직한 실시형태에서, 본 개시사항의 항체는 인간 모노크로날 항체이다. CD70에 대향하는 이러한 인간 모노크로날 항체는 마우스 계 외에 인간 면역계의 일부를 담지하는 형질전환 또는 염색체전환 마우스를 사용하여 생산되어 질 수 있다. 이들 형질전환 또는 염색체전환 마우스는 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스®로 여기서 언급된 마우스를 포함하고, 그리고 "인간 Ig 마우스"로 여기서 집합적으로 언급되어 진다.
HuMAb 마우스® (Medarex, Inc.)는 내재성 μ 및 κ 사슬 유전자좌들을 비활 성화하는 타겟된 돌연변이와 함께 비재배열된 인간 중사슬 (μ 및 γ) 및 κ 경사슬 이뮤노글로불린 시퀀스를 코드하는 인간 이뮤노글로불린 유전자의 미니 유전자좌를 포함한다 (즉, Lonberg, et al . (1994) Nature 368(6474): 856- 859 참고). 따라서, 마우스는 면역화반응에 반응하여 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고 도입된 인간 중 및 경사슬 전환유전자는 클래스 스윗칭 및 체세포돌연변이를 당하여 높은 친화성 인간 IgGκ 모노크로날을 발생한다 (Lonberg, N. et al. (1994), supra ; reviewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern . Rev . Immunol. 13: 65-93, 및 Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann . NY . Acad . Sci . 764:536-546 참고). HuMab 마우스의 제조 및 용도와 이들 마우스에 의해 수행된 게놈의 변이는 Taylor, L. et al . (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al . (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. et al . (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; 및 Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851의 문헌에 더 자세하게 기술되어 있으며, 이들의 모든 내용은 그 전체로서 레퍼런스에 의해 특징적으로 합체되어 진다. 더욱이, Lonberg 및 Kay의 미국 특허번호 Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429; Surani 등의 미국 특허번호 No. 5,545,807; Lonberg 및 Kay의 PCT 공개공보 Nos. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 및 WO 99/45962,; 그리고 Korman 등의 PCT 공개공보 No. WO 01/14424 참고.
또 다른 실시형태에서, 본 개시사항의 인간 항체는 인간 중사슬 전환유전자 및 인간 경사슬 전환염색체를 담지하는 마우스와 같이 전환유전자 및 전환염색체 상에 인간 이뮤노글로불린 시퀀스를 담지하는 마우스를 사용하여 향상되어 질 수 있다. 여기서는 "KM 마우스®"로 언급되는 이런 마우스는 Ishida 등의 PCT 공개공보 WO 02/43478에 자세하게 기술되어 있다.
더 더욱이, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 전환유전자의 동물계는 이 분야에서 이용될 수 있는 것이고 그리고 본 개시사항의 항-CD70 항체를 상승하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스 (Abgenix, Inc.)로 언급된 대안적인 전환유전자의 계가 사용될 수 있고; 이러한 마우스는, 예를 들어 Kucherlapati 등의 미국 특허번호 Nos. 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 및 6,162,963에 기술되어 있다.
더욱이, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 전환염색체의 동물계는 이 분야에서 이용될 수 있는 것이고 그리고 본 개시사항의 항-CD70 항체를 상승하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"로 언급된 인간 중사슬 전환염색체 및 인간 경사슬 전환염색체 양자를 담지한 마우스가 사용될 수 있고; 이러한 마우스는, Tomizuka et al (2000) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 97:722-727에 기술 되어 있다. 또 다른 예로서, 인간 중사슬 및 인간 경사슬 전환염색체를 담 지한 카우는 이 기술분야(Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894)에 기술되어 있고 그리고 본 발명의 항-CD70 항체를 상승하기 위하여 사용될 수 있다.
본 개시사항의 인간 모노크로날 항체는 또한 인간 이뮤노글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파아지 디스프레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체를 분리하기 위한 이런 파아지 디스프레이 방법은 이 기술분야에 확립되어 있다. 예를 들어, Ladner 등의 미국 특허번호 Nos. 5,223,409; 5,403,484; 및 5,571,698; Dower 등의 미국 특허번호 Nos. 5,427,908 및 5,580,717; McCafferty 등의 미국 특허번호 Nos. 5,969,108 및 6,172,197; 그리고 Griffiths 등의 미국 특허번호 Nos. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081 참고.
본 개시사항의 인간 모노크로날 항체는 또한 인간 항체 반응이 면역화반응에 의해 발생될 수 있도록 인간 면역 세포가 재구성되어 진 SCID 마우스를 사용하여 제조되어 질 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어 Wilson 등의 미국 특허번호 Nos. 5,476,996 및 5,698,767에 기술되어 있다.
인간 Ig 마우스의 면역화반응
인간 Ig 마우스가 본 개시사항의 인간 항체를 상승하기 위해 사용될 때, 이러한 마우스는, Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al . (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; 그리고 PCT 공개공보 WO 98/24884 및 WO 01/14424에 기술된 바와 같이 CD70 항원 및/또는 재조합 CD70, 또 는 CD70 용융 단백질의 정제된 또는 풍부한 제제로 면역화될 수 있다. 바람직하기로는, 마우스는 제일의 주입 후 6-16 주령의 것일 것이다. 예를 들어, CD70 항체의 정제되거나 재조합 제제(5-50 μg)가 복강 내로 인간 Ig 마우스를 면역화하기 위해 사용될 수 있다.
CD70에 대해 완전하게 인간 모노크로날 항체를 발생하기 위한 자세한 과정은 아래 실시예 1에 기술되어 있다. 다양한 항원으로의 누적적 경험은, 불완전 프로인드 어쥬번트에 항원으로 매 격주로 IP 면역화(전체 여섯 번 까지)에 따른 완전 프로인드 어쥬번트에 항원으로 복강 내 (IP)로 최초로 면역화될 때 형질전환 마우스가 반응하는 것을 보여준다. 그러나, 프로인드 외에 다른 어쥬번트가 또한 유효한 것으로 알려져 있다. 부가하여, 어쥬번트가 없는 전 세포가 아주 면역성인 것으로 알려져 있다. 면역 반응은, 예를 들어 리트로오비탈의 출혈에 의해 얻어지는 플라즈마 샘플로 면역화 프로토콜의 경로 상에서 모니터될 수 있다. 이 플라즈마는 ELISA에 의해 선별될 수 있고 그리고 충분한 역가의 항-CD70 인간 이뮤노글로불린을 갖는 마우스가 (실시예 1에 기술된 바와 같이) 용융을 위해 사용될 수 있다. 마우스는 희생하고 지라를 제거하기 3일 전 정맥주사로 항원으로 부양되어 질 수 있다. 각 면역화반응에 대해 2-3 용융이 수행되어 지는 것이 필요할 수 있다고 기대된다. 6 내지 24 마우스가 각 항원에 대해 전형적으로 면역화된다. 통상적으로 HCo7 및 HCol2 스트레인 양자가 사용된다. HCo7 및 HCol2 마우스 스트레인의 발생은 미국특허 No. 5,770,429 및 PCT 공개공보 WO 01/09187의 실시예 2에 각각 기술되어 있다. 부가하여, HCo7 및 HCol2 전환유전자 양자가 두 개의 다른 인간 중사슬 전환유전자(HCo7/HCol2)를 갖는 단일 마우스 내로 함께 증식되어 질 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, KM 마우스® 스트레인이 PCT 공개공보 WO 02/43478에서 기술된 바와 같이 사용되어 질 수 있다.
본 개시사항의 인간 모노크로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 발생
본 개시사항의 인간 모노크로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 발생하기 위하여, 면역된 마우스로부터의 지라세포 및/또는 림프절 세포가 분리될 수 있고 그리고 마우스 미엘로마 셀 라인과 같은 적절한 불멸화된 셀 라인에 용융될 수 있다. 얻어진 하이브리도마는 항원-특이적 항체의 생산을 위해 선별될 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터 지라 림프구의 단일 세포 현탁액은 50% PEG로 P3X63-Ag8.653 비분비 마우스 미엘로마 세포(ATCC, CRL 1580)의 일-여섯 번째 수에 용융될 수 있다. 대안적으로, 면역화된 마우스로부터의 지라 림프구의 단일 세포 현탁이 사이토 펄스 라지 챔버 셀 퓨젼 일렉트로플레이터(Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD)를 사용하여, 전자용융 방법에 기초된 전자장을 사용하여 용융될 수 있다. 세포는 L-글루타민 및 소디움 피브레이트 (Mediatech, Inc., Herndon, VA)를 가지고 더욱이 20% 송아지 혈 (Hyclone, Logan, UT)청, 18% P388DI 조건부 배지, 5% 오리젠 하이브리도마 클로닝 인자(BioVeris, Gaithersburg, VA), 4 mM L-글루타민, 5mM HEPES, 0.055 mM β-머캅토에탄올, 50 units/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신 및 1X 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘 (HAT) 배지 (시그마; HAT는 용융 24시간 후에 부가됨)를 포함하는 DMEM 고 글루코스 배지에서 일 주 동안 배양되어 진 후 평판 바닥 마이크로타이터 플레이트에 대략 2 x 105로 이식되어 진다. 일주일 후, HAT가 사용된 배지에서 배양된 세포는 HT로 대체되었다. 각각의 웰은 그런 다음 인간 모노크로날 IgM 및 IgG 항체에 대하여 ELISA에 의해 선별되어 질 수 있다. 하이브리도마 성장은 통상적으로 10-14일 후에 관찰되어 질 수 있다. 항체 분비 하이브리도마는 재이식될 수 있고 다시 스크린될 수 있으며, 그리고 만일 여전히 인간 IgG에 대해 양성적이라면, 모노크로날 항체는 희석을 제한함에 의해 적어도 두 번 서브클론될 수 있다. 안정한 서브클론은 그런 다음 소량의 항체를 특징화를 위해 조직 배양 배지에서 발생하기 위해 생체 외에서 배양될 수 있다.
인간 모노크로날 항체를 정제하기 위하여, 선택된 하이브리도마가 2-리터의 스피너-플라스크에서 모노크로날 항체 정제를 위하여 성장되어 질 수 있다. 상등액은 단백질 A-세파로스(Pharmacia, Piscataway, NJ.)로 어피니티 크로마토그라피 수행 전에 여과되고 농축되어 질 수 있다. 용리된 IgG는 순도를 확실하게 하기 위해 겔 일렉트로포르시스 및 고성능액체크로마토그라피에 의해 체크되어 질 수 있다. 버퍼 용액은 PBS로 교체될 수 있으며 그리고 농축이 1.43 흡광계수를 이용하여 OD 280에 의해 결정되어 질 수 있다. 모노크로날 항체는 나누어 -80℃에서 저장될 수 있다.
본 개시사항의 모노크로날 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성
본 개시사항의 항체는 또한 예를 들어, 이 기술 분야에서 잘 알려진 바와 같은 유전자 트랜스펙션 방법과 재조합 DNA 기술(즉, Morrison, S. (1985) Science 229: 1202)의 조합을 사용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산되어 질 수 있다.
예를 들어, 항체 또는 이들의 항체 분획을 발현하기 위하여, 부분적 또는 완전-길이 경 및 중사슬을 코드하는 DNAs가 표준 분자생물학 기술(즉, 흥미대상 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하여 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝)을 사용하여 얻어질 수 있고, 그리고 이 DNAs는 유전자가 복제의 및 전사의 제어 시퀀스에 조작적으로 연결되어 지도록 발현 벡터 내에 삽입되어 질 수 있다. 본 내용에서 용어 "조작적으로 연결"은 벡터 내의 복제의 및 전사의 제어 시퀀스가 항체 유전자의 복제 및 전사를 조절하는 이들의 의도된 기능으로 작용하도록 항체 유전자가 벡터 내에 결찰되어 지는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 발현 벡터 및 발현 조절 시퀀스는 사용된 발현 숙주 세포에 필적할 수 있는 것으로 선택된다. 항체 경사슬 유전자 및 항체 중사슬 유전자는 별도의 벡터 내로 삽입되어 질 수 있거나 또는 더욱 전형적으로는 양 유전자가 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법(즉, 항체 유전자 분획 및 벡터 상에 상보적 제한 사이트의 결찰, 또는 만일 제한사이트가 존재하지 않으면 블룬트 말단 결찰)에 의해 발현 벡터 내로 삽입된다. 여기에 기술된 항체의 경 및 중사슬 가변 영역들이, VH 분절이 벡터 내에서 CH 분절에 조작적으로 연결되고 VK 분절은 벡터 내에서 CL 분절에 조작적으로 연결되도록 바람직한 아이소타입의 중사슬 불변 및 경사슬 불변 영역들을 이미 코드하는 발현 벡터 내에 이들을 삽입함에 의해 어떤 항체 아이소타입의 완전-길이 항체 유전자를 제작하기 위하여 사용되어 질 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터가 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 시그날 펩티드를 코드 할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 시그날 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 골격-내로 연결되도록 벡터 내에 클론될 수 있다. 시그날 펩티드는 이뮤노글로불린 시그날 펩티드이거나 또는 이형성 시그날 펩티드(즉, 비-이뮤노글로불린 단백질로부터의 시그날 펩티드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자에 부가하여, 본 개시사항의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 조절하는 조절 시퀀스를 담지한다. 용어 "조절 시퀀스"는 항체 사슬 유전자의 복제 또는 전사를 조절하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소(즉, 폴리아데닐화 시그날)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 시퀀스는, 예를 들어 Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))에 기술되어 있다. 조절 시퀀스의 분비를 포함하는 발현 벡터의 디자인은 형질전환되어지는 숙주 세포의 선택, 소망하는 단백질의 발현 준위 등과 같은 인자에 의존할 수 있다는 것은 이 분야의 통상인에 의해 인지될 수 있는 것일 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현에 대한 바람직한 조절 시퀀스는 사이토메가바이러스(CMV), 시미안 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스(즉, 아데노바이러스 메이저 레이트 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 포유동물의 세포에서 고준위의 단백질 발현을 하는 바이러스의 요소를 포함한다. 대안적으로, 유비퀴틴 프로모터나 β-글로빈 프로모터와 같은 비바이러스의 조절 시퀀스가 사용될 수 있다. 더 더욱이, 조절 요소는 SRa 프로모터 시스템과 같은 다른 근원으로부터의 시퀀스로 구성되고, 이것은 SV40 어얼리 프로모터 및 인간 T 세포 류케미아 바이러스 타입 1의 긴 말단 반복으로부터 시퀀스를 포함한다 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol . Cell . Biol. 8:466-472).
항체 사슬 유전자 및 조절 시퀀스에 부가하여, 본 개시사항의 재조합 발현 벡터는 숙주세포(즉, 복제의 근원)에서 벡터의 복제와 선택할 수 있는 마커 유전자를 조절하는 시퀀스와 같은 부가적인 시퀀스를 담지할 수 있다. 선택할 수 있는 마커 유전자는 벡터가 도입되어 지는 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다(즉, Axel 등에 의한 미국 특허번호 Nos. 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017). 예를 들어, 전형적으로 선택할 수 있는 마커 유전자는 벡터가 도입되어 지는 숙주세포 상에 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 저항성을 부여한다. 바람직한 선택할 수 있는 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선택/증폭으로 dhfr-숙주 세포에서 사용하기 위한 것) 및 네오 유전자 (G418 선택을 위한 것임)를 포함한다.
경 및 중사슬의 발현을 위하여, 경 및 중사슬을 코드하는 발현 벡터(들)은 표준 기술에 의하여 숙주 세포 내로 트랜스펙트된다. 용어 "트랜스펙션"의 다양한 형태는 원핵생물 또는 진핵생물의 숙주 세포 내로 외래성 DNA의 도입, 즉 전기천공법, 칼슘-포스페이트 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 등을 위해 공통적으로 사용되는 광범위한 기술을 포괄하는 것으로 의도된다. 비록 원핵생물 뿐 아니라 진핵생물 숙주 세포에 본 개시사항의 항체를 발현하는 것이 이론적으로는 가능하기만, 진핵생물 세포, 가장 바람직하기로는 포유동물 숙주 세포에 항체의 발현이 가장 바람직한데, 이는 이러한 진핵생물 세포, 특히 포유동물 세포가 적절하게 폴드되고 면역학적으로 활성인 항체를 조합하고 분비하는 것이 원핵 세포보다 보다 쉽기 때문이다. 항체 유전자의 원핵 생물 발현이 활성인 항체의 고 수율의 생산에 비효율적인 것으로 보고되어 있다 (Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).
본 개시사항의 재조합 항체를 발현하는 바람직한 포유동물의 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포)(Urlaub and Chasin, (1980) Proc . Natl . Acad . ScL USA 77:4216-4220에 기술되고, DHFR 선택가능한 마커, 즉 R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol . Biol . 755:601-621에 기술된 것 같은 것으로 사용된 dhfr-CHO 세포를 포함함), NSO 미엘로마 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 미엘로마 세포로 사용하기 위한, 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 코드하는 재조합 발현 벡터가 포유동물의 숙주 세포 안으로 도입되어 질 때, 항체는 숙주 세포에 항체의 발현, 보다 바람직하기로는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 안으로 항체의 분비를 허용하기에 충분한 시간의 기간 동안 숙주 세포를 배양함에 의해 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하는 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
항원에 결합하는 항체의 특징
본 개시사항의 항체는, 예를 들어 유동세포분석법에 의해 CD70에 결합에 대해 시험되어 질 수 있다. 간략하게는, CD70-발현 세포가 조직 배양 플라스크로부터 수확되어지고 단일 세포 현탁액이 준비된다. CD70-발현 세포 현탁액은 프라이머리 항체로 직접적으로 뿐 아니라 PBS 내에 1% 파라포름알데하이드로 고정 후에 염색되어 진다. 대략 일백만 개의 세포들이 0.5% BSA 및 50-200 μg/ml의 프라이머리 항체를 포함하는 PBS에 재현탁되어 지고 그리고 30분 동안 얼음에서 배양되어 진다. 세포는 0.1% BSA, 0.01% NaN3를 포함하는 PBS로 이회 수세되고, 100 μl의 1:100 희석된 FITC-컨쥬게이트된 염소-항-인간 IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)에 재현탁되어 지고 그리고 추가적으로 30분 동안 얼음에서 배양되어 진다. 세포는 다시 이회 수세되고, 0.5 ml의 수세 완충액에 현탁되고 그리고 FACSCalibur 사이토미터(Becton- Dickinson, San Jose, CA) 상에서 형광염색으로 분석되어 진다.
대안적으로, 본 개시사항의 항체는 표준 ELISA에 의해 CD70에 결합에 대해 시험되어 질 수 있다. 간략하게는, 마이크로타이터 플레이트가 PBS 내에 0.25 μg/ml로 정제된 CD70으로 도포되어지고 그런 다음 PBS 내에 5% 송아지 혈청 알부민으로 차단되어 진다. 항체의 희석(즉, CD70-면역화된 마우스로부터의 프라즈마의 희석)이 각 웰에 부가되고 37℃에서 1-2 시간 동안 배양되어 진다. 플레이트는 PBS/트윈으로 수세되고 그런 다음 알카린 포스파타제에 컨쥬게이트된 제이의 시약(즉, 인간 항체에 대해서는, 염소-항-인간 IgG Fc-특이적 폴리크로날 시약)으로 37℃에서 1 시간 동안 배양되어 진다. 수세 후, 플레이트는 pNPP 기질 (1 mg/ml)로 전개되고, 그리고 405-650의 OD에서 분석된다. 바람직하기로는, 가장 높은 역가를 전개하는 마우스가 용융을 위해 사용될 것이다.
여기서 기술된 ELISA 분석법은 또한 CD70 면역원으로 양성적인 반응성을 보이는 하이브리도마에 대한 선별을 하기 위해 사용되어 질 수 있다. CD70에 대해 높은 항원항체결합력으로 결합하는 하이브리도마가 서브클론되고 더욱이 특징화된다. 모체 세포의 반응성을 보유하는(ELISA에 의해) 각 하이브리도마로부터의 일 클론이 -140℃에서 저장된 5-10 바이알 세포 은행을 만들기 위해 그리고 항체 정제를 위해 선택되어 질 수 있다.
항-CD70 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마는 모노크로날 항체 정제를 위해 2-리터의 스피너-프라스크에서 성장되어 질 수 있다. 상등액은 단백질 A-세파로스(Pharmacia, Piscataway, NJ.)로 어피니티 크로마토그라피 수행 전에 여과되고 농축되어 질 수 있다. 용리된 IgG는 순도를 확실하게 하기 위해 겔 일렉트로포르시스 및 고성능액체크로마토그라피에 의해 체크되어 질 수 있다. 버퍼 용액은 PBS로 교체될 수 있으며 그리고 농축이 1.43 흡광계수를 이용하여 OD280에 의해 결정되어 질 수 있다. 모노크로날 항체는 나누어 -80℃에서 저장될 수 있다.
선택된 항-CD70 모노크로날 항체가 유일한 항원결정인자에 결합하는가를 결정하기 위해, 각 항체가 상업적으로 이용할 수 있는 시약(Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 바이티닐화될 수 있다. 비표지된 모노크로날 항체 및 바이오티닐화된 모노크로날 항체를 사용한 경쟁성 연구가 상술한 바와 같은 CD70 도포-ELISA 플레이트를 사용하여 수행될 수 있다. 바이오티닐화된 mAb 결합은 스트렙-아비딘-알카린 포스파타제 프로브로 검지되어 질 수 있다. 대안적으로, 경쟁성 연구는 방사표지된 항체를 사용하여 수행될 수 있고 그리고 비표지된 경쟁항체는 아래 실시예에서 더 자세하게 기술되는 것과 같이 Scatchard 분석법에서 검출될 수 있다.
정제된 항체의 아이소타입을 결정하기 위해, 아이소타입 ELISA가 특정한 아이소타입의 항체에 대해 특이적인 시약을 사용하여 수행되어 질 수 있다. 예를 들어, 인간 모노크로날 항체의 아이소타입을 결정하기 위해, 마이크로타이터 플레이터의 웰이 4℃에서 밤 세워 1 μg/ml의 항-인간 이뮤노글로불린으로 도포되어 질 수 있다. 1% BSA로 블럭킹 후, 플레이트는 1 내지 2시간 동안 대류 온도에서 1 μg /ml 또는 그 이하의 시험 모노크로날 항체 또는 정제된 아이소타입 대조군으로 반응된다. 웰은 그런 다음 인간 IgGl 뿐 아니라 인간 IgM-특정 알카린 포스파타제-컨쥬게이트된 프로브와 반응되어 질 수 있다. 플레이트는 상술한 바와 같이 전개되어 지고 분석된다.
항-CD70 인간 IgGs는 웨스턴 블럿팅에 의하여 CD70 항원으로 반응성에 대하여 더 시험되어 질 수 있다. 간단하게는, CD70이 준비되어 질 수 있고 그리고 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 일렉트로포르시스되어 질 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원은 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전이되고, 10% 송아지 태반 혈청으로 차단되고 그리고 시험된 모노크로날 항체로 탐지된다. 인간 IgG 결합은 항-인간 IgG 알카린 포스파타제를 사용하여 검지되어 질 수 있고 BCIP/NBT 기질 타블렛(Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.)으로 전개될 수 있다.
이뮤노컨쥬게이트
또 다른 측면에서, 본 개시사항은 세포독소, 약물(즉, 면역억제제) 또는 방사성 독물과 같은 치료적인 부분과 컨쥬게이트된 항-CD70 항체 또는 이들의 분획으 로 특징된다. 이러한 컨쥬게이트들은 여기에서는 "이뮤노컨쥬게이트"로 언급되어 진다. 하나 또는 그 이상의 세포독소를 포함하는 이뮤노컨쥬게이트는 "면역독소"로 언급된다. 세포독소 또는 세포독소 제제는 세포에 해로운(즉, 죽이는) 제제를 포함한다. 이 예들은 택솔, 시토찰라신 B, 글라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-디하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로케인, 테트라케인, 리도케인, 프로프라노롤 및 퓨로마이신 그리고 이들의 유사화합물들을 포함한다. 치료적 제제는 또한 예를 들어, 항대사산물들(즉, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 디카바진), 알킬화 제제(즉, 메클로르에탄, 티오에파 클로르앰뷰실, 멜파란, 카르뮤스틴 (BSNU) 및 로뮤스틴 (CCNU), 시클로토스파미드, 뷰술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 cis-디클로로디아민 플레티늄 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린류(즉, 다우노루비신 (이전의 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제류 (즉, 댁티노마이신 (이전의 액티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)), 및 세포분열 저지성 제제(즉, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함한다.
본 개시사항의 항체에 컨쥬게이트될 수 있는 치료적 세포독소의 다른 바람직한 예는 듀오카르마이신, 칼리케아미신, 메이탄신 및 아우리스타틴과 이들의 유도체를 포함한다. 칼리케아미신 항체 컨쥬게이트의 예는 상업적으로 이용할 수 있다 (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst).
세포독소는 이 기술 분야에서 이용할 수 있는 링커 기술을 사용하여 본 개시사항의 항체에 컨쥬게이트될 수 있다. 항체에 세포독소를 컨쥬게이트하기 위해 사용되어 지는 링커 타입의 예는 여기에 한정되는 것은 아니지만 하이드라존, 티오에테르, 에스테르, 디설파이드 및 펩티드-함유 링커를 포함한다. 링커는 예를 들어 리소솜 구획 내에서 낮은 pH에 의한 단리에 민감하거나 또는 카테프신(즉, 카테프신 B, C, D)와 같은 종양 조직에 우세하게 발현된 프로테아제와 같은 프로테아제에 의한 단리에 민감한 것이 선택될 수 있다.
세포독소 타입, 항체에 치료적 제제를 컨쥬게이트하는 링커 및 방법의 추가적인 논의에 대해서는, 다음을 또한 참고한다: Saito, G. et al. (2003) Adv . Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol . Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat . Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr . Opin . Imestig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, CJ. (200Y) Adv . DrugDeliv. Rev. 53:247-264.
본 개시사항의 항체는 또한 방사성 이뮤노컨쥬게이트로 언급되는 세포독소적 방사성 의약품을 생산하기 위해 방사성 동위원소에 컨쥬게이트 될 수 있다.
진단학적으로 또는 치료학적으로 사용하기 위하여 항체에 컨쥬게이트될 수 있는 방사성 동위원소의 예는 여기에 한정되는 것은 아니지만, 요오딘131, 요오딘125, 인듐1 11, 이트리움90 및 루테티움177을 포함한다. 방사성 이뮤노컨쥬게이트를 제조하 는 방법은 이 기술 분야에 확립되어 있다. 방사성 이뮤노컨쥬게이트의 예는 제발린™ (IDEC Pharmaceuticals) 및 벡사르™ (Corixa Pharmaceuticals)을 포함하는 상업적으로 이용할 수 있고, 그리고 유사한 방법이 본 개시사항의 항체를 사용하여 방사성 이뮤노컨쥬게이트를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시사항의 항체 컨쥬게이트는 주어진 생물학적 반응을 변형하기 위해 사용될 수 있고, 그리고 약물 부분은 고전적인 화학적 치료제에 한정된 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 약물 부분은 원하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 엑소톡신 또는 디프테리아 독소와 같은 효소학적으로 활성인 독소 또는 이들의 활성 분획; 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ와 같은 단백질; 또는 예를 들어, 림포카인, 인터류이킨-1 ("IL-I"), 인터류이킨-2 ("IL-2"), 인터류이킨-6 ("IL-6"), 그래뉼로사이트 매크로파이지 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 그래뉼로사이트 콜로니 자극 인자("G-CSF"), 또는 다른 성장 인자와 같은 생물학적 반응 개사자를 포함한다.
항체에 이러한 치료적 부분을 컨쥬게이트하기 위한 기술은 잘 알려져 있다. 다음 참고; 즉, Arnon et al, "Monocronal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," in Monocronal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243- 56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al, "Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monocronal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," in Monocronal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al . (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe et al, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates," Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
비스페시픽 분자
또 다른 측면에서, 본 개시사항은 본 개시사항의 항-CD70 항체 또는 이들의 분획을 포함하는 비스페시픽 분자가 그 특징이다. 본 개시사항의 항체 또는 이들의 항체 결합 부분은 다른 기능적 분자, 즉 적어도 두 개의 다른 결합 사이트 또는 타겟 분자에 결합하는 비스페시픽 분자를 발생하기 위한 또 다른 펩티드 또는 단백질(즉, 다른 항체 또는 리셉터용 리간드)로 유도되어 지거나 또는 링커되어 질 수 있다. 본 개시사항의 항체는 사실 두 개 이상의 다른 결합 사이트 및/또는 타겟 분자에 결합하는 멀티스페시픽 분자를 발생하기 위한 하나 이상의 다른 기능적 분자로 유도되어 지거나 또는 링커되어 질 수 있고; 이러한 멀티스페시픽 분자는 또한 여기서 사용된 것으로 용어 "비스페시픽 분자"에 의해 포괄되어 지는 것으로 의도된다. 본 개시사항의 비스페시픽 분자를 만들기 위해, 본 개시사항의 항체가 다른 항체, 항체 분획, 펩티드 또는 결합 의태물과 같은 하나 또는 그 이상의 다른 결합 분자에 기능적으로 연결(즉, 화학적 커플링, 유전적 용융, 비공유결합적 연계 등등)되어 질 수 있어 비스페시픽 분자를 초래한다.
따라서, 본 개시사항은 적어도 하나의 CD70에 대한 제일 결합 특이성 및 제이 타겟 항원결정인자에 대한 제이 결합 특이성을 포함하는 비스페시픽 분자를 포함한다. 본 개시사항의 특정한 실시형태에서, 제이 타겟 항원결정인자는 Fc 리셉터, 즉, 인간 FcγRI(CD64) 또는 인간 Fcα 리셉터(CD89) 이다. 따라서, 본 개시사항은 FcγR 또는 FcαR 발현 이펙터 세포 (즉, 모노사이트, 매크로파아지 또는 다형핵백혈구 세포(PMNs)) 및 타겟 세포 발현 CD70 양자에 결합할 수 있는 비스페시픽 분자를 포함한다. 이들 비스페시픽 분자는 이펙터 세포에 CD70 발현 세포를 타겟으로 하고 그리고 CD70 발현 세포의 식세포작용, 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 사이토톡신 방출 또는 초산화물 음이온의 발생과 같은 Fc 리셉터-매개 이펙터 세포 활성을 촉발한다.
비스페시픽 분자가 멀티스페시픽인 본 개시사항의 일 실시형태에서, 분자는 더욱이 항-Fc 결합 특이성 및 항-CD70 결합 특이성에 부가하여 제삼 결합 특이성을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 제삼 결합 특이성은 항-증진 인자(EF) 부분, 즉 세포 독성 활성에 포함된 표면 단백질에 결합하고 그리고 이에 의해 타겟 세포에 대하여 면역 반응을 증진하는 분자이다. "항-증진 인자 부분"은 주어진 분자, 즉 항원 또는 리셉터에 결합하고, 이에 의해 Fc 리셉터 또는 타겟 세포 항원에 대한 결합 결정소의 효과의 증진을 초래하는 항체, 기능적 항체 분획 또는 리간드일 수 있다. "항-증진 인자 부분"은 Fc 리셉터 또는 타겟 세포 항원을 결합할 수 있다. 대안적으로, 항-증진 인자 부분은 제일 및 제이 결합 특이성들이 결합하는 실체와 다른 실체에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항-증진 인자 부분은 세포독성 T-세포에 결합할 수 있다(즉, 타겟 세포에 대해 증가된 면역 반응을 초래하는 CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 또는 다른 면역 세포를 통해).
일 실시형태에 있어서, 본 개시사항의 비스페시픽 분자는 결합 특이성으로 즉, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일 사슬 Fv를 포함하는 적어도 하나의 항체, 또는 이들의 항체 분획을 포함한다. 항체는 또한 Ladner et al. 미국 특허번호 No. 4,946,778에 기술된 바와 같이 Fv 또는 단일 사슬 컨스트럭트와 같은 경사슬 또는 중사슬 이량체 또는 이들의 최소한의 분획일 수 있으며, 여기에 기술된 내용은 명백하게 레퍼런스로 합체된다.
일 실시형태에 있어서, Fcγ 리셉터에 대한 결합 특이성은 모노크로날 항체에 의하여 제공되어 지고, 이 결합은 인간 이뮤노글로불린 G (IgG)에 의해 차단되지 않는다. 여기에 사용된 것으로, 용어 "IgG 리셉터"는 크로모솜 1 상에 위치된 여덟의 γ-사슬 유전자의 하나를 언급한다. 이들 유전자는 세 개의 Fcγ 리셉터 클래스인: FcγRI (CD64), FcγRII(CD32), 및 FcγRIII (CD16)로 분류된 전체 12의 트랜스멤브레인 또는 가용성 리셉터 이성형을 코드한다. 일 바람직한 실시형태에 있어서, Fcγ 리셉터는 인간 고 친화성 FcγRI이다. 인간 FcγRI은 72 kDa 분자로, 모노머의 IgG에 대해 높은 친화도를 보인다(108 - 109M-1)
어떤 바람직한 항-Fcγ 모노크로날 항체의 생산 및 특징화는 Fanger 등에 의 한 PCT 공개공보 WO 88/00052 및 미국 특허번호 No. 4,954,617에 기술되어 있으며, 이 가르침은 여기에 레퍼런스로 완전히 합체된다. 이들 항체는 리셉터의 Fcγ 결합 사이트로부터 뚜렷이 다른 사이트에 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII의 항원결정인자에 결합하고 따라서 이들의 결합이 IgG의 물리학적 준위에 의해 실질적으로 차단되지 않는다. 본 개시사항에서 유용한 특이적 항-FcγRI 항체는 mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 및 mAb 197이다. mAb 32를 생산하는 하이브리도마는 American Type Culture Collection, ATCC Accession No. HB9469으로부터 이용할 수 있다. 일 다른 실시형태에 있어서, 항-Fcγ 리셉터 항체는 모노크로날 항체 22 (H22)의 인체적응된 형태이다. H22 항체의 생산 및 특성은 Graziano, R.F. et al. (1995,) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 및 PCT 공개공보 WO 94/10332에 기술되어 있다. H22 항체 생산 셀 라인은 American Type Culture Collection에 기탁번호 HA022CL1로 기탁되어 있으며, 수납번호 CRL 11177를 가진다.
또다른 바람직한 실시형태에 있어서, Fc 리셉터에 대한 결합 특이성은 인간 IgA 리셉터에 결합하는 항체, 즉 Fc-알파 리셉터 (FcαRI (CD89))에 의하여 제공되고, 이의 결합은 바람직하기로는 인간 이뮤노글로불린 A (IgA)에 의하여 차단되지 않는다. 용어 "IgA 리셉터"는 크로모솜 19 상에 위치된 일 α-유전자 (FcαRI)의 유전자 생산을 포함하는 것을 의도한다. 이 유전자는 55 내지 110 kDa의 몇몇 대안적으로 스플라이스된 트랜스멤브레인 이형체를 코드하는 것이 알려져 있다. FcαRI (CD89)은 본질적으로 모노사이트/매크로파아지, 호산성의 및 호중구의 그래뉼로사이트 상에서 발현되어 지지만 그러나 비-이펙터 세포 집단 상에서 발현되어 지지 않는다. FcαRI는 IgAl 및 IgA2 양자에 대해 중간의 친화도(≒ 5 x 107 M-1)를 가지고, G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 시토킨에 노출에 의해 증가된다 (Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440). A3, A59, A62 및 A77로 동정되고, IgA 리간드 결합 도메인 외측으로 FcαRI를 결합하는 네 개의 FcαRI-특이적 모노크로날 항체가 기술되어 있다 (Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764).
FcαRI 및 FcγRI는 본 개시사항의 비스페시픽 분자에서 사용되기 위한 촉발 리셉터로 바람직한데, 왜냐하면 이들이 (1) 면역 이펙터 세포, 즉 모노사이트, PMNs, 매크로파아지 및 수지상 세포 상에서 일차적으로 발현되고; (2) 고준위(즉, 세포 당 5,000-100,000)로 발현되고; (3) 세포독성 활성의 매개자이고(즉, ADCC, 식세포작용); (4) 셀프-항원을 포함하여, 이들에 타겟된 항원의 증진된 항원 개시를 매개하기 때문이다.
비록 인간 모노크로날 항체가 바람직하지만, 본 개시사항의 비스페시픽 분자에서 채용될 수 있는 다른 항체는 예를 들어 뮤어라인, 키메르 및 인체적응된 모노크로날 항체를 포함한다.
본 개시사항의 비스페시픽 분자는 이 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 구성분 결합 특이성, 즉 항-FcR 및 항-CD70 결합 특이성을 컨쥬게이트함에 의해 제조되어 질 수 있다. 예를 들어, 비스페시픽 분자의 각 결합 특이성은 별도로 발생되어 질 수 있고 그런 다음 각 다른 하나에 대해 컨쥬게이트되어 질 수 있다. 결합 특이성이 단백질이거나 펩티드일 때, 다양한 커플링 제제 또는 가교제가 공유결합의 컨쥬게이트를 위해 사용되어 질 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-석신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 및 술포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-l-카르복실레이트 (sulfo-SMCC)를 포함한다 (즉, Karpovsky et al. (1984) J. Exp . Med.160:1686; Liu, MA et al (1985) Proc . Natl . Acad . ScL USA 82:8648). 다른 방법은 Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83), 및 Glennie et al. (1987) J Immumol. 139: 2367-2375에 기술된 것들을 포함한다. 바람직한 컨쥬게이트화 제제는 SATA 및 sulfo-SMCC로, 양자는 Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)로부터 이용할 수 있다.
결합 특이성이 항체일 때, 이들은 두 개의 중사슬의 C-말단 힌지 영역의 설프하이드릴 결합을 통해 컨쥬게이트될 수 있다. 특히 바람직한 실시형태에서, 힌지 영역은 기수의 설프하이드릴 잔기, 바람직하기로는 컨쥬게이션 전에 이것을 포함하도록 변이되어 진다.
대안적으로, 양 결합특이성은 동일한 벡터에 코드되어 질 수 있고 그리고 동일한 숙주세포에 발현되고 조립되어 질 수 있다. 이 방법은 특히 비스페시픽 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 용융 단백질인 경우 유용하다. 본 개시사항의 비스페시픽 분자는 하나의 단일 사슬 항체 및 결합 결정소를 포함하는 단일 사슬 분자 또는 두 결합 결정소를 포함하는 단일 사슬 비스페 시픽 분자일 수 있다. 비스페시픽 분자는 적어도 두 개의 단일 사슬 분자를 포함할 수 있다. 비스페시픽 분자를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허번호 5,260,203; 미국 특허번호 5,455,030; 미국 특허번호 4,881,175; 미국 특허번호 5,132,405; 미국 특허번호 5,091,513; 미국 특허번호 5,476,786; 미국 특허번호 5,013,653; 미국 특허번호 5,258,498; 및 미국 특허번호 5,482,858에 기술되어 있다.
이들의 특이적 타겟에 대한 비스페시픽 분자의 결합은, 예를 들어 효소-결합 면역흡착 검사 (ELISA), 방사면역측정법 (RIA), FACS 아날리시스, 바이오어세이 (즉, 성장저해), 또는 웨스턴 블럿 어세이에 의하여 확인되어 질 수 있다. 이들 어세이의 각각은 일반적으로 흥미대상의 복합체에 특이적인 표지된 시약(즉, 항체)를 채용함에 의해 특정한 흥미대상의 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들어, FcR-항체 복합체는 예를 들어 항체-FcR 복합체를 인지하고 특이적으로 결합하는 효소-결합 항체 또는 항체 분획을 사용하여 검출될 수 있다. 대안적으로, 복합체는 다양한 다른 면역분석을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 항체는 방사능활성적으로 표지되어 질 수 있고 그리고 방사면역측정법 (RIA)으로 사용되어 질 수 있다 (예를 들어, 여기에 참고로 합체된 Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986 참고). 방사활성 동위원소는 γ 카운트 또는 신틸레이션 카운트와 같은 수단에 의해 또는 오토라디오그라피에 의해 검출될 수 있다.
약학적 조성물
또 다른 측면에서, 본 개시사항은 약학적으로 허용될 수 있는 담체와 함께 제형화된, 본 개시사항의 모노크로날 항체 또는 이들의 항원-결합 부분(들)의 하나 또는 조합을 포함하는 조성물, 즉 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 본 개시사상의 항체, 또는 이뮤노컨쥬게이트나 비스페시픽 분자의 하나 또는 조합(즉, 두 개 또는 그 이상의 다른 것)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시사항의 약학적 조성물은 타겟 항원 상에 다른 항원결정성인자를 결합하거나 또는 상보적인 활성을 갖는 항체 (또는 이뮤노컨쥬게이트나 비스페시픽)의 조합을 포함할 수 있다.
본 개시사항의 약학적 조성물은 또한 조합 치료로, 예를 들어 다른 제제와 조합한 조합치료제로 투여되어 질 수 있다. 예를 들어, 조합 치료제는 적어도 하나의 다른 항-염증성 또는 면역억제제와 조합된 본 개시사항의 항-CD70 항체를 포함할 수 있다. 조합 치료제에 사용될 수 있는 치료적인 제제의 예는 아래에 본 개시사항의 항체의 용도에 대한 부분에서 보다 자세하게 기술된다.
여기서 사용된 것으로, "약학적으로 허용가능한 담체"는 생리학적으로 양립할 수 있는 일부 및 모든 용매류, 분산 배지, 도포제류, 항균 및 항곰팡이 제제, 등전제 및 흡수 지연제제 등을 포함한다. 바람직하기로는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하로, 비경구적으로, 척수로 또는 상피내로 투여(즉, 주사 또는 주입에 의해)에 적절하다. 투여의 경로에 의존하여, 활성 화합물, 즉 항체, 면역컨쥬게이트 또는 비스페시픽 분자는 화합물을 비활성화할 수 있는 산 및 다른 중성 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하기 위한 물질에 도포되어 질 수 있다.
본 개시사항의 약학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 적절한 염 을 포함할 수 있다. "약학적으로 허용가능한 염"은 모체 화합물의 희망하는 생물학적 활성을 보유하고 어떤 바람직하지 않은 독소학적 영향을 부여하지 않는 염에 관한 것이다 (예를 들어, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm . Sci. 66:1-19 참고). 이러한 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등과 같은 비독성의 무기산으로부터 유래된 것 뿐 아니라 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환 알카노이산, 하이드록시 알카노이산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등과 같은 비독성의 유기산으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기 부가염은 소디움, 포타슘, 마그네슘, 칼슘 등과 같은 알카린 토금속류로부터 유래된 것 뿐 아니라 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등과 같은 비독성의 유기 아민으로부터 유래된 것을 포함한다.
본 개시사항의 약학적 조성물은 또한 약학적으로 허용가능한 항-산화제를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 항산화제의 예는: (1) 아스코르빅산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소디움 비설페이트, 소디움 메타비설파이트, 소디움 비설파이트 등과 같은 수용성 항산화제; (2) 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시애니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등과 같은 오일-가용성 항산화제; 그리고 (3) 시트르 산, 에틸렌디아민 테트라초산(EDTA), 솔비톨, 타르타르산, 인산 등과 같은 금속 킬레이팅 제제를 포함한다.
본 개시사항의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 적절한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 적절한 이들의 혼합물, 올리브 기름과 같은 식물성 오일 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용함에 의해, 분산의 경우에는 요구되는 입자 사이즈로 유지함에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지되어 질 수 있다.
이들 조성물은 또한 보전제, 습윤제, 에멀시화제, 및 분산제와 같은 어쥬번트를 포함할 수 있다. 미생물 존재의 방지는 멸균 절차에 의해, 그리고 그 위에 다양한 항균 및 항곰팡이제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 솔르브산 등의 유입에 의한 양자의 방법에 의해 공고하게 될 수 있다. 당, 염화나트륨 등과 같은 등전제를 조성물 내에 포함하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 부가하여, 주사가능한 약학적 제형의 지연된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연하는 제제의 유입에 의해 일어날 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체는 멸균 수성 용액 또는 분산액 및 멸균 주사용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약학적으로 활성인 기질에 대한 이러한 배지 및 제제의 사용은 이 기술 분야에 알려져 있다. 통상적인 배지 및 제제가 본 활성 화합물과 조화할 수 없는 것이 아닌 한, 본 개시사항의 약학적 조성물에서의 이들의 사용은 고려되어 진다. 보충적인 활성 화합물이 또한 본 조성물에 합체되어 질 수 있다.
치료적 조성물은 제조 및 저장의 조건에서 전형적으로 멸균이어야 하고 안정하여야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜 또는 높은 약물 농도에 적절한 다른 정도의 구조로 제형화되어 질 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴 리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 리퀴드 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 적절한 이들의 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용함에 의해, 분산의 경우에는 요구되는 입자 사이즈로 유지함에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지되어 질 수 있다. 많은 경우에, 예를 들어 당과 그리고, 만니톨, 솔비톨 같은 폴리알코올류 또는 염화나트륨과 같은 등전제를 조성물 내에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 지연된 흡수는 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴으로 흡수를 지연하는 제제를 조성물 내에 포함함에 의해 일어날 수 있다.
멸균성 주사가능한 용액은 상기 열거된 성분들의 하나 또는 조합으로, 필요하면 멸균 미세여과가 따르는, 활성 화합물을 필요한 양으로 적절한 용매에 합체함으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산은 기본적인 분산 배지와 상기에 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 포함하는 멸균 운반체에 활성 화합물을 합체함에 의해 제조된다. 주사가능한 멸균 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조의 방법은 미리 멸균-여과된 이들의 용액으로부터 어떤 부가적인 소망하는 성분이 더해진 활성 성분의 분말을 얻는 진공 건조 및 동결-건조(냉동진공건조)이다.
단일 복용 형태를 생산하기 위해 담체 물질과 조합되어 질 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 대상과 그리고 특히 투여의 형식에 의존하여 다양하게 변할 것이다. 단일 복용 형태를 생산하기 위해 담체 물질과 조합되어 질 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 얻는 조성물의 양이 될 것이다. 일반적으로, 일 백 퍼센트 중에서, 이 양은 약 0.01 퍼센트에서 99 퍼센트의 활성성분, 바람직하기로는 약 0.1 퍼센트에서 70 퍼센트, 가장 바람직하기로는 약 1 퍼센트에서 30 퍼센트의 활성성분이 약학적으로 허용될 수 있는 담체와 조합하는 범위일 것이다.
복용 요법은 최적의 바람직한 반응(예를 들어, 치료적 반응)을 제공하기 위해 조정된다. 예를 들어, 단일 환제가 투여되어 질 수 있고, 몇 개로 분할된 복용량이 시간에 걸쳐 투여되어 지거나 또는 복용량이 치료적 상황의 급박성에 의해 나타난 것에 따라 비례하여 감소하거나 증가될 수 있다. 복용량의 일정성과 투여의 편이성을 위해 복용단위 형태로는 비경구적 조성물로 제형화하는 것이 특별히 유익하다. 여기서 사용된 것으로 복용 단위 형태는 치료되는 대상에 단위적인 복용량으로 적합한 단위를 물리적으로 분리하는 것을 의미한다; 각 단위는 요구된 약학적 담체와 연계하여 원하는 치료적 효과를 생성하기 위해 계산된 소정 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 개시사항의 복용 단위 형태에 대한 명세는 (a) 활성 화합물의 유일한 특징과 달성된 특정한 치료적 효과 및 (b) 개별적으로 민감성의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 포함하는 기술에서 내재하는 제한에 의해 기술되고 그리고 이에 직접적으로 의존한다.
항체의 투여를 위하여, 복용량은 호스트 체중당 약 0.0001 내지 100 mg/kg 그리고 보다 통상적으로는 0.01 내지 5 mg/kg의 범위로 된다. 예를 들어, 복용량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중 또는 1-10 mg/kg의 범위 내로 된다. 보다 높은 복용량, 예를 들어 15 mg/kg 체중, 20 mg/kg 체중 또는 25 mg/kg 체중이 필요한 경우 사용될 수 있다. 예시적인 치료 요법은 주당 일 회 투여, 매 이 주당 일 회, 매 삼 주당 일 회, 매 사 주당 일 회, 한 달에 일 회, 매 3 달에 일 회, 매 3 내지 6 달에 일 회 투여이다. 본 개시사항의 항-CD70 항체에 대한 특정한 복용량 요법은 다음의 복용량 스케쥴의 하나를 사용하여 주어진 항체로, 정맥 내 투여를 통해 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중을 포함한다: (i) 6회 복용에 대해서는 매 사 주, 그런 다음 매 세 달 간격; (ii) 매 삼 주; (iii) 일단 한번은 3 mg/kg 체중으로 하고 다음으로 매 삼 주 1 mg/kg 체중.
몇몇 방법에 있어서, 다른 결합 특이성을 갖는 본 개시사항의 둘 또는 그 이상의 항-CD70 모노크로날 항체가 동시적으로 투여되어 지고, 이 경우에 각 항체의 복용량은 지시된 범위 내로 되도록 투여된다. 항체는 통상적으로 복수의 경우로 투여되어 진다. 단일 복용 간의 간격은, 예를 들어 주 단위로, 월 단위로, 매 삼 개월 단위로 또는 매 년 단위로 될 수 있다. 간격은 또한 환자에 있어 타겟 항원에 대한 항체의 혈중 준위를 측정함에 의해 나타난 바에 따라 비규칙적으로 될 수 있다. 어떤 방법에서는, 복용은 약 1-1000 μg /ml의 플라즈마 항체 농도, 어떤 방법에서는 약 25-300 μg /ml의 플라즈마 항체 농도를 달성하도록 조정된다.
대안적으로, 항체는 지연된 방출 제형으로 투여되어 질 수 있고, 이 경우에 보다 적은 빈도 투여가 요구된다. 복용량 및 빈도는 환자에 있어서 항체의 반감기에 의존하여 다양하게 변한다. 일반적으로, 인간 항체는 가장 긴 반감기를 나타내고 그 다음으로 인체적응된 항체, 키메르 항체, 및 비인간 항체가 따른다. 투여의 복용량 및 빈도는 치료가 예방적 인지 또는 치료를 위한 것인지에 따라 다변할 수 있다. 예방적 적용에 있어서, 상대적으로 낮은 복용량은 장기간의 시간에 걸쳐 상대적으로 드문 간격으로 투여된다. 어떤 환자는 이들의 여생 동안 치료를 받는 것을 계속한다. 치료적 적용에 있어서는, 질병의 진행이 감소되거나 또는 중단되어 질 때까지 그리고 바람직하기로는 환자가 부분적으로 또는 완전한 질병의 증상의 개선을 보일 때까지 상대적으로 짧은 간격에서 상대적으로 높은 복용량이 때로는 필요하다. 따라서, 환자는 예방적인 요법이 투여되어 질 수 있다.
본 개시사항의 약학적 조성물에서 활성 성분의 실질적인 복용량 준위는 환자에 독이 됨이 없이 특정 환자, 조성물 및 투여의 양식에 대한 소망하는 치료적 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위하여 다양하게 변할 수 있다. 선택된 복용량 준위는 사용된 본 개시사항의 특정 조성물, 이들의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여의 경로, 투여의 시간, 사용된 특정 화합물의 배출율, 치료의 기간, 사용된 특정의 조성물과 조하하여 사용된 다른 약물, 화합물 및/또는 물질들, 치료되어 지는 환자의 나이, 성, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 병력 및 의료분야에 잘 알려진 다른 인자를 포함하는 다양한 약리운동학적 인자에 의존하여 변할 것이다.
본 개시사항의 항-CD70 항체의 "치료학적으로 유효한 복용량"은 바람직하기로는 질병 증상의 심각성을 감소하고, 질병 무증상 기간 및 빈도를 증가하고, 또는 질병 고통에 기인한 손상 및 불구를 예방을 초래한다. 예를 들어, CD70+ 종양의 치료에 대해서, "치료학적으로 유효한 복용량"은 바람직하기로는 치료되지 않은 대상에 비하여 적어도 약 20%, 보다 바람직하기로는 적어도 약 40%, 더 보다 바람직 하기로는 적어도 약 60%, 더더욱 보다 바람직하기로는 적어도 약 80%의 세포 성장 또는 종양 성장을 저해한다. 종양성장을 저해하는 화합물의 능력은 인간 종양에서 효능성에 진단적인 동물 모델 시스템으로 평가되어 질 수 있다. 대안적으로, 이 조성물의 특성은 숙달된 개업의에게 알려진 어세이에 의하여 생체 외에서의 저해와 같이, 저해하는 화합물의 능력을 검사함에 의해 평가될 수 있다. 치료적 화합물의 치료학적으로 유효한 량은 대상에서 종양의 사이즈를 감소하거나 그렇지 않으면 증상을 개선한다. 이 기술 분야에서의 통상인은 대상의 사이즈, 대상의 증상의 심각성, 및 선택된 투여의 경로 또는 특정한 조성물과 같은 인자에 기초하여 이러한 양을 결정할 수 있을 것이다.
본 개시사항의 조성물은 이 기술 분야에 알려진 하나 또는 그 이상의 다양한 방법을 사용하여 하나 또는 그 이상의 투여의 경로를 통해 투여되어 질 수 있다. 숙련된 전문가에 의해 인식되어 질 것과 같이, 투여의 경로 및/또는 양식은 희망하는 결과에 의존하여 다양하게 변할 것이다. 본 개시사항의 항체의 바람직한 투여의 경로는 정맥내, 근육내, 상피내로, 복막내로, 피하로, 척수로 또는, 예를 들어 주사 또는 주입에 의하는 투여의 다른 비경구적 경로를 포함한다. 여기에서 사용되는 것으로 구 "비경구적 투여"는 통상적으로 주사에 의한 내부로 및 국부적 투여 이외의 투여의 양식을 의미하고, 제한됨이 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 낭내로, 캡슐내, 궤도내, 심장내, 상피내, 복강내, 도관을 통해, 피하내, 큐티클아래, 관절내, 캡슐하, 거미막밑, 척수내, 경막외와 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
대안적으로, 본 개시사항의 항체는 국부적으로, 상피로 또는 점막의 투여 경 로와 같은 비-장관외 경로를 통해, 예를 들어 비강으로, 구강으로, 질 동맥으로, 직장으로, 설하로 또는 국소적으로 투여되어 질 수 있다.
활성성분은 임플란트, 피부를 통한 패치, 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는, 조절된 방출 제형과 같이 화합물을 빠른 방출에 대해 보호하는 담체로 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물류, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락산과 같은 생분해가능하고 생체적합한 폴리머들이 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조에 대한 많은 방법들이 특허되어 지거나 이 분야의 통상인에게 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978 참고.
치료적 조성물들은 이 기술 분야에 알려진 의료적 장치로 투여되어 질 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시형태에서, 본 개시사항의 치료적 조성물은 미국 특허번호 Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 또는 4,596,556에 기술된 장치와 같은 무바늘 피하 주사 장치로 투여되어 질 수 있다. 본 개시사항에 유용한 잘-알려진 임플란트 및 모듈의 예는; 조절된 비율로 의약을 분배하는 이식가능한 마이크로-주입 펌프를 개시하는 미국 특허번호 No. 4,487,603; 피부를 통해 치료제를 투여하기 위한 치료장치를 개시하는 미국 특허번호 No. 4,486, 194; 정확한 주입율로 치료약을 전달하는 의약 주입 펌프를 개시하는 미국 특허번호 No. 4,447,233; 지속적 약물 전달을 위한 가변 흐름의 이식가능한 유입 장치를 개시하는 미국 특허번호 No. 4,447,224; 멀티-챔버 구획부를 갖는 삼투적 약물 전달 시스템을 개시하는 미국 특허번호 No. 4,439,196; 및 삼투적 약물 전달 시스템을 개시하는 미국 특허번호 No. 4,475,196을 포함한다. 이들 특허는 여기에 레퍼런스로 합체된다. 많은 다른 이런 임프란트, 전달 시스템 및 모듈이 이 기술분야의 통상인에게 잘 알려져 있다.
어떤 실시형태에서, 본 개시사항의 인간 모노크로날 항체는 생체 내에서 적절한 분산을 공고하게 하기 위해 제형되어 질 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 배리어(BBB)는 아주 높은 친수성 화합물을 배제한다. 본 개시사항의 치료적 화합물이 BBB를 통과(만일 원한다면)하는 것을 확실하게 하기 위해, 이들은, 예를 들어 리포솜에 제형되어 질 수 있다. 리포솜을 제조하는 방법에 대해서는, 예를 들어 미국 특허번호 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331를 참고. 리포솜은 특정한 세포 또는 조직으로 선택적으로 이전되고, 따라서 타겟된 약물 전달을 증진하는 하나 또는 그 이상의 부분을 포함할 수 있다(예를 들어, V. V. Ranade (1989) J. Clin . Pharmacol. 29:685 참고). 예시적인 타겟하는 부분은 폴레이트 또는 바이오틴 (예를 들어, Low 등의 미국 특허번호 5,416,016 참고); 만노사이드류 (Umezawa et al., (1988) Biochem . Biophys . Res . Commun . 153:1038): 항체 (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob . Agents Chemother. 39:180); 계면활성제 단백질 A 리셉터 (Briscoe et al. (1995) Am . J. Physiol. 1233: 134); pl20 (Schreier et al. (1994) J. Biol . Chem. 269:9090)을 포함한다; 또한 K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; JJ. Killion; LJ. Fidler ( 1994) Immunomethods 4:273 참고.
본 개시사항의 용도 및 방법
본 개시사항의 항체, 특히 인간 항체, 항체 조성물 및 방법은 생체 외 및 생체 내에서 CD70 매개 질환의 진단 및 치료를 포함하여 다수의 진단 및 치료적 유용성을 갖는다. 예를 들어, 이들 분자는 실험실 또는 생체 외에서 배양에 있는 세포에 투여될 수 있고, 또는 다양한 질환을 치료, 예방 및 진단하기 위해 인간 대상에, 즉 생체 내에 투여되어 질 수 있다. 여기서 사용된 것으로, 용어 "대상"은 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 즉 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류 등과 같은 포유 및 비포유동물을 포함한다. 바람직한 대상은 CD70 활성에 의해 매개되어 지는 질환을 갖는 인간 환자이다. 이 방법은 특히 비정상적인 CD70 발현과 연계된 질환을 갖는 인간 환자를 치료하는데 적절하다. CD70에 대한 항체가 다른 제제와 함께 투여될 때, 이 두 개는 순차로 또는 동시적으로 투여되어 질 수 있다.
CD70에 대한 본 개시사항의 항체의 특징적 결합이 주어지면, 본 개시사항의 항체는 세포 표면 상에 CD70 발현을 특징적으로 검출하기 위해 사용되어 질 수 있고, 그리고 더욱이 면역친화성 정제를 통해 CD70을 정제하기 위해 사용되어 질 수 있다.
CD70은 신장 세포 암종, 전이성 유방암, 뇌 종양, 백혈병, 림프종 및 인후암종을 포함하는 다양한 인간의 암을 발현한다 (Junker et al. (2005) J Urol. 173:2150-3; Sloan et al. (2004) Am J Pathol. 164:315-23; Held-Feindt and Mentlein (2002) hit J Cancer 98:352-6; Hishima et al.(2000) Am J Surg Pathol. 24:742-6; Lens et al. (1999) Br J Haematol. 106:491-503). 항-CD70 항체는 암성 종양의 성장을 저해하기 위해 단독으로 사용되어 질 수 있다. 대안적으로, 아래에 기술되어지는 바와 같이, 항-CD70 항체는 다른 면역성 제제, 표준 암 치료제 또는 다른 항체와 조합하여 사용될 수 있다.
본 개시사항의 항체를 사용하여 그 성장이 저해될 수 있는 바람직한 암들은 면역요법에 전형적으로 반응하는 암을 포함한다. 치료에 대한 바람직한 암의 비-제한적인 예는 신장 암(즉, 신장 세포 암종), 유방암, 뇌 종양, 급성 미엘로마 백혈병, 만성 미엘로마 백혈병, 급성 림프 백혈병, 만성 림프 백혈병을 포함하는 만성 또는 급성 백혈병, 임파종(예를 들면, 호킨스 및 비-호지킨 림프종, 림프 임파종, 주요 중추신경 림프종, T-세포 림프종), 및 인후 암종을 포함한다. 본 개시사항의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 다른 암의 예로는 멜라노마 (예를 들면, 전이성 악성 멜라노마), 전립선 암, 대장암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 머리 또는 목의 암, 피부 또는 안구 악성 멜라노마, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 지역의 암, 위암, 고환 암, 자궁암, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 외음문암, 식도암, 작은 창자 암, 내분비계 암, 갑상선암, 부 동맥 암, 부신암, 연질 조직의 육종, 요도암, 성기암, 유년의 고체 종양, 방광암, 신장 또는 요관 암, 신장 골반 암, 중추 신경계(CNS) 종양, 림프관발생 종양, 척추 축 종양, 뇌 줄기 신경아교종, 뇌하수체선종, 카포지의 종양, 상피 암, 비늘모양 세포 암, 석면에 의해 유발된 것을 포함하는 환경적으로 유발된 암, 즉 중피종 및 상기 암들의 조합을 포함한다.
더욱이, CD70이 다양한 종양세포 상에 발현되어 지면, 본 개시사항의 인간 항체, 항체 조성물 및 방법은 발암성 질환, 즉 예를 들어, 투명세포 RCC같은 신장 세포 암종 (RCC), 아교모세포종, 유방 암, 뇌 종양, 인후 암종, 비-호지킨 림프종(NHL), 급성 림프 백혈병 (ALL), 만성 림프 백혈병 (CLL), 버킷 림프종, 악성 대세포 림프종 (ALCL), 다발성 골수종, 피부 T-세포 림프종, 결절성 소분할세포 림프절, 림프성 림프절, 말단 T-세포 림프절, 레너트 림프종, 이뮤노블라스트 림프절, T-세포 백혈병/림프절 (ATLL), 성인 T-세포 백혈병 (T-ALL), 엔트로블라스트/센트로사이트 (cb/cc) 엽포 림프절 암, B 계대의 미만성 대형세포 림프절, 혈관면역아세포 림프선병증 (AILD)-형 T 세포 림프종, HIV 연계 체강 기재 림프종, 태생암종, 비인두염의 미분화된 암종 (즉, 쉬민케 종양), 캐스틀만 질환, 카포지 사코마, 다발성 골수종, 웰덴스트롬 거대글로불린혈증 및 기타 B-세포 림프절을 포함하는 CD70 발현 종양 세포의 존재로 특징되어 지는 질환을 갖는 대상을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 일 실시형태에 있어서, 본 개시사항은 대상에 치료적으로 유효한 양의 항-CD70 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 투여하는 것을 포함하는 대상에 있어서의 종양의 성장을 저해하는 방법을 제공한다. 바람직하기로는, 항체는 인간 항-CD70 항체이다 (여기에 기술된 어떤 인간 항-인간 CD70 항체 같은 것). 부가적으로 또는 대안적으로, 항체는 키메르 또는 인체적응된 항-CD70 항체일 수 있다.
부가적으로, CD27과 CD70의 상호작용은 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)과 같은 세포-매개 자가면역 질환에서 역활을 하는 것이 또한 제안되었다 (Nakajima et al (200O) J. Neuroimmunol. 109:188-96). 이효과는 TNF-알파 생성의 저해에 의하 여 부분적으로 조절되어 지는 것으로 생각되어졌다. 더욱이, CD70 신호화의 차단이 CD8+ T-세포의 CD40-매개 클론의 확장을 저해하고 그리고 CD8+ 메모리 T-세포의 생성을 감소한다 (Taraban et al. (2004) J Immunol. 173:6542-6). 이와 같이, 본 개시사항의 인간 항체, 항체 조성물 및 방법은 예를 들어 실험적 자가면역 뇌척수염을 포함하는, B-세포 발현 CD70의 존재에 의해 특징되어 지는 질환과 같은 자가면역 질환을 갖는 대상을 치료하기 위해 사용되어 질 수 있다. 본 개시사항의 항체가 사용될 수 있는 부가적인 자가면역 질환은, 여기에 제한되는 것은 아니지만, 전신 홍반성 낭창(SLE), 인슐린 의존성 진성 당뇨병(IDDM), 염증성 장질환(IBD) (크론 질병, 궤양성 대장염, 소아 지방변증을 포함), 다발성 경화증(MS), 건선, 자가면역 갑상선염, 류마티스성 관절염(RA) 및 사구체 신염을 포함한다. 더욱이, 본 개시사항의 항체 조성물은 이식 거부를 저해하거나 방지하기 위해 또는 이식편대숙주병(GVHD)의 치료를 위해 사용되어 질 수 있다.
부가적으로, CD27과 CD70의 상호작용은 CD4+ T 상에서 신호화에서 역활을 하는 것이 또한 제안되었다. 몇몇 바이러스가 CD27 경로를 신호화 하여, 항체 반응을 중화하는 파괴를 이끈다는 것을 나타냈다 (Matter et al. (2006) J Exp Med 203:2145-55). 이와 같이, 본 개시사항의 인간 항체, 항체 조성물 및 방법은 예를 들어 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 간염 (A, B, 또는 C), 헤르페스 바이러스(예를 들어, VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II, 및 CMV, 엡스타인바바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코르노바이러스, 호흡기세포융합바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 로타 바이러스, 홍역 바이러스, 루벨라 바이러스, 파르보바이러스, 백시너 바이러스, HTLV 바이러스, 댕기열 바이러스, 파필로마바이러스, 몰루스쿰 바이러스, 폴리오바이러스, 공수병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스의 뇌염 바이러스 및 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV) 로부터의 감염을 포함하는, 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하기 위해 또는 HIV 감염/AIDS의 치료에 사용되어 질 수 있다. 부가적으로, 본 개시사항의 인간 항체, 항체 조성물 및 방법은 TNF-알파 생성을 저해하기 위해 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시사항의 항체 (즉, 인간 모노크로날 항체, 멀티스페시픽 및 비스페시픽 분자 및 조성물)는 CD70의 준위 또는 이들의 멤브레인 표면에 CD70을 포함하는 세포의 준위를 검지하기 위해 사용되어 질 수 있고, 이 준위는 그런 다음 어떤 질병 증상에 연결되어 질 수 있다. 대안적으로, 항체는 순서대로 어떤 질병증상의 예방 또는 완화에 연결되어 질 수 있는 CD70 작용을 저해하거나 또는 차단하기 위하여 사용되어 질 수 있고, 이에 의해 질병의 조절자로서 CD70을 연루시킨다. 이것은 항체와 CD70과의 복합체를 형성할 수 있는 조건 하에서 실험 샘플 및 대조 샘플을 항-CD70 항체와 접촉시킴에 의해 달성될 수 있다. 항체와 CD70과의 사이에 형성된 복합체가 실험 샘플 및 대조 샘플에서 검출되고 비교되었다.
다른 실시형태에서는, 본 개시사항의 항체 (즉, 인간 항체, 멀티스페시픽 및 비스페시픽 분자 및 조성물)는 생체 외에서 치료적 또는 진단적 용도와 연결된 결합활성에 대해 처음으로 시험되었다. 예를 들어, 본 개시사항의 조성물은 아래 시시예 기술된 세포유동분석법을 사용하여 시험되어 질 수 있다.
본 개시사항의 항체 (즉, 인간 항체, 멀티스페시픽 및 비스페시픽 분자, 이뮤노컨쥬게이트 및 조성물)는 CD70-관련 질환의 치료 및 진단에 부가적 유용성을 가진다. 예를 들어, 인간 모노크로날 항체, 멀티스페시픽 또는 비스페시픽 분자 및 이뮤노컨쥬게이트는 생체 내에서 또는 생체 외에서 하나 또는 그 이상의 다음의 생물학적 활성을 유도하기 위해 사용되어 질 수 있다: CD70을 발현하는 세포의 성장을 저해하거나 및/또는 죽이는 것; 인간 이펙터 세포의 존재하에 CD70을 발현하는 세포의 식세포작용 또는 ADCC를 조정하는 것; 또는 CD70에 결합하는 CD70 리간드를 차단하는 것.
특정한 실시형태에서, 항체 (즉, 인간 항체, 멀티스페시픽 및 비스페시픽 분자 및 조성물)는 생체 내에서 각종 CD70-관련 질환을 치료, 예방 또는 진단하기 위해 사용되어 진다. CD70-관련 질환의 예는, 다른 것들 중에, 자가면역 질환, 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE), 암, 투명세포 RCC같은 신장 세포 암종 (RCC), 아교모세포종, 유방 암, 뇌 종양, 인후 암종, 비-호지킨 림프종, 급성 림프 백혈병 (ALL), 만성 림프 백혈병 (CLL), 버킷 림프종, 악성 대세포 림프종 (ALCL), 다발성 골수종, 피부 T-세포 림프종, 결절성 소분할세포 림프절, 림프성 림프절, 말단 T-세포 림프절, 레너트 림프종, 이뮤노블라스트 림프절, T-세포 백혈병/림프절 (ATLL), 성인 T-세포 백혈병 (T-ALL), 엔트로블라스트/센트로사이트 (cb/cc) 엽포 림프절 암, B 계대의 미만성 대형세포 림프절, 혈관면역아세포 림프선병증 (AILD)-형 T 세포 림프종, HIV 연계 체강 기재 림프종, 태생암종, 비인두염의 미분화된 암종 (즉, 쉬민케 종양), 캐스틀만 질환, 카포지 사코마, 다발성 골수종, 웰덴스트롬 거대글로불린혈증 및 기타 B-세포 림프절을 포함한다.
생체 내 및 생체 외에서 본 개시사항의 항체 조성물 (즉, 인간 모노크로날 항체, 멀티스페시픽 및 비스페시픽 분자 및 이뮤노컨쥬게이트)을 투여하는 적절한 경로는 이 기술 분야에 잘 알려져 있고, 그리고 통상인에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체 조성물은 주사(예를 들어, 정맥 내로 또는 피하로)에 의해 투여되어 질 수 있다. 사용된 분자의 적절한 복용량은 대상의 연령 및 체중과 항체 조성물의 농도 및/또는 제형에 의존할 것이다.
이미 기술한 바와 같이, 본 개시사항의 인간 항-CD70 항체는 하나 또는 그 이상의 다른 치료적 제제, 예를 들어 세포독소 제제, 방사독소 제제 또는 면역억제 제제와 같이 투여되어 질 수 있다. 항체는 제제에 연결되어 질 수 있고(면역 복합체로서) 또는 제제와 별도로 투여되어 질 수 있다. 후자의 경우(별도 투여)에, 항체는 전에, 후에 또는 제제와 동시적으로 투여되어 질 수 있고 또는 다른 공지된 치료법, 예를 들어 방사와 같은 항암 치료와 같이 투여될 수 있다. 이러한 치료적 제제는, 다른 것 중에서 이들 자체로 환자에 독성이거나 독성 이하인 수준으로만 유효한 독소루비신(아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 설페이트, 카르뮤스틴, 크로르암부실 및 시클로포스파미드 하이드록시우레아와 같은 항-신생 제제를 포함한다. 시스플라틴은 매 4주에 한번 씩 100 mg/복용량으로 정맥 내로 투여되고, 그리고 아드리아마이신은 매 21일에 한번 씩 60-75 mg/ml 복용량으로 정맥 내로 투여된다. 화학치료제와 본 개시사항의 인간 항-CD70 항체 또는 이들의 항원 결합 부분의 공동 투여는 인간 종양 세포에 대해 세포독성 효과를 생성하는 다른 메카니즘 을 통해 작동하는 두 개의 항암 제제를 제공한다. 이러한 공동 투여는 약물에 대한 저항성의 전개 또는 항체로 이들 종양 세포에 비반응성을 부여하는 종양 세포의 항원성에 있어서의 변화에 기인한 문제점을 해결할 수 있다.
타겟-특이적 이펙터 세포, 즉 본 개시사항의 조성물 (즉, 인간 항체, 멀티스페시픽 및 비스페시픽 분자)는 또한 치료적 제제로 사용되어 질 수 있다. 타겟화를 위한 이펙터 세포는 매크로파아지, 뉴트로필 또는 모노사이트와 같은 인간 백혈구일 수 있다. 다른 세포는 호산백혈구, 뉴트럴 킬러 세포 및 다른 IgG- 또는 IgA-수용체 담지 세포를 포함한다. 원한다면, 이펙터 세포는 치료되어 지는 대상으로부터 얻어질 수 있다. 타겟-특이적 이펙터 세포는 생리학적으로 허용가능한 용액에 세포의 현탁액으로 투여되어 질 수 있다. 투여되는 세포의 수는 108 - 109 정도될 수 있지만, 치료적 목적에 의존하여 변할 수 있다. 일반적으로, 이 양은 타겟 세포, 즉 CD70 발현 종양 세포에 국소화를 얻기에 충분하고 그리고 예를 들어 식세포작용에 의해 세포를 죽이는 효과가 충분하다. 투여의 경로는 또한 다양하게 될 수 있다.
타겟-특이적 이펙터 세포로의 치료는 타겟된 세포의 제거를 위한 다른 기술과 연계하여 수행되어 질 수 있다. 예를 들어, 본 개시사항의 조성물 (즉, 인간 항체, 멀티스페시픽 및 비스페시픽 분자) 및/또는 이들 조성물이 보강된 이펙터 세포를 사용하여 항-종양 치료가 화학적치료법과 연계하여 사용되어 질 수 있다. 부가적으로, 조합 면역치료법은 두 개의 뚜렷한 세포독성 이펙터 모집단을 종양 세포 거부를 위해 사용되어 질 수 있다. 예를 들어, 항-Fc-감마 RI 또는 항-CD3에 연결 된 항-CD70 항체는 IgG- 또는 IgA-수용체 특이적 결합 제제와 연계하여 사용되어 질 수 있다.
본 개시사항의 멀티스페시픽 및 비스페시픽 분자는 또한 세포 표면 상에 수용체를 캡핑하고 제거함에 의해서와 같이 이펙터 세포 상에 FcγR 또는 FcγR 준위를 조정하기 위하여 사용되어 질 수 있다. 항-Fc 수용체의 혼합물은 이 목적으로 사용되어 질 수 있다.
보체를 결합하는 IgGl, -2 또는 -3 또는 IgM으로부터의 부분과 같이 보체 결합 사이트를 갖는 본 개시사항의 조성물 (즉, 인간 항체, 멀티스페시픽 및 비스페시픽 분자 그리고 이뮤노컨쥬게이트)은 보체의 존재하에서 또한 사용되어 질 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 타겟 세포를 포함하는 세포의 모집단을 본 개시사항의 결합 제제와 적절한 이펙터 세포로의 생체 외 처리는 보체 또는 보체를 포함하는 혈청의 부가에 의해 보충되어 질 수 있다. 본 개시사항의 결합 제제로 도포된 타겟 세포의 식세포작용은 보체 단백질의 결합에 의해 개선되어 질 수 있다. 다른 실시형태에서는, 본 개시사항의 조성물 (즉, 인간 항체, 멀티스페시픽 및 비스페시픽 분자)로 도포된 타겟 세포는 보체에 의하여 또한 융융되어 질 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 본 개시사항의 조성물은 보체를 활성화하지 않는다.
본 개시사항의 조성물 (즉, 인간 항체, 멀티스페시픽 및 비스페시픽 분자 그리고 이뮤노컨쥬게이트)은 또한 보체와 함께 투여되어 질 수 있다. 따라서, 본 개시사항의 범주 내는 인간 항체, 멀티스페시픽 및 비스페시픽 분자 및 혈청 또는 보체를 포함하는 조성물이다. 이들 조성물은 보체가 인간 항체, 멀티스페시픽 및 비 스페시픽 분자에 아주 근접하여 위치된다는 이점이 있다. 대안적으로, 본 개시사항의 인간 항체, 멀티스페시픽 및 비스페시픽 분자 및 보체 또는 혈청이 별도로 투여되어 질 수 있다.
또한, 본 개시사항의 항체 조성물(예를 들어, 인간 항체, 비스페시픽 또는 멀티스페시픽 분자 또는 이뮤노컨쥬게이트) 및 사용 지시를 포함하는 키트도 본 발명의 범주 내이다. 이 키트는 더욱이 면역억제제, 세포독성제제 또는 방사성 독성제제와 같은 적어도 하나의 부가적인 시약 또는 본 개시사항의 하나 또는 그 이상의 부가적인 인간 항체(예를 들어, 제일 인간 항체와 구별되는 CD70 항원 내에서 항원결정인자에 결합하는 상보적인 활성을 갖는 인간 항체)를 포함할 수 있다.
따라서, 본 개시사항의 항체 조성물로 처리된 환자는 부가적으로 세포독성제제 또는 방사성 독성제제와 같은 인간 항체의 치료적 효과를 증진하거나 고양하는 다른 치료제제와 같이 (본 개시사항의 인간 항체 투여 전에, 동시에, 또는 그 후에) 투여되어 질 수 있다.
다른 실시형태에서, 대상은 예를 들어 시토킨으로 대상을 치료함에 의해 Fcγ 또는 Fcγ 수용체의 발현 또는 활성을 조절, 즉 증진하거나 저해하는 제제로 부가적으로 처리되어 질 수 있다. 멀티스페시픽 분자로 치료하는 동안 투여되기 위한 바람직한 시토킨은 그래뉼로사이트 콜로니 자극 인자(G-CSF), 그래뉼로사이트 매크로파이지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터페론-γ(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 (TNF)를 포함한다.
본 개시사항의 조성물(예를 들어, 인간 항체, 멀티스페시픽 분자 및 비스페 시픽 분자)은 예를 들어 FcγR 또는 CD70 발현 세포를 표지하기 위해 FcγR 또는 CD70 발현 세포를 타겟으로 하기 위해 사용되어 질 수 있다. 이러한 용도를 위해, 결합 제제는 검출되어 질 수 있는 분자에 링커되어 질 수 있다. 따라서, 본 개시사항은 FcγR 또는 CD70과 같은 Fc 수용체 발현 세포를 생체 외 또는 실험실 내에서 어떤 장소에 배치하는 방법을 제공한다. 검출할 수 있는 라벨은 예를 들어, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 코-팩터일 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 개시사항은 샘플 또는 대조 샘플을 인간 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위와 접촉하는 것을 포함하여, 항체 또는 이들의 부분과 CD70과의 복합체를 형성할 수 있게 하는 조건하에서 CD70에 특이적으로 결합하는, 샘플에서 CD70 항원의 존재를 검출하거나 또는 CD70 항원의 양을 측정하는 방법을 제공한다. 이 복합체의 형성이 그런 다음 검출되어, 여기서 대조 샘플에 비교된 샘플과의 사이에서 복합체 형성 차이가 샘플에 있어서 CD70 항원의 존재를 암시한다.
또 다른 실시형태에서, 본 개시사항의 이뮤노컨쥬게이트는 아래 화합물을 항체에 연결함에 의해 CD70 세포 표면 수용체를 갖는 세포에 대해 화합물(즉, 치료적 제제, 라벨, 세포독성, 방사성 독성 면역억제제 등)을 타겟으로 하기 위해 사용되어 질 수 있다. 예를 들어, 항-CD70 항체는 여기서 그 전체로서 레퍼런스로 합체되어 지는 미국 특허번호 Nos. 6,281,354 및 6,548,530, 미국 특허공개번호 Nos. 20030050331, 20030064984, 20030073852 및 20040087497에 기술된 또는 WO 03/022806에 공개된 세포독성 화합물의 어느 것에 컨쥬게이트되어 질 수 있다. 따 라서, 본 개시사항은 또한 CD70 발현 세포(즉, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 코-팩터와 같은 검출가능한 라벨로)를 생체 외 또는 실험실 내에서 어떤 장소에 배치하는 방법을 제공한다. 대안적으로, 이뮤노컨쥬게이트는 CD70에 세포독성 또는 방사성 독성을 표적함에 의해 CD70 세포 표면 수용체를 갖는 세포를 사멸하기 위해 사용되어 질 수 있다.
본 개시사항은 부가적인 제한으로서 해석되지 않는 다음의 실시예에 의하여 더욱 자세히 기술된다. 모든 도면 및 이 출원 명세서 전체를 통해 인용된 모든 레퍼런스, 특허 및 공개된 특허출원은 분명하게 여기에 레퍼런스로 합체되어 진다.
실시예
실시예 1 : CD70 에 대한 인간 모노크로날 항체의 생성
항원
면역화반응 프로토콜이 듀얼 myc-His 태그로 용융된 재조합 인간 CD70을 항원으로 이용하였다. 대안적으로, 신장 암종 세포 라인 786-0 (ATCC Accession No. CRL- 1932)을 사용한 전 세포 면역화 반응 및 신장 암종 세포 라인 A- 498 (ATCC Accession No. HTB-44)로 부스트된 전 세포 면역화 반응이 몇몇 면역화 반응에 사용되었다.
형질전환 HuMAb 마우스® 및 KM 마우스®
CD70에 대해 완전한 인간 모노크로날 항체가 인간 항체 유전자를 각각 발현하는 형질전환성 트랜스크로모솜 마우스의 KM 스트레인 및 HuMab 형질전환성 마우스의 HCo7, HCo 12 및 HCo 17 스트레인을 사용하여 제조되었다. 이들 마우스 스트 레인에, 내인성 마우스 카파 경사슬 유전자가 Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820에 기술된 바와 같이 균질하게 파열되고 그리고 내인성 마우스 카파 중사슬 유전자가 PCT 공개공보 WO 01/09187의 실시예 1에 기술된 바와 같이 균질하게 파열되었다. 더욱이, 이 마우스 스트레인은 Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851에 기술된 바와 같이 인간 카파 경사슬 이식 유전자인 KCo5, 및 PCT 공개공보 WO 01/09187의 실시예 2에 기술된 바와 같이 인간 중사슬 이식 유전자인 HCo7, HCo 12 또는 HCo 17을 담지한다. 그리고 KM 마우스® 스트레인은 PCT 공개공보 WO 02/43478에 기술된 바와 같은 SC20 트랜스크로모솜을 포함한다.
HuMab 및 KM 면역화반응
CD70에 대해 완전한 인간 모노크로날 항체를 생성하기 위해, HuMAb 마우스® 및 KM-마우스®의 마우스들이 항원으로 재조합 인간 CD70 또는 세포 표면 상에 CD70을 발현하는 전 세포로 면역되었다. HuMab 마우스에 대한 일반적인 면역화 계획은 Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 11: 845-851, 및 PCT 공개공보 WO 98/24884에 기술되어 있다. 마우스는 항원의 제 일차 주입 후 6-16 주령이 되었다. 5-lO x lO6 세포가 복막 내로 (IP), 피하로 (Sc) 또는 발바닥 주입을 통해 HuMab 마우스를 면역화하기 위해 사용되었다.
유전자이식된 마우스는 컴플릿트 프로이드 어쥬번트 또는 리비 어쥬번트 내 에 항원으로 IP로 이회 면역되고, 컴플릿트 프로이드 어쥬번트 또는 리비 어쥬번트 내 항원으로 3-21일 IP(전체 11회 면역에 달함)가 따른다. 면역 반응은 레트로오비탈 블리드에 의해 모니터되어 진다. 플라즈마는 ELISA 및 FACS에 의해 선별되고(아래에 기술된 바와 같음) 그리고 충분한 역가의 항-CD70 인간 이뮤노글로불린을 갖는 마우스가 용융을 위해 사용되었다. 마우스는 희생되어 비장이 제거되기 3일 전에 정맥 내로 항원이 주입되었다. 전형적으로는, 각 항원에 대해 10-35 용융이 수행되었다. 다수 무리의 마우스가 각 항원에 대해 면역화되었다.
항- CD70 항체를 생산하는 HuMab 마우스® 또는 KM -마우스®의 셀렉션 :
CD70를 결합한 항체를 생산하는 HuMab 마우스 또는 KM-마우스®를 선정하기 위해, 면역화된 마우스로부터의 혈청이 CD70을 발현하지 않는 대조군 세포 라인이 아닌 재조합 인간 CD70을 발현하는 세포 라인에 결합에 대해 유동세포분석법에 의해 스크린되었다. 부가하여, 786-0 또는 A-498 세포에 결합에 대해 유동세포분석법에 의해 스크린되었다. 간략하게는, 항-CD70 항체의 결합은 CD70-발현 CHO 세포, 786-0 세포 또는 A498 세포를 항-CD70 항체로 1:20 희석에서 배양함에 의해 분석되었다. 세포는 수세되고 그리고 결합이 FITC-표지 항-인간 IgG Ab로 검출되었다. 유동세포분석법이 FACS 캘리버 유동세포분석법 (Becton Dickinson, San Jose, CA)을 사용하여 수행되었다. 비-CD70 발현 모체 CHO 세포가 아닌 CD70 발현 CHO 세포에 결합하는 항체가 Fishwild, D. et al. (1996)에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 CD70에 대한 결합에 대해 더 테스트되었다. 간략하게는, 마이크로타이터 플레이트가 PBS 내 1-2 μg/ml로 트랜스펙트된 CHO로부터 정제된 재조합 CD70 용융 단백질 로 도포되어 지고, 100 μl/웰이 4℃에서 밤 세워 배양되고, 그런 다음 PBS/트윈 (0.05%) 내에 200 μl/웰의 5% 치킨 혈청으로 차단되었다. CD70-면역 마우스로부터 혈청의 희석이 각 월에 부가되고 대류 온도에서 1-2 시간 동안 배양된다. 플레이트는 PBS/트윈으로 수세되고 그런 다음 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)와 컨쥬게이트된 고트-항-인간 IgG 폴리크로날 항체로 1시간 동안 실온에서 배양된다. 수세 후, 플레이트는 ABTS 기판 (Sigma, A-1888, 0.22 mg/ml)으로 전개되고 그리고 OD 415-495에서 스펙트로포토미터에 의해 측정되었다. 가장 높은 역가의 항-CD70 항체를 전개한 마우스가 용융을 위해 사용되었다. 용융은 아래에 기술된 바와 같이 수행되었고, 하이브리도마 상등액이 ELISA에 의한 항-CD70 활성에 대해 시험되었다.
CD70 에 대해 인간 모노크로날 항체를 생산 하이브리도마의 생성:
HuMab 마우스® 및/또는 KM 마우스로부터 분리된 마우스 비장세포가 사이토 펄스 라지 챔버 세포 용융 일렉트로포레이터(Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD)를 사용한 전자용융에 기한 전자 분야 또는 표준 기술에 기초한 PEG의 어느 하나를 사용하여 마우스 미엘로마 셀 라인에 용융되었다. 얻어진 하이브리도마는 그런 다음 항원-특이적 항체의 생성에 대해 선별되었다. 면역된 마우스로부터 비장세포의 단일 세포 현탁액이 SP2/0 비분비 마우스 미엘로마 세포(ATCC, CRL 1581)의 사분의 일의 수에 50% PEG (Sigma)로 용융된다. 세포는 L-글루타민 및 소디움 피브레이트 (Mediatech, Inc., Herndon, VA)를 가지고 더욱이 10% 송아지 혈 (Hyclone, Logan, UT)청, 18% P388DI 조건부 배지, 5% 오리젠 하이브리도마 클로닝 인자(BioVeris, Gaithersburg, VA), 4 mM L-글루타민, 5mM HEPES, 0.055 mM β-머 캅토에탄올, 50 units/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신 및 1X 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘 (HAT) 배지 (시그마; HAT는 용융 24시간 후에 부가됨)를 포함하는 DMEM 고 글루코스 배지에서 일 주 동안 배양되어 진 후 평판 바닥 마이크로타이터 플레이트에 대략 2 x 105로 이식되어 진다. 일 주일 후, 세포는 HAT가 HT로 대체된 배지에서 배양된다. 개개의 웰은 그런 다음 인간 항-CD70 모노크로날 IgG 항체에 대해 FACS 또는 ELISA (상술한 것)에 의해 선별된다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 발생되면, 배지는 통상적으로 10-14일 후에 모니터된다. 항체-분비 하이브리도마가 재이식되고 다시 선별되고, 그리고 여전히 인간 IgG에 대해 양성이면, 항-CD70 모노크로날 항체가 희석을 제한함에 의해 적어도 이회 서브클론되어 진다. 안정한 서브클론은 그런 다른 추가적인 특징화를 위해 조직 배양 배지에서 소량의 항체를 생성하기 위해 실험실 내에서 배양된다.
하이브리도마 클론 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 및 69A7가 부가적인 분석을 위해 선택되어 졌다.
실시예 2: 인간 모노크로날 항체 2 H5 , 10B4, 8B5, 18 E7 및 69A7의 구조적 특징
2H5, 10B4, 8B5, 18E7 및 69A7 모노크로날 항체의 중 및 경사슬들을 코드하는 cDNA 시퀀스가 표준 PCR 기술을 사용하여 각각 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 및 69A7 하이브리도마로부터 수득되어 지고 그리고 표준 DNA 시퀀싱 기술을 사용하여 시퀀스되었다.
2H5의 중사슬 가변영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 시퀀스는 도 1A와 SEQ ID NO:41 및 1에 각각 도시되어 있다.
2H5의 경사슬 가변영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 시퀀스는 도 1B와 SEQ ID NO:46 및 6에 각각 도시되어 있다.
공지된 인간 생식계열 이뮤노글로불린 중사슬 시퀀스에 2H5 중사슬 이뮤노글로불린 시퀀스의 비교는 2H5 중사슬이 인간 생식계열 VH 3-30.3로부터 VH 분절, 미결정 D 분절 및 인간 생식계열 JH 4b로부터 JH 분절을 이용하는 것을 증명한다. 생식계열 VH 3-30.3 시퀀스에 대한 2H5 VH 시퀀스의 얼라인먼트는 도 6에 나타나 있다. CDR 영역 결정을 위한 카밧트 시스템을 사용한 2H5 VH 시퀀스의 부가적인 분석은 도 1A 및 6과 SEQ ID NOs:11, 16 및 21에 각각 나타난 바와 같이 중사슬 CDRl, CDR2 및 CD3 영역의 윤곽을 끌어낸다.
공지된 인간 생식계열 이뮤노글로불린 경사슬 시퀀스에 2H5 경사슬 이뮤노글로불린 시퀀스의 비교는 2H5 경사슬이 인간 생식계열 VK L6로부터 VL 분절 및 인간 생식계열 JK 4로부터 JK 분절을 이용하는 것을 증명했다. 생식계열 VK L6 시퀀스에 대한 2H5 VL 시퀀스의 얼라인먼트는 도 9에 나타나 있다. CDR 영역 결정을 위한 카밧트 시스템을 사용한 2H5 VL 시퀀스의 부가적인 분석은 도 1B 및 9와 SEQ ID NOs:26, 31 및 36에 각각 나타난 바와 같이 경사슬 CDRl, CDR2 및 CD3 영역의 윤곽을 끌어낸다.
10B4의 중사슬 가변영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 시퀀스는 도 2A와 SEQ ID NO:42 및 2에 각각 도시되어 있다.
10B4의 경사슬 가변영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 시퀀스는 도 2B와 SEQ ID NO:47 및 7에 각각 도시되어 있다.
공지된 인간 생식계열 이뮤노글로불린 중사슬 시퀀스에 10B4 중사슬 이뮤노글로불린 시퀀스의 비교는 10B4 중사슬이 인간 생식계열 VH 3-30.3으로부터 VH 분절, 인간 생식계열 4-11으로부터 D 분절 및 인간 생식계열 JH 4b로부터 JH 분절을 이용하는 것을 증명했다. 생식계열 VH 3-30.3 시퀀스에 대한 10B4 VH 시퀀스의 얼라인먼트는 도 6에 나타나 있다. CDR 영역 결정을 위한 카밧트 시스템을 사용한 10B4 VH 시퀀스의 부가적인 분석은 도 2A 및 6과 SEQ ID NOs:12, 17 및 22에 각각 나타난 바와 같이 중사슬 CDRl, CDR2 및 CD3 영역의 윤곽을 끌어낸다.
공지된 인간 생식계열 이뮤노글로불린 경사슬 시퀀스에 10B4 경사슬 이뮤노글로불린 시퀀스의 비교는 10B4 경사슬이 인간 생식계열 VK L18로부터 VL 분절 및 인간 생식계열 JK 3으로부터 JK 분절을 이용하는 것을 증명했다. 생식계열 VK L18 시퀀스에 대한 10B4 VL 시퀀스의 얼라인먼트는 도 10에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧트 시스템을 사용한 10B4 VL 시퀀스의 부가적인 분석은 도 2B 및 10과 SEQ ID NOs:27, 32 및 37에 각각 나타난 바와 같이 경사슬 CDRl, CDR2 및 CD3 영역의 윤곽을 끌어낸다.
8B5의 중사슬 가변영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 시퀀스는 도 3A와 SEQ ID NO:43 및 3에 각각 도시되어 있다.
8B5의 경사슬 가변영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 시퀀스는 도 3B와 SEQ ID NO:48 및 8에 각각 도시되어 있다.
공지된 인간 생식계열 이뮤노글로불린 중사슬 시퀀스에 8B5 중사슬 이뮤노글 로불린 시퀀스의 비교는 8B5 중사슬이 인간 생식계열 VH 3-33으로부터 VH 분절, 인간 생식계열 3-10으로부터 D 분절 및 인간 생식계열 JH 4b로부터 JH 분절을 이용하는 것을 증명했다. 생식계열 VH 3-33 시퀀스에 대한 8B5 VH 시퀀스의 얼라인먼트는 도 7에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧트 시스템을 사용한 8B5 VH 시퀀스의 부가적인 분석은 도 3A 및 7과 SEQ ID NOs:13, 18 및 23에 각각 나타난 바와 같이 중사슬 CDRl, CDR2 및 CD3 영역의 윤곽을 끌어낸다.
공지된 인간 생식계열 이뮤노글로불린 경사슬 시퀀스에 8B5 경사슬 이뮤노글로불린 시퀀스의 비교는 8B5 경사슬이 인간 생식계열 VK Ll5로부터 VL 분절 및 인간 생식계열 JK 4로부터 JK 분절을 이용하는 것을 증명했다. 생식계열 VK Ll5 시퀀스에 대한 8B5 VL 시퀀스의 얼라인먼트는 도 11에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧트 시스템을 사용한 8B5 VL 시퀀스의 부가적인 분석은 도 3B 및 11과 SEQ ID NOs:28, 33 및 38에 각각 나타난 바와 같이 경사슬 CDRl, CDR2 및 CD3 영역의 윤곽을 끌어낸다.
18E7의 중사슬 가변영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 시퀀스는 도 4A와 SEQ ID NO:44 및 4에 각각 도시되어 있다.
18E7의 경사슬 가변영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 시퀀스는 도 4B와 SEQ ID NO:49 및 9에 각각 도시되어 있다.
공지된 인간 생식계열 이뮤노글로불린 중사슬 시퀀스에 18E7 중사슬 이뮤노글로불린 시퀀스의 비교는 18E7 중사슬이 인간 생식계열 VH 3-33으로부터 VH 분절, 인간 생식계열 3-10으로부터 D 분절 및 인간 생식계열 JH 4b로부터 JH 분절을 이용 하는 것을 증명했다. 생식계열 VH 3-33 시퀀스에 대한 18E7 VH 시퀀스의 얼라인먼트는 도 7에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧트 시스템을 사용한 18E7 VH 시퀀스의 부가적인 분석은 도 4A 및 7과 SEQ ID NOs:14, 19 및 24에 각각 나타난 바와 같이 중사슬 CDRl, CDR2 및 CD3 영역의 윤곽을 끌어낸다.
공지된 인간 생식계열 이뮤노글로불린 중사슬 시퀀스에 18E7 경사슬 이뮤노글로불린 시퀀스의 비교는 18E7 경사슬이 인간 생식계열 VK L15으로부터 VL 분절 및 인간 생식계열 JK 4로부터 JK 분절을 이용하는 것을 증명했다. 생식계열 VK Ll5 시퀀스에 대한 18E7 VL 시퀀스의 얼라인먼트는 도 11에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧트 시스템을 사용한 18E7 VH 시퀀스의 부가적인 분석은 도 4B 및 11과 SEQ ID NOs:29, 34 및 39에 각각 나타난 바와 같이 경사슬 CDRl, CDR2 및 CD3 영역의 윤곽을 끌어낸다.
69A7의 중사슬 가변영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 시퀀스는 도 5A와 SEQ ID NO:45 및 5에 각각 도시되어 있다.
69A7의 경사슬 가변영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 시퀀스는 도 5B와 SEQ ID NO:50 및 10에 각각 도시되어 있다.
공지된 인간 생식계열 이뮤노글로불린 중사슬 시퀀스에 69A7 중사슬 이뮤노글로불린 시퀀스의 비교는 69A7 중사슬이 인간 생식계열 VH 4-61로부터 VH 분절, 인간 생식계열 4-23로부터 D 분절 및 인간 생식계열 JH 4b로부터 JH 분절을 이용하는 것을 증명했다. 생식계열 VH 4-61 시퀀스에 대한 69A7 VH 시퀀스의 얼라인먼트는 도 8에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧트 시스템을 사용한 69A7 VH 시퀀스 의 부가적인 분석은 도 5A 및 9와 SEQ ID NOs:15, 20 및 25에 각각 나타난 바와 같이 중사슬 CDRl, CDR2 및 CD3 영역의 윤곽을 끌어낸다.
공지된 인간 생식계열 이뮤노글로불린 경사슬 시퀀스에 69A7 경사슬 이뮤노글로불린 시퀀스의 비교는 69A7 경사슬이 인간 생식계열 VK L6으로부터 VL 분절 및 인간 생식계열 JK 4로부터 JK 분절을 이용하는 것을 증명했다. 생식계열 VK L6 시퀀스에 대한 69A7 VL 시퀀스의 얼라인먼트는 도 12에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧트 시스템을 사용한 69A7 VL 시퀀스의 부가적인 분석은 도 5B 및 12와 SEQ ID NOs:30, 35 및 40에 각각 나타난 바와 같이 경사슬 CDRl, CDR2 및 CD3 영역의 윤곽을 끌어낸다.
실시예 3 : 항- CD70 인간 모노크로날 항체의 결합 특이성의 특징
면역정제된 CD70에 결합에 대한 항-CD70 항체의 비교가 CD70에 대한 결합의 특이성을 시험하기 위해 표준 ELISA에 의하여 수행되어 졌다.
재조합 myc-태그 CD70은 플레이트 상에서 밤세워 도막되어 지고, 그런 다음 항-CD70 인간 모노크로날 항체 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 및 69A7에 대한 결합에 대하여 시험되어 진다. 표준 ELISA 절차가 수행되었다. 항-CD70 인간 모노크로날 항체가 1 μg/ml의 농도로 부가되고 그런 다음 1:2 일련의 희석으로 적정되어졌다. 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)와 컨쥬게이트된 고트-항-인간 IgG (Fc 또는 카파 사슬-특이적) 폴리크로날 항체가 제 이차 항체로 사용되었다. 결과는 도 13에 나타냈다. 항-CD70 인간 모노크로날 항체 2H5, 10B4, 8B5 및 18E7는 CD70에 높은 특이성으로 결합했다.
실시예 4 ; 신장암의 암종 세포 라인의 표면 상에 발현된 CD70 에 결합하는 항-CD70 항체의 특징
항-CD70 항체는 그 세포 표면 상에 CD70을 발현하는 신장 세포 암종 세포에 대한 결합에 대해 유동세포분석법에 의해 시험되었다.
신장 세포 암종 세포 라인 A-498 (ATCC Accession No. HTB-44), 786-0 (ATCC Accession No. CRL-1932), ACHN (ATCC Accession No. CRL-1611), Caki-1 (ATCC Accession No. HTB-46) 및 Caki-2 (ATCC Accession No. HTB-47)가 각각 항체 결합에 대해 시험되어 졌다. HuMAb 2H5 항-CD70 인간 모노크로날 항체의 결합은 2H5로 1 μg/ml의 농도에서 1x1O5 세포를 배양함에 의해 평가되었다. 세포가 수세되고 그리고 결합이 FITC-표지 항-인간 IgG Ab로 검출되었다. 유동세포분석법이 FACS 캘리버 유동세포분석법 (Becton Dickinson, San Jose, CA)을 사용하여 수행되었다. 결과는 도 14에 나타냈다. 항-CD70 모노크로날 항체 2H5는 신장 암종 세포 라인 A-498, 786-0, ACHN, Caki-1 및 Caki-2에 결합했다.
신장 세포 암종 세포 라인 786-0 및 A-498이 다른 농도에서 HuMAb 항-CD70 인간 모노크로날 항체 2H5, 8B5, 10B4 및 18E7의 결합에 대해 시험되어 졌다. 항-CD70 인간 모노크로날 항체의 결합은 항체로 1 μg/ml의 출발농도에서 그리고 1:3 희석으로 항체를 일련적으로 희석한 5x1O5 세포를 배양함에 의해 평가되었다. 세포가 수세되고 그리고 결합이 PE-표지 항-인간 IgG Ab로 검출되었다. 유동세포분석법이 FACS 캘리버 유동세포분석법 (Becton Dickinson, San Jose, CA)을 사용하여 수 행되었다. 결과는 도 15A (786-0) 및 도 15B (A-498)에 나타냈다. 항-CD70 모노크로날 항체 2H5, 8B5, 10B4 및 18E7은 염색의 평균 형광 강도(MFI)에 의해 측정된 바와 같이 신장 암종 세포 라인 786-0 및 A-498에 농도의존적으로 결합했다. 항-CD70 모노크로날 항체에 대한 EC50 값은 786-0 세포 라인에 대해 1.844 nM 내지 6.669 nM의 범위로 되고 그리고 A-498 세포 라인에 대해서는 3.984 nM 내지 11.84 nM의 범위로 되었다.
신장 세포 암종 세포 라인 786-0에 대한 HuMAb 2H5 및 69 A7 항-CD70 인간 모노크로날 항체의 결합은 10 μg/ml의 출발 농도에서 2H5 또는 69A7로 2x1O5 세포를 배양함에 의해 평가되었다. 아이소타이프 대조 항체가 음성 대조군으로 사용되었다. 세포가 수세되고 그리고 결합이 FITC-표지 항-인간 IgG Ab로 검출되었다. 유동세포분석법이 FACS 캘리버 유동세포분석법 (Becton Dickinson, San Jose, CA)을 사용하여 수행되었다. 결과는 도 15C에 나타냈다. 항-CD70 모노크로날 항체 양자가 신장 암종 세포 라인 786-0에 결합했다.
신장 세포 암종 세포 라인 786-0이 HuMAb 항- CD70 인간 모노크로날 항체 69 A7의 결합에 대해 다른 농도에서 시험되었다. 항- CD70 인간 모노크로날 항체의 결합은 10 μg/ml의 출발농도에서 그리고 1:3 희석으로 항체를 일련적으로 희석한 항체로 5x1O5 세포를 배양함에 의해 평가되었다. 세포가 수세되고 그리고 결합이 PE-표지 항-인간 IgG Ab로 검출되었다. 유동세포분석법이 FACS 캘리버 유동세포분석법 (Becton Dickinson, San Jose, CA)을 사용하여 수행되었다. 결과는 도 15D에 나타 냈다. 항-CD70 모노크로날 항체 69A7은 염색의 평균 형광 강도(MFI)에 의해 측정된 바와 같이 신장 암종 세포 라인 786-0에 농도의존적으로 결합했다. 786-0에 결합한 항-CD70 모노크로날 항체 69A7에 대한 EC50 값은 6.927 nM이다.
이들 데이터는 항-CD70 HuMAbs가 신장 세포 암종 세포 라인에 결합한다는 것을 입증한다.
실시예 5 : 림프종세포 라인의 표면 상에 발현된 CD70 에 결합하는 항- CD70 항체의 특징
항-CD70 항체는 림프종 세포의 표면에 CD70을 발현하는 림프종 세포에 대한 결합에 대해 유동세포분석법에 의해 시험되었다.
림프종세포 라인 Daudi (ATCC Accession No. CCL-213), HuT 78 (ATCC Accession No. TIB- 161) 및 Raji (ATCC Accession No. CCL-86)가 각각 항체 결합에 대해 시험되어 졌다. HuMAb 2H5 항-CD70 인간 모노크로날 항체의 결합은 2H5로 1 μg/ml의 농도에서 1x1O5 세포를 배양함에 의해 평가되었다. 세포가 수세되고 그리고 결합이 FITC-표지 항-인간 IgG Ab로 검출되었다. 세포 표면 상에 CD70을 발현하지 않는 Jurkat 세포 라인이 음성 대조군으로 사용되었다. 유동세포분석법이 FACS 캘리버 유동세포분석법 (Becton Dickinson, San Jose, CA)을 사용하여 수행되었다. 결과는 도 16에 나타냈다. 항-CD70 모노크로날 항체 2H5는 염색의 평균 형광 강도(MFI)에 의해 측정된 바와 같이 림프종세포 라인 Daudi, HuT 78 및 Raji에 결합했다.
림프종세포 라인 Raji 및 Granta 519 (DSMZ Accession No. 342)가 HuMAb 항-CD70 인간 모노크로날 항체 2H5의 결합에 대해 다양한 농도에서 시험되어 졌다. 항-CD70 인간 모노크로날 항체의 결합은 50 μg/ml의 출발농도에서 그리고 1:3 희석으로 항체를 일련적으로 희석한 항체로 5x1O5 세포를 배양함에 의해 평가되었다. 아이소타이프 대조 항체가 음성 대조군으로 사용되었다. 세포가 수세되고 그리고 결합이 PE-표지 항-인간 IgG Ab로 검출되었다. 유동세포분석법이 FACS 캘리버 유동세포분석법 (Becton Dickinson, San Jose, CA)을 사용하여 수행되었다. 결과는 도 15A (Raji) 및 17B (Granta 519)에 나타냈다. 항-CD70 모노크로날 항체 2H5가 림프종세포 라인 Raji 및 Granta 519에 염색의 평균 형광 강도(MFI)에 의해 측정된 바와 같이 농도 의존적으로 결합했다. 항-CD70 항체에 대한 EC50 값은 Raji 세포에 대해 1.332 nM이고 그리고 Granta 519 세포에 대해서는 1.330 nM이다.
Raji 림프종세포 라인에 대한 HuMAbs 2H5 및 69A7 항-CD70 인간 모노크로날 항체의 결합은 10 μg/ml의 농도에서 HuMAb로 2x1O5 세포를 배양함에 의해 평가되었다. 세포가 수세되고 그리고 결합이 FITC-표지 항-인간 IgG Ab로 검출되었다. 아이소타이프 대조 항체 및 제이 항체가 단독으로 음성 대조군으로 사용되었다. 유동세포분석법이 FACS 캘리버 유동세포분석법 (Becton Dickinson, San Jose, CA)을 사용하여 수행되었다. 결과는 도 17C에 나타냈다. 항-CD70 모노크로날 항체 양자가 염색의 평균 형광 강도(MFI)에 의해 측정된 바와 같이 Raji 림프종세포 라인에 결합했다.
경쟁 FACS 분석이 2H5에 대한 69A7의 결합 특이성을 밝히기 위하여 수행되었다. Raji 세포가 천연 69Al, 2H5, 아이소타이프 대조 항체 또는 비 항체의 하나로 10 μg/ml의 농도에서 배양되었다. 수세 후, 세포는 10 μg/ml의 농도에서 FITC-컨쥬게이트 69A7로 배양되었다. 세포가 수세되고 그리고 결합이 FITC-표지 항-인간 IgG Ab로 검출되었다. 아이소타이프 대조 항체 및 제이 항체가 단독으로 음성 대조군으로 사용되었다. 유동세포분석법이 FACS 캘리버 유동세포분석법 (Becton Dickinson, San Jose, CA)을 사용하여 수행되었다. 결과는 도 17D에 나타냈다. 항-CD70 항체 69A7 및 2H5 양자가 FITC-표지 69A7의 결합을 차단하여, 양 2H5 및 69A7이 유사한 결합 항원결정인자를 공유한다는 것을 나타낸다.
Daudi 림프종세포 라인 및 786-0 신장 암종 세포가 항체 결합에 대해 더 시험되었다. HuMAb 69A7 항-CD70 인간 모노크로날 항체의 결합은 1 μg/ml의 농도에서 69A7로 2x1O5 세포를 배양함에 의해 평가되었다. 세포가 수세되고 그리고 결합이 FITC-표지 항-인간 IgG Ab로 검출되었다. 세포 표면 상에 CD70을 발현하지 않는 Jurkat 세포 라인이 음성 대조군으로 사용되었다. 유동세포분석법이 FACS 캘리버 유동세포분석법 (Becton Dickinson, San Jose, CA)을 사용하여 수행되었다. 결과는 도 17E에 나타냈다. 항-CD70 모노크로날 항체 69A7가 염색의 평균 형광 강도(MFI)에 의해 측정된 바와 같이 Daudi 림프종세포 라인 및 786-0 신장 암종 세포 라인에 결합했다.
이들 데이타는 항-CD70 HuMAbs가 림프종세포 라인에 결합한다는 것을 입증한 다.
실시예 6 : 항- CD70 모노크로날 항체의 결합 친화도의 스카트챠드 분석법
2H5, 8B5, 10B4 및 18E7 모노크로날 항체의 결합 친화도가 스카트챠드 분석법을 사용하여 CD70 형질전환 CHO 세포 라인에 대한 결합 친화도에 대해 시험되었다.
CHO 세포가 전 길이 CD70로 스카트챠드 기술을 사용하여 형질전환되고 10% 송아지 태반 혈청 (FBS)을 포함하는 RPMI 배지에서 배양된다. 세포는 트립신 처리되고 트리스 기재 결합 완충액(24mM Tris pH 7.2, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 2mM 글루코스, 1mM CaCl2, 1mM MgCl2, 0.1% BSA)으로 한번 수세되고 그리고 세포는 결합 완충액에서 2x106 세포/ml로 조정되었다. 밀리포어 플레이트(MAFB NOB)가 물에 1% 무지방 건조 분유로 도포되고 그리고 4℃에서 밤 세워 저장되었다. 플레이트는 0.2ml의 결합 완충액으로 삼 회 수세되었다. 50마이크로리터의 완충액이 단독으로 최대 결합 웰(전체 결합)에 부가되었다. 25마이크로리터의 완충액이 단독으로 대조 웰(비-특이적 결합)에 부가되었다. 다양한 농도의 125I-항-CD70 항체가 모든 웰에 25μl의 부피로 부가되었다. 100배 초과에서 다양한 농도의 비표지 항체가 대조 웰에 25 μl의 부피로 부가되고 그리고 결합 완충액 내에 25 μl의 CD70 형질전환된 CHO 세포 (2x106 세포/ml)가 모든 웰에 부가되었다. 플레이트는 4℃에서 쉐이커 상에서 200 RPM으로 두 시간 동안 배양되었다. 배양 완료시 밀리포어 플레이트가 0.2 ml의 냉 수세 완충액 (24mM 트리스 pH 7.2, 50OmM NaCl, 2.7mM KCl, 2mM 글루코스, 1mM CaCl2, 1mM MgCl2, 0.1% BSA)으로 삼 회 수세되었다. 여액이 제거되고 감마 카운터로 계수되었다. 평균 결합의 평가가 프리즘 소프트웨어(San Diego, CA)로 단일 사이트 결합 변수를 사용하여 실행되었다.
상기 스카트챠드 결합 분석법을 사용하여 CD70 형질전환 CHO 세포에 대한 항체의 KD는 대략 2H5에 대해 2.1nM, 8B5에 대해 5.1nM, 10B4에 대해 1.6nM 그리고 18E7에 대해 1.5nM이었다.
실시예 7: 항- CD70 모노크로날 항체의 내재화
항-CD70 HuMAbs가 Hum-Zap 내재화 분석법을 사용하여 CD70-발현 신장 암종 세포 내로 내재화하는 능력에 대해 시험되었다. Hum-Zap 분석이 독성 사포린에 컨쥬게이트된 인간 IgG에 대해 친화성을 갖는 이차 항체의 결합을 통한 프라이머리 인간 항체의 내재화에 대해 시험하였다.
CD70-발현 신장 암종 암 세포 라인 786-0이 밤세워 100 μl 웰에 1.25x104 세포/웰로 접종되었다. 항-CD70 HuMAb 항체 2H5, 8B5, 10B4 또는 18E7이 30 nM의 출발 농도에서 부가되고 그리고 1:3 일련의 희석으로 적정되어졌다. CD70에 비특이적인 아이소타이프 대조 항체가 음성 대조로 사용되었다. Hum-Zap (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA, IT-22-25)가 11 nM의 농도에서 부가되고 그리고 플레이트는 72 시간 동안 배양되었다. 플레이트는 그런 다음 1.0 μCi의 3H-티미 딘이 24 시간 동안 펄스되고, 수확되어 탑 카운트 신틸레이션 카운터(Top Count Scintillation Counter; Packard Instruments, Meriden, CT)에서 판독되었다. 결과는 도 18에 나타냈다. 항-CD70 항체 2H5, 8B5, 10B4 및 18E7은 CD70-발현 786-0 신장 암종 암 세포에 3H-티미딘 합일화에서 항체 농도 의존적 감소를 나타냈다. 항-CD70 항체 2H5에 대한 EC50값은 0.9424 nM이다. 이 데이타는 항-CD70 항체 2H5, 8B5, 10B4 및 18E7이 신장 암종 암 세포 라인 내로 내재화되어 진다는 것으로 입증한다.
실시예 8 ; 신장 세포 암종 세포 라인 상에 독성- 컨쥬게이트 항- CD70 항체의 세포사의 평가
이 실시예에서, 독성에 컨쥬게이트된 항-CD70 모노크로날 항체가 세포 증식 분석에서 CD70+ 신장 세포 암종 세포 라인을 죽이는 능력에 대하여 시험되었다.
항-CD70 HuMAb 항체 2H5, 8B5, 10B4 또는 18E7이 펩티딜, 히드라존 또는 디 설파이드 링커와 같은 링커를 통해 독성에 컨쥬게이트되어 진다. CD70-발현 신장 암종 암 세포 라인 ACHN 및 Caki-2가 2.5x104 세포/웰로 접종되고 그리고 CD70-발현 신장 암종 암 세포 라인 786-0가 100 μl 웰에 3시간 동안 1.25x104 세포/웰로 접종되었다. 항-CD70 항체-독성 컨쥬게이트가 30 nM의 출발 농도에서 부가되고 그리고 1:3 일련의 희석으로 적정되어졌다. CD70에 비특이적인 아이소타이프 대조 항체가 음성 대조로 사용되었다. 플레이트는 69 시간 동안 배양되었다. 플레이트는 그런 다음 1.0 μCi의 3H-티미딘이 24 시간 동안 펄스되고, 수확되어 탑 카운트 신틸레이션 카운터(Top Count Scintillation Counter; Packard Instruments, Meriden, CT)에서 판독되었다. 결과는 도 19A (Caki-2), 19B (786-0) 및 19C (ACHN)에 나타냈다. 항-CD70 항체 2H5, 8B5, 10B4 및 18E7은 CD70-발현 Caki-2, 786-0 and ACHN 신장 암종 암 세포에 3H-티미딘 합일화에서 항체-독성 농도 의존적 감소를 나타냈다. 항-CD70 항체에 대한 EC50값은 Caki-2 세포에서 6.728 nM 내지 76.05 nM 사이, 786-0 세포에서 1.635 nM 내지 3.940 nM 사이 그리고 ACHN 세포에서 9.406 nM 내지 108.5 nM 사이이다. 이 데이타는 항-CD70 항체 2H5, 8B5, 10B4 및 18E7이 독성에 컨쥬게이트될 때 신장 암종 암 세포 라인에 세포독성이다는 것으로 입증한다.
실시예 9 ; 항- CD70 항체의 ADCC 활성의 평가
이 실시예에서, 항-CD70 모노크로날 항체가 형광 세포 독성 분석에 있어서 항체 의존적 세포의 세포독성(ADCC)을 통해 이펙터 세포의 존재하에 CD70+ 세포 라인을 죽이는 능력에 대하여 시험되었다.
인간 이펙터 세포는 다음과 같이 전 혈액으로부터 제조되었다. 인간 말초 혈액 단핵 세포가 표준 피콜-파쿼 분리에 의해 헤파린화된 전세포로부터 정제되었다. 세포는 10% FBS 및 200 U/ml의 인간 IL-2을 포함하는 RPMIl 640 배지에 재현탁되어지고 그리고 37℃에서 밤세워 교반되었다. 다음날 세포가 수집되어 배양 배지에서 4 시간 동안 수세되었고 그리고 2x107 세포/ml로 재현탁되었다. 표적 CD70+ 세포는 37℃에서 20분 동안 1x106 표적 세포/mL 당 2.5 μl BATDA로 BATDA 시약 (Perkin Elmer, Wellesley, MA)으로 배양되었다. 표적 세포는 사회 수세되고, 최종 부피 1x105 세포/ml로 하였다.
CD70+ 세포 라인 ARH-77 (인간 B 어린 임파구 백혈병; ATCC Accession No. CRL- 1621), HuT 78 (인간 피부 임파구 임파종; ATCC Accession No. TIB-161), Raji (인간 B 임파구 버킷 임파종; ATCC Accession No. CCL-86) 및 음성 대조 세포 라인 L540 (인간 호지킨 임파종; DSMZ Deposit No. ACC 72)이 다음과 같이 델피아 형광 발광 분석법을 사용하여 인간 항-CD70 모노크로날 항체에 대해 항체 특이적 ADCC에 대해 시험되었다. 각 타겟 세포 라인 (100 μl의 표지된 타겟 세포)이 50 μl의 이펙터 세포 및 50 μl의 항체로 배양되었다. 1 : 50의 이펙터에 대한 타겟이 전 실험을 통해 사용되었다. 모든 연구에서 인간 IgGl 아이소타이프 대조가 음성 대조로 사용되었다. 2000 rpm 펄스 스핀과 37℃에서 한 시간 배양하여, 상등액이 취해지고, 다시 재빠르게 자아지고 그리고 20 μl의 상등액이 180 μl의 Eu 용액 (Perkin Elmer, Wellesley, MA)이 부가된 평판 바닥 플라스크에 이전되고 그리고 RubyStar 판독기 (BMG Labtech)에서 판독되었다. % 용융은 다음과 계산되었다: (샘플 방출 - 자발적 방출 * 100) / (최대 방출 - 자발적 방출), 여기서, 자발적 방출은 단지 타겟 세포 만을 포함하는 웰로부터의 형광이고 최대 방출은 타겟 세포를 포함하고 2% 트리톤-X로 처리된 웰로부터의 형광이다. ARH-77, HuT 78, Raji 및 L-540 세포 라인에 대한 세포 세포독성 % 용융은 각각 20A-D에 나타냈다. 각 CD70+ 발현 세포 라인 ARH-77, HuT 78 및 Raji는 HuMAb 항-CD70 항체 2H5 및 18E7로 항체 조정 세포독성을 보인 반면, 음성 대조 세포 라인 L-540은 항-CD70 항체의 존재 하에 인지할 만한 세포의 세포독성을 가지지 않았다. 이 데이타는 HuMAb 항-CD70 항체가 CD70+ 발현 세포에 특이적인 세포독성을 나타낸다는 것을 입증한다.
실시예 10 ; 인간 림프종세포 라인 상에 독성- 컨쥬게이트 항- CD70 항체의 세포사의 평가
이 실시예에서, 독성에 컨쥬게이트된 항-CD70 모노크로날 항체가 세포 증식 분석에서 CD70+ 인간 림프종세포 라인을 죽이는 능력에 대하여 시험되었다.
항-CD70 HuMAb 항체 2H5가 펩티딜, 히드라존 또는 디설파이드 링커와 같은 링커를 통해 독성에 컨쥬게이트되어 진다. 본 개시사항의 항체에 컨쥬게이트되어 질 수 있는 독성 화합물의 예는 2005년 9월 26일자로 대리인 사건 번호 04280/100M629US3로 같이 출원된 것에 기술되어 있다. CD70-발현 인간 림프종 암 세포 라인 Daudi, HuT 78, Granta 519 및 Raji가 100 μl 웰에 3시간 동안 105 세포/웰로 접종되었다. 항-CD70 항체-독성 컨쥬게이트가 30 nM의 출발 농도에서 부가되고 그리고 1:2 일련의 희석으로 적정되어졌다. HuMAb 항체 2H5-독성 컨쥬게이트가 또한 세포 표면 상에 CD70을 발현하지 않는 음성 대조 세포 라인인 Jurkat 세포에 대해 시험되었다. 플레이트는 72 시간 동안 배양되었다. 플레이트는 그런 다음 배양의 종료 전 0.5 μCi의 3H-티미딘이 8 시간 동안 펄스되고, 수확되어 탑 카운트 신틸레이션 카운터(Packard Instruments)에서 판독되었다. 도 21은 Daudi, HuT 78, Granta 519 및 Jurkat 세포 상에 2H5-컨쥬게이트의 효과를 나타낸다. 항-CD70 항체 2H5는 CD70-발현 Daudi, HuT 78 및 Granta 519 B-cell 림프종 암 세포에 3H-티미딘 합일화에서 항체-독성 농도 의존적 감소를 나타지만, Jurkat 세포에서는 아니었다.
별도의 분석에서, CD70-발현 인간 림프종 암 세포 라인 Raji가 100 μl 웰에 3시간 동안 104 세포/웰로 접종되었다. 항-CD70 항체-독성 컨쥬게이트가 30 nM의 출발 농도에서 부가되고 그리고 1:3 일련의 희석으로 적정되어졌다. 독성-컨쥬게이트 아이소타이프 대조 항체가 대조군으로 사용되었다. 플레이트는 3시간에 수세하거나 또는 연속적인 수세로 72 시간 동안 배양되었다. 플레이트는 그런 다음 배양의 종료 전 0.5 μCi의 3H-티미딘이 8 시간 동안 펄스되고, 수확되어 탑 카운트 신틸레이션 카운터(Packard Instruments)에서 판독되었다. 도 22A 및 22B는 각각 3시간에 수세하거나 또는 연속적인 수세로 Raji 상에 3H-티미딘 합일화에서 항체-독성 농도 의존적 감소를 나타낸다.
이 데이타는 독성에 컨쥬게이트된 항-CD70 항체가 인간 림프종 암 세포에 특이적 세포독성을 나타낸다는 것으로 입증한다.
실시예 11 : 천연 및 세포독성- 컨쥬게이트 항- CD70 항체를 사용하여 이종이식 종양 모델의 생체 내 처리
신장 세포 암종 종양이 이식된 마우스가 종양성장에 대한 항체의 생체 내 효과를 검사하기 위해 독성-컨쥬게이트 항-CD70 항체로 생체 내 처리되었다.
A-498 (ATCC Accession No. HTB-44) 및 ACHN (ATCC Accession No. CRL- 161 1) 세포가 표준 실험 절차를 사용하여 실험실에서 팽창되었다. 6-8 주령 사이의 웅성 Ncr 흉선 누드 마우스 (Taconic, Hudson, NY)가 오른쪽 옆구리로 마우스 당 0.2 ml의 PBS/마트리젤 (1 :1) 내에 7.5xlO6 ACHN 또는 A-498 세포가 피하로 이식되었다. 마우스는 계량되고 이식 후 주당 이회 전자 캐리퍼를 사용하여 삼차원적으로 종양이 측정되었다. 종양 부피는 높이 x 폭 x 길이로 계산되었다. 평균 270 mm3 ACHN 종양 또는 평균 110 mm3 A498 종양을 갖는 마우스가 처리 군으로 랜덤화 되었다. 마우스는 0일에 PBS 담체, 독성-컨쥬게이트 아이소타이프 대조 항체 또는 독성-컨쥬게이트 항-CD70 HuMAb 2H5로 복강 내로 복용되었다. 본 개시사항의 항체에 컨쥬게이트되어 질 수 있는 독성 화합물의 예는 레퍼런스 번호 MEDX-0034US4로 함께 출원된 것에 기술되어 있다. A-498 샘플 군 내의 마우스는 세 가지 다른 독성 화합물에 대해 테스트되었다. 마우스는 복용 후 60일 동안 종양 성장에 대해 모니터되어 진다. 마우스는 종양이 종단 말단점 (2000 mm3)에 도달할 때 희생되었다. 결과는 도 23A (A-498 종양) 및 23B (ACHN 종양)에 나타냈다. 독성에 컨쥬게이트된 항-CD70 항체 2H5는 종양 말단 부피 (2000 mm3)에 도달하는 평균 시간이 확장되고 그리고 종양 성장 진행을 늦추었다. 따라서, 항-CD70 항체-독성 컨쥬게이트로 처리는 생체 내에서 종양 성장에 직접적인 저해 효과를 가진다.
실시예 12: 2 H5 로 면역조직화학
면역조직화학에 의한 CD70를 인지하는 항-CD70 HuMAb 2H5의 능력이 투명 세포 신장 세포 암종 (ccRCC), 림프종 및 교아세포종 환자로부터의 임상적 생체검사법을 사용하여 시험되었다.
면역조직화학을 위하여, 5 μm 동결 분절이 사용되었다 (Ardais Inc, USA). 30분 동안 건조 후, 분절은 아세톤으로 고정되었고(실온에서 10분 동안) 5분 동안 에어 건조되었다. 슬라이드는 PBS에 수세되고 그리고 나서 20분 동안 PBS 내 10% 노르말 고트 혈청으로 예비-배양되고 이어서 실온에서 30분 동안 10% 노르말 고트 혈청을 갖는 PBS 내 10 μg/ml FITC화 2H5로 배양되었다. 다음으로, 슬라이드는 PBS로 삼 회 수세되고 그리고 실온에서 30분 동안 마우스 항-FITC (10 μg/ml DAKO)로 배양되었다. 슬라이드는 다시 PBS로 수세되고 그리고 실온에서 30분 동안 고트 항-마우스 HRP 컨쥬게이트 (DAKO)로 배양되었다. 슬라이드는 PBS로 세번(3x) 수세되었다. 디아미노벤지딘 (Sigma)이 기질로 사용되어, 갈색 염색을 얻었다. 증류수로 수세한 후, 슬라이드는 헤마톡실린으로 1분 동안 반대-염색되었다. 이어서, 슬라이드는 흐르는 증류수로 10초 동안 수세되고 그리고 글리세르젤 (DAKO) 내에 부착되었다. 임상적 생검법 면역조직화학적 염색은 비호지킨 림프종, 골수종, ccRcc 및 교아세포종 분절에서 양성 염색을 나타냈다. 단지 악성의 세포만 각 경우에 양성이고, 인접한 정상조직은 염색되지 않았다.
실시예 13 : 디퓨코실화 HuMAbs 의 생성
환원 양의 퓨코실화 잔기를 갖는 항체는 항체의 ADCC 양을 증가하는 것을 입증했다. 이 실시예에서, 퓨코실 잔기가 결핍된 2H5 HuMAb가 생성되었다.
퓨코실트랜스퍼라제 유전자인 FUT 8 (Biowa, Inc., Princeton, NJ)를 결핍한CHO 세포 라인 Ms704-PF가 항체 2H5의 중 및 경사슬을 발현하는 벡터로 전기적으로 관통되었다. 약물-저항성 클론은 6 mM L-글루타민 및 500 μg/ml G418 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 포함하는 Ex-Cell 325-PF CHO 배지 (JRH Biosciences, Lenexa, KS)에서의 성장에 의해 선정되었다. 클론은 표준 ELISA 분석법을 사용하여 IgG 발현에 대해 스크린되었다. 두 개의 별도 클론인 B8A6 and B8C11이 생산되었으며, 생산 비율은 일당 세포당 1.0 내지 3.8 피코그램의 범위로 되었다.
실시예 14 ; 디퓨코실화 항- CD70 항체의 ADCC 능의 평가
이 실시예에서, 디퓨코실화 및 비-디퓨코실화 항-CD70 모노크로날 항체가 형광 세포독성 분석에서 항체 의존적 세포의 세포독성 (ADCC)을 통한 이펙터 세포의 존재하에 CD70+ 세포를 죽이는 능력에 대하여 시험되었다.
인간 항-CD70 모노크로날 항체 2H5는 상술한 바와 같이 디퓨코실화되었다. 인간 이펙터 세포는 다음과 같이 전 혈액으로부터 제조된다. 인간 말초 혈액 단핵 세포는 표준 피콜-파쿼 분리에 의해 헤파린화된 전 혈액으로부터 정제되었다. 세포는 10% FBS (배양 배지) 및 200 U/ml의 인간 IL-2을 포함하는 RPMIl 640 배지에 재현탁되어지고 그리고 37℃에서 밤세워 교반되었다. 다음날 세포가 수집되어 배양 배지에서 한번 수세되었고 그리고 2x107 세포/ml로 재현탁되었다. 표적 CD70+ 세포는 37℃에서 20분 동안 2.5mM 프로벤시드 (분석 배지)로 보충된 매양 배지 내에 1x106 표적 세포/mL 당 2.5 μl BATDA로 BATDA 시약 (Perkin Elmer, Wellesley, MA)으로 배양되었다. 표적 세포는 2OmM HEPES 및 2.5mM 프로벤시드를 갖는 PBS 내에서 사회 수세되고, 자아 분석 배지에서 1x105 세포/ml의 최종 부피로 하였다.
CD70+ 세포 라인 ARH-77 (인간 B 림프모세포 백혈병; ATCC Accession No. CRL-1621), MEC-I (인간 만성 B 세포 백혈병; DSMZ Accession No. ACC 497), SU-DHL-6 (인간 B 세포 림프종, DSMZ Accession No. Acc572), IM-9 (인간 B 림프모세포; ATCC Accession No. CCL-159) 및 HuT 78 (인간 피부 임파구 임파종; ATCC Accession No, TIB-161)이 다음과 같이 델피아 형광 발광 분석법을 사용하여 디퓨코실화 및 비-디퓨코실화된 인간 항-CD70 모노크로날 항체 2H5에 대해 항체 특이적 ADCC에 대해 시험되었다. 각 타겟 세포 라인 ARH77 (100 μl의 표지된 타겟 세포)이 50 μl의 이펙터 세포 및 50 μl의 2H5 또는 디퓨코실화 2H5 항체로 배양되었다. 비율 1 : 50의 이펙터에 대한 타겟이 전 실험을 통해 사용되었다. 인간 IgGl 아이소타이프 대조가 음성 대조로 사용되었다. 2100 rpm 펄스 스핀과 37℃에서 한 시간 배양하여, 상등액이 취해지고, 다시 재빠르게 자아지고 그리고 20 μl의 상등액이 180 μl의 Eu 용액 (Perkin Elmer, Wellesley, MA)이 부가된 평판 바닥 플라스크에 이전되고 그리고 퓨젼 알파 TRP 플레이트 판독기 (Perkin Elmer)에서 판독되었다. % 용융은 다음과 계산되었다: (샘플 방출 - 자발적 방출 * 100) / (최대 방출 - 자발적 방출), 여기서, 자발적 방출은 단지 타겟 세포 만을 포함하는 웰로부터의 형광이고 최대 방출은 타겟 세포를 포함하고 3% 리졸로 처리된 웰로부터의 형광이다. ARH-77 세포 라인에 대한 세포 세포독성 % 특이적 용융은 도 24에 나타냈다. 각 CD70+ 발현 세포 라인 ARH-77, MEC-I, SU-DHL-6, IM-9 및 HuT 78은 HuMAb 항-CD70 항체 2H5로 항체 조정 세포독성과 항-CD70 항체 2H5의 디퓨코실화 형태와 연계된 특이적 용융의 증가된 백분율을 보였다. 부가하여, 항-CD 16 항체는 MEC-I 세포 라인에서 ADCC 효과를 차단하는 것을 나타냈다. 이 데이타는 디퓨코실화 HuMAb 항-CD70 항체가 CD70+ 발현 세포에 증가된 특이적인 세포독성을 나타낸다는 것을 입증한다.
실시예 15 ; 51 Cr -방출 분석을 사용하여 항- CD70 항체의 ADCC 활성의 평가
이 실시예에서, 항-CD70 모노크로날 항체가 51Cr-방출 분석에서 항체 의존적 세포의 세포독성 (ADCC)을 통한 이펙터 세포의 존재하에 CD70+ Raji B 림프절 세포를 죽이는 능력에 대하여 시험되었다.
인간 말초 혈액 단핵 세포(이펙터 세포)는 표준 피콜-파쿼 분리에 의해 헤파린화된 전 혈액으로부터 정제되었다. 세포는 10% FBS 및 200 U/ml의 인간 IL-2을 포함하는 RPMI l640 배지에 2x106AnL로 재현탁되어지고 그리고 37℃에서 밤세워 교반되었다. 다음날 세포가 수집되어 배양 배지에서 한번 수세되었고 그리고 2x107 세포/ml로 재현탁되었다. 이백만 타겟 Raji 세포 (인간 B 임파구 버킷 임파종; ATCC Accession No. CCL-86)는 37℃에서 1시간 동안 1 ml의 전체 부피 내에 200 μCi 51Cr으로 배양되었다. 표적 세포는 수세되고, 1 ml의 배지에 재현탁되고, 그리고 부가적으로 30분 동안 37℃에서 배양되었다. 최종 배양 후, 타겟 세포는 한번 수세 되고, 그리고 1x105 세포/ml의 최종 부피로 하였다. 최종 ADCC 분석을 위해, 100 μl의 표지된 Raji 세포가 50 μl의 이펙터 세포 및 50 μl의 항체로 배양되었다. 비율 1 : 100의 이펙터에 대한 타겟이 전 실험을 통해 사용되었다. 모든 연구에서 인간 IgGl 아이소타이프 대조가 음성 대조로 사용되었다. 몇몇 연구에서는, PBMC 배양은 20 μg/mL의 항-인간 CD 16 항체 또는 관계없는 마우스 IgGl 항체를 포함하는 튜브 또는 분석 플레이트에 PBMC를 부가하기 전에 비 항체를 포함하는 튜브에 동일하게 분리된다. 27℃에서 배양 15분 후, 혈액 세포는 상술한 바와 같이 수세 없이 사용되었다. 37℃에서 배양 4시간 후, 상등액이 수집되고 그리고 240-400 keV의 리딩 윈도우를 갖는 코브라 II 오토-감마 카운터 (Packard Instruments) 상에서 계수되었다. 분당 계수가 항체 농도로 그래프에 나타내지고 그리고 데이타는 프리즘 소프트웨어 (San Diego, CA)를 사용하여 비선형 회귀인 시그모이달 복용 반응(가변 슬로프)에 의해 분석되었다. % 용융은 다음 방정식을 사용하여 결정되었다: % 용융 = (샘플 CPM- 비 항체 CPM)/트리톤X CPM-비 항체 CPM) X 100. Raji 세포 라인에 대한 세포 독성 % 특이적 용융에 대한 항체 적정 곡선은 도 25에 나타냈다. 이 데이타는 항-CD70 항체가 Raji 세포 라인 상에 ADCC 효과를 가진다는 것을 입증한다. Raji 세포에 대한 항-CD70 항체의 EC50 값은 36.6mM이다. 항-CD16 항체의 존재하에 Raji 세포에 대한 세포 독성의 그래프는 도 26에 나타냈다. 이 데이타는 Raji 세포 상의 항-CD70 항체의 ADCC 효과가 CD16에 의존한다는 것을 입증한다.
실시예 16 ; 활성화된 T 세포 상에서 항- CD70 항체의 ADCC 능의 평가
이 실시예에서, 디퓨코실화 및 비-디퓨코실화 항-CD70 모노크로날 항체가 형광 세포독성 분석에서 항체 의존적 세포의 세포독성 (ADCC)을 통한 이펙터 세포의 존재하에 활성화된 T 세포를 죽이는 능력에 대하여 시험되었다.
인간 항-CD70 모노크로날 항체 2H5는 상술한 바와 같이 디퓨코실화되었다. 인간 이펙터 세포는 상술한 바와 같이 제조되었다. 인간 지라 T 세포가 항-CD3 도포 마그네틱 비즈 (순도 > 90%)로 양성적으로 선택되었다. 세포는 6일 동안 항-CD3 및 항-CD28 도포 비즈와 그리고 Iscove's 배지 내 25ng/ml IL-2 + 10% 열 불활성화 FCS로 자극되었다. 세포는 수집되고 그리고 요오드화 프로피듐 합일화에 의해 생존성에 대해 분석되고 (60% 생존 가) 그리고 생 세포는 동기되어 ADCC 분석 함입에 앞서 CD70 발현 (생 세포 상에서 -65% CD70+)에 대해 분석되었다.
활성화된 T 세포가 다음과 같이 델피아 형광 발광 분석법을 사용하여 디퓨코실화 및 비-디퓨코실화된 인간 항-CD70 모노크로날 항체 2H5에 대해 항체 특이적 ADCC에 대해 시험되었다. 타겟 활성화 T 세포 (100 μl의 표지된 타겟 세포)가 50 μl의 이펙터 세포 및 50 μl의 2H5 또는 디퓨코실화 2H5 항체로 배양되었다. 비율 1 : 50의 이펙터에 대한 타겟이 전 실험을 통해 사용되었다. 인간 IgGl 아이소타이프 대조가 음성 대조로 사용되었다. 2100 rpm 펄스 스핀과 37℃에서 한 시간 배양한 후, 상등액이 취해지고, 다시 재빠르게 자아지고 그리고 20 μl의 상등액이 180 μl의 Eu 용액 (Perkin Elmer, Wellesley, MA)이 부가된 평판 바닥 플라스크에 이전되고 그리고 퓨젼 알파 TRP 플레이트 판독기 (Perkin Elmer)에서 판독되었다. % 용융은 다음과 계산되었다: (샘플 방출 - 자발적 방출 * 100) / (최대 방출 - 자발 적 방출), 여기서, 자발적 방출은 단지 타겟 세포 만을 포함하는 웰로부터의 형광이고 최대 방출은 타겟 세포를 포함하고 3% 리졸로 처리된 웰로부터의 형광이다. 활성화 T 세포에 대한 세포 세포독성 % 특이적 용융은 도 27에 나타냈다. 활성화 T 세포는 HuMAb 항-CD70 항체 2H5로 항체 조정 세포독성과 항-CD70 항체 2H5의 디퓨코실화 형태와 연계된 특이적 용융의 증가된 백분율을 보였다. 항체 조정 세포독성은 항-CD70 항체의 디퓨코실화 형태 및 비-디퓨코실화 형태 양자에서 항-CD16 항체의 부가에 의해 차단되었다. 대조 IgG는 세포독성에 효과가 없었다. 이 데이타는 디퓨코실화 HuMAb 항-CD70 항체가 활성화 T 세포에 증가된 특이적인 세포독성을 나타낸다는 것을 입증한다.
실시예 17 : 수용체- 리간드 CD70 - CD27 결합에 대한 차단 분석
이 실시예에서, 항-CD70 모노크로날 항체가 차단 분석을 사용하여 리간드 CD27과의 CD70의 상호작용을 차단하는 능력에 대해 시험되었다.
웰은 4℃에서 2 μg/ml로의 항-IgG 항체 (Fc-sp.) 100 μl/웰로 밤세워 도포되어 진다. 웰은 실온에서 1시간 동안 200 μl/웰 1% BSA/PBS로 차단되어 진다. 각 웰에 37℃에서 1시간 동안 0.16 μg/ml로의 CD27-Fc-his 100 μl/웰이 쉐이킹하면서 부가된다. 각 웰은 200 μl/웰 PBS/트윈 20 (0.05 % (v.v))으로 다섯 번 수세된다. 항-CD70 항체는 10% NHS + 1% BSA/PBS에 희석되고 그리고 0.05 μg/ml에서 CD70-myc-his와 혼합되고, 실온에서 1시간 동안 배양되고 그리고 200 μl/웰 PBS/트윈 20 (0.05 % (v.v))으로 다섯 번 수세된다. CD70/CD27 상호작용을 차단하는 알려진 항체가 양성 대조군으로 사용되었고, 그리고 아이소타이프 대조 항체가 음성 대조군으로 사용되었다. CD70 및 항-CD70 항체의 혼합물은 항-Fc 항체로 차단되었고, 그리고 100 μl/웰 CD70-myc-his + 항체가 CD27-Fc-his를 포함하는 웰에 부가되었다. 혼합물은 37℃에서 1시간 동안 쉐이킹하면서 배양된다. 혼합물에 100 μl/웰의 항-myc-HRP (10% NHS + 1% BSA/PBS에 1 : 1000으로 희석됨)가 부가되고 그리고 37℃에서 1시간 동안 쉐이킹하면서 배양된다. 신호는 100 μl TMB를 부가하고, 실온에서 5-10분 동안 배양되고 그런 다음 75 μl 0.25 M H2SO4가 부가됨에 의해 검출되어 결과는 A450nm에서 판독되었다. 결과는 도 28에 나타냈다. 이 데이타는 2H5, 8B5, 및 18E7을 포함하는 몇몇 항-CD70 항체가 CD27에 대한 CD70의 결합을 차단하고, 반면 다른 항체는 CD70과 CD27과의 상호작용에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한다.
실시예 18 : 천연 항- CD70 항체를 사용하여 이종이식 종양 모델의 생체 내 처리
림프종 종양이 이식된 마우스가 종양성장에 대한 항체의 생체 내 효과를 검사하기 위해 천연 항-CD70 항체로 생체 내 처리되었다.
ARH-77 (인간 B 림프모세포 백혈병; ATCC Accession No. CRL-1621) 및 Raji 세포 (인간 B 림프구 버킷 임파종; ATCC Accession No. CCL-86)가 표준 실험 절차를 사용하여 실험실에서 팽창되었다. 6-8 주령 사이의 웅성 Ncr 흉선 누드 마우스 (Taconic, Hudson, NY)가 오른쪽 옆구리로 마우스 당 0.2 ml의 PBS/마트리젤 (1 :1) 내에 5xlO6 ARH-77 또는 Raji 세포가 피하로 이식되었다. 마우스는 계량되고 이식 후 주당 이회 전자 캐리퍼를 사용하여 삼차원적으로 종양이 측정되었다. 종양 부피는 높이 x 폭 x 길이/2로 계산되었다. 평균 80 mm3 ARH-77 종양 또는 평균 170 mm3 Raji 종양을 갖는 마우스가 처리 군으로 랜덤화 되었다. 마우스는 0일에 PBS 담체, 아이소타이프 대조 항체 또는 천연 항-CD70 HuMAb 2H5로 복강 내로 복용되었다. 마우스는 종양이 종단 말단점 (2000 mm3)에 도달할 때 희생되었다. 결과는 도 29A (Raji 종양) 및 29B (ARH-77 종양)에 나타냈다. 천연 항-CD70 항체 2H5는 종양 말단점 부피 (2000 mm3)에 도달하는 평균 시간이 확장되고 그리고 종양 성장 진행을 늦추었다. 따라서, 항-CD70 항체 단독으로 처리는 생체 내에서 종양 성장에 직접적인 저해 효과를 가진다.
실시예 19 : 세포독성- 컨쥬게이트 항- CD70 항체를 사용하여 이종이식 림프종 종양 모델의 생체 내 처리
림프종 종양이 이식된 마우스가 종양성장에 대한 항체의 생체 내 효과를 검사하기 위해 독성-컨쥬게이트 항-CD70 항체로 생체 내 처리되었다.
ARH-77 (인간 B 림프모세포 백혈병; ATCC Accession No. CRL- 1621), Granta 519 (DSMZ Accession No. 342) 및 Raji 세포 (인간 B 림프구 버킷 임파종; ATCC Accession No. CCL-86)가 표준 실험 절차를 사용하여 실험실에서 팽창되었다. 6-8 주령 사이의 웅성 Ncr 흉선 누드 마우스 (Taconic, Hudson, NY)가 오른쪽 옆구리로 마우스 당 0.2 ml의 PBS/마트리젤 (1 : 1) 내에 5xlO6 ARH-77, 10xlO6 Granta 519 또는 5xlO6 Raji 세포가 피하로 이식되었다. 마우스는 계량되고 이식 후 주당 이회 전자 캐리퍼를 사용하여 삼차원적으로 종양이 측정되었다. 종양 부피는 높이 x 폭 x 길이/2로 계산되었다. 평균 80 mm3(ARH-77), 220 mm3 (Granta 519), 또는 170 mm3 (Raji) 종양을 갖는 마우스가 처리 군으로 랜덤화 되었다. 마우스는 0일에 PBS 담체, 독성-컨쥬게이트 아이소타이프 대조 항체 또는 독성-컨쥬게이트 항-CD70 HuMAb 2H5로 복강 내로 복용되었다. 본 개시사항의 항체에 컨쥬게이트되어 질 수 있는 독성 화합물의 예는 2005년 9월 26일에 출원된 미국 가특허 출원번호 60/720,499에 기술되어 있다. 마우스는 종양이 종양 말단점 (2000 mm3)에 도달할 때 희생되었다. 결과는 도 30A (ARH-77), 30B (Granta 519) 및 30C (Raji 종양)에 나타냈다. 독성에 컨쥬게이트된 항-CD70 항체 2H5는 종양 말단 부피 (2000 mm3)에 도달하는 평균 시간이 신장했고 그리고 종양 성장 진행을 늦추었다. 따라서, 항-CD70 항체-독성 컨쥬게이트로 처리는 생체 내에서 림프종 종양 성장에 직접적인 저해 효과를 가진다.
실시예 20 : 붉은털 원숭이 B 림프종 세포와 항- CD70 항체의 교차-반응성
FACS 분석법이 또한 붉은털 원숭이 CD70+ B 림프종세포 라인인 LCL8664 (ATCC#: CRL-1805)와 교차 반응하는 항-CD70 항체 69A7의 능력을 평가하기 위해 채용되었다. HuMAb 69A7 항-CD70 인간 모노크로날 항체의 결합은 1x105 세포를 1 μ g/ml의 농도로 69A7로 배양함에 의해 평가되었다. 세포는 수세되고 그리고 결합이 FITC-표지 항-인간 IgG Ab로 검출되었다. 아이소타이프 대조 항체가 음성 대조로 사용되었다. 유동세포분석법이 FACS 캘리버 유동세포분석법 (Becton Dickinson, San Jose, CA)을 사용하여 수행되었다. 결과는 도 31에 나타냈다. 결과는 항-CD70 항체 69A7이 원숭이 CD70+ B 림프종 세포와 교차 반응한다는 것을 입증한다.
실시예 21 : 786-O 신장 암종 세포에 결합에 의한 항- CD70 항체의 내재화
786-0 인간 신장암 세포 라인이 면역-형광 염색법을 사용하여 세포에 결합에 의한 HuMab 항-CD70 항체 69A7 및 2H5의 내재화를 시험하기 위해 사용되었다. 786-0 세포 (96-웰 플레이트 내의 웰 당 1x1O4 세포)가 0.25% 트립신/EDTA으로 처리함에 의해 조직 배양 플라스크로부터 수확되고, 그런 다음 얼음 상에서 30분 동안 FACS 완충액 (PBS + 5% FBS, 배지) 내 5μg/ml의 HuMab 항-CD70 항체 각각으로 배양되었다. 인간 IgGl 아이소타이프 대조가 음성 대조로 사용되었다. 배지로 2번 수세 후, 세포는 배지에 재현탁되고(웰 당 lOOμl), 그런 다음 얼음 상에서 30분 동안 1 : 100 희석으로 PE (Jackson ImmunoResearch Lab)와 컨쥬게이트된 고트 항-인간 제이 항체로 배양된다. 세포는 0분에 즉시 형광 마이크로스코프 (Nikon) 하에서 형태학 및 면역형광 강도에 대해 이미지되어 지거나 또는 여러 시간 동안 30℃에서 배양되어 진다. 형광은 대조 항체가 아니라 HuMab 항-CD70 항체로 염색된 세포에서 관찰되었다. 분석에서 유사한 결과가 또한 FITC-직접 컨쥬게이트 HuMab 항-CD70 항체로 얻어진다. 결과는 0분에 양 항-CD70 HuMabs로 세포 표면 멤브레인 상에 형광의 발 생이 관찰되었다. 배양 30분 후, 멤브레인 형광 강도가 유의적으로 감소하였으며 반면 내부 형광은 증가하였다. 120분 시점에 멤브레인 형광은 나타나지 않았지만, 대신 세포 내의 구분에서는 존재하는 것으로 나타났다. 이 데이타는 HuMab 항-CD70 항체가 CD70-발현 내인성 종양 세포에 결합하여 특이적으로 체화되어 질 수 있다는 것으로 입증한다.
실시예 22 : HuMAb 항- CD70 이 공지된 마우스 항- CD70 항체의 결합을 차단함
이 실험에서, HuMAb 항-CD70 항체 69A7이 CD70+ 신장 암종 786-0 세포에 대해 공지의 마우스 항-CD70 항체의 결합을 차단하는 그 능력에 대해 시험되었다. 786-0 세포는 얼음 상에서 20분 동안 1 μg/ml의 마우스 항-CD70 항체 BU-69 (Ancell, Bayport, MN) 및 1, 5 또는 10 μg/ml의 HuMab 69A7로 배양되었다. IgGl 및 IgG2 아이소타이프 대조 항체가 음성 대조로 사용되었다. 세포는 2번 수세되고, 그리고 결합이 FITC-표지 항-인간 IgG Ab로 검출되었다. 유동세포분석법이 FACS 캘리버 유동세포분석법 (Becton Dickinson, San Jose, CA)을 사용하여 수행되었다. 결과는 도 32에 나타냈다. 항-CD70 HuMAb 69A7이 농도의존 형식으로 마우스 항-CD70 항체의 결합을 차단한다.
실시예 23 : HuMAb 항- CD70 이 염증성 반응을 저해함
이 실험에서, HuMAb 항-CD70 항체 2H5가 염증성 반응의 저해에 대해 시험되었다. 마우스 CD32 (CHO-S/mCD32 cells)로 안정적으로 트랜스펙트된 CHO-S 세포가 전 길이 인간 CD70 컨스트럭트 (CHO- S/mCD32/CD70 세포)로 일시적으로 트랜스펙트되었다. 표면 발현은 2A5 및 PE 컨쥬게이트 항-인간 IgG 제이 Ab를 사용한 유동세 포분석법에 의해 확인되었다(도시 생략). RosetteSep® 인간 T 세포 인리치 키트 (Cat# 15061 ; StemCell Technologies Inc) 정제 인간 말단 혈액 CD3+ T 세포가 실험실 내에서 96 웰 플레이트의 세 벌의 웰 내에 1x105 CHO-S/mCD32 또는 CHO- S/mCD32/CD70 세포/웰, 1 μg/ml 항-hCD3 (clone OKT3; BD Bioscience) 및 HuMAb 2H5 또는 비-퓨코실화 2H5 (2H5 NF)의 일련의 희석으로 1 x 106/웰로 자극되었다. 3일 후 상등액 상당액이 수집되고 인터페론-감마 (INF-γ) 분비가 정량적 ELISA 키트 (BD Biosciences)에 의하여 측정되었다. 플레이트는 lμCi/ml의 3H-티미딘으로 펄스되고, 8시간 동안 배양되고, 세포는 수확되고 그리고 3H-티미딘 합일화가 Trilux® 1450 마이크로베타 카운터 (Wallac, Inc.)에서 판독되었다. IgGl 아이소타이프 대조 항체가 음성 대조로 사용되었다. 결과는 도 33에 나타냈다. 양 2H5 및 2H5 NF는 복용량 의존 형식으로 CD70 공-자극 증식을 완전하게 저해했다 (도 33A). 데이타는 또한 2H5가 항-CD3 + CHO-S/mCD32 조정 증식에 효과를 가지지 않는 것과 같이 2H5 저해가 CD70 공자극에 특이적인 것을 나타낸다. 양 2H5 및 2H5 NF는 마찬가지로 복용량 의존 형식으로 CD70 공-자극 INF-γ 분비를 완전하게 저해했다 (도 33B). 데이타는 또한 2H5가 항-CD3 + CHO-S/mCD32 조정 INF-γ 분비에 효과를 가지지 않는 것과 같이 2H5 저해가 CD70 공자극에 특이적인 것을 나타낸다. 이들 데이타는 함께 2H5 및 2H5 NF가 CD70 인간 T 세포 공자극을 기능적으로 차단한다는 것을 보여준다.
시토메갈로바이러스 (CMV) 특이적 T 세포 반응을 위해 미리 선별된 인간 MHC 클래스 I 단상형 B*3501+ 말단 혈액 단핵 세포 (PBMC)(Astarte, Inc)가 11일 동안 25 ng/ml의 B*3501 결합 CMV 펩티드 IPSINVHHY (Pro Immune, Oxford, UK) 및 일련의 희석의 HuMAb 2H5의 존재하에서 배양되었다. 배양액은 유동세포분석법에 의해 PE 컨쥬게이트 항-CD8 염색 (clone RPA-T8, BD Biosciences)에 의한 CD8+ T 세포에 대해, APC 표지 펩티드-MHC 클래스 I 펜타머의 올리고머 염색 (Fl 14-4B; Prolmmune)에 의한 펩티드 특이적 CD8+ T 세포에 대해, 그리고 요오드화 프로피듐 염색의 결핍에 의한 생존성에 대해 분석되었다. 아이소타이프 대조 항체가 음성 대조로 사용되었다. 결과는 도 34에 나타냈다. 2H5는 펩티드 특이적 CD8+ T 세포 팽창을 부분적으로 저해하고 그리고 2H5 NF 및 양성 대조 항-MHC 클래스 I Ab (clone W6/32; BD Bioscience)는 펩티드 특이적 CD8+ T 세포 팽창을 완전하게 저해했다 (도 34A). 전체 세포 생존성의 유의성 있는 감소가 관찰되지 않았다 (도 34B). 전체 CD8+ 세포 수의 유의성 있는 감소가 관찰되지 않았다 (도 34C). 이와 함께, 데이타는 2H5 및 2H5 NF 효과는 펩티드 자극 CD8+ T 세포에 특이적인 것을 보여준다. 데이타는 동일한 공여자로 수행된 하나의 부가적 실험의 대표적인 것이다.
시토메갈로바이러스 (CMV) 특이적 T 세포 반응을 위해 미리 선별된 인간 MHC 클래스 I 단상형 B*3501+ PBMC (Astarte, Inc)가 11일 동안 25 ng/ml의 B*3501 결합 CMV 펩티드 IPSINVHHY (Pro Immune) 및 20 μgs/ml의 HuMAb 2H5의 존재하에 그리고 일련의 희석의 항-인간 CD 16 (FcRγlll) 기능적 블럭킹 Ab (clone 3G8; BD Biosciences)의 존재 또는 부존재 하에서 배양되고 그리고 나서 상술한 바와 같이 펩티드 특이적 CD 8+ 세포 수에 대해 유동세포분석법에 의해 분석되었다. 결과는 도 35에 나타냈다. 항-CD16에 의한 펩티드 특이적 CD8+ T 세포 팽창의 2H5 및 2H5 NF 조정 저해의 용량 의존 반전현상은 2H5 및 2H5 NF 저해가 CD16+ 이펙터 세포와 2H5 및 2H5 NF의 상호작용을 통해 조정되어 지는 것을 나타낸다. 대략적으로 1000 배 이상 3G8이 2H5에 비한 2H5 NF 매개 저해를 역전하는 데 필요하다. 3G8 농도에 관계없이 음성 아이소타이프 대조에 의한 펩티드 특이적 CD8+ T 세포 팽창의 저해가 없고 그리고 기능적 블럭킹 양성 대조 W6/32에 의한 펩티드 특이적 CD8+ T 세포 팽창의 저해에 대한 3G8의 무 효과가 적었다.
실시예 24 : 세포독성- 컨쥬게이트 항- CD70 항체를 사용하여 이종이식 신장 암종 종양 모델의 생체 내 처리
신장 암종 종양이 이식된 마우스가 종양성장에 대한 항체의 생체 내 효과를 검사하기 위해 독성-컨쥬게이트 항-CD70 항체로 생체 내 처리되었다.
786-0 (ATCC Accession No. CRL-1932) 및 Caki-1 (ATCC Accession No. HTB- 46) 세포가 표준 실험 절차를 사용하여 실험실에서 팽창되었다. 6-8 주령 사이의 웅성 CB 17. SCID 마우스 (Taconic, Hudson, NY)가 오른쪽 옆구리로 마우스 당 0.2 ml의 PBS/마트리젤 (1 : 1) 내에 2백5십만 786-0 또는 Caki-1 세포가 피하로 이식되었다. 마우스는 계량되고 이식 후 주당 이회 전자 캐리퍼를 사용하여 삼차원적으로 종양이 측정되었다. 종양 부피는 높이 x 폭 x 길이로 계산되었다. 평균 200 mm3 종양을 갖는 마우스가 처리 군으로 랜덤화 되었다. 마우스는 0일에 PBS 담체, 독성-컨쥬게이트 아이소타이프 대조 항체 또는 독성-컨쥬게이트 항-CD70 HuMAb 2H5로 복강 내로 복용되었다. 본 개시사항의 항체에 컨쥬게이트되어 질 수 있는 독성 화합물의 예는 2005년 9월 26일에 출원된 미국 가특허 출원번호 60/720,499에 기술되어 있다. 마우스는 종양이 종양 말단점 (2000 mm3)에 도달할 때 희생되었다. 결과는 도 36A (786-0) 및 36B (Caki-1)에 나타냈다. 독성에 컨쥬게이트된 항-CD70 항체 2H5는 종양 말단 부피 (2000 mm3)에 도달하는 평균 시간이 신장했고 그리고 종양 성장 진행을 늦추었다. 처리된 동물에서 체중 변화는 10% 이하였다. 따라서, 항-CD70 항체-독성 컨쥬게이트로 처리는 생체 내에서 림프종 종양 성장에 직접적인 저해 효과를 가진다.
SEQ ID NO: 시퀀스 SEQ ID NO: 시퀀스
1 VH a.a. 2H5 26 VK CDR1 a.a. 2H5
2 VH a.a. 10B4 27 VK CDR1 a.a. 10B4
3 VH a.a. 8B5 28 VK CDR1 a.a. 8B5
4 VH a.a. 18E7 29 VK CDR1 a.a. 18E7
5 VH a.a. 69A7 30 VK CDR1 a.a. 69A7
6 VK a.a. 2H5 31 VK CDR2 a.a. 2H5
7 VK a.a. 10B4 32 VK CDR2 a.a. 10B4
8 VK a.a. 8B5 33 VK CDR2 a.a. 8B5
9 VK a.a. 18E7 34 VK CDR2 a.a. 18E7
10 VK a.a. 69A7 35 VK CDR2 a.a. 69A7
11 VH CDR1 a.a. 2H5 36 VK CDR3 a.a. 2H5
12 VH CDR1 a.a. 10B4 37 VK CDR3 a.a. 10B4
13 VH CDR1 a.a. 8B5 38 VK CDR3 a.a. 8B5
14 VH CDR1 a.a. 18E7 39 VK CDR3 a.a. 18E7
15 VH CDR1 a.a. 69A7 40 VK CDR3 a.a. 69A7
16 VH CDR2 a.a. 2H5 41 VH n.t. 2H5
17 VH CDR2 a.a. 10B4 42 VH n.t. 10B4
18 VH CDR2 a.a. 8B5 43 VH n.t. 8B5
19 VH CDR2 a.a. 18E7 44 VH n.t. 18E7
20 VH CDR2 a.a. 69A7 45 VH n.t. 69A7
21 VH CDR3 a.a. 2H5 46 VK n.t. 2H5
22 VH CDR3 a.a. 10B4 47 VK n.t. 10B4
23 VH CDR3 a.a. 8B5 48 VK n.t. 8B5
24 VH CDR3 a.a. 18E7 49 VK n.t. 18E7
25 VH CDR3 a.a. 69A7 50 VK n.t. 69A7
51 VH 3-30.0 생식계열 a.a 54 VK L16 생식계열 a.a
52 VH 3-33 생식계열 a.a 55 VK L18 생식계열 a.a
53 VH 4-61 생식계열 a.a 56 VK L15 생식계열 a.a
SEQUENCE LISTING <110> American Home Products Corporation Green, Bruce Masi, Amy <120> Recombinant Protective Protein from Streptococcus pneumoniae <130> 00630/100H814US2 <140> US 10/433,385 <141> 2003-05-29 <150> US 60/258,841 <151> 2000-12-28 <160> 21 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer <400> 1 ggggccatgg tctttccagt ttggtcaaaa 30 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer <400> 2 ggggtcgact tataaaccag gtgcttgtcc aagttc 36 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 3 Val Glu Leu Lys Lys Glu Ala Val Lys Asp Val Thr Ser Leu Thr Lys 1 5 10 15 Ala Ala Pro Val 20 <210> 4 <211> 537 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 4 atgaatgagg taaagaaaat ggtagaattg aaaaaagaag cagtaaaaga cgtaacatca 60 ttgacaaaag cagcgccagt agcattggca aaaacaaagg aagtcttgaa ccaagctgtt 120 gctgatttgt atgtagctca cgttgctttg caccaagtgc actggtatat gcatggtcgt 180 ggtttccttg tatggcatcc aaaaatggat gagtacatgg aagctcttga cggtcaattg 240 gatgaaatca gtgaacgctt gattacactc ggtggaagcc cattctctac attgacagag 300 ttccttcaaa atagtgaaat cgaagaagaa gctggtgaat accgtaatgt tgaagaaagc 360 ttggaacgtg ttcttgttat ctaccgttac ttgtcagaac ttttccaaaa aggtttggat 420 gtcactgatg aagaaggtga cgatgtgaca aacggtatct ttgcaggcgc taaaactgaa 480 acagataaaa caatttggat gcttgcagcc gaacttggac aagcacctgg tttgtaa 537 <210> 5 <211> 178 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 5 Met Asn Glu Val Lys Lys Met Val Glu Leu Lys Lys Glu Ala Val Lys 1 5 10 15 Asp Val Thr Ser Leu Thr Lys Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Lys Thr 20 25 30 Lys Glu Val Leu Asn Gln Ala Val Ala Asp Leu Tyr Val Ala His Val 35 40 45 Ala Leu His Gln Val His Trp Tyr Met His Gly Arg Gly Phe Leu Val 50 55 60 Trp His Pro Lys Met Asp Glu Tyr Met Glu Ala Leu Asp Gly Gln Leu 65 70 75 80 Asp Glu Ile Ser Glu Arg Leu Ile Thr Leu Gly Gly Ser Pro Phe Ser 85 90 95 Thr Leu Thr Glu Phe Leu Gln Asn Ser Glu Ile Glu Glu Glu Ala Gly 100 105 110 Glu Tyr Arg Asn Val Glu Glu Ser Leu Glu Arg Val Leu Val Ile Tyr 115 120 125 Arg Tyr Leu Ser Glu Leu Phe Gln Lys Gly Leu Asp Val Thr Asp Glu 130 135 140 Glu Gly Asp Asp Val Thr Asn Gly Ile Phe Ala Gly Ala Lys Thr Glu 145 150 155 160 Thr Asp Lys Thr Ile Trp Met Leu Ala Ala Glu Leu Gly Gln Ala Pro 165 170 175 Gly Leu <210> 6 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 7 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 8 ggggtcgact aaaccaggtg cttgtccaag ttc 33 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 9 ggggccatgg ctgtagaatt gaaaaaagaa 30 <210> 10 <211> 176 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 10 Met Ala Val Glu Leu Lys Lys Glu Ala Val Lys Asp Val Thr Ser Leu 1 5 10 15 Thr Lys Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Lys Thr Lys Glu Val Leu Asn 20 25 30 Gln Ala Val Ala Asp Leu Tyr Val Ala His Val Ala Leu His Gln Val 35 40 45 His Trp Tyr Met His Gly Arg Gly Phe Leu Val Trp His Pro Lys Met 50 55 60 Asp Glu Tyr Met Glu Ala Leu Asp Gly Gln Leu Asp Glu Ile Ser Glu 65 70 75 80 Arg Leu Ile Thr Leu Gly Gly Ser Pro Phe Ser Thr Leu Thr Glu Phe 85 90 95 Leu Gln Asn Ser Glu Ile Glu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Arg Asn Val 100 105 110 Glu Glu Ser Leu Glu Arg Val Leu Val Ile Tyr Arg Tyr Leu Ser Glu 115 120 125 Leu Phe Gln Lys Gly Leu Asp Val Thr Asp Glu Glu Gly Asp Asp Val 130 135 140 Thr Asn Gly Ile Phe Ala Gly Ala Lys Thr Glu Thr Asp Lys Thr Ile 145 150 155 160 Trp Met Leu Ala Ala Glu Leu Gly Gln Ala Pro Gly Leu Val Asp Pro 165 170 175 <210> 11 <211> 176 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 11 Met Ala Val Glu Leu Lys Lys Glu Ala Val Lys Asp Val Thr Ser Leu 1 5 10 15 Thr Lys Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Lys Thr Lys Glu Val Leu Asn 20 25 30 Gln Ala Val Ala Asp Leu Tyr Val Ala His Val Ala Leu His Gln Val 35 40 45 His Trp Tyr Met His Gly Arg Gly Phe Leu Val Trp His Pro Lys Met 50 55 60 Asp Glu Tyr Met Glu Ala Leu Asp Gly Gln Leu Asp Glu Ile Ser Glu 65 70 75 80 Arg Leu Ile Thr Leu Gly Gly Ser Pro Phe Ser Thr Leu Thr Glu Phe 85 90 95 Leu Gln Asn Ser Glu Ile Glu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Arg Asn Val 100 105 110 Glu Glu Ser Leu Glu Arg Val Leu Val Ile Tyr Arg Tyr Leu Ser Glu 115 120 125 Leu Phe Gln Lys Gly Leu Asp Val Thr Asp Glu Glu Gly Asp Asp Val 130 135 140 Thr Asn Gly Ile Phe Ala Gly Ala Lys Thr Glu Thr Asp Lys Thr Ile 145 150 155 160 Trp Met Leu Ala Ala Glu Leu Gly Gln Ala Pro Gly Leu Val Asp Pro 165 170 175 <210> 12 <211> 176 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 12 Met Ala Val Glu Leu Lys Lys Glu Ala Val Lys Asp Val Thr Ser Leu 1 5 10 15 Thr Lys Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Lys Thr Lys Glu Val Leu Asn 20 25 30 Gln Ala Val Ala Asp Leu Tyr Val Ala His Val Ala Leu His Gln Val 35 40 45 His Trp Tyr Met His Gly Arg Gly Phe Leu Val Trp His Pro Lys Met 50 55 60 Asp Glu Tyr Met Glu Ala Leu Asp Gly Gln Leu Asp Glu Ile Ser Glu 65 70 75 80 Arg Leu Ile Thr Leu Gly Gly Ser Pro Phe Ser Thr Leu Thr Glu Phe 85 90 95 Leu Gln Asn Ser Glu Ile Glu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Arg Asn Val 100 105 110 Glu Glu Ser Leu Glu Arg Val Leu Val Ile Tyr Arg Tyr Leu Ser Glu 115 120 125 Leu Phe Gln Lys Gly Leu Asp Val Thr Asp Glu Glu Gly Asp Asp Val 130 135 140 Thr Asn Gly Ile Phe Glu Gly Ala Lys Thr Glu Thr Asp Lys Thr Ile 145 150 155 160 Trp Met Leu Ala Ala Glu Leu Gly Gln Ala Pro Gly Leu Val Asp Pro 165 170 175 <210> 13 <211> 175 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 13 Ala Val Glu Leu Lys Lys Glu Ala Val Lys Asp Val Thr Ser Leu Thr 1 5 10 15 Lys Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Lys Thr Lys Glu Val Leu Asn Gln 20 25 30 Ala Val Ala Asp Leu His Val Ala His Val Ala Leu His Gln Val His 35 40 45 Trp Tyr Met His Gly Arg Gly Phe Leu Val Trp His Pro Lys Met Asp 50 55 60 Glu Tyr Met Glu Ala Leu Asp Gly Gln Leu Asp Glu Thr Ser Glu Arg 65 70 75 80 Leu Ile Thr Leu Gly Gly Ser Pro Phe Ser Thr Leu Thr Glu Phe Leu 85 90 95 Gln Asn Ser Glu Ile Glu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Arg Asn Val Glu 100 105 110 Glu Ser Leu Glu Arg Val Leu Val Ile Tyr Arg Tyr Leu Ser Glu Leu 115 120 125 Phe Gln Lys Asp Leu Asp Val Thr Asp Glu Glu Gly Asp Asp Val Thr 130 135 140 Asn Gly Ile Phe Ala Gly Ala Lys Thr Glu Thr Asp Lys Thr Ile Trp 145 150 155 160 Met Leu Ala Ala Glu Leu Gly Gln Ala Pro Gly Leu Val Asp Pro 165 170 175 <210> 14 <211> 176 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 14 Met Ala Val Glu Leu Lys Lys Glu Ala Val Lys Asp Val Thr Ser Leu 1 5 10 15 Thr Lys Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Lys Thr Lys Glu Val Leu Asn 20 25 30 Gln Ala Val Ala Asp Leu Tyr Val Ala His Val Ala Leu His Gln Val 35 40 45 His Trp Tyr Met His Gly Arg Gly Phe Leu Val Trp His Pro Lys Met 50 55 60 Asp Glu Tyr Met Glu Ala Leu Asp Gly Gln Leu Asp Glu Ile Ser Glu 65 70 75 80 Arg Leu Ile Thr Leu Gly Gly Ser Pro Phe Ser Thr Leu Thr Glu Phe 85 90 95 Leu Gln Asn Ser Glu Ile Glu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Arg Asn Val 100 105 110 Glu Glu Ser Leu Glu Arg Val Leu Val Ile Tyr Arg Tyr Leu Ser Glu 115 120 125 Leu Phe Gln Lys Gly Leu Asp Val Thr Asp Glu Glu Gly Asp Asp Val 130 135 140 Thr Asn Asp Ile Phe Val Gly Ala Lys Thr Glu Thr Asp Lys Thr Ile 145 150 155 160 Trp Met Leu Ala Ala Glu Leu Gly Gln Ala Pro Gly Leu Val Asp Pro 165 170 175 <210> 15 <211> 176 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 15 Met Ala Val Glu Leu Lys Lys Glu Ala Val Lys Asp Val Thr Ser Leu 1 5 10 15 Thr Lys Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Lys Thr Lys Glu Val Leu Asn 20 25 30 Gln Ala Val Ala Asp Leu Tyr Val Ala His Val Ala Leu His Gln Val 35 40 45 His Trp Tyr Met His Gly Arg Gly Phe Leu Val Trp His Pro Lys Met 50 55 60 Asp Glu Tyr Met Glu Ala Leu Asp Gly Gln Leu Asp Glu Ile Ser Glu 65 70 75 80 Arg Leu Ile Thr Leu Gly Gly Ser Pro Phe Ser Thr Leu Thr Glu Phe 85 90 95 Leu Gln Asn Ser Glu Ile Glu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Arg Asn Val 100 105 110 Glu Glu Ser Leu Glu Arg Val Leu Val Ile Tyr Arg Tyr Leu Ser Glu 115 120 125 Leu Phe Gln Lys Gly Leu Asp Val Thr Asp Glu Glu Gly Asp Asp Val 130 135 140 Thr Asn Gly Ile Phe Ala Gly Ala Lys Thr Glu Thr Asp Lys Thr Ile 145 150 155 160 Trp Met Leu Ala Ala Glu Leu Gly Gln Ala Pro Gly Leu Val Asp Pro 165 170 175 <210> 16 <211> 176 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 16 Met Ala Val Glu Leu Lys Lys Glu Ala Val Lys Asp Val Thr Ser Leu 1 5 10 15 Thr Lys Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Lys Thr Lys Glu Val Leu Asn 20 25 30 Gln Ala Val Ala Asp Leu Tyr Val Ala His Val Ala Leu His Gln Val 35 40 45 His Trp Tyr Met His Gly Arg Gly Phe Leu Val Trp His Pro Lys Met 50 55 60 Asp Glu Tyr Met Glu Ala Leu Asp Gly Gln Leu Asp Glu Ile Ser Glu 65 70 75 80 Arg Leu Ile Thr Leu Gly Gly Ser Pro Phe Ser Thr Leu Thr Glu Phe 85 90 95 Leu Gln Asn Ser Glu Ile Glu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Arg Asn Val 100 105 110 Glu Glu Ser Leu Glu Arg Val Leu Val Ile Tyr Arg Tyr Leu Ser Glu 115 120 125 Leu Phe Gln Lys Gly Leu Asp Val Thr Asp Glu Glu Gly Asp Asp Val 130 135 140 Thr Asn Asp Ile Phe Val Gly Ala Lys Thr Glu Thr Asp Lys Thr Ile 145 150 155 160 Trp Met Leu Ala Ala Glu Leu Gly Gln Ala Pro Gly Leu Val Asp Pro 165 170 175 <210> 17 <211> 176 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 17 Met Ala Val Glu Leu Lys Lys Glu Ala Val Lys Asp Val Thr Ser Leu 1 5 10 15 Thr Lys Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Lys Thr Lys Glu Val Leu Asn 20 25 30 Gln Ala Val Ala Asp Leu Tyr Val Ala His Val Ala Leu His Gln Val 35 40 45 His Trp Tyr Met His Gly Arg Gly Phe Leu Val Trp His Pro Lys Met 50 55 60 Asp Glu Tyr Met Glu Ala Leu Asp Gly Gln Leu Asp Glu Ile Ser Glu 65 70 75 80 Arg Leu Ile Thr Leu Gly Gly Ser Pro Phe Ser Thr Leu Thr Glu Phe 85 90 95 Leu Gln Asn Ser Glu Ile Glu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Arg Asn Val 100 105 110 Glu Glu Ser Leu Glu Arg Val Leu Val Ile Tyr Arg Tyr Leu Ser Glu 115 120 125 Leu Phe Gln Lys Gly Leu Asp Val Thr Asp Glu Glu Gly Asp Asp Val 130 135 140 Thr Asn Gly Ile Phe Ala Gly Ala Lys Thr Glu Thr Asp Lys Thr Ile 145 150 155 160 Trp Met Leu Ala Ala Glu Leu Gly Gln Ala Pro Gly Leu Val Asp Pro 165 170 175 <210> 18 <211> 176 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 18 Met Ala Val Glu Leu Lys Lys Glu Ala Val Lys Asp Val Thr Ser Leu 1 5 10 15 Thr Lys Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Lys Thr Lys Glu Val Leu Asn 20 25 30 Gln Ala Val Ala Asp Leu Tyr Val Ala His Val Ala Leu His Gln Val 35 40 45 His Trp Tyr Met His Gly Arg Gly Phe Leu Val Trp His Pro Lys Met 50 55 60 Asp Glu Tyr Met Glu Ala Leu Asp Gly Gln Leu Asp Glu Ile Ser Glu 65 70 75 80 Arg Leu Ile Thr Leu Gly Gly Ser Pro Phe Ser Thr Leu Thr Glu Phe 85 90 95 Leu Gln Asn Ser Glu Ile Glu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Arg Asn Val 100 105 110 Glu Glu Ser Leu Glu Arg Val Leu Val Ile Tyr Arg Tyr Leu Ser Glu 115 120 125 Leu Phe Gln Lys Gly Leu Asp Val Thr Asp Glu Glu Gly Asp Asp Val 130 135 140 Thr Asn Gly Ile Phe Ala Gly Ala Lys Thr Glu Thr Asp Lys Thr Ile 145 150 155 160 Trp Met Leu Ala Ala Glu Leu Gly Gln Ala Pro Gly Leu Val Asp Pro 165 170 175 <210> 19 <211> 176 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 19 Met Ala Val Glu Leu Lys Lys Glu Ala Ala Lys Asp Val Ala Arg Leu 1 5 10 15 Thr Lys Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Lys Thr Lys Glu Val Leu Asn 20 25 30 Gln Ala Val Ala Asp Leu Tyr Val Ala His Val Ala Leu His Gln Val 35 40 45 His Trp Tyr Met His Gly Arg Gly Phe Leu Val Trp His Pro Lys Met 50 55 60 Asp Glu Tyr Met Glu Ala Leu Asp Gly His Leu Asp Glu Ile Ser Glu 65 70 75 80 Arg Leu Ile Thr Leu Gly Gly Ser Pro Phe Ser Thr Leu Thr Glu Phe 85 90 95 Leu Gln Asn Ser Glu Ile Glu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Arg Asn Val 100 105 110 Glu Glu Ser Leu Glu Arg Val Leu Ala Ile Tyr Arg Tyr Leu Ile Thr 115 120 125 Leu Phe Gln Lys Ala Leu Asp Val Thr Asp Glu Glu Gly Asp Asp Val 130 135 140 Thr Asn Asp Ile Phe Val Gly Ala Lys Ala Glu Leu Glu Lys Thr Val 145 150 155 160 Trp Met Leu Ala Ala Glu Leu Gly Gln Ala Pro Gly Leu Val Asp Pro 165 170 175 <210> 20 <211> 176 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 20 Met Ala Val Glu Leu Lys Lys Glu Ala Val Lys Asp Val Thr Ser Leu 1 5 10 15 Thr Lys Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Lys Thr Lys Glu Val Leu Asn 20 25 30 Gln Ala Val Ala Asp Leu Tyr Val Ala His Val Ala Leu His Gln Val 35 40 45 His Trp Tyr Met His Gly Arg Gly Phe Leu Val Trp His Pro Lys Met 50 55 60 Asp Glu Tyr Met Glu Ala Leu Asp Gly Gln Leu Asp Glu Ile Ser Glu 65 70 75 80 Arg Leu Ile Thr Leu Gly Gly Ser Pro Phe Ser Thr Leu Thr Glu Phe 85 90 95 Leu Gln Asn Ser Glu Ile Glu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Arg Asn Val 100 105 110 Glu Glu Ser Leu Glu Arg Val Leu Val Ile Tyr Arg Tyr Leu Ser Glu 115 120 125 Leu Phe Gln Lys Gly Leu Asp Val Thr Asp Glu Glu Gly Asp Asp Val 130 135 140 Thr Asn Gly Ile Phe Ala Gly Ala Lys Thr Glu Thr Asp Lys Thr Ile 145 150 155 160 Trp Met Leu Ala Ala Glu Leu Gly Gln Ala Pro Gly Leu Val Asp Pro 165 170 175 <210> 21 <211> 176 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 21 Met Ala Val Glu Leu Lys Lys Glu Ala Val Lys Asp Val Thr Ser Leu 1 5 10 15 Thr Lys Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Lys Thr Lys Glu Val Leu Asn 20 25 30 Gln Ala Val Ala Asp Leu Tyr Val Ala His Val Ala Leu His Gln Val 35 40 45 His Trp Tyr Met His Gly Arg Gly Phe Leu Val Trp His Pro Lys Met 50 55 60 Asp Glu Tyr Met Glu Ala Leu Asp Gly Gln Leu Asp Glu Ile Ser Glu 65 70 75 80 Arg Leu Ile Thr Leu Gly Gly Ser Pro Phe Ser Thr Leu Thr Glu Phe 85 90 95 Leu Gln Asn Ser Glu Ile Glu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Arg Asn Val 100 105 110 Glu Glu Ser Leu Glu Arg Val Leu Val Ile Tyr Arg Tyr Leu Ser Glu 115 120 125 Leu Phe Gln Lys Gly Leu Asp Val Thr Asp Glu Glu Gly Asp Asp Val 130 135 140 Thr Asn Gly Ile Phe Val Gly Ala Lys Thr Glu Thr Asp Lys Thr Ile 145 150 155 160 Trp Met Leu Ala Ala Glu Leu Gly Gln Ala Pro Gly Leu Val Asp Pro 165 170 175

Claims (59)

  1. 분리된 인간 모노크로날 항체 또는 이들의 항원-결합 부위로, 여기서 항체는:
    (a) 1x10-7 M 또는 그 이하의 KD로 인간 CD70에 결합하고; 그리고
    (b) 신장 세포 암종 종양 세포 라인에 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 인간 모노크로날 항체 또는 이들의 항원-결합 부위.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 항체가 IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아이소타이프의 전 길이의 항체임을 특징으로 하는 항체.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 항체 분획 또는 단일 사슬 항체임을 특징으로 하는 항체.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 5.5x10-9 M 또는 그 이하의 KD로 인간 CD70에 결합함을 특징으로 하는 항체.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 3x10-9 M 또는 그 이하의 KD로 인간 CD70에 결합함을 특징으로 하는 항체.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 2x10-9 M 또는 그 이하의 KD로 인간 CD70에 결합함을 특징으로 하는 항체.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 내재화된 것임을 특징으로 하는 항체.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 신장 세포 암종 종양 세포 라인은 786-0, A-498, ACHN, Caki-1 및 Caki-2 세포 라인으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 항체.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 B-세포 종양 세포 라인에 결합함을 특징으로 하는 항체.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 B-세포 종양 세포 라인은 Daudi, HuT 78, Raji 및 Granta 519 세포 라인으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 항체.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 퓨코스 잔기를 결한 것임을 특징으로 하는 항체.
  12. 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원-결합 부위로, 여기서 항체는 레퍼런스 항체와 CD70에 결합에 대해 교차 경쟁하고, 레퍼런스 항체는:
    (a) 1x10-7 M 또는 그 이하의 KD로 인간 CD70에 결합하고; 그리고
    (b) 신장 세포 암종 종양 세포 라인에 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원-결합 부위.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 레퍼런스 항체는:
    (a) SEQ ID NO: 1의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 영역; 및
    (b) SEQ ID NO: 5의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 영역을 특징으로 하는 항체.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 레퍼런스 항체는:
    (a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 영역; 및
    (b) SEQ ID NO: 6의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 영역을 특징으로 하는 항체.
  15. 제 12항에 있어서,
    상기 레퍼런스 항체는:
    (a) SEQ ID NO: 3의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 영역; 및
    (b) SEQ ID NO: 7의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 영역을 특징으로 하는 항체.
  16. 제 12항에 있어서,
    상기 레퍼런스 항체는:
    (a) SEQ ID NO: 4의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 영역; 및
    (b) SEQ ID NO: 8의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 영역을 특징으로 하는 항체.
  17. 제 12항에 있어서,
    상기 항체는 B-세포 종양 세포 라인에 결합함을 특징으로 하는 항체.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 B-세포 종양 세포 라인은 Daudi, HuT 78, Raji 및 Granta 519 세포 라인으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 항체.
  19. 인간 VH 3-30.3 유전자 또는 인간 VH 3-33 유전자의 산물이나 그로부터 유래된 것인 중사슬 가변 영역을 포함하는 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위로, 여기서 항체는 특이적으로 CD70에 결합하는 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  20. 인간 VK L6 유전자, 인간 VK Ll8 유전자 또는 인간 VK Ll5 유전자의 산물이나 그로부터 유래된 것인 중사슬 가변 영역을 포함하는 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위로, 여기서 항체는 특이적으로 CD70에 결합하는 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  21. 제 17항에 있어서,
    인간 VH 3-30.3 유전자 또는 인간 VH 3-33 유전자의 산물이나 그로부터 유래된 것인 중사슬 가변 영역을 더 포함하는 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원 결합 부위.
  22. 제 1항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO:9를 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl;
    (b) SEQ ID NO:13을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2;
    (c) SEQ ID NO:17을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3;
    (d) SEQ ID NO:21을 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl;
    (e) SEQ ID NO:25를 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및
    (f) SEQ ID NO:29를 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3을 포함함을 특징으로 하는 항체.
  23. 제 1항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO:10을 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl;
    (b) SEQ ID NO:14를 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2;
    (c) SEQ ID NO:18을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3;
    (d) SEQ ID NO:22를 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl;
    (e) SEQ ID NO:26을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및
    (f) SEQ ID NO:30을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3을 포함함을 특징으로 하는 항체.
  24. 제 1항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO:11을 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl;
    (b) SEQ ID NO:15를 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2;
    (c) SEQ ID NO:19를 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3;
    (d) SEQ ID NO:23을 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl;
    (e) SEQ ID NO:27을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및
    (f) SEQ ID NO:31을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3을 포함함을 특징으로 하는 항체.
  25. 제 1항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO:12를 포함하는 중사슬 가변영역 CDRl;
    (b) SEQ ID NO:16을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR2;
    (c) SEQ ID NO:20을 포함하는 중사슬 가변영역 CDR3;
    (d) SEQ ID NO:24를 포함하는 경사슬 가변영역 CDRl;
    (e) SEQ ID NO:28을 포함하는 경사슬 가변영역 CDR2; 및
    (f) SEQ ID NO:32를 포함하는 경사슬 가변영역 CDR3을 포함함을 특징으로 하는 항체.
  26. (a) SEQ ID NO:1의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및
    (b) SEQ ID NO:5의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함하고;
    여기서 항체는 CD70에 특이적으로 결합하는 것임을 특징으로 하는 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원-결합 부위.
  27. (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및
    (b) SEQ ID NO:6의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함하고;
    여기서 항체는 CD70에 특이적으로 결합하는 것임을 특징으로 하는 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원-결합 부위.
  28. (a) SEQ ID NO:3의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및
    (b) SEQ ID NO:7의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함하고; 여기서 항체는 CD70에 특이적으로 결합하는 것임을 특징으로 하는 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원-결합 부위.
  29. (a) SEQ ID NO:4의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및
    (b) SEQ ID NO:8의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함하고;
    여기서 항체는 CD70에 특이적으로 결합하는 것임을 특징으로 하는 분리된 모노크로날 항체 또는 이들의 항원-결합 부위.
  30. 청구항 1 내지 29 중의 어느 한 항에 따른 항체 또는 이들의 항원-결합 부위 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  31. 치료적 제제에 연결된 청구항 1 내지 29 중의 어느 하나에 따른 항체 또는 이들의 항원-결합 부위를 포함하는 이뮤노컨쥬게이트.
  32. 청구항 31의 이뮤노컨쥬게이트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  33. 제 31항에 있어서, 상기 치료적 제제는 세포독성임을 특징으로 하는 이뮤노컨쥬게이트.
  34. 청구항 33의 이뮤노컨쥬게이트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  35. 제 31항에 있어서,
    상기 치료적 제제는 방사성 동위원소임을 특징으로 하는 이뮤노컨쥬게이트.
  36. 청구항 35의 이뮤노컨쥬게이트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  37. 청구항 1 내지 29 중의 어느 하나에 따른 항체 또는 이들의 항원-결합 부위를 코드하는 분리된 핵산 분자.
  38. 청구항 37의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  39. 청구항 38의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  40. 청구항 39의 숙주 세포에 항체를 발현하고 숙주 세포로부터 항체를 분리하는 것을 포함하는 항-CD70 항체의 제조방법.
  41. 청구항 1 내지 29의 어느 하나에 따른 항체 또는 이들의 항원 결합 부분을 질병을 치료 또는 예방하기에 유효한 양으로 대상에 투여하는 것을 포함하는 CD70 발현 종양 세포의 성장에 의해 특징되어지는 질환을 치료하거나 예방하는 방법.
  42. 제 41항에 있어서,
    상기 질환은 암임을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 42항에 있어서,
    상기 암은 신장 세포 암종 (RCC), 투명세포 RCC, 아교모세포종, 비-호지킨 림프종(NHL), 급성 림프 백혈병 (ALL), 만성 림프 백혈병 (CLL), 버킷 림프종, 악성 대세포 림프종 (ALCL), 다발성 골수종, 피부 T-세포 림프종, 결절성 소분할세포 림프절, 림프성 림프절, 말단 T-세포 림프절, 레너트 림프종, 이뮤노블라스트 림프절, T-세포 백혈병/림프절 (ATLL), 성인 T-세포 백혈병 (T-ALL), 엔트로블라스트/센트로사이트 (cb/cc) 엽포 림프절 암, B 계대의 미만성 대형세포 림프절, 혈관면역아세포 림프선병증 (AILD)-형 T 세포 림프종, HIV 연계 체강 기재 림프종, 태생암종, 비인두염의 미분화된 암종, 쉬민케 종양, 캐스틀만 질환, 카포지 사코마, 다발성 골수종, 웰덴스트롬 거대글로불린혈증 및 기타 B-세포 림프절로 구성된 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 42항에 있어서,
    상기 암은 신장 세포 암종임을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 42항에 있어서,
    상기 암은 림프종임을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 41항에 있어서,
    상기 항체는 퓨코스 잔기를 결한 것임을 특징으로 하는 방법.
  47. 청구항 1 내지 29의 어느 한 항에 따른 항체 또는 이들의 항원 결합 부분의 치료적으로 유효한 양을 대상에 투여하는 것을 포함하고 이에 의해 자가면역 증상의 질환이 개선되어지는, 상기 치료를 필요로 하는 대상에 자가면역 질환을 치료하는 방법.
  48. 제 47항에 있어서,
    상기 자가면역 질환은 루푸스임을 특징으로 하는 방법.
  49. 청구항 1의 항체 또는 이들의 항원 결합 부분의 유효한 양을 투여하는 것을 포함하고 이에 의해 자가면역 증상의 질환이 예방 또는 약화되어지는, 대상에 자가면역 질환의 전개 위험을 예방하는 방법.
  50. 청구항 1의 항체 또는 이들의 항원 결합 부분의 치료적으로 유효한 양을 대상에 투여하는 것을 포함하고 이에 의해 염증이 개선되어 지는, 염증 치료가 필요로 하는 대상에 염증을 치료하는 방법.
  51. 제 50항에 있어서,
    상기 항체는 퓨코스 잔기를 결한 것임을 특징으로 하는 방법.
  52. 청구항 1 내지 29의 어느 하나에 따른 항체 또는 이들의 항원 결합 부분의 치료적으로 유효한 양을 대상에 투여하는 것을 포함하고 이에 의해 바이러스 감염 의 증상이 개선되어 지는, 바이러스 감염 치료가 필요로 하는 대상에 바이러스 감염을 치료하는 방법.
  53. 제 52항에 있어서,
    상기 바이러스 감염은 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 간염 (A, B, 또는 C), 헤르페스 바이러스(즉, VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II, 및 CMV, 엡스타인바바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코르노바이러스, 호흡기세포융합바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 루벨라 바이러스, 파르보바이러스, 백시너 바이러스, HTLV 바이러스, 댕기열 바이러스, 파필로마바이러스, 몰루스쿰 바이러스, 폴리오바이러스, 공수병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스의 뇌염 바이러스 및 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV)로 구성된 바이러스의 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  54. 종양세포의 성장을 저해하는 방법에 사용하기 위한 청구항 1 내지 29 중 어느 한 항의 항체 또는 이들의 항원 결합 부분.
  55. 종양세포의 성장을 저해하기 위한 치료제의 제조를 위한 청구항 1 내지 29 중 어느 한 항의 항체 또는 이들의 항원 결합 부분의 용도.
  56. 자가면역 질환의 증상을 완화하는 방법에 사용하기 위한 청구항 1 내지 29 중 어느 한 항의 항체 또는 이들의 항원 결합 부분.
  57. 자가면역 질환의 증상을 완화하기 위한 치료제의 제조에 청구항 1 내지 29 중 어느 한 항의 항체 또는 이들의 항원 결합 부분의 용도.
  58. 바이러스 감염의 증상을 완화하는 방법에 사용하기 위한 청구항 1 내지 29 중 어느 한 항의 항체 또는 이들의 항원 결합 부분.
  59. 바이러스 감염의 증상을 완화하기 위한 치료제의 제조에 청구항 1 내지 29 중 어느 한 항의 항체 또는 이들의 항원 결합 부분의 용도.
KR1020087007221A 2005-09-26 2006-09-26 씨디70에 대한 인간 모노크로날 항체 KR20080056167A (ko)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US72060005P 2005-09-26 2005-09-26
US60/720,600 2005-09-26
US72669505P 2005-10-13 2005-10-13
US60/726,695 2005-10-13
US74882705P 2005-12-08 2005-12-08
US60/748,827 2005-12-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20080056167A true KR20080056167A (ko) 2008-06-20

Family

ID=37900443

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087007221A KR20080056167A (ko) 2005-09-26 2006-09-26 씨디70에 대한 인간 모노크로날 항체

Country Status (13)

Country Link
US (1) US8124738B2 (ko)
EP (1) EP1934261B1 (ko)
JP (1) JP2009509510A (ko)
KR (1) KR20080056167A (ko)
AU (1) AU2006294663B2 (ko)
BR (1) BRPI0617549A2 (ko)
CA (1) CA2623236A1 (ko)
EA (1) EA016186B1 (ko)
ES (1) ES2527961T3 (ko)
IL (1) IL189788A0 (ko)
NO (1) NO20081987L (ko)
NZ (1) NZ566395A (ko)
WO (1) WO2007038637A2 (ko)

Families Citing this family (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58103228A (ja) * 1981-12-16 1983-06-20 Kaga Tsushin Kogyo Kk 光スイツチ方法
US20090017023A1 (en) * 2002-08-14 2009-01-15 Macrogenics, Inc. FcGammaRIIB Specific Antibodies and Methods of Use Thereof
JP5356648B2 (ja) 2003-02-20 2013-12-04 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 抗ｃｄ７０抗体−医薬結合体、ならびに癌および免疫障害の処置のためのそれらの使用
WO2006113909A2 (en) 2005-04-19 2006-10-26 Seattle Genetics, Inc. Humanized anti-cd70 binding agents and uses thereof
US20080025989A1 (en) 2003-02-20 2008-01-31 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of cancer and immune disorders
US8337838B2 (en) 2004-10-15 2012-12-25 Seattle Genetics, Inc. Anti-CD70 antibody and its use for the treatment and prevention of cancer and immune disorders
US7641903B2 (en) 2004-10-15 2010-01-05 Seattle Genetics, Inc. Anti-CD70 antibody and its use for the treatment and prevention of cancer and immune disorders
AU2005295595C1 (en) 2004-10-15 2012-06-21 Seattle Genetics, Inc. Anti-CD70 antibody and its use for the treatment and prevention of cancer and immune disorders
EP1934261B1 (en) 2005-09-26 2014-10-29 Medarex, L.L.C. Human monoclonal antibodies to cd70
US7989160B2 (en) 2006-02-13 2011-08-02 Alethia Biotherapeutics Inc. Polynucleotides and polypeptide sequences involved in the process of bone remodeling
US8168181B2 (en) 2006-02-13 2012-05-01 Alethia Biotherapeutics, Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15
WO2008074004A2 (en) * 2006-12-14 2008-06-19 Medarex, Inc. Human antibodies that bind cd70 and uses thereof
EP2185188B1 (en) 2007-08-22 2014-08-06 Medarex, L.L.C. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
DK2276509T3 (en) * 2008-04-11 2016-09-19 Seattle Genetics Inc DETECTION AND TREATMENT OF CANCER IN PANCREAS, ovarian and other cancers
ES2458541T3 (es) 2008-05-02 2014-05-06 Seattle Genetics, Inc. Métodos y composiciones para elaborar anticuerpos y derivados de anticuerpos con fucosilación del núcleo reducida
US8394922B2 (en) 2009-08-03 2013-03-12 Medarex, Inc. Antiproliferative compounds, conjugates thereof, methods therefor, and uses thereof
BR112012002460A2 (pt) * 2009-08-04 2016-11-08 Hoffmann La Roche anticorpo marcador de célula beta
JP5808054B2 (ja) 2009-12-25 2015-11-10 中外製薬株式会社 Ｎｏｇ樹立癌細胞株が移植された非ヒト動物モデルを用いた抗癌剤ターゲット探索及びスクリーニング法
CN103328626B (zh) 2010-10-06 2017-02-08 中外制药株式会社 癌干细胞群及其制备方法
HUE039849T2 (hu) * 2011-03-16 2019-02-28 Argenx Bvba CD70 elleni ellenanyagok
WO2012143499A2 (de) 2011-04-21 2012-10-26 Bayer Intellectual Property Gmbh Neue binder-wirkstoff konjugate (adcs) und ihre verwendung
RS59253B1 (sr) 2011-05-08 2019-10-31 Legochem Biosciences Inc Konjugati aktivnog agensa proteina i postupak za njihovo dobijanje
US8852599B2 (en) 2011-05-26 2014-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Immunoconjugates, compositions for making them, and methods of making and use
WO2013035824A1 (ja) 2011-09-07 2013-03-14 ファーマロジカルズ・リサーチ プライベート リミテッド 癌幹細胞の分離
MX353958B (es) * 2011-09-22 2018-02-07 Amgen Inc Proteinas de union al antigeno cd27l.
EP3559049A4 (en) 2011-10-28 2019-12-04 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd POLYPEPTIDE CONSTRUCTS AND APPLICATIONS THEREOF
EP3603671A3 (en) * 2011-10-28 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cancer stem cell-specific molecule
MX350539B (es) 2012-02-13 2017-09-08 Bristol Myers Squibb Co Compuestos de enediino, conjugados de los mismos y sus usos y metodos.
AU2013277169B2 (en) 2012-06-19 2017-02-02 Ambrx, Inc. Anti-CD70 antibody drug conjugates
CA2928851A1 (en) 2012-07-19 2014-01-23 Alethia Biotherapeutics Inc. Anti-siglec-15 antibodies
RS56169B1 (sr) 2013-02-14 2017-11-30 Bristol Myers Squibb Co Jedinjenja tubulisina, metode pripreme i primena
EP2992013B1 (en) 2013-04-29 2019-12-04 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-cd38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
CA2910553A1 (en) * 2013-04-30 2014-11-06 Universite De Montreal Novel biomarkers for acute myeloid leukemia
JP6474404B2 (ja) 2013-08-14 2019-02-27 ウィリアム マーシュ ライス ユニバーシティＷｉｌｌｉａｍ Ｍａｒｓｈ Ｒｉｃｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ウンシアラマイシン誘導体、合成方法、および抗腫瘍薬としてのそれらの使用
JP2016531920A (ja) 2013-09-05 2016-10-13 アデュロ・バイオテック・ホールディングス・ヨーロッパ・ベスローテン・フエンノートシャップＡｄｕｒｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ， Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ． Ｃｄ７０結合ペプチドおよびそれに関連する方法、プロセスおよび用途
SG11201604758PA (en) 2013-12-23 2016-07-28 Bayer Pharma AG Antibody drug conjugates (adcs) with kinesin spindel protein (ksp)
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
US10391168B1 (en) 2014-08-22 2019-08-27 University Of Bern Anti-CD70 combination therapy
AU2015337858B2 (en) 2014-10-29 2020-09-24 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd. Interferon alpha2b variants
US10077287B2 (en) 2014-11-10 2018-09-18 Bristol-Myers Squibb Company Tubulysin analogs and methods of making and use
EP3221346B1 (en) 2014-11-21 2020-09-02 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
BR112017014599A2 (pt) 2015-01-14 2018-01-16 Bristol-Myers Squibb Company dímeros de benzodiazepina, conjugados dos mesmos, e métodos de preparação e uso
WO2016115201A1 (en) 2015-01-14 2016-07-21 Bristol-Myers Squibb Company Heteroarylene-bridged benzodiazepine dimers, conjugates thereof, and methods of making and using
MX2017017172A (es) 2015-06-22 2018-02-23 Bayer Pharma AG Conjugados de ligador-principio activo (adcs) y conjugados de ligador-profarmaco (apdcs) con grupos enzimaticamente escindibles.
WO2017060322A2 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Ptefb-inhibitor-adc
EP3394096A1 (en) 2015-12-21 2018-10-31 Bristol-Myers Squibb Company Variant antibodies for site-specific conjugation
US10869929B2 (en) 2016-01-29 2020-12-22 Merck Sharp & Dohme Corp. Phosphonate linkers and their use to facilitate cellular retention of compounds
SG11201808167VA (en) 2016-03-24 2018-10-30 Bayer Pharma AG Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups
KR20190005924A (ko) 2016-05-10 2019-01-16 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 향상된 안정성을 갖는 튜부리신 유사체의 항체-약물 접합체
JP7022707B2 (ja) 2016-06-15 2022-02-18 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト Ｋｓｐ阻害剤および抗ｃｄ１２３抗体を含む特異的抗体－薬物－コンジュゲート（ａｄｃ）
WO2018014067A1 (en) 2016-07-19 2018-01-25 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-cd47 combination therapy
KR102493853B1 (ko) 2016-08-19 2023-01-30 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 세코-시클로프로파피롤로인돌 화합물, 그의 항체-약물 접합체, 및 제조 및 사용 방법
WO2018075842A1 (en) 2016-10-20 2018-04-26 Bristol-Myers Squibb Company Condensed benzodiazepine derivatives and conjugates made therefrom
CA3047522A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody drug conjugates (adcs) having ksp inhibitors
WO2018114578A1 (de) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen
CN110312533B (zh) 2016-12-21 2023-11-03 拜耳公司 具有酶促可裂解的基团的细胞毒性活性剂的前药
JP7356354B2 (ja) 2017-05-12 2023-10-04 クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト 細胞の操作のための材料及び方法並びに免疫腫瘍学におけるその使用
US11166985B2 (en) 2017-05-12 2021-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
KR20220167342A (ko) 2017-05-25 2022-12-20 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체
GB2567613A (en) 2017-06-16 2019-04-24 Argenx Bvba Treatment for acute myeloid leukaemia
US10457681B2 (en) 2017-08-16 2019-10-29 Bristol_Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a tricyclic moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10472361B2 (en) 2017-08-16 2019-11-12 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a benzotriazole moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10508115B2 (en) 2017-08-16 2019-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having heteroatom-linked aromatic moieties, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10487084B2 (en) 2017-08-16 2019-11-26 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a heterobiaryl moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10494370B2 (en) 2017-08-16 2019-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a pyridine or pyrazine moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
GB201800649D0 (en) 2018-01-16 2018-02-28 Argenx Bvba CD70 Combination Therapy
WO2019149743A1 (en) 2018-01-30 2019-08-08 Cellectis Combination comprising allogeneic immune cells deficient for an antigen present on both t-cells and pathological cells and therapeutic antibody against said antigen
US11377500B2 (en) 2018-02-01 2022-07-05 Pfizer Inc. Antibodies specific for CD70 and their uses
JP7404247B2 (ja) 2018-02-01 2023-12-25 ファイザー・インク Ｃｄ７０を標的とするキメラ抗原受容体
US11485741B2 (en) 2018-04-24 2022-11-01 Bristol-Myers Squibb Company Macrocyclic toll-like receptor 7 (TLR7) agonists
EP3790629A1 (en) 2018-05-11 2021-03-17 CRISPR Therapeutics AG Methods and compositions for treating cancer
EA202092747A1 (ru) 2018-05-29 2021-03-16 Бристол-Маерс Сквибб Компани Модифицированные саморазрушающиеся фрагменты для применения в пролекарствах и конъюгатах и способы применения и изготовления
US11554120B2 (en) 2018-08-03 2023-01-17 Bristol-Myers Squibb Company 1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidine compounds as toll-like receptor 7 (TLR7) agonists and methods and uses therefor
EP3841110A1 (en) * 2018-08-23 2021-06-30 Vanderbilt University Human monoclonal antibodies to a new universal influenza a hemagglutinin head domain epitope
WO2020070288A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and systems for controlling the agonistic properties of antibody variable domains by light
JP2022513653A (ja) 2018-11-28 2022-02-09 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 修飾された重鎖定常領域を含む抗体
SI3886914T1 (sl) 2018-11-30 2023-06-30 Bristol-Myers Squibb Company Protitelo, ki vsebuje C-terminalni podaljšek lahke verige, ki vsebuje glutamin, njegove konjugate ter metode in uporabe
US20220031860A1 (en) 2018-12-12 2022-02-03 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies modified for transglutaminase conjugation, conjugates thereof, and methods and uses
TW202038958A (zh) 2018-12-18 2020-11-01 比利時商阿根思公司 Ｃｄ７０組合治療
WO2020154889A1 (zh) * 2019-01-29 2020-08-06 上海鑫湾生物科技有限公司 具有Fc突变体的抗体与效应细胞的组合、用途和制法
US20220249558A1 (en) 2019-04-30 2022-08-11 Crispr Therapeutics Ag Allogeneic cell therapy of b cell malignancies using genetically engineered t cells targeting cd19
WO2021055306A1 (en) 2019-09-16 2021-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Dual capture method for analysis of antibody-drug conjugates
CN110699327B (zh) * 2019-10-31 2021-04-13 浙江蓝盾药业有限公司 杂交瘤细胞株6f9、抗体及其应用
TW202138388A (zh) 2019-12-30 2021-10-16 美商西根公司 以非海藻糖苷化抗－ｃｄ７０抗體治療癌症之方法
CN115209921A (zh) 2020-03-06 2022-10-18 第一三共株式会社 包含新型环状二核苷酸衍生物的抗体药物偶联物
EP4173638A1 (en) 2020-06-30 2023-05-03 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Anti-cd70 antibody and application thereof
IL302728A (en) 2020-11-13 2023-07-01 Catamaran Bio Inc Genetically modified natural killer cells and methods of using them
CN116490210A (zh) * 2020-11-23 2023-07-25 山东先声生物制药有限公司 Cd70抗体及其应用
EP4251645A1 (en) 2020-11-25 2023-10-04 Catamaran Bio, Inc. Cellular therapeutics engineered with signal modulators and methods of use thereof
CN114685657A (zh) * 2020-12-31 2022-07-01 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种功能增强型抗体阻断剂的开发及其应用
TW202241454A (zh) 2021-02-01 2022-11-01 日商第一三共股份有限公司 抗體－免疫賦活化劑共軛物之新穎製造方法
BR112023017365A2 (pt) 2021-03-12 2023-10-03 Daiichi Sankyo Co Ltd Glicano e método para produzir medicamento contendo glicano
EP4326768A1 (en) 2021-04-23 2024-02-28 Profoundbio Us Co. Anti-cd70 antibodies, conjugates thereof and methods of using the same
CN116120451A (zh) * 2021-06-17 2023-05-16 南京蓝盾生物科技有限公司 抗cd70内化的抗体、抗体偶联物及其应用
CN113754769B (zh) 2021-10-13 2023-06-06 宜明昂科生物医药技术（上海）股份有限公司 靶向cd70的抗体及其制备和用途
WO2023198851A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for controlling the tumor cell killing by light
WO2024040195A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering

Family Cites Families (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5332837A (en) * 1986-12-19 1994-07-26 The Upjohn Company CC-1065 analogs
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5162504A (en) * 1988-06-03 1992-11-10 Cytogen Corporation Monoclonal antibodies to a new antigenic marker in epithelial prostatic cells and serum of prostatic cancer patients
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
CA2078118C (en) * 1990-04-25 1999-11-16 Paul A. Aristoff Cc-1065 analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DK1024191T3 (da) 1991-12-02 2008-12-08 Medical Res Council Fremstilling af autoantistoffer fremvist på fag-overflader ud fra antistofsegmentbiblioteker
ES2149768T3 (es) * 1992-03-25 2000-11-16 Immunogen Inc Conjugados de agentes enlazantes de celulas derivados de cc-1065.
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5573924A (en) * 1992-09-08 1996-11-12 Immunex Corporation CD27 ligand
EP1757694A3 (en) * 1992-11-05 2008-02-27 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Prostate-specific membrane antigen
US7105159B1 (en) * 1992-11-05 2006-09-12 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Antibodies to prostate-specific membrane antigen
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6214345B1 (en) * 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
EP0647450A1 (en) * 1993-09-09 1995-04-12 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Improved prodrugs for enzyme mediated activation
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
NZ321172A (en) 1995-10-03 2000-02-28 Scripps Research Inst CBI analogs of CC-1065 and the duocarmycins
US5905027A (en) * 1995-12-27 1999-05-18 Uab Research Foundation Method of diagnosing and treating gliomas
US6667156B2 (en) * 1995-12-27 2003-12-23 Uab Research Foundation Diagnosis and treatment of neuroectodermal tumors
IL126314A (en) 1996-03-25 2003-07-31 Northwest Biotherapeutics Inc Monoclonal antibodies having an antigen binding region specific for the extracellular domain of prostate specific membrane antigen (psma)
US6107090A (en) 1996-05-06 2000-08-22 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of prostate cancer with antibodies to extracellur PSMA domains
US6136311A (en) * 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
US5843937A (en) * 1996-05-23 1998-12-01 Panorama Research, Inc. DNA-binding indole derivatives, their prodrugs and immunoconjugates as anticancer agents
US6124345A (en) * 1996-05-31 2000-09-26 Basf Aktiengesellschaft Carbamoyl carboxylic acid amide oximes
US6130237A (en) * 1996-09-12 2000-10-10 Cancer Research Campaign Technology Limited Condensed N-aclyindoles as antitumor agents
JP2002503228A (ja) 1997-05-22 2002-01-29 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート デュオカルマイシンおよびｃｃ−１０６５の類似体
WO2000064946A2 (en) * 1999-04-28 2000-11-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting vegf
MXPA02000962A (es) 1999-07-29 2002-07-02 Medarex Inc Anticuerpos monoclonales humanos para her2/neu.
EP2829609A1 (en) 1999-08-24 2015-01-28 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human CTLA-4 antibodies and their uses
ES2528794T3 (es) * 2000-04-11 2015-02-12 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
WO2002020715A2 (en) * 2000-09-05 2002-03-14 Biosight Ltd. Peptide conjugated anti-cancer prodrugs
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
EP1243276A1 (en) * 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
JP4255287B2 (ja) * 2001-05-14 2009-04-15 東レ・ダウコーニング株式会社 熱伝導性シリコーン組成物
US7129261B2 (en) * 2001-05-31 2006-10-31 Medarex, Inc. Cytotoxic agents
JP2005501011A (ja) 2001-06-08 2005-01-13 ユタ ベンチャー ザ セカンド リミテッド パートナーシップ 組織特異的内皮膜タンパク質
EP1404356B1 (en) 2001-06-11 2011-04-06 Medarex, Inc. Method for designing cd10-activated prodrug compounds
US6792365B2 (en) * 2001-08-10 2004-09-14 Micron Technology, Inc. Sequential unique marking
JP2005502703A (ja) 2001-09-07 2005-01-27 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート Ｃｃ−１０６５およびデュオカルマイシンのｃｂｉ類似体
US7091186B2 (en) * 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
US7261892B2 (en) * 2001-11-27 2007-08-28 Celltech R&D Limited Methods for diagnosis and treatment of epithelial-derived cancers
NZ533240A (en) 2001-11-27 2007-12-21 Oxford Glycosciences Uk Ltd Use of polypeptide for the treatment of epithelial-derived cancer
AU2003219696A1 (en) * 2002-02-01 2003-09-02 Seattle Genetics, Inc. Sga-1m, a cancer associated antigen, and uses thereof
WO2003072058A2 (en) * 2002-02-27 2003-09-04 The Government Of The United States Of America, Representated By The Secretary, Deparment Of Health And Human Services Dna-binding polyamide drug conjugates
US6534660B1 (en) * 2002-04-05 2003-03-18 Immunogen, Inc. CC-1065 analog synthesis
US6756397B2 (en) * 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
AU2003228173A1 (en) * 2002-05-17 2003-12-02 Auckland Uniservices Limited Processes for preparing 3-substituted 1-(chloromethyl)-1,2-dihydro-3h-(ring fused indol-5-yl(amine-derived)) compounds and analogues thereof, and to products obtained therefrom
JP2005534679A (ja) 2002-07-01 2005-11-17 サビエント ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド 治療的処置のための組成物および方法
US20040202665A1 (en) * 2002-07-01 2004-10-14 Janette Lazarovits Compositions and methods for therapeutic treatment
EP1545613B9 (en) * 2002-07-31 2012-01-25 Seattle Genetics, Inc. Auristatin conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
US20040081653A1 (en) * 2002-08-16 2004-04-29 Raitano Arthur B. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 251P5G2 useful in treatment and detection of cancer
JP5356648B2 (ja) * 2003-02-20 2013-12-04 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 抗ｃｄ７０抗体−医薬結合体、ならびに癌および免疫障害の処置のためのそれらの使用
WO2006113909A2 (en) 2005-04-19 2006-10-26 Seattle Genetics, Inc. Humanized anti-cd70 binding agents and uses thereof
US20080025989A1 (en) * 2003-02-20 2008-01-31 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of cancer and immune disorders
AU2003237076A1 (en) * 2003-05-23 2004-12-13 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Therapeutical use of anti-cd70 antibody for treating or preventing aids
US7109304B2 (en) * 2003-07-31 2006-09-19 Immunomedics, Inc. Humanized anti-CD19 antibodies
US20120202710A1 (en) * 2003-09-09 2012-08-09 Integrigen, Inc. Methods and compositions for generation of germline human antibody genes
US20050282168A1 (en) * 2003-09-29 2005-12-22 Wyeth Cell surface molecules as markers and therapeutic agents against kidney cancers
KR101520209B1 (ko) * 2003-11-06 2015-05-13 시애틀 지네틱스, 인크. 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물
PL1691837T3 (pl) 2003-12-10 2012-11-30 Squibb & Sons Llc IP-10 przeciwciała i ich zastosowanie
WO2005070457A1 (en) * 2004-01-23 2005-08-04 Seattle Genetics, Inc. Melphalan prodrugs
WO2005077462A2 (en) * 2004-02-09 2005-08-25 The Cbr Institute For Biomedical Research, Inc. Cd70 inhibition for the treatment and prevention of inflammatory bowel disease
US7691962B2 (en) * 2004-05-19 2010-04-06 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
JP5039544B2 (ja) 2004-06-18 2012-10-03 ジェネンテック， インコーポレイテッド 腫瘍の治療
BRPI0512928A (pt) 2004-06-30 2008-04-15 Novartis Ag composições e métodos para liberação de agentes de antitumor
US7641903B2 (en) * 2004-10-15 2010-01-05 Seattle Genetics, Inc. Anti-CD70 antibody and its use for the treatment and prevention of cancer and immune disorders
AU2005295595C1 (en) * 2004-10-15 2012-06-21 Seattle Genetics, Inc. Anti-CD70 antibody and its use for the treatment and prevention of cancer and immune disorders
WO2006065533A2 (en) 2004-11-29 2006-06-22 Seattle Genetics, Inc. Engineered antibodies and immunoconjugates
US20060233791A1 (en) * 2005-02-15 2006-10-19 Duke University Anti-CD19 antibodies and uses in oncology
CN102603770A (zh) * 2005-04-15 2012-07-25 免疫基因公司 消除肿瘤中的异质或混合细胞群体
US20060257317A1 (en) 2005-05-04 2006-11-16 Duke University Combination therapy in the treatment of cancer
KR20080026562A (ko) 2005-06-02 2008-03-25 갤럭시 바이오테크, 엘엘씨 항체를 이용한 뇌종양 치료 방법
US8008453B2 (en) * 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
EP1934261B1 (en) 2005-09-26 2014-10-29 Medarex, L.L.C. Human monoclonal antibodies to cd70
CN101312748A (zh) 2005-09-26 2008-11-26 梅达莱克斯公司 抗体-药物轭合物和使用方法
ES2375843T3 (es) 2005-10-26 2012-03-06 Medarex, Inc. Procedimientos y compuestos para la preparación de an�?logos de cc-1065.
RU2489423C2 (ru) 2006-02-02 2013-08-10 Синтарга Б.В. Водорастворимые аналоги сс-1065 и их конъюгаты
WO2007144882A2 (en) 2006-06-14 2007-12-21 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Targeted chimeric proteins
WO2008074004A2 (en) * 2006-12-14 2008-06-19 Medarex, Inc. Human antibodies that bind cd70 and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0617549A2 (pt) 2011-07-26
WO2007038637A3 (en) 2007-10-04
WO2007038637A2 (en) 2007-04-05
EP1934261B1 (en) 2014-10-29
AU2006294663B2 (en) 2012-03-22
NZ566395A (en) 2012-03-30
US20090028872A1 (en) 2009-01-29
US8124738B2 (en) 2012-02-28
AU2006294663A1 (en) 2007-04-05
EA200800953A1 (ru) 2009-02-27
IL189788A0 (en) 2008-08-07
EA016186B1 (ru) 2012-03-30
JP2009509510A (ja) 2009-03-12
NO20081987L (no) 2008-06-25
EP1934261A2 (en) 2008-06-25
ES2527961T3 (es) 2015-02-02
CA2623236A1 (en) 2007-04-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8124738B2 (en) Human monoclonal antibodies to CD70
AU2006321841B2 (en) Human monoclonal antibodies to protein tyrosine kinase 7 ( PTK7 ) and their use
KR101888321B1 (ko) 예정 사멸 리간드 1 (피디-엘1)에 대한 인간 모노클로날 항체
US8680247B2 (en) Monoclonal antibodies against glypican-3
US20090142349A1 (en) CD19 Antibodies And Their uses
US20080247944A1 (en) Irta-2 Antibodies and Their Uses
US20080187547A1 (en) Irta-5 antibodies and their uses
WO2008109533A2 (en) Human antibodies that bind multiple irta family proteins, and uses thereof
WO2006116192A2 (en) Irta-1 antibodies and their uses
CA2580967A1 (en) Irta-4 antibodies and their uses
AU2013257387A1 (en) Monoclonal antibodies against glypican-3
MX2007008260A (es) Anticuerpos irta-2 y sus usos
MX2008006792A (en) Human monoclonal antibodies to protein tyrosine kinase 7 ( ptk7 ) and their use

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E601 Decision to refuse application