CN116120451A - 抗cd70内化的抗体、抗体偶联物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗CD70内化的抗体、抗体偶联物及其应用。本申请以人源CD70为靶点，成功开发得到可结合人源CD70分子的抗体，该抗体特异性好，亲合力较高，结合细胞表面表达的人源CD70，并可被细胞高效转运至胞内；由于该抗体具有内化功能，进而可以携带毒素分子进入细胞杀死该细胞，起到治疗癌症的作用。因此，该抗体具有新颖的特性及药物开发方向，是肿瘤免疫治疗的潜在药物。

Description

抗CD70内化的抗体、抗体偶联物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗CD70内化的抗体、抗体偶联物及其应用。本发明是申请号202110675328.3，名称为抗CD70内化的抗体、抗体偶联物及其应用的分案申请。
背景技术
CD70分子，即肿瘤坏死因子受体超家族7因子(TNFSF7)，多肽链长193个a.a.，分子量21.1KD，是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白(尚未见可溶形式)，C端155个氨基酸位于膜外；胞外的第一、三及第二、四个半胱氨酸之间形成二硫键，维持胞外部分的空间结构；通常其以同源三聚体形式存在于膜上。在正常组织中，CD70的细胞表达谱较窄，主要表达于生发中心的B细胞(诱导分泌抗体)和局部淋巴组织的T细胞，在胸腺髓质上皮细胞中低水平表达。但其表达可被抗原诱导大量增加并随着免疫应答的减弱而减少，比如抗原诱导活化的T、B细胞中高表达CD70。同时其表达受到细胞因子的调控，如IL1a、IL12、TNFa、GM-CSF可上调CD70表达，IL4、IL10下调CD70表达。另外在成熟的DCs中，在TLR信号通路的介导下CD70表达。这些现象正好表明CD70为初始T细胞完全活化所需的一种协同刺激分子，在调控免疫应答中发挥重要作用。其与配体CD27相互作用，不仅起着T细胞活化第二信号的作用，而且二者之间的互作还可以调节B、NK等免疫细胞的增殖和分化。
短暂表达于活化的T和B淋巴细胞及成熟DC细胞中的CD70，在病理状态下却高表达于多种肿瘤组织中。大量研究表明，CD70在淋巴瘤、肾癌、胶质细胞瘤、乳腺癌、血源性恶性肿瘤(如霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病等)等多种肿瘤组织中高水平表达。同时观察到CD27在这些组织中的表达与CD70同步上升或下降。可能二者作为配体/受体对，形成了反馈环，促进淋巴细胞的增殖与分化，反而起到介导疾病发生的作用。CD70与CD27互作后，CD27活化，TRAF2/5结合到其胞内段，进一步激活NF-KB和c-Jun激酶信号通路，引起细胞增殖、生存和分化等。另外，亦有人认为CD70与CD27结合后也可能使CD27胞内段结合Siva从而引起Caspase介导的细胞凋亡。
鉴于以上现象，以CD70为靶点制备特异性抗体，开展肿瘤免疫治疗引起人们浓厚兴趣。目前针对CD70靶点，CART治疗、抗体药和抗体偶联药物三种应用方式均在开发中，进展最快的为强生与arGEN-X合作开发的库萨图珠单抗(Cusatuzumab，研发代号ARGX-110)，目前已完成I期临床，结果显示库萨图珠单抗联合维达扎可显著降低AML患者骨髓中的白血病干细胞，证实该靶点的可靠性。
鉴于CD70/CD27分子对重要免疫调节功能，对CD70进行调控必然会引起一系列的T细胞、甚至B细胞及NK细胞等淋巴细胞的信号传递及生理反应，是一个很理想的免疫治疗靶点，合理应用有可能调动多种细胞免疫。目前靶向CD70的疗法有CART及裸抗，临床效果有限，特别是对实体瘤来说，这两种方法几乎无效。研发人员普遍认为，抗体药物偶联物ADC将是未来治疗癌症的希望之一。
发明内容
发明目的：针对上述现有技术，本申请提供了一种抗CD70内化的抗体、抗体偶联物及其应用。
技术方案：本申请所述的一组抗CD70内化的抗体，其重链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1-16，CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO：17-32，CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：33-48。
进一步优选的，本申请所述抗CD70内化的抗体，包括以下任一所示重链可变区：
其重链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1，CDR2的氨基酸序列选自SEQID NO：17，CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：33；
其重链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2，CDR2的氨基酸序列选自SEQID NO：18，CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：34；
其重链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：3，CDR2的氨基酸序列选自SEQID NO：19，CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：35；
其重链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：4，CDR2的氨基酸序列选自SEQID NO：20，CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：36；
其重链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：5，CDR2的氨基酸序列选自SEQID NO：21，CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：37；
其重链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：6，CDR2的氨基酸序列选自SEQID NO：22，CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：38；
其重链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：7，CDR2的氨基酸序列选自SEQID NO：23，CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：39；
其重链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：8，CDR2的氨基酸序列选自SEQID NO：24，CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：40；
其重链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：9，CDR2的氨基酸序列选自SEQID NO：25，CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：41；
其重链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：10，CDR2的氨基酸序列选自SEQID NO：26，CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：42；
其重链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：11，CDR2的氨基酸序列选自SEQID NO：27，CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：43；
其重链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：12，CDR2的氨基酸序列选自SEQID NO：28，CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：44；
其重链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：13，CDR2的氨基酸序列选自SEQID NO：29，CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：45；
其重链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：14，CDR2的氨基酸序列选自SEQID NO：30，CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：46；
其重链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：15，CDR2的氨基酸序列选自SEQID NO：31，CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：47；
其重链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：16，CDR2的氨基酸序列选自SEQID NO：32，CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：48。
SEQ ID NO：1-48如下表所示：
Figure BDA0003783618590000031
Figure BDA0003783618590000041
本申请还公开了编码上述抗CD70内化的抗体的DNA分子，其重链可变区SEQ IDNO：1-48所述氨基酸对应的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：49-96所示。
SEQ ID NO：49-96如下表所示：
Figure BDA0003783618590000042
Figure BDA0003783618590000051
本申请还公开了所述抗CD70内化的抗体用于检测CD70分子的应用。
进一步的，本申请还公开了所述抗CD70内化的抗体在制备***的药物中的应用。所述肿瘤优选为肾透明细胞腺癌。
本申请还公开了一种抗体偶联物，其包括上述的抗CD70内化的抗体。
所述抗体偶联物在制备***的药物中的应用也在本申请的保护范围内。
本申请以商品化的重组人CD70生物素标签蛋白和噬菌体展示抗体库为起始材料。将CD70生物素标签蛋白与链霉亲和素包被磁珠共孵育，通过链霉亲和素与生物素之间的互作将CD70固定在磁珠上，用抗体库与其孵育，洗去未结合/结合弱的噬菌体，将与CD70蛋白结合的噬菌体洗脱下来。如此反复3次，每次改变CD70生物素标签蛋白的使用量和洗涤条件，逐次淘汰掉结合弱的噬菌体并尽可能保留更多的结合强的噬菌体。用强结合的噬菌体侵染宿主菌，涂板并过夜培养，获得单克隆菌落，即将可结合CD70的噬菌体抗体进行单克隆化。利用单克隆培养上清进行ELISA筛选，并对单克隆进行核酸序列测定。
将信号肽、抗CD70抗体、人源IgG1 Fc的编码序列连接，同框阅读，构建哺乳动物表达载体。转染293F细胞，振荡培养5天后收获上清，利用蛋白A磁珠亲和层析从上清中纯化获得融合蛋白，并对其与CD70结合特性进行鉴定。培养靶细胞，于4℃将抗体与其共孵育，平行做两组。一组经4℃孵育后转移至37℃继续孵育，另一组继续于4℃孵育。孵育结束后，加入荧光标记检测抗体，4℃孵育并用流式细胞术检测荧光抗体，即获知细胞表面被CD70捕获的抗CD70抗体。将靶细胞铺于96孔板中，过夜培养使细胞充分贴壁。加入抗体和/或毒素试剂后进行细胞培养并观察细胞生长特性。培养结束后，检测细胞活率。
技术效果：本申请以人源CD70为靶点，成功开发得到可结合人源CD70分子的抗体(融合蛋白)，该抗体特异性好，亲合力较高，结合细胞表面表达的人源CD70，并可被细胞高效转运至胞内；由于该抗体具有内化功能，进而可以携带毒素分子进入细胞杀死该细胞，即利用抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate，ADC)途径，癌细胞中CD70表达量远高于正常细胞，该ADC主要地靶向癌细胞，从而起到治疗癌症的作用。因此，该抗体具有新颖的特性及药物开发方向，是肿瘤免疫治疗的潜在药物。
附图说明
图1是phage粗培液与人源CD70结合ELISA检测结果；
图2是phage粗培液与人源CD70结合FACS检测结果；
图3是CD70抗体表达载体结构示意图，MCS为多克隆位点，靶基因***此位置；
图4是纯化抗体SDS-PAGE电泳；
图5是纯化抗体与细胞表面CD70结合性能检测；
图6是纯化抗体内化性能检测；
图7是纯化抗体内化性能与ARGX-110对比；
图8是纯化抗体内化介导毒素对细胞的杀伤效能检测；
图9是纯化抗体内化介导毒素对细胞的杀伤效能与ARGX-110对比。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。
(1)噬菌体展示抗体文库淘选
1)宿主菌TG1活化：制备mini agar培养基平板[1×M9盐，2％葡萄糖，2mM MgSO4，0.1mM CaCl2，1mM维生素B1]，划线法过夜培养TG1于37℃培养箱。
2)磁珠洗涤及封闭：吸取50ul磁珠(购自Invitrogen)，置于磁力架上，吸附后吸去液体，1ml PBS重悬、洗涤两次，用1ml 1.5％脱脂奶粉+1.5％BSA的封闭剂(第二轮、第三轮淘选时封闭剂浓度逐渐增加)封闭1小时，去除液体。
3)抗原结合：按16ug/ml的浓度将人源CD70蛋白(购自Acro Biosystem，以后各轮淘选时抗原浓度逐渐降低)用PBS中(pH7.2-7.4)稀释至1ml，重悬磁珠，旋转孵育1小时。
4)库封闭：与抗原结合至磁珠同步，取1011pfu噬菌体病毒颗粒(来自于原始抗体库或淘选扩增产物)，用1ml 1.0％脱脂奶粉+1.0％BSA的封闭剂旋转孵育1小时。
5)噬菌体结合：将磁珠置于磁力架上，去除液体。将封闭后的库加入磁珠，重悬并旋转孵育1小时，去除液体。
6)洗涤：用1ml PBST[0.01M PBS(pH7.4),0.1％Tween-20(第二、三轮Tween-20浓度分别用0.2％、0.3％)]洗涤，再用0.01M PBS(pH7.4)洗涤。
7)洗脱：吸去液体，用300ul 0.2M甘氨酸-盐酸(pH2.2)洗脱10分钟，加入20ul中和液[1M Tris-Cl(pH9.0)]混匀，暂时保存于4℃。
8)测滴度：取2ul、0.2ul(原液用2×YT培养基稀释10倍后取2ul)、0.02ul(原液用2×YT培养基稀释100倍后取2ul)洗脱液，与0.2ml对数中期(OD600＝0.5)的TG1混匀，室温孵育30分钟，均匀涂于2×YT-GA100[含2％葡萄糖，100ug/ml氨苄青霉素]平板上，37℃过夜培养，计数约50个克隆的平板上的克隆数，根据稀释倍数计算滴度。
9)噬菌体扩增：在淘选进行的同时，挑取mini agar平板上的TG1单克隆，接种于10ml 2×YT培养液中，37℃下，250rpm振荡培养至对数中期(OD600＝0.5)。加入200ul淘选获得的洗脱产物，37℃孵育30分钟。加入辅助噬菌体M13KO7，37℃再孵育30分钟，37℃下，250rpm振荡培养1小时。离心去上清，用20ml含工作浓度100ug/ml氨苄青霉素和工作浓度50ug/ml卡那霉素的2那霉素重悬，30℃，220rpm振荡培养过夜。
10)噬菌体沉淀：10000rpm离心15分钟去除菌体，上清中加入1/5体积的2.5MNaCl/20％PEG8000，冰浴2小时。10000rpm离心10分钟得到噬菌体沉淀，将残液去除干净，加入0.2ml 0.01M PBS(pH7.4)液重悬沉淀，如上文测滴度。
11)重复步骤2)-10)两或三次，获得结合力强的噬菌体展示抗体。
(2)单克隆ELISA
1)0.3ug/ml链霉亲和素4℃过夜包被酶标板，2％BSA/PBS封闭液处理2h，并用PBS洗涤3次。
2)从2×YT-GA100平板上挑取的单克隆菌落，振荡培养至对数中期，加入辅助噬菌体M13KO7，37℃孵育30分钟。37℃，220rpm振荡培养1小时，4000rpm离心15分钟。用400ul含工作浓度100ug/ml氨苄青霉素和工作浓度50ug/ml卡那霉素的2那霉素重悬，30℃，220rpm振荡培养过夜。4000rpm离心15分钟，沉淀菌体。
3)取50ul4％BSA/PBS加入到酶标板中，同时取50ul噬菌体上清，混匀，孵育1小时。
4)去除液体，0.1％PBST洗5次，PBS洗3次，去除液体。
5)将HRP标记抗M13噬菌体抗体(购自北京义翘神州)用2％BSA稀释3000倍，取100ul加入到酶标板中，孵育1小时，去除液体，0.1％PBST洗3次，拍干残液。
6)加入100ul TMB显色液，37℃孵育10min或至蓝色充分显现，加入100ul1M硫酸终止反应，在酶标仪上读取OD450，结果如图1所示，在噬菌体淘选过程中，用含有phage病毒颗粒的2毒颗T培养基50ul做检测，其原始数据如表1所示，其中数值为450nm处的吸光值及其比值。
表1：phage粗培液与人源CD70结合ELISA检测
Figure BDA0003783618590000081
Figure BDA0003783618590000091
(3)人源CD70单抗制备及流式检测
1)从2×YT-GA100平板上挑取的单克隆菌落，液体振荡培养过夜，按质粒提取法提取噬菌粒(phagemid)。
2)合成引物，PCR扩增噬菌体所展示的抗体基因编码区。
3)将以上核酸片段按序***到真核表达载体Abexp-uIgG1的MCS区(图3)，以编码N端为信号肽、中段为抗体、C端为Fc标签的融合蛋白。
4)制备无菌无内毒素的质粒。取23ug，用0.75mL的稀释液(如OPM-293CD05培养基)稀释，同时取70取)的转染试剂(如PEI溶液)加入到0.75mL的稀释液中(如OPM-293CD05培养基)轻柔混匀。将PEI稀释液加入质粒稀释液中，立即用枪轻柔混匀，室温静置15min，避免扰动。
5)加入到25ml 293F细胞及其培养液中，80rpm，37℃，5％CO2条件下培养24小时，再加入25mL新鲜生长培养基(如OPM-293CD05)，80rpm，37℃，5％CO2继续培养72小时。
6)10000rpm离心10分钟，取上清。与平衡后的proteinA亲和磁珠旋转孵育1小时，置于磁力架上，去除上清。
7)用30ml PBS洗杂3次，加入5ml 0.1M甘氨酸(pH 3.0)洗脱10分钟，置于磁力架上，吸取上清立即用1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)至中性，即获得纯化的抗体。
8)SDS-PAGE检测纯化抗体，同时进行浓度测定。采用还原电泳，抗体分子中的二硫键被打开，分子以伸展的单肽链状态进行电泳迁移，如图4所示。
对筛选所得纯化抗体测序，得到编号下表所示的编号1-16的抗体：
Figure BDA0003783618590000092
Figure BDA0003783618590000101
Figure BDA0003783618590000111
其中，编号1抗体的可变区全长氨基酸序列如SEQ ID NO：97所示，核酸序列如SEQID NO：98所示；编号2抗体的可变区全长氨基酸序列如SEQ ID NO：99所示，核酸序列如SEQID NO：100所示；编号3抗体的可变区全长氨基酸序列如SEQ ID NO：101所示，核酸序列如SEQ ID NO：102所示。
SEQ ID NO：97：
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSIYAMGWYRQAPGKQRELVAAITNSGGTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNAVLEQASGDPVVYRYLEVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：98：
CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAAGCATCTTCAGTATCTATGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCAGCTATTACTAATAGTGGTGGCACAAACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTAATGCAGTTCTTGAACAGGCTAGCGGCGACCCCGTGGTTTACAGGTATCTCGAAGTTTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA
SEQ ID NO：99：
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIASIYHMAWYRQASGKQRELVALIISDGKINYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNAQNWATRDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：100：
CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAAGCATCGCCAGTATCTATCACATGGCCTGGTACCGCCAGGCTTCAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCACTCATTATTAGTGATGGTAAGATAAACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTAATGCCCAGAATTGGGCCACAAGAGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO：101：
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSIYAMGWYRQAPGKQRELVALITNSGGTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPVDTAVYYCNAVEEEVVAGTDRYRYLEVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：102：
CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAAGCATCTTCAGTATCTATGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCACTTATTACTAATAGTGGTGGCACAAACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCAGTGGACACGGCCGTCTATTACTGTAATGCGGTTGAGGAGGAGGTAGTAGCTGGTACTGACCGCTACAGGTATCTCGAAGTTTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA
9)流式细胞术检测纯化抗体的细胞结合能力
①将表达CD70的细胞株(如786-0)用0.25％的胰酶充分消化，血清终止消化，离心收集细胞，PBS轻轻吹打制备单细胞悬液。
②10ml PBS洗涤细胞1次，1000rpm离心5min,再用1ml PBS悬浮细胞，细胞计数。
③取2.5×105个细胞于96孔细胞培养板中，离心收集细胞。
④加入100μl步骤(2)2)中的phage上清或100ul 10ug/ml步骤(3)9)中的纯化抗体，混匀，室温孵育30分钟至1小时。
⑤离心收集细胞，用300ul PBS洗涤细胞1次。
⑥若为phage检测，加入100ul用PBS稀释1000倍的抗M13噬菌体抗体(购自北京义翘神州)，孵育30min，PBS洗一次，加入100ul用PBS稀释100倍的荧光标记(如FITC、APC)抗体，室温下避光反应20min；若为纯化抗体检测，加入100μl用PBS稀释200倍的荧光标记(如FITC、APC)抗体，室温下避光反应20min。
⑦用1ml PBS洗涤细胞1次，1000rpm离心8min，去除上清液。
⑧加入100μl PBS重悬成单细胞悬液，用流式细胞仪上机检测，phage流式如图2所示，图中左侧、右侧柱形图分别代表与野生型CHO-K1、CD70超表达CHO-K1细胞株结合信号，其原始数据如表2，其中数值为荧光强度中值(MFI)及其比值。纯化抗体流式如图5所示，其中ARGX-110为阳性对照，hIgG1为阴性对照，其原始数据如表3，其中数值为荧光强度中值(MFI)。
表2：phage粗培液与人源CD70结合FACS检测结果
Figure BDA0003783618590000131
Figure BDA0003783618590000141
表3：纯化抗体与细胞表面CD70结合性能检测
浓度ug/ml hIgG1 ARGX-110 1 2 3 4 5 6 7
5 89.0 12418.8 8609.0 11987.1 13689.4 3432.6 9041 10485.9 10746.8
1.25 64.9 12599.1 9067.2 13122.4 14076.3 2999.1 11379.5 11309.3 9939.8
0.3125 53.4 10454.3 7496.8 13127.1 11707.1 1580.4 10484.4 11518.5 6865.7
0.0781 140.8 7363.1 4512.0 10307.0 10255.8 686.3 7695.9 9669.2 3319.6
0.0195 112.4 3930.7 3641.6 6087.3 4576.2 149.1 3786 5428 1109.3
0.0049 100.1 1132.5 697.9 4267.7 2820.6 76.1 957.6 875.3 383.9
0.0012 119.1 622.5 629.7 1486.6 465.3 66.3 393.3 250.7 144.3
0.0003 96.4 283.5 1263.6 485.2 173.1 343.6 197.4 272 116.5
浓度ug/ml 8 9 10 11 12 13 14 15 16
5 17027.1 5318.8 18997.2 18658.2 16308.4 7303.1 9995.4 11034.7 8213.7
1.25 19287.1 6009.8 18780.9 18599.9 16708.3 7267.5 9000.9 10878.6 8076.9
0.3125 19126.1 6170.7 16032.5 16648.0 17391.7 5319.8 8216.2 9521.7 7723.0
0.0781 8412.4 3523.3 9042.7 6333.4 17250.2 4247.4 2866.7 3027.9 6113.4
0.0195 2577.6 1156 2964 1942.3 12055.9 1298.6 1653.0 1237.6 3240.5
0.0049 875.1 306.5 937.5 604.2 4218.5 942.7 1800.8 937.1 1091.9
0.0012 309.2 96.3 347.2 231.5 1590.8 498.2 1216.1 336.8 352.4
0.0003 137.7 44.8 140.2 110.6 848.1 267.4 399.2 272.7 255.7
(4)抗体内化功能检测
1)0.25％Typsin-EDTA消化786-0细胞，离心弃上清，用完全培养基重悬。
2)将75ul细胞悬液加至96孔板中，并使得每孔有1.5，并使5个细胞。
3)按抗体EC80的工作浓度(即饱和浓度的80％)加入25ul，混匀。每个抗体分两板，每板各做一孔。4℃、孵育1小时。
4)加入PBS至终体积250ul，500g常温离心5min，甩去上清保留细胞沉淀，用吸水纸吸净残液，轻拍实验板使细胞分散，PBS再洗一次，分散细胞。此步去掉多余未结合的抗体。
5)用100ul基础培养基重悬细胞，其中一板于37℃孵育2小时，另一板于4℃孵育2小时。37℃孵育过程中抗体会转入细胞，而4℃则抑制了内化。
6)加入100ul用PBS稀释的荧光二抗(加入前二抗浓度为工作浓度的2倍)，4℃孵育0.5小时。
7)500g常温离心5min，甩去上清保留细胞沉淀，用吸水纸吸净残液，轻拍实验板使细胞分散，PBS再洗一次，分散细胞。
8)加入100ul PBS重悬，流式细胞仪上机检测，Graphpad Prism处理数据。如图6所示，抗体与细胞结合后，通过荧光二抗检测结合于细胞表面的待测抗体，图6原始数据如表4，其中数值为荧光强度中值(MFI)。图7是将检测样品即本文中的seq No.ID于37℃测得的MFI除以4℃测得的MFI定义为数值A，将ARGX-110于37℃测得的MFI除以4℃测得的MFI定义为数值B，则A/B值即为相对内化。
表4：纯化抗体内化性能检测
样品/seq No.ID 37℃ 4℃ 样品/seq No.ID 37℃ 4℃
ARGX-110 6335.0 7365.6 9 1296.7 3418.8
1 1149.3 2160.8 10 6910.7 13886.0
2 1003.9 7450.1 11 8750.5 13581.0
3 1561.3 3420.7 12 6870.6 9654.2
4 370.3 774.1 13 3774.3 5686.8
5 716.8 2580.4 14 3595.1 4961.0
6 1884.7 3071.9 15 2505.8 3528.0
7 1492.8 2544.3 16 4025.4 6003.4
8 6032.4 13007.9  
(5)抗体内化介导毒素对细胞的杀伤效能检测
1)0.25％Typsin-EDTA消化786-0细胞，离心弃上清，用完全培养基重悬。
2)将90ul细胞悬液加至96孔板中，并使得每孔有2500个细胞。
3)将抗体稀释至10倍的EC50值，向其中加入浓度为45nM的FabFc-ZAP human试剂(其工作浓度为4.5nM；购自Advanced Targeting Systems)，取该混合液10ul，加入到步骤2)中的细胞中，混匀。
4)37℃，5％CO2培养箱培养72小时。
5)将CCK8试剂盒室温平衡15min。取出96孔细胞培养板，加入CCK8试剂，于37℃培养箱避光孵育1至3小时，酶标仪读取OD450值。如图8所示，抗体、毒素和细胞共孵育后，CCK8法测得的细胞活性低于仅抗体和细胞共孵育相比。其原始数据如表5所示，其中数值为450nm的吸光值(A450)。将抗体(ARGX-110或Seq No.ID所指抗体)与毒素同时处理细胞后测得的450nm吸光值除以仅用抗体(ARGX-110或Seq No.ID所指抗体)处理细胞后测得的450nm吸光值定义为数值A，将毒素处理细胞后测得的450nm吸光值除以未处理的细胞测得的450nm吸光值定义为数值B，则A/B值即为相对杀伤。如图9所示。
表5：纯化抗体内化介导毒素对细胞的杀伤效能检测
Seq No.ID 抗体+毒素 抗体 Seq No.ID 抗体+毒素 抗体
ARGX-110 2.3615 2.8350 9 1.0498 2.2105
1 1.0227 2.1778 10 1.1626 3.1110
2 0.8658 2.2844 11 1.0138 3.0691
3 0.7365 2.2092 12 1.2944 2.9997
4 1.0377 2.2920 13 1.7668 2.5112
5 0.6969 2.2609 14 1.0145 2.1882
6 0.8546 2.3082 15 1.8259 2.5652
7 0.9212 2.8220 16 1.5359 2.5258
8 0.9660 2.3672 - - -
毒素+细胞 2.1185 - 细胞 2.4601 -

Claims (7)

1.一组抗CD70内化的抗体，其特征在于，其重链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQ IDNO：3，CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO：19，CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：35。
2.编码权利要求1所述抗CD70内化的抗体的DNA分子，其特征在于，其重链可变区SEQID NO：3、19、35所述氨基酸对应的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：51、67、83所示。
3.权利要求1所述抗CD70内化的抗体用于制备检测CD70分子的诊断试剂中的应用。
4.权利要求1所述抗CD70内化的抗体在制备***的药物中的应用。
5.一种抗体偶联物，其特征在于，包括权利要求1所述的抗CD70内化的抗体。
6.权利要求5所述抗体偶联物在制备***的药物中的应用。
7.根据权利要求4或6所述应用，其特征在于，所述肿瘤为肾透明细胞腺癌。
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