KR20080051191A - 단리된 동종접합 간세포, 그로부터 유래된 분화 세포 및이들을 제조 및 사용하기 위한 물질 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다능성 동종접합 간(HS) 세포, 및 이를 제조하기 위한 방법 및 재료를 개시하고 기술한다. 또한, 본 발명은 HS 세포의 선조(다능성) 세포 또는 또 다른 목적하는 세포, 당해 세포들의 군 또는 조직으로의 분화 방법을 제공한다. 또한, 본원에 개시된 HS 세포의 용도는 (비제한적으로) 각종 질환(예를 들어, 유전자 질환, 신경퇴행성 질환, 내분비-관련된 장애 및 암), 외상성 손상의 진단 및 치료, 미용적 또는 치료적 이식, 유전자 치료 및 세포 대체 요법을 포함한다.
다능성 동종접합 간세포, 선조 세포, 분화, 상피 세포

Description

단리된 동종접합 간세포, 그로부터 유래된 분화 세포 및 이들을 제조 및 사용하기 위한 물질 및 방법 {Isolated Homozygous Stem Cells Differentiated Cells Derived Therefrom and Materials and Methods for Making and Using Same}
본 발명은 다능성 동종접합 간(HS) 세포, 및 그의 제조 방법 및 제조를 위한 물질을 개시한다. 또한, 본 발명은 HS 세포를 선조 세포 또는 다른 목적하는 세포로 분화하는 방법을 제공한다. 또한, 본원에 개시된 HS 세포는 각종 질병, 예를 들어 유전적 질병, 신경변성 질병, 내분비 관련 질환 및 암, 외상성 상처의 진단 및 치료, 미용적 및 치료적 이식술, 및 유전 치료법 및 세포 대체 치료법에 사용될 수 있다.
1981에, 에반스(Evans) 및 카우프만(Kaufman)은 마우스 포배로부터 배아 간(ES) 세포를 단리하는 기술을 기술하였다 ("Establishment in Culture of Pluripotent Cells from Mouse Embryos," Nature 292:154-6 (1981)). 이 과정에서 내부 세포 덩어리 (ICM)를 사용하여 분화되지 않고 다능성으로 남아있는 세포주를 증가시켰다, 즉 세포는 임의 세포형으로 발달하는 능력을 보유하였다. ES 세포주는 후속해서 닭 (Pain et al, Development 122:2339-48 (1996)), 햄스터 (Doetschmann et al., Dev. Biol. 127:224-7 (1988), 돼지 (Wheeler et al., Reprod. Fertil. Dev. 6:563-8 (1994)), 명주원숭이(marmoset) (Thompson et al., Biol, Reprod. 55:254-9 (1996)), 및 붉은털원숭이 (Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844-8 (1995))를 포함한 다른 동물 모델에서 생산되었다.
사이또(Saito) 등 (Roux's Arch. Dev. Biol., 201:134-141 (1992))은 3 계대까지 생존하나 4 계대후 손실된 소 배아 간세포 유사 세포주를 보고하였다. 또한, 핸디사이드 (Handyside) 등 (Roux's Arch. Dev. Biol.,196:185-190 (1987))은 마우스 내부 세포 덩어리 (ICM)로부터 유래된 마우스 ES 세포주를 단리시키는 조건하에서 양 배아의 면역외과적으로 단리된 내부 세포 덩어리를 배양하는 것을 개시하였다. 또한, 이러한 조건하에서 양 ICM이 ES 세포 유사 세포 및 내배엽 유사 세포의 영역을 부착, 확산 및 전개시키나, 배양이 연장된 후 내배엽 유사 세포만이 나타난 것으로 보고되었다.
ES 세포는 생체내 마우스 포배에 주입될 때 수용자 배아의 ICM 중으로 혼입되고, 생식 세포주를 포함한 많은 상이한 조직 유형에 기여한다 (Stewart et al., "Stem Cells from Primordial Germ Cells Can Reenter the Germ Line," Dev. Biol. 161:626-8 (1984)). 또한 문헌 (Bradley et al., Nature 309:255-256 (1984)) 참조하라.
최근, 체니(Cherny) 등 (Theriogenology, 41:175 (1994))은 장기간 배양으로 유지된, 다능성 소의 원시 생식 세포 유래된 세포주를 보고하였다. 배양 대략 7일 후, 이러한 세포는 알칼린 포스파타제(AP)에 대해 양성으로 염색되고, 배아 유사 개체를 형성하는 능력을 나타내며 적어도 2개의 상이한 세포 유형으로 자발적으로 분화되는 ES 유사 콜로니를 생산하였다. 또한, 이들 세포는 복사 인자 OCT4, OCT6 및 HES1에 대해 mRNA를 발현하는 것으로 보고되었다.
캠벨(Campbell) 등 (Theriogenology, 43:181 (1995)) (요약서)는, 마우스에서 ES 세포주의 단리를 촉진하는 조건하에서 배양된, 9일째 양의 배아로부터 배양 배아 원반 (ED) 세포의 핵 전달에 따른 생존 양의 생산을 보고하였다. 이들 결과를 기초로 하여, 저자들은 9일째 양의 배아로부터의 ED 세포는 핵 전달에 의해 분화전능성이 되고, 분화전능성은 3 계대까지 동안 배양에서 유지된다고 결론지었다. 캠벨(Campbell) 등 (Nature, 380:64-68 (1996))은 또한 배양 세포주로부터 핵 전달에 의한 양의 클로닝을 보고하였다.
반 스테켈렌버그-해머스(Van Stekelenburg-Hamers) 등 (Mol. Reprod. Dev., 40:444-454 (1995))은 소 포배의 ICM 세포로부터 영구 세포주의 단리 및 특성을 보고하였다. 저자들은 공급자 세포 및 배양 매질이 소 ICM 세포의 부착 및 성장을 지지하는데 가장 효율적인지를 결정하기 위해 상이한 조건하에 8 또는 9일째 소 포배로부터 ICM을 단리하고 배양하였다. 이들은, 이 결과를 기초로 하여, 배양된 ICM 세포의 부착 및 성장이 STO (마우스 섬유아세포) 공급자 세포 (소 자궁 상피 세포 대신)의 사용, 및 배양 매질을 보충하기 위한 차콜 제거 혈청 (정상 혈청보다)의 사용에 의해 증가된다고 결론지었다. 그러나, 반 스테켈렌버그 등은 이들 세포주가 다능성 ICM 세포보다 더 상피 세포를 닮은 것으로 보고하였다(id.).
스미스(Smith) 등 (WO94/24274, 1994. 10. 27. 공개), 에반스(Evans) 등 (WO90/03432, 1990. 4. 5. 공개) 및 휠러(Wheeler) 등 (WO94/26889, 1994. 11. 24. 공개)은 유전자도입 동물을 얻기 위해 사용될 수 있는 것으로 알려진 동물의 간세포의 단리, 선별 및 전파를 보고하였다. 또한, 에반스 등 (WO90/03432, 1990. 4. 5. 공개)은 유전자도입 동물의 생산을 위한 돼지 및 소과 종으로부터 유래된 다능성으로 알려진 배아 간세포의 유래를 보고하였다. 또한, 휠러 등 (WO94/26889, 1994. 11. 24, 공개)은 키메릭 및 유전자도입 유제동물의 생산을 위한 배아 간세포를 개시하였다.
핵 이식을 위한 유제동물의 ICM 세포의 사용도 보고되었다. 예를 들어, 콜라스(Collas) 등 (Mol. Reprod. Dev., 38:264-267 (1994))은 용균시킨 공여 세포를 적출된 성숙 난모세포 중으로 미세주입에 의한 소 ICM의 핵 이식 기술을 개시하였다. 이 문헌은, 소의 수용자로 이동시 4번의 임신 및 2번의 출산을 야기하는 15개 포배를 생산하기 위한 7일 동안의 시험관내 배아의 배양을 개시하였다. 또한 키퍼(Keefer) 등 (Biol. Reprod., 50:935-939 (1994))은, 소 수용자로 이식시 7마리의 생존 자손을 낳는, 포배를 생산하기 위한 핵 전달 과정에서 공여 핵으로서의 소 ICM 세포의 사용을 개시하였다. 또한, 심스(Sims) 등 (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:6143-6147 (1993))은 단기간 시험관내 배양된 소 ICM 세포를 적출된 성숙 난모세포 중으로 전달시켜 송아지를 생산하는 것을 개시하였다.
단기간 배양된 배아 원반 세포 (3 계대까지)의 핵 전달에 따른 생존 양의 생산은 보고되었다 (Campbell 등, Theriogenology, 43:181 (1995)). 또한, 핵 전달에서 소의 다능성 배아 세포의 사용 및 키메릭 태아의 생산도 보고되었다 (Stice 등, Theriogenology, 41:301 (1994)).
보다 최근에, 시벨리(Cibelli) 등 (WO01/29206, 2001. 4. 26 공개, 어드밴스드 셀 테크놀로지(Advanced Cell Technology) (ACT)에게 양도)은 동종, 동종이형 및(또는) 이종개체 이식을 위한 세포 및 기관을 발생하기 위한 포배의 내부 세포 덩어리로부터 단리된, 사람을 비롯한 포유동물의 ES 세포를 분화하는 방법을 개시하였다. 그러나, 개시된 간세포는 본원 발명과 달리 수정된 배로부터 생성되었다. 더욱이, ACT의 연구자들에 의한 수정되지 않은 배로부터 간세포를 생성하기 위한 노력은 성공되지 못하였다 (Washington Post, "First Human Embryos Are Cloned in US," 2001. 11. 26 참조).
상술한 기재로부터, 많은 그룹들이 ES 세포주를 생산하기 위해 시도하였음을 알 수 있다. ES 세포가 주목받는 것은 주로 ES 세포가 다능성이고, 따라서 성숙된, 분화된, 작용성 세포를 증가시킬 수 있기 때문이다. 그러나, ES 세포의 유망한 치료적 및 예방적 응용에도 불구하고, ES 세포의 사용은 다양한 윤리적 중요성을 일으키고 있다. 상기 문단에서 기술한 바와 같이, ES 세포는 난모세포의 수정시 발달하는 포배로부터 유래된다. 따라서, ES 세포는, 확실히 희생될 것인 잠재적으로 생존가능한 배아로부터 고유적으로 유래되거나 수확된다.
더욱이, ES 세포의 사용 또는 발달과 관련된 기술적 문제들이 있다. 예를 들어, 다른 개체들, 예를 들면 현존하는 세포주로부터 유래되는 ES 세포는 양립불가능한 수용자로 이식될 때 면역반응을 일으킬 수 있고, 핵 공여자의 수명 동안 획득된 유전적 돌연변이는 다능성 세포주로 전달되기 때문에 개체 핵 전달로부터 유 래된 ES 세포주는 치료 용도로는 덜 이상적일 수 있다.
그러나, ES 세포를 포함한 다능성 세포는 유전적 질병, 신경변성 질병 및 암과 같은 질병을 손상된 신경에 대한 기능을 복구하거나 회복시킴으로써 또는 대체 조직 또는 기관의 공급원을 공급함으로써 치료적으로 치료하는데 사용될 수 있기 때문에, ES 세포를 포함한 다능성 세포는 매우 유용하다. 또한, 다능성 세포는 배아 키메라를 증가시키거나 다음 세대로 이들의 게놈을 전달시키는 능력 때문에, 이들은 발달 생물학의 연구에서, 그리고 이식 치료법을 위해 사용될 수 있다.
따라서, 선행기술에서는 다능성 세포의 다른 공급원의 개발이 필요하였다. 본 발명은 이러한 하나의 공급원을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본 발명은 단리된 동종접합 간(HS) 세포를 제공하는데, 이들은 (a) 2개의 난모세포 또는 2개의 정자세포를 융합하거나, (b) 난자형성 동안 제2 극체의 방출을 방지하거나, (c) 적절한 조건하에서 제2 극체의 방출 및 자발적인 게놈 자기 복제를 허용하거나, (d) 2개의 일배체 난자 또는 정액 핵을 적출된 난모세포에 전달함으로써 생성되는 포배 유사 덩어리로부터 단리된다. 추가로, 동종접합된 간세포 스크리닝은 방법 (a) 또는 (d)가 사용되는 경우 유전자형을 사용하여 수행된다.
본 발명의 HS 세포는 다능성이고, 이들은 수정되지 않고 생존 배아로 발달될 수 없는 세포 덩어리로부터 단리되기 때문에 윤리적 중요성을 일으키지 않는다. 더욱이, 면역조직상용성 매칭은 동종접합 ES 세포주가 조직 또는 세포 이식 치료법 에서 이용되거나, 은행 및(또는) 수탁소에 보관되는 경우 달성되기 어렵다. 이것은, 어드밴스드 셀 테크놀로지(ACT) 및 다른 기관에 의해 개발된 것을 포함한 ES 세포주가 수정된 배아 또는 성인 분화된 세포를 사용한 핵 전달 기술로부터 유래되고, 유전적으로 이형접합되기 때문이다. 본 발명의 다능성 간세포는 동종접합 (최소한의 이형접합 또는 균일 동종접합)되기 때문에, 이러한 세포는 현재 이용가능한 이식술, 세포 대체, 및 ES 세포주를 사용한 유전 치료 기술이 직면하거나, ES 세포주를 은행 및(또는) 기탁소에서 유지하는데 직면하는 면역조직상용성 문제를 극복하는데 사용될 수 있다.
배우자형성 동안, 이형접합 배세포, 즉 부와 모 염색체 둘다를 갖는 생식 세포는 감수분열을 행한다. 제1 감수분열적 분할 (감수분열 I)에서 동종 염색체는 분리되어, 교차 현상으로 인해 도입되는 약간의 이형접합을 갖는 부 염색체 또는 모 염색체를 함유하는 2개의 동종접합 딸세포를 형성한다. 또한, 난모형성 동안, 하나의 딸세포 (주요 극체)의 방출이 관찰된다. 다른 딸세포는 중기 II에서 정지된다. 이러한 중기 II 이배체 난모세포는 최소한의 이형접합성을 갖는 동종접합 간세포를 유도하는데 사용될 수 있다.
적절한 활성화시, 중기 II 난모세포는 염색분체 중 하나 (즉, 제2 극체)의 방출에 의해 감수분열을 완성하도록 진행되어 일배체 세포가 된다. 이러한 중기 완성된 일배체 난모세포는 세포질분열 없이 자가 복제하여 이것을 이배체로 만들고 단일 동종접합하도록 만든다. 따라서, 이러한 중기 완성된 일배체 난모세포도 이형접합 없는 본 발명의 동종접합 간세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 문헌 (Kaufman M.H. Robertson E.J., Handyside A.H., Evans M.J., "Establishment of pluripotential cell lines from haploid mouse embryos," J. Embryol. Exp. Morphol., 73:249-61 (1983)) 참조하라.
최소 이형접합성과 균일 동종접합성을 가진 HS 세포 2종 모두는, 동종접합 간세포가 2세트의 동일한 주조직적합 복합체(MHC) 일배체를 포함할 수 있기 때문에 이형접합 ES 세포(예를 들어, 수정된 배아기의 배아, 치료 클로닝 배아, 및 성인 간세포로부터 유도된 것)를 갖는 간세포에 비해서 우수한다. 따라서, HS 세포에 의해, 제공자와 이식 치료가 필요한 개체간의 면역조직적합성 매칭(matching)이 보다 쉽게 이루어진다. 이같은 하나의 MHC 일배체에 대한 동종접합 간세포는 동일한 일배체를 갖는 수용자뿐 아니라, 모 일배체 중 어느 하나와 동일한 MHC 성분을 갖는 수용자에게도 허용된다.
더욱이, 사람 MHC 유전자 좌는 염색체 6 상의 4 Mb 이내에 위치하고, MHC 대립 유전자는 일반적으로 일괄적으로 유전된다. 일부 MHC 대립 유전자 조합은 개체군 중에서 상당히 높은 빈도로 공유된다. 예를 들어, 15개의 가장 일반적인 HLA-A, -B, -DR 일배체는 21.3%의 카프카스 인종 미국인에 의해 공유되고, 일배체 빈도에 대한 유사한 관찰이 다른 인종에 대한 배경 정보가 되는 모리(Mori, M) 등의 문헌 ["HLA gene and haplotype frequencies in the North American population: the National Marrow Donor Program Donor Registry," Transplantation, 64(7): 1017-27(1997)]에서 관찰된다. 이와 같은 결합 불균형을 지지하는 증거를 고려하면, 수정되지 않은 제1 감수분열후의 이배체 생식체에서 유도된 HS 세포를 사용하는 것은 조직 또는 세포 이식을 위해 간세포 뱅크(bank) 또는 보관소에서 유지될 필요가 있는 면역학적으로 상이한 세포주의 수를 감소시킬 수 있다.
따라서, 가능하게는, 상이한 일배체에 대해 동종접합성인 몇백개의 간세포주는 개체군의 대부분과 충분히 매칭될 수 있을 것이다. 이 수는 배아 간세포, 성인 간세포, 또는 치료 클로닝 간세포로부터 유도된 간세포주를 위한 뱅크 또는 보관소을 유지하기에 필요한 일배체의 수에 비해서 굉장히 작은 것이다. 예를 들어, 매 200개의 일배체에 대해서, 20,000회 이상의 이형접합 가능성이 있다.
따라서, 본 발명은 일 실시 양태에서 유전성 질병, 예를 들어 혈유병, 당뇨병, 헌팅톤병 등을 치료하기 위해, 수용자와 관련된 여성 제공자로부터의 수정되지 않은 난모세포로부터 유도될 수 있는 MHC 유전자 좌 및 와일드형(정상) 유전자에 대해 동종접합 간세포를 제공한다. 본 발명의 HS 세포주 내에서 비정상 (발병) 대립유전자를 제외시킴으로써 얻어지는 이점은 현재 입수할 수 있는 ES 세포주에 의해서 현 시점에서는 얻을 수 없다.
기형종은 3개의 배 층 중 임의의 것으로부터의 정상 유도체를 암시하는 각종의 조직 성분으로 구성된다. 천연 기형종은 3개의 배 층-외배엽, 중배엽 및 내배엽 중 어느 하나를 대표하는 성분으로 분화되는 능력을 갖는 이배체 분화전능성 세포, 전형적으로 수정되지 않은 생식 세포로부터 유도된다. 기형종의 기원에 대한 과학적 이론은 고립된 분화전능성 난할구 또는 초생의 생식 세포의 불완전 트위닝(twinning), 종양 증식, 체 세포의 핵 내의 분화전능성 제네릭 정보의 활성, 및 생식 세포의 단성생식 발현을 포함한다.
천연의 자발 기형종은 이배체이고, 종종 다배체이다(Surti et al., Am. J. Hum. Gene. 47: 635-643 (1990)). 이배체 기형종 조직은 분열 I에 대해 2차적으로 일어나거나, 난자에 의한 제2 극체의 융합에 의해 일어나는 것으로 여겨진다(문헌[Eppig and Eicher, Genetics, 103:797-812(1983); Eppig and Eicher, J. Hered., 79:425-429(1988)] 참조). 또한, 기형종은 이형접합 숙주에서 유전학적으로 동종접합하는 것으로 입증되었다(문헌 [Linder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63:699-704(1969); Linder and Power, Ann. Hum. Genet. 34:21-30, (1970)], [Linder et al, Nature, 254:597-598(1975)], [Kaiser-McCaw et al., Cytogenet. Cell. Genet., 16:391-395(1975)]). 그러나, 후속적인 연구는 이같은 결과에 일치되게 재현하는데 실패하였다(문헌 [Surti et al, Am. J. Hum. Gene., 47:636-643(1990); Carritt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 7400-7404 (1982); Parrington et al., J. Med. Genet., 21:1-12(1984)], [Deka et al., Am. J. Hum. Genet., 47:644-655(1990)], [Dahl et al, Cancer Genet. Cytogenet., 46:115-123(1990)] 참조).
다른 종양과 달리, 기형종은 독특한 조직 형태를 나타낸다. 이들은 표피, 중추신경계 조직, 또는 성숙 연골과 같은 조직을 포함하여 다양한 분화 조직으로 구성된다. 이들은 또한 비특이적 조직형, 예를 들어 임파 조직 또는 섬유 기질을 함유한다. "스템플라즘(stemplasm)"이란 HS 세포가 숙주로 이식될 때 발현되는 덩어리를 기술하는데 사용되는 신조어이다. 기형종과 달리, 스템플라즘은 3개의 모든 배아 배층으로부터의 세포를 여전히 함유하면서 조절된 성장을 보여준다. 따라 서, 본 발명의 HS 세포를 생체내 분화시키는 수단으로서 사용될 수 있다.
당업계에서는 직접 분화할 수 있는 간세포의 확실한 근원에 대한 분명한 필요성이 있다. 본 발명은 수정 절차의 필요성없이 동형 접합 간세포를 제공함으로써 이같은 필요를 달성하였다. 본 발명은 수정되지 않은 제1 감수분열후의 이배체 간세포로부터 유도된 동종접합 간(HS) 세포를 개시한다. 시험관내 수정 분야에서 널리 사용되는 기술을 사용하여 각 제공자로부터 얻을 수 있는 제공자 세포가 포배-유사 덩어리를 형성시킬 수 있고, 이 덩어리로부터 본 발명의 HS 세포가 유도되고, 이런 HS 세포는 임의 세포형, 세포군 또는 조직형으로 분화될 수 있다. 또한, 이어서 HS-유도된 분화 세포 및(또는) 조직이 진단 및 치료, 특히 세포 대체 요법 및 유전자 치료 및 화장 및(또는) 치료 이식에 사용될 수 있다. 더욱이, 이같은 사용은 모든 것이 아니라 대표적인 것이다.
III. 본 발명의 요약
본 발명은 단리된 동종접합 간세포(HS)의 제조 및 이런 세포가 지시되고 예정된 방법으로 분화될 수 있는 독특한 특성을 갖는다는 발견에 관한 것이다. 이런 식으로, HS 세포는 ES 세포와 유사하지만, 수정 절차 또는 배아 조직의 채취를 필요로 하지 않는다.
본 발명의 목적은 세포 치료를 위한 그리고 세포, 세포 군, 조직 및 이식용 기관의 발생을 위한 세포원으로서 사용될 수 있는 단리된 동종접합 간세포를 제조하는 신규하고 개선된 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 단리된 동종접합 간(HS) 세포를 제공하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 포유류, 조류, 어류, 양서류 및 파충류의 동물을 포함하는 동물 제공체로부터 유도된 HS 세포를 제공하는 것이다. 바람직한 실시 양태에서, 동물은 포유류이고, 보다 바람직하게는 사람이다. HS 세포는 제공자로부터 회수된 제1 감수분열 후의 수정되지 않은 이배체 생식 세포로부터 유도되고, 여기서 제공자 세포는 현행 및 미래의 시험관내 수정 기술을 사용하여 채취될 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 2개의 난모세포 또는 2개의 정자세포를 융합하고, (b) 난자형성중 제2 극체의 방출을 막고, (c) 적합한 조건에서 제2 극체의 방출과 자발적 게놈 자가 복제를 허용하고, (d) 2개의 일배체 난 또는 정액 핵을 핵이 제거된 난모세포로 옮기는 단계에 의해 유사분열에 의해 생성된 포배-유사 덩어리로부터 유도된 동종접합 간세포(HS)를 제공하는 것이다. 또한, 방법 (a) 또는 (d)를 사용할 때 유전형 분석을 사용하여 동종접합된 간세포를 체별한다.
또한, 본 발명의 목적은 수정되지 않은 제1 감수분열후의 이배체 생식 세포로부터 동종접합 간세포를 유도해내는 방법을 제공하는 것이다. 바람직하게는, 난자형성중 난모세포로부터 제2 극체의 방출을 막거나, HS 세포가 추출되는 포배-유사 덩어리를 만드는 이와 같은 일배체 난모세포의 적절 조건하에서 제2 극체의 방출과 자발적 게놈 자가 복재를 허용하는 방법에 의해 HS 세포가 유도된다.
HS 세포는, 살아있는 동물로 이식될 때 수정되지 않은 제1 감수분열후의 이배체 생식 세포형 스템플라즘의 활성화 시에 생성된다. 또다른 목적은 상기 스템플라즘 내의 다양한 발현 단계로부터 HS 세포를 단리시키는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 스템플라즘으로부터 단리될 세포를 선정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 목적하는 세포, 세포군, 또는 조직형에 도달하도록 적합한 조건하에서 상기한 단리 HS 세포를 분화시키는 것을 포함하는 목적하는 세포, 세포군, 또는 조직형의 제조 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 HS 세포로부터 유도된 분화 세포 및 치료 및(또는) 진단을 위한 이런 분화 세포의 용도를 제공하는 것이다. 조직의 예로는 상피, 연결 조직, 근육 조직 또는 신경 조직을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상피 세포의 예시적인 형태로는 각질화 상피 세포, 습윤 층상 배리어 상피; 라이닝 상피 세포; 외분비-분비 상피 세포; 내분비-분비 상피 세포; 세포외 매트릭스 분비 상피 세포; 장, 외분비선 및 비뇨생식관의 세포와 같은 흡수 상피 세포; 및 수축성 상피 세포를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 연결 조직 세포의 예시적인 형태로는 세포외 매트릭스 분비 세포; 신진대사 및 저장을 위해 특화된 세포; 및 혈액 및 면액계의 순환 세포를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 근육 세포의 예시적인 형태는 추진 작용이 있는 수축성 세포 및 섬모충 세포를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 신경 또는 감각 세포의 예시적인 형태로는 a) 감각 변환기; b) 자율 뉴런; c) 감각 기관의 지지 세포; 및 d) 말초 뉴런; 및 중추신경계의 뉴런 및 신경교 세포를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 생식 세포의 예시적인 형태로는 생식 세포 및 영양 세포를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 보다 구체적인 목적은 HS 세포 유래의 유발 세포를, 진단, 예컨대 세포 치료, 유전자 치료와 같은 치료, 및 세포의 생성, 세포 덩어리, 조직 및 이식용 장기용 세포원으로도 사용할 수 있는 다능성 선조 세포로 분화시키기 위한 신규한 방법을 제공하는 것이다. 이러한 용도는 구체적이기보다는 예시적인 것이다.
본 발명의 목적은 진단, 예컨대 세포 치료, 유전자 치료와 같은 치료, 및 세포의 생성, 세포 덩어리, 조직 및 이식용 장기용 세포원으로도 사용할 수 있는, 유전자적으로 조작된 HS 세포 유래의 선조 세포를 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 이러한 용도는 구체적이기보다는 예시적인 것이다. 한 실시 양태에서, 목적하는 유전자는 선조 세포로 더 분화되도록 하는 HS 세포 내에 삽입, 제거 또는 변형될 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 선조 세포 자체는 유전자적으로 변경된 후 배양되어 유전자적으로 변경된 선조 세포의 집락을 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 HS 세포 유래의 선조 세포, 바람직하게는 인간 선조 세포를 제공하는 것이다. 한 실시 양태에서, 이러한 선조 세포는 세포, 세포군, 조직 및(또는) 기관으로 분화되도록 유도된다. 또한, 본 발명의 목적은 이러한 선조 세포를 치료 및(또는) 진단용 분화된 세포 및(또는) 조직으로 배양하는데 사용하는 것이다.
본 발명의 구체적인 목적은 세포, 조직 또는 기관 이식, 유전자 치료 및(또는) 세포 치료가 치료적으로 또는 진단적으로 이로운 임의의 질환의 치료 또는 진단을 위한 선조 세포, 바람직하게는 인간의 선조 세포를 제공하는 것이다. 본 발명의 HS 세포, 선조 세포 및(또는) 분화된 세포는 동종 또는 이종 범위 내에서 사용 될 수 있다.
본 발명의 HS 및 선조 세포, 및 분화된 HS 및 선조 세포는 동일한, 관련되거나 관련되지 않은 포유동물, 바람직하게는 인간의 난자 또는 정자를 이용하여 생성할 수 있다.
본 발명의 다른 구체적인 목적은 본 발명에 따라 제조된 분화 세포를 생체외 또는 생체내에서 세포 분화 및 분석 목적의 연구, 예를 들어 의약 연구에 사용하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유전자 조작된 HS 세포, 또는 단리된 HS 세포로부터 생성된 세포, 조직 또는 기관의 군을 사용하여 질병 상태를 연구 또는 진단하는데 사용하기 위한 질병 상태의 모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 그 자리에서 또는 생체 외에서, 단리된 HS 세포로부터 적합한 대체 세포, 세포군, 조직 또는 기관을 생성함으로써 장애 또는 질병 상태를 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 장애 및 질병 상태의 예로는 외상성 상해 (예컨대 후-외상 회복 및 재건, 사지 대체, 척수 상해, 화상 등) 및 출생 결손; 세포, 조직 및 기관의 병리학적 및 악성 질환 (예컨대 암); 및 세포 및 근육 조직의 퇴행성 및 선천성 질병 (예컨대 근이영양증, 심장 질환), 신경 (예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병 및 다발성 경화증), 상피 (예컨대 실명 및 근질환, 죽상경화증 및 기타 혈관 협착 질환, 효소 결핍, 예컨대 크론병, 및 호르몬 결핍, 예컨대 당뇨병), 및 결합 조직 (예컨대 면역 질환 및 빈혈)을 들 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다. HS 유래 세포 및 조직은 이를 필요로 하는 대상자에게 바람직하게는 대상자 자신의 공여 물질을 이용하여 식피 또는 이식된다.
본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따라 제조된 분화 세포로부터 제조된 이소제닉 또는 신제닉 세포, 조직 또는 기관을 사용하는 것을 포함하는, 진단 및 이식, 유전자 및(또는) 세포 대체 치료의 개선된 방법을 제공하는 것이다. 이러한 치료는 예를 들어 파킨슨병, 헌팅톤병, 알츠하이머병, ALS, 척수 상해, 다발성 경화증, 근이영양증, 당뇨병, 간 질환, 심장 질환, 연골 대체, 화상, 혈관 질환, 요도 질환을 포함하는 질환 및 상해의 치료뿐만 아니라 면역 결핍 및 암의 치료, 및 골수 이식을 포함한다.
본 발명의 상기 및 다른 목적은 후술하는 상세한 설명, 실시예 및 청구의 범위에 상세히 설명되어 있다.
V. 바람직한 실시 양태에 대한 상세한 설명
본원 명세서의 모든 인용 문헌들은 본원 명세서에서 그의 전문을 참고로 포함한다. 본원 명세서의 그 어떤 것도, 본 발명이 선행 발명의 개시물에 우선하는 자격이 없다거나, 또는 선행 기술은 합법적이고 적절한 개시물을 제공하고 있다는 인정으로서 해석되어서는 안된다. 본원 명세서에 나타낸 나타낸 이러한 상세한 설명, 바람직한 실시 양태 및 실시예는 본 발명을 제한한다기 보다는 예시하는 것으로 이해해야 한다.
본 발명은 단리된 동종접합 간 (HS) 세포, HS 세포의 제조 방법, 및 진단, 세포 치료, 유전자 치료에 사용하거나, 또는 미용 및 치료를 위한 이식용 조직 및 기관을 제공하는 세포의 공급원으로서 사용하기 위한 분화된 세포의 제조 방법을 제공한다. 더구나, 이러한 용도는 한정되지 않는다. 더욱 특별하게, HS 세포를 수정되지 않은 제1 감수분열후의 이배체 생식 세포에서 유래한 포배-유사 덩어리에서 단리한다.
과거에는, 배아 간 (ES) 세포를 수정된 포배의 내부 세포 덩어리에서 유래된 세포들을 장기간 배양하여 발생시켰다. 이어서, ES 세포를 배양하고, 유전적으로 변형시키고, 분화를 유발시켜 치료용 형질전환 동물 또는 세포들을 제조하는 세포로 제조하였다.
본 발명은 동종접합인 간세포를 제공하는데, 이들이 수정되지 않은 제1 감수분열후의 이배체 생식 세포의 유사분열 활성화 동안 생성된 포배-유사 덩어리에서 단리된다는 점에서, 분화가능한 다능성 세포를 수득하는 선행 방법과 상이하다. 더구나, 포배-유사 덩어리에서 단리된 HS 세포는 분화를 유발시켜 분화된 세포 또는 조직, 다중-기능성 선조 세포를 수득하거나, 또는 영구 세포주로서 유지시킬 수 있다. 이를 원하는 경우, 본 발명의 HS 세포 또는 선조 세포를 유전자 변형시킬 수 있다.
그러므로, 본 발명은 다능성 HS 세포, 다중-기능성 선조 세포 및(또는) 최종 분화된 세포, 이들의 제조 방법을 제공하며, 이러한 세포들은 다양한 치료 및 진단 목적에 사용될 수 있다.
A. 정의
본 발명의 문맥상, 하기 정의를 적용한다.
"분화"란 세포가 정상적인 기능을 하는 세포로 성숙함에 따라서 겪게 되는 고도로 조절된 과정이다. 분화된 세포는 고유의 특성을 갖고, 특정 기능을 수행하며, 잘 분할되지 않는다. 반대로, 분화되지 않은 세포는 다중의 비특정 활성 및 기능이 있는 비특정된 외관을 지닌 빠르게 분할되는 미성숙, 배아 또는 원시 세포이다.
본원에서 사용한 용어 "간세포"는 활발하게 분할되고, 순환하는 비교적 분화되지 않은 세포를 말하며, 이들은 성숙되고, 분화되고, 기능성인 계통의 세포를 적절하게 자극시킬 때 생성된다. 간세포의 규정된 특성들은 다음과 같다: (a) 그 자체로는 최종 분화되지 않음; (b) 동물의 생존 기간에 제한되지 않고 분할할 수 있음; 및 (c) 분할할 때, 각각의 딸 세포는 남아 있는 간세포를 선택하거나, 또는 비가역적으로 최종 분화를 일으키는 과정에 착수한다. 이들의 능력 (즉, 몇 가지 형태의 분화된 세포를 생성할 수 있는 능력)에 있어서 처음에는 제한되지 않은 이들 간세포들을 "다능성"으로 명명한다. 현재, 다능성 세포의 근원은 배아 (ES) 간세포, 배아 암종 (EC) 세포, 체세포 복제, 기형종 및 기형암종에서 생성된 세포를 포함한다.
3 개의 간 층 (즉, 내배엽, 중배엽 및 외배엽) 중 하나에서 세포를 각각 생성할 수 있는 선조 세포주를 본원 명세서에서는 "다중-기능성"으로 언급한다. 각각의 선조 세포주는 최종 분화되지 않으며, 동물의 생존 기간 동안 계속하여 분할할 수 있으며, 유일한 1 가지 유형의 배아 층에서 다른 조직 또는 세포가 되는 것 으로 생각된다. 그러므로, 특히 선조 세포주는 뼈, 연골, 평활근, 횡문근 및 조형 세포 (중배엽); 간, 원시 창자 및 호흡기 상피 (내배엽); 또는 신경, 신경교세포, 모낭 및 원시 치아 (외배엽)으로 분화될 수 있다. 그러므로, 용어 "선조 세포"는 "다중-기능성 간세포" 또는 "전구 세포"와 유사하게 사용될 수 있다. 생체내에서 또는 생체외에서 HS 세포의 유도된 분화에 의해 생성되는 이러한 선포 세포주 (여기서, 용어 "생체내에서"는 동종 또는 동종이형 동물에서 상기 HS 세포를 캡슐화하여 이러한 캡슐화된 세포로부터 간형질을 생성함으로써 유발된 분화를 포함함)는 배지에서 영구 세포주로 유지될 수 있다.
"기형종"은 다양한 유형의 분화 조직, 3 개의 배아 층 모두에서 유도된 조직, 예를 들어, 뼈, 근육, 연골, 신경, 원시 치아, 샘내피 등을 포함하는 비정상적 세포들의 자연 발생적 특발성 덩어리인데, 계속하여 분할되고, 생성되지만 이들 분화된 조직 보다 더 많은 분화되지 않은 간세포와 혼합되어 있다.
기형종은 생식 조직에서 종종 발견되는 자발적으로 형성된 신생물이며, 3 가지의 배야 간 층 모두의 세포를 함유한다. 또한, 성장이 조절되지 않는 것이 특징이다. "간형질"은 HS 세포를 숙주에 이식할 때 발생하는 덩어리를 기술하는 데 사용되는 새롭게 파생된 용어이다. 기형종과는 달리, 간형질의 성장을 조절되지만, 여전히 3 개의 배아 층 모두의 세포를 함유한다. 그러므로, 생체내에서 본 발명의 HS 세포를 분화시키기 위한 수단으로 사용될 수 있다.
"기형암종"은 기형종의 제2류이다. 기형종은 대개 양성이지만; 이들이 악성이 될 경우, 기형암종이 발달하고, 숙주를 사망시킬 수 있다.
"동종접합 간세포", 앞에서 기술한 용어 "기형종 간세포" 또는 "TS 세포"는 수정되지 않은 제1 감수분열후의 이배체 생식 세포에서 생산한 분화되지 않은 간세포이다. 바람직하게는, 난자형성 (또는 "활성") 동안 제2 극체의 배출을 방지하거나, 적절한 조건에서 제2 극체를 배출시키고, 일배체 난모세포를 자발적 게놈 자가복제시킴으로써 형성된다. 동종접합 (HS) 세포는 수정되지 않은 제1 감수분열후의 이배체 생식 세포의 "유사분열 활성화" 동안 발달하는 포배-유사 덩어리들의 내부 세포 덩어리에서 발생된 단리된 세포이며, 이들은 (a) 2 개의 난모세포 또는 2 개의 정자세포를 융합하고, (b) 난자형성 동안 제2 극체의 배출을 방지하고; (c) 적절한 조건에서 제2 극체를 배출시키고, 자발적 게놈 자가복제시키거나; (d) 2 개의 일배체 난핵 또는 정핵을 이핵난모세포로 전이시킴으로써 달성될 수 있다. 따라서, 동종접합인 간세포에 대한 스크리닝은 (a) 또는 (d)의 방법을 사용할 때 유전자형 분석을 사용하여 수행된다.
포유류의 전개에 있어서, 난할은 얇은 벽의 공동의 구(hollow sphere), 즉, 포배를 형성하는데, 이때 배아(embryo)는 한쪽의 세포 덩어리[또는 내부 세포 덩어리(inner cell mass)로 알려져 있다]에 의해 나타난다. 상기 포배 는 착상(implantation) 전에 형성되며, 포배에 상응한다. 상기 얇은 벽의 공동의 구의 벽은 영양아층(trophoblast)(이것은 포유류의 포배 의 주변을 형성하는 상피의 추가의 배아층임)이라고 불리며, 상기 배아를 자궁 벽에 부착시킨다. 상기 영양아층은 융모막의 외층을 형성하며, 모체 조직과 함께 태반을 형성한다.
본 발명에 있어서, "포배-유사 덩어리(blastocyst-like mass)"는 당업계에서 사용하는 "포배"라는 용어와 다른데, 그것이 유사분열적으로 활성화된 수정되지 않은 제1 감수분열후의 생식 세포(mitotically activated nonfertilized post-meiosis I germ cell)의 생성물이기 때문이다.
본원에서 사용된 용어, "유사분열적으로 활성화된"은 유사분열적으로 규칙적인 세포 분할을 수행하는 능력을 얻는 것을 의미하며, 난모세포의 처녀생식적 활성화 및 정자세포의 남성생식적 활성화를 모두 포함한다. 본 발명의 목적상, "유사분열적으로 활성화된"은 처녀생식적 활성화 또는 남성생식적 활성화와 동의어로 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "동종접합성 제1 감수분열후의 이배체 생식 세포"는 배우자 형성 단계의 생식 세포를 의미하며, 상기 배우자 형성 단계에서는 상기 세포들이 부성 또는 모성 상동 염색체들의 2 개의 복제본을 포함한다.
B. 본 발명의 단리된 간세포
앞서 설명된 바와 같이, 본 발명의 동종접합 간(HS)세포는 활성화된, 수정되지 않은 제1 감수분열후의 생식 세포로부터 형성된다. 예를 들어, 두 개의 성숙한 난모세포들 또는 정모세포들이 융합되면 포배 유사 덩어리가 형성되고, 이로부터 HS 세포가 유도될 수 있다. 이러한 포배 유사 덩어리로부터 유도된 간세포는 후감수분열 유전자형(postmeiotic genotype)을 가지며, 이것이 상기 간세포를 동종접합성, 다능성 및 생물학적으로 양성이 되게 한다.
나아가, 선호되는 실시 양태에서, 본 발명의 HS 세포는 임의의 개인으로부터 얻을 수 있으며, 또한 그 개인에게 사용할 수 있으며, 또는 관련이 있거나 또는 없 는 면역조직상용성(immunohistocompatible) 개인[이 수용자와 상기 HS 세포, 선조 세포(progenitor), 또는 상기 HS 세포 또는 원종 세포로부터 유도된 분화된 세포 및/또는 조직과의 사이에 높은 면역학적 상용성을 갖는다]에게도 사용할 수 있다.
HS 세포들은 세개의 생식 층으로부터 기원하는 여러가지 유형의 조직들로 시험관내 또는 생체내에서 분화하도록 유도될 수 있다. 선호되는 실시 양태에서, HS 세포는 동종이계(allogeneic) 동물 또는 동일계(isogenic) 동물에서 캡슐화되어 스템플라즘(stemplasms)을 생성할 수 있으며, 그 안에서 상기 세포는 내배엽, 중배엽 및 외배엽으로부터 기원하는 여러가지 유형의 조직으로 분화될 수 있다. 상기 조직들은 피부, 모발, 신경 조직, 이자 섬 세포, 골격, 골수, 뇌하수체, 간, 방광 및 동물(사람 포함)에 있어서 진단 또는 치료 유용성을 갖는 기타 조직을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 나아가, 분화 기술 분야, 특히 ES 세포 및 배아 암(teratocarcinoma) 세포의 분화를 위해 개발된 기술 분야의 당업자는 다능성 세포를 분화시켜서 원하는 유형의 조직을 과도한 실험 없이 제조할 수 있다.
예를 들어, 본원에 참고문헌으로 포함된 호울의 문헌[Hole, Cells Tissues Organs, 165: 181-189 (1999)]은 시험관 내에서 배아 간세포로부터 조혈 세포를 분화시키는 것을 지시하는 방법을 기술하고 있다. 추가로, 본원에 참고문헌으로 포함된 도에츠만 등의 문헌[Doetschman et al., Embryol. Exp. Morphol., 87: 27-45 (1985)]은 현탁 배지에서 성장한 ES 세포로부터 백혈병 억제 인자(LIF)를 회수(withdrawl)하면 적혈구 세포 및 대식세포로 이루어진 혈도(blood islands)를 포 함하는 방광 배양체가 형성된다는 것을 제시하였다. 간세포로부터 기타 조혈 세포들, 예를 들어 호중구, 비대세포, 대식세포 및 적혈구 세포를 생산하는 것은 문헌에 개시되어 있다[예를 들어, Wiles 및 Keller, Development, 111 : 259-267 (1991) ; Keller et al, Mol. Cell. Biol. 13: 473-486 (1993a); 그리고 Lieschke 및 Dunn, Exp. Hematol., 23: 328334 (1995): 이들은 모두 전체로서 본원에 참고문헌으로 포함된다]. 상기 방법들은 본 발명의 HS 세포들에 적용가능하다.
본원에 참고문헌으로 포함된 초 등의 문헌[Cho et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 97979802 (1999)]에 개시된 기술은 효율적으로 ES 세포들을 성숙한 Ig-분비 B 림프구로 분화시키기 위한 기술로서, 본 발명의 HS 세포들과 함께 사용될 수 있다. 유사하게, 본원에 참고문헌으로 포함된 다니의 문헌[Dani, Cells Tissues Organs, 165: 173-180 (1999)]은 세포를 위한 방법을 개시하고 있는데, ES 세포를 지방세포로 분화시키는 것이 본 발명의 문맥에서 사용할 수 있는 유망한 모델로서 기능한다는 것을 보여준다. 예를 들어 분화 초기 단계의 배아체(embryoid body)를 레티노산으로 짧은 기간 동안 처리하는 것은 지방생성과 관련이 있는 것으로 보인다.
간세포를 여러가지 신경 세포로 분화시키는 기술은 본원에 참고문헌으로 포함된 오카베 등의 문헌[Okabe et al. Mech. Dev., 59: 89-102 (1996)]에 기술되어 있다. 유사하게, 본원에 참고문헌으로 포함된 맥도날드 등의 문헌[McDonald et al., Nature Medicine, 5: 1410-1412 (1999)]은 손상된 척수를 치료함에 있어서 특별한 유용성을 갖는 간세포로부터 유도된 희소돌기아교세포(oligodendrocytes) 및 신경 세포를 개시하고 있다. 이 기술들은 본 발명의 HS 세포와 함께 사용될 수 있다.
특정 세포 계통(lineage)을 유도하기 위하여 부세포주(accessory cell lines; 예: OP9)을 사용하는 것도 고려할 수 있다. 예를 들어 적혈구성, 골수성 및 림프성 계통과 관련있는 본원에 참고문헌으로 포함된 나카노 등의 문헌[Nakano et al., Science, 265: 1098-1101 (1994)] 및 나카야마 등의 문헌[Nakayama et al., Blood, 91: 2283-2295 (1998)]을 참고하라.
본 발명의 HS 세포를 여포 세포 및 상피 세포로 분화시키는 기술도 고려할 수 있다. 예를 들어 본원에 참고문헌으로 포함된 테일러 등의 문헌[Taylor et al., Cell, 102: 451-361 (2000)]은 ES 세포-유도된 여포 및 상피 세포가 모발 치환술(hair replacement) 및 식피술(skin graft therapy)에 사용될 수 있음을 개시하고 있다. 이 기술들은 본 발명의 HS 세포들과 함께 사용하기 위하여 변형될 수 있다. 특정 조절 유전자의 발현은 분화를 지시하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어 조혈 유전자와 관련있는, 본원에 참고문헌으로 포함된 호울 등의 문헌[Hole et al., Blood, 90: 1266-1276 (1996a)] 및 배티어즈의 문헌[Battieres. Clin. Hematol., 3: 467-483 (1997)]을 참조하라. 유사하게, 사전 증거는 지질 대사에 관련된 핵 조절 인자들[예를 들어 PPAR(PPARδ 및 PPARγ) 및 C/EBPδ(C/EBPβ, C/EBPδ 및 C/EBPα), 그러나 이에 한정되지는 않는다]이 전지방세포(preadipocytes)를 지방세포로 최종(terminal) 분화시키는 촉발제가 될 수도 있음을 시사한다. 그러한 인자들은 본 발명의 분화 방법의 문맥상 유용성을 가질 것 이다.
분화에 특이적인 유전자의 발현을 검출하는 방법, 조직에 특이적인 항원을 검출하는 방법, 세포 또는 조직 모폴로지를 검사하는 방법, 이온 채널 기능과 같은 기능적 발현을 검출하는 방법 또는 HS 세포의 분화를 검출하기 위한 임의의 적절한 방법을 사용하여 필요한 기능에 따라서 분화를 평가할 수 있다.
생체내 또는 시험관내 분화 기술에 의하여 본 발명의 HS 세포로부터 유도된 다능성 선조 세포는 모든 세 종류의 생식 층(germ layer): 외배엽, 중배엽 및 내배엽으로부터 세포를 생산할 수 있다.
예를 들면, 선조 세포는 뼈, 연골, 평활근, 횡문근 및 조혈세포 (중배엽); 간, 원시장관 및 호흡기 상피 (내배엽); 또는 신경, 아교세포, 모낭 및 치아순 (외배엽)으로 분화될 수 있다. 본 발명의 선조 세포가 무한증식할 필요는 없지만, 이들은 무한증식 세포주로서 유지된다. 형태적으로 선조 세포는 ES 세포에서 발견되는 세포 표면 마커, 예를 들면 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, 알칼리 포스파타제 활성에 대해 양성이고 SSEA-1에 대해 음성인 영장류 ES 세포주의 특징적 세포 표면 마커를 발현하지 않는다.
바람직하게는, 다른 다능성 HS 세포의 부재 하에서 HS 세포를 배양함으로써 본 발명의 선조 세포의 생산이 유도된다. 또한, 선조 세포의 증식은 상기 선조 세포가 유도되는 다능성 HS 세포의 추가적 성장 및 증식을 막음으로써 촉진된다. 선조 세포를 생성하기 위하여 당해 기술분야에 알려진 기술을 사용할 수 있으며, 예를 들면 포배 유사 덩어리로부터 단리된 HS 세포를 분화 유도제의 존재 및 다른 HS 세포의 부재 하에서 배양해서 다능성 선조 세포를 생성하고 미분화된 HS 세포가 더 증식되는 것을 막을 수 있다.
또한, 본 발명의 단리된 HS 세포는 유전자 각인 때문에 만기 (full-term) 배아로 발달할 수 없지만, HS는 하기 실시예에서 입증되는 바와 같이 기능적으로 분화된 세포, 및(또는) 조직으로 분화될 수 있는 능력을 유지한다. 유전자 각인의 기전은 현재로서는 잘 알려지지 않았지만, 처녀생식 배아는 유전자 각인의 결과로서 만기로 발달하지 못한다는 것이 명백히 입증되었다 (Surani et al., Development Supplement 89-98 (1990)). 유전자 각인은 배자계열 특이적 후생적 마킹 과정을 포함하는데, 이는 각인된 유전자의 발현이 그의 부모 기원에 의해 결정되기 때문이다 (Allen et al., Development, 120:1473-1482 (1994)). 각인 기전에 사용될 수 있는 유전가능한 후생적 변경은 대립유전자-특이적 DNA 메틸화 및 DNase I 과민성 분석에 의해 검출될 수 있는 것과 같은 크로마틴 구조 변경을 포함한다. 상기 참조. 어떤 유전자 (예를 들면, Igf2r 및 H19)에 대해서는, 부계 대립유전자가 각인되는 반면, 다른 유전자 (예를 들면, Igf2 및 Snrpn)에 대해서는 모계 대립유전자가 항상 각인된다. 상기 참조 (또한 문헌 [Mann et al., Cell, 62:251-260 (1990)] 및 [Devel. Biol., 3:77-85 (1992) 참조: 이들은 유전적 각인에 대한 관련성 및 남성생식적 및 처녀생식적 배아의 다능성의 논의를 위하여 본원에 참고문헌으로 포함된다).
C. 본 발명의 동종접합성 간세포의 제조
상기 언급된 바와 같이, HS 세포는 유사분열적 활성화 또는 수정되지 않은 제1 감수분열후의 이배체 생식 세포의 제조에 의해 전개되는 포배 유사 덩어리로부터 단리된다. 도 1은 수정되지 않은 제1 감수분열후의 이배체 생식 세포로부터 HS 세포를 전개시키는 선호되는 방법을 보여주는 플로우 차트이다.
생식 세포들은 활성화되면 포배 유사 덩어리를 생성하는 수정되지 않은 제1 감수분열후의 이배체 생식 세포로 전개되며, 상기 포배 유사 덩어리로부터 본 발명의 HS 세포가 유도된다. 본 발명의 HS 세포 및/또는 분화된 세포는 예를 들어 착상 또는 이식(transplantation)에 의한 질병의 진단 및/또는 치료에 있어서 그러한 치료가 필요한 감염된 개인에게 유용하다.
동종접합성 제1 감수분열후의 이배체 생식 세포들을 동일한 개인으로부터 또는 면역상용성(immunocompatible) 제공자로부터 얻을 수 있지만, 특정 경우에는 자기-제공자가 선호된다. 그러나, 상기 치료를 위하여 선택된 감염된 개인이 유전적 질병을 앓고 있는 경우(즉, 돌연변이 또는 부적절한 발현에 기인한 결정적인 유전자의 결여에 의한 질병)에는 비-자기 제공자(non-self donor)를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 별법으로, 선택 절차 분야의 당업자는 원하는 유전자형을 나타내는 상기 자기 생식 세포(self germ cell)(예: 결함이 있는 유전자 또는 돌연변이된 유전자를 갖지 않는 세포들)를 선택할 수 있으며, 상기 세포들은 상기 결함 유전자를 발현시킬 수 있다. 상기 선택 기술들은 조직 이식에 있어서 면역-비상용성 유전형 또는 표현형(phenotype)을 회피하기 위하여 사용될 수도 있다.
동종접합성 제1 감수분열후의 이배체 생식 세포들을 종래의 기술, 특히 시험관 수정 분야에서 일반적으로 사용되는 기술들을 사용하여 제공자로부터 수확할 수 있다. 예를 들어 인간 난소 여포로부터 난모세포를 흡인하는 기술을 개시하고 있는 조운스 등의 문헌[Jones HW Jr. et al., Fertil. Steril., 37 (1) : 26-29 (1982)], 부고환 및 고환으로부터 정충을 수집하는 기술을 개시하고 있는 리섹 등의 문헌[Lisek et al., Tech. Urol., 3 (2): 81-85 (1997)], 한 제공자의 핵 물질을 다른 제공자의 뉴클리에이트된 난모세포에 이식하는 기술을 개시하고 있는 스타이스 등의 문헌[Stice et al., Mol. Reprod. Dev., 38 (1) : 61-8 (1994)], 및 타쿠치 등의 문헌[Takeuchi et al., Hum. Reprod., 14 (5): 1312-7 (1999)]을 참고하라. 상기 문헌들의 전체 내용은 본원에 참고문헌으로 포함된다.
HS 세포는 (a) 두개의 난모세포 또는 두개의 정자세포의 융합에 이은 유전자형 확정에 의한 동종접합 간세포에 대한 스크리닝; (b) 난자 발생 동안에 제2 극체 방출 방지; (c) 제2 극체 방출 및 적절한 조건하에서의 자발적 게놈 자가 복제의 허용; 또는 (d) 적출된 난자에의 두 개의 단상 난핵 또는 정자 핵의 전달에 이은 유전자형 확정에 의한 동종접합 간세포에 대한 스크리닝에 의한다. 도 2는 남성과 여성에서 유사분열과 감수분열 양상의 차이를 보여주는, 정자 발생 및 난자 발생에 대한 개략도를 제공한다.
본 발명 내용상 유용한 난모세포는 당업계에 공지되거나, 발견되어야 할 임의의 적합한 방법을 이용하여 얻어질 수 있다. 인간 난모세포는 대체로 공여 개체의 난포로부터 배양되며 주위 또는 접착 세포로부터 단리된다. 수율을 극대화하기 위하여, 공여 개체에서 과배란유도(superovulation)를 유도한다. 과배란유도는 적절한 고나도트로핀 또는 고나도트로핀 유사체를 클로미펜 시트레이트와 배합하거나 단독으로 투여하여 유도할 수 있다 (문헌 [Barriere et al., Rev. Prat., 40(29): 2689-93 (1990)], 본 명세서에 참고로 인용됨). 마우스에 있어서, 예시적 방법으로는 임마혈청(PMS)의 모방 여포 자극 호르몬(FSH)으로의 투여 및 인융모성 고나도트로핀(hCG)의 모방 황체형성 호르몬(LH)으로의 투여가 있다 (문헌 [Hogan et al., Manipulating the mouse embryo: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994] 참조). 과배란유도의 효율적 유도는 암컷의 연령 및 체중, 고나도트로핀의 용량, 투여 시간, 및 사용 품종을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 수 개의 변수에 따라 좌우된다.
배란의 과유도 및 난모세포 배양은 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 상세한 마우스 프로토콜을 위하여, 상기 호간(Hogan) 등의 문헌 제130 내지 132면(전체 내용이 참고로 인용됨)을 참조하라. 예를 들면, 호간은 PMS 및 hCG(둘 다 무균 0.9% NaCl 용액 중의 동결 건조 분말로부터 재현탁됨)의 복강내 투여로 과배란유도를 유발하는 것을 기술한다. 상기 호간 프로토콜(마우스로부터의 난모세포 배양)은 과도한 실험 없이 인간에게 관례적으로 적용될 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜도 배란화 난모세포의 융합을 유도하는 것을 보인다(예를 들어, 문헌 [GG Sekirina, Ontogenez, 16(6):583-8 (1985)] 및 [Gulyas BJ, Dev. Biol. 101(1):246-50(1984)](본 명세서에 참고로 인용됨)를 참조). 별법으로는, 문헌 [Nogues et al., Zygote, 2(1):15-28](본 명세서에 참고로 인용됨)에서는 배발생의 제1 단계를 겪을 수 있는 "접합자" 또는 "난모세포 융합 생성물(OFP)"의 생성을 가져오는, 불활성화 센다이 바이러스에 의한 난모세포 융합 유도를 기술한다. 난모세포 융합 기술을 보기 위해서는, 문헌 [Gulyas BJ. Dev. Biol., 4:57-80 (1986)](본 명세서에 참고로 인용됨)를 참조하라. 마우스 난모세포의 융합을 위한 상세한 프로토콜을 위해서는, 상기 호간 등의 문헌 제148-500면(여기서는, 그의 부착된 난구세포를 갖는 배양된 난자가 둘베코 PBS 중의 7% 에탄올 용액 중에서 5분간 유지되고, 매질로 세척되고, 37℃에서 5시간 동안 배양됨)을 참조하라. 상기 난구 세포들은 이어서 히알루로니다제 처리에 의해 제거된다. 도 3은 난모세포 융합 및 난모세포 융합 생성물의 발생을 도시한다.
별법으로는, 난모세포로부터의 제2 극체 방출을 방지하면 HS 세포를 발생시킬 수 있다. 본래, 제1 극체의 제1 감수분열 및 분리 후에, 제2 감수분열이 일어난다. 제2 극체의 방출 전에 난모세포를 Ca++ 이온투과담체(A23187) 또는 에탄올을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 제제에 노출시킨 다음, 6-디메틸아미노퓨린(6-DMAP), 퓨로마이신 또는 시토칼라신 D를 포함하는 제제에 노출시키면 이배체 난모세포가 활성화되고 후속적으로 포배-유사(blastocyst-like) 덩어리가 형성된다. 도 4는 활성화의 가능한 생성물을 도시한다.
또 다른 실시 양태에서는, 제2 극체의 방출 및 자발적 게놈 자기복제를 허용하는 것을 이용하여 HS 세포를 유도할 수 있다. 무성생식적 활성화시, 난모세포가 제2 극체를 방출하고 단상이 된다. 상기 일배체 난모세포는 적절한 조건하에서 배양시 분열하고 포배-유사 덩어리를 형성한다. 문헌 [Taylor, A.S., et al., "The early development and DNA content of activated human oocytes and parthenogenetic human embryos," Hum. Reprod., 9(12):2389-97 (1994)], [Kaufman, M.H. et al., "establishment of pluripotential cell lines from haploid mouse embryos," J. Embryol. Exp. Morphol, 73:249-61 (1983)]을 참조하라.
본 발명의 내용상 유용한 정자세포는 당업계에 공지되거나 발견되어야 할 임의의 적합한 방법, 특히 시험관내 수정 분야에 통상적인 방법들을 이용하여 얻을 수 있다. 수컷에 사용하기 위한 HS 세포를 생성시키기 위하여, 정자세포(제2 감수분열 완료)를 배양한 다음, 융합을 유도한다. 정자세포 융합은 잘 확립된 표준 기술을 이용하여 이룰 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Asakura, et al., Exp. Cell. Res., 181(2):566-73 (1989)](본 명세서에 참고로 인용됨)에서는 한 쌍의 정자세포의 융합 및 단일 첨단체(시나크로좀(synacrosome))의 궁극적 형성을 유도하기 위한 저장성 배지의 사용을 기술한다. 별법으로는, 이차 정모세포(제1 감수분열 완료)를 당업계에 공지된 방법을 이용하여 활성화시킬 수 있다.
마지막으로, 상기한 바와 같이, 단리된 HS 세포를 적출된 난모세포로부터 생성시킬 수 있다. 자세히는, 두개의 정핵 또는 일배체 난핵을 탈핵된 난모세포로 전달하여 난모세포 세포질 중의 공여자 수컷 또는 암컷의 핵 유전정보를 지닌 수정되지 않은 이배체 난모세포를 생성시킬 수 있다. 수컷에서는, 이러한 접근법은 정자가 접합자 중의 유전자 발현을 유발하는 난자를 수정시킬 경우에 관여되는 과정을 모방하기 때문에, 부측(paternal)의 유전자 발현을 유리하게 한다. 공여 핵 물질은 당업계의 통상적인 표준 기술을 이용하여 배양하고(하거나) 단리시킬 수 있 다. 마찬가지로, 전달 단계는 시험관내 수정 분야에서 통상적인 기술을 이용하여 행할 수 있다 (미국특허 제5,945,577호, WO98/07841 및 문헌 [Wobus et al., Cells Tissues Organs, 166:1-5(2000)](본 명세서에 참고로 인용됨)의 교시를 참조).
바이러스 벡터 전달, 세균 벡터 전달 및 합성 벡터 전달(예; 플라스미드, 리포좀 및 콜로이드 복합체를 통한 전달)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 폴리뉴클레오티드 트렌스펙션 기술에 의해 HS 세포로 유전자변형을 도입할 수 있다.
수정된 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 ES 세포를 단리시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 포배-유사 덩어리들의 내부 세포 덩어리로부터 HS 세포를 단리시키는데 상기 방법을 적용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Gardner et al., "Culture and Transfer of Human Blastocysts", Current Opinions in Obstetrics and Gynecology, 11:307-311 (1999)], 미국특허 제5,843,780호(Thomson 등), 및 미국특허 제5,905,042호(Stice 등)(그 내용들이 본 명세서에 참고로 인용됨)를 참조하라.
D. 본 발명의 단리된 HS 세포로부터의 유도 선조세포 및 분화세포, 세포괴 및 조직형
단리된 HS 세포들은 임의의 적절한 방법에 의해 사이토킨, 성장 인자, 세포외 기질 성분 및 기타 인자들의 존재 또는 부재하에 분화되도록 유도된다. 예를 들면, HS 세포는 3D 접착 환경(예; 1% 콜라겐 겔)에서 또는 평면 접착 환경(액체)에서 분화되도록 유도될 수 있다. 극미중력 환경도 HS 세포 분화를 유도하는데 이용할 수 있다 (문헌 [Ingram et al, In vitro Cell Dev. Biol. Anim., 33(6):459- 466 (1997)] 참조). 분화 유도의 또 다른 방법은 면역결핍 마우스에서 스템플라즘(stemplasm)을 발생시키거나(문헌 [Thompson et al., Science, 282(5391):1145-47 (1998)]), 또는 다른 동물들에게서 발생시키는 것이다. 분화는 HS 세포를 캡슐화하고 이들이 적절한 숙주에서 스템플라즘을 형성하게 하는 방식으로 유도된다. 예를 들면, 인간 HS 세포는 캡슐화되고 상기 세포가 유도되는 동일 환자(이소제닉(isogenic)) 또는 다른 사람(알로제닉(allogenic))에 배치될 수 있다. 마찬가지로, 전체 포배-유사 덩어리는 수용 동물에 이식되어 스템플라즘을 형성하게 할 수 있다.
현재, 합성 선택 투과성 막을 이용한 신체의 면역계로부터 세포를 분리시키는 다수의 기술들이 이용가능하다. 상기 기술들은 생체내 스템플라즘 발생에 의한 HS 세포 분화에 이용할 수 있다. 예를 들면, 스템플라즘을 발생시키기 위한 캡슐화 HS 세포의 이식시, 혈액 또는 혈장과 캡슐화 세포간의 영양물, 산소, 및 생치료성 물질을 자유 교환시키는데 막을 이용할 수 있다. 상기 시스템은 상기 막 및 기질 지지체의 화학적 특성에 근거하여, 항원, 사이토킨 및 기타 면역학적 부분들의 쌍방향 확산을 조절할 수 있다. 문헌 [Lanza et al., Nat. Biotechnol., 14(9):1107-11(1996)]을 참조하라. 동물에서 포배-유사 덩어리의 이식을 포함하는 시스템을 위하여, 개별 또는 다중 세포 덩어리들을 단일 동물에 이식할 수 있다.
HS 세포는 임의의 동물 공여 물질로부터 생산할 수 있고 임의의 동물계에서 사용할 수 있다. 인간 및 비인간 HS 세포 둘 다 본 발명에서 고려된다. 적합한 수의학적 응용으로는 포유류, 어류, 파충류, 조류 및 양서류로부터의 HS 세포의 발 생 및 이들에의 사용을 포함한다.
본 발명의 전능성의 단리된 HS 세포는 연구, 진단 목적, 또는 개체에의 이식을 위한 분화된 조직의 시험관내 배양을 포함하는 다양한 치료적 용도를 위한 선택된 조직으로 분화시킬 수 있다. 바람직하게는, HS 세포는 HS 세포 형성을 위한 공여 물질을 제공하는 개체에 치료적으로 사용될 수 있다.
당업계의 숙련자에게 공지된 전능성 세포를 분화시키는데 사용되는 현행 기술로는 다양한 배아세포 및 배자밖 세포형들(extra-embryonic cell types)로 배아성암종(EC) 세포를 분화시키는 방법을 포함한다 (문헌 [Andrews, APMIS, 106:158-168 (1998)](본 명세서에 참고로 인용됨)). 상기 기술은 HS 세포의 분화를 유도하는 데에도 이용할 수 있다. EC 세포의 지시된 분화를 위해 사용되는 시험관 방법으로는 세포 운명 결정 및 분화를 유발하는 것으로 알려진 다양한 인자들에 EC 세포를 노출시켜 목적하는 세포형 또는 조직으로 만드는 것을 포함한다. 별법으로는, 이용되는 시험관 분화 설계는 간세포 유지를 지지하는 것으로 알려진 성장 인자의 제거를 포함할 수 있다. 상기 인자들을 매질로부터 제거하지 않으면, 간세포들은 배양체로 알려진 클러스터를 형성하는데, 배양체 내에서 전부 3개의 배아생식세포 층의 후손들이 발견될 수 있다. 이 때, 상기 배양체 내의 특정 세포 계통의 존재는 추가적 성장 인자 및 화학물질로 배지를 보충하여 개선시킬 수 있다. 이어서, 생성된 세포 개체수는 목적하는 세포형의 증가된 비율을 함유할 것이고, 선택적으로 단리시킬 수 있다. 전능성 간세포 및 이들의 의약에서의 용도에 대한 논의를 위하여, 문헌 [Edwards et al., Modern Trend, 74(1): 1-7 (2000)](본 명세서에 참고로 인용됨)도 참조하라.
분화 조절 인자의 예시적 예로는 사이토킨, 호르몬 및 LIF와 같은 세포조절 인자, 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), IL-3, 티로이드 호르몬(T3), 간세포 인자(SCF), 섬유아세포 성장 인자(FGF-2), 혈소판 유도 성장 인자(PDGF), 모양 신경 영양 인자가 있지만, 이에 한정되지는 않는다. GM-CSF, SCF 및 IL-3과 같은 자극성 사이토킨들이 분화 촉진을 보이고 있지만(문헌 [Keil et al., Ann. Hematol., 79(5):243-8 (2000)](본 명세서에 참고로 인용됨) 참조), LIF와 같은 억제성 인자들이 미분화된 전능성 상태로 마우스 배아 줄기(ES) 세포를 유지하는 것을 보이고 있다(문헌 [Zandstra et al., Blood, 96(4):1215-22(2000)](본 명세서에 참고로 인용됨)). 또한, SCF는 그의 추정 선조들로부터의 닭의 파골세포의 분화를 자극하는 것을 보이지만(문헌 [van't Hof et al., FASEB J., 11(4):287-93 (1997)](본 명세서에 참고로 인용됨)), FGF-2는 부동화 GHFT 세포에서 프롤락틴 발현을 유지하고 락토트로프(lactotrope) 분화를 개시하는 역할을 하여, 간세포의 상이한 뇌하수체전엽 세포로의 분화를 조절하는 메카니즘을 제시한다(문헌 [Lopez-Fernandez et al., J. Biol. Chem. 275(28):21653-60 (2000)](본 명세서에 참고로 인용됨)). 또한, 혈소판-유도 성장 인자(PDGF-AA, -AB 및 -BB)는 신경원 분화를 지지하지만, 모양 신경 영양 인자 및 티로이드 호르몬 T3은 성상세포 및 희돌기교세포의 클론들을 발생시킨다(문헌 [Johe et al., Genes. Dev., 10(24):3129-40 (1996)](본 명세서에 참고로 인용됨)).
나아가, 2001년 4월 26일 공개된 WO제01/29206호[시벨리(Cibelli) 등]는 분 화제, 성장인자, 호르몬과 그 길항제, 세포외 기질성분과 각종 인자에 대한 항체, 및 ES 세포의 분화를 유도하는데 사용될 수 있는 기술과 같은 다양한 분화 인자를 기재하고 있다. 그러한 기술 및 시약/인자를 본 발명에 따라 사용할 수 있고, 본 명세서에 참고로 혼입한다. 또한, 본 명세서에 참고로 혼입되는 슐디너(Schuldiner) 등의 문헌["Effects of Eight Growth Factors On The Differentiation Of Cells Derived From Human Embryonic Stem Cells," PNAS 97(21):11307-12(2000)] 참조.
HS 세포는 또한 생체내, 바람직하게는 제자리에서 이식에 의한 분화가 유도될 수 있고, 이 때 상기 세포는 조직학적 및 기능적 분화를 경험하고 숙주세포와 적합한 관계를 형성한다. 이식 부위에 위치한 내인성 조절인자는 스템(stem)으로 하여금 특정 종류의 분화된 세포 도는 조직으로 분화되게 할 수 있다. 대안적으로, 일단의 분기 분화세포 및(또는) 조직이 진피, 복막 및 콩팥피막에 이식된 줄기세포로부터 생성된다. 신장피막 이식 절차에 대한 상세한 기술과 관련한 상기 호르간 문헌 183 내지 184쪽 참조.
1. 인간 기형종( Teratomas ) 내에서 발견되는 분화된 세포의 조직학적 특징 및 유전자형
기형종은 성숙 및(또는) 미성숙 조직으로 구성될 수 있다. 몇몇 종류의 분화된 조직을 포함하는 세포 군의 형태학적 분석이 유리 슬라이드에 고정된 기형종의 절편에서 확인되었고, 조직 형태학이 통상의 기술을 사용해 이들 기형종 절편 상에서 수행된다. 본 명세서에 참고로 혼입되는 장(Zhuang) 등의 문헌[J Pathol, 146:620(1995)] 및 보트메이어(Vortmeyer) 등의 문헌[Am. J. Pathol., 154:987-991(1999)]. 기형종의 미세절개는 성숙한 편형상피, 성숙한 장상피, 성숙한 연골 및 호흡상피, 미성숙 연골, 성숙한 신경교조직, 미성숙 신경조직 및 성숙한 호흡상피를 비롯한 개개 조직 성분을 선택적으로 획득하였다. 생체외 이식가능한 기형암종 및 관련 기술로부터 단리된 각종 세포주에 대한 상세 기술과 관련하여 본 명세서에 참고로 혼입되는 니콜라스(Nicolas) 등의 문헌[Cancer Research, 36:4224-4231 (1976)] 참조.
DNA 추출 후, 몇몇 인간 염색체 상의 다중 유전적 표식자를 사용해 대립유전자의 접합자 특징을 분석하였다. 한정된 수의 성숙한 종양의 초기 연구에 있어, 동일한 대립 유전자의 동종접합성을 일관적으로 탐지하였다. 그의 내용이 전부 본 명세서에 참고로 혼입되는 보트메이어 등의 문헌[Am. J. Pathol., 154:987-991 (1999)] 참조. 그러나, 다수의 기형종의 분석 결과, 이형접합성 대립유전자를 갖는 유전자 좌를 갖는 소수의 종양을 밝혀냈다.
이종접합성 기형 조직은 분열전(premeiotic) 세포로부터 유래된다는 가정을 증명하기 위해, 성숙(분화) 및 미성숙(미분화) 조직 성분을 함유하는 난자 및 고환 기형종을 절개해 동일한 실험 절차에 따라(아래 실시예 참조) 각종 성숙 및 비성숙 조직 성분의 시료를 얻었다. 미성숙 편형상피, 미성숙 신경조직 및 미성숙 연골을 비롯한 미분화된 조직 성분에서 이형접합성 대립유전자를 검출하였다. 이들 종양으로부터의 분화된 조직은 동일한 유전적 표식자에 대해 동종접합성이였다. 시험된 분화조직 성분은 동일한 종양의 동일한 성숙 성분의 별개 영역으로부터 수거된 복제 시료를 비롯한 성숙한 피지선 조직 및 성숙한 편평상피을 포함한다.
이 시험 결과는 유전적 동형 접합성이 인식가능한 성숙한 조직형으로의 분화와 관계되고 유전적 이형접합성이 미분화 조직과 관련된다는 것을 증명한다. 따라서, 기형종 내 미분화 조직의 영역은 분열전 생식세포에서 기형 발생에 의해 개시되고, 기형종 내 분화된 조직은 분열후(postmeiotic) 생식세포로부터 유래된다.
분열전 세포는 각각의 염색체의 복제를 포함하여, 분열전 세포의 증식이 유전적으로 이형접합성 세포의 집단을 생성한다. 반대로, 분열후 세포는 각각의 염색체의 오직 한 복제를 가지며 유전적으로 동종접합성이다. 분열후 전구세포가 증식하여 성숙한 기형종 또는 기형종 내 성숙한 분화조직의 영역을 생성한다는 사실은 감수분열이 염색체 재배열 및 유전물질의 재조합에 대한 메카니즘임은 물론, 조직 분화 및 전개로 이끄는 특정 유전자의 활성화에 대한 필수조건임을 암시한다.
따라서, 감수분열을 경험하지 않은 증식성 종양세포는 비분화되고 이형접합성인 특성을 보유하고 미분화된 기형종 조직으로 전개될 것이다. 분화된 기형종 조직은 감수분열을 완료한 증식성 기형종 세포로부터 유래되거나 또는 기형 발생을 경험하는 분열후 세포로부터 유래될 수 있다.
따라서, 감수분열은 기형종에서 조직 분화를 위해 필요하다. 기형종 내 조직 성분의 유전적 분석은 동종접합성이 조직학적으로 성숙한 분화조직에 관련되고 유전적 이형접합성은 조직학적으로 미성숙한 미분화조직에 관련됨을 보여주었다. 이 결과는 기형종 세포가 후속 조직분화를 경험할 수 있기 전에 감수분열이 완료되어야 함을 뒷받침한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 단리되고 미분화되고 다능 동종접합성 줄기세포를 생성하는 생식 세포의 감수분열의 중단을 교시한다.
2. 특정 세포 또는 조직으로의 HS 세포의 분화
상기 문단에서 언급된 바와 같이, 당업자에게 이용가능한 분화 유도법은 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어, 세포는 분화 각각의 웰이 인자의 독특한 조합을 포함하는 조직 배양웰에서 배양될 수 있다. 그러한 인자를 코딩하는 핵산 또는 cDNA는 이식 또는 바이러스에 의해 그러한 핵산을 운반하기 위해 제도된 구조체와 같은 네이키드(naked) DNA로서 평판 배양(plate out)될 수 있다. 분화된 세포는 a) 분화 특지적 항체, 2) 형태학 3) 분화 특이적 프리머 또는 4) 특정 종류의 분화된 세포를 동정하기 위한 임의의 다른 이용가능한 기술을 사용해 동정가능하다.
분화 프로토콜을 받게 되면, 특정한 세포계통으로부터의 원시세포를 통상의 기술에 의해 분화된 HS 세포로부터 단리할 수 있다. 원한다면, 세포 배양 도는 다른 적합한 방법에 의해 그러한 단리된 분화 전구세포를 늘릴 수 있다.
또한, 전구세포는 그 분화의 임의의 적합한 단계 중에 트란스팩션될 수 있다. 예를 들어, 포배 유사 덩어리의 형성 전에 HS 세포를 트란스펙션하고, 이어서 상기 세포를 핵제거된 난모세포에 대한 핵 도너로 사용할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 전구세포를 예컨대 이형접합성 시스템의 CD34+ 또는 CD38과 함께 단리 후 트란스펙션될 수 있다.
원하는 유전자를 삽입, 결실 또는 변형하는 임의의 공지된 방법을 사용해 유전적으로 변형된 전구세포 또는 HS 세포를 생성할 수 있다.
캡슐화된 HS 세포 또는 포배 유사 덩어리의 동물에의 이식 직후, 기형종 및 기형암종 조차 생성 가능하다. HS 세포가 이식 수용체에서 양성 또는 악성 종양을 형성하는 것을 방지할 목적으로, 미분화된 세포의 성장을 막기 위해 그러한 세포에 유전자를 도입하거나 또는 그 세포로부터 유전자를 제거할 수 있다. 예를 들어, MMTV와 같은 유도성 촉진인자를 세포에 도입한 다음, 미분화된 세포의 성장을 막고 분화를 유도하는 유전자의 발현을 촉진하는 덱사메타손으로 유도할 수 있다. 또는, 생식세포 특이적인 유전자에 대한 촉진인자를 도입해 세포 순환 봉쇄제 또는 세포사멸 유전자의 발현을 촉진할 수 있다.
분화된 전구세포를 만드는 바람직한 방법은 칼슘 이온투과담체를 사용한 수정되지 않은 제1 분열후의 이배체 난모세포의 활성화, 및 포배 유사 덩어리가 형성되는 단계로 배지 매질에서 그러한 활성화된 난모세포의 배양을 포함한다. 이어서, 투명대를 프로나제를 사용해 세포 덩어리로부터 제거한 다음, 외과적면역학에 의해 융모 세포를 제거한다. 세포 덩어리가 잔존하는 상태에서, 평판 접착 환경, 3D 접착 환경, 극미중력, 면역결핍 동물 또는 동형 또는 동종 동물에서 발생하는 형성 스템플라즘을 사용해 사이토킨의 존재 또는 부재 하에서 HS 세포의 응집체의 분화를 유도할 수 있다. 이어서, 분화된 전구세포를 분화된 세포 덩어리의 유도체로부터 제거할 수 있다.
전능세포가 분화될 수 있는 특정 종류의 세포/조직은 아래에서 기술된다. 그러나, 그러한 기술 내용은 예시적인 것이지 철저한 것은 아니다. 본 발명은 본 명세서에 열거된 기술 또는 아직 발견되지 않은 기술을 비롯해 당업계에 공지된 분화법을 사용해 실시할 수 있다.
내배엽세포형으로의 분화
전능세포의 각종 내배엽 세포형으로의 분화는 이식 목적, 또는 영양소의 흡수 및 처리에 있어, 또는 직접적인 패턴 형성에 큰 치료적 관련이 있다. HS 세포는 고용량의 RA, 또는 골형성 단백질 (BMP)-2를 비롯한 전환성장인자 β상과에 속하는 군으로 처리하여 내배엽 전구세포로 분화될 수 있다[Pera and Herzfeld, Reprod, Fert. Dev., 80:551-555(1998)]. 또한, 일부 HS 세포계는 헥사메틸렌 비스아세타미드(HMBA)에 의해 독특하고 명백히 비신경성인 방향으로 분화될 수 있다(Andrews, APMIS, 106:158-168(1998)). BMP-2를 사용해 벽(parietal) 또는 내장 내배엽으로의 분화를 특히 촉진시킬 수 있다(Rogers et al., Mol. Bio. Cell, 3:189-196(1992)). BMP는 연골 및 골의 생체내 성장을 유도할 수 있는 분자이지만, BMP 메시지는 또한 발육하는 심장, 모낭 및 중추신경계를 비롯해 많은 비골 조직에서 발현되며, 이는 세포 운명 및 분화에서의 중추적인 역할을 나타낸다.
상피조직으로의 분화
상피세포는 세포간 물질이 매우 적은 매우 응집된 다면세포로 구성된다. 상피세포의 형성 및 치수는 높은 원주형에서 입방형, 낮은 비늘형까지 다양하다. 상피세포의 핵은 형태적으로 구형에서, 신장된형, 타원형에 이르기까지 독특한 외관을 갖는다. 이들 세포간의 접착은 매우 강한 경향이 있다. 따라서, 신체의 표면을 덮고 그 동공들을 정렬하는 세포 시트가 형성된다. 이들 시트는 한 종류의 상피세포를 포함하는 단층, 또는 많은 상이한 종류의 상피세포를 포함하는 층화된 다층의 형태를 취할 수 있다.
상피세포의 기본 기능은 외피와 라이닝(예, 피부), 흡수(예. 내장), 분비(분비기관의 상피세포), 감지(신경상피) 및 수축(예, 근상피세포)를 포함한다. 각종 상피세포, 및 HS 세포를 각종 상피세포로 분화시키는 방법에 대한 예시적 논의가 후술된다.
(a) 각화성 상피세포
각화성 상피세포는 신체의 상피 및 피부층(예, 털, 피부, 손톱 등)에 주로 관련된다. 그 예로는 상피 및 손톱바닥의 각화세포(분화성 상피세포), 상피 및 손톱바닥의 기저세포(상피 줄기세포), 및 모간부(예, 골수, 피질 및 표피), 모근초(예, 표피, 헉슬리 및 헨리층 및 외용) 및 기질세포(머리카락 줄기세포)를 들 수 있지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
기저세포는 줄기세포처럼 작동하는 더욱 특화된 세포를 일으키는 상피시트 중 상대적으로 미분화된 세포이다. 피부의 편평 상피의 기저세포는 표피 및 조상(nail bed)의 각질세포를 일으킨다. 유사하게, 부고환(squamous)의 상피(흡수 상피세포, 이하에서 논의됨)도 부고환 주세포를 일으킨다. 후각 점막의 기저세포는 후각 및 버팀세포를 일으킨다. 따라서, 기저세포는 더욱 특화된 상피 세포의 선조 세포로서 역할을 한다.
본 발명의 단리된 HS 세포는 ES 세포, EC 세포, 다른 종류의 다기능성 또는 간세포, 및(또는) 기형암종 세포에 대해 당 분야에서 알려진 기술을 사용하여 적절한 선조 세포 또는 기저세포를 통해 또는 직접 성숙한 각질화 상피 세포로 분화될 수 있다. 예를 들면, 소포 줄기세포 특히 비포펜트(bipotent) 소포 팽출 간세포로 부터 소포 및 표피의 형성을 기술하고 있는 문헌[Taylor et al., Cell, 102:405-462(2000)]에 기재된 프로토콜 참조 (상기 문헌의 내용을 본원에서 참고문헌으로 포함함).
(b) 장벽 상피 세포
장벽 상피 세포는 습윤 층나뉨(stratified) 차단 상피 및 리닝(lining) 상피의 두개의 클래스로 나뉠 수 있다. 습윤 층나뉨 상피는 예를 들어 요상피(리닝 방광 및 요관)의 세포, 및 각막, 혀, 구강, 식도, 항문관, 먼쪽 요도 및 질(즉, 점막조직의 세포)의 층나뉨 편평상피의 기저 상피세포를 포함한다. 리닝 상피는 예를 들어 폐, 장, 외분비샘 및 요로를 리닝(lining)하는 세포 및 폐쇠된 내부 신체 공간을 리닝하는 세포를 포함한다.
관(vessel), 로(duct) 및 열린 공간(open cavity)을 리닝하는 상피 세표의 예는 이하를 포함하나 그에 한정되지 않는다: 유형 I 허파세포(폐의 공기 공간을 리닝함); 이자관 세포(샘꽈리중심세포); 땀샘, 침샘 및 젖샘의 층이 안나뉜 관(duct)세포; 사구체의 벽세포 및 발세포; 콩팥세관고리의 얇은 부분의 세포; 및 신장, 정낭, 고환 및 다른 선(gland)의 관세포.
폐쇄된 내부 신체 공간을 리닝하는 세포의 예는 이하를 포함하나 그에 한정되지 않는다: 혈관 및 림프관의 관내피세포(창문, 연속 및 지라); 만나는 공간을 리닝하는 윤활세포; 복막, 흉막 및 심장막 공간을 리닝하는 장막세포; 귀의 외림프공간을 리닝하는 세포; 귀편평세포의 엔노림파틱 공간을 리닝하는 세포; 맥락막 얼기 세포(뇌척수액 분비함); 연수막의 편평세포; 눈의 섬모상피세포; 및 각막세포.
본 발명의 단리된 HS 세포는 ES 세포, EC 세포, 다른 다기능성 또는 줄기세포, 및(또는) 기형암종을 분화시키는 것에 관한 당 분야에 알려진 기술을 사용하여 기저세포같은 적절한 선조 세포를 통해 또는 직접 성숙한 차단 상피 세포로 세포분화될 수 있다. 예를 들면, 림보코니알 상피세포의 분화단계 및 간세포의 리뷰를 제공하는 본원에서 참고문헌으로 포함된 문헌[Wolosin et. al., Progress in Retinal and Eye Research, 19(2): 223-255(2000)]을 참조.
(c) 외분비, 내분비, 및 기질 분비 상피세포
외분비선은 관(duct 또는 canal)를 통해 부피의 유리 표면으로또는 신체의 열린 공간, 예를 들면 소화관, 식도관 또는 생식기관의 유리 표면으로 생성물을 분비한다. 그들의 생성물은 혈관으로 방출되지 않는다.
외분비 생성물의 예는 이하를 포함한다: 점액 다당류 및 탄화수소류, 소화효소, 젖, 눈물, 왁스, 피지, 땀, 정액 및 질액.
외분비로 특화된 상피세포의 예는 이하를 포함하나 그에 한정되지 않는다: 침샘 세포 (점액 및 장액); 혀의 폰 에브너(von Ebner)의 샘의 세포; 유선의 세포; 눈물선의 세포; 귀의 귀지샘의 세포; 외분비 및 아포크린 땀샘의 세포; 눈꺼풀의 몰(Moll)선; 피지선의 세포; 코의 보우만(Bowman)의 선의 세포; 샘창자의 브루너(Brunner)의 선의 세포; 정낭선의 세포; 고환선의 세포 ; 리트레(Littre)의 선의 세포 ; 자궁 내막의 세포 ; 호흡 및 소화관의 분리된 술잔세포; 위 리닝의 점액세포; 위선의 효소원세포 및 산분비세포; 이자의 꽈리샘 세포; 작은 창자의 파네스(Paneth)세포; 및 폐의 클라라(Clara)세포 및 유형 II 허파꽈리세포.
본 발명의 단리된 HS 세포는 외분비 상피세포로 ES 세포, EC 세포, 다른 다기능성 또는 줄기세포, 및/또는 기형암종세포를 분화시키는 당 분야에 알려진 기술을 사용하여 적절한 선조 세포를 통해 또는 직접 분화될 수 있다. 그러한 기술을 본원에서 참고문헌으로 포함한다.
내분비선은 호르몬이라고 불리구은 그들의 생성물을 혈관으로 직접 분비한다. 호르몬은 신체를 거쳐 그들의 표적 영역으로 순환하고, 화학 전달자로서 활동하여 특이적인 신체 기능을 조절한다. 내분비선의 대부분은 또한 상피 유도체이다: 그들은 상피 시트로부터 함입시켜 형성되고, 상피 시트의 유리 표면에 그들을 연결시키는 관(duct)를 초기에 갖는다. 배 발생동안, 그들은 그들의 관을 잃어서, 관이 없는 선으로 불리운다. 그들의 분비 생성물은 세포사이의 사이질 공간에서 유리되고, 최근접의 모세관의 혈관으로 확산된다. 현미경하에서, 내분비선은 하나의 큰 차이를 갖는 임의의 층이진 상피 조직처럼 보인다: 그들은 유리 표면적을 갖지 않고, 다른 조직에 의해 직접 둘러싸인다.
내분비의 예는 이하를 포함한다: 옥토신, 바소프레신, 세로티닌, 엔도르핀스, 소마스타틴, 세크레틴, 콜레시스토키닌, 인슐린, 글루카곤, 봄베신, 칼시토닌, 에피네프린, 노레피네프린, 스테로이드, 및 다른 호르몬. 내분비로 특화된 내피세포의 예는 이하를 포함하나 이에 한정되지 않는다: 앞 및 뒤 뇌하수체의 세포; 장 및 기도의 세포; 갑상선 및 부갑상선의 세포; 부신선의 세포; 생식선의 세포; 및 신장의 토리곁장치의 세포.
본 발명의 단리된 HS 세포는 내분비 상피세포로 적절한 ES 세포, EC 세포, 다른 줄기세포 및/또는 기형암종을 분화시키는 당 분야에 알려진 기술을 사용하여 선조 세포를 통해 또는 직접 분화될 수 있다. 그러한 기술은 본원에 참고문헌으로 포함되어있다. 예를 들면, 그 전부가 참고문헌으로 포함된 문헌[Ramiya et al., Nature Medicine, 6 (3): 278-282 (2000)]은 이자 줄기세포로부터의 이자섬 세포의 시험관내 생성을 기술하고 있고, 여기서, IPSC(Islet producing stem cell (IPSC) 배지는 전당뇨병(prediabetic) 생취로부터 추출된 소화된 이자 조직으로부터 확립(establish)된다. 소도 프로게니터 세포(Islet progenitor cell)가 정상 생쥐 혈청을 포함하는 얼(Earl)의 고아미노산 미디움에서 배양된 상피 유사 IPSC의 단층으로부터 자랐다. Id . VEGF, 간세포 성장인자, 재생 유전자(regenerating gene)-1, 전환 성장인자 및 소도 신생 연관 단백질(islet neogenesis-associated protein) 역시 관상피세포(ductal epithelial cell)로 분열촉진되어 소도 내분비 세포로 자라는 것이 밝혀졌다. Id. 게다가, 간세포 성장인자, 베타-셀룰린 및 액티빈 A가 샘꽈리 세포(acinar cell)을 인슐린 분비 세포로 분화시키는 것이 보여졌다. Id. (또한, 그 내용이 본원에 참고문헌으로 포함된 문헌[Serup et al., Nature Genetics, 25: 134-135 (2000), Assady et al., Diabetes, 50: 1691-7 (2001), 및 Lumelsky et al., Science, 292 : 1389-93 (2001)]참조)
결합 조직의 주요한 요소는 단백질 섬유, 무정형 바탕질 및 조직 유체로 구성된 그의 세포외 기질(matrix)이다. 세포외 기질의 성분은 상피 조직 또는 결합조직 또는 둘다에 의해 분비된다. 세포외 기질 분비로 특화된 상피세포의 예는 이하를 포함하나 그에 한정되지 않는다: 사기질모세포(ameloblasts) (에나멜 분비함 ); 귀의 전정장치의 팔라눔 세밀루나툼 세포(planum semilunatum cell); 및 코르티(Corti)의 치간세포(interdental cell)이다.
본 발명의 단리된 HS 세포는 세포외 기질 분비 상피세포로 ES 세포, EC 세포, 다른 다기능성 또는 줄기세포, 및(또는) 기형암종 세포를 분화시키는 데 당 분야에 알려진 기술을 사용하여 적절한 선조 세포를 통해 또는 직접 분화될 수 있다.
(d) 상피 흡수 세포( Epithelial Absorptive Cell )
흡수에 관련된 상피 세포는 장, 외분비샘 및 비뇨생식관에서 발견된다. 그러한 상피 세포의 예는 이하를 포함하나 그에 한정되지 않는다: 창자의 솔가장자리 세포(brush border cell); 외분비선의 줄무늬 관세포(striated duct cell); 쓸개 상피세포; 신장의 근위세관(proximal tubule)의 솔가장자리 세포; 신장의 원위 세관 세포(distal tubule cell); 세관날(ductulus efferen)의 비섬모세포(nonciliated cell); 및 부고환(epididymal) 주요 및 기저 세포.
본 발명의 단리된 HS 세포는 흡수 상피세포로 ES 세포, EC 세포, 다른 다기능성 또는 줄기세포, 및(또는) 기형암종 세포를 분화시키는 데 당 분야에 알려진 기술을 사용하여 적절한 선조 세포를 통해 또는 직접 분화될 수 있다.
(e) 수축 상피 세포( Contractile Epithelial Cells )
근육상피세포는 분비 또는 관(ductal) 세포의 기저판과 기저폴(base pole)의 사이에 위치한 별(stellate) 또는 스핀들(spindle) 모양의 세포이다. 근육상피세포의 기능은 선(gland)의 분비 또는 컨덕팅 부분 주위를 수축시켜, 외부로 생성물을 분비하는 것을 추진하는 것을 도와주는 것이다.
본 발명의 단리된 HS 세포는 수축 상피세포로 ES 세포, EC 세포, 다른 다기능성 또는 줄기세포, 및(또는) 기형암종 세포를 분화시키는 데 당 분야에 알려진 기술을 사용하여 적절한 선조 세포를 통해 또는 직접 분화될 수 있다.
(f) 기타 여러가지 상피 세포
어떤 상피세포는 특히 단일 기능 또한 환경에 특화되고 상기의 어떠한 분류로도 들어갈 수 없다. 예를 들면, 앞 수정체(lens)의 상피 세포를 포함하는 수정체 세포 및 수정체 섬유 세포이다. 유사하게, 망막 색소 상피 세포를 포함하는 색소 세포 및 멜라닌 세포이다.
본 발명의 단리된 HS 세포는 특이적인 상피세포로 ES 세포, EC 세포, 다른 다기능성 또는 줄기세포, 및(또는) 기형암종 세포를 분화시키는 데 당 분야에 알려진 기술을 사용하여 적절한 선조 세포를 통해 또는 직접 분화될 수 있다.
결합 조직으로의 분화
결합조직은 그 세포에 의해 생성되는 세포간 물질이 많은 것을 특징으로 한다. 결합조직은 신체에서 형태를 제공하고, 유지하는 것을 책임진다. 역학적인 역할을 하며, 세포 및 장기를 연결하고 묶는 기능을 하고, 결국 신체를 지지하는기질(matrix)를 제공한다.
결합 조직의 일부 세포, 예를 들면 골세포, 섬유모세포 및 지방조직은 국지적으로 생성되고 그곳에 남는다. 다른 곳으로 오는 다른 세포는 순환하고 결합조직에 일시적으로 머무른다. 결합 조직의 세포 성분은 이하의 클래스로 세분할 수 있다: 세포외기질 분비 세포; 대사 및 저장에 특화된 세포; 및 혈액 및 면역계의 순환 세포.
결합 조직의 이러한 클래스에 대한 자세한 논의는 이하에서 제공된다.
(a) 세포외 기질 분비 세포
세포외 기질 분비의 예는 이하를 포함하나 그에 한정되지 않는다: 섬유모세포; 모세관의 혈관주위세포(pericyte); 추간판의 풀포수스(pulposus) 세포; 시멘트질모세포 및 시멘트질세포 (치아 뿌리의 뼈와 유사한 시멘트질을 분비함); 상아질 모세포 및 상아질세포(상아질을 분비함); 연골세포 (연골(cartilage)을 분비함); 골모세포 및 골세포; 오스테오프로게니터(osteoprogenitor) 세포 (오스테오모블라스트(osteoblast) 줄기세포); 눈의 유리체의 유리체세포(hyalocyte); 및 귀의 바깥 림프(perilymphatic)공간의 별세포(stellate cell).
본 발명의 단리된 HS 세포는 세포외 기질 분비 세포로 ES 세포, EC 세포, 다른 다기능성 또는 줄기세포, 및(또는) 기형암종 세포를 분화시키는 데 당 분야에 알려진 기술을 사용하여 적절한 선조 세포를 통해 또는 직접 분화될 수 있다.
(b) 대사 및 저장을 위해 특화된 세포
대사 및 저장을 위해 특화된 세포의 예는 간세포 및 지방세포를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
ES 세포, EC 세포, 다른 종류의 다능성 또는 간세포 및(또는) 기형암 세포의 분화에 대해 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 본 발명의 단리된 HS 세포를 직접 또는 적당한 전구 세포를 경유하여 대사 및 저장을 위해 특화된 세포로 분화시킬 수 있다.
한 양태에서, HS 세포를, 예를 들어 다니(Dani, Cells Tissues Organs, 165: 173-180(1999))의 방법으로 지방세포로 분화 유도한다. HS 세포의 시험관내 지방세포로의 분화 능력은 지방형성에 있어서 초기 분화를 연구하고, 간엽 간세포의 지방모세포 직계로의 위임에 관여된 조절 유전자의 동정을 위한 유망한 모델을 제공한다.
HS 세포의 지방세포 직계로의 위임을 위한 전제조건은 분화의 초기 단계에 있는 HS 세포-유도된, 유배아체를 레티노산(RA)으로 단기간 처리하는 것이다. ES 세포로부터 지방형성의 발달에서 2개의 상이 구별된다. 유배아체(EB) 형성후 2일과 5일 사이인 제1 상은 all-trans-RA에 의해 영향을 받는 HS 세포의 위임에 대한 허용기에 상응한다. 제2 상은 종말 분화에 대한 허용기에 상응하고, 전구지방 클론주로부터 세포의 분화에서 이미 밝혀진 바와 같은 지방형성 호르몬을 필요로 한다. RA 처리 부재시의 2-5%에 비교하여, 처리는 지방 세포를 함유하는 증식물 50-70%를 야기한다.
RA는 종말 분화에 중요한 것으로 알려진 호르몬 또는 화합물로 대체될 수 없다. 초기 EB를 인슐린, 트리요오도티로닌, 덱사메타손 또는 PPARs의 강력한 활성화제(예, 티아졸리딘디온 BRL49653) 및 비대사성 지방산 2-브로모팔미테이트로 단독 또는 조합하여 처리시, 낮은 수준의 지방형성(5%)이 초래된다. 종말 지방세포 분화를 조절하는 것으로 이미 보고된 인자 중에서, RA가 HS 세포로부터 지방 세포의 발달을 촉진할 수 있는 유일한 천연 화합물일 수 있다.
에너지 공급원으로서 지방세포의 주 기능은 트리글리세리드를 저장(지질형성 활성)하고, 호르몬성 조건에서 유리 지방산을 방출(지질분해 활성)하는 것이다. EB 유도된 지방세포가 각각 인슐린 및 β-아드레날린성 효현제에 반응하여 지질형성 및 지질분해 활성 모두를 나타고, 이는 HS 세포로부터 성숙 및 기능성 지방세포가 시험관내 형성된다는 것을 나타낸다.
PPARs(PPARδ 및 PPARγ) 및 C/EBPδ (C/EBPβ, C/EBPδ 및 C/EBPα)는 지질 대사에 관여된 유전자를 조절하는 핵 인자이다. C/EBPα가 지방세포 분화된 표현형을 유지하는데 중요한 것으로 보이나, 몇몇 증거는 PPARγ, C/EBPβ및 C/EBPδ가 전구지방세포의 지방세포로의 종말 분화를 촉진한다는 것을 나타낸다. 간세포의 지방세포 직계로의 위임에 있어서 상기 인자들의 역할을, HS 세포의 결정 및 분화기 동안 이들의 발현을 연구하여 기술한다. PPARγ및 C/EBPβ의 발현은 결정기 동안 낮고, 종말 분화의 표지인 지방세포-유리산 결합 단백질(a-F ABP)의 발현에 평행한다. 상기 결과는 PPARγ및 C/EBPβ가 HS 세포의 지방세포 직계로의 위임에 있어서 조절 유전자가 아니라는 것을 암시한다. PPARδ유전자 발현이 랫트 유배아 발달 동안 초기에 검출되고, PPARγ의 발현에 선행한다는 것이 이미 보고되었다. 발달 EBs에서 동일한 일시적 발현 패턴이 보존된다. PPARγ와 달리, PPARδ는 HS 세포의 결정기 동안 강하게 발현되고, 이 인자가 간엽 선조 세포의 지방세포 직계로의 위임에 관여된 마스터 유전자로서 우수한 후보자일 수 있다는 것을 암시한다. 그러나, PPARδ유전자의 발현은 지방 조직에 국한되는 것이 아니고, 이의 발현은 HS 세포의 지방형성을 유도하는데 요구되는 처리에 의해 변화되지 않는다. 지방산 2-브로모팔미테이트 또는 카르보시클린과 같은 PPARδ의 강력한 활성화제에 의한 초기 EBs의 자극은 지방형성 경로에 있어 EBs의 분화를 촉진할 수 없다.
PPARδ및(또는) PPARγ가 결핍된 HS 세포의 생성은 지방형성의 여러 단계 동안 이들 전사 인자의 역할의 설명을 촉진할 것이다. 2 라운드의 동종 재조합을 경유한 유전자 표적화로 상기 돌연변이 HS 세포를 생성한다. 유전자 트랩핑 및 기능의 득실과 같은 미분화 HS 세포의 유전자 조작과 결합된 분화 배양 시스템은 지방형성의 초기 결정에 관여된 신규 조절 유전자를 동정하는 수단을 제공할 것이다.
게다가, 백혈병 억제 인자(LIF) 및 LIF 수용체(LIF-R) 유전자가 전구지방세포의 지방세포로의 분화 동안 발달상 조절된다. 지방세포 분화의 제1 단계 동안 LIF 및 LIF-R 둘 모두가 발현된다는 사실은 이 경로가 지방형성에 조절적 역할을 한다는 것을 암시한다. LIFR/HS 세포가 지방세포로 분화할 수 있는지 연구하여 LIF의 역할을 기술한다. LIF-null ES 세포가 야생형 세포에 필적하는 효율로 지방을 형성한다는 것이 알려져 있고, 이는 LIF 발현의 부재가 지방 조직의 발달을 저지하지 않는다는 것을 나타내는 LIF 돌연변이 마우스 연구와 일치한다. LIF는 IL-6 사이토킨 패밀리에 속하고, 이 패밀리원의 특징이 생물학적 기능의 중복성이다.
따라서, LIF-관련된 사이토킨이 생체내 및 시험관내 모두에서 LIF의 결핍을 보상할 수 있을 것이라고 가정할 수 있다. 따라서, 지방형성 동안 LIF-R의 역할을 조사한다. 그러나, LIFR/HS 세포의 형성시, LIF-R null HS 세포의 지방세포로의 분화 능력이 현저히 감소된다. 야생형 HS 세포로부터 유도된 증식물의 55-70%에 비교하여, 돌연변이 세포로부터 유도된 5-7% 증식물만이 지방세포 콜로니를 함유하였다. 배양 조건과 결합된 유전적으로 변형된 HS 세포를 사용하여 간세포를 지방 형성 경로로 위임하는 것은 지방 세포의 발달에 있어서 LIF-R의 역할을 결정하는 것을 촉진한다.
다른 양태에서, 본원에 참고문헌으로 인용된 하마자끼 등(Hamazaki 등, FEBS Letters, 497:15-19 (2001))의 방법을 사용하여 본 발명의 HS 세포를 간세포로 분화시킬 수 있다.
(c) 혈액 및 면역계의 순환 세포
혈액 및 면역계 세포의 예는 적혈구, 거대핵세포, 대식세포(예, 단핵구, 파골세포, 란게르한스 세포, 수지상 세포 및 소교세포), 호중구, 호산구, 호염구, 비만 세포, 살세포, T 림프구(예, 보조 T 세포, 억제 T 세포, 살 T 세포) 및 B 림프구(예, IgM, IgG, IgA, IgE, 살세포)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
ES 세포, EC 세포, 다른 종류의 다능성 또는 간세포 및(또는) 기형암 세포의 분화에 대해 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 본 발명의 단리된 HS 세포를 직접, 또는 조혈 간세포와 같은 적당한 전구 세포를 경유하여 혈액 및 면역계의 순환 세포로 분화시킬 수 있다. 스즈끼 등(Suzuki 등, Int'l J. of Hematology, 73:1-5 (2001)) 및 조 등(Cho 등, PNAS, 96:9797-9802 (1999))에 의해 기술된 것을 포함하여, 상기 방법을 본원에 참고로 인용한다.
한 양태에서, HS 세포를 조혈 직계를 형성하도록 유도한다. ES 세포의 시험관내 분화 후 전부는 아니더라도, 대부분의 조혈 직계를 생성할 수 있다(Hole, Cells Tissues Organs, 165:181-189 (1999)). 백혈병 억제 인자(LIF)의 퇴출 후 HS 세포가 유사하게 분화하기 시작할 것이나, 상기 분화 동안 다능성 세포형의 배 양 조건이 후속적으로 생성되는 세포 직계의 성질에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 적어도 3개의 방법이 사용될 것이다: (1) HS 세포를 응집시키고, 현탁 배양으로 분화시킬 수 있고, (2) HS 세포를 반고형 배지에 시딩하고, 제자리 분화시킬 수 있고, (3) HS 세포를 부속 세포형의 존재 하에 분화시킬 수 있다.
현탁 배양은 ES 세포의 시험관내 분화에 대한 최초 보고서 중 일부를 기초로 하여 사용된다. 도에크만 등(Doetschman 등, Embryol Exp Morphol., 87:27-45 (1985))은 LIF의 퇴출 후 ES 세포로부터 낭성 유배아체의 형성 및 현탁 배양에서의 성장을 보고하였다. 상기 유배아체는 적혈구 및 대식세포로 구성된 혈액섬(난황낭 조혈의 기억)을 함유하였다. 반고형 배지에서의 분화는 몇몇 그룹에 의한 호중구, 비만 세포, 대식 세포 및 적혈구 직계의 생성에 대한 증명(Wiles 및 Keller, Development, 111:259-267 (1991); Keller 등, Mol. Cell Biol. 13:473-486 (1993a); Lieschke 및 Dunn, Exp. Hematol., 23:328-334 (1995))에 기초하여 사용된다. 순차적으로 적혈구, 골수세포, 림프구 직계의 존재를 나타내고(Nakano 등, Science, 265:1098-1101 (1994)), 후자는 자연 살세포형을 포함(Nakayama 등, Blood, 91:2283-2295 (1998))하는 것으로 증명된 OP9와 같은 부속 세포주의 사용이 고려된다.
HS 세포는 시험관내 분화 동안 전부는 아니더라도, 대부분의 조혈 직계를 형성하는 가능성을 실현할 수 있으나, 이들이 자발적으로 그렇게 할 것인지에 대해서는 명확하지 않다. ES 세포에 있어서, 몇몇 그룹이 부가의 조혈 성장 인자에 대한 요건을 보고하였다. 나까노 등(Nakano 등, Science, 265:1098-1101 (1994))의 연 구는 대식세포 콜로니 자극 인자-결핍 세포주 OP9의 사용이 포괄적인 조혈 분화를 촉진하는데 중요하다는 것을 암시한다. RP010 간질세포주를 사용하는 연구자들에 의해 간질세포에 대한 요구도 지적되었다(이 경우에, 외인성 성장 인자도 사용되었다). 반대로, 다른 그룹은 골수세포, 적혈구 또는 림프구 직계로의 위임이 외인성 세포주 또는 성장 인자를 요구하는 것으로 보이지 않는다고 보고하였다(Hole 등, Blood 90:1266-1276 (1996a)).
ES 세포에 있어서, 조혈 분화 결과에서의 명백한 차이는 상기 그룹에 의한 몇몇 상이한 방법에 기인할 수 있다. 일부는 낮은 수준의 특정 직계 위임을 증폭시킬 수 있는 외인성 사이토킨을 사용하였다. 실제로, 분화 ES 세포 자체가 위임에 영향을 미칠 수 있는 광범위한 조혈 사이토킨(Hole 등, Blood 90:1266-1276 (1996a); Hole 등, Gene Technology, Berlin, Springer, pp 3-10 (1996b)) 및 인자(Keller 등, Mol. Cell. Biol., 13:473-486 (1993b))의 전사물을 함유한다는 것이 명백하다.
시험관내 HS 세포 분화 후 림프구 선조 세포가 생성되고 단리될 수 있다. 림프구 분획이 유전적 병변에 의해 손상된 마우스로의 입양 전달은 장기 및 단기에 걸쳐 ES 세포-유도된 림프구 재증식을 야기한다(Potocnik 등, Immunol. Lett., 57:131-137 (1997)). 초기 보고서는 ES 세포-유도된 조혈 선조 세포의 재증식능이 림프계에 국한될 수 있다는 것을 암시하나, 추가의 연구는 ES 세포-유도된 세포가 장기, 다직계, 조혈 재증식 가능성을 증명할 수 있다는 것을 보여준다(Palacios 등, Natl. Acad. Sci. USA, 92:7530-7534 (1995); Hole 등, Blood 90:1266-1276 (1996a)).
장기간 재증식하는 조혈 간세포는 시험관내에서 ES 세포의 분화에 따라 확인될 수 있다. 이 분화의 시간에 따른 경과의 특성을 확인함으로써, ES 세포는 조혈 간세포가 별개의 세포 유형으로 처음 나타나는 단계에서 유전자의 분화 발현을 검증하는데 사용될 수 있다. 조혈 간세포는 비교적 짧은 분화의 기간에 존재한다: 다계열 재증식 활성은 분화의 제4일에 존재하지만 제3일 또는 제5일에서는 발견되지 않는다 (Hole et al., Blood, 90: 1266-1276 (1996a)). 공지의 조혈 유전자의 발현은 조혈 분화에서 이 기간의 중요성을 강화하고; 이 기간 중 발현은 현저하게 상향 조절된다 (Hole et al., Blood, 90:1266-1276 (1996a); Hole and Graham, Battieres Clin. Hematol., 3:467-483 (1997)). 감쇄 혼성화 (subtractive hybridizaton) 접근을 사용하여 문헌 [Hole and Graham, Battieres Clin. Hematol., 3:467-483 (1997)]에서는 이 시험관내 분화 모델이 조혈 유전자의 풍부한 공급원이라는 것을 증명하였고; 확인된 신규 유전자 중 둘 이상이 초기 조혈 커미트먼트 (commitment)에 일치하는 방식으로 배자발생 및 조혈 세포주에서 발현된다는 것을 증명하였다.
초기 조혈 커미트먼트에 관여할 가능성이 있는 유전자를 확인하기 위하여 유전자 트래핑을 사용할 수 있다. 이 전략에서, 유전자는 HS 세포의 게놈으로 약물 내성을 부여하는 발현 구성물과 종종 결합되는 리포터 구성물을 삽입함으로써 무작위로 돌연변이화된다. 통상적으로, "트랩"된 유전자의 발현 프로파일은 키메라 동물의 생산 후에 관찰되고; 그 후 후보 유전자는 서열화에 의해 확인될 수 있다. 대체 가능한 접근 방법은 예비 스크리닝으로 TS 세포의 시험관내 분화를 사용하는 것이다. 시험관내 ES 세포 조혈 분화의 OP-9-의존적 모델을 사용하여, 조혈 및 상피 세포의 발현 트래핑이 증명되었다 (Stanford et al., Blood 92:4622-4631 (1998)).
추가적 실시 양태에서, HS 세포는 림프구로 분화 유도된다. 초 (Cho) 등에 의해 제공된 이 방법을 사용하는 예시적 프로토콜은 다음과 같고, 초 등은 ES 세포가 성숙 Ig-분비 B 림프구로 분화시키기 위한 효율적 시스템을 확립하였다 (Cho et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA. 96:9797-9802 (1999)).
BM-간질 세포주인 OP9을 2.2 g/l 중탄산나트륨 및 20% FCS (ES 등급 및 시험된 로트; Cyclone, Logan, UT)가 보충된 αMEM에서 단층으로 배양하였다. HS 세포를 1 ng/ml 백혈병 억제 인자 (R&D Systems, Minneapolis, MN)를 포함하는 미토마이신 C-처리된 배아 섬유아세포의 컨플루언트한 단층 상에서 배양하였다. HS 및 배아 섬유아세포를 15% FCS, 2mM 글루타민, 110 ㎍/ml 소듐 피루베이트, 50 μM2-머캅토에탄올 및 10 mM HEPES (pH 7.4)를 보충한 DMEM 중에 유지하였다. 모든 공동-배양은 37℃에서 공기 중 5% CO2를 함유하는 조습된 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 주기적 시험으로 모든 세포주가 마이코플라스마가 없는 배양으로 유지되는 것을 확인하였다.
조혈 유도를 위하여, HS 세포의 단일 세포 현탁액을 6-웰 플레이트 내의 컨플루언트한 OP9 단층 상에 접종하였다. 제3일에 배지를 갈고, 제5일까지, 거의 100%의 TS 콜로니가 중배엽 유사 콜로니로 분화하였다. 제5일에 공동배양을 트립신 처리하고 (0.25%; GIBCO/BRL); 단일-세포 현탁액을 30 분 동안 미리 플레이팅하고; 부착되지 않은 세포 (1 내지 2 x 106)를 10 cm 디쉬 내의 새로운 컨플루언트 OP9 층 상에 재접종하였다. 제6일 또는 7일에 조혈세포 유사, 매끄럽고 둥근 세포의 군락이 나타나기 시작했다. 제8일에, 느슨하게 부착된 세포를 부드럽게 씻어내고 새로운 OP9 층에 위치시켰다 (트립신 없이). 이 처리는 조혈 능력이 있는 세포를 농축시키고, 분화된 중배엽 및 미분화된 HS 콜로니를 남긴다.
이 계대 후, 조혈세포 콜로니는 제10일 및 12일 사이 및 그 후에 현저한 증식으로 증대되었다. 제19일에, HS/OP9 공동배양으로부터 회수된 CD45+ 세포의 총 수는 약 105 세포였고-Flt-3L은 5-20 mg/ml의 최종 농도로 사용되었다 (R&D 시스템). 세포를 제5일로부터 외인성 Flt-3L의 존재 하에 배양하였다. 제 5일에 Flt-3L의 첨가는 B 림프구생성의 증대에 대한 일시적 창을 나타내는 것으로 보이는데, 이는 Flt-3L이 더 늦은 시간에 (제8일 또는 그 이후) 첨가될 때 증대가 관찰되기 때문이다. 제8일과 15일 사이에 배지를 갈고(갈거나) 트립신 없이 세포를 계대배양시켰다 [즉, 세포를 단일-세포 현탁액으로 만들거나 여과한다 (70 ㎛)].
slgM-B 세포를 생산하기 위하여, 림프구생성-조혈 세포를 제15일에 수거하고, 새로운 OP9 단층에 재플레이팅하였다. 제28일에, 세포를 리포다당류 (LPS) 10 ㎍/ml로 4 일 동안 자극하였다. 그 후 유세포 분석 및 ELISA 분석을 위하여 각각 세포 및 배양 상청액을 수거하였다. 별도의 실험에서, 세포를 LPS (100 ㎍/ml)로 48 시간 동안 자극하고, CD80 (B7-1)의 상향 조절에 대해 분석하였다.
형질전환된 세포주를 생성시키기 위하여, IL-7 (5 ng/ml)(R&D 시스템)을 제8일에 Flt-3L-함유 TS/OP9 공동 배양에 첨가하여 미성숙 프리-B 세포를 유지하고- 공동-배양을 제4일의 생산 세포주의 컨플루언트 플레이트로부터 수거된 바이러스 스톡을 첨가함으로써 감염시켰다. 4 ㎍/ml의 폴리브렌 (Sigma) 및 IL-7을 함유하는 3 ml의 바이러스 스톡으로 배지를 교환함으로써 10 cm 디쉬로부터의 공동-배양을 감염시켰다. 플레이트를 37℃에서 2 내지 4 시간 동안 주기적으로 흔들어 주었다. 이 기간 후, IL-7을 함유하는 5 ml의 신선한 OP9 배지를 플레이트에 첨가하였다. 배지를 IL-7을 포함하지만 Flt-3L을 포함하지 않는 배지로 5 일 후 교환하였다. 추후의 배지 교환은 IL-7을 포함하지 않았다. 유세포 분석에 의해 모든 형질전환된 세포주가 동일한 표현형을 갖는다는 것이 나타났다. 각 실험에서 현저한 수의 CD45R+ CD24+ IgMe 미성숙 프리-B 세포가 존재하였다. 감염된 세포를 대량으로 증식시킨 후, 제한 희석 (limiting dilution)에 의해 클로닝하였다. 바이러스 게놈의 혼입된 카피의 존재를 서던 블롯 분석으로 확인하였다.
HS/OP9 공동 배양의 개시 후 상이한 시간에서 수거된 세포의 유세포 분석에 의해 CD45+ 세포가 공동 배양의 제5일에 처음 관찰되는 것으로 나타났다. 제8일에 CD45+ 세포는 그 표면에 CD117 및 Sca-1도 발현하고, 따라서 초기 조혈 간세포의 표현형과 유사한 표현형을 나타내었다. 공동 배양 시스템에서 발생하는 초기 조혈의 상당 부분은 TER-119에 양성으로 염색되는 다수 분획의 CD24+ 세포에 의해 명백히 알 수 있듯이 적혈구 계열의 세포를 발생시킨다 (제8일 및 12일). 공동배양된 제12일의 세포의 대다수가 적혈구 계열 (CD24hi CD45- TER-119∼)에 속하지만, CD45+ 세포는 낮은 수준에서 높은 수준에 이르는 CD45R을 발현한다. 이 표현형은 B 계열 세포가 제8일과 12일 사이에 공동 배양으로부터 나타난다는 것을 나타낸다. 이 B 계열 표현형이 제12일까지 확실히 나타나지만, 장기간 배양 (20일 초과)에서는 CD19+IgM B 세포가 거의 생성되지 않는다.
조혈 세포가 처음 관찰되었을 때 Flt-3L을 제5일의 TS/OP9 공동 배양에 첨가하였다. 제19일의 공동 배양의 분석에 의해 Flt-3L의 첨가가 HS/OP9 공동 배양으로부터 B 림프구의 생성을 현저히 증가시킨다는 것이 밝혀졌다 (60∼/o vs. 6% CD45R+ 세포, 각각 Flt-3L 첨가 및 무첨가). 따라서, 제5일에 HS/OP9 공동 배양에 Flt-3L을 첨가하면 그 후 B 계열 세포의 회수를 약 10 배까지 증가시켰다. 특히, 골수, CD 11b+ (Mac-1), 및 적혈구, TER-119, 세포의 빈도는 Flt-3L-처리 배양에서 감소하였다. T 림프구 분화에 대한 증거는 이 배양에서 관찰되지 않았다. 제19일의 HS/OP9 공동 배양 세포의 표현형은 Flt-3L의 첨가가 총 세포 수의 증가는 적은 것으로 관찰되지만(∼30%) CD19. CD45R-AA4.1-CD24+IgM∼ 세포의 생성을 특이적으로 증가시킨다는 것을 나타낸다. 제5일에 Flt-3L의 첨가에 의해 HS/OP9 공동 배양 시스템에서 B 림프구생성이 높은 효율로 발생하였다.
추후 수거된 Flt-3L을 포함하는 HS/OP9 공동배양의 분석에 의해 B-계통 마커에 양성인 세포의 비율이 크게 증가하는 것으로 나타났다. 4 주간의 배양 기간 후, 공동 배양에서 거의 모든 (>90%) 세포가 B 계열 CD45R+ CD19+ 림프구였다. 이 HS-유래 B 림프구는 CD 11b+ 표현형 및 작은 서브세트 (2 내지 3%)의 CD5+ B 세포를 나타내었고, 이는 CD5+ B 세포가 HS/OP9 공동 배양에서 쉽게 생성되지 않음을 암시한다.
시험관내 생성된 B-세포의 기능적 능력을 더 입증하기 위하여, 제28일의 공동배양을 LPS로 처리하였는데, 그 후 성숙 표면 IgM∼CD 19+ B 세포가 그 수가 증가하고 광범위하게 증식하였다. 미토겐 활성화 후, 보통 활성화 후 성숙 B 세포 상에서 상향조절하는 공동 자극 분자인 CD80 (B7-1)의 발현을 발견하였다. 또한, LPS로 자극된 세포로부터의 배양 상청액은 119∼의 존재에 대해 (ELISA 분석에 의해) 양성으로 반응하고, 이는 이 세포들이 강한 수준의 Ig 분비가 가능하다는 것을 나타낸다. 이러한 발견은 시험관 내에서 HS 세포가 성숙 미토겐-반응성 Ig-분비 B 세포로 분화되는 것에 대한 증거가 된다.
HS/OP9 공동 배양 시스템에 외인성 Flt-3L를 첨가하는 것은 시험관 내에서 HS 세포로부터 성숙, 기능성 B 림프구를 생산하기 위한 효율적이고 실제적인 모델 시스템의 개발에 주요한 요소인 것으로 밝혀졌다. 다양한 발견에 의해 Flt-3L이 시험관 내에서 초기 B 림프구생성에 중요한 인자라는 견해가 뒷받침된다. 또한, 다양한 실험 결과에 의해 Flt-3L이 HS/OP9 공동배양에 첨가되는 방식이 B 림프구의 생성을 촉진한다는 것이 밝혀졌다. 생체내에서 B 세포 분화 중 발생하는 유세포 분석 단계. HS-유래 B 세포가 정상 발생 단계를 따르고 생체내에서 선조 세포 및 성숙 B 세포와 기능적으로 유사하다는 사실은 이 시스템이 B 세포 분화에서 현저한 것으로 나타날 것이라는 결론에 이르게 한다.
유전적으로 변형된 HS 세포로부터 전적으로 시험관 내에서 형질전환되고 분화된 안정한 세포주를 얻을 수 있게 됨으로써 다른 응용도 가능해진다. 형질전환체는 생산하고 유지하기가 쉽고 빠른 배증 시간을 가지기 때문에, 세포주의 유도는 계통-특이적 유전자-표적화 돌연변이를 연구하는데 있어서 또하나의 가능한 접근 수단이 될 것이다. 예를 들면, V(D)J 재조합에 관여된 어떤 유전자에서 무효 (null) 돌연변이가 평가될 수 있다.
본 발명은 시험관 내에서 HS 세포로부터 직접 인간 B 세포 선조 세포 및(또는) B 림프구의 생성을 위한 시스템을 고안한 것이다. 이러한 시스템은 무감마글로불린혈증 또는 특정 B 세포 기능장애를 앓는 개체에 대한 치료로 응용되는 유전적으로 정의된 HS 세포-유래 B 세포의 무한한 공급원을 제공할 것이다.
근육 조직으로의 분화
근육 조직은 수축 또는 추진의 분화된 기능을 갖는 신장된 세포로 구성된다 (예를 들면, 섬모 세포).
수축 세포의 예는 골결근 세포 (적색, 백색, 중간, 방추 및 위성 세포); 심근 (보통, 결절세포 및 푸르킨예 섬유); 및 평활근을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
위성 세포는 골격근의 재생에 관여된 근육 간세포이다. 이 세포는 각 성숙 근육 섬유를 둘러싸는 기저판 내에 있는 단핵의 방추형 세포이다. 이들은 근육 분 화 후 잔존하는 불활성 근모세포로 여겨진다. 그러나, 적절한 자극 후, 보통은 활동하지 않던 이 세포는 활성화고 증식하여 새로운 골격근 섬유를 형성한다.
근모세포는 결국 골격근 섬유로 발전되는 근관을 생성시키기 위하여 함께 융합할 수 있는 유사분열후 세포이다. 따라서, 근모세포는 골격근 섬유의 직접적 선조 세포로서 알려졌다.
본 발명의 단리된 HS 세포를 ES 세포, EC 세포, 다른 종류의 다능성 또는 간세포 및(또는) 기형암종 세포로 분화시키 것에 대한 공지 기술을 이용하여 수축 근육 세포로 직접 또는 위성 세포 또는 근모세포와 같은 적절한 선조 세포를 거쳐서 분화되었다. 이러한 기술은 문헌[McKarney et al, Int J. Dev. Biol. 41(3):385-90(1997)] 및 문헌[Gussoni et al., Nature 401(6751): 390-4(1999)]에 기술된 것들과 같은 과정을 포함하고, 이들 문헌은 본원에 인용문헌으로 삽입되었다. 맥카니(McKarney) 등은 배아간세포 분화에 대한 미오게닉 조절 인자(myf5, 미오게닌, MyoD1 및 myf6)의 효과를 기술하였다. 구소니(Gussoni) 등은 정상 조혈간세포를 방사선 동물로의 전달하여 이식 수용체의 조혈 구역의 재구축을 제공하는 것에 관해 기술하였다.
추진 작용을 갖는 섬모 세포의 예는 호흡기 관의 섬모 세포; 난관 및 자궁내막의 섬모 세포; 고환 그물 및 고환날세관의 섬모 세포; 및 중추신경계 섬모 세포를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다.
또한, 지방 세포 및 골격 근세포는 동일한 중간엽 간세포 선조 세포로 부터 얻어진다고 여겨지고, 생체내에서 골격근육 및 지방 발생 프로그램은 상호 배타적 이라고 제안된다. 생체내에서는, 골격근 및 지방 조직간에는 종종 상관 관계가 있다. 지방 세포계에 대조적으로 골격근세포계가 나타난다. RA의 HS의 세포 농도(10-8 M)의 분화동안 자발적으로 저성장 처리된 단일 EB는 이어서 지방세포 및 골격근세포를 모두 유발할 수 있다(a-FABP 및 미오게닌 유전자의 발현에 각각 따름). 그러나, RA의 농도가 증가됨에 따라, 분화 프로그램의 진행에 변화가 발생한다. RA 농도가 10-8 M보다 높은 경우, 미오게닌의 발현은 억제되고, a-F ABP의 발현이 증가된다.
a-F ABP 및 미오게닌 유전자의 발현은 현미경 관찰에 의해 측정된 지방세포 및 근세포의 발생과 병렬적이다. 주로 에센시말(esenchymal) 세포에 의해 주로 발현되는 A2COL6 유전자의 발현이 변형되지 않았고, 이는 RA에 의한 초기 EB의 전처리는 HS 세포의 발생 프로그램에서 일반화된 변화를 유도하지 않는다는 것을 제안한다. 근세포발생의 지방세포발생으로의 변화는 농도-의존 방식으로 RA에 의해 유도될 수 있다. 골격근세포 발생의 초기 유전자 표지, 예를 들어, Myf 5 내지 MyoD의 발현 연구는 근모세포 선조 세포의 발생을 방해하는 단계를 알아야 하는 것이 요구됨에도 불구하고, 이들 결과는 HS 세포를 지방 세포계로 코미트먼트를 위한 허용기간이 또한 근세포계에 결정적인 것이라는 결론을 유도한다. 생채내 HS 세포 발생의 분화는 지방세포 또는 근세포 발생 경로를 따르는 간세포의 결정과 관련된 인자들의 특성화를 유도할 수 있다.
본 발명의 단리된 HS 세포 및 기원 세포는 또한 문헌[Kehat et al., J. Clin. Invest., 108:407-414 (2001)] 및 문헌[Muller et al., The FASEB Journal, 14: 2540-2548 (2000)]과 같은 공지 기술을 이용하여 심근세포로 분화됨을 유도할 수 있고, 이들 문헌들은 본원에 인용 문헌으로 삽입되었다.
신경 조직의 분화
신경 및 감각 조직은 신경 충격의 수신, 생성 및 전달의 특성화된 작용을 갖는 세포체로부터 나타나는 신장된 과정을 갖는 세포로 구성된다. 신경 및 감각 조직의 세포는 다음의 4개의 군으로 나누어진다: 자율신경세포; 신경세포 및 아교세포; 감각기관의 지지세포 및 말초 신경세포; 및 감각 전달세포. 다양한 부류의 신경 및 감각 세포의 예시적인 논의가 하기에 제공된다.
본 발명의 단리 HS 세포 및 기원 세포를 문헌[Guan et al., Cell Tissue Res, 305: 171-176 (2001), Przyborski et al., Eur. J. of Neuroscience, 12: 3521-28 (2000)], 문헌[Brustle et al., Science, 285: 754-6 (1999), Hancock et al., Biochem. & Biophys. Res. Comm., 271: 418-421 (2000)], 문헌[Liu et al., PNAS, 97 (11): 6126-31 (2000)] 및 문헌[Fairchild et al., Curr. Bio., 10 (23): 1515-18 (2000)]을 포함하는 공지 기술을 이용하여 다양한 종류의 신경 조직으로의 분화를 유도할 수 있고, 이들 문헌은 본원에 인용 문헌으로 삽입되었다.
(a) 레티노인산에 의해 호메오 ( homeobox ) 유전자의 분화된 활성
드로소필라(Drosophila) 및 베테브레이트(vertebrate) 배자 발생에서 위치 정보를 특정하는 호메오박스 유전자는 천연 모르포겐인 RA에 반응한다. 인간 HS 세포에서는 RA가 HOX 1,2,3 및 4로 알려진 인간 안테나피디아(Antennapedia)-유사 호메오박스 유전자의 4개의 클러스터(cluster) 모두의 발현을 특이적으로 활성화시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 HOV 2 유전자가 농도-의존 방식으로 및 클러스터 중의 3' 내지 5' 배열과 동시배열된 순서로 RA에 의해 EC 세포중에서 차별적으로 활성화된을 입증하고 있는 문헌[Bottero et al., Rec. Res. Cancer Res. 123: 133-143(1991)]을 참고하고, 이 문헌은 본원에 인용문헌으로 삽입되었다.
이들 유전자는 정상적으로 발생하는 중추신경계의 전면-후면 축을 따라 발현되고, 여기서, 3' 유전자가 미엔세팔론(myencephalon)에서 더 입쪽으로 발현되고, 5' 유전자는 척수에서 더 끝쪽에서 발현된다. 호메오박스 유전자의 농도 의존성은 HS 세포가 특정 호메오박스 클러스터 또는 클러스터 내의 개별적인 유전자의 발현을 유발하는 RA의 특정 농도에 노출될 수 있고, 따라서, 정밀한 위치, 예를 들어, 중추신경계의 하부에 대응되는 유형의 조직으로 분화되는 코미트먼트를 유발할 수 있다는 것을 의미한다.
(b) 자율 신경
자율 신경의 예는 1)콜린성 신경세포 2) 아드레날린성 신경세포 및 3)펩티드성 신경세포를 포함하고, 이로 제한되지는 않는다.
본 발명의 단리된 HS 세포는 자율신경세포로 ES 세포, EC 세포, 다른 종류의 다능성 또는 간세포 및(또는) 기형암종 세포를 분화시키는 것에 대한 공지 기술을 이용하여 직접 또는 적절한 선조 세포를 거쳐서 분화될 수 있다.
(c) 신경 세포 및 아교 세포
신경 세포 및 아교 세포의 예는 1)신경 세포, 2)별아교세포, 및 3)희소돌기 아교세포를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
본 발명의 단리된 HS 세포를 ES 세포, EC 세포, 다른 종류의 다능성 또는 간세포 및(또는) 기형암종 세포를 분화시키는 것에 대한 공지 기술을 이용하여 직접 또는 신경세포 선조 세포과 같은 적절한 중간체 세포를 거쳐서 신경세포 및 아교세포로 분화시킬 수 있다. 이러한 기술은 하기 기술된 바와 같은 과정을 포함하고, 이들은 본원에 인용문헌으로 삽입되었다.
문헌[Woodbury et al., J. Neurosci. Res. 61: 364-370 (2000)](본원에 인용문헌으로 삽입됨)은 재조합 골수 간질 세포(rMSC)에서 신경세포성 표현형을 유도하는 1-10 mM BME(SFM/BME)을 포함하는 무혈청 배지의 이용을 기술한다.
문헌[Lee et al., Nature Biotech. 18: 675-678 (2000)](본원에 인용문헌으로 삽입됨)은 미토겐 및 특정 시그날 분자 및 인자, 예를 들어, SHH(sonic hedgehog), FGF-8, 아스코르빈산 cAMP 및 그의 유사체를 이용하는 쥐 배아간세포로부터 중뇌 및 후뇌 신경 세포, 특히 도파민성 및 세로토닌성 신경 세포의 효율적인 발생을 기술한다.
문헌[Okabe et al., Mech. Dev. 59: 89-102 (1996)](본원에 인용 문헌으로 삽입됨)은 배아간(ES) 세포로부터 신경상피세포 선조 세포의 분화를 가능하게 하는 배양 조건을 기술한다. 특히, ES 세포로부터 유도된 신경상피세포 선조 세포의 매우 풍부한 밀도는 염기성 섬유모인자 성장인자(bFGF)의 존재하에서 다산한다. 이들 세포는 신경 세포 및 DEGF의 아교 후속 끌기로 분화된다.
문헌[McDonald et al., Nature Medicine 5: 1410-1412 (1999)](본원에 인용 문헌으로 삽입됨)은 직접 분화의 방법으로서 현장 이식을 기술한다. 특히, 신경 분화 쥐 배아줄기세포를 외상성 상해 9일 후 래트의 척수로 이식하였다. 2-5주 후, 조직분석은 이식 유발된 세포는 생존했고, 별아교세포, 희소돌기아교세포 및 신경세포로 분화되었고, 병변 가장자리로부터 8mm 떨어진 곳으로 이동하였다.
문헌[Borlongan et al., NeuroReport 9: 3703-3709 (1998)](본원에 인용문헌으로 삽입됨)은 무한증식 인간 배아 암 세포(Netra 2 또는 NT2 세포)로부터 (hNT) 세포와 같이 후-미오틱 신경세포의 발생을 자극하는 레티노인산의 이용을 기술한다.
문헌[Oliver Buerstle et al., "Protocol for producing Glial precursors from pES Cells: A Source of Myeliiiating Transplaiits", The Americatt Associationfor the Advanceinent of Science 285: 754-756 (1999)]은 또한 ES 세포를 아교세포로 분화시키는 것에 대한 기술을 기술한다. 이러한 기술은 HS 세포를 분화시키는데 사용될 수 있고, 이는 본원에 인용 문헌으로 삽입되었다.
신경세포성 선조 세포의 전기생리학적 성질을 특성화하기 위해, 이들은 12일 이상 동안 B27 및 5% FCS를 포함하는 뉴로베이살 배지에서 유지시키고, 15개의 세포의 활성을 3개의 플래이트로부터 측정하였다. 이러한 세포의 휴지 멤브레인 포텐셜은 약 -60mV이고, 이들은 휴지 포텐셜로부터 20mV에 의해 탈극화된 내부방향 활성 전류를 나타낸다.
내부방향 전류는 고속 불활성 외부방향 전류(IA) 및 지속되는 외부방향 전류가 이어진다. 이들 전류는 외부방향 K-조정 채널에 의해 중개되는 것 같이 나타내 는 Cs-충전 세포에는 없었다.
대부분의 신경세포성 세포는 지속 및 크기를 다양화하는 자발적인 시냅스 전류를 나타낸다. 측정된 신경세포성 선조 세포, 즉, 퓨터티브(putative) 신경세포에 인접한 세포상의 글루타메이트의 적용은 짧은 지연을 이용하여 측정된 신경세포에서 이들 시냅스 전류의 발생을 유발한다. 측정된 시냅스 전류는 아세테이트 함유 피펫으로 측정했을 때 두 종류: 약 0mV에서 가역적인 고속 흥분성 포스트시냅스 전류 및 약 -50mV에서 가역적인 저속-지연 억제성 시냅스 전류이다. 또한, 측정된 세포는 휴지 포텐셜에서 측정된 표지된 내부 방향 전류를 이용하는 글루타메이트의 국소 적용에 반응 한다. 자발적 및 발생되는 시냅스 반응 및 글루타메이트에 대한 세포의 반응은 출생전, 배양된 CNS 신경세포의 것들과 동종인 일련의 성질을 유지한다.
NMDA에 의해 측정된 세포의 자극은 시클릭 아데노신 모노포스페이트 반응 요소 결합 단백질(CREB 단백질)의 인산화 및 c-fos 유전자의 전사를 유도한다. 이들 2개의 유도는 관능성 NMDA 수용체가 발현되는지를 결정하도록 분석된다. 비자극 세포는 포스포-CREB으로 손상되서는 안된다. 반대로, 10분 동안 글루타메이트 또는 NMDA의 자극 후 측정된 신경세포성 세포는 집중 핵 면역반응성을 나타냈고, 포스포-CREB에 의한 손상을 나타내었다. 반대로, 아교-유사 세포의 거대 핵은 포스포-CREB 손상을 전혀 나타내지 않았다.
또한, 글루타메이트로 처리한 RT-PCR 또는 NMDA는 c-fos 유도를 나타내고, 이 제조에서 신경 세포의 일부는 작용적 NMDA 수용체를 갖는 것을 제안하고, 시냅 스 연결 존재는 또한 전자 현미경에 의해 확인될 수 있고, 또는, 형태학적 특징에 의해, 예를 들어, 다수의 시냅스 소포를 포함하는 전형적인 전-시냅스 구조 또는 활성 부위의 특징인 막의 두께가 관찰되었다. 이러한 결과는 HS 세포로부터 유발된 신경 선조 세포는 작용적 시냅스 연결을 형성하는 후-미토틱(mitotic) 신경 세포로 분화될 수 있다는 것을 제안한다.
이전의 연구들은 bFGF가 신경상피 전구 세포에 대한 강한 분열촉진물질(미토겐, mitogen)임을 보여주었다. bFGF에 대한 HS 세포의 반응을 조사하기 위하여, ITS/FN 배지에서 6 내지 7일 동안 유지시킨 HS 세포를 몇몇 상이한 DMEM/F12-기재 배지에서 해리시키고 플레이트시킨다. 3일 후에 세포 농도를 측정한다. 변형된 N3 (mN3) 배지로 보충된 DMEM/F12 배지, bFGF 및 피브로넥틴(섬유결합소, fibronectin)를 조합하여 사용하면 최고의 증식 효과(proliferative effect)를 나타낼 것이다. 5 내지 50 ng/ml의 농도에서, bFGF는 증식에 대하여 동일한 효과를 나타낼 것이다. 1 ng/ml 미만의 농도에서는 bFGF는 명확한 증식 효과를 나타내지 않을 것이다. 라미닌(laminin)이 피브로넥틴보다 세포 증식에 대하여 약간 높은 자극을 나타내므로, N3 배지, bFGF 및 라미닌 ("N3FL"배지)가 신경 전구물질-유사 세포에 대한 증식 조건으로서 사용된다.
N3FL 배지에서, 우세하게 증식하는 세포는 ITS/FN 배지-유래 네스틴(nestin)-양성(양성) 세포와 유사해야 한다. N3FL 배지에서 성장하는 경우, 다양한 ES 세포주(D3, CJ7 및 Jl)와 같은 HS 세포는 형태(morphology)가 동일해야 하고, bFGF에 정확히 의존하여 증식해야 한다. 세포 증식은 플레이팅(plating) 후 1 일, 4일 및 7일째에 세포 밀도를 계수(count)하여 정량화된다. 세포를 계수하면 배양액(culture)에서 7일 후의 세포 수가 6배 증가한 것을 알 수 있다.
신경 전구물질(neuronal precursor) (네스틴)(nestin), 감수분열후(post-mitotic) 신경(미세관-연결 단백질(microtubule-associated protein) 2; MAP2), 별아교세포(astrocytes) (아교섬유(glial fibrillary) 산성 단백질; GFAP) 및 올리고덴드로사이트(희소돌기아교세포, oligodendrocyte) 계통(04, Gal-C)에 특이한 반응을 보이는 항체로 표본(preparation)을 염색하는 것도 가능하다. 네스틴-양성 세포는 각각의 시점에서 전체 세포 모집단의 80% 보다 커야 하고, MAP2-양성 세포는 전체 세포 모집단의 약 10 내지 15%이어야 하며; GFAP-양성 세포는 전체 세포 모집단의 2% 미만 이어야 한다. 상기 세포 모집단에서는 04-양성 또는 Gal-C-양성 세포가 관찰되어서는 않된다.
더욱이, 성숙 중추신경계로부터 단리된 신경 선조 세포는 뇌에 이식한 후에는 뉴우런(neurons) 및 아교(glia1) 세포로 분화되고, 척수(spinal cord)에 이식한 후에는 올리고덴드로사이트 및 별아교세포로 분화한다. 유사하게, 간세포(stem cell)는 척수로 이식되어, 분화 및 이동을 거쳐서 손상된 척수의 회복을 촉진시킨다. 맥도널드(McDonald) 등은 문헌 [1999, Nature Medicine 5: 1410-1412]에서 신경 분화를 유도하기 위하여 RA (레틴산, retinoic acid)에 노출(500nM의 모두 트랜스인 RA에 4일 동안 노출)시킨 이식된 ES 세포를 이식시켜셔, 별아교세포, 올리고덴드로사이트 및 뉴우런으로 분화되고, 척수 내에서 이동하고, 손상된 청구의 회복을 나타내는 거동(운동) 결과를 관찰하였다.
한 가지 실시 양태에서, HS 세포는 ES 세포를 대체하여, 척수에 이식되어 분화 및 이동을 거치고, 그러한 치료가 필요한 환자의 회복을 촉진시킬 수 있다. HS 세포 유래 배아 유사체(embryoid bodies) (4 일 동안은 레틴산 없이, 이어서, 4일 동안은 레틴산에 노출)를 이식에 사용하며, 여기서, RA가 신경 분화를 유도한다. 부분적으로 트립신처리된(trypsinized) 배아 유사체를 세포 응집체(aggregates)로서 이는 척수 타박상(contusion) 9일 후에 형성된 관(syrinx)에 이식하였다. 세포 이식 대신에 배양 배지만을 관에 투여하는 것을 제외하고는 섐-조작된(Sham-operated) 대조군은 동일하게 처리하였다. 운동 작용은 바쏘-비이티-브레스너한 (Basso-Beattie-Bresnahan) (BBB) 운동 측정기(Locomotor Rating Scale)로 평가하였다.
이식 전날(손상 후 8일 째) BBB 스코어를 얻고, 대조군 및 시험 그룹을 짝지워서, 초기 운동 스코어가 그룹 사이에 평형을 이루도록 대상들을 무작위적으로 그룹으로 나누었다. 충격으로 인간 손상 8일 째에, 척수 고정 프레임(spinal stereotaxic frame), 5-㎕ 해밀턴 시린지(Hamilton syringe)로 배열된 직경 100 ㎛의 팁을 지닌 유리 피펫, 또는 코프(Kopf) 미세고정(microstereotaxic) 주사 시스템(코프 모델 5000 & 900; 미국 캘리포니아주 투중가 소재의 코프(Kopf)사 제품)을 사용하여, 신경 분화된 HS 세포 (약 1x106) 또는 비히클 배지를 대상 동물에 투여하였다. HS 세포 또는 비히클 배지 (5 ㎕)는 5분에 걸쳐서 T9 수준에서 관의 중앙으로 주사하였다. 시간-매치된 대조군을 갖는 3개의 독립적인 시험은 전제적으로 완 성된다. 첫 번째 시리즈는 이식 5주 후에 거동 분석 및 후기 조직학적 분석(late histologic analysis)(그룹 당 n = 11)을 위하여 완결되고, HS 세포 이식의 경우를 대조군과 비교한다. 두번째 시리즈는 초기(이식 2 주후) 및 후기(이식 5 주 후) 의 조직학적 결과(그룹 당 n = 11)를 비교하는 데 이용되었으며, HS 세포 이식 (로사(ROSA) lacZ 유전자전환 세포주(transgene line))경우를 대조군과 비교한다.
유전학적으로 마킹(marked)되고 10 μM의 BrdU로 24 시간 동안 펄스시켜 시험관 내에서 미리-표지된(pre-labled) HS 세포-유래 세포를 이식 후 14 내지 33일에 인-시튜(in situ) 방식으로 확인한다. 확인은 특이 항체를 사용해서도 달성할 수 있다. 이식후 2 내지 5 주 후에, HS 세포-유래 세포는 응집체 내에서 발결되거나 손상 부위 전체에서 단일하게 분호하여야 한다. 또한, 입(rostral) 또는 꼬리(caudal) 방향으로 관 가장자리로 부터 8mm 떨어져서 단일 세포가 발경되어야 한다. 대부분의 이식된 대상 동물에서, 이식 후 2주 째에는, 배지로 처치된 대상 동물에서 관이 통상적으로 차지하는 공간을 HS 세포-유래 세포가 채워야 한다. 5 주 째에는, 이 영역에서 HS 세포-유래 세포의 밀도는 감소되고, 섬유를 함유하는 세포외 매트릭스로 재체되어야 한다.
올리고덴드로사이트(샘종 폴립증 유전자 생성물(adenomatous polyposis coli gene product)), 아트로사이트(아교섬유 산성 단백질) 및 뉴우런(뉴우런-특이 핵 단백질)에 대하여 특이한 마커(marker)에 대한 항체를 사용하여 잔존하는 HS 세포-유래 세포를 확인할 수 있다. 핵은 획스트(Hoechst) 33342 염색제로 뚜렷하게 확인할 수 있다. 대부분의 잔존하는 HS 세포-유래 세포는 올리고덴드로사이트 및 별 아교세포이나, 어떤 HS 세포-유래 뉴우런은 척수의 중간에도 존재할 수 있다. 많은 HS 세포-유래 올리고덴드로사이트는 마이엘린의 중요한 성분인 마이엘린 염기성 단백질에 대하여 면역학적으로 활서이어야 한다.
"장외 보행(open field locomotion)"에서의 수행은 HS 세포 이식에 의해 향상된다. 섐-조작된 이식 그룹은 체중이 지탱할 수 없었던 반면, HS 세포로 이식된 대상 동물은 부분적으로 체중이 실린 보행(weight-supported ambulation)이 가능할 것이다. BBB 스코어에서 통계적인 차리는 이식 2 주 후에 달성될 것이다. 1개월 후에, 섐-조작된 그룹과 HS 세포 이식된 그룹 사이에 두 가지 점에서의 차이가 나타났다. 전자에서 얻어진 스코어는 체중이 실리거나 조화되는 움직임이 없음을 나타내는 반면, 후자의 스코어는 부분적으로 팔다리의 체중이 실리고 부분적으로 팔다리가 조화되는 움직임으로 특징지워지는 걸음걸이를 나타내었다.
요약하면, 체중이 감소되는 손상 후 9일 째에 척수로 이식된 경우, HS 세포-유래 세포는 5주 이상 생존하고, 이식된 부위로 부터 8 mm 이상 이동하고, 종양을 형성하지 않고 별아교세포, 올리고덴드로사이트 및 뉴우런으로 분화되며, 운동 기능을 향상시켜야 한다.
bFGF를 제거하여 미리 분화를 유도시킨 신경 세포는 B27이 보충물 및 5% 우태아혈청이 가해진 신경기본 배지 중에서 세포가 현저하게 죽지 않고 2주 이상 유지될 수 있다. 이러한 장기간의 배양은 Jl, CJ7 및 D3 세포주에 적용될 수 있다. 그러나, N3-기재 혈청 무함유 배지에서는 장기간의 배양이 어렵다.
MAP2 및 신경 필라멘트-M (NF-M)을 갖는 배양액에서의 세포의 이중 표 지(double labeling)는 두 가지의 신경 돌기가 존재한다는 것을 가리킨다. 안티-MAP2 항체는 짧고 두꺼운 돌기(processes) 및 세포체(cell bodies)를 염색시키는 한편, 안티-NF-M는 얇고 긴 돌기를 염색시킨다. 이중 표지되면 HS 세포-유래 뉴우런은 MAP2-양성 덴드라이트(dendrites) 및 NF-M-양성 액손(axons)을 갖는다.
안티-시냅신(anti-synapsin) I으로 염색시키면 덴드라이트의 세포막에 밀접하여 연결된 정확한 구조를 나타낸다. 그러한 염색 형태는 시냅스 소포가 액손을 따라 별개의 부위로 분리되는 것을 가리킨다.
신경전달물질 표현형을 조사하기 위하여, 뉴우런 세포로 분화된 HS 세포는 신경전달물질에 대한 몇가지 항체로 염색된다. 그 결과를 완전히 음성인 세포와 함께 혼합된 글루타메이트-양성 세포가 다수 있음을 나타낸다.
또한, 김마-아미노부티르산(GABA)-양성 세포가 공통되고, GABA 염색도 가능하다. 따라서, GABA 양성이나 MAP2-음성인 얇은 돌기를 확인할 수 있다. GABA성 뉴우런은 GABA-양성이고 MAP2-음성이어야 하므로, 이러한 발견은 덴드라이트 및 액손 구조의 분화를 나타낸다.
신경 유전자 발현은 뉴우런-특이 프라이머의 패널을 사용한 역전사중합효소 연쇄반응(RT-PCR)에 의해 보다 분석될 수 있다. 표본은 글루타메이트 데카르복실라제(GAD65)' 칼빈딘(calbindin) D28, NMDA 수용체 1,2A. 2B, 20, (1-아미노-3-히드록시-5-메틸이속사졸-4-프로피오네이트 (AMPA) 수용체, 및 GABAA 수용체를 발현하는 세포를 함유한다. 모든 경우, 분화된 세포로부터 전체 RNA에서 보다 높은 전사 량이 검출된다.
이러한 뉴우런성 세포들이 임의의 특이적 CNS 영역에서 세포에 상응하는지를 확인하기 위하여, 전방-후발 축을 따라 3가지 위치에서의 특이 마커의 발현이 분석된다. Otx-1가 전뇌 및 중간뇌에서, En-1은 중간뇌-마름뇌 (hindbrain) 경계에서, Hoxa-7은 후방 척수에서 주로 발현된다. 분화되지 않은 HS 세포는 Hoxa-7를 발현하나, Otx-1 및 En-1는 발현하지 않는다. 그러므로, 후방 마커 Hoxa-7는 10일 이상동안 bFGF의 존재하에 네스틴-양성 세포 증식에서 낮게 조절되어야(down-regulated)한다. 대조적으로, Otx-1 및 En-1은 이러한 증식하는 세포에서 신호전달을 높게 조절되어야(up-regulated)한다. B27 및 혈청을 함유하는 신경기본 배지로 스위치함으로써 분화시킨 이후에, Hoxa-7 발현은 다시 높게 조절되고(up-regulated), Otx-1 및 En-1 발현은 유지되어야 한다. 상이한 전사인자의 존재는 표본이 상이한 CNS 영역의 뉴우런 특성을 생성한다는 것을 시사한다.
(d) 감각 기관 및 말단 뉴우런의 지지 세포
감각 기관 및 말단 뉴우런의 지지 세포(supporting cell)의 예는 표피 기관의 지지세포(예: 내부 및 외부 기둥(pillar) 세포, 내부 및 외부 지골(phalangeal) 세포, 경계(border) 세포, 헨슨(Hensen) 세포); 전정기관의 지지세포; 미뢰의 지지 세포; 후각 상피세포의 지지 세포; 신경집세포(Schwann cell); 장 아교세포; 및 위성 세포(satelite cell)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 단리된 HS 세포는 그러한 지지 세포로 직접적으로 분화하거나 ES 세포, EC 세포, 기타 종류의 다능성(pluripotent) 또는 간세포 및/또는 기형암 종(teratocarcinoma) 세포를 분화시키기 위한 당분야에 공지된 기법을 사용하여 적절한 전구 세포를 통하여 분화될 수 있다.
(e) 감각 탐촉자( Transducers )
감각 탐촉자의 예들은 1) 광수용체; 청각 센서(예: 표피의 내부 및 외부 모세포(hair cell)); 2) 가속 및 중력 센서; 2) 미각 센서 (II형 미뢰 세포); 3) 후각 센서(예: 후각 뉴우런); 혈액 pH 센서(경동맥 소체(carotid body) 세포, I형, II 형); 4) 촉각 센서(예: 표피의 머켈(Merkel) 세포, 일차 감각 뉴우런); 5) 온도 및 통증 센서(예: 일차 감각 뉴우런); 및 6) 근육 골격 계통에서 형태 및 힘 센서 (고유감각 일차 감각 뉴우런)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 단리된 HS 세포는 직접적으로 또는 ES 세포, EC 세포, 기타 종류의 다능성(pluripotent) 또는 간세포 및/또는 기형암종(teratocarcinoma) 세포를 분화시키기 위한 당분야에 공지된 기법을 사용하여 적절한 전구 세포를 통하여, 감각 탐촉자, 특히 일차 감각 뉴우런으로 분화될 수 있다.
생식 세포로의 분화
생식과 관련있는 세포는 난모세포 및 정모세포와 같은 생식 세포, 난포세포와 같은 지지 세포(nurse cell), 흉선 상피 세포, 및 버팀 세포(Sertoli cell)을 포함한다.
본 발명의 단리된 HS 세포는, 직접적으로 또는 ES 세포, EC 세포, 기타 종류의 다능성(pluripotent) 또는 간세포 및/또는 기형암종(teratocarcinoma) 세포를 분화시키기 위한 당분야에 공지된 기법을 사용하여 적절한 전구 세포(예: 난조세 포(ooginium), 정조세포(spermatogonium) 또는 (난황낭내배엽으로부터 유래된) 원시 배아세포)를 통하여, 생식세포로 분화될 수 있다.
E. 실시예
실시예 1. 동형접합 간세포 형성 및 기형종 내의 3개의 배아 배엽의 선조 세포 및 다양한 조직으로의 그의 분화
실시예 1 (a): 활성화시킨 후 제2 극체의 방출의 차단에 의한 마우스 제1 감수분열후의 난모세포로부터의 HS 세포의 유도
73종의 난모세포를 하기 방법으로 과배란시킴으로써 하이브리드 (BDA2 F1: C57 블랙 x DBA2, 메사추세츠주 윌밍톤 소재의 찰스 리버 실험실 (Charles River Laboratories)), 8주 생, 암컷 마우스로부터 수득하였다. 3마리의 하이브리드 마우스에 약 48 시간 따로 떨어져서 임신한 암말의 혈청 생식생자극호르몬 (PMS; 텍사스주 휴스톤 소재의 PCCA (29-10001BX)) 5 IU/100 ㎕ 및 인간 융모막 생식생자극호르몬 (HCG; 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마 (C8554)) 5 IU/100 ㎕의 주사제를 투여하였다.
난모세포를 HCG 주사 약 17 시간 이후에 수확하고, 최종 농도 0.3 mg/ml로 M2 배지 (M7167, 시그마)중에 용해시킨 한 방울 (∼300 ㎕)의 히알루론산분해효소 (H4272, 시그마) 중의 새롭게 수득한 난모세포를 인큐베이션함으로써 작은더미 덩어리를 제거하였다. 추가로 핸들링하기 전에 난모세포를 이어서 HEPES 완충된 M2 배지로 3회 세척하였다.
난모세포를 이어서 5 μM 칼슘 이온운반체 (C7522, 시그마: Ca2 + 1 mg/764.8 ㎕; DMSO 2.5 mM = 500 x (스톡); 최종 농도 2 ㎕ Ca2 + (500 X)/1 ml M2 = 3 μM) 용액으로 실온에서 5 분 동안 처리함으로써 활성화시켰다. 난모세포를 이어서 HEPES 완충된 M2 배지로 2회 세척하였다.
Ca++ 활성화된 난모세포를 6-디메틸아미노푸린 (6-DMAP (D2629, 시그마)을 함유한 M16 중탄산염-완충된 배양 배지 (M7292, 시그마) {250 mM=50 x (스톡); 최종 농도: 20 ㎕/1 ml Ml6 = 5 mM} 및 5% CO2 중에서 37 ℃에서 3 시간 동안 인큐베이션하였다. 난모세포를 이어서 M16 배지로 3회 세척하고, 광유하의 1방울의 M16 배지 중에서 4 일 이상 동안 인큐베이션하였다.
M16 배지 중에서 인큐베이션 4 내지 5일 후에, 포배와 유사한 세포 덩어리를 Ca++ 활성화된 난모세포로부터 수득하였다. 이들 포배-유사 덩어리로 둘러싸인 껍질을 떼어낸 후에 ("헤칭 (hatching)"), 이 껍질을 간세포 형성용 ES 배지 (DMEM: 메릴랜드주 록빌 (Rockville) 소재의 기브코(Gibco), 라이프 테크놀로지즈 (Life technologies), (11995-065) ; 20% FBS: 기브코 (16141-079))중의 미토마이신-C 처리된 생쥐 배아 영양세포층 상으로 15 일 이상 동안 옮겼다.
별법으로, 간세포를 외과적면역학으로 헤칭한 포배-유사 덩어리로부터 유도하였다. 헤칭된 포배-유사 덩어리를 항-마우스 Thy-1 래빗 혈청 (1:10, ACL2001, 뉴욕주 웨스트버리 (Westbury) 소재의 아쿠레이트 케미칼 (Accurate Chemical)) 및 항-인간 림프구 래빗 혈청 (1:10, CL8010, 아쿠레이트 케미칼)과 함께 1 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 세포 덩어리를 M2 배지로 3회 세척하고, 기니픽 도움체 (1:10, ACL4051, 아쿠레이트 케미칼)와 함께 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션하여 영양막 세포를 용해시켰다. 도움체-처리된 세포 덩어리를 이어서 M2 배지 중에서 3회 세척하고, 간세포 형성을 위한 미토마이신-C 처리된 생쥐 배아 영양세포층으로 15 일 이상 동안 옮겼다.
*생쥐 배아 섬유모세포 영양 세포를 스템셀, 인크. (Stemcell, Inc.) (00308)로부터 구입하고, 2 내지 3회 계대배양하였다. 미토마이신-C (최종 농도: 1011 ㎍/ml, 시그마 M4287)를 함유한 5 ml의 DMEM/10% FBS 배지로 37 ℃에서 3 시간 동안 1개의 60 mm 디쉬의 융합성-확장된 영양 세포를 처리하였다. 처리된 영양 세포를 이어서 5 ml의 DMEM/10% FBS로 3회 세척하고, 37 ℃에서 5 분 동안 1 ml의 트립신처리로 수거하고, 5 ml의 DMEM/10% FBS 배지로 중성화시키고, 1000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 수득한 미토마이신-처리된 세포 펠렛을 15 ml의 DMEM/10% FBS 배지 중에 재현탁하고, 3개의 60mm 디쉬 (세포 현탁물 5 ml/1개의 디쉬) 상에 플레이팅하고, 사용하기 전에 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
실시예 1 (b): 활성화시킨 후 제2 극체의 방출의 차단에 의한 인간 이배체 난모세포로부터의 포배-유사 세포 덩어리의 발생.
여성 난자 제공자들을 류프롤라이드 아세테이트 (일리노이주 디어필드 (Deerfield) 소재의 루프론 TAP 파마슈티컬즈 (Lupron TAP Pharmaceuticals))로 하류-조정하고, 이어서 300 IU/일의 투여량으로 소포 자극 호르몬 (FSH) (세로모 파 마슈티컬 (Seromo Pharmaceutical)) 처리함으로써 COH (조절된 난소 과다자극)를 개시시켜 적절한 다중소포 반응을 유도하였다. 소포 성숙도에 대한 초음파 기준에 부합되는 경우, 단일 10,000 IU 투여량의 hCG를 투여하고, 질경유 소포 흡인을 hCG 투여 약 36 시간 후에 수행하였다. 회수된 난모세포로부터의 작은더미를 80 IU/ml 히알루론산분해효소에 약 30 초 동안 노출시킨 후 10% 인간 혈청 알부민 (캘리포니아주 샌디에이고 소재의 인비트로케어, 인크(InVitroCare, Inc.))이 보충된 HEPES-완충된 인간 자궁관액에 노출시킴으로써 제거하였다.
유사분열 활성화를 이루기 위해, 작은더미 무함유 성숙 M-II 난모세포를 5 μM 칼슘 이온운반체 (A23187, 시그마)로 5 분 동안 33 ℃에서 처리한 후에, 1 내지 5 mM 6-디메틸아미노푸린 (6-DMAP, 시그마) 중에서 3 내지 5 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하여 처리하였다. 세포 분열 및 포배 형성을 위해 활성화된 난모세포를 IVC-1 배지 (인비트로케어, 인크.)에서 3 일 동안 인큐베이션하고, 추가로 IVC-3 (인비트로케어, 인크.)중에서 2 일 동안 인큐베이션하였다. 변법으로는, 일수 (day number) 2종의 배아 유사 세포 덩어리를 STO 영양 세포 상에서 동시배양할 수 있었다. 6일 째에 미세조작기 하에 한팔의 미세조작기의 한팔을 사용하고 투명 구역을 다른 팔로 안전하게 확보하며 투명 구역의 총 외부 표면 영역의 약 1/8에 산성화된 티로드 용액을 가함으로써 조력 헤칭을 수행하였다. 포배를 이어서 묽어진 구역으로부터 유출시키고, 이어서 항-Thy1 및 도움체로 처리하여 면역외과학적으로 트로펙토르덤 (trophectorderm) 중의 세포를 제거하였다. 이어서, 비필수 아미노산, 펜-스트렙 (pen-strep) (라이프 테크놀로지즈), 베타-메르캅토에탄올 (시 그마) 및 LIF (케미콘 (Chemicon))가 보충된 DMEM 배지 중에 20% 소 태아 혈청 (라이프 테크놀로지즈)을 함유한 간세포 배양 배지 중의 미토마이신 처리된 STO 영양 세포 (ATCC)상에서 상기 처리된 포배를 배양하였다. 도 8d 참조.
실시예 1 (c): 활성화시킨 후 제2 극체의 방출 및 게놈 자가복제에 의한 인간 제1 감수분열후의 이배체 난모세포로부터의 포배-유사 세포 덩어리의 발생 및 게놈 자가복제
여성 난자 제공자들을 류프롤라이드 아세테이트 (일리노이주 디어필드 소재의 루프론 TAP 파마슈티컬즈)로 하류-조정하고, 이어서 300 IU/일의 투여량으로 소포 자극 호르몬 (FSH) (세로모 파마슈티컬) 처리함으로써 COH (조절된 난소 과다자극)를 개시시켜 적절한 다중소포 반응을 유도하였다. 소포 성숙도에 대한 초음파 기준에 부합되는 경우, 단일 10,000 IU 투여량의 hCG를 투여하고, 질경유 소포 흡인을 hCG 투여 약 36 시간 후에 수행하였다. 회수된 난모세포로부터의 작은더미를 80 IU/ml 히알루론산분해효소에 약 30 초 동안 노출시킨 후 10% 인간 혈청 알부민 (캘리포니아주 샌디에이고 소재의 인비트로케어, 인크)이 보충된 HEPES-완충된 인간 자궁관액에 노출시킴으로써 제거하였다.
유사분열 활성화를 이루기 위해, 작은더미 무함유 성숙 M-II 난모세포에 허위 ICSI(세포질내 정자 주입술)을 수행하여 정자로 가짜 활성화시킨 후에, 25 μM 칼슘 이온운반체 (A23187, 시그마)와 함께 5 분 동안 33 ℃에서 인큐베이션하였다. 이 방식으로 활성화된 난모세포는 제2 극체가 방출되고, 일배체가 되었다. 세포 분열 및 포배 형성을 위해 이러한 일배체 난모세포를 IVC-1 배지 (인비트로케어, 인크.)에서 3 일 동안 인큐베이션하고, 추가로 IVC-3 (인비트로케어)중에서 2 일 동안 인큐베이션하였다. 별법으로는, 일수 (day number) 2종의 배아 유사 세포 덩어리를 STO 영양 세포 상에서 동시배양할 수 있었다. 6일 째에 미세조작기 하에 포배 구역 외부에 산성화된 티로드 용액을 가함으로써 조력 헤칭을 수행하였다. 포배를 이어서 묽어진 구역으로부터 유출시키고, 비필수 아미노산, 펜-스트렙 (라이프 테크놀로지즈), 베타-메르캅토에탄올 (시그마) 및 LIF (케미콘)이 보충된 DMEM 배지 중의 20% 소 태아 혈청 (라이프 테크놀로지즈)을 함유한 간세포 배양 배지 중의 미토마이신-처리된 STO 영양 세포 (ATCC) 상에서 배양하였다.
활성화로 발생된 일배체 난모세포는 세포질분열 없이 그의 게놈을 자가 복제할 수 있었고, 이배체 세포로 되었다 (Taylor, A. S., et al., "The early development and DNA content of activated human oocytes and parthenogenetic human embryos," Hum. Reprod. 9 (12): 2389-97 (1994); Kaufman, M. H. et al., "Establishment of pluripotential cell lines from haploid mouse embryos," J. Embryol. Exp. Morphol. 73: 249-61 (1983)).
6일 째에 미세조작기 하에 포배 구역 외부에 산성화된 티로드를 가함으로써 조력 헤칭을 수행하였다. 포배를 이어서 묽어진 구역으로부터 유출시키고, 비필수 아미노산, 펜-스트렙 (라이프 테크놀로지즈), 베타-메르캅토에탄올 (시그마) 및 LIF (케미콘)가 보충된 DMEM 배지 중의 20% 소 태아 혈청 (라이프 테크놀로지즈)을 함유한 간세포 배양 배지 중의 미토마이신 처리된 STO 영양 세포 (ATCC) 상에서 배양시켰다. 도 8a 내지 c 참조.
실시예 1 (d): 마우스 HS 세포 성장, 마우스 신장 피막 하에서의 이러한 HS 세포의 분화 및 이러한 세포의 배아유사 체 형성
1,400 U ml-1의 백혈병 억제 인자 (LIF) (ESGROTM), 케미콘 ESG1106: 106 유닛/ml을 함유한 ES 세포 배지 중의 0.1% 젤라틴 코팅된 디쉬 (10 cm) 상에 실시예 1 (a)에 기재된 바와 같이 포배-유사 덩어리로부터 수득된 HS 세포를 시딩하였다. [콜로니로 배양시키기 위한 실시예 1 (b)에 기재된 바와 같이 마우스 영양 세포층 상에 대해 최종 100 μM가 되도록 ES 배지 500 ml: 녹(knock)-DMEM (기브코 10829-018) 425 ml; FCS (허가된 ES 세포, 기브코 16141-061) 75 ml; MEM 비필수 AA 용액 (기브코 11140-050) 5 ml; 페니실린 스트렙토마이신-글루타민 (Penicillin Streptomycin-Glutamin) (기브코 10378-016) 5 ml; 2-메르캅토에탄올 (기브코 21985-023) 0.5 ml]
HS 세포의 콜로니를 몇몇의 조각으로 절개하고, 26 하이브리드 마우스의 2개의 신장 피막 중 하나에 이식하여 스템플라즘(stemplasm) 형성을 유도하였다. 이어서, 이식 1, 3, 6, 9.5, 10.5, 11, 12 및 14주 후에 마우스를 죽여서 줄기질을 수확하였다. 형태 연구를 위해 각각의 줄기질 절반을 포르말린 중에서 고정시키고, 분자 특성화를 위해 다른 절반을 -80 ℃에서 동결시켰다. 줄기질은 3주 주변에서 가시가능한 크기로 형성되기 시작하였다. 줄기질 수확을 스테거링 (staggering)하여, 줄기질 내에서 발생된 다양한 조직 유형을 연구하였다. 본원에서 확인되는 모든 조직 유형은 상기 줄기질 내에서 발생되었다. 줄기질 유전형을 상기에 기재된 PCR-기재 대립유전자 분석으로 확인하였다.
배아유사 체 (EB)를 생성시키기 위해 60 mm 디쉬 상의 HS 세포를 먼저 PBS로 2회 세척하였다. 트립신/EDTA 용액 1 ml를 이어서 첨가하고, 세포를 37 ℃에서 5 분 동안 두었다. ES 배지 5 ml를 이어서 첨가하고, 세포를 세포 스크레퍼로 들어내고, 1000 rpm에서 5 분 동안 회전 침전시켰다. 이렇게 수득한 세포 펠렛을 이어서 LIF가 없는 5ml ES 배지 중에 재현탁하고, 세포수를 카운팅하였다. 세포를 이어서 2 x 106/10 cm 디쉬에서 박테리아 배양 디쉬 상에 시딩하였다. 세포를 ES 배지 중에 4 일 동안 공급하며, 15 ml 튜브 내로 세포를 옮기고, 세포가 튜브 바닥에 정치될 때까지 약 5 분 동안 기다림으로써 매 2일마다 배지를 교환하였다. 세포가 이어서 뭉치어져서 EB를 형성하고, 추가 분화를 위해 원래 디쉬로 옮겼다 .
실시예 1 (e): 기형종 내의 인간 HS 세포의 분화 및 이러한 분화된 조직의 유전적 동형접합성.
31종의 기형종을 위싱톤, DC 소재의 3군 병리학 연구소 및 뉴욕주 뉴욕 소재의 뉴욕대학교 병리학부 (Dr. J. Liu)의 파일로부터 획득하였다. 다양한 상이한 종류의 독점적으로 분화되는 조직은 여성 환자로부터의 20종의 난소 암에서 발견되었다. 당업계에 공지된 방법을 사용하는 대표적인 경우에 수행되는 FISH 분석 및 염색체 3 및 8에 대한 알파-위성 프로브로 확인됨으로써 이 분화되는 조직은 이배체임이 밝혀졌다. 미분화된 조직 및 분화된 조직의 3 내지 12 조직 영역은 여성 환자로부터 7개의 난소 암에서 발견되었고, 남성 환자로부터의 4개의 고환 암이 확 인되고, 유전 분석을 위해 각각의 경우로부터 선택적으로 미세절개하였다. 각각의 경우에, 분화되는 조직은 유전적으로 동형접합되는 것이 발견되고, 미분화되는 조직은 유전적으로 이형접합되는 것이 발견되었다.
미세절개 . 유리 슬라이드 상의 비염색된 6 마이크론 부분을 크실렌으로 탈파라핀화시키고, 100% 내지 80%의 에탄올 중에 세정하고, 헤마톡실린 및 에오신으로 순간 염색하고, TE 완충액 중의 10% 글리세롤 중에 세정하였다. 직광 현미경 시각화 하에 조직 미세절개하였다. 각각의 경우로부터, 유전 분석을 위해 상이한 조직 분화의 6 내지 12 영역을 개별적으로 미세 절개하였다. 추가로, 정상, 비-종양 조직의 몇몇 영역을 제조하였다.
DNA 추출. Tris-HCI, pH 8.0; 1.0 mM 에틸렌디아민 테트라아세트산, pH 8.0; 1% 트윈 (Tween) 20 및 0.5 mg/ml 단백질분해효소 K를 함유한 완충액 25 ㎕ 중에 생성된 세포를 바로 재현탁하고, 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 혼합물을 5 분 동안 끓여서 단백질분해효소 K를 불활성화시키고, 이 용액 1.5 ㎕를 DNA의 PCR 증폭을 위해 사용하였다.
유전 분석. 미세절개 후에 입수가능한 제한된 양의 DNA 중에서 동형접합성을 확실하게 확인하기 위해, DIS1646 및 D1S243 (Ip), D3S2452 (3p), D5S346 (5q), D7S1822 (7q), Ank-1 (8p), D9S171 (9q), D9S303 (9q), Int-2 및 PYGM (11q), IFNA (9p), D17S250 (17q), CYP2D (22q) 및 AR (Xq)을 포함하는 14종 이하의 별개의 고 다형 미세위성 표지로 다중 상이한 미세절개한 조직 샘플을 분석하였다. 상술한 바와 같이, 총부피 10 ㎕중에 DNA 주형 1.5 ㎕를 함유하는 각각의 PCR 샘플, 각각 의 프라이머 10 pmol, dATP, dCTP, DGTP 및 DTTP 각각 20 nmol, 15 mM MgCl2, 0.1U Taq DNA 중합효소, 0.05 ml [32P] dCTP (6000 Ci/mmol) 및 10 X 완충액 1 ㎕. PCR을 35 주기를 수행하였다: 95 ℃에서 1 분 동안 변성시키고, 1 분 동안 접합시키고 (표지에 따라 다른 55 내지 60 ℃의 접합 온도) 및 72 ℃에서 60 초 동안 연장시킴. 최종 연장을 10 분 동안 지속하였다. 표지된 증폭 DNA를 등부피의 포름아미드 적하 염료 (95% 포름아미드, 20 mM EDTA, 0.05% 브로모페놀 블루 및 0.05% 크실렌 시아놀)와 혼합하였다.
샘플을 5 분 동안 95%에서 변성시키고, 6% 아크릴아미드 (아크릴아미드:비스아크릴아미드 49:1)로 이루어진 젤 상으로 적하하고, 1800 V에서 90 분 동안 전기영동할 수 있었다. 전기영동 후에, 젤을 3 mm 왓트만 종이로 옮기고, 건조시킬 수 있었다. 자가방사선술을 코닥 X-OMAT 필름 (뉴욕주 로체스터 소재의 이스트만 코닥 (Eastman Kodak)으로 수행할 수 있었다.
결과. 동일한 대립유전자의 일관된 동형접합성을 나타내는 분화되는 암적인 조직에는 편평 상피, 아교세포 및 연골의 미세절개된 샘플을 포함하였다 (표지 Ankl (상부) 및 D1S1646 (바닥)로 분석함). 정상 난소 조직은 대조군으로서 포함되었다.
기형종의 서브셋에서, 부정합 동형접합 대립유전자를 가지는 것으로 발견되는 분화되는 암적인 조직 (표지 Int-2, D9S303, D1S1646, D3S2452 및 Ankl로 분석함)에는 표피, 피지선, 호흡기 상피 및 아교세포의 샘플이 포함되었다. 정상 난소 조직은 대조군으로서 포함되었다. 이러한 암에서, 생식 세포에서 제1 감수분열 전에 종양형성의 개시로부터 대립 이형접합성이 발생된다고 여겨졌다. 기형발생 암 세포 개시 이후에, 불규칙적이고 독립적인 일들이 이어서 감수분열후 유전형을 갖는 선조 세포로 유도하였다.
분화되는 조직 및 미분화되는 조직 모두를 함유하는 난소 기형종 및 고환 생식 세포 암의 시리즈도 또한 분석하였다. 각각의 암에서, 미분화되는 조직 및 분화되는 조직 성분 모두가 생성되었다. 동형접합 및 이형접합 성분을 표지 D3S2452, D3S303, CYP2D 및 D17S250을 사용하여 탐지하였다. 정상 난소 및 고환 조직을 대조군으로서 포함하였다. 미성숙 편평 상피, 신경 조직 (동일한 암 내에서의 신경 조직의 개별적인 영역으로부터 때때로), 연골, 선 (glandular) 구조 및 중간엽을 포함하는 미분화되는 조직 성분에서 이형접합 대립유전자를 탐지하였다. 미세절개로 동일한 암으로부터 단리한 분화되는 조직 성분은 동일한 표지에 대해 동형접합임이 발견되었다. 시험되는 성숙 성분은 피지선 조직, 모낭 및 성숙 편평 상피 (동일한 암 내에서의 편평 상피의 개별적인 영역으로부터 때때로)를 포함하였다. 일부 암에서, 분화되는 성분은 반대 동형접합 대립유전자를 나타내며, 이는 는 재조합을 나타내거나 또는 다양한 성분이 별개의 감수분열후 세포로부터 개별적으로 발생된다는 것을 제시하였다.
실시예 1(f). 인간 HS 세포로부터 선조세포의 유도
1차 분화
1차 배아 섬유아세포층이 포함된 60 ㎜ 접시 (팔콘(Falcon), #353802) 및(또 는) 0.1 % 젤라틴 코팅 접시에서 성장한 HS 세포를 1.5 ㎖ 트립신/EDTA (인비트로겐(Invitrogen), #25300-050)으로 트립신화하고, 15 ㎖ 원뿔 튜브 중의 1.5 ㎖ ES-LIF 배지로 옮겼다. 그 다음, 세포를 1200 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 세포 펠렛을 2 ㎖ ES-LIF 배지중의 단일 세포 현탁액에 재현탁시키고, 현탁 배양-35 ×10 ㎜-접시 (NalgeNunc, #171099)에 1 내지 3 ×106의 세포 밀도로 현탁 세포로서 배양하여, 4 내지 6일 동안 간세포가 유배아체 (EB)로 알려진 둥근 구형 클러스터를 형성하게 하였다. 형성된 EB를 15 ㎖ 원뿔 튜브로 옮겨 2일 마다 세척한 다음 바닥에 정착시켰다. 상청액을 제거하고, 새로운 ES-LIF를 첨가하였다. 그 다음, EB를 현탁액 배양 접시로 옮겼다. 유배아체로 성장한 HS 세포는 모두 생식세포층, 외배엽, 내배엽 및 중배엽으로 이루어졌다.
외배엽 선조세포. 4 내지 6일 후에, EB를 티로신/EDTA 1 ㎖ 중에서 티로신화하고, ES-LIF 배지 4 ㎖에서 세척하고, 10% 세럼 리플레이스먼트(Serum Replacement, 인비트로겐, #10828), 및 G5 (인비트로겐, #I7503), N2 (인비트로겐, #I7502-048) 또는 베타 NGF (100 ng/㎖) (알 앤드 디 시스템즈(R&D Systems), #256-GF)로 보충된 DMEM/넉아웃(Knockout) 배지 (인비트로겐, #10829-018) 중 단일 세포 현탁액으로 재현탁시켰다. 상기 세포를 10일 동안 피브로넥틴-코팅된 35 ㎜ 접시 중에 3 내지 5 ×105/3 ㎖ (50 ㎍/㎖) (시그마(Sigma), #F-0895)로 배양하고, 배지를 2 내지 3일 마다 교체하였다.
별법으로, EB를 ES-LIF 배지 중 0.1 % 젤라틴-코팅된 접시에 1 내지 2일 동 안 배양한 다음 배지를 인슐린 (5 ㎍/㎖), 셀레늄 클로라이드 (0.015 nM), 트랜스페린 (50 ㎍/㎖) 및 피브로넥틴 (5 ㎍/㎖) (시그마)가 보충된 혈청 무함유 배지로 6일 동안 교체하였다. 세포를 티로신화하고, 단일 세포 현탁액을 N2 배지 (N2 (인비트로겐, #I7502-048), B27 (인비트로겐, #I7504-44) 및 bFGF (lO ng/㎖) (인비트로겐, #13256-029)로 보충된 혈청 무함유-DMEM/F12)에 배양하였다. 그 다음 세포를 계수하고, 폴리-L-오르니틴 (15 ㎍/㎖) (시그마, #P36550)으로 예비 코팅된 24-웰 플레이트 중에서 2 내지 5 ×104 세포/웰/400 ㎕ N2 배지의 밀도로 접종하고, 6일 동안 팽창시켰다.
이들 선조세포는 G5, RA, FGF, NGF, GNDF 또는 BNDF를 첨가하여 상이한 유형의 뉴런 세포로 더 분화되었다. 이들은 세포 팽창을 위해 조절된 배지에서 또한 유지되었다.
중배엽 선조세포. 중배엽 선조세포에 대해서는, 상기한 바와 같은 10 % 세럼 리플레이스먼트 및 베타-NGF가 보충된 DMEM/넉아웃 배지 중의 단일 세포 현탁액을 10일 동안 배양하고, 배지를 2/3일 마다 교체하였다. 이 기간후에, 심장 선조세포에 대해서 세포를 액티빈(Activin) A 보충된 (20 ng/㎖) (시그마, #A4941) 조절 배지에서 10일 더 배양하였다. 별법으로, 신장 및 뮬러관 선조세포를 액티빈 A 보충된 (20 ng/㎖) (시그마, #A4941) 조절 배지에서 4 내지 6일 동안 추가로 배양한 다음 TGF-베타 (알 앤드 디 시스템즈, #) 2 ng/㎖를 배지에 첨가하고, 세포를 4 내지 6일 더 배양하였다.
내배엽 선조세포. 내배엽 선조세포에 대해서는, 라미닌-코팅 (10 ㎍/㎖) (시그마, #L2020) 또는 콜라겐 I-코팅 (10 ㎍/㎖) (시그마, #C-7661) 상의 G5 또는 베타-NGF와 함께 10 % 세럼 리플레이스먼트가 보충된 DMEM/넉아웃 배지 중의 단일 세포 현탁액을 10일 동안 배양하였다. HGF (20 ng/㎖) 및(또는) TGF-알파 (2 ng/㎖)를 배지에 첨가하여 G5 또는 베타-NGF로 대체하고, 세포를 6 내지 8일 더 배양하였다.
별법으로, EB를 콜라겐 I-코팅 접시상에 플레이팅하고, ES-LIF 배지에서 4일 동안 배양하였다. FGF (20 ng/㎖)를 첨가하고, 세포를 3일 더 배양하였다. 이 기간 후에, HGF (20 ng/㎖) 및(또는) TGF-알파 (2 ng/㎖)를 첨가하고, 6일 더 배양하였다.
또한, EB를 라미닌-코팅 부착 접시 (10 ng/㎖) (시그마, #L2020) 또는 0.1 % 젤라틴 코팅 35 ×10 ㎜ 부착 접시에 옮기고, ES-LIF 배지에서 1 내지 2일 동안 배양하였다. 배지를 제거하고, 혈청 무함유 DMEM/F12 (인비트로겐, #11330-0321) 배지를 인슐린 (5 ㎍/㎖) (인비트로겐, #I1882), 셀레늄 클로라이드 (0.015 nM) (시그마, #S5261), 트랜스페린 (50 ㎍/㎖) (시그마, #T-2036) 및 피브로넥틴 (5 ㎍/㎖) (시그마)로 보충하였다. 상기 배지를 ITSFn 배지로 지정하였다. 세포를 ITSFn 배지에서 6일 동안 공급하고, 이 배지를 2일마다 교체하였다.
실시예 1(g): 이식된 HS 세포로부터 동종접합 선조세포의 분화 및 단리
동종접합 선조세포를 얻기 위해, 상기 설명 및 실시예에서 상기 개시된 방법으로부터 유래된 다능성 HS 세포를 신장 캡슐하에 면역손상된 마우스중으로 이식하고 N2 배지(N2(인비트로겐, #I7502-048), B27(인비트로겐, #I7504-44) 및 bFGF(10 ng/mL)(인비트로겐, #13256-029)로 보충된 혈청 무함유 DMEM/F12) 중에서 배양하였다. 그 후, 세포를 계수하고, 폴리-L-오르니틴(15 ㎍/ml)(시그마, #P36550)로 예비 코팅된 24 웰 플레이트에서 2 내지 5 ×104 세포/웰/400 ㎕ N2 배지의 밀도로 접종하고 6일 동안 팽창시켰다.
이들 선조세포를 G5, RA, FGF, NGF, GNDF 또는 BNDF를 첨가함으로써 상이한 뉴런 세포 형으로 더 분화시켰다. 또한, 이들을 세포 팽창을 위해 조절된 배지중에서 유지하였다.
중배엽 선조세포
중배엽 선조에 대해서는, 상기한 바와 같이 10% 세럼 리플레이스먼트 및 베타-NGF로 보충된 DMEM/넉아웃 배지중 단일 세포 현탁액을 2/3일 마다 배지 변화로 10일 동안 배양하였다. 이 기간 후, 세포를 심장 선조세포에 대해 또다른 10일 동안 액티빈 A 보충(20 ng/ml)(시그마, #A4941) 조절된 배지중에서 더 배양하였다. 또한, 신장 및 뮬러관 선조세포에 대해, 세포를 액티빈 A 보충(20 ng/ml)(시그마, #A4941) 조절된 배지중에서 4 내지 6일 동안 더 배양한 후 TFG-베타(알 앤드 디 시스템스, #) 2 ng/ml를 배지에 가하고 세포를 4 내지 6일 더 배양하였다.
내배엽 선조세포
내배엽 선조에 대해서는, 라미닌 코팅(10 ㎍/ml)(시그마, #L2020) 또는 콜라겐 I 코팅(10 ㎍/ml)(시그마, #C-7661)상의 G5 또는 베타-NGF와 함께 10% 세럼 리플레이스먼트로 보충된 DMEM/넉아웃 배지중 단일 세포 현탁액을 10일 동안 배양하 였다. HGF(20 ng/ml) 및(또는) TGF-알파(2 ng/ml)를 배지에 가하여 G5 또는 베타-NGF를 치환하고 세포를 6 내지 8일 더 배양하였다.
또한, EB를 콜라겐 I 코팅 접시상으로 플레이팅하고 ES-LIF 배지중에 4일 동안 배양하였다. FGF(20 ng/ml)를 가하고 세포를 3일 더 배양하였다. 이 기간후, HGF(20 ng/ml) 및(또는) TGF-알파(2 ng/ml)를 가하고 6일 더 배양하였다.
또한, EB를 라미닌 코팅 부착 접시(10 ng/ml)(시그마, #L2020) 또는 0.1% 젤라틴 코팅 35*10 mm 부착 접시로 옮기고 ES-LIF 배지중에서 1 내지 2일 동안 배양하였다. 배지를 제거하고, 혈청 무함유 DMEM/F12(인비트로겐, #11330-0321) 배지를 인슐린(5 ㎍/ml)(인비트로겐, #I1882), 셀레늄 클로라이드(0.015 nM)(시그마, #S5261), 트랜스페린(50 ㎍/ml)(시그마, #T-2036) 및 피브로넥틴(5 ㎍/ml)(시그마)로 보충하였다. 이 배지를 ITSFn 배지로 지정하였다. 세포를 6일 동안 ITSFn 배지에 공급하였고 이 배지를 2일 마다 교체하였다.
실시예 1(g): 이식된 HS 세포로부터 동종접합 선조세포의 분화 및 단리
동종접합 선조세포를 얻기 위해, 상기 설명 및 실시예에서 상기 개시된 방법으로부터 유래된 다능성 HS 세포를 신장 캡슐하에 면역손상된 마우스중으로 이식하고 4 내지 6주 동안 생체내 성장시켰다. 얻어진 세포 덩어리를 단일 세포로 나누고 세포주로 추가 증식 및 분화를 위해 공급기 세포상에서 배양하였다.
계통 구속(선조세포의 유형)을 평가하기 위해, 유전자 발현 분석, 예를 들어 RT-PCR, 노던 블롯(northern blot), 면역조직화학 등을 공지된 계통 특이 표지자, 예를 들어 외배엽을 위한 NF-H, 케라틴, D-베타-H, 중배엽을 위한 에놀라아제, CMP, 레닌, 칼리케레인, WT1, 델타-글로빈, 베타-글로빈, 및 내배엽 선조 계통을 위한 알부민, 알파-1-AT, 아밀라아제, PDX-1, 인슐린, 알파-FP에 대해 수행하였다.
실시예 2. 마우스 HS 세포의 중배엽성 배아층 세포로의 분화
실시예 2(a): 조혈 세포로의 분화
마우스 HS 세포를 LIF (1000 IU/ml)와 함께 ES 배지 (DMEM Gibco 1195-065; FBS Gibco 16141-079, 100 μM 비필수 (Non-Essential) 아미노산 Gibco 11140-050; 50 단위/ml 페니실린-스트렙토마이신 Gibco 15070-063; 100 μM β-머캅토에탄올 Gibco 21985-023)상에서 3 내지 5일 동안 배양하였다. 그 후 세포를 트립신/EDTA (Gibco 25300-054, 1 ml/60 mm 접시)로 5분 동안 37℃에서 트립신화하고 ES 배지 5 ml를 첨가하였다. 마우스 간세포를 세포 스크래퍼로 접시로부터 들어 올리고 세포 현탁액을 5분 동안 1000 rpm으로 방사하였다. 수득된 세포 펠렛을 LIF 없이 4.5 X 10-4M MTG (monothioglyceral Sigma M6145)로 2 X 106/10 cm 접시의 세포 농도에서 4일 동안 37℃, 5％ CO2에서 ES 배지 중에서 재현탁하였다. 그 후 마우스 HS 세포를 현탁액 중에서 응괴시켜 배아체 (EB)를 형성시켰다.
형성된 30 내지 40개의 EB를 소 태아 혈청, 소 혈청 알부민, 소 췌장 인슐린, 인간 트랜스페린 (철 포화), β-머캅토에탄올, L-글루타민, rm IL-3, rh IL-6, rm SCF 및 rh-에리트로포에틴을 함유하는 3 ml 메틸셀룰로오스 기재 조혈세포 분화 배지 M3434 (Stemcell 03434)를 갖는 35 mm 접시로 옮기고, 37℃, 5％ C02에서 배양하였다. 10일 배양한 후, 여러 콜로니 및 상이한 유형의 세포를 피펫 팁으로 집어 서 500 ㎕ IMDM 배지 (Sigma I3390) 중에서 재현탁하였다. 그 후 혼합물을 4-웰 챔버슬라이드 중으로 옮기고, 37℃에서 3시간 이상 동안 챔버 슬라이드를 배양하여 콜로니 및 세포를 슬라이드에 부착시켰다. 세포를 슬라이드에 부착한 후, IMDM 배지를 폐기하고 세포를 7분 동안 메탄올 중에서 고정시켰다. 메탄올 고정 후 슬라이드를 통풍 건조시키고, 1:20 희석된 기엠사 (Giemsa) 스테인 (Sigma GS-500)으로 실온에서 30분 동안 염색한 후, 물로 3회 세척하였다. 10일 동안 배양한 후 콜로니 및 상이한 유형의 조혈세포를 관찰하기 시작했다. 상기 프로토콜을 사용하여 수득한 CFU (콜로니 형성 단위)에 있어 도 5a, 적혈구에 있어 도 5b, 단핵세포에 있어 도 5c 및 림프구에 있어 도 5d를 참조할 것.
또한 M3434에서 10 내지 15일 동안 성장한 EB를 IMDM, 10％ FBS 및 IL-3 (Stemcell 02733) 단독으로 또는 IL-3 및 GM-CSF (Stemcell 02732)의 조합을 갖는 35 mm 접시로 옮겼다. 세포를 고정하고 상기와 같이 염색하고 사이토킨과 액체 IMDM 중에서 5일 안에 EB로부터의 세포 분화를 관찰하였다. IL-3와 IMDM으로부터 분화된 세포는 과립을 함유하나 단핵세포는 함유하지 않았고, IL-3와 GM-CSF로부터 분화된 세포는 과립 및 일부 단핵세포를 함유하였다. (도 5e 및 5f 참조)
실시예 2(b): 자발적 수축 근육 세포로의 분화
마우스 HS 세포를 LIF (1000 IU/ml)와 함께 ES 배지 (DMEM Gibco 1195-065; FBS Gibco 16141-079, 100 μM 비필수 아미노산 Gibco 11140-050; 50 단위/ml 페니실린-스트렙토마이신 Gibco 15070-063; 100 μM β-머캅토에탄올 Gibco 21985-023) 중에서 3 내지 5일 동안 배양하였다. 그 후 세포를 트립신/EDTA (Gibco 25300- 054, 1 ml/60 mm 접시)로 5분 동안 37℃에서 트립신화하고 ES 배지 5 ml를 첨가하였다. 마우스 간세포를 세포 스크래퍼로 접시로부터 들어 올리고 세포 현탁액을 5분 동안 1000 rpm으로 방사하였다. 수득된 세포 펠렛을 LIF 없이 2 X 106/10 cm 접시의 세포 농도에서 4일 동안 37℃, 5％ CO2에서 ES 배지 중에서 재현탁하였다. 그 후 마우스 HS 세포를 현탁액 중에서 응괴시켜 배아체 (EB)를 형성시켰다.
형성된 10 내지 15개의 EB를 젤라틴으로 코팅된 24-웰 플레이트로 옮기고 (0.1％ 젤라틴 1 ml를 각각의 웰에 첨가하고 2시간 이상 동안 후드안에 두었다. 그 후 젤라틴을 제거하고 플레이트를 30분 동안 건조시켰다.), LIF 무함유 ES 배지 (2일마다 교체함)에서 배양하였다. 4일째 정도에 자발적 수축 세포 또는 박동 EB가 나타났고 3 내지 4일까지 박동이 계속되었다. (도 6 참조).
또한, 상기한 바와 같이 수득된 EB를 소 태아 혈청, 소 혈청 알부민, 소 췌장 인슐린, 인간 트랜스페린 (철 포화), β-머캅토에탄올, L-글루타민, rm IL-3, rh IL-6, rm SCF 및 rh-에리트로포에틴을 함유하는 M3434 (Stemcell 03434)라 불리는 반고체 배지 (1％ 메틸셀룰로오스로 됨) 중에서 37℃, 5％ C02에서 배양함으로써 박동 EB를 유발하였다. 3 내지 4일 배양한 후, 박동 EB를 관찰하였다.
또한 상기 EB를 37℃, 5％ CO2에서 4일 동안 배양한 후, 인슐린 (5 ㎍/ml, Sigma I1882), 셀레늄 클로라이드 (30 nM, Sigma S5261) 및 피브로넥틴 (5 ㎍/ml, Sigma F1141)을 함유한 DMEM/F12 (Gibco 11320-033)를 함유하는 혈청 무함유 ITSFn 배지 중에서 형성시켰다.
실시예 3. 마우스 HS 세포의 내배엽성 배아 층 유래 세포로의 분화
실시예 3(a): 췌장 세포로의 분화
60 mm 접시 (펠콘 (Falcon), #353802)에서 일차 배아 섬유모세포 층과 함께 배양한 HS 세포 및(또는) 0.1 ％ 젤라틴-코팅된 접시에서 배양한 HS 세포에 트립신/EDTA (인비트로젠 (Invitrogen), #25300-050) 1.5 ㎖을 첨가하여 트립신으로 세포를 떼어내고, 이 세포를 ES-LIF 배지 1.5 ㎖이 들어있는 15 ㎖ 코니칼 튜브내로 옮겼다. 세포를 1000 rpm에서 회전 침전시키고, 상층액을 제거하였다.
수득한 세포 펠렛에 ES-LIF 배지 2 ㎖을 첨가하고 재현탁시켜 단일 세포 현탁액으로 만들고, 현탁 배양-35＊10 mm-접시 (날게넝크 (NalgeNunc), #171099)에서 현탁 세포로서 배양하여, 간세포가 배아유사체 (embryoid body, EB)로 알려진 원형 클러스터를 형성하도록 하였다. 형성된 EB를 2일마다 15 ㎖ 코니칼 튜브로 옮겨서 세척하였다. EB를 침전시키고 상층액을 제거하였다. 그 후 새로운 ES-LIF를 첨가하고, EB를 현탁 배양 접시로 다시 옮겼다. 배아유사체로서 배양된 HS 세포는 모든 배아 세포 층 (외배엽, 내배엽 및 중배엽)을 포함하였다.
췌장 전구 세포의 선별
배아유사체로서 4일 내지 6일 동안 배양한 후, 세포를 15 ㎖ 코니칼 튜브로 옮기고 침전시켰다. 배지 절반을 제거하고 새로운 ES-LIF 배지 1.5 ㎖을 튜브에 첨가한 후, 튜브내 모든 내용물을 0.1 ％ 젤라틴-코딩된 35＊10 mmm 점착성 접시로 옮기고 밤새 배양하였다. 다음 날 ES-LIF 배지를 제거하고, 인슐린 (5 ㎍/㎖; 시그마 (Sigma), #I-1882), 염화셀레늄 (0.015 nM; 시그마 (Sigma), #S5261), 트렌스 페린 (50 ㎍/㎖; 시그마 (Sigma), #T-2036) 및 피브로넥틴 (5 ㎍/㎖; 시그마 (Sigma), #F-0895)이 첨가된 무혈청 DMEM/F12 (인비트로젠 (Invitrogen), #11330-0321) 배지를 첨가하였다. 이 배지를 ITSFn 배지로 명칭하였다. 세포를 ITSFn 배지에서 6일 동안 배양하면서, 배지를 2일마다 교체하였다.
또한, ES-LIF 배지가 들어있는 라미닌-코팅된 점착성 접시 (10 ng/㎖; 시그마 (Sigma), #L-2020)에서 EB를 2일 내지 4일 동안 배양하여 내배엽성 세포가 배아유사체에서 이탈되도록 하고, 이것을 N2 (인비트로젠 (Invitrogen), #I7502-048), B27 (인비트로젠 (Invitrogen), #I7504-44) 및 bFGF (10 ng/㎖; 인비트로젠 (Invitrogen), #13256-029)가 첨가된 8.7 mM 글루코스 DMEM/F12 무혈청 배지에서 4일 동안 증식시켰다. 내배엽 증식 후, 배지를 ITSFn 배지로 바꾸고, 2일마다 배지를 교체하며 6일 동안 배양하여 췌장 전구 세포를 선별하였다.
별법으로, EB 배양 4일 내지 6일 후에 트립신/EDTA 1 ㎖을 첨가하여 트립신으로 세포를 떼어내고, ES-LIF 배지로 세척하고, 10 ％ 교체 혈청 (인비트로젠 (Invitrogen), #10828) 및 G5 (인비트로젠 (Invitrogen), #17503), 또는 베타 NGF (알＆디 시스템 (R＆D systems), #256-GF)가 첨가된 DMEM/녹아웃 (Knockout) 배지 (인비트로젠 (Invitrogen), #10829-018)내에서 재현탁시켜 단일 세포 현탁액으로 만들었다. 상기 세포를 피브로넥틴-코팅된 35 mm 접시 (10 ㎍/㎖)에서 2일마다 배지를 교체하며 4일 내지 6일 동안, 배지 3 ㎖ 당 세포수 3-5×105개로 배양하였다. 4일 내지 6일 후, 상기 DMEM/녹아웃 배지를 대신하여 ITSFn 배지를 교체 첨가하고, 세포를 6일 동안 더 배양하여 췌장 전구 세포를 선별하였다.
상기 췌장 전구 세포는 초기 마커 (marker)로서의 네스틴 (Nestin), 뉴로게닌 (neurogenin) 3 및 티로신 탈수소효소에 대해 양성으로 나타났다.
bFGF 에 의한 췌장 전구 세포의 증식. ITSFn 매질에 보존된 세포를 매질을 제거한 후, PBS로 2회 세척하였다. 1 ml의 트립신/EDTA를 첨가하고, 세포를 37 ℃에서 5 분 동안 배양하여 해리시켰다. 셀 스크래퍼 (cell scraper)를 사용하여 qn착 세포를 더 해리시켰다. 이어서, 3 ml의 ES-LIF 매질을 접시에 첨가하고, 전체 내용물을 15 ml 코니칼 튜브로 옮겼다. 췌장 선조 세포를 선택하고 남은 DB를 약 2 내지 5 분 동안 침강시키고, 상청액을 새로운 15 ml 코니칼 튜브로 옮기고, 1200 rpm에서 회전시켰다. 상청액을 버리고, 5.8 mM 이하의 글루코스에서 N2 (인비트로겐 (Invitrogen), #I7502-048), B27 (인비트로겐, #I7504-44) 및 bFGF (10 ng/ml)(인비트로겐, #13256-029)로 보충된 무-혈청 DMEM/F12 매질에 세포 펠릿을 재현탁시켰다. 상기 매질을 N2 매질로 지정하였다.
세포를 계수하고, 폴리-L-오르니틴 (15 ug/ml)(시그마 (Sigma), #P36550)으로 예비코팅된 24-웰 플레이트에 2-5 X 105 세포/웰/400 ul N2 매질의 밀도로 시딩하였고, 6 내지 8일 동안 증식시켰다. 다르게는, 세포를 5 X 104 세포/웰/400 ul N2 매질의 밀도로 시딩하고 8 내지 10 일 동안 증식시켰다.
예비코팅 프로토콜은 하기와 같았다: 400 ul의 폴리-L-오르니틴 (15 ug/ml)을 24-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 실온에서 밤새 정치시켰다. 이어서, 플레 이트를 PBS로 2회 세척하고, 새로운 PBS를 첨가하고 플레이트를 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 플레이트를 PBS로 세척하고, 400 ul의 피브로넥틴 (10 ug/ml)를 첨가한 후, 플레이트를 실온에서 사용하기 전 적어도 2 시간 동안 배양하였다.
췌장 선조 세포의 인슐린-분비 베타-섬 세포로의 분화
100 ng/ml의 EGF (인비트로겐, #53003-018), 20 ng/ml의 HGF (시그마, #H1404), 및 20 ng/ml의 액티빈 A (시그마, #A4941) 또는 20 ng/ml의 VEGF (알 앤드 디 시스템즈 (R & D Systems), #298-VS)의 존재하에서 N2 매질로부터 bFGF를 회수함으로써 췌장 선조 세포를 인슐린-분비 베타 섬 세포로 분화시켰다. 매 2일 마다 매질을 교체하면서 세포를 6 일 동안 분화시켰다. 분화시, 췌장 상피세포가 소형의 구형 세포로 생성되었고, 상기는 신속하게 증식되어 평활한 구형을 나타내는 유기적인 세포 군집을 형성하였다 (도 7a 참조).
인슐린-분비 베타 섬의 검출. 인슐린 생성 및 분비를 검출하기 위해서, 분화 매질을 제거하고, 10 mM의 니코틴아미드, .015 nM의 염화셀레늄, 50 ug/ml의 트랜스페린, .1 mM의 푸트레신 (시그마, #P5780), 및 20 nM의 프로게스테론 (시그마, #P8783)으로 보충된 고 글루코스 DMEM/F12로 대체하였다. 이어서, 상기 세포들을 37 ℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 3 시간 후, 인슐린 분비 분석을 위해 각 웰 중의 매질을 모아 - 70 ℃에 보관하거나, 면역세포화학을 위해 각 웰 중 세포를 4 ％ 파라포름알데히드 (EMS, #15712) 중 실온에서 30 분 동안 고정하거나, 또는 유전자 발현의 RT-PCR 분석을 위해 각 웰로부터의 RNA를 RNAzol (텔-테스트 인크. (Tel-Test, Inc.), 텍사스주 프렌즈우드 소재, #CS-105)에 의해 모았다. 몇몇 실 험에서는 면역세포화학 또는 PT-PCR 대신, 밤새 4 ℃에서 산-에탄올로 추출함으로써 췌장-구형 군집의 인슐린 함량을 측정하였다. 무-세포 추출물을 모으고, 0.4 M 트리스-염기로 중화시키고, 인슐린 함량 분석을 위해 - 70 ℃에서 보관하였다.
면역세포화학. 실온에서 30 분 동안 4 ％ 파라포름알데히드 중 고정 후, 세포를 PBS (바이오플루이즈 (Biofluids), #P312-500)로 3회 세척하였다. 상기 세포들을 실온에서 5 분 동안 100 ％ 메탄올 (피셔 사이언티픽 (Fischer Scientific), #HC400-1gal) 중 더 고정하고 투과가능케하였다 (permeabilization). 이어서, 세포를 PBS로 3회 더 세척하고, 저해 용액 (다코 엔비젼 더블 스테인 시스템 (DAKO Envision double stain system), #K1395)으로 5 분 동안 저해시켰다. 과량의 저해 완충액을 제거하고, 1차 항체를 적용한 후, 세포를 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 인슐린에 대해서, 사용한 1차 항체는 1:50 희석된 다클론성 기니아 피그 항-인슐린 (다코 (DAKO), #A0564)이었다. 희석액을 매질 B 중에서 제조하였다 (칼태그 (Caltag), #GAS002).
세포를 PBS로 3회 헹구고, HRP-접합된 2차 항체를 적용한 후 (바틀 (Bottle) 2)(다코, #K1395), 세포를 30 분 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 3회 헹구고, 과량의 액체를 흡착시키고, 액체 DAB-색소원 기질 (바틀 3)을 5 내지 10 분 동안 첨가하였다. 마지막으로, 세포를 PBS로 다시 헹구고 현미경으로 검사하였다 (도 7b 참조).
글루카곤, 1:300 (DAKO, #A0565)에 대한 이중 스테이닝을 DAKO 엔비젼 (Envision) 이중 스테이닝 프로토콜에 따라 수행하였다 (도 7b를 참조). Pax6, 1:300 (콘밴스 (Convance, #PRB-278P)) 및 다른 세포형을 표시하기 위한 항체를 또한 사용하였다. 별법으로, 모든 면역스테이닝을 플루오로크롬으로 콘주게이션된 이차 항체 (시그마 (Sigma), 몰레큘라 프로브즈 (Molecular Probes) 또는 잭슨 랩스 (Jackson Labs))를 사용하여 수행하고 레이카 (Leica) 도립 (inverted) 형광 현미경으로 가시화하였다.
인슐린 분비 및 세포-함량 측정 분석법: 췌장 구형 클러스터의 인슐린 단백질 분비 또는 인슐린 함량을 측정하기 위해, 각각의 웰로부터 수집한 매질 또는 에탄올 추출물을 효소결합항체법 (ELISA, 일리노이주 시카고 소재 크리스탈켐 (Crystalchem))에 적용하였다.
실시예 3(b): HS 세포의 간(肝)세포로의 분화
HS 세포의 간(肝)세포 분화를 위한 하기 프로토콜은 문헌 [Hamazaki et al., "Hepatic maturation in differentiating embryonic stem cells in vitro", FEBS Lett. 497(1): 15-9 (2001)]에 기초한다.
동종접합 간세포를 조직 배양 디쉬 (FALCON 35-3802, 60 ×15 mm 스타일, 폴리스티렌, 비발열, 벡톤 디킨슨 랩웨어 (Beckton Dickinson Labware)) 상에서 비필수 아미노산, 펜-스트렙 (라이프 테크놀로지즈 (Life Technologies)), 베타-메르캅토에탄올 (시그마) 및 LIF (케미콘 (Chemicon))로 보충된 DMEM 배지 중 20% 소 태아 혈청을 함유한 간세포 배지에서 미토마이신 처리된 마우스 배아 섬유모세포 (STO 세포)에 플레이팅하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 이어서 HS 세포를 트립신-EDTA (0.05% 내지 0.5%) (라이프 테크놀로지즈)로 트립신화하고, LIF 없는 동일한 배지에서 배아체 형성을 위해 5 일 동안 서스펜전 디쉬 (suspension dish) (리드 (Lid) 및 벤트 (Vent)와 서스펜전 디쉬 (Suspension Dish), 날지 넌크 인터내셔날 (Nalge Nunc International), 171099, 35 ×10 mm)에서 배양하였다. 이어서 형성된 배아체를 100 ng/ml 산성 섬유모세포 성장 인자 (시그마, F-3133)를 함유한 LIF가 없는 간세포 배지 중에서 0.1% 콜라지 (collage) 유형 I (시그마, C 7661)로 코팅된 24-웰 플레이트 (코닝 인코포레이티드 (Corning Incorporated)/코스타 (Costar) 3524, 리드/비발열 폴리스티렌과 24 웰 세포 배양 클러스터/플랫버텀 (Flatbottom))로 옮기고 3일 동안 배양하였다.
3일 후에, 배지를 20 ng/ml 간(肝) 성장 인자 (시그마, H-1404)를 함유한 LIF가 없는 간세포 배지로 6일 동안 교체한 후, 10 ng/ml OSM (시그마, O-9635), 10 μM 덱사메타존 (시그마, D-6645), 5 ㎍/ml 셀레니우스 산 (알드리치 (Aldrich), 22985-7), 50 ㎍/ml 인슐린 (인비트로젠 (Invitrogen), I-1882) 및 50 ㎍/ml 트랜스페린 (시그마, T-2036)을 함유한 LIF가 없는 간세포 배지로 교체하였다. 이어서 분화된 세포를 간(肝) 특이성 유전자 발현에 대해 분석하였다. 분석된 유전자, PCR을 위한 어닐링 온도, 예상된 생성물 크기 및 RTPCR의 프라이머 서열은 하기와 같다: 트랜스티레틴 (TTR) 55 ℃, 225 bp, 5-CTC ACC ACA GAT GAG AAG, 5-GGC TGA GTC TCT CAA TTC; α-페토프로틴 (AFP) 55 ℃, 173 bp, 5-TCG TAT TCC AAC AGG AGG, 5-AGG CTT TTG CTT CAC CAG; α-1-안티-트립신 (AAT), 55 ℃, 484 bp, 5-AAT GGA AGA AGC CAT TCG AT, 5-AAG ACT GTA GCT GCT GCA GC; 알부민 (ALB), 55 ℃, 260 bp, 5-GCT ACG GCA CAG TGC TTG, 5-CAG GAT TGC AGA CAG ATA GTC; 글루코스-6-포스파타제 (G6P), 55 ℃, 210 bp, 5-CAG GAC TGG TTC ATC CTT, 5-GTT GCT GTA GTA GTC GGT; 티로신 아미노트랜스퍼라제 (TAT), 50 ℃, 206 bp, 5-ACC TTC AAT CCC ATC CGA, 5-TCC CGA CTG GAT AGG GTA G; β-액틴, 55 ℃, 200 bp, 5-TTC CTT CTT GGG TAT GGA AT, 5-GAG CAA TGA TCT TGA TCT TC; 및 SEK1, 50 ℃, 300 bp, 5-TGT ATG GAG CTC ATG TCT ACC, 5-GTC TAT TCT TTC AGG TGC CA.
실시예 4. 마우스 HS 세포의, 외배엽 배아층에서 세포로의 분화
실시예 4(a): 뉴런 선조 세포 및 유사분열후의 기능적 신경 세포로의 분화
한 실시양태에서, HS 세포가 뉴런 선조 세포를 형성하도록 유도하였다. HS 세포에서 유래된 신경상피 선조 세포는 뉴런과 신경교 둘다로 분화하고, 더욱 분화되어 광범위하게 다양한 뉴런-특이적 유전자를 발현하고, 흥분성 시냅스 연결부와 억제성 시냅스 연결부를 둘다 발생시킨다. ES 세포에서 나타나는 위치-특이적 신경 마커의 발현 양상은 다양한 중추 신경계 (CNS) 뉴런 세포형의 존재를 입증하는 것이다. 유사하게, HS 세포는 다양한 CNS 구조의 유사분열후의 기능적 뉴런들로 효율적으로 분화될 수 있는 뉴런 선조 세포도 생성한다고 여겨진다.
오까베 (Okabe) 등의 방법을 사용하여 HS 세포의 다양한 뉴런 세포 및 뉴런으로의 분화를 유발하였다 [Okabe et al., Mech. Dev. 59: 89-102 (1996)].
재료. 재료 및 이를 구입한 공급처는 다음과 같았다: 피브로넥틴, 라미닌, 신경기본 배지, B27 보충제 및 수퍼스크립트 II RNase H-역전사효소 (깁코/BRL (미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)); bFGF (R＆D 시스템스 (미국 미네소타주 미네아폴리 스 소재)); 인슐린, 트랜스페린. 염화셀레늄, 폴리오르니틴, 프로게스테론, 푸트레신, T3, 시토신 아라비노시드, 항-MAP2 항체, 항-NF-M 항체, 항-GABA 항체 및 항-글루타메이트 항체 (시그마 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재)); Taq 중합효소 (버쉬랭거-만하임 (Bushranger-Mannheim) (독일 만하임 소재)); 항-GFAP 항체 (ICN 바이오메디칼스 (Biomedicals) (미국 캘리포니아주 코스타 메사 소재)); 항-케라틴 8 항체 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection) (미국 메릴랜드주 록크빌 소재)); 벡타스타인 (Vectastain) ABC 키트 (벡터 래버러토리스 (Vector laboratories) (미국 캘리포니아주 벌링게임 소재); 이중 염색 키트 및 아미노에틸 카르바졸 (지미드 래버러토리스 인크. (Zymed Laboratories Inc.)) (미국 캘리포니아주 카를톤 코트 소재); 항-인산화 CREB 항체 (업스테이트 바이오테크놀로지 인크. (Upstate Biotechnology Inc.) (미국 뉴욕주 레이크 플래시드 소재)); BrdU 염색 키트 (아머샴 (Amersham) (미국 일리노이주 알링톤 하이츠 소재)); 형광 2차 항체 (캅펠 (Cappel) (미국 노쓰 캐롤라이나주 두르함 소재)).
네스틴 -양성 세포의 선별. 4일 동안 ES 배지 현탁 배양물 (배지 성분에 관해서는 상기 실시예들을 참조) 중에 유지한 HS 세포 클럼프 (또는 EB)를 15 ml 튜브로 옮겼다. EB가 침강한 후에, 상기 ES 배양 배지의 절반을 제거하였고, 신선한 ES 배지 2.5 ml을 원래의 배양 디쉬에 첨가하였다. 이어서, 디쉬를 ES 배지로 헹구고, 동일한 15 ml 튜브에 첨가하였다. 이어서, EB를 새로운 조직 배양 디쉬로 옮겼다. 24시간 후에 ES 배지를 교체하였고, 피브로넥틴 (FN)을 함유하는 ITS 배지 (ES 세포에 적합한 물을 5 mg FN (1 mg/ml) 위에 조심스럽게 첨가하고 이를 4℃에서 30분 동안 방치하여 제조한 스톡 25 ㎕/5 ml 배지)를 첨가하였다 (500 ml ITS 배지: DMEM/F12 (1 : 1) (깁코 12500-039) 6 g; 멸균수 0.5 ml 및 10 N NaOH 5 mcl 중에 용해한 인슐린 (인터젠 (Intergen) 4501-01) 2.5 mg; 염화셀레늄 (0.5 mM) 30 mcl; 글루코스 0.775 g; 글루타민 0.0365 g; NaHCO3 1.2 g; 및 트랜스페린 (시그마 T-2036) 25 mg; pH 7.5; 100 × P/S. 5 ml)
이어서, FN을 함유하는 ITS 배지 중의 세포를 6 내지 10일 동안 공급하였으며, 배지는 2일 마다 교체하였다. 도 9a는 배양 6일 후의 네스틴-양성 세포를 나타낸다.
bFGF 에 의한 네스틴 -양성 세포의 증식. ITS/FN 배지 중에 유지시킨 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 이어서, 상기 배지에 트립신/EDTA 용액 (0.05％ 트립신/0.04％ EDTA) 1 ml을 첨가하고, 세포를 37℃에서 5분 동안 유지하여 세포를 떼어냈다. 이어서, ES 배지 (전술한 실시예에서 기재함) 5 ml을 첨가하였고, 세포를 15 ml 튜브로 옮겼다.
먼저 EB를 침강시킨 후에 원심분리하여 수집하였다. 세포 펠렛을 B27 배지 보충제 (B27 무혈청 보충제 50 ×, 액체, 깁코 17504-44)를 함유하는 N2 배지 5 ml 중에 재현탁했다 (N2 배지 500 ml: f12/DMEM 6 g; 글루코스 0.775 g; 글루타민 0.0365 g; NaHCO3 0.845 g; 인슐린 0.0125 g; 1 M 푸트레신 (스톡) 50 ㎕ (최종 100 μM) ; 0.5 mM 셀렌산염 (스톡) 30 mcl (최종 30 nM; 0.1 mM 프로게스테론 (스톡) 100 mcl (최종 20 nM); pH 7.2로 조정함; 100 ×P/S. 5 ml).
이어서, 세포를 계수하여 24-웰 플레이트에 5 ×105개 세포/웰의 세포 밀도로 접종 (N2 배지 400 mcl)하거나 폴리-L-오르니틴 (15 ㎍/ml) 및 라미닌 (1 ㎍/ml) (둘다 미국 매사추세츠주 베드포드에 소재하는 벡터 딕킨슨 랩웨어 (Bector Dickinson Labware) 제품)로 예비코팅해 둔 6 cm 디쉬에 5 ×106 내지 7 ×106개 세포/디쉬의 세포 밀도로 접종 (N2 배지 3 ml)하였다 (예비코팅 프로토콜: 멸균 커버 슬립 (어시스텐트 (assistent) 1001/0012, 12 mm)을 각 웰 (24-웰 플레이트)에 삽입하였음; 폴리-L-오르니틴 400 ㎕ (15 ㎍/ml)을 첨가한 후에, 1000 ×스톡으로부터 PBS로 희석하여 밤새 방치하였음; 상기 플레이트를 PBS로 세척한 후에 신선한 PBS를 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 30분 동안 놓아 두었음; 이어서, 플레이트에 다시 PBS 및 FN (1 ㎍/ml) 400 ㎕를 첨가한 후에 1000 ×스톡으로부터 PBS로 희석하였음; 플레이트를 37℃에서 2시간 이상 놓아두었음).
이어서, 플레이팅된 세포에 10 내지 20 ng/ml bFGF (미국 미네소타주 미네아폴리스에 소재하는 R＆D 시스템스 제품) 및 B27 보충제를 함유하는 N2 배양 배지를 첨가하고, 세포를 상기 배지상에 6일 동안 공급하였다. 배지를 2일 마다 교체하였다. 계대배양을 위해서는, PBS 중 0.05％ 트립신 및 0.04％ EDTA로 세포를 떼어내고, 원심분리하여 수집하고 다시 플레이팅했다.
bFGF 로 증식된 네스틴 -양성 세포의 분화. 세포 배양물에서 bFGF를 제거하여 세포의 분화를 유도하였다. 세포 클럼프가 3 내지 4일 동안 라미닌 (1 mg/ml)을 보충한 N2 배지 중에 cAMP (1 mM) 및 AA (200 μM) (둘다 미국 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마 제품)의 존재 또는 부재하에서 스프레딩되도록 하였다. 이어서, 세포를 분화 조건하에 6 내지 15일 동안 인큐베이션했다.
면역세포화학. 인산염 완충 염수 (PBS; pH 7.4) 중 2％ 파라포름알데히드를 사용하여 세포를 20 내지 30분 동안 고정시키고, PBS 중 0.2％ Triton X-100를 사용하여 투과성이 되도록 하고, 5％ 정상 염소 혈청으로 처리하였다. 세포를 네스틴에 대한 1차 항체 (1 : 1000; NIH의 엠. 마빈 (M. Marvin) 박사에게서 얻음)와 함께 30분 내지 1시간 동안 인큐베이션했다. 또한, 세포는 케라틴 8에 대한 1차 항체 (1 : 1000), 뇌 지방산 결합 단백질 (1 : 1000), MAP2 (1 : 200), NF-M (1 : 100), 시냅신 (Synapsin) I (1 : 1000), GFAP (1 : 50), 04, GalC (생산 세포의 상청액), GABA (1 : 1000) 및 글루타메이트 (1 : 500)와 함께 인큐베이션할 수도 있다. PBS로 세척한 후에, 벡타스타인 ABC 키트의 방법에 따라 세포를 프로세싱했다.
MAP2 및 NF-M을 사용한 이중 면역형광 염색을 위하여, 유사한 방식으로 세포를 고정시키고, Triton X-100을 사용하여 투과성이 되도록 하고, NGS로 처리하였다. 이어서, 세포를 모노클로날 항-MAP2 항체와 함께 인큐베이션한 후에, 플루오레신-표지된 항-마우스 IgG와 인큐베이션한 다음, 다시 2％ 파라포름알데히드로 30분 동안 고정시킬 수 있다. 재고정 후에, 세포를 모노클로날 항-NF-M 항체와 인큐베이션한 후에 로다민-표지된 항-마우스 IgG와 인큐베이션했다. 2번째 고정을 통해, 로다민-접합된 항-마우스 IgG와 항-MAP2 모노클로날 항체와의 교차-반응이 제거되었다.
효소-결합 2차 항체를 사용한 이중-표지 면역세포화학을 위하여, 이중 염색 키트 (지미드 래버러토리스 인크. 제품)에 대한 지침을 따랐다. 항-인산화 CREB 항체 (1 : 1000)를 사용한 염색 기술은 문헌 [Ginty et al. (1993)]에 기재되어 있는 바와 같다.
증식 분석법. 세포를 BrdU과 함께 8시간 동안 37℃에서 인큐베이션했다. 인큐베이션 후에, 세포를 즉시 고정시키고 BrdU 염색 키트에 대한 지침에 따라 프로세싱했다. 착색 반응 후에, 세포를 PBS 중 0.8％ 과산화수소 및 5％ NGS와 함께 30분 동안 인큐베이션하여 HARP 활성을 불활성화시켰다. 격렬한 세척 후에, 항-네스틴 또는 항-MAP2 항체 염색을 위한 프로세싱을 수행함으로써, 아미노에틸 카르바졸로 가시화한 세포질에서 붉은빛 반응 생성물이 생성되었다.
200 ×배율로 각 영역 당 세포의 수를 계수하여, 세포 밀도를 결정하였다. 각 샘플에 대해 8개의 영역을 분석하고, 세포 밀도를 보정하여 평균을 계산했다.
RT - PCR. 콤므크진스키 (Chomczynski) 및 사키 (Sacchi)의 방법 [Chomczynski and Sacchi, Anal Biochem 162: 156-159 (1987)]에 따라 각 세포 제제로부터 전체 RNA를 추출하였다. 전체 RNA를 RNase가 없는 DNase로 처리하고, 수퍼스크립트 II RNase H-역전사효소에 대한 지침에 따라 cDNA 합성을 수행하였다. 0.2 mM dNTP, 각각 0.3 μM의 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 및 0.25 U Taq 중합효소를 함유하는 PCR 완충액 (50 mM KCl, 10 mM 트리스-HCl (pH 8.8), 1.5 mM MgCl2, 0.001％ (w/v) 젤라틴) 중에서 PCR 반응을 수행하였다. 사이클 파라미터는 다음과 같았다: 95℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 어닐링 및 72℃에서 60초 동안 신 장. 사이클 시간은 각 프라이머가 지수 증폭기 내에 있을 동안으로 결정하였다.
게놈 DNA의 증폭은 생성물인 액틴-NMDAR1, NMDAR2D, 칼비딘 D28, GAD65, GABAAa3, AMPA 수용체의 크기를 통해 구별될 수 있다. 다른 프라이머의 경우, 역전사효소를 첨가하지 않은 채로 대조군 증폭을 수행하여, 임의의 게놈 DNA 증폭을 관찰하였다. 대조군 실험에서는 게놈 DNA 증폭이 관찰되지 않았다.
전기물리학. 130 mM 아세트산칼륨 (또는 120 CsCl + 10 KCl), 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 1 mM ATP, 0.1 mM EGTA, 10 mM NaCl을 함유하는 3 내지 6 ㏁ 패치 파이펫을 사용하여 세포를 실온에서 기록한 후에, KOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정하고, 수크로스를 사용하여 삼투압을 300 mosM로 조정하였다. 기록 염수는 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES 및 10 mM 글루코스를 함유하였다. 수크로스를 사용하여 삼투압은 320 mosM로 조정하였고, NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정하였다. 기록된 세포 근처 또는 기록된 세포의 100 ㎛ 이내에서 가시 영역의 인접 세포 근처에서 마이크로파이펫을 통해 압력을 인가하여 글루타메이트 (기록 염수 중 1 mM)를 가하였다. 액소패치 (Axopatch) 증폭기로 전류 신호를 증폭하여 저장하고, pClamp-6 소프트웨어를 사용하여 IBM 컴퓨터상에서 분석하였다.
전자 현미경법. 플라스틱 디쉬 중의 세포를 PBS 중 2％ 파라포름알데히드 및 1％ 글루타르알데히드를 사용하여 1시간 동안 고정시켰다. 이어서, 세포를 물로 세척하여 1％ OsO4를 처리하였으며, 아세트산우라닐로 차단-염색하고 에탄올로 탈수시켜 아랄디트 (Araldite) 수지 중에 묻었다. 얇게 잘라낸 샘플을 JEOL 1200 EX 전자 현미경하에서 관찰하였다.
분화된 뉴런 배양물의 자극. 신경기본 배지 및 B27 및 5％ FCS 중에서 분화시킨 세포를 10 μM 글루타메이트 또는 10 μM NMDA를 함유하는 동일 배지와 함께 10분 동안 인큐베이션했다. 자극 직후에는, 포스포-CREB 염색을 위해 세포를 고정시켰다. 자극 후에 세포를 50분 동안 인큐베이션하고 RNA를 추출하여 c-fos 유도를 분석하였다.
실시예 4(b): 티로신 히드록실라제 -양성 뉴런 세포의 분화
HS 세포는 하기 기재한 바와 같은 여러 단계의 분화 후에 티로신 히드록실라제를 시험관내 생성할 수 있었다. 실시예 1(d)에 기재한 바와 같이 EB를 4일 동안 형성시킨 후에 ES 세포 배지 중의 접착성 조직 배양 표면에 플레이팅하였다.
배양 24시간 후에, ES 세포 배지를 DMEM/F12 (1 : 1), 깁코 11320-033 보충제 및 5 ㎍/ml 인슐린 (시그마 I1882), 30 nM 염화셀레늄 (시그마 S5261) 및 5 ㎍/ml 피브로넥틴 (시그마 F1141)을 함유하는 무혈청 인슐린/트랜스페린/셀레늄/피브로넥틴 (ITSFn) 배지로 교체함으로써, 네스틴-양성 세포의 선별을 개시하였다.
네스틴-선별 6 내지 10일 후에, 세포 증식을 개시하였다. 구체적으로, 0.05％ 트립신/0.04％ EDTA를 사용하여 세포를 떼어내고, DMEM/F12 (1 : 1), N2 보충제 (100 ×, 깁코 17502-048)로 보충한 깁코 11320-033, 20 ㎍/ml 인슐린, 1 ㎍/ml 라미닌 (시그마, L2020), 10 ng/ml bFGF (R＆D 시스템스, 233-FB), 500 ng/ml SHH의 뮤린 N-말단 단편 (R＆D 시스템스, 461-SH) 및 100 ng/ml 뮤린 FGF8 이소형 b (R＆D 시스템스, 423-F8)를 함유하는 N2 배지 중의, l5 ㎍/ml 폴리오르니틴 (시그마, P3655) 및 1 ㎍/ml 라미닌 (시그마, L2020)으로 예비코팅한 조직 배양 플라스틱 또는 유리 커버 슬립에 1.5 ×105 내지 2 ×105개 세포/cm2의 농도로 플레이팅하였다. 배지를 2일 마다 교체하였다.
1 μM cAMP (시그마, A6885), 200 μM 아스코르브산 (시그마, A5960)의 존재 또는 부재하에서 라미닌 (1 mg/ml)을 사용한 증식에 관하여 상기 기재한 배지로부터 bFGF를 제거하여 티로신 히드록실라제-양성 세포의 분화를 유도하였다. 세포를 분화 조건하에서 6 내지 15일 동안 인큐베이션했다.
티로신 히드록실라제-양성 세포를 검출하기 위해서, 유도된 HS 세포 배양물을 PBS (인산염 완충액 염수, pH 7.4)로 1회 헹구고, 4％ 파라포름알데히드 (일렉트론 마이크로스코피 사이언시스 (Electron Microscopy Sciences), 15712)로 30분 동안 고정시켰다. 이어서, 고정된 세포를 PBS로 3회 헹구고 메탄올을 5분 동안 처리하였다.
메탄올로 처리한 세포를 다시 PBS로 3회 헹구고 엔비젼 + 시스템 (Envision + System) (다코 (Dako), K4010)의 차단 용액 (병 1)으로 5분 동안 차단하였다.
과량의 차단 완충액를 떨어뜨리고, 1차 항체 토끼 항-티로신 히드록실라제 (펠 프리즈 (Pel Freez), P40101-0, PBS 중 1 : 300)를 세포에 가하였으며, 60분 동안 실온에서 인큐베이션했다.
1차 항체로 염색된 세포를 PBS로 3회 헹구고, 엔비젼 + 시스템의 2차 항체로 표지된 중합체 (병 2)를 가하여 세포 배양물을 덮어 30분 동안 실온에서 인큐베이 션했다.
2차 항체로 염색된 세포를 PBS로 3회 헹구고, 엔비젼 + 시스템의 액체 DAB + 기질 (병 3)을 첨가하여 세포 배양물을 덮고 5분 동안 인큐베이션했다. 마지막으로, 세포를 PBS로 3회 헹구고, 현미경하에서 티로신 히드록실라제-양성 세포를 검출하였다 (선별 6일 후의 네스틴-양성 세포를 나타내는 도 9b 참조).
도 1은 난모 세포의 단성생식적 활성의 생성물이다.
도 2는 정자 발생 및 난자 발생을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3은 난모 세포의 융합 및 난모 세포 융합 생성물 전개를 나타낸다.
도 4는 난모 세포의 단성생식적 활성 생성물을 상세히 나타낸 것이다.
도 5a는 마우스 HS 세포 유래의 집락 형성 유닛 (CFU)의 형태의 사진이다.
도 5b는 마우스 HS 세포 유래의 적혈구의 형태의 사진이다.
도 5c는 마우스 HS 세포 유래의 단핵 세포의 형태의 사진이다.
도 5d는 마우스 HS 세포 유래의 림프구의 형태의 사진이다.
도 5e는 마우스 HS 세포 유래의 과립을 갖는 조혈 세포의 형태의 사진이다.
도 5f는 마우스 HS 세포 유래의, 과립과 단핵 세포를 모두 갖는 조혈 세포의형태의 사진이다.
도 6은 마우스 HS 세포 유래의 박동 근육 세포의 형태의 사진이다.
도 7a는 마우스 HS 세포 유래의 췌장 세포의 군집의 형태의 사진이다.
도 7b는 인슐린 염색 부위가 갈색으로 표시되고 글루카곤 염색 부위가 적색으로 표시된, 마우스 HS 세포 유래의 췌장 세포의 인슐린 및 글루카곤 염색 사진이다.
도 8a는 인간의 동종 접합 후-감수 분열 I 이배체 난모 세포 유래의 상실 배아형 덩어리의 전개를 나타내는 사진이다.
도 8b는 인간 동종 접합 후-감수 분열 I 이배체 난모 세포 유래의 초기 포배 -유사 덩어리의 사진이다.
도 8c는 인간 동종 접합 후-감수 분열 I 이배체 난모 세포 유래의 내부 세포 덩어리를 방출하는 포배-유사 덩어리의 사진이다.
도 8d는 인간 동종 접합 후-감수 분열 I 이배체 난모 세포 유래의 영양 세포층 (D) 위에서 성장하는 단리된 내부 세포 덩어리의 사진이다.
도 9a는 마우스 HS 세포 유래의 네스틴-양성 신경 선조 세포의 형태의 사진이다.
도 9b는 마우스 HS 세포 유래의 티로신 히드록실라제-포지티브 뉴런 세포의 형태에 대한 사진이다.

Claims (12)

  1. (a) 수정되지 않은 제1 감수분열후의 동종접합 이배체 생식 세포를 칼슘 이온운반체로 인큐베이션시키고, 상기 생식 세포를 6-디메틸아미노푸린으로 인큐베이션시켜, 유사분열 활성화된, 포유동물의 수정되지 않은 동종접합 이배체 생식 세포를 제조하고;
    (b) 상기 유사분열 활성화된, 수정되지 않은 동종접합 이배체 생식 세포를 배양하여 포배-유사 덩어리를 형성시키고;
    (c) 상기 포배-유사 덩어리의 내부 세포 덩어리로부터 동종접합 간세포를 단리하는 것
    을 포함하는 방법으로부터 유래되는 단리된 동종접합 간세포.
  2. 제1항의 단리된 동종접합 간세포를 적합한 조건하에 분화시키는 것을 포함하는, 목적하는 선조 세포, 분화된 세포, 분화된 세포군, 또는 조직형의 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 분화는 세포 조절 인자, 호르몬 또는 사이토킨의 존재하에 상기 단리된 동종접합 간세포를 배양시킴으로써 수행되는 것인 방법.
  4. (a) 표적 유전자를 제1항의 동종접합 간세포 내에 삽입, 제거 또는 변형시켜, 유전적으로 변경된 동종접합 간세포를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 유전적으로 변경된 동종접합 간세포의 분화를 유도하는 단계
    를 포함하는, 유전적으로 변경된 선조 세포의 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 분화는 세포 조절 인자, 호르몬 또는 사이토킨의 존재하에 상기 유전적으로 변경된 동종접합 간세포를 배양시킴으로써 유도되는 것인 방법.
  6. (a) 표적 유전자를 제2항 또는 제3항의 방법으로 제조된 선조 세포 내에 삽입, 제거 또는 변형시켜, 유전적으로 변경된 선조 세포를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 유전적으로 변경된 선조 세포를 배양시켜, 유전적으로 변경된 선조 세포를 성장시키는 단계
    를 포함하는, 유전적으로 변경된 선조 세포의 제조 방법.
  7. (a) 수정되지 않은 제1 감수분열후의 동종접합 이배체 생식 세포를 칼슘 이온운반체로 인큐베이션시키고, 상기 생식 세포를 6-디메틸아미노푸린으로 인큐베이션시켜, 유사분열 활성화된, 포유동물의 수정되지 않은 동종접합 이배체 생식 세포를 제조하고;
    (b) 상기 유사분열 활성화된, 수정되지 않은 동종접합 이배체 생식 세포를 배양하여 포배-유사 덩어리를 형성시키고;
    (c) 상기 포배-유사 덩어리의 내부 세포 덩어리로부터 동종접합 간세포를 단 리하는 것
    을 포함하는 동종접합 간세포의 제조 방법.
  8. 제7항의 방법으로 제조된 단리된 동종접합 간세포를 적합한 조건하에 분화시키는 것을 포함하는, 목적하는 선조 세포, 분화된 세포, 분화된 세포군, 또는 조직형의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 분화는 세포 조절 인자, 호르몬 또는 사이토킨의 존재하에 상기 단리된 동종접합 간세포를 배양시킴으로써 수행되는 것인 방법.
  10. (a) 표적 유전자를 제7항의 방법으로 제조된 동종접합 간세포 내에 삽입, 제거 또는 변형시켜, 유전적으로 변경된 동종접합 간세포를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 유전적으로 변경된 동종접합 간세포의 분화를 유도하는 단계
    를 포함하는, 유전적으로 변경된 선조 세포의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 분화는 세포 조절 인자, 호르몬 또는 사이토킨의 존재하에 상기 유전적으로 변경된 동종접합 간세포를 배양시킴으로써 유도되는 것인 방법.
  12. (a) 표적 유전자를 제8항 또는 제9항의 방법으로 제조된 선조 세포 내에 삽 입, 제거 또는 변형시켜, 유전적으로 변경된 선조 세포를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 유전적으로 변경된 선조 세포를 배양시켜, 유전적으로 변경된 선조 세포를 성장시키는 단계
    를 포함하는, 유전적으로 변경된 선조 세포의 제조 방법.
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