JP2002517982A - 細胞の分化／増殖および維持因子ならびにそれらの使用 - Google Patents

細胞の分化／増殖および維持因子ならびにそれらの使用

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ピーター テイビッド ラスジェン，
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ジュリー − アン レイク，
ジェニファー ワシントン，
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、多能性細胞の分化、増殖および／または維持に影響を及ぼし得る生物学的に活性な因子に関する。本発明はまた、生物学的に活性な因子を用いて、多能性細胞から異なる特性を有する多能性細胞（より詳細には、ＥＰＬ細胞）を生成する方法；ならびに上記多能性細胞から部分的に分化した細胞または最終分化した細胞を生成する方法に関する。本発明はまた、多能性細胞および部分的に分化した細胞または最終分化した細胞、ならびにヒト細胞および遺伝子治療、ならびにトランスジェニック動物の生成におけるそれらの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、生物学的に活性な因子、およびより詳しくは胚幹（ＥＳ）細胞を含
む多能性細胞の分化、増殖および／または維持に影響し得る因子に関する。本発
明はまた、生物学的に活性な因子を用いて多能性細胞から、異なる特性を有する
多能性細胞（より詳しくは、ＥＰＬ細胞）を産生する方法；およびその多能性細
胞から部分的に分化した細胞にまたは最終分化した細胞を産生する方法に関する
。本発明はまた、多能性細胞および部分的に分化した細胞または最終分化した細
胞、ならびにそれらの使用に関する。
【０００２】 哺乳動物の胚内での初期発生の事象は、胚外細胞系列を綿密に作り上げ、そし
て胚盤胞の形成を生じ、これは、栄養外胚葉、原始内胚葉および多能性細胞のプ
ール、内細胞塊（ＩＣＭ／原外胚葉）を含む。発生が継続するにつれて、ＩＣＭ
／原外胚葉の細胞が発生し、原始外胚葉を形成するように、それらは、迅速な増
殖、選択的アポトーシス、分化および再構築を被る。マウスにおいて、細胞のＩ
ＣＭは、胚盤胞の移植の時間あたりで迅速に増殖し始める。生じた多能性細胞塊
は、胞胚腔まで広がる。５．０と５．５ｄ．ｐ．ｃとの間で、原外胚葉の内細胞
は、アポトーシスを被り、始原羊膜腔を形成する。外側の生存細胞または初期原
始外胚葉は増殖し続け、そして６．０〜６．５ｄ．ｐ．ｃ．まで、原始外胚葉ま
たは胚外胚葉とよばれる多能性細胞の偽層状化上皮層（ｐｓｅｕｄｏ−ｓｔｒａ
ｔｉｆｉｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｌａｙｅｒ）を形成する。原始外胚葉は
、生殖細胞を生じ、そして原腸形成の間、胚固有の初期胚葉および胚外中胚葉の
産生のための基質として作用する。
【０００３】 原腸形成前の胚内における多能性細胞の一時的に異なるプールの発生潜的なお
よび示差的に発現される遺伝子の分析により、ＩＣＭおよび原始外胚葉の２つの
異なる多能性細胞の集団を同定した。各集団内の細胞は、移植研究及び遺伝子発
現マーカーの分析によって明らかなように相同であるらしい。示差的な遺伝子発
現により規定されるように、多能性細胞の不均一性の確立および原始外胚葉にお
ける多能性細胞の亜集団の決定は、６．５ｄ．ｐ．ｃ．での原始線条の形成より
前に胚において実証されていない。４．５と６．５ｄ．ｐ．ｃ．との間の子宮環
境内での遺伝子マーカーの欠乏および胚の小さなサイズ、複雑性および比較的達
成し難いことにより、多能性細胞の発生の総合的な分析が可能でなかった。
【０００４】 多能性細胞は、胚幹（ＥＳ）細胞として移植前のマウスの胚から単離され得る
。ＥＳ細胞は、インビトロで多能性細胞集団として不定に維持され得、そして、
宿主の胚盤胞に再導入する場合、生殖細胞を含むマウスの全成体組織に寄与し得
る。従って、ＥＳ細胞は、正常なマウスの発生を調節する全てのシグナルに応答
する能力を保持し、そして初期胚内の多能性細胞の生物学および分化を基礎とし
た機構、ならびに胚操作、およびその結果としての商業的、医療的および農業的
適用のための機会を提供する機構の研究のための強力なモデル系を潜在的に示す
。他の多能性細胞および細胞株は、これらの特性および適用のいくつかまたは全
てを共有する。
【０００５】 齧歯類以外の種由来の多能性細胞の首尾良い単離、長期のクローン維持、遺伝
子操作および生殖系伝達は、一般的に、今日まで困難であり、そしてこの原因に
ついては未知である。国際特許出願ＷＯ９７／３２０３３および米国特許第５，
４５３，３５７号は、齧歯類以外の種由来の細胞を含む多能性細胞を記載し、そ
して、始原多能性細胞は、国際特許出願ＷＯ９８／４３６７９およびＷＯ９６／
２３３６２ならびに米国特許第５，８４３，７８０号に記載される。しかし、こ
れらの多能性細胞が異なる特性を有する多能性細胞に形質転換され得る場合、始
原多能性細胞は有用である。
【０００６】 ＥＳ細胞の分化は、自己再生を促進し、そして幹細胞の分化を妨げるサイトカ
イン白血病抑制因子（ＬＩＦ）、および他のｇｐ１３０アゴニストによりインビ
トロで調節され得る。しかし、ＬＩＦの存在下かまたは非存在下における、レチ
ノイン酸を除く、ＥＳ細胞の特定の細胞型への分化を誘導し得る生物学的分子は
、現在、未知である。
【０００７】 先行技術に関連した１つ以上の困難性または欠損を克服、または少なくとも緩
和することは、本発明の目的である。
【０００８】 出願人は、ＥＳ細胞を含む多能性細胞の分化、増殖および／または維持に影響
し得る生物学的に活性な因子を同定した。より詳細には、この因子は、多能性細
胞（例えば、接着培養物中および懸濁培養物中のＥＳ細胞）の、異なる特性を有
する多能性細胞、より詳細には初期原始外胚葉様（ＥＰＬ）細胞への変換を引き
起こし得る。さらに、この因子は、インビトロでのこれらの細胞の増殖を維持お
よび支持し得る。それはまた、インビトロおよびインビボでの原始外胚葉から誘
導されたＥＰＬ細胞の単離および維持を可能にする。
【０００９】 出願人は、理論により制限されることを望まない一方、ＥＰＬ細胞は、６．０
ｐ．ｄ．ｃ．または初期原始外胚葉より前の胚移植後の多能性細胞のインビトロ
等価物を示すと考えられている。
【００１０】 従って、用語「ＥＰＬ細胞」とは、多能性を保持し、そして以下によりＯｃｔ
４およびＦｇｆ５を発現する細胞へ変換ならびに／またはＯｃｔ４およびＦｇｆ
５を発現する細胞として維持される多能性細胞由来の細胞をいうことが理解され
るべきである： （ａ）本発明の生物学的に活性な因子またはそれらの高分子量もしくは低分子
量成分；あるいは、 （ｂ）本発明に従う馴化培地；あるいは、 （ｃ）本発明に従う低分子量成分の存在下または非存在下における細胞外マト
リクス。
【００１１】 多能性細胞（ＥＰＬ細胞が誘導され得る）は、インビトロまたはインビボで誘
導されたＩＣＭ／原外胚葉、インビトロまたはインビボで誘導された原始外胚葉
、奇形癌細胞、ＥＣ細胞、始原生殖細胞、ＥＧ細胞、および脱分化によるかまた
は核移植により誘導された多能性細胞由来のＥＳ細胞であり得るが、それらに制
限されない。ＥＰＬ細胞はまた、脱分化により、分化した細胞から誘導され得る
。
【００１２】 さらに、ＥＰＬ細胞は、ｇｐ１３０アゴニストの存在下で（ａ）、（ｂ）また
は（ｃ）の除去によりＥＳ細胞へ復帰され得るが、それに限定されない。
【００１３】 この生物学的に活性な因子は、好ましくは２つの成分（低分子量成分および高
分子量成分）を含む。
【００１４】 低分子量成分は、アミノ酸もしくはその機能的に活性なアナログ、あるいはペ
プチドまたはその機能的に活性なフラグメントもしくはアナログであり得る。好
ましくは、低分子量成分は、プロリンもしくはその機能的に活性なアナログ、あ
るいはプロリンを含むペプチドまたは機能的に活性なフラグメントもしくはその
アナログである。さらにより好ましくは、低分子成分は、Ｌ−プロリンまたはＬ
−プロリンを含むペプチドである。このペプチドは、好ましくは約５ｋＤ未満の
分子量であり、より好ましくは、約３ｋＤ未満の分子量を有する。あるいは、ま
たはさらに、このペプチドは、好ましくは約１〜１１、より好ましくは約１〜７
、最も好ましくは約１〜４のアミノ酸の大きさを有する。最も好ましくは、この
ペプチドは、以下の群より選択される： Ｐｒｏ−ａｌａ Ａｌａ−ｐｒｏ Ａｌａ−ｐｒｏ−ｇｌｙ Ｐｒｏ−ＯＨ−ｐｒｏ Ｐｒｏ−ｇｌｙ Ｇｌｙ−ｐｒｏ Ｇｌｙ−ｐｒｏ−ａｌａ Ｇｌｙ−ｐｒｏ−ＯＨ−ｐｒｏ Ｇｌｙ−ｐｒｏ−ａｒｇ−ｐｒｏ Ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｇｌｙ−ｇｌｙ Ｖａｌ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｇｌｙ 物質Ｐ−ｆｒａｇ１〜４（Ａｒｇ−ｐｒｏ−ｌｙｓ−ｐｒｏ） 物質Ｐ遊離酸 （ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−ｇｌ
ｙ−Ｌｅｕ−ｍｅｔＯＨ） プロテアーゼ消化（コラーゲナーゼ消化を含む）コラーゲンフラグメント； ならびに機能的に活性なフラグメントおよびそのアナログ；ならびに生物学的
活性について競合する分子。
【００１５】 用語「機能的に活性な」とは、フラグメントまたはアナログが、ＥＳ細胞を含
む多能性細胞の分化、増殖および／または維持に影響し得ることを意味する。
【００１６】 高分子量成分は、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。好ましくは、高
分子量成分は、約１０ｋＤより大きい分子量を有し、より好ましくは約５０〜１
０００ｋＤの間、最も好ましくは約１００〜５００ｋＤの間の分子量を有する。
この高分子量成分は、溶液中であり得るかまたは細胞外マトリクス中に含まれ得
る。
【００１７】 本発明のこの局面の好ましい形態において、高分子量成分は、細胞外マトリク
スタンパク質であり得るか、または機能的に活性なフラグメントもしくはそのア
ナログ（例えば、フィブロネクチンまたはラミニンあるいはそれらの機能に活性
なフラグメントもしくはアナログ）であり得る。特定の好ましい形態において、
高分子量成分は、細胞性フィブロネクチンである。細胞性フィブロネクチンは、
１０％還元／変性ポリアクリルアミドゲルで測定した場合、約２１０〜２５０ｋ
Ｄの分子量を有し得る。
【００１８】 本発明のさらなる局面において、ＥＳ細胞を含む多能性細胞の分化、増殖およ
び／または維持に影響し得る組成物が提供され、上記組成物は、本明細書中で先
に記載したような生物学的に活性な因子および／または低分子量成分および／ま
たは高分子量成分を、アジュバント、賦形薬またはキャリアと共に含む。
【００１９】 生物学的に活性な因子は、培養された細胞により馴化された培地から単離され
得る。あるいは、生物学的に活性な因子の成分は、他の供給源から生成され得、
合成または組換え的に生成され得る。
【００２０】 従って、本発明のさらなる局面において、多能性細胞の分化、増殖および／ま
たは維持に影響し得る馴化培地、あるいは約５ｋＤａ未満の培地成分を含むその
画分、および／または約１０ｋＤａより上の培地成分を含むその画分が提供され
る。
【００２１】 好ましくは、この馴化培地は、本明細書中で先に記載されるような生物学的に
活性な因子、またはその低分子量成分もしくは高分子量成分を含む。
【００２２】 好ましくは、この馴化培地は、本明細書中で後に記載されるような方法により
調製される。
【００２３】 好ましくは、この馴化培地は、肝細胞または肝癌細胞もしくは肝癌細胞株、よ
り好ましくはヒト肝細胞癌細胞株（例えばＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ ＨＢ−８
０６５）またはＨｅｐａ−１ｃ１ｃ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０２６））
、初代胚性マウス肝臓細胞、初代成体マウス肝臓細胞、または初代ニワトリ肝臓
細胞、あるいは胚外内胚葉細胞もしくは胚外内胚葉細胞株（例えば、細胞株ＥＮ
Ｄ−２およびＰＹＳ−２）を用いて、調製される。しかし、生物学的に活性な因
子は、任意の適切な種（好ましくは哺乳動物またはトリ）由来の肝臓細胞または
他の細胞により馴化した培地から単離され得る。あるいは、その活性はまた、１
つ以上の他の成分を発現する細胞と異なる２つ以上の馴化培地の寄与により誘導
され得る。
【００２４】 従って、本発明のさらなる局面において、多能性細胞の分化、増殖および／ま
たは維持に影響し得る馴化培地を調製する方法を提供し、上記方法は、以下： 細胞、および細胞培養培地を提供する工程； 上記細胞培養培地において、馴化培地を作製するのに十分な時間で上記細胞を
培養する工程；ならびに 上記培養培地から上記細胞を分離し、上記馴化培地を提供する工程、 を包含する。
【００２５】 この細胞は、任意の適切な型であり得る。好ましくは、この細胞は、肝細胞ま
たは肝癌細胞あるいは肝細胞株または肝癌細胞株である。より好ましくは、それ
らは、ヒト肝細胞癌細胞株、初代胚マウス肝臓細胞、初代成体マウス肝臓細胞、
および初代ニワトリ肝臓細胞からなる群より選択される。最も好ましくは、ヒト
肝細胞癌細胞株（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２細胞（ＡＴＣＣ ＨＢ−８０６５）また
はＨｅｐａ−１ｃ−１ｃ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０２６））が使用され
る。あるいは、この細胞は、内胚葉細胞であり得、より好ましくは初代胚外細胞
、または培養した胚外細胞もしくは細胞株（例えば、内胚葉細胞株ＥＮＤ−２お
よびＰＹＳ−２）であり得る。
【００２６】 この細胞は、それらのインビトロでの増殖および維持に適切な条件下で培養さ
れ得る。このことは、血清（ウシ胎仔血清およびウシ血清を含む）の使用を含む
か、または培地は血清なしであり得る。他の増殖増強成分（例えば、インスリン
、トランスフェリンおよび亜セレン酸ナトリウム）は、馴化培地または細胞外マ
トリクスから誘導され得る細胞の増殖を改善するために添加され得る。当業者に
容易に明らかであるように、増殖増強成分は、培養した細胞型、他の増殖因子の
存在、付着因子および存在する血清の量に依存する。
【００２７】 この細胞は、培養において細胞を確立するのに十分な時間で培養され得る。こ
のことは、（本発明者らは、）培養培地中で細胞が平衡化する時間を意図する。
好ましくは、細胞は、約３〜５日間培養される。
【００２８】 この細胞培養培地は、使用された細胞を確認するのに適切な任意の細胞培養培
地であり得る。細胞が肝臓細胞または肝臓細胞株である場合、培養培地は、好ま
しくは、１０％ＦＣＳ、４０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１ｍＭ Ｌ−グルタミ
ン、３７℃、５％ＣＯ2で補充した、高いグルコースを含むＤＭＥＭである。
【００２９】 細胞からの細胞培養培地の分離は、細胞から培地をデカントすることのような
任意の適切な技術により達成され得る。好ましくは、細胞培養培地は、遠心分離
または濾過（例えば、０．２２μＭフィルターを通して）により明澄化されて、
過剰の細胞および細胞細片を除去する。この分離方法により培地から増殖成分を
取り出さない場合、培養物から細胞を分離する他の公知の方法が用いられ得る。
【００３０】 本発明のなおさらなる局面について、実質的に、または部分的に精製された細
胞外マトリクスが提供される。この細胞外マトリクスは、多能性細胞の分化、増
殖、および／または維持に影響し得る。
【００３１】 好ましくは、この細胞外マトリクスは、本明細書中で先に記載されるような生
物学的に活性な因子、またはその高分子量成分を含む。
【００３２】 好ましくは、この細胞外マトリクスは、本明細書中に後に記載されるような方
法によって調製される。
【００３３】 従って、本発明のさらなる局面において、多能性細胞の分化、増殖、および／
または維持に影響し得る細胞外マトリクスを調製するための方法が提供され、こ
の方法は、以下： 細胞、支持基材、および細胞培養培地を提供する工程； 支持基材の存在下で上記細胞培養培地中の上記細胞を、細胞外マトリクスが生
成するのに十分な時間で培養する工程；ならびに 上記細胞および上記培養培地を、上記支持基材から分離し、細胞外マトリクス
を提供する工程、 を包含する。
【００３４】 この細胞は、任意の適切な型であり得る。好ましくは、この細胞は、肝細胞も
しくは肝癌細胞または肝細胞株もしくは肝癌細胞株である。より好ましくは、そ
れらは、ヒト肝細胞癌細胞株、初代胚マウス肝臓細胞、初代成体マウス肝臓細胞
、および初代ニワトリ肝臓細胞からなる群より選択される。最も好ましくは、ヒ
ト肝細胞癌細胞株（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２細胞（ＡＴＣＣ ＨＢ−８０６５）ま
たはＨｅｐａ−１ｃ−１ｃ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０２６））が使用さ
れる。あるいは、この細胞は、内胚葉細胞であり得、より好ましくは初代胚外細
胞、または培養した胚外細胞もしくは細胞株（例えば、内胚葉細胞株ＥＮＤ−２
およびＰＹＳ−２）であり得る。
【００３５】 この細胞は、馴化培地の調製について記載される条件に従って、培養され得る
。マトリクス関連活性の単離は、ＥＣＭおよび支持下層から細胞培養培地および
適切な細胞または細胞株の分離を含む。これは、適切な緩衝液でマトリクスを洗
浄することを含む。好ましくは、細胞は、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中
、０．２％アジド、０．１ｍＭ ＰＭＳＦで、６〜１８時間培養し、細胞を殺傷
および分離するか、またはＰＢＳでさらに洗浄することによって除去した細胞お
よび細片を用いて、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ中で１５分間培養し、細胞を分離した
。
【００３６】 あるいは、多能性細胞の分化、増殖および／または維持に影響し得る細胞外マ
トリクスは、動物供給源（例えば、内臓、壁または原始内胚葉）または動物細胞
および組織（例えば胎盤）から調製され得る。細胞外マトリクスはまた、人工的
手段（例えば、精製した細胞外マトリクスまたは半精製した細胞外マトリクス成
分を組織培養プレート上で乾燥させる）によって調製され得る。
【００３７】 出願人は、ヒト肝細胞腫細胞株、初代胚マウス肝臓細胞、初代成体マウス肝臓
細胞および初代ニワトリ肝臓細胞を用いて調製した生物学的に活性な因子は、マ
ウスＥＳ細胞の分化、増殖および／または維持に影響し得ることを見出している
。従って、出願人は、理論により限定されることを望まないが、この因子は、種
を超えて生物学的に活性であるようである。
【００３８】 生物学的に活性な因子の成分は、部分的または実質的に精製され得る。この成
分の精製は、細胞の除去、続いて陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互
作用クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンアフィニ
ティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過法、順相
クロマトグラフィーおよび／または逆相クロマトグラフィーのような技術により
行われ得る。好ましくは、この成分の精製は、ＦＰＬＣおよびＨＰＬＣクロマト
グラフィー技術を用いて実行される。
【００３９】 本発明のこの局面の好ましい形態において、低分子量成分は、必要に応じた分
画の組み合せにより精製され得る（例えば、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー（好ましくは、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｇ１０カラム上で）、順相クロマトグ
ラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィー（好ましくは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘペ
プチドゲル濾過カラム上で）；ならびに好ましくは、規定された順で連続的に精
製され得る。
【００４０】 従って、本発明は、多能性細胞の分化、増殖および／または維持に影響し得る
生物学的に活性な因子の低分子量成分を部分的または実質的に精製するための方
法を提供し、この方法は、以下 この低分子量成分の供給源、 第１のゲル濾過クロマトグラフィー支持体、 順相クロマトグラフィー支持体、および 第２のゲル濾過クロマトグラフィー支持体 を提供する工程； この低分子量成分の供給源を第１のゲル濾過クロマトグラフィー支持体に接触
させて、第１の画分を生成する工程； この第１の画分を、順相クロマトグラフィー支持体に接触させて、第２の画分
を生成する工程；ならびに この第２の画分を第２のゲル濾過クロマトグラフィー支持体に接触させて部分
的または実質的に精製された低分子量成分を生成する工程、 を包含する。
【００４１】 好ましくは、この方法は、上記の低分子量成分の供給源を分画工程（例えば、
限外濾過）に供し、約３ｋＤ未満の分子量の成分を含む画分を得る、さらなる工
程を包含する。
【００４２】 本発明のこの局面のさらなる好ましい形態において、高分子量成分を、アフィ
ニティクロマトグラフィー（好ましくは、ヘパリンセファロースアフィニティク
ロマトグラフィー（例えば、ヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂカラム上で））、
陰イオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｒｅｓｏｕｒｓｅ Ｑ陰イオン交換
カラムを使用して）およびゲル濾過クロマトグラフィー（好ましくは、Ｓｕｐｅ
ｒｏｓｅ ６ゲル濾過カラム上で）の組合せによって、そして好ましくは、この
述べた順序で連続することによって、精製し得る。
【００４３】 従って、本発明は、多能性細胞の分化、増殖、および／または維持に影響し得
る生物学的に活性な因子の高分子量成分を、部分的または実質的に精製する方法
を提供する。この方法は、以下の工程を包含する： 上記の高分子量成分の供給源、 ヘパリンアフィニティクロマトグラフィー支持体、 陰イオン交換クロマトグラフィー支持体、および ゲル濾過クロマトグラフィー支持体 を提供する工程； 上記の高分子量成分の供給源をヘパリンアフィニティクロマトグラフィー支持
体に接触させて第１の画分を生成する工程； 上記の第１の画分を陰イオン交換クロマトグラフィー支持体に接触させて第２
の画分を生成する工程；ならびに 上記の第２の画分をゲル濾過クロマトグラフィー支持体に接触させて、部分的
または実質的に精製された高分子量成分を生成する工程。
【００４４】 あるいは、高分子量成分を、随意の分画（例えば、限外濾過（例えば、Ａｍｉ
ｃｏｎ ＤｉａＦｌｏ ＹＭ１０膜を使用する））、陰イオン交換クロマトグラ
フィー（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｑ陰イオン交換カラムを使用する）、疎
水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、フェニルセファロース疎水性相互作
用カラムを使用する）、ヘパリンアフィニティクロマトグラフィー（例えば、ヘ
パリンセファロースアフィニティクロマトグラフィー（例えば、ヘパリンセファ
ロースＣＬ−６Ｂカラムを使用する））ならびにゲル濾過（例えば、Ｓｕｐｅｒ
ｏｓｅ ６ゲル濾過カラムを使用する）の組合せで、そして好ましくはこの述べ
た順序で連続することにより精製し得る。
【００４５】 従って、本発明は、多能性細胞の分化、増殖、および／または維持に影響し得
る生物学的に活性な因子の高分子量成分を、部分的または実質的に精製する方法
を提供する。この方法は、以下の工程を包含する： 上記の高分子量成分の供給源、 陰イオン交換クロマトグラフィー支持体、 疎水性相互作用クロマトグラフィー支持体、 ヘパリンアフィニティクロマトグラフィー支持体、および ゲル濾過クロマトグラフィー支持体 を提供する工程； 上記の高分子量成分の供給源を陰イオン交換クロマトグラフィー支持体に接触
させて第１の画分を生成する工程； 上記の第１の画分を疎水性相互作用クロマトグラフィー支持体に接触させて第
２の画分を生成する工程； 上記の第２の画分をヘパリンアフィニティクロマトグラフィー支持体に接触さ
せて第３の画分を生成する工程；ならびに 上記の第３の画分をゲル濾過クロマトグラフィー支持体に接触させて、部分的
または実質的に精製された高分子量成分を生成する工程。
【００４６】 好ましくは、この方法は、上記の高分子量成分の供給源を分画工程（例えば、
限外濾過）に供し、約１０ｋＤより大きい分子量の成分を含む画分を得る、さら
なる工程を包含する。
【００４７】 あるいは、高分子量成分を、ゼラチンアフィニティクロマトグラフィー（好ま
しくは、ゼラチンセファロースアフィニティクロマトグラフィー）、その後必要
に応じて透析を行うことにより精製し得る。
【００４８】 従って、本発明は、多能性細胞の分化、増殖、および／または維持に影響し得
る生物学的に活性な因子の高分子量成分を、部分的または実質的に精製する方法
を提供する。この方法は、以下の工程を包含する： 上記の高分子量成分の供給源、 ゼラチンアフィニティクロマトグラフィー支持体、および 透析システム を提供する工程； 上記の高分子量成分の供給源をゼラチンアフィニティクロマトグラフィー支持
体に接触させて第１の画分を生成する工程；ならびに 上記の第１の画分を透析に供して、部分的または実質的に精製された高分子量
成分を生成する工程。
【００４９】 好ましくは、この高分子量成分の精製方法は、上記の高分子量成分の供給源を
分画工程（例えば、限外濾過）に供し、約１０ｋＤより大きい分子量の成分を含
む画分を得る、さらなる工程を包含する。この工程を、この精製手順の任意の適
切な点で包含し得る。
【００５０】 好ましくは、高分子量成分または低分子量成分の供給源は，本明細書中上記の
ような部分的に精製された生物学的に活性な因子、本明細書中上記のような馴化
培地または本明細書中上記のような細胞外マトリクスである。
【００５１】 本明細書中上記のような馴化培地を使用してＥＰＬ細胞を含む多能性細胞を誘
導および維持し得るか、またはこの培地を分画して生物学的に活性な因子または
その成分を生じ得、これらを、単独でかまたは他の培地と組合せて添加して多能
性細胞（例えば、ＥＰＬ細胞）を誘導および維持する培地を提供し得る。あるい
は、生物学的に活性な因子またはその成分の、部分的に精製された形態または実
質的に精製された形態あるいは合成形態または組換え形態を、他の培地に、単独
でかまたは組合せて添加して、多能性細胞（例えば、ＥＰＬ細胞）を誘導および
維持する培地を提供し得る。馴化培地を、希釈せずに使用してもよいし、または
希釈して（例えば、約１０％〜８０％）使用してもよい。
【００５２】 低分子量成分がプロリンである場合、細胞維持培地中のその濃度は、好ましく
は約４０μＭ以上の範囲である。高分子量成分が細胞のフィブロネクチンである
場合、細胞維持培地中のその濃度は、好ましくは、約２μｇ／ｍｌ以上の範囲で
ある。関連細胞由来および関連細胞株由来の細胞外マトリクスまたは人工的に調
製した細胞外マトリクスもまた使用して、生物学的に活性の高分子量成分を提供
し得る。馴化培地、因子またはその高分子量成分もまた培養プレートをコーティ
ングするために使用して、所望の生物学的活性を提供し得る。
【００５３】 本発明の生物学的に活性な因子またはその高分子量成分または低分子量成分を
使用して、多能性細胞（ＥＰＬ細胞を含む）を生成し得、この細胞は、齧歯類由
来だけでなく、他のより商業的に重要な種（ヒトを含む）由来であり得る。
【００５４】 従って、本発明のさらなる局面において、初期原始外胚葉様（ＥＰＬ）細胞を
生成および／または維持する方法を提供する。この方法は以下の工程を包含する
： 多能性細胞、および 本発明に従う生物学的に活性な因子、またはその高分子量成分もしくは低分
子量成分 を提供する工程；あるいは 本発明に従う馴化培地、または 本発明に従う細胞外マトリクスおよび必要に応じて本発明の生物学的に活性
な因子の低分子量成分を提供する工程；ならびに 多能性細胞を、生物学的に活性な因子またはその高分子量成分もしくは低分子
量成分、あるいは馴化培地、あるいは細胞外マトリクスと接触させて、ＥＰＬ細
胞を生成または維持する工程。
【００５５】 多能性細胞を、胚幹（ＥＳ）細胞、インビトロまたはインビトロで誘導された
ＩＣＭ／原外胚葉、インビボまたはインビトロで誘導された原始外胚葉、始原生
殖細胞、ＥＧ細胞、奇形癌細胞、ＥＣ細胞、および脱分化によってかまたは核移
植によって誘導した多能性細胞からなる群から選択し得る。ＥＰＬ細胞もまた、
脱分化により分化した細胞から誘導され得る。
【００５６】 生物学的に活性な因子またはその高分子量成分もしくは低分子量成分あるいは
馴化培地、あるいは細胞外マトリクスに必要に応じて低分子量成分を加えたもの
を、インビトロでのＥＰＬ細胞の単離、増殖、または維持のために使用し得る。
ＥＰＬ細胞を、接着培養中で生成し得るかまたは懸濁液培養中で細胞凝集物とし
て生成し得る。生物学的に活性な因子または生物学的に活性な因子の成分、ある
いは馴化培地、あるいは細胞外マトリクスに必要に応じて低分子量成分を加えた
ものもまた、単独でまたは他の因子と組合せて使用して、当業者に公知の技術に
より分化した細胞、組織または器官を生成し得る。ＥＰＬ細胞から誘導された分
化した細胞を、同種移植、調和性（ｃｏｎｃｏｒｄａｎｔ）移植または異種移植
、細胞治療、組織および器官の増大または置換、ならびに遺伝子治療において使
用し得る。
【００５７】 本発明のこの局面の１つの形態において、多能性細胞を、生物学的に活性な因
子またはその高分子量成分もしくは低分子量成分あるいは馴化培地、あるいは細
胞外マトリクスに必要に応じて低分子量成分を加えたものに、好ましくは約１０
０単位／ｍｌより高い濃度、そしてより好ましくは約１０００単位／ｍｌよりも
高い濃度であるｇｐ１３０アゴニスト（例えば、サイトカイン白血病（ｌｅｕｋ
ａｅｍｉａ）阻害因子（ＬＩＦ））存在下で接触させ得る。オンコスタチンＭ、
ＣＮＴＦ、ＣＴ１またはＩＬ６と可溶性ＩＬ６レセプター、およびＩＬ１１なら
びに他の等レベルのｇｐ１３０アゴニストもまた使用し得る。
【００５８】 マウスにおいて、多能性細胞はＥＳ細胞であり得るか、または胚もしくは細胞
凝集物（胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ））のＩＣＭ／原外胚葉の多能性
細胞由来の細胞であり得るか、あるいは胚由来の原始外胚葉または胚様体もしく
は細胞凝集物としてＥＳ細胞のインビトロでの分化から誘導された原始外胚葉の
いずれかであり得る。他の種において、多能性細胞は、各種に関連する段階での
等価な細胞供給源由来であり得る。すべての種由来の多能性細胞の供給源は、始
原生殖細胞または奇形癌由来の細胞を含み得る。さらに、多能性細胞は、脱分化
により（例えば、分化した細胞を多能性段階へ復帰させることにより）、または
核移植技術の適用により（例えば、分化した細胞または部分的に分化した細胞の
核を卵母細胞または初期胚性細胞へ移入する場合）、誘導され得る。多能性細胞
は、任意の脊椎動物（マウス、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、および
ニワトリを含む）由来であり得る。この多能性細胞を、当業者に公知の任意の方
法により単離し得る。
【００５９】 本発明のこの局面の好ましい形態において、この方法は、以下のさらなる工程
：ＥＰＬ細胞を同定する工程を包含する。
【００６０】 多能性細胞からＥＰＬ細胞への転換を、マーカー遺伝子（ＲＮＡ転写物および
細胞表面マーカー）の発現、細胞の形態、サイトカイン応答性により、および／
またはインビトロもしくはインビボでの分化により評価し得る。
【００６１】 多能性細胞からＥＰＬ細胞への転換を評価するために使用され得るマーカー遺
伝子としては、公知のマーカー（例えば、Ｒｅｘ１、Ｆｇｆ５、Ｏｃｔ４、アル
カリホスファターゼ、ウボモルリン、ＡＦＰ、Ｈ１９、Ｅｖｘ１、ｂｒａｃｈｙ
ｕｒｙ）および本発明者らにより同定された新規なマーカー遺伝子（例えば、Ｌ
１７、Ｐｓｃ１およびＫ７）が挙げられる。ＥＳ細胞からＥＰＬ細胞への移行の
間にダウンレギュレートされるマーカー遺伝子としては、Ｒｅｘ１、Ｌ１７およ
びＰｓｃ１が挙げられる。Ｆｇｆ５およびＫ７は、この移行の間にアップレギュ
レートされる。多能性細胞マーカーである、Ｏｃｔ４、アルカリホスファターゼ
およびウボモルリンは、ＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞の両方によって同様のレベル
で発現される。部分的に分化したかまたは分化した、胚性系列または胚外系列に
おいて発現される他の遺伝子（例えば、ＡＦＰ、Ｈ１９、Ｅｖｘ１およびｂｒａ
ｎｃｈｙｕｒｙ）は、いずれのＥＳ細胞またはＥＰＬ細胞でも発現されない。
【００６２】 ＥＰＬおよび他の多能性細胞に対して差示的に作用する、サイトカインおよび
増殖因子としては、ＥＰＬ細胞の分化を誘導するが、ＥＳ細胞の分化を誘導しな
いＦＧＦファミリーのメンバー（例えば、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦおよびＦＧＦ４）
、ならびにＥＰＬ細胞の分化を誘導するがＥＳ細胞の分化を誘導しないＴＧＦβ
ファミリーのメンバー（例えば、アクチビンＡ）が挙げられる。さらに、ＥＰＬ
細胞は、ＥＳ細胞の維持に必要とされるよりも約１０倍低いＬＩＦのレベルによ
って培養物中で維持される。
【００６３】 ＥＰＬ細胞の分化は、速度および構造物の比率および、細胞凝集物もしくは胚
様体中で形成される分化した細胞型（例えば、原始外胚葉、内臓内胚葉、発生期
中胚葉、心筋、マクロファージ、およびニューロン）により他の多能性細胞の分
化と区別され得る。ＥＳ細胞と比較した場合、ＥＰＬ細胞は、後期原始外胚葉の
加速した形成、発生期中胚葉、拍動している心臓細胞（ｃａｒｄｉｏｃｙｔｅ）
およびマクロファージの加速かつ増大した形成、ならびに内臓内胚葉およびニュ
ーロンの減少した形成もしくはそれらが形成しないことを経験する。ＥＰＬ細胞
は、胚盤胞注入後の胚の発生に寄与しないが、ＥＳ細胞およびＥＧ細胞は寄与す
る。ＥＰＬ細胞は、胚盤胞注入後の胚の発生に寄与しないが、ＥＳ細胞およびＥ
Ｇ細胞は寄与する。
【００６４】 ＥＰＬ細胞を、生物学的に活性な因子またはその成分あるいは馴化培地、また
は細胞外マトリクスに必要に応じて低分子量成分を加えたものの存在下で、さら
なるｇｐ１３０アゴニストの存在下もしくは非存在下での培養により、因子、状
態または手順により誘導されるさらなる分化が開始されるまで、多能性状態で維
持し得る。
【００６５】 従って、本発明のさらなる局面において、部分的に分化した細胞および／また
は最終分化した細胞を生成する方法が提供される。この方法は、以下の工程を包
含する： 多能性細胞、および 本発明に従う生物学的に活性な因子、またはその高分子量成分もしくは低分
子量成分、あるいは 本発明に従う馴化培地、あるいは 本発明に従う細胞外マトリクスおよび必要に応じて本発明の生物学的に活性
な因子の低分子量成分 を提供する工程； 多能性細胞を、生物学的に活性な因子、またはその高分子量成分もしくは低分
子量成分、または馴化培地、または細胞外マトリックスと、さらなるｇｐ１３０
アゴニストの存在下あるいは非存在下で接触させて、初期始原胚様（ＥＰＬ）細
胞を生成する工程；ならびに ＥＰＬ細胞の環境を操作して、部分的に分化した細胞および／または最終分化
した細胞を生成する工程。
【００６６】 多能性細胞を、胚幹（ＥＳ）細胞、インビボまたはインビトロで誘導されたＩ
ＣＭ／原外胚葉、インビボまたはインビトロで誘導された原始外胚葉、始原生殖
細胞、ＥＧ細胞、奇形癌細胞、ＥＣ細胞、および脱分化によってかまたは核移植
によって誘導された多能性細胞からなる群から選択し得る。ＥＰＬ細胞もまた、
脱分化により分化した細胞から誘導され得る。
【００６７】 本発明のこの局面の好ましい形態において、ＥＰＬ細胞の環境を、生物学的に
活性な因子またはその成分または馴化培地または細胞外マトリックスの維持ある
いは除去によって、１つ以上の分化因子（例えば、増殖因子）の存在下または非
存在下で操作し得る。例えば、馴化培地、生物学的活性な因子、またはその成分
とのＥＰＬ細胞の接触を、好ましくは懸濁液中で増殖された細胞凝集物中で、好
ましくはＦＧＦファミリー由来の増殖因子（例えば、ＦＧＦ４）の存在下で維持
することを使用して、胚性神経外胚葉（ｎｅｕｒｅｃｔｏｄｅｒｍ）と等価な少
なくとも部分的に分化した細胞型を生成し得、この細胞型は、さらに神経細胞型
の範囲へと分化し得る。神経外胚葉は、胚性外胚葉に等価な細胞型を介して誘導
され、これは、他の外胚葉細胞型の範囲にさらに分化し得る。
【００６８】 生物学的に活性な因子またはその成分の非存在下で、そして好ましくは、ＦＧ
Ｆファミリーのメンバー（例えば、ＦＧＦ４）の存在下で、ＴＧＦ−βファミリ
ー由来の増殖因子をＥＰＬ細胞に添加して、胚性の発生期中胚葉と等価な少なく
とも部分的に分化した細胞型を生成し得、これは、さらに中胚葉細胞型の範囲に
分化し得る。
【００６９】 本発明のこの局面のさらに好ましい局面において、馴化培地、または生物学的
に活性な因子またはその成分の存在下で多能性細胞から形成された胚様体または
凝集物は、脱凝集されて単一の細胞懸濁液になり得る。馴化培地、または生物学
的に活性な因子またはその成分の非存在下で、好ましくはＦＧＦファミリーのメ
ンバー（例えば、ＦＧＦ４）の存在下で再凝集した場合、これらの細胞が優性に
分化して、胚性の発生期中胚葉と等価な少なくとも部分的に分化した細胞型を生
成し得、これは、さらに中胚葉細胞型（血液系列または筋肉系列を含む）の範囲
に分化し得る。
【００７０】 多能性細胞を、胚幹（ＥＳ）細胞、インビボまたはインビトロで誘導されたＩ
ＣＭ／原外胚葉、インビボまたはインビトロで誘導された原始外胚葉、始原生殖
細胞、ＥＧ細胞、奇形癌細胞、ＥＣ細胞、および脱分化によってかまたは核移植
によって誘導された多能性細胞からなる群から選択し得る。ＥＰＬ細胞もまた、
脱分化により分化した細胞から誘導され得る。
【００７１】 本発明のこの局面のさらに好ましい形態において、ＥＰＬ細胞の分化は、まず
、ＥＰＬ細胞の単層培養物を形成し、次いで、ＦＧＦファミリーまたはＴＧＦβ
ファミリーのメンバーの存在下でこの細胞をさらに培養するプロセスによって達
成され得る。このプロセスにより誘導された細胞は、特殊な形態の分化した細胞
である。
【００７２】 さらに、馴化培地、または生物学的に活性な因子またはその成分の非存在下で
の、接着培養物または懸濁液培養物中で形成されたＥＰＬ細胞の凝集による、懸
濁液培養物におけるＥＰＬ細胞凝集物の形成は、内臓内胚葉（これは、胚におけ
る多能性細胞の分化に影響することが公知である）のような細胞型の非存在下で
これらの細胞の分化を生じる。この様式で分化される、凝集されたＥＰＬ細胞は
、高レベルの発生しようとする中胚葉を形成し、この中胚葉は、さらに分化され
て、拍動している筋肉および血液ならびに中胚葉起源の他の組織を形成し得る。
【００７３】 本発明のこの局面のさらに好ましい形態において、この方法は、以下のさらな
る工程を包含する： 細胞表面マーカーならびに遺伝子発現マーカー、形態、および分化の潜在能力
を含む手順により、部分的に分化した細胞または最終分化した細胞を同定する工
程。
【００７４】 多能性細胞から神経外胚葉細胞および神経系列への転換を評価するために使用
され得るマーカー遺伝子としては、公知のマーカー、例えば、Ｇｂｘ２、Ｓｏｘ
１、Ｓｏｘ２、ネスチン、Ｎ−Ｃａｍ、Ｏｃｔ４、Ｆｇｆ５およびｂｒａｃｈｙ
ｕｒｙが挙げられる。多能性細胞から神経外胚葉細胞への移行の間にダウンレギ
ュレートされるマーカーとしては、Ｏｃｔ４およびＦｇｆ５が挙げられる。この
移行の間にアップレギュレートされるマーカーとしては、Ｇｂｘ２、Ｓｏｘ１、
Ｓｏｘ２、ネスチンおよびＮ−Ｃａｍが挙げられる。この移行の間に発現されな
いマーカーとしては、ｂｒａｃｈｙｕｒｙが挙げられる。
【００７５】 多能性細胞の中胚葉および誘導体への変換を評価するために使用され得るマー
カー遺伝子は、Ｏｃｔ４、Ｆｇｆ５およびｂｒａｃｈｙｕｒｙのような公知のマ
ーカーを含み、そして多能性細胞からの中胚葉への変転の間に下方制御されるＮ
ｋｘ ２．５マーカーは、Ｏｃｔ４およびＦｇｆ５を含む。この変転の間に上方
制御されるマーカーは、ｂｒａｃｈｙｕｒｙを含み、および中胚葉が筋肉前駆体
に分化する場合には、Ｎｋｘ ２．５を含む。
【００７６】 中胚葉および外胚葉の胚葉細胞は、インビトロでのそれらの分化能に基づいて
区別され得る。中胚葉胚葉は、筋肉および血液系列に分化し得るが、神経外胚葉
または神経系列に分化し得ない。外胚葉胚葉は、神経外胚葉および神経系列に分
化し得るが、筋肉および血液系列に分化し得ない。
【００７７】 本発明のさらなる局面において、優先的に外胚葉胚葉細胞を産生するための、
それから優先的に、部分的に分化した外胚葉細胞および神経外胚葉細胞を産生す
るための、そしてまた、皮膚細胞を含むがこれに限定されない、最終分化した外
胚葉細胞を優先的に産生するための、そしてまた、最終分化した神経細胞を優先
的に産生するための方法を提供する。
【００７８】 優先的に中胚葉胚葉細胞を産生するための、それらから優先的に部分的に分化
した中胚葉細胞を産生するための、そしてまた血液細胞および拍動する心臓細胞
を含むがこれらに限定されない最終分化した中胚葉細胞を優先的に産生するため
の方法もまた提供する。
【００７９】 本発明のさらなる局面において、外胚葉胚葉細胞、神経外胚葉細胞、部分的に
分化した外胚葉細胞または部分的に分化した神経外胚葉細胞、および最終分化し
た外胚葉細胞（例えば、皮膚細胞）、および本発明の方法によって産生された最
終分化した神経細胞を提供する。
【００８０】 本発明のさらなる局面において、中胚葉胚葉細胞、部分的に分化した中胚葉細
胞、および本発明の方法によって産生された最終分化した中胚葉細胞（例えば、
血液細胞および筋細胞）を提供する。
【００８１】 本発明のさらなる局面において、培養されたＥＰＬ細胞が提供される。
【００８２】 あるいは、ＥＰＬ細胞は、好ましくは約１０００単位／ｍｌ以上のレベルでの
ＬＩＦのようなｇｐ１３０アゴニストまたは等価なレベルでの他のｇｐ１３０ア
ゴニストの存在下で、馴化培地、または生物学的に活性な因子、あるいはそれら
の成分を除去することによってＥＳ細胞に復帰され得る。これは、インビボおよ
びインビトロの両方での、ＥＳ細胞の遺伝子発現、サイトカインの再応答、形態
学および分化能の再樹立によって付随される。これは、任意の所望の種に由来す
る、そして特にＥＳ細胞が以前に利用可能ではなかった種に由来する、原始外胚
葉またはＥＰＬ細胞の復帰または脱分化によって、ＥＳ細胞を作製するための手
段を提供する。
【００８３】 従って、本発明のさらなる局面において、ＥＳ細胞を産生する方法を提供し、
この方法は、以下： 多能性細胞、 本発明に従う生物学的に活性な因子またはその高分子量もしくは低分子量の成
分、あるいは、 本発明に従う馴化培地、あるいは 本発明に従う細胞外マトリクス、および必要に応じて、本発明に従う生物学的
に活性な因子の低分子量の成分；ならびに ｇｐ１３０アゴニスト； を提供すること、 多能性細胞と、生物学的に活性な因子またはその高分子量もしくは低分子量の
成分、または馴化培地、あるいは細胞外マトリクスとを接触させること；ならび
にさらなるｇｐ１３０アゴニストの存在または非存在下でＥＰＬ細胞を産生する
こと；ならびに ＥＰＬ細胞とｇｐ１３０アゴニストとを、生物学的に活性な因子またはその高
分子量もしくは低分子量の成分、または馴化培地、あるいは細胞外マトリクスの
非存在下で接触させること；ＥＰＬ細胞をＥＳ細胞に復帰させることを包含する
。
【００８４】 多能性細胞は、本明細書中上記に記載されるように、任意の適切な型であり得
る。
【００８５】 本方法は、本明細書中上記に記載されるように、部分的に分化した細胞または
最終分化した細胞を産生するためにＥＳ細胞を分化させるさらなる工程を包含し
得る。
【００８６】 好ましくは、ｇｐ１３０アゴニストは、白血病阻害因子（ＬＩＦ）である。し
かし、他のｇｐ１３０アゴニスト（例えば、オンコスタチンＭ、ＣＮＴＦ、ＣＴ
１、または多能性ＥＳ細胞をインビトロで維持するために必要とされるレベルで
可溶性ＩＬ６レセプターを有するＩＬ６）もまた、使用され得る。
【００８７】 本発明のさらなる局面において、遺伝的に改変されたＥＳ細胞を産生する方法
を提供し、この方法は、以下： 多能性細胞、 本発明に従う生物学的に活性な因子またはその高分子量もしくは低分子量の成
分、あるいは、 本発明に従う馴化培地、あるいは 本発明に従う細胞外マトリクス、および必要に応じて、本発明に従う生物学的
に活性な因子の低分子量の成分；ならびに ｇｐ１３０アゴニスト； を提供すること、 ＥＰＬ細胞を産生するためにさらなるｇｐ１３０アゴニストの存在または非存
在下で、多能性細胞と、生物学的に活性な因子またはその高分子量もしくは低分
子量の成分、または馴化培地、あるいは細胞外マトリクスとを接触させること； ＥＰＬ細胞において１以上の遺伝子を改変すること；ならびに 遺伝的に改変されたＥＰＬ細胞とｇｐ１３０アゴニストとを、生物学的に活性
な因子またはその高分子量もしくは低分子量の成分、または馴化培地、あるいは
細胞外マトリクスの非存在下で接触させること；遺伝的に改変されたＥＰＬ細胞
を遺伝的に改変されたＥＳ細胞に復帰させることを包含する。
【００８８】 多能性細胞は、本明細書中上記に記載されるように、任意の適切な型であり得
る。
【００８９】 遺伝的に改変されたＥＳ細胞はまた、復帰したＥＳ細胞（ＥＰＬ細胞ではない
）が遺伝的に改変される場合に本方法に従って産生され得ることに留意すべきで
ある。
【００９０】 本方法は、ＥＰＬ細胞の形成を含む、本明細書中上記の方法によって、遺伝的
に改変された部分的に分化した細胞または最終分化した細胞を産生するために遺
伝的に改変されたＥＳ細胞を分化させるさらなる工程を包含し得る。
【００９１】 あるいは、遺伝的に改変された部分的に分化した細胞または最終分化した細胞
は、以下を包含する方法によって産生され得る： 多能性細胞、 本発明に従う生物学的に活性な因子またはその高分子量もしくは低分子量の成
分、あるいは、 本発明に従う馴化培地、あるいは 本発明に従う細胞外マトリクス、および必要に応じて、本発明に従う生物学的
に活性な因子の低分子量の成分；ならびに ｇｐ１３０アゴニスト； を提供すること、 多能性細胞と、生物学的に活性な因子またはその高分子量もしくは低分子量の
成分、または馴化培地、あるいは細胞外マトリクスとを接触させること；さらな
るｇｐ１３０アゴニストの存在または非存在下でＥＰＬ細胞を産生すること； ＥＰＬ細胞において１以上の遺伝子を改変すること；ならびに 遺伝的に改変された部分的に分化した細胞または最終分化した細胞を産生する
ために、遺伝的に改変されたＥＰＬ細胞を分化させること。
【００９２】 あるいは、部分的に分化した細胞または最終分化した細胞は、本明細書中上記
のように産生され得、次いで、遺伝的に改変され得る。
【００９３】 多能性細胞は、本明細書中上記のように、任意の適切な型であり得る。
【００９４】 本発明はまた、遺伝的に改変されたＥＰＬ細胞を産生する方法を提供し、この
方法は、以下： 多能性細胞、および 本発明に従う生物学的に活性な因子またはその高分子量もしくは低分子量の成
分、あるいは、 本発明に従う馴化培地、あるいは 本発明に従う細胞外マトリクス、および必要に応じて、本発明に従う生物学的
に活性な因子の低分子量の成分を提供すること； 多能性細胞において１以上の遺伝子を改変すること；ならびに 遺伝的に改変された多能性細胞と生物学的に活性な因子またはその高分子量も
しくは低分子量の成分、または馴化培地、あるいは細胞外マトリクスとを接触さ
せること；さらなるｇｐ１３０アゴニストの存在または非存在下で遺伝的に改変
されたＥＰＬ細胞を産生すること、を包含する。
【００９５】 多能性細胞は、本明細書中上記のような、任意の適切な型であり得る。
【００９６】 あるいは、ＥＰＬ細胞は、本明細書中上記のように産生され得、次いで遺伝的
に改変され得る。
【００９７】 本方法は、遺伝的に改変された部分的に分化した細胞または最終分化した細胞
を産生するために、遺伝的に改変したＥＰＬ細胞を分化させるさらなる工程を包
含し得る。
【００９８】 あるいは、遺伝的に改変されたＥＰＬ細胞および／またはＥＳ細胞は、遺伝的
に改変された部分的に分化した細胞または最終分化した細胞を脱分化させること
によって産生され得、その方法は以下を包含する： 部分的に分化した細胞または最終分化した細胞；および 本発明に従う生物学的に活性な因子またはその高分子量もしくは低分子量の成
分、あるいは、 本発明に従う馴化培地、あるいは 本発明に従う細胞外マトリクス、および必要に応じて、本発明に従う生物学的
に活性な因子の低分子量の成分、を提供すること； 部分的に分化した細胞または最終分化した細胞において１以上の遺伝子を改変
すること；ならびに 遺伝的に改変された脱分化した細胞と、生物学的に活性な因子またはその高分
子量もしくは低分子量の成分、または馴化培地、あるいは細胞外マトリクスとを
接触することを包含する方法によって、遺伝的に改変された部分的に分化した細
胞または最終分化した細胞を脱分化させること；さらなるｇｐ１３０アゴニスト
の存在または非存在下で遺伝的に改変されたＥＰＬ細胞を産生すること。
【００９９】 そのように形成された遺伝的に改変されたＥＰＬ細胞は、遺伝的に改変された
ＥＳ細胞に復帰され得るか、そして/または本明細書中上記のように、遺伝的に
改変された部分的に分化した細胞または最終分化した細胞を形成するように分化
され得る。
【０１００】 本方法の１つの局面において、遺伝的に改変された部分的に分化した細胞また
は最終分化した細胞は、遺伝的に改変された脱分化した多能性細胞を形成するよ
うに核移植において核質として使用され得る。そのように形成された脱分化した
多能性細胞は、さらなるｇｐ１３０アゴニストの存在または非存在下において、
以下と接触させることを包含する方法によって、遺伝的に改変されたＥＳ細胞お
よびＥＰＬ細胞を産生するように使用され得る： 本発明に従う生物学的に活性な因子またはその高分子量もしくは低分子量の成
分、または 本発明に従う馴化培地、あるいは 本発明に従う細胞外マトリクス、および必要に応じて、本発明に従う生物学的
に活性な因子の低分子量の成分。
【０１０１】 そのように形成された遺伝的に改変されたＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞は、本明
細書中上記のように、遺伝的に改変された部分的に分化した細胞または最終分化
した細胞を形成するように分化され得る。
【０１０２】 これらの細胞の遺伝子の改変は、当業者に公知の任意の手段により実行され得
、これらの改変は、外来ＤＮＡを導入すること、ＤＮＡを取り除くこと、または
これらの細胞のＤＮＡ内で変異を生じることを包含する。この遺伝子の改変は、
その細胞の遺伝的構成の任意の変化によりその本来の細胞と遺伝的に異なる細胞
を生じることを包含する。
【０１０３】 従って、本方法は、その多能性状態において維持されている多能性細胞または
遺伝的に改変された多能性細胞、あるいはその部分的に分化した状態において維
持されている遺伝的に改変した部分的に分化した細胞を提供し、そしてキメラ動
物およびトランスジェニック動物（核移植により作製された動物を含む）を形成
するために使用され得る。
【０１０４】 本発明のさらなる局面において、本発明の方法によって産生された、ＥＳ細胞
、遺伝的に改変されたＥＳ細胞、ＥＰＬ細胞、遺伝的に改変されたＥＰＬ細胞、
部分的に分化した細胞または最終分化した細胞および遺伝的に改変された部分的
に分化した細胞または最終分化した細胞を提供する。
【０１０５】 本発明のさらなる局面において、キメラ動物を産生する方法が提供され、この
方法は、以下を含む： 本発明に従う多能性細胞または遺伝的に改変された多能性細胞、および 前原腸形成胚； を提供すること、 前原腸形成胚中に多能性細胞または遺伝的に改変された多能性細胞を導入する
こと；および キメラ形成能をモニターすること。
【０１０６】 従って、本発明のなおさらなる局面において、本発明に従う細胞または遺伝的
に改変された細胞を使用して産生された、キメラ動物またはトランスジェニック
動物（核移植から誘導された動物を含む）が提供される。
【０１０７】 本発明の生物学的に活性な因子、その成分、馴化培地、細胞外マトリクス、細
胞および方法は、以下を含む多数の適用を有する： （１）核移植における細胞質体または核質の供給源。例えば： ・任意の起源のＥＰＬ細胞、およびＥＰＬから誘導された細胞（ＥＳ細胞、部分
的に分化した細胞、最終分化した細胞）は、核移植において細胞質体または核質
として使用され得る ・遺伝的に改変されたＥＳ細胞、遺伝的に改変されたＥＰＬ細胞、および遺伝的
に改変された部分的に分化した細胞および遺伝的に改変された最終分化した細胞
は、細胞質体または核質の核移植として使用され得る ・部分的に分化した細胞または最終分化した細胞の脱分化から誘導されたＥＰＬ
細胞は、核移植のための核物質の供給源として使用され得る ・遺伝的に改変した部分的に分化した細胞または遺伝的に改変した最終分化した
細胞の脱分化から誘導された遺伝的に改変されたＥＰＬ細胞は、核移植のための
核物質の供給源として使用され得る ・改変されていない多能性細胞もしくは遺伝的に改変された多能性細胞、部分的
に分化した細胞、最終分化した細胞、組織、器官および動物は、ＥＰＬ細胞を細
胞質体または核質として使用する場合、核移植から誘導され得る （２）ヒト医薬における使用。例えば： ・任意の供給源から得られたＥＰＬ細胞、および、好ましくは、プログラムされ
た分化または指示された分化により得られたＥＰＬ細胞の分化した子孫は、ヒト
細胞治療のために改変されていない形態で用いられ得る。
【０１０８】 使用の好ましい様式は、自己由来のＥＰＬ細胞およびその子孫を使用すること
である： −外胚葉系列を形成するようにプログラムされた細胞は、ニューロン細胞およ
び皮膚細胞の治療手順を含むがこれに制限されない細胞治療手順のために用いら
れ得る。例えば、ニューロン細胞を用いる細胞治療は、パーキンソン病の処置に
用いられ得る −中胚葉系列のためにプログラムされた細胞は、骨髄治療および筋細胞治療（
例えば、癌の処置のためおよび骨髄レスキューのため）を含むがこれに制限され
ない細胞治療手順のために用いられ得る ・この適用において記載された任意の手段により得られた遺伝的に改変されたＥ
ＰＬ細胞、および好ましくは、指示された分化またはプログラムされた分化によ
り得られたそれらの分化した子孫は、ヒト遺伝子治療のために用いられ得る。
【０１０９】 このような遺伝子治療は、好ましくは、自家誘導性ＥＰＬ細胞またはその分化
された子孫を用いて実行される。
【０１１０】 −処置され得る遺伝的疾患の例としては、血友病、Ｉ型糖尿病、デュシェーヌ
ジストロフィーおよび他の筋ジストロフィー、ゴシェ（Ｇａｕｃｈｅ）病および
他のムコ多糖類疾患、嚢胞性線維症が挙げられるがこれらに制限されない ・任意の供給源から得られたＥＰＬ細胞、および好ましくは、プログラムされた
分化または指示された分化により得られたそれらの分化した子孫は、例えば、ウ
イルスによる感染に耐性を与える細胞を提供するウイルスレセプターの遺伝子操
作により、そのウイルス感染に対する耐性を細胞に与えるために遺伝的に改変さ
れ得る ・任意の供給源から得られたＥＰＬ細胞、および好ましくは、プログラムされた
分化または指示された分化により得られたそれらの分化した子孫は、遺伝子的に
改変され、細胞が、生物学的に活性なタンパク質薬物（例えば、サイトカインま
たはリンホカイン（例えば癌および他の疾患を処置するためのインターロイキン
−２））のための薬物送達系として作用することを可能にし得る ・任意の供給源から得られた改変されていないＥＰＬ細胞または遺伝子的に改変
されたＥＰＬ細胞、および好ましくは、プログラムされた分化または指示された
分化により得られたそれらの分化した子孫は、移植のための細胞および組織なら
びに器官の成分を作製するために用いられ得る。
【０１１１】 本発明は、ここで、添付の実施例および図面を参照して、より完全に記載され
る。ただし、以下の説明は、例証のみであり、そして上記の本発明の普遍性を制
限するいかなる様式でも理解されるべきでないことが理解されるべきである。
【０１１２】 表１。胚のＩＣＭおよび原始外胚葉における遺伝子発現と比較したＥＳ細胞お
よびＥＰＬ細胞の遺伝子発現パターンのまとめ。ＲＮＡを、ＭＥＤＩＩの存在下
で２日間増殖したＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞から単離し、そしてＯｃｔ４、ウボ
モルリン、Ｆｇｆ５、Ｒｅｘ１、ＡＦＰ、Ｈ１９、Ｅｖｘ１およびＢｒａｃｈｙ
ｕｒｙの発現について、ノーザンブロットによって分析した。Ｇｂｘ２発現を、
ＲＮＡ保護アッセイを用いて検出した。アルカリホスファターゼ活性を、ＥＳ細
胞層およびＥＰＬ細胞層における酵素染色を用いて検出した。胚性発現パターン
をＲｏｓｎｅｒら、１９９０、Ｓｃｈｕｅｌｅｒら、１９９０、Ｙｅｏｍら、１
９９１（Ｏｃｔ４）；Ｈａｈｎｅｌら、１９９０（アルカリホスファターゼ）；
Ｓｅｆｔｏｎら、１９９２（ウボモルリン）；ＨａｕｂおよびＧｏｌｄｆａｒｂ
、１９９１、Ｈｅ’ｂｅｒｔら、（Ｆｇｆ５）；Ｒｏｇｅｒｓら、１９９１（Ｒ
ｅｘ１）；Ｂｕｌｆｏｎｅら、１９９３；Ｃｈａｐｍａｎら、１９９７（Ｇｂｘ
２）；ＤｚｉａｄｅｋおよびＡｄａｍｓｏｎ、１９７８（ＡＦＰ）；Ｐｏｉｒｉ
ｅｒら、１９９１（Ｈ１９）；ＢａｓｔｉａｎおよびＧｒｕｓｓ、１９９０、Ｄ
ｕｓｈおよびＭａｒｔｉｎ、１９９２（Ｅｖｘ１）；ならびにＨｅｒｒｍａｎｎ
、１９９１（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）によって決定した。
【０１１３】 表２。ＥＳ細胞および復帰したＥＰＬ細胞は、ＣＢＡ／Ｃ５７黒色宿主胚盤胞
へ注射した場合、キメラマウスの発生に寄与するが、ＥＰＬ細胞は寄与しない。
Ｅ１４ＴＧ２ａ ＥＳ細胞、５０％ＭＥＤＩＩ中で、２日間および４日間増殖さ
せたそのＥＰＬ細胞誘導体（それぞれ、ＥＰＬ；２およびＥＰＬ；４）および復
帰ＥＰＬ細胞（これは、ｍＬＩＦを含むがＭＥＤＩＩは含まない培地におけるＥ
ＰＬ細胞の６日間の培養によって形成された）（ＥＰＬ；２RおよびＥＰＬ；４R ）の注射からの結果のまとめ。
【０１１４】 表３。精製したＥＣＭ成分の、培養中のＥＰＬ細胞安定性に対する効果。ＥＳ
細胞を、ＤＭＥＭ＋５０％ＭＥＤＩＩ中で、ＥＣＭ成分であるゼラチン、ラミニ
ン、血漿フィブロネクチン、ＩＶ型コラーゲン、ならびにラミニン、血漿フィブ
ロネクチンおよびＩＶ型コラーゲンの混合物で前処理した組織培養プラスチック
上に播種した。５日後、培養物を、アルカリホスファターゼで染色し、そして関
連する分化を伴わないＥＰＬ細胞コロニーの割合を、決定した。
【０１１５】 表４。個々の５．５ｄ．ｐ．ｃ．胚を、胚培養培地または胚培養培地＋５０％
ＭＥＤＩＩのいずれかにおいて、２ｍｌのＩＶ型コラーゲンで処理した組織培
養物ウェル中に播種した。５日後、外植物を、４％ＰＦＡ中で固定し、そしてイ
ンサイチュハイブリダイゼーションによってＯｃｔ４発現について染色した。
【０１１６】 表５。ＥＰＬ細胞誘導活性の低分子量成分の生理化学的特性のまとめ。
【０１１７】 表６。ｓｆＭＥＤＩＩ（活性サンプル）および非馴化培地（コントロールサン
プル）の精製（図１５）によって誘導したサンプルのアミノ酸分析。ｓｆＭＥＤ
ＩＩから精製したサンプルを、加水分解ありおよびなしで分析した。
【０１１８】 表７。Ｒの存在下で試験した、アミノ酸、プロリンアナログおよびペプチドの
ＥＰＬ細胞誘導活性のまとめ。＋＝ＥＰＬ細胞誘導活性（最小限の活性濃度を、
ボールドで示す）；−＝ＥＰＬ細胞形成の欠如；*＝高濃度（５００μＭ ＡＺ
ＥＴ、１００μＭ ３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリン、５０μＭサルコシンおよ
びサブスタンスＰ）でのＥＳ細胞死。
【０１１９】 表８。ＥＣＭ成分に対するＥＳ細胞からのＥＰＬ細胞形成のまとめ。ＥＣＭ成
分を、溶液（±４０μＭ Ｌ−プロリン）中のまたはマトリクス（±４０μＭ
Ｌ−プロリン）としてのＥＳ細胞に提示した。精製した生体活性＝プロトコル２
によって精製したＭＥＤＩＩの高分子量成分；ＭｅｄＩＩ＝Ｈｅｐ Ｇ２馴化培
地またはＥＣＭ；＋＝ＥＰＬ細胞形成；−＝ＥＰＬ細胞形成なし；±＝散在性の
平坦な多能性細胞コロニー。ＥＣＭ成分を、１０μｇ／ｍｌ（ＩＶ型コラーゲン
；ビトロネクチンおよび血漿フィブロネクチン）、３μｇ／ｍｌ（ラミニン）ま
たは２μｇ／ｍｌ（細胞フィブロネクチンおよび精製した生体活性）での溶液中
で使用した。ゼラチンを、０．０１％で使用し、そしてＭＥＤＩＩを５０％で使
用した。
【０１２０】 （実施例１：原始外胚葉様細胞集団の形成。生物学的に誘導される因子に応答
したＥＳ細胞に由来するＥＰＬ細胞） （材料および方法） （細胞培養条件） ＥＳ細胞を、０．２％ゼラチン／ＰＢＳで、最低３０分間前処理した、組織培
養等級のプラスチックウェア（Ｆａｌｃｏｎ）上でのフィーダーの非存在下で培
養した。細胞を、１０００ユニットのＬＩＦを補充したダルベッコ改変イーグル
培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＨ７．４（高グルコースを含有し、そして１０
％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｅｒｕｍ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）、４０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、
０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）を補充した）（本明細書に
おいて、ＤＭＥＭと称する）中で、加湿インキュベーター中で１０％ ＣＯ2の
下で培養した。慣用の組織培養を、Ｓｍｉｔｈ（１９９１）によって記載される
ように実施した。Ｅ１４ ＥＳ細胞（Ｈｏｏｐｅｒら、１９８７）を、Ａｎｎａ
Ｍｉｃｈｅｌｓｋａ（Ｍｕｒｄｏｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｅｌｂｏｕｒ
ｎｅ）から得た。ＣＣＥ ＥＳ細胞（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、１９８６）を、Ｒ
ｉｃｈａｒｄ Ｈａｒｖｅｙ（Ｗａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）から得た。ＭＢＬ５（Ｐｅａｓｅら
、１９９０）およびＤ３（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８５）ＥＳ細胞株を、
Ｌｉｎｄｓａｙ Ｗｉｌｌｉａｍｓ（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍｅ
ｌｂｏｕｒｎｅ）から得た。ＣＧＲ８およびＥ１４ＴＧ２ａ（Ｈｏｏｐｅｒら、
１９８７）ＥＳ細胞は、Ａｕｓｔｉｎ Ｓｍｉｔｈ（Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｇ
ｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ）によって提供された。
【０１２１】 ＬＩＦを、以下の改変を伴って、Ｓｍｉｔｈ（１９９１）によって記載される
ように、マウスＬＩＦ発現プラスミドｐＤＲ１０でトランスフェクトしたＣＯＳ
−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）細胞から産生させた。ＣＯＳ−１細胞を、
Ｂｉｏ−ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓａｒを、２７０ボルトおよび２５０μＦＤ
の電気容量を用いたエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。ト
ランスフェクトされた細胞を、高グルコースを含有し、そして１０％ ＦＣＳ、
４０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１ｍＭ Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥ
Ｍ、ｐＨ７．４中で７×１０4細胞／ｃｍ2でプレーティングした。培地を採取し
、そしてＳｍｉｔｈ（１９９１）によって記載されるようにＬＩＦ発現について
アッセイした。あるいは、培地に、１０００ユニットの組換えＬＩＦ（ＥＳＧＲ
Ｏ、ＡＭＲＡＤ）を補充した。
【０１２２】 Ｈｅｐ Ｇ２細胞（Ｋｎｏｗｌｅｓら、１９８０；ＡＴＣＣ ＨＢ−８０６５
）を、ＤＥＭＥ中での培養物中に維持し、そしてコンフルエントで継代した。馴
化培地（ＭＥＤＩＩ）に、ＨｅｐＧ２細胞をＤＭＥＭ中に５×１０4細胞／ｃｍ2 の密度で播種した。培地を、４〜５日後に採取し、０．２２μｍメンブレンを通
した濾過により滅菌し、そして使用前に０．１ｍＭ β−ＭＥを補充した。ＭＥ
ＤＩＩを、４℃で１〜２週間、または−２０℃で６ヶ月まで、見かけ上の活性喪
失なしに保存した。
【０１２３】 ＥＰＬ細胞を、ＬＩＦの添加のありまたはなしのＤＭＥＭ中の５０％ＭＥＤＩ
Ｉ馴化培地を含む培地中で形成させ、そして維持した。ＥＰＬ形成は、１０％と
８０％の間のＭＥＤＩＩの添加で明らかであり、これは、５０％ ＭＥＤＩＩで
最適な培養条件であった（データ示さず）。
【０１２４】 ＥＰＬ細胞を、ＥＳ細胞から形成し、そして以下のように維持した。
【０１２５】 接着培養：ＥＳ細胞を、上記のように、１．３×１０4細胞／ｃｍ2の密度で、
５０％ＭＥＤＩＩを含むＤＭＥＭ中で０．２％のゼラチン／ＰＢＳで最低３０分
間前処理した組織培養等級のプラスチックウェア（Ｆａｌｃｏｎ）上に播種した
。ＥＰＬ細胞を、慣用の組織培養技術（Ｓｍｉｔｈ，１９９１に記載されるよう
な）を用いて、５０％ ＭＥＤＩＩ中で維持した。
【０１２６】 懸濁凝集物において：ＥＳ細胞を、上記のように５０％ ＭＥＤＩＩを含むＤ
ＭＥＭ中で細菌ペトリ皿における懸濁培養物中に１×１０5細胞／ｃｍ2の密度で
播種した。得られたＥＰＬ細胞凝集物を、２日後に、１：２に分割し、そして５
０％ ＭＥＤＩＩを含む新たなＤＭＥＭへ播種した。コントロール凝集物（ＥＢ
）を、ＭＥＤＩＩを含まないＤＭＥＭ中で同一の様式においてＥＳ細胞を凝集さ
せることによって形成させた。
【０１２７】 （ＤＮＡ操作） すべてのＤＮＡ操作を、標準的なプロトコルを用いて行った（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、１９８９）。ＤＮＡを、Ｔ7 Ｓｅｑｕｅｎａｓｅキット（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）を製造業者の指示のとおりに用いて配列決定した。配列決定反応物を、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に記載されるように、６％のポリアクリルアミド
／尿素ゲル上で分離し、そしてＸ線フィルムに対して曝露した。
【０１２８】 （ノーザンブロットおよびリボヌクレアーゼ保護分析） 細胞質ＲＮＡを、培養したＥＳ細胞層およびＥＰＬ細胞層から、Ｅｄｗａｒｄ
ｓらの方法（１９８５）を用いて、単離した。総ＲＮＡを、１回１×ＰＢＳで洗
浄したＥＰＬ細胞凝集物から単離し、遠心分離によってペレット化し、そして−
２０℃で保存した。ペレットを、１ｍｌの抽出緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ；５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ７．５；５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０；０．５
％ＳＤＳ）（２００μｇのプロテイナーゼＫ（Ｍｅｒｃｋ）を補充した）中に再
懸濁した。滅菌し、酸洗浄したガラスビーズ（０．５ｍｍ）を、メニスカスのす
ぐ下に添加し、そして激しくボルテックスした。さらに３ｍｌの抽出緩衝液／プ
ロテイナーゼＫを添加し、そしてフェノール／クロロホルム抽出の前に３７℃で
１時間インキュベートした。核酸を、４００μｌの３Ｍ 酢酸Ｎａおよび４ｍｌ
のイソプロパノールを３０分間−８０℃で添加することによって沈降させ、そし
てベンチトップ遠心分離機中で３５００ｒｐｍでの遠心分離により収集した。核
酸を、４００μｌ ＤＮａｓｅＩ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ８．
０；１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０；１０ｍＭ ＭｇＣｌ2；０．１ｍＭ ＤＴ
Ｔ）、ＤＮａｓｅＩを含まないＲＮａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ）２０ユニット中に再懸濁し、そして３７℃で１時間インキュベートした
。ＲＮＡを４０μｌの３Ｍ 酢酸Ｎａおよび１ｍｌのエタノールの添加によって
沈降させ、そして遠心分離により採集した。
【０１２９】 ノーザンブロット分析を、Ｔｈｏｍａｓら、１９９５に記載されるように実施
した。ＤＮＡプローブを、Ｇｉｇａｐｒｉｍｅ標識キット（ＢｒｅｓａＧｅｎ）
またはＭｅｇａｐｒｉｍｅキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてＤＮＡフラグメ
ントから調製した。ＤＮＡフラグメントを、以下のプラスミドから単離した。Ｈ
１９ ｃＤＮＡフラグメントを、ＬＣ１０−８（Ｐｏｉｒｉｅｒら、１９９１）
からＰｖｕＩＩを用いて７７８ｂｐフラグメントとして切り出した。Ｂｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ ＫＳ＋中の４６２ｂｐ Ｏｃｔ４のＳｔｕＩ ｃＤＮＡフラグメン
ト（残基４９１から５９３）を、Ｈ．Ｓｃｈｏｅｌｅｒ博士（Ｓｃｈｏｅｌｅｒ
ら、１９９０）から得た。４８４ｂｐのフラグメントを、ＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩ
ＩＩ消化により遊離させ、そしてプローブ生成に用いた。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ特
異的プローブを、ｐＳＫ７５（Ｈｅｒｒｍａｎ、１９９１）から、１６００ｂｐ
ＥｃｏＲＩフラグメントとして切り出した。ウボモルリンプローブを、ｐＵＣ
８中のＦ２０Ａ（Ｒｉｎｇｗａｌｄら、１９８７）から、６２０ｂｐのＥｃｏＲ
Ｉフラグメントとして切り出した。７００ｂｐ ＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ Ｅｖｘ
１ ｃＤＮＡフラグメントを、ｐＡＢ１１（ＤｕｓｈおよびＭａｒｔｉｎ、１９
９２）から切り出した。Ｆｇｆ５を、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｈｅ’ｂｅｒｔら
、１９９０）における全長コード領域クローンとして得た。これから、８００ｂ
ｐ ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ ｃＤＮＡフラグメントを単離し、そしてプローブ
として使用した。ＡＦＰプローブを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＩＩ＋中に
クローニングされたマウスＡＦＰ ｃＤＮＡの最初の３５０ｂｐをコードする４
００ｂｐ ＥｃｏＲＩフラグメントから生成した（Ｒ．Ｋｒｕｍｌａｕｆ博士、
ＮＩＭＲ、Ｌｏｎｄｏｎからの寄贈）。８４８ｂｐ Ｒｅｘ１フラグメント（こ
れは、ｐＣＲTMＩＩ（ｐＲｅｘ１、Ｎ．Ｃｌａｒｋｅ博士、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎ
ｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｕ
．Ｋ．から得た）にクローニングされた）を、ＥｃｏＲＩ消化によって切り出し
た。ｍＧＡＰプローブを、３００ｂｐのｍＧＡＰ ｃＤＮＡ配列を含むプラスミ
ド全体（Ｒａｔｈｊｅｎら、１９９０）を標識することによって合成した。それ
ぞれ７３７ｂｐ、２３２ｂｐおよび４５８ｂｐの、Ｌ１７、Ｋ７およびＰｓｃ１
のｄｄＰＣＲフラグメントを、ＥｃｏＲＩ消化によってＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＩＩ ＫＳ＋から遊離させ、そしてプローブとして使用した。
【０１３０】 Ｇｂｘ２およびｍＧＡＰの検出のためのＲＮａｓｅ保護アッセイ方法論および
アンチセンスプローブは、Ｃｈａｐｍａｎら、（１９９７）に記載されるとおり
であった。Ｏｃｔ４検出のためのアンチセンスリボプローブを、Ｔ３ＲＮＡポリ
メラーゼを用いて、ＮｃｉＩを用いて線状化した上記のＯｃｔ４含有プラスミド
から転写した。
【０１３１】 ノーザンブロットおよびＲＮａｓｅ保護物を、ホスホルイメジャースクリーン
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）に曝露し、そしてＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｉｍａｇｅｒ機器上で現像した。遺
伝子発現のレベルを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍ
ｉｃｓ）ソフトウェアを用いて定量した。
【０１３２】 （インサイチュハイブリダイゼーション） 細胞層、細胞凝集物およびマウス胚全体についてのインサイチュハイブリダイ
ゼーションを、ＲｏｓｅｎおよびＢｅｄｄｉｎｇｔｏｎの方法（１９９３）を以
下の改変を伴って用いて、行った。細胞層および細胞凝集物を、予備ハイブリダ
イズさせ、ハイブリダイズさせ、そして６０℃で洗浄し、そして胚を予備ハイブ
リダイズさせ、ハイブリダイズさせ、そして６５℃（Ｌ１７；Ｋ７）および６３
．５℃（Ｐｓｃ１）で洗浄した。細胞層、細胞凝集物、および胚を、１０％熱非
働化ＦＣＳを用いてブロックし、そして抗体をＴＢＳＴ／１％ ＦＣＳ中に添加
した。この抗体は、細胞層または細胞凝集物のインサイチュハイブリダイゼーシ
ョンの場合には予備吸着されなかった。抗体を、マウス胚とのインキュベーショ
ンの前に、胚の粉末（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８）を用いて予備吸
着させた。
【０１３３】 異系交配したＳｗｉｓｓ胚を、時限交配した（ｔｉｍｅ−ｍａｔｅｄ）Ｓｗｉ
ｓｓ雌性マウスから、特定の日に採取した。交尾後０．５日を、充填の日の正午
と指定した。交配した雌性マウスを、頚部脱臼またはＣＯ2窒息によって屠殺し
た。そして、子宮を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を補充したＤＭＥＭ中
で、胚を切断するまで、３７℃に維持した。胚を、標準的な切断技術を用いて、
ＰＢＳ中で取り出した。Ｒｅｉｃｈａｒｔ膜を取り除き、そしてその胚を、ＰＢ
Ｓ固定液中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）へと直接移した。
【０１３４】 アンチセンスＯｃｔ４プローブを、４６２ｂｐのＳｔｕＩ Ｏｃｔ４ ｃＤＮ
Ａフラグメント（Ｓｃｈｏｅｌｅｒら、１９９０）を含むブルースクリプトから
ランオフ転写物としてＴ３ ＲＮＡポリメラーゼによって合成し、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉで線状化した。コントロールとして用いたセンス転写物を、ＸｈｏＩを用いて
線状化した同じプラスミドから入手し、そしてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用い
て転写した。センスおよびアンチセンスＦｇｆ５転写物を、ＥｃｏＲＩまたはＢ
ａｍＨＩのいずれかで線状化した全長Ｆｇｆ５コード配列を含むプラスミドクロ
ーンから生成し（Ｈｅ’ｂｅｒｔら、１９９０）、そしてそれぞれＴ７ ＲＮＡ
ポリメラーゼまたはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写した。Ｌ１７、Ｐｓ
ｃ１およびＫ７のためのセンスおよびアンチセンスのプローブを、それぞれ７３
７ｂｐ、４５８ｂｐおよび２３２ｂｐのフラグメントを含むプラスミドクローン
から生成した。Ｌ１７、Ｐｓｃ１およびＫ７のアンチセンス転写物を、ＸｈｏＩ
消化およびＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ１７、Ｐｓｃ１）での転写、ならびに
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｋ７）での転写を伴うＨｉｎｄＩＩＩ消化によって
、生成した。センスプローブを、クローンのＢａｍＨＩ消化、ならびにＬ１７お
よびＰｓｃ１についてはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにＫ７についてはＴ
３ ＲＮＡポリメラーゼを使用して転写することによって、生成した。アンチセ
ンスＢｒａｃｈｙｕｒｙプローブを、ｐＳＫ７５から合成し（Ｈｅｒｒｍａｎ、
１９９１）、ＢａｍＨＩで線状化し、そしてＴ７ポリメラーゼを用いて転写した
。センスプローブを、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて線状化した同じプラスミドから生
成し、そしてＴ３ポリメラーゼを用いて転写した。
【０１３５】 （アルカリホスファターゼ染色） アルカリホスファターゼを、診断キット８６−Ｒ（Ｓｉｇｍａ）を用いて可視
化した。このキットを、製造業者の記載に従って、以下の改変を伴って用いた。
細胞層を、４．５ｍＭクエン酸、２．２５ｍＭクエン酸ナトリウム、３ｍＭ塩化
ナトリウム、６５％メタノールおよび４％パラホルムアルデヒド中に、洗浄およ
び染色の前に固定した。
【０１３６】 （組織学的分析） 胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）を、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデ
ヒド（ＰＦＡ）において、４℃で一晩固定し、その後、パラフィン蝋中に包埋し
、そしてＨｏｇａｎら、１９９４に記載のように切片化した。切片を、ヘマトキ
シリン：エオシンを用いて染色した。
【０１３７】 （ＤＤＰＣＲ） ＥＳ細胞とＥＰＬ細胞との間で示差提示ＰＣＲによって示差的に発現された転
写物の同定を、Ｓｃｈｕｌｚ（１９９７）（Ｐｓｃ１）ならびにＬｉａｎｇおよ
びＰａｒｄｅｅ（１９９２）（Ｌ１７、Ｋ７）において記載されるように実施し
た。プライマーを、ＥｃｏＲＩ制限部位を取り込むように設計し、そしてｃＤＮ
Ａ産物を、ＥｃｏＲＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋中にクロ
ーニングした。
【０１３８】 （結果） （ＭＥＤＩＩは、接着培養物におけるＥＳ細胞からＥＰＬ細胞への転移をもた
らす） 組換えＬＩＦ（ＬＩＦ）を補充した培地中およびフィーダー細胞層（図１Ａ）
の非存在下で増殖する場合、ＥＳ細胞は、顕著な半球形のコロニー形態を示すコ
ロニーを９５％を超えて有する均質な集団として増殖する。ＥＳ細胞分化を誘導
し得る因子についてアッセイするために、ＥＳ細胞を播種し、そしてｍＬＩＦお
よび哺乳動物細胞株に由来する馴化培地の存在下で培養した。５日後、その細胞
を、ＥＳ細胞コロニー形態からの分岐について評価した。
【０１３９】 ０．２％ゼラチン／ＰＢＳで予備処理した組織培養等級のプラスチックウェア
（Ｆａｌｃｏｎ）上でＨｅｐ Ｇ２細胞（ＭＥＤＩＩ）によって馴化した１０〜
８０％の培地の存在下で培養した場合、ＥＳ細胞は、本発明者らが初期の原始外
胚葉様すなわちＥＰＬ細胞（図１Ｂ）と命名した細胞とは形態学的に異なる細胞
集団を生じた。ＥＰＬ細胞の形成は、ＭＥＤＩＩに特異的であり、そしてアッセ
イした他の１３の馴化培地のいずれに対しても応答は見られなかった。特徴的な
ＥＳ細胞コロニー形態とは対照的に、ＥＰＬ細胞は、単層コロニーとして増殖し
、そこでは、１以上の顕著な核小体を有する核を含む個々の細胞が、容易に認識
され得た。形態的には、ＥＰＬ細胞は、Ｐ１９ ＥＣ細胞に類似する（ＭｃＢｕ
ｎｅｒｙおよびＲｏｇｅｒｓ、１９８２；ＲｕｄｎｉｃｋｉおよびＭｃＢｕｒｎ
ｅｙ、１９８７）。この細胞は、原始外胚葉の細胞に類似すると考えられる。５
０％ＭＥＤＩＩの存在下でのＥＳ細胞の培養は、比較的均質な細胞集団をもたら
した。この集団において、９５％を超えるコロニーが、ＥＰＬ細胞コロニー形態
のものであり、そして残留するＥＳ細胞コロニーは検出され得なかった（図１Ｄ
）。このことは、添加したＬＩＦ（図１Ｄ）の存在下または非存在下で起こった
。ＥＰＬ細胞集団内で、ＥＳ細胞培養物において見られるものと類似する分化し
た細胞の散発性コロニーが検出された（図１Ｄ）。分化したコロニーのレベルは
、添加したＬＩＦの非存在下（図１Ｄ）において形成されたＥＰＬ細胞培養より
４倍高かった。このことは、ＥＰＬ安定性におけるＬＩＦについての可能な役割
を示唆する。ＥＳ細胞からの比較的均一な細胞集団の形成は、ＥＳ細胞がＬＩＦ
の除去に応答して自然に分化した場合に生成される分化した細胞型の変種とは対
照的であった（図１Ｃ、Ｄ）。しかし、自然に分化したＥＳ細胞培養物において
、小さな集団のＥＰＬ様コロニーが見られた（図１Ｄ）。このことは、ＥＰＬ細
胞がＥＳ細胞の正常な誘導体であることを示唆する。ＥＰＬ細胞形態は、４０継
代を超えて、すなわち１００日を超えての長期培養で維持され得（データは示さ
ず）、そしてその培養培地においてＭＥＤＩＩの継続的な存在に依存した。ＭＥ
ＤＩＩおよびＬＩＦの除去は、自然なＥＳ細胞分化（図１Ｃ）から発生したもの
に類似する、分化した細胞型のアレイの生成を生じた（データは示さず）。
【０１４０】 ＭＥＤＩＩに応答した、ＥＳ細胞からＥＰＬ細胞への転移は、多数の独立して
誘導したＥＳ細胞株（ＭＢＬ５ Ｄ３、ＣＣＥ、Ｅ１４およびＣＧＲ８を含む）
について実証された（データは示さず）。各々のＥＳ細胞株から生成したＥＰＬ
細胞の外見は、類似していた。
【０１４１】 （ＥＰＬ細胞は、多能性である） 培養物における分化した細胞の自然生成（図１Ｄ）およびＭＥＤＩＩの除去に
続くＥＰＬ細胞の自然な分化は、これらの細胞が、さらなる分化についての能力
を保持していることを示唆した。
【０１４２】 初期のマウス胚および生殖系列の多能性細胞、ならびに培養物中のＥＳ細胞は
、ホメオボックス遺伝子Ｏｃｔ４の発現およびアルカリホスファターゼ活性によ
って特徴付けられる。Ｏｃｔ４発現は、初期のマウス胚の多能性細胞に限定され
、そしてインビボおよびインビトロの両方で、多能性細胞の分化に対してダウン
レギュレートされる。ＥＰＬ細胞を、ＥＳ細胞をＭＥＤＩＩまたはＭＥＤＩＩ＋
ＬＩＦの存在下で、２、４、６および１６日間にわたり、２日おきの継代を伴っ
て、培養することにより形成した。これらの集団からのＲＮＡのノーザン分析は
、ＥＳ細胞において見られるレベルと等価なレベルでのＯｃｔ４の発現を示し（
図２Ａｉ）、そしてＥＰＬ細胞の形成が自然な分化の過程とは等価でないことを
示唆する（図２Ａｉｉ）。ＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞の単層の、Ｏｃｔ４特異的
なアンチセンスＲＮＡプローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションは
、そのＥＰＬ細胞を横切って均一に分配されるが、その培養物内の細胞の亜集団
には限定されないＯｃｔ４発現を示した（図２Ｂ、Ｃ）。その集団内で自然に分
化した細胞は、Ｏｃｔ４を発現しなかった（データは示さず）。アルカリホスフ
ァターゼ活性の分析もまた、ＥＰＬ細胞による均一な発現を示した（図２Ｄ、Ｅ
）。ここで、分化した細胞において活性のダウンレギュレートが伴った（データ
は示さず）。ＥＰＬ細胞培養物におけるこれらの多能性細胞マーカーの均一な分
配は、ＥＰＬ細胞集団の均質性を実証した。
【０１４３】 （ＥＰＬ細胞形成は、原始外胚葉（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｅｃｔｏｄｅｒｍ
）様遺伝子発現の確立に随伴される） ＥＰＬ細胞による多能性細胞マーカー遺伝子の発現は、これらの細胞が、初期
胚の多能性細胞集団と、またはおそらくＯｃｔ４発現が完全には下方制御されて
いない分化した細胞系列と等価であり得ることを示唆した。胚の多能性細胞集団
は、形態学的基準および発生的基準によって、ならびにマーカー遺伝子の時間的
および空間的発現によって、分化した細胞系列から識別され得る。ＥＰＬ細胞の
胚性等価物を、胚の多能性細胞集団ならびに胚外系列および原腸胚の分化細胞を
同定するマーカー遺伝子の発現を分析することによって研究した。
【０１４４】 ３つの遺伝子Ｆｇｆ５、Ｒｅｘ１およびＧｂｘ２は、ＩＣＭと原始外胚葉の細
胞間で示差的に転写されると報告されている（表１に要約される）。Ｆｇｆ５の
発現は、ＩＣＭ由来の原始外胚葉の形成において上方調節されるが、Ｒｅｘ１お
よびＧｂｘ２の両方の発現は、ＩＣＭにおいて検出され得るが、６．５ｄ．ｐ．
ｃ．まで原始外胚葉において検出され得ない。ＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞におけ
るＦｇｆ５およびＲｅｘ１の発現を、ノーザンブロットによって評価した（図２
Ａ；表１）。Ｇｂｘ２の発現を、ＲＮアーゼプロテクションアッセイによって分
析した（図２Ｆ；表１）。ＥＳ細胞においてわずかに検出可能なＦｇｆ５の発現
は、ＭＥＤＩＩにおける２日間のＥＰＬ細胞増殖において、５０倍上昇した。Ｆ
ｇｆ５の発現は、培養の時間と共にＥＰＬ細胞において増加し、その結果、Ｆｇ
ｆ５の３４０倍の誘導を表す最大の発現が６日目までに到達され、そして培養物
中で少なくとも１６日間維持された。Ｒｅｘ１はＥＳ細胞によって高いレベルで
発現されたが、この発現はＥＰＬ細胞形成の２日間のうちに５０％下方調節され
た（図２Ａ；表１）。Ｒｅｘ１発現は、より長い期間にわたり培養されたＥＰＬ
細胞中でさらに低減され、その結果、ＭＥＤＩＩ中で６日間増殖されたＥＰＬ細
胞は、ＥＳ細胞と比較して、Ｒｅｘ１発現において５倍の低減を示した。Ｇｂｘ
２発現はＥＳ細胞中で高く、そしてＭＥＤＩＩ中の培養で２日間維持された。し
かしこのＧｂｘ２発現は、ＭＥＤＩＩ中でのさらなる培養で、６日目までに検出
不可能なレベルにまで低減された。Ｆｇｆ５、Ｒｅｘ１およびＧｂｘ２の発現の
変化は、ＭＥＤＩＩ中で形成されるＥＰＬ細胞と比較して、ＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦ
中でＥＳ細胞のＥＰＬ細胞への移行が行われる場合に遅延した（図２Ａ；２Ｆ）
。このことは、ＬＩＦが、ＥＳ細胞からＥＰＬ細胞への移行を遅延させることを
示唆する。ＥＰＬ細胞形態の維持、ならびに高レベルのＦｇｆ５およびＯｃｔ４
の発現（図２Ａ）は、ＥＰＬ細胞を安定な細胞集団として維持するＭＥＤＩＩの
能力を実証し、そしてこれはＥＳ細胞の自発的な分化の間に観察される遺伝子の
発現変化とは明らかに異なる（図２Ａｉｉ）。
【０１４５】 ＭＥＤＩＩ中で４日間培養されたＥＰＬ細胞単層を、ＤＩＧ標識アンチセンス
Ｆｇｆ５転写物を使用して、Ｆｇｆ５発現についてプローブした。等価なレベル
のＦｇｆ５特異的染色が、培養物内のすべてのＥＰＬ細胞において観察された（
図２Ｇ）。このことは、ＥＳ細胞からＥＰＬ細胞への移行の均一性、およびＥＰ
Ｌ細胞集団の同質性の両方を確証する。
【０１４６】 ウボモルリン（ＩＣＭおよび原始外胚葉の多能性細胞によって発現されるが、
始原生殖細胞系列の細胞において下方制御されるカドヘリン）の発現を、ＥＳ細
胞培養物およびＥＰＬ細胞培養物中において、ノーザンブロット分析により評価
した。ウボモルリン発現は、ＥＳ細胞中で観察された発現と等価なレベルかまた
はそれを超えるレベルでＥＰＬ細胞中で維持された（図２Ｈ）。このことは、こ
れらの細胞が始原生殖細胞のインビトロ等価物を表さないことを示唆する。
【０１４７】 多能性細胞マーカーの発現パターンと一致して、ＥＰＬ細胞は、初期胚（Ｈ１
９、ＡＦＰ）、原始線条（Ｅｖｘ１）、または発生期中胚葉（Ｂｒａｃｈｙｕｒ
ｙ）の胚外系列について特異的な、検出可能なレベルのマーカー遺伝子を発現し
なかった（表１；データは示さず）。
【０１４８】 ＥＳ細胞のＥＰＬ細胞への形態学的移行は、インビボで多能性細胞集団を識別
するマーカー遺伝子の示差的調節に随伴されることが見出された。ＥＳ細胞にお
ける遺伝子発現は、移植前の胚の多能性細胞由来であるそれらの起源と等価であ
ったが、ＥＰＬ細胞は、初期胚の中のわずか１つの細胞集団である原始外胚葉に
よって共有される一連のマーカー遺伝子を発現した（表１）。
【０１４９】 （新規の多能性細胞マーカー遺伝子の発現は、ＥＰＬ細胞と初期原始外胚葉
との間の関連を支持する） ＥＳ細胞のＥＰＬ細胞への移行は、ＩＣＭの原始外胚葉への移行と関連した遺
伝子発現変化を模擬するように思われる。スクリーニングを実施して、これらの
細胞集団間で示差的に発現される遺伝子を同定した。ＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦ中で２
、４、６、および８日間培養されたＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞から単離されたＲ
ＮＡを、ディファレンシャルディスプレイポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）
を用いて分析した。ＥＳ細胞とＥＰＬ細胞との間で示差的に発現されるｃＤＮＡ
フラグメントを精製し、クローニングし、そして配列決定した。
【０１５０】 ３つの新規の部分的ｃＤＮＡとして、Ｌ１７、Ｐｓｃ１およびＫ７を同定した
（図３）。上記に概説されたように調製された、ＥＳ細胞のＲＮＡおよびＥＰＬ
細胞のＲＮＡのノーザンブロット発現分析により、Ｌ１７は、ＥＳ細胞中で高度
に発現されるが、ＥＰＬ形成および培養物中での維持と共に迅速に下方制御され
ることが示された（図４Ａ）。Ｐｓｃ１は、ＥＳ細胞中で発現され、そしてＬ１
７よりも漸進的にＥＰＬ細胞中で下方制御された（図４Ｂ）。Ｋ７は、ＥＳ細胞
中において低レベルで発現されるが、延長したＥＰＬ細胞培養物において上方調
節された（４、６、および８日；図４Ｃ）。
【０１５１】 移植前マウス胚および周囲移植（ｐｅｒｉ−ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）マウ
ス胚におけるこれらの遺伝子のインビボ発現を、３．５ｄ．ｐ．ｃ．〜５．５ｄ
．ｐ．ｃ．までのマウス胚（これは、ＩＣＭの原始外胚葉への移行を包含する）
のホールマウントインサイチュハイブリダイゼーションによって分析した。３つ
全ての新規の遺伝子の発現は、インビボでのこれらのステージにおいて多能性細
胞に限局化された。
【０１５２】 Ｌ１７は、３．５ｄ．ｐ．ｃ．のＩＣＭ、および４．５ｄ．ｐ．ｃ．のＩＣＭ
／原外胚葉の多能性細胞において高度に発現された（図５Ａ）。Ｌ１７の発現は
、ＩＣＭ／原外胚葉が増殖を開始するにつれて（４．７５日目）下方制御され、
そして後羊膜腔（ｐｒｏ−ａｍｎｉｏｔｉｃ ｃａｖｉｔｙ）形成後には検出不
可能であった。
【０１５３】 Ｐｓｃ１は、３．５ｄ．ｐ．ｃ．の内部細胞塊において、そして４．５ｄ．ｐ
．ｃ．のＩＣＭ／原外胚葉の多能性細胞において発現された（図５Ｂ）。Ｌ１７
とは異なり、Ｐｓｃ１の発現は、増殖性の原外胚葉芽において維持され（４．７
５〜５．０ｄ．ｐ．ｃ．）、そして５．０ｄ．ｐ．ｃ．後に後羊膜腔の形成を開
始した後に下方制御された。
【０１５４】 Ｋ７の発現は、４．５ｄ．ｐ．ｃ．以前のＩＣＭ／原外胚葉の多能性細胞にお
いて検出されなかった（図５Ｃ）。Ｋ７の発現は、５．２５ｄ．ｐ．ｃ．での後
羊膜腔形成後に多能性細胞中で検出されたが、この多能性細胞が再構成されて、
原始外胚葉に特徴的な円柱上皮シートを形成する５．５ｄ．ｐ．ｃ．までに下方
制御された。
【０１５５】 インビボにおける胚性多能性細胞へのＬ１７、Ｐｓｃ１およびＫ７発現の厳密
な制限は、ＥＰＬ細胞が多能性であるとの同定を支持する。胚のＩＣＭ／原外胚
葉と原始外胚葉の集団との間におけるこれらの遺伝子の示差的発現は、ＥＰＬ細
胞が、ＥＣ細胞とは異なり、かつ初期原始外胚葉の細胞により密接に関連すると
の同定と一致した。
【０１５６】 （ＥＰＬ細胞の維持における、ｇｐ１３０シグナリングの役割） ｍＬＩＦの添加を伴うＥＰＬ培養物と比較して、ｍＬＩＦの添加を伴わないＥ
ＰＬ細胞培養物において見られる分化した細胞コロニーのレベルの増加は（図１
Ｃ、Ｄ；図６）、ＥＰＬ細胞の維持における、ＬＩＦ、またはｇｐ１３０を通し
てシグナリングする他のサイトカインの可能な役割を示唆した。ｈＬＩＦではな
く、ｍＬＩＦ、ｈＯＳＭ、ｈＩＬ−６およびｈＩＬ−１１の活性を骨髄性白血病
性Ｍ１細胞およびＥＳ細胞において中和する（Ｌａｋｅ、１９９６）マウスｇｐ
１３０に対する抗体（ＲＸ−１９；Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕら、１９９６）、および
ｈＬＩＦ活性を中和するｈＬＩＦに対する抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使
用して、ＥＰＬ細胞の維持におけるｇｐ１３０シグナリングの役割を評価した。
【０１５７】 ＥＰＬ細胞の形成は、抗ｇｐ１３０抗体（１０μｇ／ｍｌ）または抗ｈＬＩＦ
抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で観察された。その一方で、抗ｈＬＩＦ抗体の
添加は、ＭＥＤＩＩ単独中で培養された細胞と比較して、ＥＰＬ細胞の著しい不
安定化を生じた（図６）。このことは、この細胞によって発現されるｍＬＩＦで
はなく、ＭＥＤＩＩ中のｈＬＩＦの存在が、ＥＰＬ細胞の維持に重要であること
を示唆した。抗ｈＬＩＦ抗体および１，０００ユニットのｍＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ
；Ａｍｒａｄ）の両方の添加は、ＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦ中で形成されたＥＰＬ細胞
培養物で観察されるレベルまで、分化のレベルを低減させた。このことは、ｇｐ
１３０シグナリングが、培養物中でＥＰＬ細胞の安定性を回復させ得たことを実
証する。
【０１５８】 ＥＳ細胞を、ＭＥＤＩＩ、抗ｈＬＩＦ抗体（１０μｇ／ｍｌ）、およびｍＬＩ
Ｆを１０〜１０００ユニット／ｍｌの濃度で（ＥＳＧＲＯ；Ａｍｒａｄ）含有す
る培地中に播種した。ＥＰＬ細胞の維持は、約５０〜１００ユニット／ｍｌのｍ
ＬＩＦの添加によって達成され（データは示さず）、これはＥＳ細胞の維持に必
要とされる１０００ユニット／ｍｌよりも１０〜２０倍低い。
【０１５９】 （懸濁培養物におけるＥＰＬ細胞の形成） ４日間５０％ＭＥＤＩＩ中にあるＥＳ細胞から形成された凝集体（ＥＢＭ）を
、４日間ＭＥＤＩＩの非存在下にあるＥＳ細胞から形成されたコントロール凝集
体（ＥＢ）と、形態学的レベルおよび遺伝子発現レベルで比較した。ＥＢは、Ｅ
ＢＭとの比較において内部組織崩壊を示した。このことは、ＥＢＭにおける均一
な中心領域の細胞死と比較して、ＥＢを通して無作為に分布するいくつかの内部
領域の細胞死が無作為分布することによって示される（図７Ａ）。ＥＢＭにおけ
るこの細胞死の中心領域は、均一の厚さの明らかに均質な細胞層によって取り囲
まれた。さらに、ＥＳ細胞ＥＢにおいて形成される胚外性内胚葉の外層は、顕微
鏡で識別され得ない。このことは、ＥＢＭが単一の細胞型からなることを示唆す
る。
【０１６０】 遺伝子発現分析を、培養物中で４日間発生させたＥＢおよびＥＢＭに対し、イ
ンサイチュハイブリダイゼーションおよびノーザンブロット分析によって実施し
た（図７Ｂ）。凝集体を、原始外胚葉マーカーＯｃｔ４およびＦｇｆ５、ならび
にＢｒａｃｈｙｕｒｙ（発生期中胚葉への多能性細胞の分化において上方調節さ
れる遺伝子）の発現について分析した。ＥＢにおけるＯｃｔ４の発現は斑状であ
り（領域の細胞は染色されない）、このことはこの凝集体中の細胞の一部分が分
化を受けたことを示唆する。対照的に、Ｏｃｔ４の発現は、ＥＢＭを含む細胞層
全体に均一に検出された。このことは、これらの細胞が多能性を維持し、そして
分化を受けなかったことを示唆する。この結論は、ＥＢの約１０％における分化
特異的マーカーのＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現によって支持され、そしてこのこと
は、これらの凝集体中の一部分の細胞が発生期中胚葉まで分化を受けたことを示
唆する。対照的に、ＥＢＭにおいてＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現が検出されなかっ
たことは、これらの凝集体内の細胞が発生期中胚葉までいかなる分化も受けなか
ったことを示す。
【０１６１】 凝集体におけるＦｇｆ５の発現を分析して、ＥＰＬ細胞／原始外胚葉の形成を
評価した（図７Ｂ）。ＥＢＭにおいて、Ｆｇｆ５は細胞層全体に均質に発現され
た。このことは、これらの凝集体中の多能性細胞が、移行を受けてＥＰＬ細胞／
原始外胚葉を形成した多能性細胞の均一な集団を表したことを示す。対照的に、
ＥＢにおけるＦｇｆ５の発現は不均一であった。
【０１６２】 ＥＢおよびＥＢＭから抽出されたＲＮＡのノーザンブロット分析は、インサイ
チュ分析の知見を支持した（図８）。４日目に、ＥＢＭ遺伝子の発現は、原始外
胚葉について診断的である高レベルなＯｃｔ４およびＦｇｆ５によって特徴付け
られた。発生期中胚葉について診断的であるＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現は、検出
され得なかった。ＥＳ細胞ＥＢは、不均一な細胞型の形成と一致して一定範囲の
遺伝子を発現した。
【０１６３】 発現データを要約すると、分化細胞に対して初期原始外胚葉から胚外内胚葉の
範囲にわたる種々の細胞型が検出され得るＥＢとは対照的に、ＥＢＭがＥＰＬ細
胞および胚性原始外胚葉に対して等価である均一な細胞集団からなることが示唆
された。ＭＥＤＩＩを伴わない１００ユニットのＬＩＦにおいて発生したコント
ロール凝集体は、ＥＢＭとして発生しなかった。このことは、ＭＥＤＩＩ存在下
での多能性細胞の分化において観察された改変が、ＭＥＤＩＩにおいて存在する
低レベルのＬＩＦの原因となり得ないことを実証する（データは示さず）。
【０１６４】 （要旨） 本実施例におけるデータは、初期原始外胚葉様細胞またはＥＰＬ細胞とよばれ
る代替的な安定な多能性細胞集団へのＥＳ細胞の均一な分化を指向する生物学的
活性を、馴化培地であるＭＥＤＩＩが含むことを実証する。ＥＰＬ細胞は、遺伝
子発現および形態学に基づいて、初期原始外胚葉の細胞と最も密接に関連すると
同定された。ＥＳ細胞からＥＰＬ細胞への移行は、接着培養物中または懸濁凝集
体中において実施され得る。
【０１６５】 （実施例２） （ＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞は、異なるが交換可能である多能性細胞状態を
表す） （材料および方法） 特に明言しない限り、すべての細胞および組織培養技術を、実施例１に記載の
ようにした。ＥＰＬ細胞を、ＭＥＤＩＩの非存在下で１０００ユニットのＬＩＦ
を含有する培地内に、１．３×１０4細胞／ｃｍ2密度にてＥＰＬ細胞の単一細胞
懸濁物を播種することによって復帰（ｒｅｖｅｒｔ）させた。
【０１６６】 （胚盤胞注射） ＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞を、Ｓｔｅｗａｒｔ、１９９３に記載のような標準
的な胚盤胞注射技術を使用してＣＢＡ／Ｃ５７ Ｆ２胚盤胞内に導入した。
【０１６７】 （ＧＰＩ分析） 血液および組織のグルコースリン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）分析を、Ｂｒａｄ
ｌｅｙ、１９８７に記載のようにした。血液サンプルを尾から収集した。分析し
た組織サンプルは、脳、眼、大腿、心臓、腸、腎、肝臓、肺、筋肉、胃、皮膚、
脾臓、舌、胸腺、および卵巣または精巣から採取された。組織サンプルを、凍結
／融解によって、および均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｓａｔｉｏｎ）によって調製
した。
【０１６８】 （結果） ＭＥＤＩＩではなくＬＩＦを含有する培地中で播種および培養されたＥＰＬ細
胞は、ＥＳ細胞様コロニー形態に適合することが観察された（本発明者らが、復
帰（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）とよぶプロセス）。さらに、ＬＩＦ存在下で、確立さ
れたＥＰＬ細胞のコロニーからＭＥＤＩＩを除くことは、ＥＳ細胞の表現型につ
いて示唆的な三次元コロニー構造の形成を生じた（データは示さず）。ノーザン
ブロット分析を使用して、ＥＳ細胞、ＥＰＬ細胞、および復帰ＥＰＬ細胞におけ
るＯｃｔ４、Ｆｇｆ５およびＲｅｘ１の発現を試験した（図９Ａ）。２、４、お
よび６日間、ＭＥＤＩＩおよびＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦ中で培養および継代されたＥ
ＰＬ細胞を、６日間ＬＩＦを単独で含有する培地内にこの細胞を継代することに
よって復帰させた。復帰ＥＰＬ細胞は、Ｆｇｆ５の低発現およびＲｅｘ１の高発
現を示した。これは、ＥＳ細胞において観察された遺伝子発現プロフィールに匹
敵し、そして親のＥＰＬ細胞における高レベルのＦｇｆ５発現および低レベルの
Ｒｅｘ１発現とは異なる。これらのデータは、ＥＰＬ細胞の表現型復帰がＥＳ細
胞遺伝子発現プロフィールの確立に随伴されることを示した。これらのデータは
また、ＥＰＬ細胞特性の確立および維持の両方に対するＭＥＤＩＩの必要性を実
証した。
【０１６９】 クローン化したＥＰＬ細胞株を生成および復帰させて、復帰がＥＰＬ細胞集団
内の残存ＥＳ細胞の結果でないことを確証した。ＭＥＤＩＩを含有するが添加Ｌ
ＩＦを有さない培地中で４日間増殖させたＥＰＬ細胞を、ＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦ中
に限界希釈で播種して、クローン性ＥＰＬ細胞コロニーを生成した。２つのクロ
ーンを、ｍＬＩＦ単独またはＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦを含有する培地中に播種する前
に、３週間にわたってＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦ中で増殖した。得られた培養物を、Ｅ
Ｓ細胞、ＥＰＬ細胞および分化したコロニーの存在について評価した（図９Ｂ）
。両方の株由来で高い割合の細胞が、ＬＩＦ単独中に播種および維持された培養
物中で、ＥＳ細胞形態を有するアルカリホスファターゼ陽性コロニーを形成し、
これはＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦ中で維持された培養物中ではみられなかった。これは
、このクローン株の効率的な復帰を示した。
【０１７０】 （ＥＰＬ細胞ではなく、復帰ＥＰＬ細胞は、胚盤胞注射後のキメラマウスに
寄与する） 移植前胚および移植後胚由来の多能性細胞は、後者ではなく前者が胚盤胞注射
後の胚発生に寄与する能力によって異なる。ＥＳ細胞は、すべての胚性組織およ
び成体組織に寄与する能力を保持する。Ｅ１４ＴＧ２ａ ＥＳ細胞およびそれら
のＥＰＬ細胞誘導体を、ＣＢＡ／Ｃ５７ Ｆ２胚盤胞に注射した場合に、キメラ
マウスに寄与するそれらの能力について試験した。マウス子孫に対するＥＳ細胞
およびＥＰＬ細胞誘導体の寄与分を、毛色の寄与分、ならびに血液および組織の
ＧＰＩ分析によって評価した。Ｅ１４ＴＧ２ａ ＥＳ細胞は、注射した胚盤胞の
４４％の発生に寄与した（表２）。対照的に、ＥＰＬ細胞遺伝子発現を確立する
ように２および４日間、添加ＬＩＦを伴わないＭＥＤＩＩ中で増殖したＥ１４Ｔ
Ｇ２ａ誘導性ＥＰＬ細胞は、それぞれ３３および５０の生存仔の毛色を評価した
場合に、キメラ形成に寄与しなかった（表２）。これらのマウスの２０個体から
採取した血液サンプルのＧＰＩ分析もまた、ＥＰＬ細胞由来のいかなる寄与も検
出できなかった。２個体のマウスから採取された１５の組織サンプルの分析もま
た、いかなるＥＰＬ細胞の寄与も検出できなかった。このことは、生存仔の割合
が、ＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞を用いて注射された胚盤胞から同等であるので、
注射された胚盤胞の生存率に対するＥＰＬ細胞の副作用では説明され得ない（表
２）。
【０１７１】 前述の胚盤胞注射実験において使用されたＥＰＬ細胞を、ＭＥＤＩＩではなく
ＬＩＦを含有する培地中で６日間培養することによって復帰させた（２Rおよび
４R）。これらの細胞は、注射された胚盤胞の３６％（２R）および６３％（４R
）における胚発生に寄与した（表２）。復帰ＥＰＬ細胞を用いて産生されたキメ
ラマウスの、それぞれ１０および２から採取された血液および組織サンプルのＧ
ＰＩ分析は、これらの細胞が、中胚葉由来、内胚葉由来、および外胚葉由来の成
体マウスの細胞系列に寄与し得ることを確証した（データは示さず）。これらの
データは、ＥＳ細胞からＥＰＬ細胞への移行が、ＥＰＬ細胞ではなくＥＳ細胞の
能力によって反映される、宿主胚盤胞内に導入された場合の発生に寄与する種々
の発生能力の細胞を生じることを示した。キメラ発生に寄与する復帰ＥＰＬ細胞
の能力は、ＥＰＬ細胞によるキメラ形成能力におけるこの喪失が、ＥＰＬ細胞形
成における多能性の喪失の原因とはなり得ないことを示唆する。
【０１７２】 （要旨） ＥＳ細胞に復帰するＥＰＬ細胞の能力は、推定および実証された他の多能性細
胞型の挙動（例えば、培養物中の始原生殖細胞（ＰＧＣ）からのＥＧ細胞の形成
）と一致し、そしてＥＰＬ細胞が多能性であるという推論を支持する。さらに、
ＥＳ細胞型への復帰は、原始外胚葉の予測された特徴である。子孫に対し胚盤胞
注射後のキメラマウスに寄与しないＥＰＬ細胞の実証された能力と組合わせると
、これは、ＥＰＬ細胞が、ＥＳ細胞とは異なり、そして原始外胚葉と最も密接に
関連するとの同定を支持する。結局、復帰は、ＥＰＬ細胞が、脱分化または復帰
により、インビトロでのＥＳ細胞の産生のための基質として使用され得ることを
実証する。
【０１７３】 （実施例３） （胚性原始外胚葉およびインビトロ誘導原始外胚葉からのＥＰＬ細胞および
ＥＳ細胞の単離） （導入） 既存の手順および培養条件は、任意の哺乳動物種の原始外胚葉由来の多能性細
胞の維持および／または増殖を支持できなかった。原始外胚葉由来の多能性細胞
および細胞株の首尾良い単離および維持は、商業的適用、医療的適用、および農
業的適用についての可能性を有する遺伝的に操作可能な多能性細胞の単離につい
て、代替的な方法論を提供する。マウスにおいて、そのような株は、移植前胚（
ＥＳ細胞）または始原生殖細胞系列（ＥＧ細胞）の多能性細胞から単離されてい
るのみである。多能性細胞株の効率的な単離は、現在、限られた数の近交系マウ
ス系統（例えば、１２９）に制限されており、そして他の哺乳動物においては成
功したことが実証されていない。
【０１７４】 ＭＥＤＩＩは、哺乳動物胚の原始外胚葉の多能性細胞と最も密接に関連したＥ
ＰＬ細胞の形成および維持を支持する。この実施例において、本発明者らは、原
始外胚葉由来の多能性細胞を単離および維持するために、ＭＥＤＩＩの生物学的
活性を利用する方法論の開発を議論する。
【０１７５】 （材料および方法） （細胞および細胞培養） ＥＳおよびＥＰＬ細胞についての細胞培養条件は、他に特定する場合以外は、
実施例１に記載した通りである。原始外胚葉から単離された細胞を、高濃度グル
コースを含み、そして１５％ ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔ
ｈ Ｓｅｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、４０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシ
ン、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（β−Ｍ
Ｅ）、および１０００単位のＬＩＦを補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｇ
ｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＨ ７．４（胚培養培地）中で、加湿インキュベーター
中にて、１０％ＣＯ2下で培養した。不活化フィーダー層を、ＳＴＯ細胞（ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ−１５０３）または初代マウス胚性線維芽細胞（Ａｂｂｏｎｄａｎ
ｚｏら、１９９３）のいずれかから調製した。フィーダー細胞の不活化を、３０
グレイの電離放射線に細胞を曝露することによって達成した。フィーダー細胞を
、製造業者の指示書に従って、使用の少なくとも６時間前にＤＭＥＭ中で１×１
０5細胞／ｃｍ2の密度で、ヒト胎盤ＩＶ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ）を用いて処
理した組織培養プラスチック上に播種した。フィーダー細胞層を、培養培地およ
び胚性外植片の添加の前に、ＤＭＥＭで１回洗浄した。多能性細胞を、多能性特
異的マーカーであるアルカリホスファターゼおよびＯｃｔ４ならびに実施例１に
記載されるようなインサイチュ分析技術を使用して同定した。
【０１７６】 胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）（ＥＢ）を、実施例１に記載されるよ
うに形成した。
【０１７７】 （胚性細胞の供給源） ＣＢＡ／Ｃ５７ Ｆ２胚を、特定の日数において、発情期を合わせて交配（ｔ
ｉｍｅ−ｍａｔｅｄ）させたＣＢＡ／Ｃ５７ Ｆ１雌のマウスから取り出した。
交尾（ｃｏｉｔｕｍ）０．５日後を、膣栓形成（ｐｌｕｇｇｉｎｇ）の日の正午
として指定した。交尾した雌のマウスを頚椎脱臼またはＣＯ2窒息によって屠殺
し、そして子宮を、胚の切開まで、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．４を補充
したＤＭＥＭ中に３７℃で保った。標準的な切開技術を用いて胚を取り出し、１
０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．４を補充したＤＭＥＭ中に移した。胚外外胚葉
の除去は、胚を、胚よりもわずかに小さい口径まで炎の中で引き伸ばしたパスツ
ールピペットを通して、ピペッティングすることによって機械的に達成した。
【０１７８】 （結果） （インビトロで形成された原始外胚葉由来の多能性細胞の単離） 懸濁培養においてＥＳ細胞の凝集によって形成された胚様体（ＥＢ）は、胚外
の細胞型および分化した細胞型の秩序だった外見を伴う、初期マウス胚形成に等
価な分化の経路に従う。これらの細胞の外見は、遺伝子発現における変化によっ
てモニターされ得る。ＥＢ発生の４日目までに、胚様体中の多能性細胞集団は、
原始外胚葉マーカーＦｇｆ５およびＯｃｔ４の発現、ならびにＥＳ／ＩＣＭ細胞
マーカーＲｅｘ１（図１０Ａ）のダウンレギュレーションによって決定されるよ
うに、大部分または完全に原始外胚葉からなる。ＥＢにおける多能性細胞は、培
養の８／９日目までに大部分を分化する。
【０１７９】 培養において４〜８日間発生させた個々のＥＢを、１×ＰＢＳ中の０．５ｍＭ
ＥＧＴＡで５分間処理し、その後トリプシン処理して単細胞懸濁物にした。各
々の単一の細胞懸濁物を、ＤＭＥＭ＋ＬＩＦまたはＤＭＥＭ＋５０％ ＭＥＤＩ
Ｉ＋ＬＩＦのいずれかを含む２つの２ｍｌ組織培養ウェルの間で等しく分けた。
５日後、培養物をアルカリホスファターゼ活性について染色し、多能性細胞コロ
ニーを同定した。培地中におけるＭＥＤＩＩの存在は、多数の多能性細胞コロニ
ーの単離を生じた（図１０Ｂ）。このことは、この因子が、ＥＢ中の多能性細胞
からの多能性ＥＰＬ細胞の効率的な単離および維持を可能にしたことを示す。こ
れらのＥＰＬ細胞は、Ｆｇｆ５およびＲｅｘ１の発現（図１０Ａ）によって、お
よび、ＬＩＦ単独を補充した培地では多能性細胞増殖および維持を補助できなか
ったこと（図１０Ｂ）によって、これらの段階にあるＥＢ中の唯一の多能性細胞
集団であるとして示された原始外胚葉から生じた。ＬＩＦは、多能性ＩＣＭ細胞
または多能性ＥＳ細胞の維持に十分であることが示されてきた。多能性細胞は、
ＬＩＦの存在下または非存在下のいずれにおいてもＥＢ誘導原始外胚葉から単離
され得るが、ＭＥＤＩＩの存在に依存した。
【０１８０】 これらのデータは、ＭＥＤＩＩがＥＢの原始外胚葉由来の多能性細胞の維持お
よび増殖を補助し得ることを示す。原始外胚葉から単離された多能性細胞は、形
態および遺伝子発現において、ＥＰＬ細胞に等価であり、そしてＬＩＦの存在下
およびＭＥＤＩＩの非存在下で培養した場合に、ＥＳ細胞に復帰し得た（データ
は示さず；実施例２）。このようにＥＢの原始外胚葉から単離し、ＥＳ細胞に復
帰した多能性細胞は、宿主胚盤胞に導入された場合に、キメラマウスに寄与する
ことが示されてきた。
【０１８１】 （マウス胚の原始外胚葉由来の多能性細胞の単離および維持） この研究の目的は、マウスの非１２９系統の原始外胚葉由来の多能性細胞の単
離および維持であった。ＥＳ細胞を通常では高頻度では生じないこの系統由来の
多能性細胞の首尾よい単離および維持は、他の哺乳動物に拡張し得る一般的的技
術を提供する。
【０１８２】 （５．５ｄ．ｐ．ｃ．胚由来の原始外胚葉は、多能性細胞単離の好ましい物質
である） ５．５、６．５、および７．５（ｄ．ｐ．ｃ．）において発情期を合わせて交
配させた雌のマウスから切開された全胚を、Ｒｅｉｃｈａｒｔ’ｓ膜を有さない
ように切開し、そして個々に、１ｍｌの胚培養培地＋５０％ ＭＥＤＩＩ中で、
２ｍｌの組織培養ウェル（０．１％ ゼラチンで３０分間前処理した）に置いた
。３７℃、１０％ＣＯ2における３日間の培養後、胚性外植片をアルカリホスフ
ァターゼについて染色し、アルカリホスファターゼポジティブ細胞の存在および
量を評価した。アルカリホスファターゼポジティブ細胞を含む胚性外植片の数は
、５．５ ｄ．ｐ．ｃ．日の外植片において最大であり（２５％と４０％との間
で変動した）、そして７．５ ｄ．ｐ．ｃ．日胚の外植片において５％未満まで
、胚の齢の増加に伴って有意に減少した。５．５ ｄ．ｐ．ｃ．胚の外植片中の
アルカリホスファターゼポジティブ細胞の量は変動したが、大部分の外植片は、
２０％以上のアルカリホスファターゼポジティブ細胞を含んだ。５．５ｄ．ｐ．
ｃ．胚を、続く実験における原始外胚葉の供給源として使用した。
【０１８３】 原始外胚葉由来の多能性細胞の首尾よい単離および維持を、５．２５ｄ．ｐ．
ｃ．と５．５ｄ．ｐ．ｃ．との間に収集した胚から達成した。この機会の後の胚
の収集は、１〜２時間によってさえ、この手順を損ない得る。これらの胚由来の
外植片は、迅速に分化し、そして原始外胚葉細胞層は、形態学的に同定され得な
い。５．２５ｄ．ｐ．ｃ．よりも初期の胚由来の細胞の単離は試みなかった。
【０１８４】 （精製した細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分は培養中のＥＰＬ細胞を安定化す
る） 培養中のＥＰＬ／原始外胚葉細胞の安定性に対する代替的な細胞外マトリクス
活性の効果を、低密度（２．５×１０2細胞／ｃｍ2）で、ＤＭＥＭ＋ＬＩＦまた
はＤＭＥＭ＋５０％ ＭＥＤＩＩ中で、ゼラチン（実施例１）、血漿フィブロネ
クチン、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン（全てＳｉｇｍａより入手し、そして製造
業者の説明書に従って使用した）、ならびに血漿フィブロネクチン、ラミニン、
およびＩＶ型コラーゲンの組み合わせで前処理した組織培養プラスチック上でＥ
Ｓ細胞を播種することにより試験した。選択され、精製されたＥＣＭ成分は、初
期胚の細胞外マトリクス中に存在することが示された。細胞を５日間培養し、そ
してアルカリホスファターゼについて染色した。コロニーを、コロニー中の分化
した（アルカリホスファターゼネガティブ）細胞型の存在または非存在について
分類し、そして分化した細胞の存在を、多能性細胞の安定性の尺度として用いた
（表３）。試験された条件では、ＥＰＬ細胞安定性についてゼラチンが最も好ま
しくなく、ＥＰＬ細胞コロニーのうちの７８％が、少なくともいくつかの分化し
た細胞を含んでいた。精製したマトリクス成分の全ては、ゼラチンと比較して、
より安定なＥＰＬ細胞培養物を生じ、ＩＶ型コラーゲン、およびＩＶ型コラーゲ
ンを含むマトリクス混合物は、未分化のＥＰＬ細胞コロニーをそれぞれ５９％お
よび６２．５％生じた。ＭＥＤＩＩの非存在下で培養されたＥＳ細胞は、全ての
試験されたマトリクスで安定であった。
【０１８５】 ＩＶ型コラーゲンで前処理した組織培養プラスチックを、次の実験において原
始外胚葉由来の多能性細胞の培養に使用した。
【０１８６】 （ＭＥＤＩＩ中の生物学的活性は、胚性原始外胚葉の増殖および維持に必要で
ある） 培養中の原始外胚葉維持におけるＭＥＤＩＩの役割を、切開した５．５ｄ．ｐ
．ｃ．胚を個々に、胚培養培地または胚培養培地＋５０％ ＭＥＤＩＩ中で、Ｉ
Ｖ型コラーゲンで前処理した２ｍｌ組織培養ウェルに置き、３７℃、１０％ＣＯ 2 に維持することによって評価した。培養５日後、外植片を４％ＰＦＡで固定し
、そして多能性Ｏｃｔ４ポジティブ細胞の存在を、インサイチュハイブリダイゼ
ーションによって評価した（図１１；表４）。ＬＩＦの存在下において培養した
胚は、迅速に秩序が破壊され、そして壊死性となり、明らかに原始外胚葉細胞層
を欠き、そして５日後にはＯｃｔ４ポジティブ細胞を全く含まなかった。対照的
に、５０％ ＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦの存在下で維持された胚の多くは、多能性細胞
マーカーＯｃｔ４（図１１Ｂ）について強力にかつ均一に染色された、明確な、
同定可能な原始外胚葉細胞層を含む、その胚の組織を保持した。５０％ ＭＥＤ
ＩＩ＋ＬＩＦの存在下で培養された生存している外植片の５４％がＯｃｔ４ポジ
ティブ細胞を含んでいた。このことは、ＭＥＤＩＩが、培養中の原始外胚葉由来
の多能性細胞の維持を促進することを示す。
【０１８７】 多数の実験の比較分析は、新鮮なＭＥＤＩＩが、凍結させたＭＥＤＩＩとは対
照的に、胚性原始外胚葉由来の多能性細胞のインビトロでの維持のためにより有
効であることを示した。
【０１８８】 （インビトロでの胚由来の原始外胚葉の首尾よい単離および維持に関連する他
のパラメーター） 内臓内胚葉は、原腸形成の間の多能性細胞の分化に関与する誘導性シグナルの
供給源として認識されている。胚性外植片からの内臓内胚葉の除去を、この分化
誘導シグナルの供給源を除去するため、および培養中に多能細胞安定性を促進す
るために行った。この工程の効果は定量されなかったが、胚からの多能性細胞の
首尾よい単離および維持は、原始外胚葉および胚外内胚葉を含む外植片から達成
されなかった。
【０１８９】 さらに、インビトロ培養の最初の段階の間に組織培養下層に付着できなかった
原始外胚葉外植片は、より少ない混在する分化した細胞を伴う、増殖している原
始外胚葉を含むことが示された。これらの外植片は、さらなる培養の多能性細胞
の好ましい供給源であった。原始外胚葉外植片の懸濁培養を、ＤＭＥＭ培養基（
低融点アガロース、Ｓｉｇｍａ）中の０．５ｍｌの０．５％アガロースの、２ｍ
ｌ組織培養ウェルへの添加によって達成した。これは、胚培養培地中で３×３０
分間洗浄し、その後５０％ ＭＥＤＩＩを含む胚培養培地に対してあらかじめ平
衡化した。
【０１９０】 （５．５ｄ．ｐ．ｃ．胚（図１２）の原始外胚葉由来の多能性細胞の単離およ
び維持） 妊娠から６日目の朝（約５．４ｄ．ｐ．ｃ．）に、午前１０時と１１時との間
に、発情期を合わせて交配した雌のマウスから胚を子宮から切開した。各々の胚
を、Ｒｅｉｃｈａｒｔ膜、胎盤外の錐状体（ｃｏｎｅ）および内臓内胚葉層を除
去するために切開し、これは、混在する細胞型が存在しない原始外胚葉を含むカ
ップ状構造を生じた（図１２Ｂ）。全ての組織を胚から機械的に取り出した。原
始外胚葉外植片を、アガロースを詰めた２ｍｌウェル中に個々に置き、そして１
ｍｌの胚培養培地＋５０％ ＭＥＤＩＩ中で培養した。胚を、３７℃で、１０％
ＣＯ2加湿インキュベーター中で培養した。
【０１９１】 培養の２日目または３日目に、生存している外植片を懸濁物から取り出し、再
切開して培養物中に生じる分化物を全て除去し、そして記載のように調製した２
ｍｌウェルを再配置した。
【０１９２】 培養の５日目に、ＥＰＬ細胞（図１２Ｂ）に多くの点で等価なＯｃｔ４ポジテ
ィブ細胞の同定可能な上皮シートを通常含む、生存している外植片（０日目に播
種された外植片の約２５％）を、懸濁物から除去し、再切開し、そして胚培養培
地＋５０％ ＭＥＤＩＩ中で、ＩＶ型コラーゲンで前処理された組織培養プラス
チックにプレートした。外植片を、さらに２日間、胚培養培地＋５０％ ＭＥＤ
ＩＩ中で維持した。この段階の外植片は、通常入り組んだ上皮シートからなって
いた（図１２Ｂ）。次いで、外植片を、ＬＩＦの存在下およびＭＥＤＩＩの非存
在下で胚培養培地中で培養した。これは、このシートの平板化を生じ、そしてＥ
Ｓ細胞様の外見を採っていた（図１２Ｂ）。インサイチュハイブリダイゼーショ
ンによるこれらの細胞の分析は、Ｏｃｔ４（図１２Ｂ）およびアルカリホスファ
ターゼ発現によって評価されるように、これらの細胞が多能性であることを示し
た。
【０１９３】 培養の９日目または１０日目において、外植片を、トリプシン処理によって単
細胞および細胞の小さい凝集塊へとばらばらにし、そしてＩＶ型コラーゲンで前
処理したか、または不活化フィーダー細胞をあらかじめ播種した２ｍｌウェル中
に播種した。この方法によって得られた細胞は、外見上はＥＳ細胞と等価であり
（図１２Ｂ）、多能性細胞マーカーアルカリホスファターゼおよびＯｃｔ４（図
１３）を発現し、自発的に分化する能力を保持し、そして少なくとも４週間培養
中に増殖した。多能細胞を、約１０％の胚から単離した。その効率は、標準的な
技術による、１２９マウス胚盤胞段階の胚のＩＣＭからのＥＳ細胞の単離物と匹
敵し得る。
【０１９４】 （要約） この実施例において記載された研究は、胚性原始外胚葉に由来する多能細胞が
、長期間の間、ＥＰＬおよびＥＳ細胞に類似した多能細胞として、培養中に単離
および維持され得ることの最初の実証を提供する。これらの細胞の培養および継
代は、ＭＥＤＩＩ中に含まれる生物学的活性に依存していた。この様式において
得られる多能性細胞は、遺伝子操作がしやすいようであり、そして潜在的な商業
的、医学的、および農業的適用を有する供給源を示す。多能性ＥＰＬ細胞および
ＥＳ細胞が、他の方法論によるＥＳ細胞およびＥＧ細胞を単離しにくいマウス種
の原始外胚葉から単離され得るということの実証は、他の哺乳動物およびトリの
種由来の多能性細胞系統の単離についての機会を潜在的に提供する。
【０１９５】 ＥＰＬ細胞に等価な細胞が、ＭＥＤＩＩ中に含まれる生物学的活性の存在下で
培養される胚性原始外胚葉から、単離および維持され得るということの実証は、
ＥＰＬ細胞と、胚性原始外胚葉との間の提案された類似性についてのさらなる支
持を提供する。
【０１９６】 （実施例４） （無血清馴化培地からの生物学的に活性な因子の成分の精製） （材料および方法） 全ての細胞および組織培養技術は、他に言及されない限りは、実施例１に記載
された通りであった。ＥＰＬ細胞誘導因子の精製は、標準的なＦＰＬＣおよびＨ
ＰＬＣクロマトグラフィー技術を利用した。これは、ＥＳ細胞からＥＰＬ細胞へ
の転換についての形態に基づくアッセイによって活性を評価する。アミノ酸、プ
ロリンアナログ、およびペプチドをＳｉｇｍａより購入した。
【０１９７】 無血清ＭＥＤＩＩ（ｓｆＭＥＤＩＩ）を、全ての精製プロトコールにおける生
物学的に活性な因子の供給源として使用した。ＳｆＭＥＤＩＩは、ＭＥＤＩＩに
類似の様式で（実施例１、データは示さず）ＥＳからＥＰＬへの細胞移行を引き
起こすことが示された。ｓｆＭＥＤＩＩを産生するために、Ｈｅｐ Ｇ２細胞を
、５×１０4細胞／ｃｍ2の密度で播種し、そして３日間培養した。細胞を、１×
ＰＢＳで２回、そして無血清培地（１ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ β−
ＭＥ、１×ＩＴＳＳ補充物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、１０
ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．４および１１０ｍｇ／Ｌ ピルビン酸ナトリウム
を補充した、高濃度グルコースを含むが、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ
）で１回、２時間洗浄した。新鮮な無血清培地を０．２３ｍｌ／ｃｍ2の比で添
加し、そして細胞をさらに３〜４日間培養した。ＳｆＭＥＤＩＩを収集し、滅菌
し、そしてＭＥＤＩＩ（実施例１）についてのように保存した。ｓｆＭＥＤＩＩ
の大規模産生を、コルゲートローラーボトル（ｃｏｒｒｕｇａｔｅｄ ｒｏｌｌ
ｅｒ ｂｏｔｔｌｅ）（Ｆａｌｃｏｎ）中で実行した。
【０１９８】 （ＥＰＬ細胞誘導活性についての細胞アッセイ） 精製した画分のＥＰＬ細胞誘導活性を試験するための形態に基づくアッセイを
、Ｄ３ ＥＳ細胞を用いて行った。アッセイを、２ｍｌウェル（Ｆａｌｃｏｎ）
中、総量１ｍｌ／ウェルで行った。ＥＳ細胞（２．５×１０2細胞／ｃｍ2）を、
半精製画分の存在下で培養し、そして培養の４日後にＥＰＬ細胞形態について顕
微鏡的に点数化し、そしてアルカリホスファターゼ活性について染色５日後に巨
視的に点数化した。
【０１９９】 細胞外マトリクス調製物を以下のように形成した。Ｈｅｐ Ｇ２細胞を、実施
例１に記載の条件下で、コンフルエントまで増殖させた。細胞を、ＰＢＳ中の０
．５％アジ化ナトリウム／０．１ｍＭ ＰＭＳＦ中で、３７℃または室温で６〜
１８時間インキュベートして、細胞を殺傷および剥離させるか、または０．５ｍ
Ｍ ＥＧＴＡ中で室温で１５分間培養して、細胞を剥離させた。細胞および細片
を、ＰＢＳで洗浄することによって除去した。半精製タンパク質または精製タン
パク質由来のマトリクスの形成を、１〜２μｇのタンパク質を２ｍｌの組織培養
ウェル上で乾燥させることによって達成した。ＥＳ細胞を、１０００単位／ｍｌ
ＬＩＦおよび１０μｇ／ｍｌ Ｌ−プロリンで補充したＤＭＥＭ中で、２．５
×１０2細胞／ｃｍ2の濃度で、マトリクス上に播種した。４日目に細胞の形態を
、顕微鏡的にアッセイし、続いて５日目に、アルカリホスファターゼ活性につい
ての染色を行った。
【０２００】 半精製サンプルにおけるプロリンの存在を、８０％プロパノール中の０．２ｍ
ｍシリカゲル ６０ Ｆ254プレート（Ｍｅｒｃｋ）でのサンプルの薄層クロマ
トグラフィー、続いてニンヒドリンを用いる染色によって直接的に検出した。
【０２０１】 （プロテアーゼ消化） ２５０ｍｇのＩＶ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ）を、最終容量１０ｍｌの５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ ｐＨ ７．４、１００ｍＭ ＣａＣｌ2緩衝液中のＩＶ型
コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）の３ ＦＡＬＧＰＡ単位を用いて、連続的に混合し
ながら、３７℃で一晩インキュベートして、消化した。４００ｍｌ限外濾過セル
（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して、４℃、窒素圧下で、Ａｍｉｃｏｎ Ｄｉａｆｌｏ
ＹＭ３膜を通す限外濾過によって、消化したコラーゲンフラグメントを、酵素
および未消化のタンパク質から分離した。限外濾過から得られた溶離液を、０．
２２μｍのフィルターに通し、そして１．５ｍｌのアリコートを凍結乾燥し、そ
して２００μｌの水に再懸濁した。４×５０μｌの再懸濁した濾液を、水中で平
衡化され、そしてＳＭＡＲＴ微量精製システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に接続さ
れたＳｕｐｅｒｄｅｘペプチドゲル濾過カラムにアプライした。２５μｌ画分を
収集し、そしてＲの存在下でＥＰＬ細胞誘導活性について、直接的にアッセイし
た。
【０２０２】 ＥＰＬ細胞誘導活性の高分子量成分のトリプシン消化のために、８０μｌのＲ
（３．６ｍｇ／ｍｌ）を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ ｐＨ ８．５、２０ｍＭ
ＣａＣｌ2中の１００単位のトリプシン（Ｄｉｆｃｏ）を用いて、２５℃で１
時間消化した。この反応を、１００μＭ ＰＭＳＦの添加により停止させた。こ
のサンプルを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０カラム（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮し、そ
してＥＰＬ細胞誘導活性の高分子量成分についてアッセイした。
【０２０３】 （還元ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによるタンパク質分析） タンパク質サンプルを、馴化培地から直接的に得るか、またはクロマトグラフ
ィー画分をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０カラム（Ａｍｉｃｏｎ）で脱塩して、２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ ｐＨ ８．５を用いてもともとの容量にした。サンプル
を、Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０によって記載されるように、１０％還元ＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル上で電気泳動し、そしてタンパク質を、Ｈｅｕｋｅｓｈｏ
ｖｅｎおよびＤｅｒｎｉｃｋ（１９８５）の方法を用いる銀染色によって可視化
した。
【０２０４】 ウェスタンブロッティングのために、ゲルをウェスタン転写緩衝液（３９ｍＭ
グリシン、４８ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、２０％ メタノール、０．０３７％
ＳＤＳ）中で３０分間洗浄し、そしてＭｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ装置（Ｂ
ｉｏＲａｄ）上で、この緩衝液中で、ニトロセルロースに、４００ｍＡｍｐｓ、
定電圧で３時間エレクトロブロットした。フィルターを、一晩、ＰＢＴ（０．１
％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１×ＰＢＳ）、５％ スキムミルク粉末中でブ
ロックした。モノクローナル抗体３Ｅ２（Ｓｉｇｍａ）（細胞性ヒトフィブロネ
クチンのＥＤＡ領域に特異的である）を、１％ スキムミルク粉末、ＰＢＴ中で
１／１０００に希釈し、そして室温で２時間インキュベートし、その後フィルタ
ーとともに室温で２時間インキュベーションした。フィルターをＰＢＴ中で、３
回室温で洗浄し、次いで室温で２時間、１％スキムミルク、ＰＢＴ中で１／１０
０００に希釈したヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ抗体（Ｄａｋｏ）中でイ
ンキュベートした。ウェスタン緩衝液１（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ ｐＨ
７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ）中で２０分間洗浄し、続いてウェスタン緩衝液
２（Ｔｒｉｓ．Ｃｌ ｐＨ ９．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ 2 ）中で２×２０分間の洗浄を行った。反応を、ウェスタン基質混合物（１０ｍ
ｌ ウェスタン緩衝液２、４０μｌ ＮＢＴ（７０％ ＤＭＦ中７５ｍｇ／ｍｌ
）、４０μｌ ＢＣＩＰ（１００％ ＤＭＦ中５０ｍｇ／ｍｌ））中で、暗所で
進行させ、そして１０ｍｌ ウェスタン緩衝液１、１００ｍＭ ＥＤＴＡの添加
によって停止させた。
【０２０５】 （結果） （ＭＥＤＩＩ内の可溶性生物学的因子は、ＥＳからＥＰＬ細胞への変換を担う
） ＳｆＭＥＤＩＩは、１０×１０3Ｍrカットオフ膜（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３ユ
ニット；Ａｍｉｃｏｎ）を通す限外濾過によって２つの画分に分離された。両方
の画分を、ｍＬＩＦの存在下で、Ｄ３ ＥＳ細胞のアルカリホスファターゼ陽性
ＥＰＬ細胞への完全な変換を生じる能力として規定されるＥＰＬ形成活性につい
てアッセイした（図１４）。５０％ＭＥＤＩＩに等価な濃度で保持された画分（
＞３×１０3Ｍr）に播種されたＥＳ細胞は、ＥＰＬ細胞を形成しなかったが、Ｅ
Ｓ細胞コロニーのサイズは増大した。５０％ＭＥＤＩＩに等価な濃度で溶出画分
へと播種したＥＳ細胞（＜３×１０3Ｍr）は、ＥＳ、ＥＰＬ、および分化した細
胞を含むコロニー形態のアレイを生じた。ＥＳ細胞の存在および分化した細胞の
より高度の比率は、ＥＳからＥＰＬ細胞への変換に特徴的ではなく、溶出された
物質単独ではＥＰＬ細胞形成を誘導し得なかったことを実証した。ＥＳ細胞を、
保持された画分および溶出された画分の両方を含有する培地に５０％ＭＥＤＩＩ
に等価な濃度で播種することにより、ｓｆＭＥＤＩＩについて観察されたものと
等価な均一なＥＰＬ細胞が形成された。これらのデータは、２つの分離可能な生
物学的因子がＥＳからＥＰＬ細胞への変換に要求されることを示した。
【０２０６】 （ｓｆＭＥＤＩＩからのＲおよびＥ画分の大規模調製） ＭＥＤＩＩからの生物活性因子の精製および分析のための開始材料を、４００
ｍｌの限外濾過細胞（Ａｍｉｃｏｎ）を４℃、窒素圧下で使用するＡｍｉｃｏｎ
Ｄｉａｆｌｏ ＹＭ３膜を介するｓｆＭＥＤＩＩの限外濾過によって得た。保
持された画分（Ｒ）（＞３×１０3Ｍr）、を即座に使用するか、または等分して
−２０℃で保存した。溶出した画分（Ｅ）（＜３×１０3Ｍr）、を即座に使用す
るか、または４℃で保存した。
【０２０７】 （ＥＰＬ細胞誘導活性の低分子量成分の検出のための細胞アッセイ） ＥＰＬ細胞誘導活性の低分子量成分を、１ｍｌの培養培地に、低分子量の夾雑
物を除くためにＰＤ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通過させたＲの２０μ
ｌ（５０〜１００μｇのタンパク質）を補充したことを除き、上記のようにアッ
セイした。
【０２０８】 （低分子量成分の物理化学的特性） ＥＰＬ細胞誘導活性の低分子量成分の物理化学的特性を、Ｅの処置およびアッ
セイから推定した（表５）。活性を、ｐＨ２．０での酸処理、凍結解凍の繰り返
し、１時間の沸騰、および室温での５０ｍＭ ＤＴＴでの還元に続いて維持した
。活性成分は、水、アセトニトリル、メタノール、およびプロパノールにおいて
可溶であり、ＨＰＬＣ精製をしやすかったが、標準的な技術を使用してはイオン
交換もしくは逆相ＨＰＬＣカラムに結合しなかった。
【０２０９】 （ＥＰＬ細胞誘導活性の低分子量成分の精製） ２２０ｍｌのＥを、水で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０カラム（１１０
０ｍｌのベッド容量、１１０×１１３ｍｍ）にかけた。溶出を、室温、流速３５
ｍｌ／分で、水で行った。４５ｍｌの画分を回収し、そして各画分の１ｍｌのア
リコートを凍結乾燥した。凍結乾燥した画分を、１００μｌの水に再懸濁し、そ
して２５μｌをＥＰＬ細胞誘導活性についてアッセイした。活性を画分６〜１０
において、注入後１９〜２５．２分に検出した（図１５Ａ）。
【０２１０】 画分７〜９をプールし、凍結乾燥し、そして３０：７０のメタノール：アセト
ニトリル１ｍｌに再懸濁した。サンプルを１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分
離し、沈殿物を除去し、そしてＷａｔｅｒｓ ５１０ ＨＰＬＣ機器に連結させ
た１０ｍｌのＷａｔｅｒｓラジアルパック正常相シリカカラム（８ｍｍ Ｉ．Ｄ
．）にかけた。そのカラムを、３０：７０のメタノール：アセトニトリルで流速
０．２ｍｌ／分で１５分間洗浄し、その後その物質を水に対する２０分の直線勾
配で流速０．５ｍｌ／分を使用して溶出した。溶出した物質を、２１５ｎｍにセ
ットしたＷａｔｅｒｓ４９０Ｅプログラム可能多波長検出器で検出した。１ｍｌ
の画分を回収し、凍結乾燥し、５０μｌのＤＭＥＭ中に再懸濁し、そしてカラム
から７０％水／３０％（３０：７０ メタノール：アセトニトリル）で溶出した
ＥＰＬ細胞誘導活性についてアッセイした（図１５Ｂ）。
【０２１１】 ３２分〜３５分の間の正常相クロマトグラフィーからの最も高い活性を有する
画分を凍結乾燥し、５０μｌの水中に再懸濁し、そして１０μｌを、ＳＭＡＲＴ
微量精製システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に連結したＳｕｐｅｒｄｅｘペプチド
ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけ、そして室温で水中にて平衡化し
た。そのカラムを水で流速２５μｌ／分で溶出し（図１５Ｃ）、そして２５μｌ
のサンプルを回収した。これを５回繰り返し、分析のために適切なサンプルを得
た。個々のサンプルを、単一ピークもしくはいくつかの密接して溶出するピーク
（すなわち、画分８、９、および１０）において注入後約７１．０４〜７４．０
４分に溶出する画分において検出した生物活性について直接アッセイした。活性
画分の推定分子量は、溶出容量によれば＜７００Ｄであった。
【０２１２】 （精製された低分子量成分の特徴づけ） Ｓｕｐｅｒｄｅｘペプチドゲル濾過カラムからの画分９を、凍結乾燥し、ＦＭ
ＯＣおよびＯＰＡで誘導体化し、そしてアミノ酸分析を、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａ
ｃｋａｒｄ Ａｍｉｃｏｎ−Ｑｕａｎｔ ＩＩアナライザーを使用して、加水分
解ありおよびなしで行った。結果を、同一の精製に供した非馴化培地のコントロ
ールサンプルと比較した（表６）。アミノ酸アラニンおよびイミノ酸プロリンが
、加水分解したサンプルおよび加水分解していないサンプルの両方で、コントロ
ールと比べて豊富に存在していた。これは、これらのアミノ酸が、遊離のアミノ
酸として（そしてペプチドとしてではなく）精製したサンプル中に存在したこと
を示す。
【０２１３】 Ｌ−プロリン（３×１０-4Ｍ）およびＬ−アラニン（３．９×１０-4Ｍ）を、
ＥＰＬ細胞誘導活性についてアッセイした。Ｌ−プロリンは、Ｒの存在下で、ｓ
ｆＭＥＤＩＩの低分子量成分を識別可能な様式で、ＥＳ細胞からＥＰＬ細胞への
変換をもたらした。これは、形態の変化、ならびに実施例１で報告したＦｇｆ５
およびＲｅｘ１発現を含んでいた（データ示さず）。Ｌ−アラニンは、Ｒの存在
下または非存在下でＥＳ細胞に対して効果がなかった。
【０２１４】 １０-4ＭのＬ−プロリンのＥＳ細胞へのＲの非存在下での添加は、ＥＰＬ細胞
に形態学的に類似のいくつかの細胞／コロニーを含有する異種集団を生じた。Ｒ
の添加は、完全かつ均一なＥＰＬ細胞形成のために必要であった。
【０２１５】 プロリンの最小に活性なモル濃度は、約４０μＭであることが見出された。生
物学的アッセイにおける至適濃度は、１００μＭであることが見出された。
【０２１６】 （ＥＳおよびＥＰＬ細胞に対するプロリンアナログおよびプロリン含有ペプチ
ドの効果） 他の細胞系においてプロリン様生物活性を有することが報告されたプロリンア
ナログおよびプロリン含有ペプチドを、ある範囲の濃度にわたって試験して、Ｒ
の存在下または非存在下でＥＰＬ細胞をＥＳ細胞から形成するその能力を評価し
た。結果を表７に示す。
【０２１７】 プロリンアナログであるＤ−プロリン、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロ
リン、ピロリジン、Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−プロリン、
およびＬ−ピペコリン酸（ＰＣＡ）は、Ｒの存在下または非存在下でＥＳ細胞成
長または分化に対して何ら観察可能な効果を有していなかった。サルコシン、Ｌ
−アゼチジン−２−カルボン酸（ＡＺＥＴ）および３，４デヒドロ−Ｌ−プロリ
ンは、ＥＳ細胞成長を、低濃度で阻害し、そしてより高い濃度で、Ｒの存在下ま
たは非存在下で、ＥＰＬ細胞形成を誘導することなくＥＳ細胞死を引き起こした
。これらのデータは、他のプロリン生物活性について記載されるものとは異なる
ＥＰＬ細胞形成におけるプロリン活性についての構造的必要条件を指摘する。
【０２１８】 プロリン含有ペプチドであるａｌａ−ｐｒｏ、ｇｌｙ−ｐｒｏ、ｐｒｏ−ＯＨ
−ｐｒｏ、ａｌａ−ｐｒｏ−ｇｌｙ、ｇｌｙ−ｐｒｏ−ａｌａ、ｇｌｙ−ｐｒｏ
−ａｒｇ−ｐｒｏ、ｖａｌ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｇｌｙ、ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｇｌｙ
−ｇｌｙ、物質Ｐ遊離酸（ａｒｇ−ｐｒｏ−ｌｙｓ−ｐｒｏ−ｇｌｎ−ｇｌｎ−
ｐｈｅ−ｐｈｅ−ｇｌｙ−ｌｅｕ−ｍｅｔ−ＯＨ）、物質Ｐフラグメント１〜４
（ａｒｇ−ｐｒｏ−ｌｙｓ−ｐｒｏ）およびＢｒａｄｙｋｉｎｉｎ（ａｒｇ−ｐ
ｒｏ−ｐｒｏ−ｇｌｙ−ｐｈｅ−ｓｅｒ−ｐｒｏ−ｐｈｅ−ａｒｇ；データ示さ
ず）は、Ｒと組み合わせて、ＥＳのＥＰＬ細胞への変換を、Ｌ−プロリンと類似
のモル濃度で引き起こすことができた（表７）。Ｒの存在下でのペプチドｐｒｏ
−ａｌａ、ｐｒｏ−ｇｌｙ、およびｇｌｙ−ｐｒｏ−ＯＨ−ｐｒｏもまた、ＥＳ
のＥＰＬ細胞への変換を引き起こし得たが、プロリンのモル濃度より約６倍高い
モル濃度でであった（表７）。特異的活性とこれらのペプチドにおけるプロリン
のモル量との間の相関のなさは、この因子の作用についての構造的必要条件につ
いてのさらなる証拠を提供し、レセプターと相互作用する可能性を指摘する。
【０２１９】 ＥＰＬ細胞がまた、ＥＳ細胞がＲ、およびコラーゲンＩＶのコラゲナーゼ消化
から生じる部分的に精製されたコラーゲンＩＶ加水分解産物の存在下で培養され
た場合に、形成された。遊離のＬ−プロリンは、部分的に精製されたコラーゲン
ＩＶ加水分解産物内でＴＬＣによって検出され得なかった。コラーゲンＩＶ加水
分解産物の生物活性は、おそらく、コラーゲンＩＶタンパク質中の繰り返しのＧ
ｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘモチーフの存在を反映し、そしてＥＣＭ成分の分解によるイン
ビボでのこの生物活性の可能な供給源を提供する。
【０２２０】 物質Ｐのカルボキシ末端（フラグメント５〜１１；ｇｌｎ−ｇｌｎ−ｐｈｅ−
ｐｈｅ−ｇｌｙ−ｌｅｕ−ｍｅｔ−ＯＨ；データ示さず）、インテグリン結合ペ
プチドＲＧＤ、ニューロキニンＡおよびＢレセプターアンタゴニスト（ニューロ
キニンＡおよびセンクチド（ｓｅｎｋｔｉｄｅ））、ならびにアミノ酸Ｌ−アラ
ニンおよびＬ−リジンは、Ｒの存在下または非存在下で、ＥＳ細胞に対して観察
可能な効果を有しておらず、そして上記の生物活性ペプチドと等しいかそれより
も大きい濃度で使用された。
【０２２１】 ５０μＭよりも大きい濃度で、タキキニン物質Ｐは、ＥＳ細胞のアポトーシス
を誘導した。物質Ｐ遊離酸および物質Ｐフラグメント１〜４と比較して、物質Ｐ
は、ＮＫ−１レセプターに対する著しく増大した親和性を有する。
【０２２２】 これらの結果は、Ｌ−プロリンおよびプロリン含有ペプチドが、ｓｆＭＥＤＩ
Ｉの低分子量成分に関連する生物活性を有することを示した。類似するが異なる
特異的活性を有する複数の因子の同定は、生物活性の構造的必要条件に向けられ
、これは、レセプター相互作用の関与を示唆し、そしてＥＰＬ細胞誘導活性の低
分子量成分を有するさらなるペプチドの予想を可能にする。
【０２２３】 （ＥＰＬ細胞誘導活性の高分子量成分の精製） （ＥＰＬ細胞誘導活性の高分子量成分の検出のための細胞アッセイ） ＥＰＬ細胞誘導活性の高分子量成分を、１ｍｌの培養培地に５００μｌのＥ（
１０％ＦＣＳとなるように作製されたもの）または４０μＭのＬ−プロリンを補
充したことの除き、以前に記載したようにアッセイした。
【０２２４】 他の様式で示さない限り、アッセイに含めるために以下のように画分を調製し
た。クロマトグラフィー精製工程からのＲの半精製した画分のタンパク質濃度を
ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイキット（ＢｉｏＲａｄ＃５００−０００１）を
使用して推定した。１００μｇのタンパク質を含有する各画分のアリコートを、
ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０ユニット（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮し、２ｍｌのＰＢＳ
で洗浄し、そして再び濃縮した。各画分を、タンパク質の０．１μｇ〜１０μｇ
の範囲の濃度で、ＥＰＬ細胞誘導活性の高分子量成分についてアッセイした。
【０２２５】 （高分子量成分の物理化学的特性） ＥＰＬ細胞誘導活性の低分子量成分の物理化学的特性を、Ａｍｉｃｏｎ Ｄｉ
ａｆｌｏ ＹＭ１０膜を限外濾過のために使用したことを除いて、上記のように
調製されたＲの処理およびアッセイから推定した。Ｒを、ＰＤ１０カラム（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）にかけ、低分子量の夾雑物を除去し、そして約５０〜１００μ
ｇ／ｍｌでアッセイにおいて使用した。＞５６℃での１時間のインキュベーショ
ン、またはプロテアーゼトリプシンでの消化によるＲの処置により、生物活性が
損失した。ＥＰＬ細胞誘導活性の高分子量成分はまた、ｐＨ５．５以下で不安定
であるか、または１００ｍＭ ＤＴＴのような還元剤での４時間、室温での処理
の後に不安定であった。これらのデータは、ＥＰＬ細胞誘導活性の高分子量成分
がタンパク質様であることを示した。
【０２２６】 （高分子量成分の生物活性は、培養されたＨｅｐ Ｇ２細胞の細胞外マトリッ
クス（ＥＣＭ）において検出され得る） ＥＳ細胞を、２ｍｌの組織培養ウェル中に低細胞密度２．５×１０2細胞／ｃ
ｍ2でＨｅｐ Ｇ２ ＥＣＭ上に播種し、そしてＤＭＥＭ＋ＬＩＦにおいてＬ−
プロリンありまたはなしで５日間培養した。培養物を、５日後アルカリホスファ
ターゼ活性について染色し、そしてその培養物をＥＰＬ細胞形成についての形態
学によってアッセイした。Ｈｅｐ Ｇ２細胞由来のマトリックスは、ＥＰＬ細胞
誘導活性の高分子量成分の供給源として作用し得、そしてＬ−プロリンと組み合
わせて使用された場合、効果的にＥＰＬ細胞の形成を誘導した（表８）。単独で
使用された場合、そのマトリックスは、ＥＳからＥＰＬ細胞への完全な変換を誘
導し得なかったが、しかし、多くのコロニーが平たいか、または広がった形態学
に適合した。
【０２２７】 （ｓｆＭＥＤＩＩからの高分子量成分の精製：プロトコル１） ４ｌのｓｆＭＥＤＩＩから上記のように調製されたＲを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
．Ｃｌ ｐＨ８．５中に作製し、そして３００ｍｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｑ陰
イオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通した。結合したタンパク質を、２
００ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ ｐＨ８．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２
００ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ ｐＨ８．５、４００ｍＭ ＮａＣｌ、お
よび２００ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ ｐＨ８．５、１Ｍ ＮａＣｌの段
階的勾配を介して溶出した（図１６Ａ）。２００ｍｌのサンプルを回収し、そし
て４０μＭ Ｌ−プロリンの存在下でそれらのＥＰＬ細胞を形成する能力につい
てアッセイした。活性は、４００ｍＭ ＮａＣｌにおいてカラムから溶出した。
【０２２８】 陰イオン交換クロマトグラフィーからの活性画分を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃ
ｌ ｐＨ８．５中、最終濃度０．５Ｍ 硫酸アンモニウムとなるように作製した
。そのサンプルを０．２２μｍのフィルターを介して濾過し、沈殿した物質を除
去し、その後４０ｍｌのフェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅ急速疎水性相互作用カラム
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通した。結合したタンパク質を１工程で５０ｍｌの２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ ｐＨ８．５でカラムから溶出し（図１６Ｂ）、そして
アッセイによってＥＰＬ細胞誘導活性の高分子量成分を含有することが示された
。
【０２２９】 疎水性相互作用クロマトグラフィーからの活性画分を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．
Ｃｌ ｐＨ８．５中、伝導率が１００ｍＭ ＮａＣｌ未満になるように希釈した
。そのサンプルを１０ｍｌのヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂカラム（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）に通した。結合したタンパク質を、１工程で１０ｍｌの０．
５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ ｐＨ８．５でカラムから溶出し（
図１６Ｃ）、そしてアッセイによってＥＰＬ細胞誘導活性の高分子量成分を含有
することが示された。
【０２３０】 ヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティークロマトグラフィーからの活性画
分を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に、ＳＭＡＲ
Ｔシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）において、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ ｐＨ
８．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中にて通した（図１６Ｄ）。５０μｌの画分を回
収し、そして直接アッセイした。ｓｆＭＥＤＩＩの高分子量成分に等価な生物活
性を含む画分が、単一のピークとして５００〜１０００ｋＤａの間に溶出した。
ＥＰＬ細胞形成は、ＥまたはＬ−プロリンの存在下でのみ観察された。
【０２３１】 還元ＳＤＳ ＰＡＧＥにより、生物活性の高分子量成分を含有するサンプル中
で、約２１０〜２６０ｋＤａの高度に精製されたタンパク質の存在が明らかにな
った（図１６Ｅ）。
【０２３２】 （ｓｆＭＥＤＩＩからの高分子量成分の精製：プロトコル２） １リットルのｓｆＭＥＤＩＩを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、ｐＨ８．５にお
いて平衡化した５０ｍｌのヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）にかけた。そのカラムを２００ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．
Ｃｌ、ｐＨ８．５、２００ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、ｐＨ８．５＋１５
０ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、ｐＨ８．５＋５０
０ｍＭ ＮａＣｌ、および２００ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、ｐＨ８．５
＋１Ｍ ＮａＣｌ（図１７Ａ）を用いて連続的に洗浄した。各洗浄のアリコート
をＥＳ細胞に対する生物活性についてアッセイした。ＥＰＬ細胞誘導活性の高分
子量成分は、５００ｍＭ ＮａＣｌ画分においてカラムから溶出した。
【０２３３】 ヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティークロマトグラフィーからの活性画
分を、１５０ｍＭ ＮａＣｌへと２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、ｐＨ８．５で希釈
し、そして２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、ｐＨ８．５＋１５０ｍＭ ＮａＣｌで予
め平衡化した１ｍｌのＲｅｓｏｕｒｃｅＱ陰イオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）にかけた。タンパク質を、６０分間にわたる１５０ｍＭから５００ｍＭ
ＮａＣｌ、続いて５分間にわたる１Ｍ ＮａＣｌ中１ｍｌ／分での洗浄の勾配で
カラムから溶出した（図１７Ｂ）。交互の１．５ｍｌ画分を、２００〜３００ｍ
Ｍ ＮａＣｌでこのカラムから溶出したＥＰＬ細胞誘導活性の高分子量成分につ
いてアッセイした。
【０２３４】 陰イオン交換クロマトグラフィーからの画分１０〜１７をプールし、そして２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、ｐＨ８．５＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ中にてＳｕｐｅｒ
ｏｓｅ６ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通した（図１７Ｃ）。５０μ
ｌの画分を収集し、そして５００〜１０００ｋＤａの間の単一のピークとして溶
出したＥＰＬ細胞誘導活性の高分子量成分の存在について直接アッセイした。
【０２３５】 活性画分を、還元ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析し、そしてプロトコル１にお
いて精製したタンパク質に等価な約２１０〜２６０ｋＤａの高度に精製されたタ
ンパク質を含有することが示された（図１７Ｄ）。
【０２３６】 （ｓｆＭＥＤＩＩ由来の高分子成分の精製：プロトコル３） ４リットルのｓｆＭＥＤＩＩを、ＰＢＳ中で予め平衡化した２５ｍｌのゼラチ
ンＳｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティークロマトグラフィーカラム（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）に、約５ｍｌ／分の流速で供した。このカラムをＰＢＳ中で再平衡化し
、そしてタンパク質を、ＰＢＳ中の５０ｍｌ容量の６Ｍ尿素で溶出した（図１８
Ａ）。この溶出物を、４℃にて４回、４リットルのＰＢＳに対して透析して、尿
素を取り除いた。この溶出物のタンパク質濃度を、ＢｉｏＲａｄタンパク質アッ
セイキットを用いて決定し、そして０．１〜１０μｇを、生物活性についてアッ
セイした。
【０２３７】 この溶出物を、還元ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析し、そしてプロトコル１お
よび２において精製されたタンパク質に相当する、高度に精製された約２１０〜
２６０ｋＤａのタンパク質を含むことを示した（図１８Ｂ）。精製されたタンパ
ク質の収量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析によって、約１ｍｇ／リットル ｓｆＭＥ
ＤＩＩであると決定した。
【０２３８】 （高分子量活性の特徴付けおよび同定） 精製プロトコル１〜３から得られた高度に精製された活性画分は、溶液中２μ
ｇ／ｍｌで使用される場合（図１９Ｃ）か、または組織培養プラスチック上に予
め被膜される場合（データは示さず）のいずれかに、Ｅ−プロリンまたはＬ−プ
ロリンの存在下でＥＰＬ細胞形成を誘導し得た。このことは、ＥＣＭの成分とし
てのこのタンパク質の以前の同定と一致した。ＥＰＬ細胞を誘導する活性は、Ｅ
−プロリンまたはＬ−プロリンの非存在下で検出され得なかった。
【０２３９】 細胞外マトリクスタンパク質であるヒトラミニン（Ｓｉｇｍａ）、ウシビトロ
ネクチン（Ｚ．Ｕｐｔｏｎ博士、ＣＲＣ ｆｏｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｇｒｏｗｔｈ
ａｎｄ Ｒｅｐａｉｒ，Ａｄｅｌａｉｄｅ）コラーゲンＩＶ（Ｓｉｇｍａ）、
ヒト血漿フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）およびヒト細胞性フィブロネクチン（
Ｊ−Ｐ Ｌｅｖｅｓｑｕｅ，ＩＭＶＳ，Ａｄｅｌａｉｄｅ）を、４０μＭプロリ
ンの存在下で、組織培養培地中のＥＳ細胞からのＥＰＬ細胞の形成を促進する能
力について試験し、そして活性画分に対して比較した（表８）。これらのうち、
１μｇ／ｍｌ以上の濃度の細胞性フィブロネクチンのみが、溶液中に添加された
場合にＥＳ細胞からＥＰＬ細胞の形成をもたらし得た（図１９Ａ、Ｂ）。細胞性
フィブロネクチンは２５０ｋＤａのジスルフィド結合化タンパク質のホモ二量体
であり、その活性は、還元ＳＤＳ ＰＡＧＥによって同定されるｓｆＭＥＤＩＩ
から高度に精製された生物活性因子のサイズおよび特徴と一致した。
【０２４０】 細胞性フィブロネクチンに特異的な抗体を用いて、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ゲル濾
過からの活性画分のウエスタンブロット分析（プロトコル２）により、２４０ｋ
Ｄａの精製されたタンパク質を、細胞性フィブロネクチンとして同定確認した（
図２０）。
【０２４１】 （複数のＥＣＭタンパク質を使用して、マトリクスとして細胞に提示される
場合に、ＥＰＬ細胞を誘導する活性の高分子量成分を提供し得る。） 上記の基底膜成分を、組織細胞培養プラスチック上に予め被膜された場合にＥ
ＰＬ細胞形成を促進する能力について試験した。ＥＰＬ細胞形態の形態学的誘導
は、Ｌ−プロリンの存在下において、細胞性および血漿フィブロネクチン、なら
びに基底膜成分であるラミニンに制限された（表８）。
【０２４２】 フィブロネクチンおよびラミニンは、細胞表面インテグリンレセプターを介し
て細胞に結合し、このリガンド結合の特異性は、αインテグリンとβインテグリ
ンとの間の種々のヘテロ二量体の組合せにより決定される。これらのデータは、
妥当なインテグリンレセプターを活性化するＥＣＭ成分の範囲が、細胞外マトリ
クスとしてＥＳ細胞に提示される場合にＥＰＬ細胞形成を誘導し得ることを示唆
する。しかし、細胞性フィブロネクチンのみが、可溶性形態において提示される
場合にＥＳ細胞からＥＰＬ細胞の形成を誘導することを示している。
【０２４３】 （概要） ｓｆＭＥＤＩＩのサイズ画分は、ＥＰＬ細胞形成において少なくとも２つの生
物学的に活性な因子（高分子量成分および低分子量成分）についての必要条件を
表した。ｓｆＭＥＤＩＩの低分子量成分を、４０μＭ以上の濃度において活性な
Ｌ−プロリンとして同定した。プロリンアナログおよび小ペプチドの分析は、プ
ロリンを含有する多数の小ペプチドが、ＥＰＬ細胞の形成においてＬ−プロリン
の代わりに置換され得ることを実証した。
【０２４４】 種々のプロトコルによるクロマトグラフィー的精製は、ｓｆＭＥＤＩＩの高分
子量成分を、細胞性フィブロネクチンとして同定した。Ｌ−プロリンの存在下で
、高分子量成分すなわち細胞性フィブロネクチンは、溶液中においておよびマト
リクスとしての両方で、ＥＰＬ細胞の形成をもたらし得た。マトリクスに関連す
るが可溶性形態でなく、かつＬ−プロリンと組み合わせたＥＳ細胞に提示される
場合、いくつかの細胞外マトリクス成分が、ＥＰＬ細胞の形成を誘導する能力は
、細胞性フィブロネクチンの生物学的活性が、細胞表面でインテグリンによって
媒介され、最もおそらくはα１：β５のヘテロ二量体であることを示唆した。
【０２４５】 まとめると、この実施例において提示されるデータは、可溶性形態またはマト
リクス関連形態において提示された場合、ＥＳ細胞からＥＰＬ細胞の形成を誘導
し得る因子を同定し、そして類似のレセプター／分子相互作用を介して作用する
、類似の生物活性を有する因子の予測について十分な情報を提供する。
【０２４６】 （実施例５） （ＥＰＬ細胞誘導性活性の生物学的に活性な成分は、異なる供給源および種
から単離され得る） （材料および方法） （初代細胞株（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）の調製） 初代肝臓細胞を、ＧｉｇｅｒおよびＭｙｅｒ（１９８１）によって記載された
手順をわずかに改変した手順に基づく手順を用いて調製した。マウスを屠殺し、
そして直ちに肝臓を露出ために解剖した。各肝臓を、門脈を通して、１０ｍｌの
ＰＢＳ、続いてＨａｎｋ緩衝化塩溶液（ＨＢＳＳ；２リットル中に、０．８ｇ
ＫＣｌ、０．１２ｇ ＫＨ2ＰＯ4、１６ｇ ＮａＣｌ、０．１ｇ Ｎａ2ＨＰＯ4 、２ｇ グルコース、４ｍｌ １％フェノールレッド、０．０３５ｇ ＮａＨＣ
Ｏ3）中の１０ｍｌ ０．０５％コラゲナーゼで灌流した。灌流した肝臓を取り
出し、１０ｍｌ／肝臓の０．０５％コラゲナーゼ／ＨＢＳＳで浸軟し、そして３
７℃にて３０分間インキュベートした。肝臓懸濁液を、肝臓の分離を補助するた
めにピペッティングによって、規則正しく撹拌した。細胞をＨＢＳＳ（１０ｍｌ
）で２回洗浄して、コラゲナーゼを除去し、そして夾雑する赤血球をＳａｓｓａ
溶液（１リットルあたり、６．９５ｇ ＮＨ4Ｃｌ、２．０５８ｇ Ｔｒｉｓ−
塩基、１ｇ ＫＨＣＯ3）中に溶解した。Ｗｉｌｌｉａｍｉｓ Ｅ培地（１ｍｌ
／リットル、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中で２回の洗浄後、この細胞を、ＤＭＥＭ中
でゼラチン処理した組織培養フラスコに播種し、そして３７℃、５％ＣＯ2にて
インキュベートした。
【０２４７】 初代鳥類肝細胞を、１７〜１８日齢のニワトリ胚から調製した。簡潔にいうと
、ニワトリ胚を卵から取り出し、断頭し、そして心臓および肝臓を露出するため
に解剖した。この肝臓を、心臓のカニューレ挿入を介して、２ｍＭ ＥＤＴＡを
含有する１０ｍｌの０．９％ ＮａＣｌで灌流して血球を取り除き、続いて、Ｈ
ＢＳＳ中、４ｍｌの０．０５％コラゲナーゼによって灌流した。全ての肝臓を灌
流し、そして収集した際、肝臓を取り出し、ＨＢＳＳ中にプールし、そして新鮮
な０．０５％コラゲナーゼ／ＨＢＳＳ中に移した。プールした肝臓を、細い先端
のはさみ（ｆｉｎｅ ｔｉｐｐｅｄ ｓｃｉｓｓｏｒ）で浸軟し、そして５分毎
に穏やかに撹拌しながら３０分間インキュベートし、そして１０分毎に１０ｍｌ
ピペットを用いて穏やかにピペッティングして、細胞の分離を補助した。コラゲ
ナーゼを、ＨＢＳＳ（２ｍｌ／肝臓）で洗浄することによって取り除いた。夾雑
する赤血球を、Ｓａｓｓａ溶液中で溶解した。Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｅ（２ｍｌ／
肝臓）で２回の洗浄後、細胞細片および溶解した赤血球からのヘモグロビンを取
り除き、この肝細胞を、Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｅ培地（１ｍｌ／肝臓）中に再懸濁
し、そして収量を測定した。代表的には、２×１０7細胞／肝臓を得て、そして
１７５ｃｍ2の組織培養フラスコにプレートアウト（ｐｌａｔｅｄ ｏｕｔ）し
、そして２０ｍｌのＤＭＥＭ中で、３７℃／５％ＣＯ2にて培養した。
【０２４８】 （馴化培地の調製） 初代マウス肝細胞および初代ニワトリ肝細胞を、馴化培地の収集の前に、ＤＭ
ＥＭ０中に４日間培養した。
【０２４９】 マウス肝細胞性癌細胞株Ｈｅｐａ−１ｃ１ｃ ７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ２０２
６）およびＨｅｐ ３Ｂ（ＡＴＣＣ ＨＢ−８０６４）、ならびにＰ１９胚性期
癌由来細胞株ＥＮＤ２（内臓内胚葉様、Ｍｕｍｍｅｒｙら、１９８５）およびＰ
ＹＳ２（壁内胚葉様、Ｌｅｈｍａｎら、１９７４）を、ＤＭＥＭ中で維持した。
細胞株を３７℃、５％ＣＯ2にて非ゼラチン化組織培養フラスコ中に４日間培養
した後に、馴化培地を、収集した。
【０２５０】 馴化培地を、実施例１においてＭＥＤＩＩについて記載されるように処理した
。馴化培地を、実施例１および４に記載されるような生物学的活性についてアッ
セイした。
【０２５１】 （生物活性成分の視覚化） ＥＮＤ−２培地の活性画分中のプロリンの存在を、実施例４に記載されるよう
な薄層クロマトグラフィーによって検出した。細胞性フィブロネクチンを、実施
例４に記載されるような還元ＳＤＳ ＰＡＧＥによって検出した。
【０２５２】 （結果） 初代哺乳類肝細胞および初代鳥類肝細胞からの馴化培地、肝臓由来細胞株（Ｈ
ｅｐａ−１ｃ１ｃ ７およびＨｅｐ ３Ｂ）ならびに胚性内胚葉様細胞株（ＥＮ
Ｄ−２およびＰＹＳ−２）を、ＥＳ細胞からＥＰＬ細胞を形成する能力について
アッセイした。
【０２５３】 マウスおよびニワトリの両方の始原肝細胞からの馴化培地は、培養中に、ＥＳ
細胞のＥＰＬ細胞への移行をもたらし得た（図２１Ａ）。これは、播種された初
代肝細胞から採取された真の培地のみであった。継代は、線維芽細胞出現の細胞
によって過増殖された肝細胞の損失およびＥＰＬ細胞を誘導する生物学的活性の
損失を生じた。生物学的活性における差異は、初代胚性（ニワトリ）肝細胞およ
び成体（マウス）肝細胞ならびにＭＥＤＩＩからの馴化培地において検出されな
かった。
【０２５４】 培養した細胞株であるＨｅｐａ−１ｃ１ｃ ７、Ｈｅｐ ３Ｂ、ＥＮＤ−２お
よびＰＹＳ−２によって馴化された培地は、培養中にＥＳ細胞からＥＰＬ細胞の
形成を誘導しなかった。しかし、これらの細胞株のいくつかは、生物学的活性の
１つの成分を発現することを示し得た。Ｈｅｐａ−１ｃ１ｃ ７細胞からの馴化
培地は、Ｌ−プロリンと組み合わせて使用される場合、ＥＳのＥＰＬ細胞への移
行をもたらした（図２１Ｂ）。このことは、これらの細胞がＥＰＬ細胞誘導活性
の高分子量成分を発現することを示唆する。このことは、Ｈｅｐａ−１ｃ１ｃ
７馴化培地の還元ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析によって確認され、これは、細胞性フィ
ブロネクチンに対して等価な可動性を有するタンパク質の存在を示した（図２１
Ｃ）。Ｈｅｐ ３Ｂからの馴化培地は、ＭＥＤＩＩから精製された生物学的活性
成分単独でか、またはこの生物学的活性成分と組み合わせて、ＥＳのＥＰＬ細胞
への移行をもたらし得なかった。これらの細胞、およびいくつかの他の肝臓由来
細胞株は、検出可能なレベルの細胞性フィブロネクチンを発現しなかった（図２
１Ｃ）。このことは、ＥＰＬ細胞誘導活性の高分子量成分の発現は、肝臓由来細
胞株の間で偏在していないことを示した。
【０２５５】 ＥＮＤ−２細胞からの馴化培地は、細胞性フィブロネクチンと組み合わせて使
用した場合に、ＥＳ細胞からＥＰＬ細胞の形成を誘導した（図２１Ｂ）。このこ
とは、これらの細胞が、Ｌ−プロリンまたは機能的アナログを分泌するが細胞性
フィブロネクチンを分泌しないことを示唆した（図２１Ｃ）。順相クロマトグラ
フィーによるこの馴化培地の半精製（ｓｅｍｉｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（実
施例４）および薄層クロマトグラフィーによる分析は、ＥＮＤ−２馴化培地にお
けるＬ−プロリンの存在を実証した（データは示さず）。
【０２５６】 （概要） ＭＥＤＩＩにおいて見出される活性に等価であり、そしてＥＳ細胞のＥＰＬ細
胞への形質転換を誘導し得る生物学的活性は、異なる種（哺乳動物およびトリを
含む）の細胞からの馴化培地において、ならびに胚および成体の両方からの組織
において、同定されている。このことは、この活性が進化の間、これらの種をこ
えて保存されていることを実証し、そして胚発生におけるこの活性の基本的な重
要性を示す。さらに、ＥＰＬ細胞誘導活性の個々の成分は、異なる系統由来の細
胞によって発現される。
【０２５７】 （実施例６） （インビトロでのＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞の代替的分化） （材料および方法） （細胞培養およびインビトロ分化アッセイ） 全ての細胞および組織培養技術は、他に言及されない限り、実施例１に記載さ
れるとおりであった。分化アッセイのために使用される全てのＥＰＬ細胞を、Ｍ
ＥＤＩＩの存在下で２日間培養したＥＳ細胞から形成した。さらなるＬＩＦの存
在または非存在を、各実施例について特定した。
【０２５８】 ＫＳＦ４ ＥＳ細胞株（これは、核局在化されるＬａｃＺを構成的に発現する
（Ｂｅｒｇｅｒら、１９９５；Ｐａｔｒｉｃｋ Ｔａｍ、ＣＭＩＲ、Ｎｅｗ Ｓ
ｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａから入手される））を、前述のよう
に４０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、０．１ｍＭ
β−メルカプトエタノール、１ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１０００単位のＬ
ＩＦを補充したＤＭＥＭ（高グルコース）中で、不活化した始原マウス胎仔線維
芽細胞フィーダー層（Ａｂｂｏｎｄａｎｚｏら、１９９３）上で維持した。ＥＰ
Ｌ細胞の形成前に、ＫＳＦ４細胞を、フィーダー層の非存在下で、２つの継代に
ついて、ゼラチン処理した組織培養プラスチック上で培養した。
【０２５９】 本明細書中で詳述される実験の大部分について、胚様体（ＥＢ）を、部分的な
トリプリン処理（ｔｒｙｐｓｉｎｉｓａｔｉｏｎ）方法（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、
１９８７）を用いて、ＭＥＤＩＩまたはＬＩＦ（ＤＭＥＭ）を添加することなく
、培地中に形成した。あるいは、ＥＢを、ＥＳ ＤＭＥＭ中の細菌学的ディッシ
ュにおいて１×１０5細胞／ｍｌでプレート化した、またはペトリディッシュ蓋
の内表面上において１．６×１０4で培地（５０ｍｌ）の懸滴中に懸濁した、単
一細胞懸濁液から形成した。懸濁滴（ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｄｒｏｐ）において
形成された細胞凝集体を、４８時間後に、さらなる培養のために細菌学的ディッ
シュに移した。ＥＢを、培地の定期的な補充で維持した。混合した細胞ＥＢを、
以前に記載されるように、２つの細胞集団が特定の比で混合された単一懸濁液か
ら形成した。
【０２６０】 本明細書中に提示されるものと一致する結果を、種々のＥＳ細胞株（Ｄ３（Ｄ
ｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８５）、ＭＢＬ５（Ｐｅａｓｅら、１９９０）、Ｋ
ＳＦ−４（Ｂｅｒｇｅｒら、１９９５）およびＥ１４（Ｈｏｏｐｅｒら、１９８
７））由来のＥＰＬ細胞を用いて、ならびにＥＢ形成の代替方法（単一細胞懸濁
、懸滴および部分的トリプシン処理を含む）を用いて得た。さらに、ＥＰＬ細胞
について報告される潜在的な分化は、これが、等しい時間の間にＬＩＦの非存在
下での培養により自然に分化されているＥＳ細胞によって反復発生され得ない場
合、これらの細胞と特異的に関連した（データは示さず）。
【０２６１】 多能性細胞の凝集体のレチノイン酸（ＲＡ）分化を、１μＭ ＲＡを補充した
ＤＭＥＭ中で、１×１０5細胞／ｍｌの密度で細菌学的ディッシュにＥＳ細胞ま
たはＥＰＬ細胞をプレート化することによって実施した。４８時間後、凝集体を
ＤＭＥＭへ移し、そして２日間維持し、次いで、２ｍｌの組織培養ウェルへ個々
に播種した。ニューロンの存在を、播種２日後の顕微鏡検査によって評価した。
ニューロンの同定を、神経フィラメント２００抗体Ｎ−４１４２（Ｓｉｇｍａ）
で陽性染色することによって確認した。
【０２６２】 （サイトカイン／成長因子アッセイ） サイトカイン／成長因子の効果についてのアッセイを、４ウェルマルチディッ
シュ（Ｎｕｎｃ）に低密度（７５細胞／ｃｍ2）で播種したＥＳ細胞およびＥＰ
Ｌ細胞に対して、それぞれ０．８ｍｌのＤＭＥＭ＋ＬＩＦまたは０．８ｍｌのＤ
ＭＥＭ＋５０％ ＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦ中で実施した。サイトカイン／成長因子を
規定の濃度で添加し、そしてこのアッセイを、実施例１に記載されるように、培
養物の５日後のアルカリホスファターゼ活性について染色した。
【０２６３】 （遺伝子発現分析） ＲＮＡを、Ｅｄｗａｒｄｓら（１９８５）の方法を用いてＥＳ細胞およびＥＰ
Ｌ細胞から単離した。ＲＮＡを、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（
１９８７）の方法によってＥＢおよびＲＡ処置した凝集体から単離した。
【０２６４】 ノーザンブロット分析およびホールマウントインサイチュハイブリダイゼーシ
ョンを、実施例１に記載されるように実施した。リボプローブを、Ｋｒｅｉｇお
よびＭｅｌｔｏｎ（１９８７）によって記載されるように合成した。
【０２６５】 ノーザンブロット分析および／またはインサイチュハイブリダイゼーションの
ために用いられるプローブフラグメントを、以下を添加して、実施例１に詳述さ
れるように行った：ＡＦＰ（ＨｉｎｄＩＩＩを伴うｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｋ
Ｓ ＩＩ＋（Ｒ．Ｋｒｕｍｌａｕｆ博士、ＮＩＭＲ、Ｌｏｎｄｏｎから入手した
）中の、マウスＡＦＰ ｃＤＮＡの最初の３５０ｂｐをコードする４００ｂｐの
ＥｃｏＲＩフラグメントを含むプラスミドの直線化、続いてＴ３ポリメラーゼを
用いる転写）；ＳＰＡＲＣ（１３Ｇ４３（Ｍａｓｏｎら、１９８６）由来の５７
０ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメント）；Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ（ＨｉｎｄＩＩＩを伴
う９０９ｂｐ ｇｏｏｓｅｃｏｉｄゲノムＤＮＡ（Ｂｌｕｍら、１９９２）を含
むプラスミドの直線化およびＴ３ポリメラーゼを用いる転写）；Ｎｋｘ２．５（
ＨｉｎｄＩＩＩを伴う１．６ｋｂ Ｎｋｘ２．５ ｃＤＮＡ（Ｌｉｎｔｓら、１
９９３）を含むプラスミドの直線化およびＴ３ポリメラーゼを用いる転写）。
【０２６６】 （組織学的分析） ＥＢを、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で、４℃で一晩固
定し、そして実施例１に記載されるように処理および切片化した。切片を、１０
秒間、トルイジンブルーで染色し、Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒ（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）中で清掃し、そしてキシレンベースのマウント媒体を
用いてカバーガラスで覆った。インサイチュハイブリダイゼーションに供するＥ
Ｂを、４％ＰＦＡで一晩固定化し、ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で数回
洗浄し、１００％メタノールで５分間処理し、次いで、イソプロパノールで１０
分間処理した。次いで、塊を実施例１に記載されるように包埋および切片化した
。
【０２６７】 β−ガラクトシダーゼ活性を検出するために、ＥＢを、ＰＢＳ中の０．２％グ
ルタルアルデヒド中で、氷上で１５分間固定化し、界面活性剤リンス（０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．３）、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％ デオキシコー
ル酸ナトリウム、０．０２％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４５０）を用いて３×１５
分間洗浄し、そして５ｍＭ フェリシアン化カリウム、５ｍＭ フェロシアン化
カリウムおよび１ｍｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含む界面活性剤リンスを用いて３７
℃で２時間染色した。次いで、ＥＢを、界面活性剤リンスを用いて３回（３×）
洗浄し、そして７０％ エタノールに移した。切片化のために、ＥＢを、実施例
１に記載されるように、１００％ エタノールに対して脱水し、そして処理した
。
【０２６８】 （免疫学的検出） 切片化したＥＢにおけるＡＦＰ発現を、以下の改変を伴って、Ｄｚｉａｄｅｋ
およびＡｄａｍｓｏｎ（１９７８）によって記載されるように本質的に実施した
。抗体のインキュベーションの前に、内因性ペルオキシダーゼ活性を、メタノー
ル中の３％ Ｈ2Ｏ2中で３０分間、切片のインキュベーションによってブロック
した。切片をウサギ抗−ＡＦＰ（ＩＣＮ）の１／２００希釈液で、２時間インキ
ュベートし、ＰＢＳで数回洗浄し、次いで、ＨＲＰ結合体化抗ウサギＩｇＧ（Ｓ
ｉｌｅｎｕｓ）の１／２００希釈液でインキュベートした。
【０２６９】 （ＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞からの拍動筋の形成） 拍動筋の形成を、ＤＭＥＭ中の予め平衡化したアガロースプラグ（２ｍｌの組
織培養ウェル中で、ＤＭＥＭに対して３７℃、１０％ＣＯ2で、３時間平衡化さ
せたＤＭＥＭ培地ベースの１％アガロース）上にプレートした、ＥＳ細胞または
ＥＰＬ細胞のいずれかから形成させた、個々のＥＢにおいて評価した。拍動筋の
存在または非存在を、４、６、８、１０および１２日目に顕微鏡試験により評価
した。あるいは、拍動筋の形成を、発生６日目に２ｍｌウェル内へ播種した個々
のＥＢにおいて評価し、そして７、８、１０、１２、１４および１６日目に顕微
鏡によりスコアした。播種した凝集体もまた、８、１０および１２日目に最終分
化したニューロンの存在についてスコアした。
【０２７０】 （結果） 胚様体（懸濁液中の多能性細胞の凝集により形成された）は、初期の胚発生と
同様の分化経路（実施例１）をたどり、そして胚細胞型および胚外細胞型の両方
への多能性細胞の分化の、広範な評価の機会を提供する。用語ＥＢは、本明細書
中でＤＭＥＭ中で培養された多能性細胞凝集体を記載するために使用する。
【０２７１】 （ＥＰＬおよびＥＳ胚様体形成の予備的特徴付け） ＥＢが、ＥＳ細胞またはＥＰＬ細胞のいずれかから形成された場合、はっきり
した形態学的差異が明らかになった。ＥＳ細胞のＥＢは、丸い、比較的平滑で、
そして規則的な凝集体の均質な集団を含んだ（図２２Ａ）。ＥＰＬ細胞から形成
されたＥＢもまた、均質な集団を形成したが、その凝集体は不規則で、そして組
織化されていないようであった（図２２Ｂ）。切片化および染色により、ＥＳ細
胞のＥＢが、緻密な丸い形態により特徴付けられる、比較的均一な細胞集団を含
むのに対して（図２２Ｃ）、未分化の多能性細胞を連想させる、ＥＰＬのＥＢに
おける内部の細胞は、緩やかに密集され、そして異質であることが示され、これ
はおそらく分化を反映する（図２２Ｄ）。この観察は、ＥＳ細胞およびＥＰＬ細
胞の分化の詳細な比較研究を促した。
【０２７２】 （多能性細胞のＥＰＬ細胞胚様体において促進された分化） ＩＣＭから原始外胚葉、胚葉形成への進行は、インビボおよびインビトロでの
胚様体分化の間の両方での遺伝子発現の変化によりモニターし得る。Ｒｅｘ１は
、ＩＣＭおよびＥＳ細胞により発現され、そしてＥＰＬ細胞、６．０ｄ．ｐ．ｃ
．の時点の原始外胚葉およびインビトロでのＥＳ細胞分化の間の原始外胚葉にお
いては下方調節される。Ｆｇｆ５は、ＩＣＭまたはＥＳ細胞のいずれによっても
発現されないが、ＥＰＬ細胞ならびに原腸形成の前および原腸形成の間の原始外
胚葉において発現され、そしてインビトロでのＥＳ細胞分化の間、一過性的に上
方調節される。Ｏｃｔ４は、胚、ＥＰＬ細胞およびＥＳ細胞の全ての多能性細胞
集団により発現され、そしてインビボおよびインビトロにおけるこれらの細胞の
分化では下方調節される。
【０２７３】 Ｒｅｘ１の発現は、ＥＳ細胞胚様体およびＥＰＬ細胞胚様体の両方において下
方調節されることが見出されたが、Ｒｅｘ１調節の動態は、この２つの細胞集団
の間で異なった。わずかに検出可能な基底レベルへの下方制御が、１日目のＥＰ
Ｌ細胞胚様体において観察された（図２３）。対照的に、同様のレベルのＲｅｘ
１発現は、ＥＳ細胞胚様体において２日目まで観察されず、１日目では中間レベ
ルの発現が観察された。同様に、Ｆｇｆ５調節の動態は、ＥＳ細胞またはＥＰＬ
細胞から誘導された胚様体の間で異なった。ＥＰＬ細胞においてすでに発現され
たＦｇｆ５は、ＥＰＬ細胞胚様体において、１日目から急速に上方調節され、２
／３日目にピークに達し、その後４日目に発現は顕著に低下した。ＥＳ細胞胚様
体におけるＦｇｆ５発現の上方調節は、３日目までに観察されなかった。これら
の胚様体の発現レベルは、４日目にさらに増加したが、それらのレベルは、ＥＰ
Ｌ細胞胚様体における２日目および３日目のＦｇｆ５レベルより依然低いままで
あった。Ｏｃｔ４発現は、ＥＳ細胞胚様体およびＥＰＬ細胞胚様体の両方におい
て経時的に減少したが、ＥＰＬ細胞胚様体においてより急速に下方調節され、３
日目および４日目の間で４倍の減少が見出された（図２３）。このＯｃｔ４発現
の減少に続き、Ｆｇｆ５発現が最も高いレベルになった。このことはおそらく、
それらの胚様体内での多能性細胞の分化を反映する。
【０２７４】 ＥＳおよびＥＰＬの両方の胚様体の発生において観察されたＲｅｘ１、Ｆｇｆ
５およびＯｃｔ４発現の変化は、分化が、正常な胚発生の事象を反映し、そして
後期原始外胚葉の形成を通して進行することを示唆した。さらに、Ｏｃｔ４およ
びＦｇｆ５発現の減少により検出されたような、Ｆｇｆ５発現の急速な増加およ
び分化のより早期の開始は、ＥＰＬ細胞胚様体内での多能性細胞の分化は、ＥＳ
細胞胚様体に比べて促進されることを示した。これらの特性は、本発明者らの以
前の、ＥＳおよびＥＰＬ細胞の６．０ｄ．ｐ．ｃ．より前に生じる多能性細胞集
団とのアライメントに一致する。
【０２７５】 （ＥＰＬ細胞胚様体の環境は、内臓内胚葉の形成に非許容的である） ４．５ｄ．ｐ．ｃ．までに、胞胚腔の腔に曝された多能性細胞は、分化して原
始内胚葉を形成した。原始内胚葉は、２つの異なる内胚葉細胞集団である、内臓
内胚葉（これは、原外胚葉と接触した状態にある）および体壁内胚葉（これは、
多能性細胞から移動して栄養外胚葉に隣接する内胚葉の層を形成する）を生じる
。他のものは、胚様体発生の比較的後期（９〜１２日目）での胚外性内胚葉形成
を分析したが、内臓内胚葉細胞および体壁内胚葉細胞の両方を含む、内胚葉の外
層の形成は、発生４日目または５日目までに胚様体において観察され得る。この
タイミングは、原始外胚葉の形成および内腔の生成（すなわち、胚において内胚
葉の特定化を生じる事象）と一致する。従って、この段階での内胚葉形成の分析
は、正常な胚の事象を反映するようである。
【０２７６】 ＥＰＬおよびＥＳ胚様体の発生の間の体壁内胚葉および内臓内胚葉の形成を、
それぞれＳＰＡＲＣおよびＡＦＰ発現により分析した。ＳＰＡＲＣ発現は、ＥＳ
およびＥＰＬ細胞胚様体において同様の動態を示し、最初の４日間にわたって約
２倍増加した（図２４Ａ）。ＥＳおよびＥＰＬ細胞胚様体のホールマウント（ｗ
ｈｏｌｅｍｏｕｎｔ）インサイチュハイブリダイゼーションおよび切片化は、Ｓ
ＰＡＲＣ発現が４日目にＥＳおよびＥＰＬ細胞の両方の胚様体の内胚葉細胞の外
層に制限されることを示し（図２４Ｂ、Ｃ）、これは体壁内胚葉の形成を示す。
ＡＦＰのレベルは、非常に低いため、これらの段階の間ではノーザンまたはＲＮ
ａｓｅ保護によって検出されず、そのため胚様体のホールマウントインサイチュ
ハイブリダイゼーションを使用して、ＡＦＰ発現を検出した。３日目までに、１
％のＥＳ細胞胚様体が、それらの表面上にＡＦＰ発現の分散したパッチを示した
。このレベルは、４日目までにＥＳ細胞胚様体の５２．９＋／−９．５％まで上
昇した（図２４Ｄ）。切片化により、ＡＦＰ発現は、外部細胞に制限され、従っ
てそれが内臓内胚葉を示すことが確認された（図２４Ｆ）。ＡＦＰ発現は、胚様
体発生の３日目または４日目にＥＰＬ細胞胚様体の表面または内部細胞上で検出
され得なかった（図２４Ｅ）。
【０２７７】 細胞混合実験を実行して、ＥＰＬ細胞が内臓内胚葉を形成しないことが、これ
らの細胞の発生能力の先天的な制限またはその胚様体環境における変化を反映し
たか否かを決定した。ＫＳＦ−４ ＥＳ細胞株は、その核にβ−ガラクトシダー
ゼタンパク質を標的化するよう改変されたＬａｃＺ遺伝子を構成的に発現する。
ＫＳＦ−４ ＥＳ細胞から形成された胚様体の分析により、Ｄ３ ＥＳ細胞に匹
敵するレベルの内臓内胚葉の形成を実証した（データは示さず）。マウス胚性線
維芽細胞フィーダー細胞の非存在下で継代した後に、ＫＳＦ−４ ＥＳ細胞を、
ＭＥＤＩＩ中で２日間培養し、ＫＳＦ−４ ＥＰＬ細胞（ＥＰＬ（ＬＺ＋））を
形成した。１：１の比のＤ３ ＥＳ細胞およびＥＰＬ（ＬＺ＋）細胞の同時凝集
により生成された胚様体を、４日目に内臓内胚葉の形成についてＡＦＰ発現によ
り評価した。ＥＳ細胞胚様体およびＥＰＬ（ＬＺ＋）細胞胚様体は、それらの先
に記載されたレベル（それぞれ、胚様体の６５％および０％）と一致するレベル
で内蔵内胚葉を生じた。混合した細胞集団から形成された胚様体は、ＥＳ胚様体
に匹敵するレベル（５１％）で内臓内胚葉を生じた。β−ガラクトシダーゼ活性
およびＡＦＰ発現についての二重染色により、その内臓内胚葉内にＬａｃＺ＋細
胞およびＬａｃＺ−細胞の両方が存在することが明らかになった（図２５）。こ
のことは、ＥＰＬ胚様体が内臓内胚葉を生じることが不可能なことは、ＥＰＬ細
胞の先天的な発生制限よりむしろ、その胚様体環境の欠損から生じることを示唆
し、そしてこれは内臓内胚葉形成のための誘導性シグナルの存在を示す。
【０２７８】 （内臓内胚葉の非存在下での多能性細胞の分化） ＥＰＬ細胞からのＥＢの形成は、内臓内胚葉の非存在下での多能性細胞の分化
のための方法論を提供する。内臓内胚葉は、インビボでの多能性細胞の分化に影
響を与えるシグナルを発現することが公知である。この細胞型の非存在下での分
化は、因子および環境変化を加えることによって多能性細胞の分化を特異的に制
御するための機会を提供する。このことは、多能性細胞の分化が、外部ＥＳ細胞
から自発的に分化する内臓内胚葉からのシグナルにより、少なくとも部分的に制
御される、ＥＳ細胞のＥＢにおいては達成され得ない。
【０２７９】 （促進および増強されたＥＰＬ細胞のＥＢにおける中胚葉の形成） ＥＳおよびＥＰＬ細胞のＥＢ内での初期中胚葉の形成を、初期中胚葉のマーカ
ーである、ｂｒａｃｈｙｕｒｙおよびｇｏｏｓｅｃｏｉｄの発現を分析すること
によりモニターした。以前の報告と一致して、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ発現は、ＥＳ
細胞のＥＢにおいて、発生の０〜３日目ではほとんど検出されないが、４日目に
上方制御された（図２６）。Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ発現は、この実験の過程の間で
、ＥＳ細胞のＥＢにおいて検出され得なかった。対照的に、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ
およびｇｏｏｓｅｃｏｉｄの発現は、ＥＰＬ細胞のＥＢ発生の２日目および３日
目に、それぞれ３０倍および６倍上方制御され、その後４日目に発現が、９倍（
ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）および６．５倍（ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ）減少した（図２６
）。ＥＳ細胞胚様体およびＥＰＬ細胞胚様体の両方において、中胚葉マーカーの
発現は、原始外胚葉マーカーであるＦｇｆ５およびＯｃｔ４の発現レベルの減少
の直前に生じる（図２３）。ＥＳ細胞胚様体におけるＢｒａｃｈｙｕｒｙ発現は
、さらに延長した培養後でさえ、３／４日目のＥＰＬ細胞体で見出されるレベル
に到達しなかった。
【０２８０】 ホールマウントインサイチュハイブリダイゼーションを使用して、胚様体集団
内でのｂｒａｃｈｙｕｒｙ発現の程度を決定した。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ発現を、
３日目で１％のＥＳ細胞ＥＢおよび４日目にその細胞体の１６％において検出さ
れた（図２６Ｂ、Ｄ）。対照的に、３日目および４日目にそれぞれ、９８％およ
び９２％のＥＰＬ細胞ＥＢが、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ発現を示した（図２６Ｃ、Ｅ
）。同様の発現パターンが、ｇｏｏｓｅｃｏｉｄで観察された（データは示さず
）。ＥＳおよびＥＰＬ細胞胚様体内のＯｃｔ４発現は、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ発現
の開始および程度との予期された逆の相関関係を示した。Ｏｃｔ４発現は、３日
目および４日目にコントロールＥＢ全体で比較的均一であったが（図２６Ｆ、Ｈ
）、中胚葉の分化が開始したＥＰＬ細胞のＥＢ内では分散していた（図２６Ｇ、
Ｉ）。発生期中胚葉に特異的なマーカーの比較は、ＥＰＬ細胞胚様体が、ＥＳ細
胞胚様体と比較して、より早期の出現およびより広範な中胚様の形成を生じる促
進された分化のプログラム受けていることを示唆した。
【０２８１】 発生期中胚葉の最終分化を、拍動心筋細胞の出現によりモニターした（図２７
Ａ）。この最終分化は、発生の８日目にＥＳ細胞のＥＢにおいて最初に検出され
（８％）、そして経時的に増加して１２日目にその細胞体の３６％に達した。Ｅ
ＰＬ細胞のＥＢにおいて、拍動筋は、６日目（ＥＳ細胞のＥＢにおけるその出現
の２日前）までに１４％の胚様体において観察され、そして胚様体発生の１０日
目および１２日目までに６０％に安定的に増加した。拍動筋を含むＥＰＬ細胞の
ＥＢの割合は、全ての時点でＥＳ細胞のＥＢより高かった。このプロフィールに
一致して、Ｎｋｘ２．５の発現は、ＥＳ細胞のＥＢに比べて（８日目）、ＥＰＬ
細胞のＥＢにおいて、より早期に（６日目までに）誘導された（図２７Ｂ）。さ
らに、Ｎｋｘ２．５の発現レベルは、ＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞のＥＢの両方に
おいて、１２日目まで増加し、この期間全体を通しては、ＥＳ細胞ＥＢにおける
レベルは、ＥＰＬ細胞のＥＢにおいて観察されたレベルより約３倍低かった。Ｅ
ＰＬ細胞が心筋を形成する増強された能力は、胚様体として分化された場合、お
そらく促進かつ増加された発生期中胚葉の形成に影響する。
【０２８２】 従って、ＥＰＬ細胞のＥＢとしての形成および分化は、多能性細胞の中胚葉系
統への分化の効率的なプログラミングの方法論を提供する。中胚葉前駆体は、Ｅ
Ｓ細胞のＥＢにおいてより、早期にそしてさらに高いレベルで形成される。
【０２８３】 （ＥＰＬ細胞胚様体は、ニューロン形成の能力の減少を示す） ＥＰＬ細胞の外胚葉由来系統への分化を、個々の胚様体内でのニューロンの存
在により評価し（図２８Ａ）、そしてＥＳ細胞のＥＢと比較した。ニューロンは
、１０日目より前ではいずれの胚様体集団においても検出されなかった。１０日
目に、２６％のＥＳ細胞のＥＢは、明らかな神経網を保持した。この神経網は１
２日目までに４１％に上昇した。ＥＰＬ細胞から誘導された胚様体はニューロン
を形成しなかった。
【０２８４】 ＥＳ細胞およびＰ１９胚性癌腫（ＥＣ）細胞は、レチノイン酸（ＲＡ）の存在
下で凝集体として分化した場合、ニューロンを形成する。ＥＰＬ細胞のＥＢがニ
ューロンを生じないことがニューロン分化の能力の先天的制限から生じるか否か
を試験するために、ＲＡの存在下での凝集後のＥＰＬ細胞のニューロンへ分化す
る能力を評価した。個々のＲＡ処理したＥＳおよびＥＰＬ細胞の凝集物を、ニュ
ーロンの存在についてスコアし（図２８Ｂ）、そしてそれぞれ、６３％および６
８％の同様のニューロン形成の頻度を示すことが見出された。このことは、ＥＰ
Ｌ細胞のＥＢ内でのニューロンの非存在が、ＥＰＬ細胞のニューロンを形成する
能力における先天的制限に影響しないが、ニューロンの特定化の減少を生じた、
変化した胚様体環境に影響することを示した。
【０２８５】 要するに、ＥＰＬ細胞ＥＢは、発生期中胚葉および中胚葉誘導体を高い効率で
形成したが、ニューロン形成能力を保持するにもかかわらず、ニューロンを形成
しなかった。ＥＰＬ細胞のＥＢにおける分化は、これらの条件下で培養された多
能性細胞から中胚葉胚葉の指向された形成に影響し得る。このことは、ＥＰＬ細
胞のＥＢの、外胚葉性系統の特定化において役割を果たすことが実証された内臓
内胚葉の外層を、形成しない事実に起因し得る。
【０２８６】 （サイトカイン／成長因子に応答するＥＰＬ細胞の分化） （ＦＧＦ成長因子ファミリーのメンバーに応答するＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞
の分化） ＥＳおよびＥＰＬ細胞を、それぞれＤＭＥＭ＋ＬＩＦまたはＤＭＥＭ＋５０％
ＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦに、７５細胞／ｃｍ2の密度で播種した。細胞を、漸増濃度
（０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ）の組換えウシ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧ
Ｆ：Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の存在下で、５日間培養した。
ＬＩＦの存在下でのＥＳ細胞へのｂＦＧＦの添加は、ＥＳ細胞の形態、分化また
は増殖に効果を及ぼさなかった。対照的に、１０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度のｂＦＧ
Ｆの添加は、ＥＰＬ細胞のある特徴的な細胞型（細胞型Ａ；図１７Ａ）への分化
を誘導し、この細胞型はアルカリフォスファターゼに対して染色されなかった。
同様の結果は、ヒト組換え酸性ＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；１０ｎｇ／ｍ
ｌ）、ヒト組換えｋＦＧＦ／ＦＧＦ４（Ｓｉｇｍａ）を含むＦＧＦファミリーの
他のメンバーで得られた。ヒト組換えＦＧＦ５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、
５００ｎｇ／ｍｌまでの濃度ではＥＳ細胞またはＥＰＬ細胞の分化を誘導しなか
った。
【０２８７】 １０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦで誘導した代表的な分化培養物内の個々のコロニー
を、ＥＳ細胞、ＥＰＬ細胞、分化細胞、または混合ＥＰＬ／分化細胞として、形
態およびアルカリフォスファターゼ染色に基づいて分類した（図２９Ｂ）。未分
化のＥＳ細胞コロニーの割合は、ｂＦＧＦの存在に関わらず同様であった。ＥＰ
Ｌ細胞培養物へのｂＦＧＦの添加は、ＥＰＬ細胞コロニーのレベルの顕著な減少
（５８％から２１％）を生じ、それに対応して分化を含むコロニーが増加した（
４２％から７９％）。このことは、ｂＦＧＦが、培養物中でＥＰＬ細胞の分化を
誘導するが、ＥＳ細胞の分化を誘導しないことを示す。
【０２８８】 （アクチビンＡはＥＰＬ細胞の分化を誘導するが、ＥＳ細胞の分化を誘導しな
い） ＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞を、７５細胞／ｃｍ2の密度で播種した。細胞を、
漸増濃度の組換えヒトアクチビンＡ（１〜２００ｎｇ／ｍｌ；Ｆｌｉｎｄｅｒｓ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｓ．ＡのＲ．Ｒｏｇｅｒｓ博士より提供）を
添加した、ＤＭＥＭ＋ＬＩＦまたはＤＭＥＭ＋５０％ＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦ中で、
それぞれ５日間培養した。アクチビンＡは、試験したいずれの濃度でも、ＥＳ細
胞の形態、分化または増殖に効果を及ぼさなかった。培養中のＥＰＬ細胞へのア
クチビンＡの添加は、それらの分化を誘導した。５日後に、アクチビンＡ処理し
たウェル中の大部分のコロニーは、線維芽細胞の細胞型の存在により特徴付けら
れる異なるコロニー形態（図２９Ｃ）を有し、この細胞型はアルカリフォスファ
ターゼ活性について染色されなかった。この細胞型は、ｂＦＧＦでのＥＰＬ細胞
の分化により形成された、細胞型Ａと形態学的に異なり、そして細胞型Ｂと命名
される。
【０２８９】 １５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡで誘導した代表的な分化培養物内の個々のコ
ロニーを、ＥＳ細胞、ＥＰＬ細胞、分化細胞、または混合ＥＰＬ／分化細胞とし
て、形態およびアルカリフォスファターゼ染色に基づいて分類した（図２９Ｄ）
。未分化のＥＳ細胞コロニーの割合は、アクチビンＡの存在に関わらず同様であ
った。ＥＰＬ細胞培養物へのアクチビンＡの添加は、ＥＰＬ細胞コロニーの割合
の顕著な減少（５２％から３％）および分化細胞を含むコロニーの割合の増加（
４８％から９７％）により評価されるように、効率的な細胞分化を生じた。
【０２９０】 （復帰したＥＰＬ細胞は、ＥＳ細胞の分化能力を回復する） ＥＰＬ細胞は、ＭＥＤＩＩの非存在下であるがＬＩＦの存在下で培養した場合
、形態、遺伝子発現、サイトカイン応答および胚盤胞注入後にキメラに寄与する
能力により評価されるように、ＥＳ細胞に復帰する（実施例２）。ＥＳ細胞を、
ＭＥＤＩＩ中で２日間の培養によりＥＰＬ細胞に分化し、その後ＬＩＦを含む培
地に継代して、復帰されたＥＰＬ細胞を形成する（ＥＰＬR）。胚様体を、各Ｅ
Ｓ、ＥＰＬおよびＥＰＬR細胞集団から形成し、それらの分化を比較した。
【０２９１】 ＥＰＬR細胞から誘導された胚様体は、ＥＳ細胞のＥＢと形態学的に同一であ
り、ＥＰＬ細胞のＥＢと４日目に容易に区別され得た（図２２；データは示さず
）。ＥＳおよびＥＰＬ細胞ＥＢおけるＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現は（図３０Ａ）
、先に記載のプロフィール（図２６）と一致した。ＥＰＬR細胞のＥＢにおける
Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現は、ＥＳ細胞のＥＢについて観察した発現に類似し、
その発現は、発生の４日目に低いレベルで検出され、ＥＰＬ細胞について記載さ
れたように２日目および３日目で高いレベルで検出されなかった。内臓内胚葉を
生じなかったＥＰＬのＥＢと比較して、ＥＰＬRのＥＢは、ホールマウントイン
サイチュハイブリダイゼーションで示されたように、ＥＳのＥＢに匹敵するレベ
ルで内臓内胚葉を生じた（それぞれ、３１％および４６％）。個々に播種したＥ
Ｓ、ＥＰＬおよびＥＰＬRのＥＢの顕微鏡的分析（図３０Ｂ、Ｃ）により、ＥＰ
ＬのＥＰＬR細胞への復帰が、高いレベルのニューロン形成の回復ならびに拍動
心筋細胞のレベルの減少および後期の出現により付随したことが示された。従っ
て、復帰されたＥＰＬ細胞は、インビトロおよびインビボの両方においてＥＳ細
胞への同様の分化能力を有する（実施例２）。
【０２９２】 （概要） ＥＰＬ細胞の多能性の性質を確証づけたＥＳおよびＥＰＬ分化の比較分析は、
原始外胚葉様としてのＥＰＬ細胞の同定を支持し、そしてＥＳ細胞およびＥＰＬ
細胞を、代替的分化能力および成長因子応答に基づいて発生的に異なる集団とし
て定義した。実施例２と組み合わせて、このことは、ＥＳおよびＥＰＬ細胞が、
インビトロおよびインビボの両方において異なる分化能力を有することを示す。
【０２９３】 胚様体内のＥＳおよびＥＰＬ細胞分化の産物は、外胚葉性および中胚葉性の胚
葉ならびに誘導体の割合、および胚外体系統内臓内胚葉の形成の両方において異
なる。従って、ＥＰＬ細胞胚様体の形成は、以下を提供する： −内臓内胚葉の非存在下での多能性細胞の分化および内臓内胚葉により生成され
る誘導性シグナルについての方法論。これは、指向された系統特異的分化を含む
、多能性細胞の分化の制御の前例のない機会を提供する −ＥＰＬ細胞への分化およびそれに引き続く胚様体の形成、または中胚葉誘導成
長因子／サイトカインでの処置による中胚葉の運命に対する多能性細胞分化の効
率的なプログラミングについての方法論。
【０２９４】 （実施例７） （外胚葉胚葉および中胚葉胚葉ならびに誘導体の、多能性細胞のインビトロで
の指向性分化による代替形成） ＭＥＤＩＩにおける因子の使用は、接着培養物中のコロニー、または原始外胚
葉に典型的な懸濁物中の凝集体のいずれかとして、多能性ＥＰＬ細胞の均一な集
団のインビトロでの産生のためのストラテジー開発を可能にした。さらに、ＥＰ
Ｌ胚様体が指令細胞型内臓内胚葉（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｙｐ
ｅ ｖｉｓｃｅｒａｌ ｅｎｄｏｄｅｒｍ）を形成し得ないこと、およびＥＰＬ
細胞がＥＳ細胞を分化させない誘導性シグナルに対して応答することは、多能性
細胞の分化を直接的に制御するための機会を提供する。
【０２９５】 この実施例において、本発明者らは、多能性ＥＰＬ細胞の分化をインビトロで
制御して、特定の胚性胚葉（特に、外胚葉および中胚葉）に典型的な細胞型を生
成し得ることを実証する。これらの胚葉細胞は分化した誘導体の生成のために使
用され、商業的な使用、医療的な使用および農業的な使用について可能性を有し
得る。特に、効率的かつプログラムされた代替の胚葉の形成のために、環境的な
刺激の操作（例えば、細胞外マトリクスの変更および／または外因性の可溶性因
子の添加）が使用され得る。この環境のさらなる操作は、胚葉に由来する個々の
細胞系列の指向性形成を可能にし、これは、特定の細胞型および分化中間物の産
生を可能にする。このストラテジーの例を以下に概説する。
【０２９６】 （材料および方法） （細胞培養条件） 全ての細胞培養技術および組織培養技術を、特に明記しない限り、実施例１お
よび６に記載した。
【０２９７】 （系列特異的な分化：神経外胚葉の形成） 神経外胚葉の産生のために、ＥＢＭ（実施例１）を４日目に回収し、そして細
菌ペトリ皿にて、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４（Ｓｉｇｍａ）を含むかまたは含ま
ない、５０％ＭＥＤＩＩを含むＤＭＥＭ中に再懸濁し、そしてさらに３日間維持
した。
【０２９８】 続いて、インサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子発現の分析のため
に使用される細胞凝集体を、４％ ＰＦＡで固定する前に、予めゼラチンで被覆
した組織培養プレート上に１６時間播種した（８日目）。コントロールの凝集体
は、ＭＥＤＩＩ非存在下のＤＭＥＭ中でＥＳ細胞から形成されたＥＳ細胞ＥＢで
あった。インサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子発現の分析のために
使用される８日目の時点での細胞凝集体を、１０％ ＦＣＳを含む５０：５０の
ＤＥＭＥ：Ｆ１２（Ｆ１２，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）にて、ゼラチン化した組織培
養プラスチック上に播種した。１６時間後、この培地をＩＴＳＳ（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、１ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１０〜２０ｎｇ
／ｍｌの組換えヒトＦＧＦ４を補充した５０：５０のＤＥＭＥ：Ｆ１２に変更し
た。凝集体を、４％ ＰＦＡで固定する前にこの培地中に１〜４日間維持した。
【０２９９】 ＥＳ細胞から形成された神経外胚葉のニューロンに分化する能力を評価するた
めの機能的分化アッセイのために、７日目の凝集体を２ｍｌの組織培養ウェルに
個々に播種し、そして上記のように維持した。ニューロンの形成を、８日目、１
０日目、および１２日目に評価した。
【０３００】 （系列特異的な分化：中胚葉の形成） 中胚葉系列の細胞の形成を、いくつかの類似のアプローチを使用して達成した
。
【０３０１】 接着培養物において生成されたＥＰＬ細胞から：中胚葉は、実施例１に記載さ
れるようなＭＥＤＩＩ存在下での接着培養により形成されたＥＰＬ細胞から形成
された。実施例６に記載されるように、これらの細胞を単一細胞懸濁物になるま
でトリプシン処理し、そして細菌プレート中に１×１０5細胞／ｍｌの密度で播
種して、ＥＰＬ細胞ＥＢを形成させた。
【０３０２】 懸濁物において形成されたＥＰＬ細胞から（ＥＭＢ）：懸濁培養物において細
胞凝集体（ＥＢＭ）として形成されたＥＰＬ細胞を、単一細胞懸濁物になるまで
トリプシン処理し、そして細菌ディッシュ中のＤＭＥＭまたは１０ｎｇ／ｍｌの
ＦＧＦ４を含むＤＭＥＭ中で再凝集化させることにより中胚葉に分化させた。細
胞を１×１０5細胞／ｍｌの密度で播種した。
【０３０３】 （ＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞からのマクロファージの形成） ０日目のＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞をトリプシン処理し、そして細菌グレード
のペトリ皿中のＤＭＥＭに１×１０5細胞／ｍｌの密度で播種し、凝集体形成を
可能にした。２日目に、各プレートからの約１００の凝集体を収集し、そして４
００Ｕ／ｍｌのＩＬ−３（Ｔ．Ｇｏｎｄａ博士，ＩＭＶＳ，Ａｄｅｌａｉｄｅか
ら提供）および１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ）を補充した１．２５ｍｌのＭＣ培地（Ｉｓｃｏｖｅｓ改変ダルベッコ培地（
ＩＭＤＭ）、１５％ ＦＣＳ、５０ｍｇ／ｍｌアスコルビン酸、および４．５×
１０-4Ｍモノチオグリセロール（ＭＴＧ）中の０．９％メチルセルロース））に
播種した。１４日目、および１８日目に、各細胞型からの５０のコロニーを、５
以上のマクロファージ（陽性）または５未満のマクロファージ（陰性）を含むと
してスコア付けした。
【０３０４】 ＭＣ培養物中で形成された細胞を、遠心分離によって収集し、サイトスピン（
ｃｙｔｏｓｐｉｎ）し、そして風乾した。マクロファージを、メイ−グリュンヴ
ァルト−ギームザ染料で染色した場合に形態学的によって、そして、マクロファ
ージ特異的抗体Ｆ４／８０で陽性染色することによって同定した（Ａｕｓｔｙｎ
およびＧｏｒｄｏｎ，１９８１）。
【０３０５】 （遺伝子発現分析） インサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロットおよびＲＮａｓｅプ
ロテクションによる遺伝子発現分析を、実施例１および６に記載されるようにし
て行った。さらなるプローブは以下であった：ホールマウントインサイチュハイ
ブリダイゼーションのためのＳｏｘ１リボプローブを、ＢａｍＨＩで線状化しそ
してＴ３ ＲＮＡポリメラーゼで転写するか（アンチセンス）、またはＨｉｎｄ
ＩＩＩで線状化しそしてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼで転写した（センス）プラス
ミド＃１０２２（Ｒｏｂｉｎ Ｌｏｖｅｌｌ−Ｂａｄｇｅ博士，ＮＩＭＲ，Ｌｏ
ｎｄｏｎから入手した）から生成した。ＲＮａｓｅプロテクションのためのアン
チセンスＳｏｘ１プローブを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋にサブク
ローン化したプラスミド＃１０２２中のＳｏｘ１ ｃＤＮＡからの約４５０ｂｐ
のＸｈｏ１／ＥｃｏＲ１フラグメントを含むプラスミドから生成した。得られた
プラスミドをＫｐｎ１で線状化し、そしてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼで転写した
。インサイチュハイブリダイゼーションにおける使用のためのＳｏｘ２プローブ
を、ＡｃｃＩで線状化しそしてＴ３ ＲＮＡポリメラーゼで転写するか（アンチ
センス）、またはＮｏｔＩで線状化しそしてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼで転写し
た（センス）プラスミド＃１０１５（Ｒｏｂｉｎ Ｌｏｖｅｌｌ−Ｂａｄｇｅ博
士，ＮＩＭＲ，Ｌｏｎｄｏｎから入手した）から生成した。インサイチュハイブ
リダイゼーションにおける使用のためのアンチセンスＧｂｘ２リボプローブを、
ＡｌｕＩで線状化しそしてＴ３ ＲＮＡポリメラーゼで転写したｐＧｂｘ２ｃ７
．１（Ｃｈａｐｍａｎら，１９９７）から生成した。
【０３０６】 （免疫組織学的分析） 播種した細胞凝集体を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定し、そして
適切なブロッキング緩衝液中で３０分間ブロッキングし、続いて、一次抗体と共
にブロッキング緩衝液中で４℃にてインキュベートした。次いで、凝集体をブロ
ッキング緩衝液中で種特異的な二次抗体で１時間リンスした。ＦＩＴＣ結合体化
二次抗体のために、没食子酸プロピル５ｍｇ／ｍｌを添加した。スライドをＮｉ
ｋｏｎ ＴＥ３００顕微鏡上で蛍光を使用して試験した。
【０３０７】 ネスチン：ブロッキング緩衝液：ＰＢＳ中１％ヤギ血清、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳ
Ａ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００。一次抗体：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔ
ｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、参照ラット４０１、１：１００の
希釈で使用した。二次抗体：ＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＭ（μ特異性（
μ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）：Ｓｉｇｍａ）、１：１００の濃度で使用した。
【０３０８】 Ｎ−Ｃａｍ：ブロッキング緩衝液：ＰＢＳ中１％ ＦＣＳ、１ｍｇ／ｍｌ Ｂ
ＳＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００。一次抗体：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ，ＳＣ−１５０７、１：２０の濃度で使用した。二次抗体：ＦＩＴ
Ｃ結合体化ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）、１：７００の希釈で使用した。
【０３０９】 ＮＦ２００：ＮＦ２００を、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（１９８７）によって記載さ
れるような間接的な免疫蛍光により検出した。一次抗体：抗神経フィラメント２
００（Ｓｉｇｍａ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｎ−４１４２）、１：２
００の希釈で使用した。二次抗体：ＦＩＴＣ結合体化抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｌｅ
ｎｕｓ）、１：６０の希釈で使用した。
【０３１０】 （結果） （インビトロでの多能性細胞の分化による、外胚葉、神経外胚葉および神経系
列のプログラムされた形成） 懸濁培養において、５０％ ＭＥＤＩＩを含むＤＭＥＭ中で４日間ＥＳ細胞を
凝集させることにより形成させた、ＥＢＭ（実施例１）を、５０％ ＭＥＤＩＩ
を含むＤＭＥＭまたは５０％ ＭＥＤＩＩおよび２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ４を含
むＤＭＥＭにて、さらに３日間懸濁物中に維持した。これらの条件下で、約１０
０％のＥＢＭが、偽層状化の外観の独特の層状の構造を有する細胞凝集体に発達
した（図３１Ａ）。これらの層は、５０％ ＭＥＤＩＩのみで培養された凝集体
において観察されたが、ＦＧＦ４の存在下で増強された。しかし、これらの層は
、ＥＰＬ細胞ＥＢにおいては全く見出されず、塊（ｂｏｄｙ）内において細胞の
サブセットを含むＥＳ細胞ＥＢにおいて散発的にのみ観察された。
【０３１１】 これらの層における細胞の同定は、転写物の発現および胚性細胞型のための診
断的な細胞表面マーカーの分析によって試験した。インサイチュハイブリダイゼ
ーションによる遺伝子発現の分析のために、凝集体を懸濁培養の７日後に、５０
％ ＭＥＤＩＩを含みおよびＦＧＦ４を含むかもしくは含まないＤＭＥＭ中のゼ
ラチン処理した組織培養プラスチック上に１６時間播種した（図３１Ｂ）。細胞
層においては多能性細胞のマーカーであるＯｃｔ４の発現は検出され得ず、この
ことは、これらの細胞は多能性でなかったことを示す。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発
現はインサイチュハイブリダイゼーションによって検出されなかった。このこと
は、これらの構造が、発生期中胚葉を含まなかったことを実証する。さらに、中
胚葉の形態の細胞型は、凝集体内において認識され得ない。
【０３１２】 Ｓｏｘ１は初め、インビボにおいて神経外胚葉／神経板および未分化の神経細
胞により発現される。中胚葉起源または内胚葉起源の細胞型においては発現され
ない。Ｇｂｘ２は原始線条において発現され、次いで、神経管閉鎖（ｎｅｕｒａ
ｌ ｔｕｂｅ ｃｌｏｓｕｒｅ）より前に神経外胚葉において発現され、続いて
、中脳／後脳境界で発現される。Ｓｏｘ２は、神経管閉鎖の後に神経外胚葉にお
いて発現され、そして神経細胞の最終的分化まで持続する。インサイチュハイブ
リダイゼーションにより、層内の細胞により広範にＳｏｘ１が広範囲で発現され
、そしてＧｂｘ２はこれらの細胞のサブセットにより発現されることが実証され
た。このことは、これらの培養条件によって産生された細胞型が、神経外胚葉、
特に、神経管閉鎖のときあたりでの初期神経板に相当することを示唆した。
【０３１３】 これらの凝集体における神経遺伝子の発現の分析は、８、９および１０日目で
のインサイチュハイブリダイゼーション（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２およびＧｂｘ２；
図３２Ａ）および免疫組織化学（ネスチンおよびＮ−ＣＡＭ；図３２Ｂ）により
、神経特異的なマーカーの分析によって洗練された。Ｓｏｘ１の発現は、発生の
８日目で、９０％より多くの凝集体において検出されたが、発現は各凝集体の一
部の細胞においてのみ観察された。Ｓｏｘ１発現は、発生の９日目および１０日
目に増大し、各凝集体の約１００％の細胞がＳｏｘ１を発現していた。同様に、
１０日目には、ほとんどの細胞がＳｏｘ２もまた発現していた。Ｇｂｘ２発現は
、発生の８日目に一部の細胞において観察され、そして９日目および１０日目に
は下方制御された。この発現パターンは、細胞層を神経外胚葉起源であると同定
したことと一致した。
【０３１４】 これらの細胞の神経外胚葉としての同定は、神経タンパク質の発現によって支
持された（図３２Ｂ、データは示さず）。未分化の神経幹細胞によって発現され
る中間径フィラメントタンパク質であるネスチンは、Ｓｏｘ１と同様に、８日目
、９日目および１０日目の細胞層において発現された。Ｎ−Ｃａｍは、全ての神
経系列（未分化の細胞および分化した細胞の両方を含む）により発現されるマー
カーである。Ｎ−Ｃａｍ染色は、８日目、９日目および１０日目の凝集体の至る
所で検出され、Ｎ−Ｃａｍを発現している細胞の数はほぼ１００％にまで増加し
た。Ｎ−Ｃａｍは、細胞層および層を取り囲む分化した細胞の両方において発現
されており、このことは、分化した細胞のほとんどが神経起源であったことを示
す。
【０３１５】 遺伝子発現のノーザンブロット分析およびＲＮａｓｅプロテクション分析は、
ＥＢＭが、ＭＥＤＩＩの存在下で神経外胚葉を形成するようにプログラムされた
という結論を支持した。Ｏｃｔ４およびＦｇｆ５発現（図３３Ａ）は、ＥＢＭ凝
集体において４日目と５日目との間に著しくダウンレギュレートされ、このこと
は、多能性細胞の損失を示した。しかし、低いが一貫したレベルのＯｃｔ４転写
が、５日後のＥＢＭ凝集体において検出された。インサイチュハイブリダイゼー
ション（図３１Ｂ）は、低いＯｃｔ４転写が、凝集体中の残余の多能性細胞から
発現されず、そしてこのことが、これらの凝集体における初期神経外胚葉の特性
であり得ることを実証した。この残余の発現は、低レベルの神経外胚葉を形成す
るＥＳ細胞ＥＢにおいて検出され得なかった。ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現は、Ｏ
ｃｔ４発現の欠失と一致して、ＥＳ細胞ＥＢにおいて４日目から観察されたが、
ＥＢＭにおいては検出され得なかった（図８）。最後に、Ｇｂｘ２発現およびＳ
ｏｘ１発現（図３３Ｂ）は、６、７、および８日目のＥＢＭから形成された凝集
体におけるＲＮａｓｅプロテクションにより検出された。Ｇｂｘ２の発現は８日
目に低下したが、Ｓｏｘ１発現は１０日まで増加し続けた。
【０３１６】 これらの結果は、多能性細胞を、ＭＥＤＩＩ内の因子によって、外胚葉のおよ
び神経外胚葉の発生運命について特異的にプログラムし得ることを実証する。こ
の外胚葉細胞は、中胚葉細胞型の非存在下で形成され、そしてインビボで神経外
胚葉に相当する遺伝子発現の時間的パターンを示す。このパターンは、神経板に
相当する初期神経外胚葉細胞型から、神経管の閉鎖後に現れる後期神経外胚葉細
胞型への進行を伴う。胚において、これらの細胞は、全ての神経系統についての
前駆体である。
【０３１７】 （インビトロで指向された多能性細胞分化により誘導された神経外胚葉は、神
経細胞型へさらに分化され得る） ＭＥＤＩＩ、またはＥＳ細胞ＥＢの存在下でＥＢＭから発生した個々の凝集体
を接種し、そしてニューロン（これは軸索の突起の存在によって形態学的に同定
された（そしてＮＦ２００の発現によって確認された；データを示さず））およ
び拍動心臓細胞（ｂｅａｔｉｎｇ ｃａｒｄｉｏｃｙｔｅ）の存在について、８
、１０および１２日目に評価した。拍動心臓細胞（図３４Ａ）は、８日目に５０
％を超えるＥＳ細胞ＥＢにおいて検出され得、そしてこれらは、発生の１０〜１
２日間にわたり存続した。対照的に、ＭＥＤＩＩにおいて維持された大部分のＥ
ＢＭ由来の凝集体（９９．６％）は、拍動心臓細胞を含まなかった。これらの凝
集体における拍動心臓細胞（中胚葉由来の組織）の欠失は、発生の初期段階での
ｂｒａｃｈｙｕｒｙ発現の欠失と一致し（実施例１、図７、８）、そしてこのこ
とは中胚葉系統が、これらの凝集体において形成されないことを示す。ニューロ
ンは、発生の８日目のいずれの凝集体集団おいても検出されなかった（図３４Ｂ
）が、１０日目の６０％を超えるＥＢＭ由来の凝集体においては明らかであった
。１２日目までに、９０％を超過するこれらの凝集体が、ニューロンを含んでい
た。比較すると、ニューロンの形成は、ＥＳ細胞ＥＢの１０％（１０日目）およ
び２５％（１２日目）において観察された。これらのデータは、神経外胚葉が、
ＭＥＤＩＩの存在下で培養されたＥＢＭによって、高レベルかつ中胚葉細胞の非
存在下で形成されるという以前の結論を支持し、そしてこの神経外胚葉が、最終
的に分化した神経細胞型を生じ得ることを実証する。従って、ＭＥＤＩＩ中でＥ
ＢＭから発生した凝集体は、未分化の神経細胞において富化される。
【０３１８】 インビボでの神経外胚葉の形成は、最終的な外胚葉の形成を通じて進行する。
インビボでの最終的な外胚葉についてのマーカーは存在しないが、遺伝子発現分
析は、低レベルのＯｃｔ４を発現し、そして神経外胚葉マーカーを発現できない
神経外胚葉を形成するようにプログラムされたＥＢＭ中の細胞の集団を同定した
。これらの細胞は、原始外胚葉（高Ｏｃｔ４発現）と神経外胚葉（高Ｓｏｘ１、
Ｇｂｘ２）との間で過渡的に存在し、そしてこのことは、神経外胚葉形成が、最
終的な外胚葉を示し得る中間体集団を介して進行することを示唆する。
【０３１９】 本明細書中で記載される神経外胚葉の形成は、化学的インデューサー（例えば
、レチノイン酸）の添加、または遺伝子操作に依存することなく、神経形成を促
進する。代わりに、それは、馴化培地ＭＥＤＩＩ中に見出された生物学的誘導因
子に依存する。この様式において形成された神経の前駆体は、胚形成の間に神経
細胞の形成に類似した様式において多能性細胞から分化されると考えられ、従っ
てこれは、商業上、医療上、および農業上の適用に有用である分化した神経細胞
の産生に理想的である。さらに、レチノイン酸のような化学的インデューサーに
よる制限された神経系統の形成とは対照的に、これらの方法論を用いて産生され
た神経細胞型の同一性は、制限されないようである。
【０３２０】 （多能性細胞分化の神経外胚葉プログラミングは、ＭＥＤＩＩの高分子量成分
を必要とするが、ＭＥＤＩＩの低分子量成分を必要としない） 胚形成の間に、神経外胚葉は、基底膜／細胞外マトリックスとの会合を維持す
る前原始外胚葉細胞（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｅｃｔｏｄｅｒ
ｍ ｃｅｌｌ）から形成される。ＭＥＤＩＩの高分子量成分内での生物活性ＥＣ
Ｍタンパク質の同定は、多能性細胞由来の指向された神経外胚葉形成におけるこ
の活性の役割についての研究を促進した。これを、神経細胞型が通常形成されな
いＥＰＬ ＥＢ中でニューロンの形成を誘導するこの成分の能力によって試験し
た（実施例６）。
【０３２１】 ＥＰＬ細胞を、ＭＥＤＩＩの存在下でかつＬＩＦの非存在下において、２日間
ＥＳ細胞を培養することによって形成した。ＥＰＬ細胞ＥＢを、ＤＭＥＭまたは
ＤＭＥＭ＋Ｒにおいて形成した（実施例４）。発生の４日目に、組織胚様体を、
ゼラチンで処理された２ｍｌの組織培養ウェルに個別に接種した。拍動心臓細胞
およびニューロンを、発生の７、８、９、および１０日目に評価した（図３５）
。
【０３２２】 ＥＰＬ細胞ＥＢは、拍動筋（ｂｅａｔｉｎｇ ｍｕｓｃｌｅ）を高分子量成分
の非存在下において高い効率で形成し、そしてこれらのＥＢは、ニューロンを含
まなかった。組織胚様体形成の間の高分子量成分（５０〜１００μｇ／ｍｌ）の
封入は、９日目にＥＢの約５％において、そして１０日目および１２日目に１０
〜１２％において神経細胞の発生を生じた。高分子量成分の存在下で形成された
ＥＰＬ細胞ＥＢのわずか１０〜１２％が、拍動筋を含んでおり、そして拍動筋の
形成は、９日まで遅延された。これらの実験を１μｇ／ｍｌの抗ヒトＬＩＦ中和
抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下で行った。従って、変更された発生プ
ログラムは、Ｈｅｐ Ｇ２細胞によって発現される低レベルのＬＩＦの原因とな
り得ない。
【０３２３】 この実験は、中胚葉の形成を遅延および減少し、ニューロンの形成を促進する
ような、多能性細胞凝集体中の分化のプログラムにおけるＭＥＤＩＩの高分子量
成分、そしておそらくＥＣＭ成分の役割を実証する。
【０３２４】 （多能性細胞に由来する中胚葉系統の効率的にプログラムされた形成） 多能性細胞は、実施例６に示されるような、同質のＥＰＬ細胞中間体を通じた
分化により、特定の中胚葉の発生運命を採用するようにプログラムされ得る。こ
のことは、ＥＰＬ細胞ＥＢ中の内臓外胚葉の非存在を反映し得る。発生期の中胚
葉形成は、約１００％のＥＰＬ細胞ＥＢにおいて検出され得、そして、可能な発
生期の中胚葉細胞発生運命の１つのみを含む拍動心臓細胞をスコア付けすること
によると、おそらく過小評価される。先の実験を、接着培養においてＥＳ細胞か
ら形成されたＥＰＬ細胞を用いて行った。ここに本発明者らは、インビトロでの
多能性細胞からの効率的な中胚葉形成のための代替的方法論を記載する。
【０３２５】 （懸濁液中で形成したＥＰＬ細胞の再凝集による中胚葉の形成） ＭＥＤＩＩの存在下で懸濁液中において形成されたＥＰＬ細胞（ＥＢＭ、実施
例１）は、胚性原始外胚葉（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｅｃｔ
ｏｄｅｒｍ）に相当する特性を有する細胞の安定かつ同質な集団を含む。中胚葉
の発生運命へとこれらの細胞の分化をプログラムすることは、ＭＥＤＩＩの神経
外胚葉誘導活性の除去およびＥＣＭ成分からの解離の両方を必要とすると考えら
れる。これは、インビボにおける原始線条形成の間に中胚葉を形成することを運
命付けられた多能性細胞の挙動を模倣する。
【０３２６】 ４日目に、ＥＭＢを、単一細胞懸濁液に対してトリプシン処理し、そしてＤＭ
ＥＭ＋／−１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ４、またはＤＭＥＭ＋５０％ＭＥＤＩＩ＋／
−１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ４中に再凝集した。発生の引き続く４日後に、ＤＭＥ
Ｍにおいて培養された再凝集体と、ＤＭＥＭ＋５０％ＭＥＤＩＩにおいて培養さ
れた凝集体との間で、明白な形態学的な差異が明らかとなった（図３６）。２日
目および４日目での、これらの凝集体からのＲＮＡを、ｂｒａｃｈｙｕｒｙおよ
びＯｃｔ４の発現に対するノーザンブロットによって分析した（図３６）。Ｏｃ
ｔ４発現は、４日目の再凝集体においてダウンレギュレートされた。これは、分
化が生じた場合の多能性の損失を示した。再凝集体が、神経外胚葉を形成するこ
とを運命付けられているという事実と一致して、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ発現は、Ｄ
ＭＥＭ＋５０％ＭＥＤＩＩ中で発生した再凝集体において検出され得なかった。
中胚葉形成を示すｂｒａｃｈｙｕｒｙ発現は、ＦＧＦ４の非存在下において、２
日目および４日目にＤＭＥＭ中で発生した再凝集体において、強力にアップレギ
ュレートされた。ＦＧＦ４の存在下で、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ発現は２日目にピー
クを迎え、そして４日目までにダウンレギュレートされた。このことは、ＦＧＦ
４の添加が、多能生細胞の加速された中胚葉分化を生じることを示唆する。マー
カー遺伝子の発現を、Ｏｃｔ４およびｂｒａｃｈｙｕｒｙ特異的プローブと再凝
集体とのインサイチュハイブリダイゼーションによって確認した（データ示さず
）。これらのデータは、懸濁液において形成されたＥＰＬ細胞が、中胚葉へ分化
するようにプログラムされ得ることを示す。
【０３２７】 （方向付けられた多能性細胞の分化によって誘導された中胚葉前駆体は、代替
的発生運命についてプログラムされ得る） ＥＰＬ細胞ＥＢにおける高レベルの中胚葉のプログラムされた形成を、発生期
中胚葉および拍動心臓細胞の形成によって実証した（実施例６）。ＥＰＬ細胞Ｅ
Ｂにおける上昇したレベルの発生期中胚葉が、筋原性系統へと発生的に制限され
たか否か、または代替的発生運命へとプログラムされ得るか否かを確証するため
に、外因性サイトカインに応答するマクロファージの形成を評価した。
【０３２８】 ＥＰＬ細胞およびコントロールＥＳ細胞ＥＢを、ｍＩＬ−３およびｈＭ−ＣＳ
Ｆを補充したＭＣ培地において分化させ、そして１２日目、１５日目、および１
８日目にマクロファージの存在について記録した（図３７）。４．８％のＥＳ細
胞ＥＢと比べると、１２日目に、３２．４％のＥＰＬ細胞ＥＢが、マクロファー
ジを含むことを観察した。１５日目および１８日目のマクロファージを含む組織
胚様体の割合は、ＥＰＬ細胞ＥＢの４３％およびＥＳ細胞ＥＢの９〜１０％まで
増加した。ＥＰＬ細胞ＥＢにおける中胚葉の初期形成と一致して、マクロファー
ジの形成が、ＥＳ細胞ＥＢと比べてこれらの組織胚様体においておよそ２日早く
開始された（データ示さず）。ＥＰＬ細胞ＥＢにおける複数の中胚葉系統の形成
の増大は、これらの（組織胚葉）体において増大した発生期中胚葉が、特定の環
境的な合図に応答して代替の発生運命をプログラムされ得る、多能性中胚葉前駆
体を含むことを示唆する。
【０３２９】 （多能性細胞分化は、選択的な中胚葉および外胚葉系統の形成について特異的
にプログラムされ得る） 多能性細胞の中胚葉性の分化（ＥＰＬ細胞のＥＢの形成）および外胚葉性の分
化（ＥＢＭの形成）を指向するために開発された方法論の比較分析を、図３８に
示す。分化した集団を、ニューロンおよび拍動筋の存在について、それぞれ中胚
葉系統および外胚葉系統についての代表的な細胞型としてスコアした。
【０３３０】 ＥＰＬ細胞のＥＢは、高い効率で拍動筋を形成したが、ニューロンを形成する
ことはできなかった。ＥＢＭは、相反するパターンを示し、高い効率でニューロ
ンを形成したが、拍動筋の形成には失敗した。特に中胚葉の形成は、おそらくこ
の分析において過少評価される。なぜなら、単一の中胚葉の細胞型（拍動筋）の
みをスコアしたからである。従って、多能性細胞集団を、形成および分化するた
めのＭＥＤＩＩ内の因子の適切な使用は、インビトロでの多能性細胞由来の選択
的な中胚葉および外胚葉の胚葉の特異的形成を指向し得る。
【０３３１】 （概要） 本発明者らは、選択的な胚葉（すなわち、外胚葉および中胚葉）の細胞系統へ
の多能性細胞の分化を指向するための方法について記載する。ＭＥＤＩＩ中の（
接着培養または懸濁培養での）生物学的活性に対する応答におけるＥＰＬ細胞の
形成は、これらの系統特異的分化のプロトコルに必須の工程である。上記の例に
おいて使用した多能性細胞は、ＭＥＤＩＩ中のＥＳ細胞の培養により得たが、本
発明者らは、胚性ＩＣＭ、原始外胚葉またはＰＧＣから単離した原始多能性細胞
、あるいは脱分化または核移植により得た多能性細胞を、インビトロでの制御さ
れた系統特異的分化についての材料の供給源として使用し得たことを認識する。
【０３３２】 中胚葉の形成の非存在下での神経外胚葉の形成は、ＥＰＬ細胞が、懸濁培養で
ＭＥＤＩＩの存在下において分化した場合に生じた。これは、馴化培地が、神経
決定に必要な成分を含んだことを示唆した。この馴化培地の分画は、この成分が
、１０ｋＤａより大きな培地成分を含む画分に存在し、そしてＥＣＭ成分をＥＰ
Ｌ細胞の形成に活性な成分として同定され得ることを示唆した。ＥＣＭ成分の接
触による原始外胚葉からの神経外胚葉の形成は、胚形成の間のこの系統の決定と
一致している。
【０３３３】 神経外胚葉の非存在下でのＥＰＬ細胞からの中胚葉の効率的な形成は、接着培
養または懸濁培養において達成され得、そしてＭＥＤＩＩを除去し、潜在的にＥ
ＣＭタンパク質との接触を排除することが必要とされ得る。これは、ＭＥＤＩＩ
を添加しない培地中でのＥＰＬ細胞の凝集または再凝集により達成され得るか、
またはＴＧＦβまたはＦＧＦファミリーのメンバーの存在下でゼラチン処理した
プラスチックウェア（ｐｌａｓｔｉｃ−ｗａｒｅ）上にＥＰＬ細胞を播種するこ
とにより達成され得る。ＥＰＬ細胞の分化は、細胞凝集として内臓内胚葉の非存
在下で進行し、そして中胚葉細胞系統の形成を生じ、これは、遺伝子発現および
分化の終結により評価される。
【０３３４】 重要なことに、ＥＰＬ細胞および、ＭＥＤＩＩまたはＭＥＤＩＩ活性の含有ま
たは排除は、単一の胚葉由来の前駆体および分化した細胞に高度に富化された細
胞集団の産生のためのアプローチを提供する。このアプローチは、化学的な誘導
物質（例えば、神経細胞形成のためのレチノイン酸）の添加、または多能性細胞
の先の遺伝的改変を含まない。その代わりに、このアプローチは、インビボでの
正常な胚発生の間の神経外胚葉および中胚葉の形成に関与すると考えられる因子
に依存する。この様式で誘導される前駆体は、ヒトの医薬、獣医学的適用および
農業における計画された適用に理想的である。
【０３３５】 （実施例８：遺伝子治療適用） 遺伝子治療における本発明の有用性は、以下のようである。これは、いくつか
の動物種（ヒツジ、ウシおよびマウスを含む）においてすでに開発され、そして
使用されている核移植技術の使用に依存する。ドナーのヒト卵子は、インビトロ
において受精させるが、次いで核を取り除き、そして意図された遺伝子治療のレ
シピエント由来の細胞からの核に置き換える。核移植された卵を、インビトロで
初期胚に発達させ、次いで初期胚由来の細胞を使用して、本発明の手順および産
物を用いて、ＥＰＬまたはＥＳ細胞株を生成する。ついで、この細胞株を、当業
者に公知のＤＮＡ移入技術を使用して遺伝的に改変し、遺伝的欠損を補正するか
、または所望の遺伝子（例えば；血友病（ｈｅｍｏｐｈｅｌｉａ）のための凝固
因子遺伝子、嚢胞性線維症のためのＣＦ遺伝子、Ｉ型糖尿病のためのインスリン
遺伝子）の機能性コピーを置換もしくは添加する。次いで、改変されたＥＳ細胞
株またはＥＰＬ細胞株を、インビトロで所望の細胞、組織、または器官に分化さ
せる。これを、治療的移植手順でレシピエント中に再導入する。改変された細胞
株の全ての遺伝子（改変された遺伝子または導入された遺伝子を除く）が、レシ
ピエント個体自身の遺伝子と同一であり、これは、結局完全に適合した移植であ
るので、細胞または組織の拒絶はないようである。
【０３３６】 あるいは、適合しないヒトＥＳ細胞株またはＥＰＬ細胞株由来の改変された細
胞を、遺伝的に改変し、次いで当業者に公知の細胞カプセル化技術によりカプセ
ル化する。次いで、それらを、その処置される個体において欠失または欠損して
いる遺伝子産物（例えば、凝固因子、インスリンなど）をその個体において産生
するように、移植片としてレシピエントに導入する。任意のレシピエントに対し
て非免疫学的になるようにドナーの樹立したＥＳ細胞株またはＥＰＬ細胞株を遺
伝的に改変することも可能であり、それにより「万能なＥＳ細胞株またはＥＰＬ
細胞株」を生成する。この細胞株を、さらに改変して、カプセル化技術を使用す
ることなく上述の治療的手順に使用する。
【０３３７】 このような「万能な」ドナー細胞を使用して、異種移植手順（例えば、遅延し
た移植拒絶を減少または排除するためにヒト内皮で異種移植片器官血管（例えば
、豚の腎臓または心臓）をコートする）に使用されるヒト内皮細胞を生成する。
【０３３８】 （実施例９：多能性細胞由来の神経細胞の移植） 長期にわたる治療としての神経細胞の移植および神経学的障害の治癒により与
えられる期待にもかかわらず、実施するための重大なハードルが依然として存在
する。同種異系移植および異種移植は、たとえ免疫学的保護が、血液脳関門によ
り提供されたとしてもなお、拒絶される。さらに、神経移植試験においてしばし
ば使用される胎児細胞の利用可能性は、希である。定義された神経経路にそった
、多能性細胞のインビトロにおける制御された分化により発生する神経幹細胞を
含む神経細胞は、神経細胞治療および神経移植のための理想の細胞の供給源を提
供する。
【０３３９】 ヒトにおいて神経ドーパミン細胞の移植は、パーキンソン病の症状をいくらか
和らげるために試行され、そして神経細胞の移植もまた、神経変性障害に対する
利点を与え得る。これらの細胞をヒト治療のために提供する最初の工程として、
多能性細胞由来の神経細胞を用いる移植をマウスモデルにおいて研究し得る。核
の位置（ＫＳＦ４細胞株）または細胞質（ＲＯＳＡ ２６細胞株）に対して指向
されたβガラクトシダーゼを発現するＥＳ細胞株の分化は、本明細書中に記載さ
れるようにＭＥＤＩＩを使用する神経経路に沿って指向され得る。神経外胚葉（
ｎｅｕｒｅｃｔｏｄｅｒｍ）または分化された神経細胞を、新生児の脳胞中に注
入し得る。移植した細胞の生存は、脳におけるβガラクトシダーゼを発現する細
胞の維持により示される。移植した細胞の同化する能力は、細胞質形態のβガラ
クトシダーゼを発現するマーカー細胞（すなわち、ＲＯＳＡ ２６ＥＳ細胞由来
の細胞）により樹立された関係を研究することにより決定され得る。
【０３４０】
【表９】 最後に、種々の改変、変更および／または付加が本明細書中に概説される、本
発明の思想から逸脱することなくなされうることは理解されるべきである。
【０３４１】
【表１】
【０３４２】
【表２】
【０３４３】
【表３】
【０３４４】
【表４】
【０３４５】
【表５】
【０３４６】
【表６】
【０３４７】
【表７】
【０３４８】
【表８】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＭＥＤＩＩは、ＥＳ細胞からＥＰＬ細胞への移行に影響する。ＥＳ細胞は、培
養４日後に、ＬＩＦ（Ａ）、５０％ＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦ（Ｂ）または添加物なし
（Ｃ）を含有する培地中で増殖される。ＭＥＤＩＩの存在下で培養されたＥＳ細
胞は、ＥＰＬ細胞の形成に関連する特徴的形態学を示す。この棒は、５０μｍを
示す。（Ｄ）ＥＳ細胞は、ＬＩＦ、５０％ＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦ、５０％ＭＥＤＩ
Ｉおよび添加物なし、を含有するＤＭＥＭ中で２５０細胞／ｃｍ2の密度で播種
された。５日後、培養物はアルカリホスファターゼおよびヘマトキシリンについ
て染色され、そしてＥＳ、ＥＰＬおよび分化したコロニーのパーセンテージが決
定された。アルカリホスファターゼ陽性コロニーは、形態学に基づいて、ＥＳ細
胞コロニーおよびＥＰＬ細胞コロニーに小分割され、分化したコロニー（Ｄ）は
、アルカリホスファターゼ陰性であると決定された。それぞれの状態についての
プレーティング効率（％）は、４２．８＋／−８．７（ＬＩＦ）；４７．２６＋
／−２．６（５０％ＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦ）；４０．５＋／−５．９（５０％ＭＥ
ＤＩＩ）；４１．４＋／−６．６（添加なし）であった。
【図２】 （Ａ）は、ＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞のＲＮＡのノーザンブロット分析。ＭＥ
ＤＩＩまたはＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦ中で、２、４、６および１６日間培養した、Ｅ
１４のＥＳ細胞、ＥＰＬ細胞誘導体（ｉ）そして、外因性因子の非存在下で６日
間培養した自発的に分化したＥＳ細胞（ｉｉ）から単離した２０μｇの総ＲＮＡ
をＦｇｆ５、Ｒｅｘ１、Ｏｃｔ４およびｍＧＡＰの発現について分析した。Ｆｇ
ｆ５転写物は、２．７および１．８ｋｂ（Ｈｅｂｅｒｔら、１９９０），Ｒｅｘ
１では１．９ｋｂ（Ｈｏｓｌｅｒら、１９８９），Ｏｃｔ４では１．５５ｋｂ（
Ｒｏｓｎｅｒら、１９９０）そしてｍＧＡＰでは１．５ｋｂであった。（Ｂ，Ｃ
）は、Ｏｃｔ４の発現についての、ＥＳ細胞層（Ｂ）およびＥＰＬ細胞層（Ｃ）
のインサイチュ分析。（Ｄ，Ｅ）：ＥＳ細胞（Ｄ）およびＥＰＬ細胞（Ｅ）は、
アルカリホスファターゼの存在について染色された。（Ｆ）：ＭＥＤＩＩ＋ＬＩ
ＦおよびＭＥＤＩＩ中で２、４および６日間培養したＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞
由来のＲＮＡ１０μｇは、ＲＮアーゼ保護により、Ｇｂｘ２、Ｏｃｔ４およびｍ
ＧＡＰの発現について分析された。（Ｇ）は、Ｆｇｆ５の発現についてのＥＰＬ
細胞のインサイチュ分析。（Ｈ）：ＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦ中で２日間および６日間
維持されたＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞由来の２０μｇの全ＲＮＡは、ウボモルリ
ン（Ｕｖｏ）の発現についてノーザンブロットにより分析された。ｍＧＡＰ発現
は、ＲＮＡレベルを正規化するために用いられた。棒はＢ−Ｅでは３２μｍを、
そしてＦでは２５μｍを示す。
【図３Ａ】 Ｌ１７のｄｄＰＣＲ産物の配列。
【図３Ｂ】 Ｋ７のｄｄＰＣＲ産物の配列。
【図３Ｃ】 Ｐｓｃ１のｄｄＰＣＲ産物の配列。
【図４Ａ】 ８日間までＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦの培養液で維持されたＥＳ細胞およびＥＰＬ細
胞から単離された５μｇのポリＡ ＲＮＡ（Ｌ１７およびＰｓｃ１）または２０
μｇの全ＲＮＡ（Ｋ７）におけるＬ１７（Ａ）、Ｐｓｃ１（Ｂ）およびＫ７（４
）の発現のノーザン分析。転写サイズは、図に示される。ノーザンブロットは、
Ｏｃｔ４の発現に対して定量化そして正規化された。
【図４Ｂ】 ８日間までＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦの培養液で維持されたＥＳ細胞およびＥＰＬ細
胞から単離された５μｇのポリＡ ＲＮＡ（Ｌ１７およびＰｓｃ１）または２０
μｇの全ＲＮＡ（Ｋ７）におけるＬ１７（Ａ）、Ｐｓｃ１（Ｂ）およびＫ７（４
）の発現のノーザン分析。転写サイズは、図に示される。ノーザンブロットは、
Ｏｃｔ４の発現に対して定量化そして正規化された。
【図４Ｃ】 ８日間までＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦの培養液で維持されたＥＳ細胞およびＥＰＬ細
胞から単離された５μｇのポリＡ ＲＮＡ（Ｌ１７およびＰｓｃ１）または２０
μｇの全ＲＮＡ（Ｋ７）におけるＬ１７（Ａ）、Ｐｓｃ１（Ｂ）およびＫ７（４
）の発現のノーザン分析。転写サイズは、図に示される。ノーザンブロットは、
Ｏｃｔ４の発現に対して定量化そして正規化された。
【図５Ａ】 ３．５ｄ．ｐ．ｃ．と５．５ｄ．ｐ．ｃ．との間で切断されたマウス胚のホー
ルマウントインサイチュハイブリダイゼーション分析による新規なマーカー遺伝
子Ｌ１７（Ａ）、Ｐｓｃ１（Ｂ）およびＫ７（Ｃ）のインビボ発現、。ＰＥは、
原始外胚葉；ＰＣは、原始羊膜腔；ＶＥは、内臓外胚葉。
【図５Ｂ】 ３．５ｄ．ｐ．ｃ．と５．５ｄ．ｐ．ｃ．との間で切断されたマウス胚のホー
ルマウントインサイチュハイブリダイゼーション分析による新規なマーカー遺伝
子Ｌ１７（Ａ）、Ｐｓｃ１（Ｂ）およびＫ７（Ｃ）のインビボ発現、。ＰＥは、
原始外胚葉；ＰＣは、原始羊膜腔；ＶＥは、内臓外胚葉。
【図５Ｃ】 ３．５ｄ．ｐ．ｃ．と５．５ｄ．ｐ．ｃ．との間で切断されたマウス胚のホー
ルマウントインサイチュハイブリダイゼーション分析による新規なマーカー遺伝
子Ｌ１７（Ａ）、Ｐｓｃ１（Ｂ）およびＫ７（Ｃ）のインビボ発現、。ＰＥは、
原始外胚葉；ＰＣは、原始羊膜腔；ＶＥは、内臓外胚葉。
【図６】 ｈＬＩＦは、培養中におけるＥＰＬ細胞の維持に必要である。ＥＳ細胞は、以
下を含有するＤＭＥＭ中で２５０細胞／ｃｍ2の密度で播種された：５０％ＭＥ
ＤＩＩまたは５０％ＭＥＤＩＩ＋ｍＬＩＦ（１０００単位／ｍｌ）、ｈＬＩＦ（
１０００単位／ｍｌ）、抗ｈＬＩＦ抗体（１０μｇ／ｍｌ）、ｈＬＩＦ（１００
０単位／ｍｌ）および抗ｈＬＩＦ抗体（１０μｇ／ｍｌ）、ｍＬＩＦ（１０００
単位／ｍｌ）および抗ｈＬＩＦ抗体（１０μｇ／ｍｌ）、抗ｇｐ１３０抗体（１
０μｇ／ｍｌ）、またはｈＬＩＦ（１０００単位／ｍｌ）および抗ｇｐ１３０抗
体（１０μｇ／ｍｌ）。培養５日後、コロニーはアルカリホスファターゼについ
て染色され、そしてＥＰＬ細胞含有コロニー（ＥＰＬ）および分化したコロニー
（Ｄ）のパーセンテージが決定された。それぞれの状態についてのプレーティン
グ効率（％）は、３２．５＋／−１．５（５０％ＭＥＤＩＩ）；３９．８＋／−
１．３（５０％ＭＥＤＩＩ＋ｍＬＩＦ）；３５．０＋／−０．２（ＭＥＤＩＩ＋
ｈＬＩＦ）；２５．５＋／−１．０（ＭＥＤＩＩ＋抗ｈＬＩＦ抗体）；２８．８
＋／−３．８（ＭＥＤＩＩ＋ｈＬＩＦ＋抗ｈＬＩＦ抗体）；４０．０＋／−０．
５（ＭＥＤＩＩ＋ｍＬＩＦ＋抗ｈＬＩＦ抗体）；３６．８＋／−３．３（ＭＥＤ
ＩＩ＋抗ｇｐ１３０抗体）；３６．３＋／−２．３（ＭＥＤＩＩ＋ｈＬＩＦ＋抗
ｇｐ１３０抗体）であった。
【図７】 （Ａ）は、ＥＳ細胞から形成され、そして４日間、ＤＭＥＭ（ＥＢ，ｉ）また
はＤＭＥＭ；ＭＥＤＩＩ（ＥＢＭ，ｉｉ）において増殖された凝集物のヘマトキ
シリン：エオシンで染色した５μｍの切片。（Ｂ）：ＥＳ細胞から形成され、そ
して４日間、ＤＭＥＭ（ＥＢ，ｉ，ｉｉｉ，ｖ）またはＤＭＥＭ；ＭＥＤＩＩ（
ＥＢＭ，ｉｉ，ｉｖ，ｖｉ）において増殖された凝集物は、ホールマウントイン
サイチュハイブリダイゼーションにより、Ｏｃｔ４（ｉ，ｉｉ）、ｂｒａｃｈｙ
ｕｒｙ（ｉｉｉ，ｉｖ）およびＦｇｆ５（ｖ，ｖｉ）の発現について分析された
。
【図８】 発生の２、３および４日時点でＥＢおよびＥＢＭから単離した２０μｇの全Ｒ
ＮＡは、ノーザンブロット分析によりＦｇｆ５、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｏｃｔ４
およびｍＧＡＰの発現について分析された。Ｆｇｆ５転写物は、２．７および１
．８ｋｂ（Ｈｅｂｅｒｔら、１９９０），ｂｒａｃｈｙｕｒｙでは、２．１ｋｂ
（Ｌａｋｅ，１９９６）、Ｏｃｔ４では１．５５ｋｂ（Ｒｏｓｎｅｒら、１９９
０）そしてｍＧＡＰでは１．５ｋｂであった。
【図９】 （Ａ）は、ＥＰＬ細胞および復帰したＥＰＬ細胞のＲＮＡのノーザンブロット
分析。ＭＥＤＩＩまたはＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦの存在下で、２、４および６日間培
養した、ＥＰＬ細胞由来の、およびＬＩＦのみを含有する培地中で復帰したその
復帰した誘導体由来（２R、４R、および６R）の２０μｇの総ＲＮＡをＦｇｆ５
、Ｒｅｘ１、Ｏｃｔ４およびｍＧＡＰの発現について、ノーザンブロットにより
分析した。（Ｂ）：クローンのＥＰＬ細胞株＃１および＃２は、ｍＬＩＦおよび
５０％ＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦを含有する培地中へ、それぞれ２５０細胞／ｃｍ2お
よび５００細胞／ｃｍ2の密度で播種された。５日後、培養物はアルカリホスフ
ァターゼについて染色され、そしてＥＳ、ＥＰＬおよび分化したコロニーのパー
センテージが決定された。アルカリホスファターゼ陽性コロニーは、形態学に基
づいて、ＥＳ細胞コロニーおよびＥＰＬ細胞コロニーに小分割され、分化したコ
ロニー（Ｄ）は、アルカリホスファターゼ陰性であると決定された。プレーティ
ング効率（％）は、１８．４＋／−２．６２（クローン＃１、ＬＩＦ）；３４．
８＋／−４．５６（クローン＃１、５０％ＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦ）；２０．４＋／
−１．７１（クローン＃２、ＬＩＦ）；３１．１６＋／−２．９３（クローン＃
２、５０％ＭＥＤＩＩ＋ＬＩＦ）であった。
【図１０】 （Ａ）：発生の１、２、３および４日時点でＥＳ細胞（０日）およびＥＳ細胞
ＥＢから単離した２０μｇの全ＲＮＡは、ノーザンブロット分析によりＲｅｘ１
、Ｆｇｆ５、Ｏｃｔ４およびｍＧＡＰの発現について分析された。（Ｂ）：ＬＩ
Ｆ（灰色）を補充したＤＭＥＭ、またはＬＩＦ＋５０％ＭＥＤＩＩ（黒色）を補
充したＤＭＥＭ中における、ＥＢの、５、６、７および８日の単一細胞懸濁液の
培養物に由来するアルカリホスファターゼ陽性多能性細胞コロニーの数。
【図１１】 培養における胚由来原始外胚葉の維持はＭＥＤＩＩを必要とする。（Ａ）胚培
養培地（ＬＩＦ／ＣＩＶ）または胚培養培地＋５０％ＭＥＤＩＩ（ＭＥＤＩＩ／
ＣＩＶ）において、５日間培養した５．５ｄ．ｐ．ｃの胚移植片の形態学。（Ｂ
）胚培養培地＋５０％ＭＥＤＩＩにおいて、５日間培養した５．５ｄ．ｐ．ｃの
胚移植片におけるＯｃｔ４発現のインサイチュハイブリダイゼーション分析。同
じ移植片は、両方のパネルにおいてみられる。右のパネルはさらに４倍拡大して
いる。
【図１２Ａ】 （Ａ）は、マウス胚の原始外胚葉からの多能性細胞の単離および維持のために
用いるストラテジーの模式図。（Ｂ）は、単離の手順の異なる段階の代表的胚性
移植片。いくつかの異なる単離実験からの移植片が示される。
【図１２Ｂ】 （Ａ）は、マウス胚の原始外胚葉からの多能性細胞の単離および維持のために
用いるストラテジーの模式図。（Ｂ）は、単離の手順の異なる段階の代表的胚性
移植片。いくつかの異なる単離実験からの移植片が示される。
【図１３】 ５．５ｄ．ｐ．ｃ．胚の原始外胚葉（ＥＥＰＬ細胞）から単離され、そしてＳ
ＴＯフィーダー層上での長期培養において樹立された多能性細胞コロニーは、細
胞染色およびインサイチュハイブリダイゼーションにより、アルカリホスファタ
ーゼおよびＯｃｔ４の発現について分析された。
【図１４】 ＭＥＤＩＩ内の２つの可溶性因子は、ＥＳ細胞からのＥＰＬ細胞の形成の原因
である。ｓｆＭＥＤＩＩは、ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３ユニット上の限外濾過を介
して、保持画分（Ｒ）および溶出画分（Ｅ）に分離された。ＥＳ細胞は、ＬＩＦ
の存在下で、Ｅ、Ｒ、またはＥ＋Ｒを含有する培地に中に２５０細胞／ｃｍ2の
密度で播種された。５日後、培養物はアルカリホスファターゼについて染色され
、そしてＥＳ、ＥＰＬ（アルカリホスファターゼ陽性）および分化したコロニー
（アルカリホスファターゼ陰性；Ｄ）のパーセンテージが決定された。プレーテ
ィング効率（％）は、４８．４％（溶出画分）；４１．６％（保持画分）；４９
．２％（溶出画分および保持画分）；３２．８％（ｍＬＩＦ）。
【図１５】 ＥＰＬ細胞誘導性活性の低分子量成分の精製。（Ａ）：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ
１０ゲル濾過によるＥの分画。（Ｂ）：順相クロマトグラフィーによるＡからの
活性画分の分画。（Ｃ）：Ｓｕｐｅｒｄｅｘペプチドゲル濾過によるＢからの活
性画分の分画。溶出物質は、２１５ｎｍでの吸光度により決定した。クロマトグ
ラフィーの画分は、ＥＰＬ細胞誘導性活性の低分子量成分の存在についてアッセ
イされた。それぞれのクロマトグラフ下の実線は、この活性を含有する画分を示
す。
【図１６】 ｓｆＭＥＤＩＩの高分子量成分の精製（プロトコール１）。陰イオン交換クロ
マトグラフィー（Ａ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｂ）、ヘパリンア
フィニティークロマトグラフィー（Ｃ）およびＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ゲル濾過ク
ロマトグラフィー（Ｄ）を介するＲの連続した精製。タンパク質は、２８０ｎｍ
で検出された。実線棒は、生物活性を含有する画分を示す。（Ｅ）は、精製の各
段階からの活性画分の銀染色された還元ＳＤＳ １０％アクリルアミドゲル。サ
ンプルは、５μｇタンパク質（１００ＫＤ；陰イオン交換；疎水性相互作用）ま
たは２μｇタンパク質（ヘパリンアフィニティー；ゲル濾過）のいずれかを含ん
だ。
【図１７】 ｓｆＭＥＤＩＩの高分子量成分の精製（プロトコール２）。ヘパリンＳｅｐｈ
ａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂクロマトグラフィー（Ａ）、陰イオン交換クロマトグラ
フィー（Ｂ）、およびＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｃ）
によるＲの連続した精製。タンパク質は、２８０ｎｍで検出された。実線棒は、
生物活性を含有する画分を示す。（Ｄ）は、精製の各段階からの活性画分の銀染
色された還元ＳＤＳ １０％アクリルアミドゲル。サンプルは、５μｇタンパク
質（ｓｆＭＥＤＩＩ）、２μｇタンパク質（ヘパリンアフィニティー；陰イオン
交換）または１μｇタンパク質（ゲル濾過）のいずれかを含んだ。
【図１８】 ｓｆＭＥＤＩＩの高分子量成分の精製（プロトコール３）。（Ａ）は、ゼラチ
ンＳｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティークロマトグラフィーによるｓｆＭＥＤＩＩ
の精製。タンパク質は、２８０ｎｍで検出された。生物活性の溶出は、実線棒に
よって示される。（Ｂ）は、ｓｆＭＥＤＩＩからの５μｇのタンパク質、および
ゼラチンＳｅｐｈａｒｏｓｅの流出画分、および間質性細胞から１μｇの細胞性
フィブロネクチン（ｃＦＮ間質細胞）、およびｓｆＭＥＤＩＩからのゼラチンＳ
ｅｐｈａｒｏｓｅ精製した高分子量成分（ｃＦＮＳＦＭ２）の銀染色された還元
ＳＤＳ １０％アクリルアミドゲル。
【図１９】 ８７μＭのＬ−プロリンの存在下で、ヒト血漿フィブロネクチン（２μｇ／ｍ
ｌ）（Ａ）、ヒト細胞性フィブロネクチン（２μｇ／ｍｌ）（Ｂ）、およびプロ
トコール２により精製したｓｆＭＥＤＩＩの高分子量成分（２μｇ／ｍｌ）（Ｃ
）において培養されたＥＳ細胞の形態。
【図２０】 ヒト細胞フィブロネクチンに対するモノクローナル抗体（３Ｅ２，Ｓｉｇｍａ
）を用いてプローブした、精製ヒト血漿フィブロネクチン（１μｇ、０．５μｇ
）、精製ヒト細胞フィブロネクチン（１．０、０．５、０．２５μｇ）およびプ
ロトコール２により精製されたｓｆＭＥＤＩＩの高分子量の成分（１．０、０．
５、０．２５μｇ）のウエスタンブロット。タンパク質サイズマーカーの位置を
示している。
【図２１】 ＥＰＬ細胞誘導性活性の成分は、分散した細胞型および種において同定され得
る。（Ａ）は、培養において、３日後の初代成体マウス肝細胞または初代胚性ニ
ワトリ肝細胞由来の、ＤＭＥＭ＋５０％馴化培地に播種されたＥＳ細胞の形態。
（Ｂ）は、Ｈｅｐａ−１ｃ１ｃ ７細胞＋／−４０μＭ Ｌプロリン由来の、Ｄ
ＭＥＭ＋５０％馴化培地に播種されたＥＳ細胞、またはＥＮＤ−２細胞＋／−１
０μｇ細胞フィブロネクチン由来の、ＤＭＥＭ＋５０％馴化培地に播種されたＥ
Ｓ細胞の形態学。（Ｃ）は、馴化されたＤＭＥＭからの５μｇのタンパク質であ
って、１，細胞なし；２，Ｈｅｐ Ｇ２；３，Ｈｅｐ ３Ｂ；４，Ｈｅｐａ−１
ｃ１ｃ ７；５，ＥＮＤ−２；６，ＰＹＳ−２のように、１０％還元ＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動された。タンパク質は、銀染色により可視化さ
れた。矢印は細胞フィブロネクチンモノマーの位置を示す。
【図２２】 分化の４日目でのＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞ＥＢの形態学。（Ａ）は、ＥＳの
ＥＢで、（Ｂ）は、ＥＰＬのＥＢ。（Ｃ，Ｄ）：ＥＢは、は切片化され、トルイ
ジン−ブルーで染色された；（Ｃ）は、ＥＳ ＥＢ、（Ｄ）は、ＥＰＬ ＥＢ。
【図２３】 分化しているＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞のＥＢにおける多能性細胞マーカー、
Ｆｇｆ５、Ｒｅｘ１、およびＯｃｔ４の発現。ノーザンブロット分析は、分化の
示した日数の日にＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞のＥＢ由来の２０μｇの全ＲＮＡに
対して実行した。ｍＧＡＰの発現は負荷コントロールとして用いられた。
【図２４】 ＥＰＬ細胞は、ＥＢとして分化した場合、壁（ｐａｒｉｅｔａｌ）内胚葉を形
成するが内臓内胚葉は形成しない。（Ａ）２０μｇの全ＲＮＡのノーザンブロッ
ト分析により決定した分化の、１〜４日目でのＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞由来の
ＥＢにおけるＳＰＡＲＣの発現。（Ｂ，Ｃ）アンチセンスＤＩＧ標識化ＳＰＡＲ
Ｃ特異的リボプローブを用いてホールマウントインサイチュハイブリダイゼーシ
ョンに供された４日目のＥＳ細胞（Ｂ）およびＥＰＬ細胞（Ｃ）のＥＢの切片。
（Ｄ，Ｅ）アンチセンスＤＩＧ標識化ＡＦＰ特異的リボプローブを用いた４日目
のＥＳ細胞（Ｄ，Ｆ）およびＥＰＬ細胞（Ｅ）ＥＢのホールマウントインサイチ
ュハイブリダイゼーション。ＡＦＰを発現する領域は、矢印で示される。（Ｆ）
ＥＳ細胞発現の断面。
【図２５】 ＥＰＬ細胞は、ＥＢ形成の間にＥＳ細胞と混合された場合、内臓内胚葉を形成
する能力を回復する。１：１の細胞混合により形成された４日目のキメラＥＰＬ
（ＬＺ＋）：ＥＳ ＥＢは、β−ガラクトシダーゼ活性について染色され（円で
囲まれた領域内の細胞）、切片化されそして免疫組織化学によりＡＦＰタンパク
質について染色された（黒）。
【図２６】 ＥＳ細胞のＥＢに比べたＥＰＬ細胞のＥＢにおける、中胚葉誘導の増強および
促進。（Ａ）２０μｇの全ＲＮＡのノーザンブロット分析により決定した分化の
０〜４日目でのＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞のＥＢにおけるｂｒａｃｈｙｕｒｙ、
ｇｏｏｓｅｃｏｉｄおよびｍＧＡＰの発現。（Ｂ〜Ｉ）：３日目（Ｂ，Ｃ，Ｆ，
Ｇ）および４日目（Ｄ，Ｅ，Ｈ，Ｉ）での、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｂ〜Ｅ）およ
びＯｃｔ４（Ｆ−１）に特異的なアンチセンスＤＩＧ標識化リボプローブを用い
たＥＳ細胞（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）およびＥＰＬ細胞（Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ）のＥＢのホ
ールマウントインサイチュハイブリダイゼーション。
【図２７】 ＥＳ細胞のＥＢに比べたＥＰＬ細胞のＥＢにおける、拍動する心臓細胞の形成
の増強および促進。（Ａ）分化の４〜１２日の間の拍動する筋肉を示すＥＳ細胞
およびＥＰＬ細胞のＥＢのパーセンテージ。平均パーセンテージおよび標準偏差
は、それぞれの実験（ｎ＝４８）における２つの別の実験に由来した。（Ｂ）２
０μｇの全ＲＮＡのノーザンブロット分析により決定した４〜１２日目のＥＳ細
胞およびＥＰＬ細胞のＥＢにおけるＮｋｘ２．５発現。
【図２８】 ニューロンを形成するＥＰＬ細胞の能力は、用いられたインビトロ分化レジメ
に依存する。（Ａ）分化の８、１０および１２日でのニューロンを形成するＥＳ
細胞およびＥＰＬ細胞のＥＢのパーセンテージ。（Ｂ）ニューロンを含むＥＳ細
胞およびＥＰＬ細胞のＲＡ処理凝集体のパーセンテージ。平均パーセンテージお
よび標準偏差は、４つの別の実験に由来した。それぞれの実験においてｎ＝３２
。
【図２９Ａ】 ＦＧＦおよびＴＧＦβファミリーの増殖因子に応答するＥＳ細胞およびＥＰＬ
細胞の分化。（Ａ）細胞型Ａの特徴的な分化形態学を示す、ｂＦＧＦの存在下で
分化したＥＰＬ細胞コロニー。（Ｂ）５日後の、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の
存在下または非存在下におけるＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞の培養後のＥＳ細胞（
ＥＳ）、ＥＰＬ細胞（ＥＰＬ）、分化した細胞（Ｄ）ならびに混合したＥＰＬ細
胞および分化した細胞（ＳＤ）のコロニーの比率。（Ｃ）アクチビンＡの存在下
において分化したＥＰＬ細胞コロニー。これは、細胞型Ｂの分化した形態学の特
徴を示す。（Ｄ）５日後の、アクチビンＡ（１５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または
非存在下におけるＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞の培養後のＥＳ細胞（ＥＳ）、ＥＰ
Ｌ細胞（ＥＰＬ）、分化した細胞（Ｄ）ならびに混合したＥＰＬ細胞および分化
した細胞（ＳＤ）のコロニーの比率。
【図２９Ｂ】 ＦＧＦおよびＴＧＦβファミリーの増殖因子に応答するＥＳ細胞およびＥＰＬ
細胞の分化。（Ａ）細胞型Ａの特徴的な分化形態学を示す、ｂＦＧＦの存在下で
分化したＥＰＬ細胞コロニー。（Ｂ）５日後の、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の
存在下または非存在下におけるＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞の培養後のＥＳ細胞（
ＥＳ）、ＥＰＬ細胞（ＥＰＬ）、分化した細胞（Ｄ）ならびに混合したＥＰＬ細
胞および分化した細胞（ＳＤ）のコロニーの比率。（Ｃ）アクチビンＡの存在下
において分化したＥＰＬ細胞コロニー。これは、細胞型Ｂの分化した形態学の特
徴を示す。（Ｄ）５日後の、アクチビンＡ（１５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または
非存在下におけるＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞の培養後のＥＳ細胞（ＥＳ）、ＥＰ
Ｌ細胞（ＥＰＬ）、分化した細胞（Ｄ）ならびに混合したＥＰＬ細胞および分化
した細胞（ＳＤ）のコロニーの比率。
【図２９Ｃ】 ＦＧＦおよびＴＧＦβファミリーの増殖因子に応答するＥＳ細胞およびＥＰＬ
細胞の分化。（Ａ）細胞型Ａの特徴的な分化形態学を示す、ｂＦＧＦの存在下で
分化したＥＰＬ細胞コロニー。（Ｂ）５日後の、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の
存在下または非存在下におけるＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞の培養後のＥＳ細胞（
ＥＳ）、ＥＰＬ細胞（ＥＰＬ）、分化した細胞（Ｄ）ならびに混合したＥＰＬ細
胞および分化した細胞（ＳＤ）のコロニーの比率。（Ｃ）アクチビンＡの存在下
において分化したＥＰＬ細胞コロニー。これは、細胞型Ｂの分化した形態学の特
徴を示す。（Ｄ）５日後の、アクチビンＡ（１５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または
非存在下におけるＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞の培養後のＥＳ細胞（ＥＳ）、ＥＰ
Ｌ細胞（ＥＰＬ）、分化した細胞（Ｄ）ならびに混合したＥＰＬ細胞および分化
した細胞（ＳＤ）のコロニーの比率。
【図２９Ｄ】 ＦＧＦおよびＴＧＦβファミリーの増殖因子に応答するＥＳ細胞およびＥＰＬ
細胞の分化。（Ａ）細胞型Ａの特徴的な分化形態学を示す、ｂＦＧＦの存在下で
分化したＥＰＬ細胞コロニー。（Ｂ）５日後の、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の
存在下または非存在下におけるＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞の培養後のＥＳ細胞（
ＥＳ）、ＥＰＬ細胞（ＥＰＬ）、分化した細胞（Ｄ）ならびに混合したＥＰＬ細
胞および分化した細胞（ＳＤ）のコロニーの比率。（Ｃ）アクチビンＡの存在下
において分化したＥＰＬ細胞コロニー。これは、細胞型Ｂの分化した形態学の特
徴を示す。（Ｄ）５日後の、アクチビンＡ（１５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または
非存在下におけるＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞の培養後のＥＳ細胞（ＥＳ）、ＥＰ
Ｌ細胞（ＥＰＬ）、分化した細胞（Ｄ）ならびに混合したＥＰＬ細胞および分化
した細胞（ＳＤ）のコロニーの比率。
【図３０】 復帰したＥＰＬ細胞は、ＥＢとして分化した場合、ＥＳ細胞と同様の分化能力
を有する。（Ａ）：分化の１〜４日での、ＥＳ細胞、ＥＰＬ細胞およびＥＰＬR
細胞由来のＥＢにおけるＦｇｆ５およびｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現の２０μｇの
全ＲＮＡのノーザンブロット分析。（Ｂ）：分化の７〜１２日からの拍動する筋
肉を示すＥＳ細胞、ＥＰＬ細胞およびＥＰＬR細胞のＥＢのパーセンテージ（ｎ
＝３６）。（Ｃ）：分化の７〜１２日からのニューロンを形成するＥＳ細胞、Ｅ
ＰＬ細胞およびＥＰＬR細胞のＥＢのパーセンテージ（ｎ＝３６）。
【図３１】 ＥＢＭの形成を介する神経外胚葉（ｎｅｕｒｅｃｔｏｄｅｒｍ）への指向され
た多能性細胞の形成。（Ａ）ＥＳ細胞から形成され、そしてＤＭＥＭ＋５０％Ｍ
ＥＤＩＩ中で４日間、そしてさらにＤＭＥＭ＋５０％ＭＥＤＩＩ＋２０ｎｇ／ｍ
ｌ ＦＧＦ４中で３日間増殖したＥＢＭ。偽層状化上皮外観をした特有の回旋状
の細胞層が凝集物の中に形成された。（Ｂ）Ａとして増殖した凝集体は、ゼラチ
ン処理したプラスチック上に、ＤＭＥＭ＋５０％ＭＥＤＩＩ＋２０ｎｇ／ｍｌ
ＦＧＦ４中に、１６時間、播種され、そしてインサイチュハイブリダイゼーショ
ンにより、Ｏｃｔ４（ｉ）、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（ｉｉ）、Ｇｂｘ２（ｉｉｉ）
およびＳｏｘ１（ｉｖ）の発現について分析された。
【図３２】 ＥＢＭ由来の凝集物における神経外胚葉および神経幹細胞のマーカーの発現。
ＥＢＭ（４日目）は、ＤＭＥＭ＋５０％ＭＥＤＩＩ＋２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ４
中で３日間 培養され、そして８、９、および１０日目に、遺伝子発現の分析の
ために、ゼラチン上に播種された。（Ａ）Ｇｂｘ２、Ｓｏｘ１およびＳｏｘ２ア
ンチセンスプローブを用いた凝集物のインサイチュハイブリダイゼーション。（
Ｂ）ネスチンおよびＮ−Ｃａｍに対する抗体を用いた、９日目での凝集物の免疫
組織化学。
【図３３Ａ】 ＥＢＭ由来の神経外胚葉のプログラムされた形成の間の多能性細胞および神経
外胚葉マーカーの発現。（Ａ）ＥＳ細胞のＥＢ（ＩＣ＋Ｂ、４日目）、ＤＭＥＭ
＋２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ４において４日目から培養されたＥＳ細胞のＥＢ（Ｉ
Ｃ＋Ｂ／ＦＧＦ、５〜８日目）、ＥＢＭ（ＭＥＤＩＩ、４日目）およびＤＭＥＭ
＋５０％ＭＥＤＩＩ＋２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ４において４日目から培養された
ＥＢＭ（ＭＥＤＩＩ／ＦＧＦ、５〜８日目）由来の１０μｇの全ＲＮＡを、ノー
ザンブロットにより、Ｏｃｔ４、Ｆｇｆ５およびｍＧＡＰの発現について分析し
た。
【図３３Ｂ】 ＥＢＭ由来の神経外胚葉のプログラムされた形成の間の多能性細胞および神経
外胚葉マーカーの発現。（Ｂ）ＥＢＭ（４日目）およびＤＭＥＭ＋５０％ＭＥＤ
ＩＩ＋２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ４において培養されたＥＢＭ（６、７、８日目）
由来の２０μｇの全ＲＮＡに対する、Ｇｂｘ２およびＳｏｘ１についてのＲＮア
ーゼ保護。
【図３４】 インビトロにおける多能性細胞の指示された分化による中胚葉および外胚葉起
源の分化した細胞型の形成。ＥＳ細胞のＥＢ（コントロールＥＢ）およびＥＢＭ
（ＥＢＭ）から発生した個々に播種された凝集物は、（Ａ）拍動する心臓細胞（
中胚葉由来）および（Ｂ）ニューロン（外胚葉由来）の存在について８、１０、
および１２日でスコアづけされた。
【図３５】 ＭＥＤＩＩの高分子量成分は、ＥＰＬ細胞からのニューロンの形成を促進する
。１および４、ＤＭＥＭ；２および５、ＤＭＥＭ＋抗ヒトＬＩＦ抗体；３および
６、ＤＭＥＭ＋抗ヒトＬＩＦ抗体＋１００μｇ／ｍｌ Ｒにおいて培養されたＥ
ＰＬ細胞ＥＢから発生した個々に播種された凝集体は、拍動する心臓細胞（１，
２，３）およびニューロンの存在について７、８、９および１０日に評価された
。
【図３６】 懸濁液中に形成されたＥＰＬ細胞の再凝集による中胚葉の形成。トリプシン処
理され単一細胞になり、そしてＤＭＥＭ（ＩＣ＋Ｂ）＋／−１０ｎｇ／ｍｌ Ｆ
ＧＦ４または、ＤＭＥＭ＋５０％ＭＥＤＩＩ（ＭＥＤＩＩ）＋／−１０ｎｇ／ｍ
ｌ ＦＧＦ４において再凝集されたＥＢＭ（４日目）由来の２０μｇの全ＲＮＡ
を、ノーザンブロットにより、ｂｒａｃｈｙｕｒｙおよびＯｃｔ４の発現につい
て、２および４日後に分析した。４日目の、ＤＭＥＭおよびＤＭＥＭ＋５０％Ｍ
ＥＤＩＩにおける代表的凝集物を示す。
【図３７】 ＥＰＬ細胞のＥＢにおける発生期中胚葉は、造血系細胞の形成に対してプログ
ラムされ得る。ＥＳ細胞およびＥＰＬ細胞のＥＢは、マクロファージの形成を誘
導するためにＩＬ−３およびＭ−ＣＳＦを補充されたメチルセルロースにおいて
培養された。マクロファージを含む凝集物の比率は、１２、１５および１８日に
決定された。
【図３８】 多能性細胞由来の中胚葉（ＥＰＬ ＥＢ）および外胚葉（ＥＢＭ）の胚葉の指
示された形成に関する方法論の比較解析。播種された凝集物は、拍動する心臓細
胞の形成について１０日時点で、およびニューロンの形成について１２日時点で
スコアづけされた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 15/09 Ｅ 15/02 15/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ラスジェン， ジョイ オーストラリア国 5051 サウス オース トラリア， ブラックウッド， ミモザ アベニュー １ (72)発明者 レイク， ジュリー − アン オーストラリア国 5083 サウス オース トラリア， ブロードヴュー， ビーベン アヴェニュー １ (72)発明者 ワシントン， ジェニファー オーストラリア国 5031 サウス オース トラリア， セバルトン， バレンタイン ストリート 54シー Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA21 DA02 GA03 GA18 HA03 HA17 4B063 QA05 QQ08 QQ15 QQ33 QQ79 QQ80 QS36 4B065 AA91X AA93X AB01 AB05 AB06 BA08 BB01 BB19 BB23 BB34 BC01 BC41 BD14 BD18 CA24 CA44 4H045 AA10 BA10 BA11 BA12 BA13 BA17 CA40 DA01 EA20 FA72 GA22 GA23 GA26 HA02 HA05

Claims (86)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 さらなるｇｐ１３０アゴニストの存在下または非存在下で多
    能性細胞の分化、増殖および／または維持に影響を及ぼし得る、部分的または実
    質的に精製された生物学的に活性な因子であって、該因子は、プロリンおよびそ
    の機能的に等価なアナログ、プロリンを含むペプチドならびにその機能的に活性
    なフラグメントおよびアナログからなる群より選択される低分子量成分；ならび
    に生物学的活性について該低分子量成分と競合する分子；ならびに細胞外マトリ
    クスタンパク質およびそれらの機能的に活性なフラグメントまたはアナログから
    なる群より選択される高分子量成分；ならびに生物学的活性について該高分子量
    成分と競合する分子を含む、部分的または実質的に精製された生物学的に活性な
    因子。
  2. 【請求項２】 前記低分子量成分が、約５ｋＤ未満の分子量を有し、そして
    前記高分子量成分が約１０ｋより大きな分子量を有する、請求項１に記載の生物
    学的に活性な因子。
  3. 【請求項３】 前記低分子量成分が以下からなる群より選択される、請求項
    １に記載の生物学的に活性な因子： 【化１】 プロテアーゼ消化（コラゲナーゼ消化を含む）コラーゲンフラグメント；ならび
    にそれらの機能的に活性なフラグメントおよびアナログ；ならびに生物学的活性
    についてそれらと競合する分子。
  4. 【請求項４】 前記高分子量成分が、フィブロネクチンまたはその機能的に
    活性なフラグメントもしくはアナログ、あるいはラミニンまたはその機能的に活
    性なフラグメントもしくはアナログである、請求項１に記載の生物学的に活性な
    因子。
  5. 【請求項５】 前記高分子量成分が、細胞性フィブロネクチンまたはその機
    能的に活性なフラグメントもしくはアナログである、請求項４に記載の生物学的
    に活性な因子。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載の生物学的に活性な因子、および該因子のた
    めのアジュバント、希釈剤またはキャリアを含む、多能性細胞の分化、増殖およ
    び／または維持に影響を及ぼし得る組成物。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載の生物学的に活性な因子を含む馴化培地を調
    製する方法であって、該方法は、 以下を提供する工程： 肝細胞または肝癌細胞、肝細胞株または肝癌細胞株、胚外内胚葉細胞およ
    び胚外内胚葉細胞株からなる群より選択される細胞、ならびに 細胞培養培地、 細胞培養培地中で馴化培地を生成するに十分な時間にわたり該細胞を培養する
    工程；ならびに 該培養培地から該細胞を分離して、該馴化培地を提供する工程、 を包含する、方法。
  8. 【請求項８】 前記細胞または細胞株が、ヒトもしくはマウスの肝細胞癌腫
    細胞株、初代胚性マウス肝細胞、初代成体マウス肝細胞、初代ニワトリ肝細胞、
    および胚外内胚葉細胞もしくは胚外内胚葉細胞株からなる群より選択される、請
    求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記細胞または細胞株が、ヒト肝細胞癌腫細胞株Ｈｅｐ Ｇ
    ２（ＡＴＣＣ ＨＢ−８０６５）、マウス肝細胞癌腫細胞株Ｈｅｐａ １ｃ１ｃ
    −７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０２６）、内臓内胚葉細胞株ＥＮＤ−２および壁内
    胚葉細胞株ＰＹＳ−２からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記細胞または細胞株が、ヒト肝細胞癌腫細胞株Ｈｅｐ
    Ｇ２（ＡＴＣＣ ＨＢ−８０６５）である、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１に記載の生物学的に活性な因子を含む、多能性細
    胞の分化、増殖および／または維持に影響を及ぼし得る馴化培地。
  12. 【請求項１２】 請求項１に記載の生物学的に活性な因子を含む細胞外マト
    リクスを調製するための方法であって、該方法は、 以下を提供する工程： 肝細胞または肝癌細胞、肝細胞株または肝癌細胞株、胚外内胚葉細胞およ
    び胚外内胚葉細胞株からなる群より選択される細胞、 支持体基材、ならびに 細胞培養培地； 細胞培養培地中で細胞外マトリクスを生成するに十分な時間にわたり支持体基
    材の存在下で該細胞を培養する工程；ならびに 該支持体基材から該細胞および該細胞培養培地を分離して、該細胞外マトリク
    スを提供する工程、 を包含する、方法。
  13. 【請求項１３】 前記細胞または細胞株が、ヒトもしくはマウスの肝細胞癌
    腫細胞株、初代胚性マウス肝細胞、初代成体マウス肝細胞、初代ニワトリ肝細胞
    、およびヒトもしくはマウスの胚外内胚葉細胞および胚外内胚葉細胞株からなる
    群より選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記細胞または細胞株が、ヒト肝細胞癌腫細胞株Ｈｅｐ Ｇ２（ＡＴＣＣ ＨＢ−８０６５）、マウス肝細胞癌腫細胞株Ｈｅｐａ １ｃ１
    ｃ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０２６）からなる群より選択される、請求項１３
    に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記細胞または細胞株が、ヒト肝細胞癌腫細胞株Ｈｅｐ Ｇ２（ＡＴＣＣ ＨＢ−８０６５）である、請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１に記載の生物学的に活性な因子を含む、多能性細
    胞の分化、増殖および／または維持に影響を及ぼし得る細胞外マトリクス。
  17. 【請求項１７】 多能性細胞の分化、増殖および／または維持に影響を及ぼ
    し得る生物学的に活性な因子の高分子量成分を部分的または実質的に精製するた
    めの方法であって、該方法は、 以下を提供する工程： 該高分子量成分の供給源、 ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー支持体、 アニオン交換クロマトグラフィー支持体、および ゲル濾過クロマトグラフィー支持体； 該高分子量成分の供給源と、該ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー支
    持体とを接触させて、第１の画分を生成する工程； 該第１の画分と、該アニオン交換クロマトグラフィー支持体とを接触させて、
    第２の画分を生成する工程；ならびに 該第２の画分と、該ゲル濾過クロマトグラフィー支持体とを接触させて、該部
    分的または実質的に精製された高分子量成分を生成する工程、 を包含する、方法。
  18. 【請求項１８】 前記高分子量供給源が、請求項１に記載の部分的に精製さ
    れた生物学的に活性な因子、請求項１１に記載の馴化培地、または請求項１６に
    記載の細胞外マトリクスである、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー支持体が
    、ヘパリンｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラムであり、そして前記ゲル濾過
    支持体が、ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ゲル濾過カラムである、請求項１８に記載の方
    法。
  20. 【請求項２０】 多能性細胞の分化、増殖および／または維持に影響を及ぼ
    し得る生物学的に活性な因子の高分子量成分を部分的または実質的に精製するた
    めの方法であって、該方法は、 以下を提供する工程： 該高分子量成分の供給源、 限外濾過膜、 アニオン交換クロマトグラフィー支持体、 疎水性相互作用クロマトグラフィー支持体、 ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー支持体、および ゲル濾過クロマトグラフィー支持体； 該高分子量成分の供給源と、該限外濾過膜とを接触させて、約１０ｋＤより大
    きな成分を有する画分を得る工程； 該約１０ｋＤより大きな成分を有する画分と、該アニオン交換クロマトグラフ
    ィー支持体とを接触させて、第１の画分を得る工程； 該第１の画分と、該疎水性相互作用クロマトグラフィー支持体とを接触させて
    、第２の画分を生成する工程； 該第２の画分と、該ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー支持体とを接触
    させて、第３の画分を生成する工程；ならびに 該第３の画分と、該ゲル濾過クロマトグラフィー支持体とを接触させて、該部
    分的または実質的に精製された高分子量成分を生成する工程、 を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 前記高分子量供給源が、請求項１に記載の部分的に精製さ
    れた生物学的に活性な因子、請求項１１に記載の馴化培地、または請求項１６に
    記載の細胞外マトリクスである、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記限外濾過膜が、Ａｍｉｃｏｎ ＤｉａＦｌｏ ＹＭ１
    ０メンブレンであり、前記アニオン交換クロマトグラフィー支持体が、Ｓｅｐｈ
    ａｒｏｓｅ Ｑアニオン交換カラムであり、該疎水性相互作用クロマトグラフィ
    ー支持体が、フェニルセファロース疎水性相互作用カラムであり、前記ヘパリン
    アフィニティークロマトグラフィー支持体がヘパリンｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ
    −６Ｂカラムであり、そして前記ゲル濾過クロマトグラフィー支持体がｓｕｐｅ
    ｒｏｓｅ ６ゲル濾過カラムである、請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 多能性細胞の分化、増殖および／または維持に影響を及ぼ
    し得る生物学的に活性な因子の高分子量成分を部分的または実質的に精製するた
    めの方法であって、該方法は、 以下を提供する工程： 該高分子量成分の供給源、 ゼラチンアフィニティークロマトグラフィー支持体、および 透析システム； 該高分子量成分の供給源と、該ゼラチンアフィニティークロマトグラフィー支
    持体とを接触させて、第１の画分を得る工程；ならびに 該第１の画分を透析に供して、該部分的または実質的に精製された高分子量成
    分を生成する工程、 を包含する、方法。
  24. 【請求項２４】 前記高分子量供給源が、請求項１に記載の部分的に精製さ
    れた生物学的に活性な因子、請求項１１に記載の馴化培地、または請求項１６に
    記載の細胞外マトリクスである、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記ゼラチンアフィニティークロマトグラフィー支持体が
    ゼラチンセファロースアフィニティークロマトグラフィー支持体である、請求項
    ２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 多能性細胞の分化、増殖および／または維持に影響を及ぼ
    し得る生物学的に活性な因子の低分子量成分を部分的または実質的に精製するた
    めの方法であって、該方法は、 以下を提供する工程： 該低分子量成分の供給源、 限外濾過膜、 第１のゲル濾過クロマトグラフィー支持体 順相クロマトグラフィー支持体、および 第２のゲル濾過クロマトグラフィー支持体； 該低分子量成分の供給源と、該限外濾過膜とを接触させて、約３ｋＤ未満の成
    分を有する画分を得る工程； 該約３ｋＤ未満の成分を有する画分と、該第１のゲル濾過クロマトグラフィー
    支持体とを接触させて、第１の画分を得る工程； 該第１の画分と、該順相クロマトグラフィー支持体とを接触させて、第２の画
    分を生成する工程；ならびに 該第２の画分と、該第２のゲル濾過クロマトグラフィー支持体とを接触させて
    、該部分的または実質的に精製された低分子量成分を生成する工程、 を包含する、方法。
  27. 【請求項２７】 前記低分子量供給源が、請求項１に記載の部分的に精製さ
    れた生物学的に活性な因子、または請求項１１に記載の馴化培地である、請求項
    ２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記限外濾過膜が、Ａｍｉｃｏｎ ＤｉａＦｌｏ ＹＭ３
    メンブレンであり、前記第１のゲル濾過クロマトグラフィー支持体が、セファロ
    ースゲル濾過クロマトグラフィー支持体であり、そして前記第２のゲル濾過クロ
    マトグラフィー支持体が、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ペプチドゲル濾過クロマトグラフ
    ィー支持体である、請求項２６に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 初期原始外胚葉様（ＥＰＬ）細胞を生成および／または維
    持する方法であって、該方法は、 以下を提供する工程： 多能性細胞、および 請求項１に記載の生物学的に活性な因子；または 請求項１１に記載の馴化培地；または 請求項１６に記載の細胞外マトリクス；ならびに さらなるｇｐ１３０アゴニストの存在下または非存在下で、該多能性細胞と、
    該生物学的に活性な因子または該馴化培地または該細胞外マトリクスとを接触さ
    せて、該ＥＰＬ細胞を生成または維持する工程、 を包含する、方法。
  30. 【請求項３０】 前記多能性細胞が、胚幹（ＥＳ）細胞、インビボまたはイ
    ンビトロで誘導されたＩＣＭ／原外胚葉、インビボまたはインビトロで誘導され
    た原始外胚葉、原始生殖細胞、ＥＧ細胞、奇形癌細胞、ＥＣ細胞、ならびに分化
    および／または核移植により得られた多能性細胞からなる群より選択される、請
    求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記低分子量成分が、以下からなる群より選択される、請
    求項２９に記載の方法： 【化２】 プロテアーゼ消化（コラゲナーゼ消化を含む）コラーゲンフラグメント；ならび
    にそれらの機能的に活性なフラグメントおよびアナログ；ならびに生物学的活性
    についてそれらと競合する分子。
  32. 【請求項３２】 前記高分子量成分が、フィブロネクチンまたはその機能的
    に活性なフラグメントもしくはアナログ、あるいはラミニンまたはその機能的に
    等価なフラグメントもしくはアナログである、請求項２９に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記高分子量成分が、細胞性フィブロネクチンまたはその
    機能的に等価なフラグメントもしくはアナログである、請求項３２に記載の方法
    。
  34. 【請求項３４】 前記多能性細胞が、さらなるｇｐ１３０アゴニストの存在
    下で、前記生物学的に活性な因子、または前記馴化培地、または前記細胞外マト
    リクスと接触される、請求項２９に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記生物学的に活性な因子、または前記馴化培地、または
    前記細胞外マトリクスが、ヒトもしくはマウスの肝細胞癌腫細胞株、初代胚性マ
    ウス肝細胞、初代成体マウス肝細胞、初代ニワトリ肝細胞、および胚外内胚葉細
    胞もしくは胚外内胚葉細胞株からなる群より選択される細胞または細胞株から生
    成される、請求項２９に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記細胞または細胞株が、ヒト肝細胞癌腫細胞株Ｈｅｐ Ｇ２（ＡＴＣＣ ＨＢ−８０６５）、マウス肝細胞癌腫細胞株Ｈｅｐａ １ｃ１
    ｃ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０２６）、内臓内胚葉細胞株ＥＮＤ−２および壁
    内胚葉細胞株ＰＹＳ−２からなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記細胞または細胞株が、ヒト肝細胞癌腫細胞株Ｈｅｐ Ｇ２（ＡＴＣＣ ＨＢ−８０６５）である、請求項３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 ＥＰＬ細胞を、好ましくは、Ｏｃｔ４およびＦｇｆ５の発
    現によって同定する工程を包含する、請求項２９に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記ＥＰＬ細胞が、哺乳動物またはトリである、請求項２
    ９に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 培養されたＥＰＬ細胞。
  41. 【請求項４１】 哺乳動物またはトリである、請求項４０に記載の細胞。
  42. 【請求項４２】 部分的に分化した細胞および／または最終分化した細胞を
    生成する方法であって、該方法は、 以下を提供する工程： 多能性細胞、および 請求項１に記載の生物学的に活性な因子；または 請求項１１に記載の馴化培地；または 請求項１６に記載の細胞外マトリクス；および さらなるｇｐ１３０アゴニストの存在下または非存在下で、該多能性細胞と、
    該生物学的に活性な因子または該馴化培地または該細胞外マトリクスとを接触さ
    せて、該ＥＰＬ細胞を生成する工程、ならびに 該生物学的に活性な因子またはその高分子量成分もしくは低分子量成分、また
    は該馴化培地、または該細胞外マトリクスの存在下または非存在下で、および１
    つ以上の分化因子の存在下または非存在下で、該ＥＰＬ細胞を培養して、部分的
    に分化した細胞および／または最終分化した細胞を生成する工程、 を包含する、方法。
  43. 【請求項４３】 前記多能性細胞が、胚幹（ＥＳ）細胞、インビボまたはイ
    ンビトロで誘導されたＩＣＭ／原外胚葉、インビボまたはインビトロで誘導され
    た原始外胚葉、原始生殖細胞、ＥＧ細胞、奇形癌細胞、ＥＣ細胞、ならびに分化
    および／または核移植により得られた多能性細胞からなる群より選択される、請
    求項４２に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記低分子量成分が、以下からなる群より選択される、請
    求項４２に記載の方法： 【化３】 プロテアーゼ消化（コラゲナーゼ消化を含む）コラーゲンフラグメント；ならび
    にそれらの機能的に活性なフラグメントおよびアナログ；ならびに生物学的活性
    についてそれらと競合する分子。
  45. 【請求項４５】 前記高分子量成分が、フィブロネクチンまたはその機能的
    に活性なフラグメントもしくはアナログ、あるいはラミニンまたはその機能的に
    活性なフラグメントもしくはアナログである、請求項４２に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 前記高分子量成分が、細胞性フィブロネクチンまたはその
    機能的に活性なフラグメントもしくはアナログである、請求項４５に記載の方法
    。
  47. 【請求項４７】 部分的に分化した細胞および／または最終分化した細胞を
    、細胞表面マーカーの発現、形態、および／または分化能力によって同定する工
    程をさらに包含する、請求項４２に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 前記部分的に分化した細胞および／または最終分化した細
    胞が、哺乳動物またはトリである、請求項４２に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記ＥＰＬ細胞が、前記生物学的に活性な因子、またはそ
    の高分子量成分もしくは低分子量成分、または前記馴化培地、または前記細胞外
    マトリクスの存在下で、好ましくは、ＦＧＦファミリー由来の増殖因子の存在下
    で懸濁物中で培養され；そして前記部分的に分化した細胞および／または最終分
    化した細胞が、優勢に外胚葉胚葉細胞、優勢に部分的に分化した外胚葉、優勢に
    神経外胚葉もしくは優勢に神経幹細胞および／または優勢に最終分化した皮膚も
    しくはニューロン細胞を含む、請求項４２に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 前記ＥＰＬ細胞が、前記生物学的に活性な因子、またはそ
    の高分子量成分もしくは低分子量成分、または前記馴化培地、または前記細胞外
    マトリクスの非存在下で懸濁物中で培養され、そして前記部分的に分化した細胞
    および／または最終分化した細胞が、優勢に中胚葉胚葉細胞、優勢に部分的に分
    化した細胞および／または優勢に最終分化した発生期中胚葉細胞（例えば、血球
    および筋細胞）を含む、請求項４２に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 懸濁物中で形成された前記ＥＰＬ細胞が、前記生物学的に
    活性な因子または前記その高分子量成分もしくは前記低分子量成分、または前記
    馴化培地、または前記細胞外マトリクスの非存在下で、好ましくは、ＦＧＦファ
    ミリー由来の増殖因子の存在下で、解離し、そして再凝集し、そして該細胞なら
    びに部分的に分化した細胞および／または最終分化した細胞が、優勢に中胚葉胚
    葉細胞、優勢に部分的に分化した細胞および／または優勢に最終分化した発生期
    中胚葉細胞（例えば、血球および筋細胞）を含む、請求項４２に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 前記ＥＰＬ細胞が、前記生物学的に活性な因子または前記
    その高分子量成分もしくは前記低分子量成分、または前記馴化培地、または前記
    細胞外マトリクスの非存在下で、ＦＧＦファミリー由来の増殖因子およびＴＧＦ
    βファミリー由来の増殖因子の存在下で、接着培養で培養され、そして該細胞が
    分化される、請求項４２に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 内臓内胚葉の非存在下で多能性細胞を分化させる、請求項
    ５０または５１に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 請求項４９に記載の多能性細胞の分化によって、優勢に外
    胚葉細胞、優勢に神経外胚葉細胞、ならびに優勢に部分的に分化した細胞および
    ／または最終分化した神経外胚葉細胞を生成する方法。
  55. 【請求項５５】 請求項５０または５１に記載の多能性細胞の分化によって
    、優勢に最初期または発生期中胚葉細胞、ならびに優勢に部分的に分化した細胞
    および／または最終分化した中胚葉細胞を生成する方法。
  56. 【請求項５６】 請求項４２または５４に記載の方法によって生成された、
    神経外胚葉細胞、部分的に分化した神経外胚葉細胞または神経幹細胞または最終
    的に分化した神経細胞。
  57. 【請求項５７】 請求項４２、５０、５１または５５に記載の方法によって
    生成された、中胚葉胚葉細胞、および部分的に分化した中胚葉細胞または最終分
    化した中胚葉細胞（例えば、筋細胞または血球）。
  58. 【請求項５８】 請求項４２または５４に記載の方法によって生成された、
    外胚葉胚葉細胞、部分的に分化した外胚葉細胞、または最終分化した外胚葉細胞
    （例えば、皮膚細胞）。
  59. 【請求項５９】 胚幹（ＥＳ）細胞を生成する方法であって、該方法は、 以下を提供する工程： 多能性細胞、 請求項１に記載の生物学的に活性な因子；または 請求項１１に記載の馴化培地；または 請求項１６に記載の細胞外マトリクス；および ｇｐ１３０アゴニスト； 該多能性細胞と、該生物学的に活性な因子、または該馴化培地、または該細胞
    外マトリクスとを、さらなるｇｐ１３０アゴニストの存在下または非存在下で接
    触させて、ＥＰＬ細胞を生成する工程；ならびに 該ＥＰＬ細胞と、該ｇｐ１３０アゴニストとを、該生物学的に活性な因子、ま
    たは前記その高分子量成分もしくは低分子量成分、または該馴化培地、または該
    細胞外マトリクスの成分の非存在下で接触させて、該ＥＰＬ細胞がＥＳ細胞へ復
    帰することを可能とする工程、 を包含する、方法。
  60. 【請求項６０】 前記多能性細胞が、胚幹（ＥＳ）細胞、インビボまたはイ
    ンビトロで誘導されたＩＣＭ／原外胚葉、インビボまたはインビトロで誘導され
    た原始外胚葉、原始生殖細胞、ＥＧ細胞、奇形癌細胞、ＥＣ細胞、ならびに分化
    および／または核移植により得られた多能性細胞からなる群より選択される、請
    求項５９に記載の方法。
  61. 【請求項６１】 前記低分子量成分が以下からなる群より選択される、請求
    項５９に記載の方法： 【化４】 プロテアーゼ消化（コラゲナーゼ消化を含む）コラーゲンフラグメント；ならび
    にそれらの機能的に活性なフラグメントおよびアナログ；ならびに生物学的活性
    についてそれらと競合する分子。
  62. 【請求項６２】 前記高分子量成分が、フィブロネクチンまたはその機能的
    に活性なフラグメントもしくはアナログ、あるいはラミニンまたはその機能的に
    活性なフラグメントもしくはアナログである、請求項５９に記載の方法。
  63. 【請求項６３】 前記高分子量成分が、細胞性フィブロネクチンまたはその
    機能的に活性なフラグメントもしくはアナログである、請求項６２に記載の方法
    。
  64. 【請求項６４】 前記ＥＳ細胞が哺乳動物またはトリである、請求項５９に
    記載の方法。
  65. 【請求項６５】 前記ＥＳ細胞を分化させて、部分的に分化した細胞または
    最終分化した細胞を生成する工程をさらに包含する、請求項５９に記載の方法。
  66. 【請求項６６】 請求項５９に記載の方法によって生成されるＥＳ細胞。
  67. 【請求項６７】 哺乳動物またはトリである、請求項６６に記載の細胞。
  68. 【請求項６８】 遺伝的に改変されたＥＳ細胞を生成する方法であって、該
    方法は、 以下を提供する工程： 多能性細胞、 請求項１に記載の生物学的に活性な因子；または 請求項１１に記載の馴化培地；または 請求項１６に記載の細胞外マトリクス；および ｇｐ１３０アゴニスト； 該多能性細胞と、該生物学的に活性な因子、または該馴化培地、または該細胞
    外マトリクスとを、さらなるｇｐ１３０アゴニストの存在下または非存在下で接
    触させて、ＥＰＬ細胞を生成する工程； 該ＥＰＬ細胞における１つ以上の遺伝子を改変する工程；ならびに 該遺伝的に改変されたＥＰＬ細胞と、該ｇｐ１３０アゴニストとを、該生物学
    的に活性な因子、または前記その高分子量成分もしくは低分子量成分、または該
    馴化培地、または該細胞外マトリクスの成分の非存在下で接触させて、該遺伝的
    に改変したＥＰＬ細胞がＥＳ細胞へ復帰することを可能とする工程、 を包含する、方法。
  69. 【請求項６９】 遺伝的に改変されたＥＰＬ細胞を生成する方法であって、
    該方法は、 以下を提供する工程： 多能性細胞、 請求項１に記載の生物学的に活性な因子；または 請求項１１に記載の馴化培地；または 請求項１６に記載の細胞外マトリクス；および ｇｐ１３０アゴニスト； 該多能性細胞における１つ以上の遺伝子を改変する工程；ならびに 該遺伝的に改変された多能性細胞と、該生物学的に活性な因子、または該馴化
    培地、または該細胞外マトリクスとを、さらなるｇｐ１３０アゴニストの存在下
    または非存在下で接触させて、該遺伝的に改変されたＥＰＬ細胞を生成する工程
    、 を包含する、方法。
  70. 【請求項７０】 前記多能性細胞が、胚幹（ＥＳ）細胞、請求項５９に記載
    のＥＳ細胞、インビボまたはインビトロで誘導されたＩＣＭ／原外胚葉、インビ
    ボまたはインビトロで誘導された原始外胚葉、原始生殖細胞、ＥＧ細胞、奇形癌
    細胞、ＥＣ細胞、ならびに分化または核移植により得られた多能性細胞からなる
    群より選択される、請求項６９に記載の方法。
  71. 【請求項７１】 請求項２９に記載のＥＰＬ細胞を生成する工程、および該
    ＥＰＬ細胞を遺伝的に改変する工程を包含する、遺伝的に改変されたＥＰＬ細胞
    を生成する方法。
  72. 【請求項７２】 遺伝的に改変された、部分的に分化した細胞または最終分
    化した細胞を生成する方法であって、該方法は、 以下を提供する工程： 多能性細胞、 請求項１に記載の生物学的に活性な因子；または 請求項１１に記載の馴化培地；または 請求項１６に記載の細胞外マトリクス；および ｇｐ１３０アゴニスト； 該多能性細胞と、該生物学的に活性な因子、または該馴化培地、または該細胞
    外マトリクスとを、さらなるｇｐ１３０アゴニストの存在下または非存在下で接
    触させて、ＥＰＬ細胞を生成する工程； 該ＥＰＬ細胞における１つ以上の遺伝子を改変する工程；ならびに 該ＥＰＬ細胞を分化させて、遺伝的に改変された、部分的に分化した細胞また
    は最終分化した細胞を生成する工程、 を包含する、方法。
  73. 【請求項７３】 請求項４２に記載の部分的に分化した細胞または最終分化
    した細胞を調製する工程を包含する、遺伝的に改変された、部分的に分化した細
    胞または最終分化した細胞を生成する方法。
  74. 【請求項７４】 請求項６８に記載の方法によって生成される、遺伝的に改
    変されたＥＳ細胞。
  75. 【請求項７５】 請求項６９または７０に記載の方法によって生成される、
    遺伝的に改変されたＥＰＬ細胞。
  76. 【請求項７６】 請求項７１または７２に記載の方法によって生成された、
    遺伝的に改変された、部分的に分化した細胞または最終分化した細胞。
  77. 【請求項７７】 キメラ動物を生成する方法であって、該方法は、 以下を提供する工程： 請求項６２に記載のＥＳ細胞または請求項７３に記載の遺伝的に改変され
    たＥＳ細胞、および 前原腸形成胚； 該ＥＳ細胞または遺伝的に改変されたＥＳ細胞を、該前原腸形成胚に導入する
    工程；ならびに キメラ形成能力をモニタリングする工程、 を包含する、方法。
  78. 【請求項７８】 請求項７７に記載の方法によって生成される、キメラ動物
    またはトランスジェニック動物。
  79. 【請求項７９】 請求項４０もしくは４１に記載の改変されていないＥＰＬ
    細胞、または請求項７６に記載のそれらの分化した子孫を、ヒト細胞治療または
    トランスジェニック動物生成における使用のために使用する、方法。
  80. 【請求項８０】 請求項７５に記載の遺伝的に改変されたＥＰＬ細胞、また
    は請求項７６に記載のそれらの分化した子孫を、ヒト遺伝子治療またはトランス
    ジェニック動物生成における使用のために使用する、方法。
  81. 【請求項８１】 核移植細胞を調製する方法であって、該方法は、 以下を提供する工程： ＥＰＬ細胞、またはＥＰＬ由来の部分的に分化した細胞もしくは十分に分
    化した細胞、および 除核されたレシピエント細胞； ＥＰＬ細胞またはＥＰＬ細胞由来の部分的に分化した細胞もしくは十分に分化
    した細胞、あるいはこれらの細胞由来の核を、除核されたレシピエントに移植す
    る工程；ならびに 合わされた細胞を融合および活性化して、核移植細胞を形成する工程、 を包含する、方法。
  82. 【請求項８２】 前記除核されたレシピエント細胞が、卵母細胞、単一の細
    胞胚または他の多能性細胞である、請求項８１に記載の方法。
  83. 【請求項８３】 核移植細胞を誘導する方法であって、該方法は、 以下を提供する工程： 細胞、 除核されたレシピエントＥＰＬ細胞またはＥＰＬ細胞由来の除核された細
    胞； 該細胞を、該除核されたＥＰＬ細胞またはＥＰＬ細胞由来の除核された細胞に
    移植する工程； 合わされた細胞を融合および活性化して、核移植細胞を形成する工程、 を包含する、方法。
  84. 【請求項８４】請求項８１および８３に記載の方法に従って誘導された核移
    植細胞。
  85. 【請求項８５】 請求項８４に記載の核移植細胞から誘導された哺乳動物お
    よびトリ。
  86. 【請求項８６】 請求項８４に記載の核移植細胞から誘導された多能性細胞
    。
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