본 발명은 인간의 모유에서 분리한 유산균인 락토바실러스 가제리 BNR17을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 식품 또는 약제학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명자들은 모유에서 분리한 “락토바실러스 가제리 BNR17” 균주를 2006년 1월 23일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 10902BP, 대한민국 특허출원 제2007-7011080호 참조).
상기 락토바실러스 가세리 BNR17 유산균은 내산성과 내담즙성 및 항균활성이 우수하므로, 다양한 유산균 발효유 및 발효 제품을 생산하기 위한 종균으로 사용할 수 있으며, 이때 상기 발효유 식품으로는 요구르트, 칼피스, 치즈, 버터 등을 들 수 있고, 발효 제품으로는 두부, 된장, 청국장, 젤리, 김치 등을 들 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 발효유 및 발효 제품은 통상적인 제조 방법에서 균주만을 본 발명의 유산균 균주로 대체함으로써 용이하게 제조할 수 있다.
상기와 같이 본 발명의 조성물은 식품 또는 식품용 첨가제일 수 있고 식품은 바람직하게는 발효 식품이다. 또한, 본 발명의 조성물은 분말 또는 과립형태일 수 있고 분말 또는 과립형태는 당업계에서 통상의 방법으로 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 당뇨 유발 동물을 대상으로 실험을 실시한 결과 락토바실러스 가세리 BNR17 투여군은 대조군에 비해 20% 이상 혈당이 강 하되고(도 6 참조), 당 내성시험에서도 대조군에 비해 50% 정도 수준으로 뛰어난 혈당강하 효과를 보인다(도 7 참조). 또한, 1일 급이량 및 음수량은 대조군에 비해 BNR17 투여군에서 각각 20%, 40% 이상의 감소효과를 나타내며(도 3 및 도 4, 참조), 뇨 배설 및 분변량은 50% 이상의 감소효과를 보인다(도 5 참조).
본 발명의 또다른 실시예에 따르면, 다양한 농도의 락토바실러스 가세리 BNR17 투여군, 경구용 혈당강하제 투여군을 추가하여 실험한 경우에도, 락토바실러스 가세리 BNR17 투여군은 투여량이 많아질수록 체중 감소가 적어지고(도 9 참조) 급이량, 음수량 및 분변량의 감소 현상이 관찰되었다(도 10, 도 11 및 도 12 참조). 또한, BNR17 투여량이 커질수록 혈당 증가가 적었고 식전 및 식후 혈당이 대조군에 비해 최대 30% 감소되었다(도 13 및 도 14 참조).
이러한 결과는 락토바실러스 가세리 BNR17 유산균이 당뇨병의 대표적인 증상인 다식, 다음 및 다뇨 현상을 개선시켜주고, 난소화성 다당류 생성능이 당뇨병의 예방 및 치료를 위해 사용될 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 유산균 식품을 제조함에 있어서, 상기 락토바실러스 가세리 BNR17은 허용 가능한 담체와 함께 독립적으로 또는 타 성분과 함께 첨가되어 사용되거나, 인간 또는 동물이 섭취하기에 적합한 조성물 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 유산균은 다른 프로바이오틱 세균을 함유하지 않은 식품 및 이미 몇 가지 프로바이오틱 세균을 함유한 식품에 첨가되어 사용될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 유산균 식품을 제조함에 있어서, 상기 락토바실러스 가세리 BNR17 유산균과 함께 사용 가능한 다른 미생물로는 인간이나 동물이 섭취하기에 적합하고, 섭취시 병원 성 유해세균을 억제하거나 포유동물 장관 내의 미생물 균형을 개선시킬 수 있는 프로바이오틱 활성을 갖는 것이면 제한 없이 사용될 수 있다. 그러한 프로바이오틱 미생물의 예로는 사카로미세스(Saccharomyces), 칸디다(Candida), 피치아(Pichia) 및 토룰롭시스(Torulopsis)를 포함하는 효모(yeast), 아스퍼질러스(Aspergillus), 리조퍼스(Rhizopus), 뮤코(Mucor), 페니실린(Penicillium) 등과 같은 곰팡이 및 락토바실러스(Lactobacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 류코노스톡(Leuconostoc), 락토코커스(Lactococcus), 바실러스(Bacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 그로피오니박테리움(Propionibacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 페디오코커스(Pediococcus) 속에 속하는 세균 등이 있다. 적당한 프로바이오틱 미생물의 구체적인 예로는 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 론검(Bifidobacterium longum), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 델브루키(Lactobacillus delbruckii), 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 파시미누스(Lactobacillus farciminus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici) 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 우수한 프로바이오틱 활성을 가지면서 면역활성 증강 및 항암작용이 뛰어난 프로바이오틱 미생물 혼합균을 본 발명의 당뇨병 예방 또는 치료용 유산균 식품에 추가로 포함함으로써 그 효과를 더욱 증진시킬 수 있다. 본 발명의 유산균 식품에 함유될 수 있는 담체의 예로는 증량제, 고섬유 첨가제, 캡슐화제, 지질 등이 있으며, 이러한 담체들의 예는 당업계에 충분히 공지되어 있다. 본 발명의 조성물의 유효성분인 락토바실러스 가세리 BNR17은 동결건조되거나 캡슐화된 형태, 배양 현탁액, 건조분말 또는 과립 형태일 수 있다.
또한, 본 발명은 유효량의 락토바실러스 가세리 BNR17(기탁번호: KCTC 10902BP)와 허용가능한 담체를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 락토바실러스 가세리 BNR17 유산균은 통상적으로 투여 경로에 따라 선택되는 약제학적 담체 및 부형제, 또는 보조 유효 성분 등과의 혼합에 의해 얻어지는 정제 또는 캡슐과 같은 단위 형태로 경구투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 적합한 담체, 부형제 및 희석제에는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 인산칼슘, 알긴산염, 트래거캔스 고무, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 스테아르산마그네슘 또는 광유 등이 포함된다. 본 발명의 미생물 조성물은 추가로 윤활제, 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 방부제, 감미제 또는 향미제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 위장을 통과한 뒤 소장에 도달하여 활성 성분인 미생물이 신속하게 장내에 방출되도록 장용 피복 제제로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 통상적인 캡슐화 방법을 사용하여 캡슐 형태의 조성물로 제조될 수 있다. 예를 들어, 표준 담체를 사용하여 동결 건조시킨 본 발명의 미생물을 함유하는 펠렛(pellet)을 제조한 후, 이를 경질의 젤라틴 캡슐 내에 충전시킬 수 있다. 또는, 본 발명의 미생물과 임의의 적절한 약제학적 담체, 예를 들어 수성 검, 셀룰로스, 규산염 또는 오일을 사용하여 현탁액, 분산액을 제조한 후, 이러한 분산액 또는 현탁액을 연질의 젤라틴 캡슐 내에 충전시킬 수도 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 특히, 경구용 단위 제형으로서 장용 피복된 장용성 제제로서 제공될 수 있다. 본 명세서 내에서의 "장용 피복"은 위산에 의해서는 분해되지 아니하여 피복이 유지되나, 소장에서는 충분히 분해되어 활성 성분이 소장 내에 방출될 수 있도록 하는, 약제학상 허용 가능한 모든 종류의 공지의 피복을 포함한다. 상기 "장용 피복"은 pH 1의 HCl용액과 같은 인공 위즙을 36℃ 내지 38℃에서 접촉시킬 때, 2시간 이상 그대로 유지되며, 바람직하게는 이후에 pH 6.8 의 KH2PO4 완충 용액과 같은 인공 장즙에서 30분 이내에 분해되는 피복을 지칭한다.
상기 장용 피복은 바람직하게는 1개의 코어(core)에 약 16 내지 30, 바람직하게는 16 내지 25 ㎎ 이하의 양으로 피복된다. 상기 장용 피복은 두께가 5 내지 100 ㎛, 바람직하게는 20 내지 80 ㎛인 경우에 장용 피복으로서 만족스러운 결과를 나타낸다. 장용 피복의 재료는 공지의 고분자 물질들 중에서 적당히 선택될 수 있으며, 적당한 고분자 물질은 다수의 공지 문헌(L. Lachman 외, The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 3판, 1986, pp. 365~373; H. Sucker 외, Pharmazeutische Technologie, Thieme, 1991, pp. 355-359; Hagers Handbuch der pharmazeutischen Praxis, 4판, Vol. 7, pp. 739 ~ 742, 및 766 ~ 778, (SpringerVerlag, 1971); 및 Remington's Pharmaceutical Sciences, 13판, pp. 1689 ~ 1691 (Mack Publ., Co., 1970))에 열거되어 있고, 셀룰로즈 에스테르 유도체, 셀룰로즈 에테르, 아크릴 수지의 메틸아크릴레이트 공중합체 및 말레산 및 프탈산 유도체의 공중합체가 이들에 포함될 수 있다.
상기 장용 피복은 장용 피복 용액을 코어에 분무하는 통상적인 장용 피복법을 사용하여 제조될 수 있다. 장용 피복 공정에 사용되는 적당한 용매로는 에탄올과 같은 알콜, 아세톤과 같은 케톤, CH2Cl2 와 같은 할로겐화 탄화수소 용매를 들 수 있으며, 이들 용매들의 혼합 용매가 사용될 수도 있다. 디(di)-n-부틸프탈레이트 또는 트리아세틴과 같은 연화제를 피복용액에 첨가할 수 있는데 코팅재료 대 연화제를 1 대 약 0.05 내지 약 0.3의 비율로 피복 용액에 첨가하는 것이 바람직하 다. 분무 과정은 연속적으로 수행하는 것이 적절하며, 피복 조건을 고려하여 분무량을 조절하는 것이 가능하다. 분무압은 다양하게 조절할 수 있고, 일반적으로 약 1 내지 약 1.5 바(bar)의 분무압으로 만족할만한 결과가 얻어진다.
상기 약제학적 조성물의 "약제학적 유효량"은 포유동물의 장내에서 체내로 흡수되는 저당류의 양을 감소시킬 수 있는 미생물의 최소량을 의미하며, 본 발명의 조성물에 의하여 체내에 투여되는 미생물의 양은 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 질환의 심각도, 그리고 사용되는 미생물과 보조 유효 성분에 따라 적절하게 조정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 대상 개체에 매일 일회 이상 투여될 수 있다. 단위 투여량은 인간 피험자 및 다른 포유동물을 위한 단위 투여에 적합하도록 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 적절한 약제학적 담체 및 치료 효과를 나타내는 상기 락토바실러스 가세리 BNR17 유산균의 예정된 양을 함유한다. 성인 환자의 경구 투여용 단위로는 상기 유산균 0.1 g 이상을 함유하는 것이 바람직하며, 본 발명의 조성물 경구 투여량은 일회에 0.1 내지 10 g, 바람직하게는 0.5 내지 5 g이다. 상기 미생물의 약제학적 유효량은 0.1 내지 10 g/1일이다. 또한, 일일 총 투여량을 여러 횟수로 분할하여 필요에 따라 연속적으로 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량 범위는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 아니한다.
본 발명의 조성물을 주기적으로 복용하는 경우, 장내에 본 발명의 미생물들이 균총을 이루면서 인체가 당류를 흡수하는 것을 경쟁적으로 방해할 뿐 아니라, 단당류 형태의 탄수화물을 다당류 형태로 전환시켜 이들이 체내에서 흡수되는 것을 방지하고, 미생물이 생산한 비소화성 식이섬유가 장내 유용균의 생육조건을 좋게 하여 장운동을 자극함으로써 결과적으로 본 발명의 조성물이 당뇨병의 예방 및 치료제로 기능하게 된다.
한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 혈당강하 효과 또는 당뇨병 예방 및 치료를 극대화하기 위하여, 종래 당업자에게 공지되어 있는 임의의 경구용 혈당 강하제를 적절한 함량으로 포함할 수 있으며, 이때 첨가제의 함량 범위는 반복실험 등을 통해 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 첨가제로 유용한 성분의 바람직한 예로는 콘쥬게이트 리놀레산(conjugated linoleic acid), 폴리덱스트로즈(polydextrose), 이눌린(inulin), 구아검(guar gum), 아랍검(arabic gum), L-카르틴(carteine), 포도씨 추출물, 프럭토올리고당(fructooligosaccharide), 자일로올리고당(xylooligosaccharide), 라피노즈(raffinose), 글루콘산(gluconic acid), 샴피뇽(champignon), 폴리안토시아니딘(polyanthocyanidine), 락툴로즈(lactulose), 락티톨(lactitol), 락토수크로즈(lactosucrose), 영지버섯 추출물, 인삼(홍삼) 추출물, 돌미나리 추출물, 다시마 추출물, 뽕잎 추출물, 대추씨 추출물, 달개비풀 추출물, 양배추도라지 추출물, 참마 분획물, 누에분말 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 가세리 BNR17(기탁번호: KCTC 10902BP)을 준비하는 단계; 및 상기 락토바실러스 가세리 BNR17을 유효량만큼 식품에 첨가하는 단계를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 식품의 제조 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 락토바실러스 가세리 BNR17(기탁번호: KCTC 10902BP)을 준비하는 단계; 및 유효량의 락토바실러스 가세리 BNR17에 담체를 혼합시키는 단계를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 제조 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 모유로부터 유산균의 분리
아기를 분만한지 2주 이내의 여성의 모유를 채취하여 인산완충용액을 이용해 적절하게 희석한 후 원액과 희석액을 락토바실러스 선택배지에 도말하였다. 37℃에서 2~3일간 배양하여 나타난 콜로니들을 형태 및 색깔별로 구별하여 다시 순수분리하였다. 분리된 콜로니에 대해 그람염색 및 현미경 관찰을 실시하여 그람 양성이면서 막대형의 형태를 갖는 콜로니만 선별하였으며, 이들을 pH 6.8의 MRS 액체배지에서 37℃, 24시간 배양하면서 배양액의 pH가 4.5 이하로 감소하는 콜로니를 재선별 하였다. 이후 pH 2.0의 MRS 배지에서 2시간 배양한 후 다시 0.3%의 oxgall이 첨가된 MRS 배지 내에서 9시간 배양한 경우에 생존이 가능한 내산성, 내담즙성 락토바실러스 균주를 분리하였고, 16S rRNA 시퀀싱(sequencing)으로 동정하여 락토바실러스 가제리 종에 속하는 균주임을 확인하였다(서열목록 1, 도 1 참조). 본 발명자들은 상기 균주를 "락토바실러스 가제리 BNR17"로 명명하고, 2006년 1월 23일 자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 10902BP).
실시예
2. 제2형 당뇨 모델을 이용한 동물실험 Ⅰ
<2-1>
실험군
및 유산균 투여방법
제2형 당뇨병 모델인 C57BLKS/J-db/db 마우스(암컷, 9주령)를 두 그룹으로 나누어 한 그룹(대조군)에는 PBS(pH 7.4)액 0.2 ㎖를, 그리고 다른 그룹(실험군)에는 락토바실러스 가세리 BNR17을 최종 균수 109 CFU/0.2 ㎖가 되도록 PBS액에 현탁하여 5주간 매일 하루 두 번씩(오전, 오후) 경구투여 하였다. 사육환경은 온도 21± 2℃, 습도 55± 5%, 환기 횟수 15~17회/시간, 조도 150~300 Lux, 및 조명은 12시간 명암(점등: 06:00, 소등: 18:00)으로 조정하여 실험 기간동안 일정한 상태로 유지하였다. 고형사료(중앙실험동물, 한국)와 물(Autoclaved water)은 자유 급이ㆍ급수시켰으며, 부검 및 샘플링(sampling) 전에 16시간동안 절식시켰다.
본 실험에 있어서, 물질 처리군과 대조군 사이의 통계학적 유의차는 Student's t-test에 의하여 검정하였고, p<0.05를 실험군 간의 유의성있는 차이로 판정하였다.
<2-2> 실험방법 및 결과
<2-2-1> 체중 측정
실험기간 동안 체중은 16시간 절식 상태에서 일정 시간에 측정하였다.
그 결과, 체중의 경우 실험 시작 전 PBS액을 투여한 대조군은 42.45± 0.43g, 그리고 락토바실러스 가세리 BNR17 투여군은 43.27± 2.45g 이었으나, 21일째부터 BNR17 투여군에서 체중 및 식이효율(Food Efficiency Ratio, FER)이 대조군에 비해 서서히 증가하기 시작하여 실험 종료시 대조군은 약 101.9%의 체중 증가를 보였으나, BNR17을 투여한 실험군은 약 107.4%의 체중 증가를 보였다(도 2 및 표 1). 또한, 식이 효율에 있어서도 대조군에 비해 유의적으로 높은 수치를 나타내었다. 이 결과로부터 유산균이 고혈당으로 인해 야기되는 체중 감소 현상을 개선시키는 효과가 있음을 확인하였다.
그룹 |
체중(g) |
체중증가 (g/day) |
최초 체중 |
최종 체중 |
대조군 |
42.447± 0.427 |
43.233± 3.206 |
0.02± 0.089 |
BNR17 |
43.267± 2.452 |
46.452± 0.739* |
0.09± 0.098 |
상기 표에서, *P < 0.05 이다.
<2-2-2>
급이량
,
음수량
,
뇨배설
및
분변량
측정
실험기간 동안 급이량은 7일 간격으로 일정 시간에 측정하였고, 1일 기준으로 급이량을 산출하였다. 또한, 음수량은 3일 간격으로 일정 시간에 측정하였고, 1일 기준으로 음수량을 산출하였다. 아울러, 각 군별로 새로운 깔짚 교체 후, 3일 간격으로 배설되는 뇨 및 분변을 수집하여 무게를 측정하였다.
그 결과, 급이량의 경우 대조군은 평균 6.44 g/일인 반면에 BNR17 투여군은 평균 5.10 g/일로 대조군에 비해 20.8%의 감소를 보였다(도 3). 음수량 평균값의 경우 대조군은 18.46 ㎖/일, BNR17 투여군은 9.86 ㎖/일로 대조군에 비해 46.6% 감소효과를 보였으며(도 4), 또한 뇨배설량 및 분변량에서도 대조군은 129.76 g/3일, BNR17 투여군은 61.74 g/3일로 대조군에 비해 52.4% 감소효과를 보였다(도 5a 및 도 5b). 상기 결과로부터, 모유로부터 분리한 유산균인 락토바실러스 가세리 BNR17은 당뇨의 대표적인 증상인 다식, 다음 및 다뇨 현상을 개선시켜 주는 탁월한 효과가 있음을 확인하였다.
<2-2-3> 혈당 측정
혈당 측정은 실험 시작 전을 포함하여 7일 간격으로 실시하였으며, 16시간 절식 후 꼬리정맥에서 채혈하여 혈당측정기(AGM-2100, 올메디쿠스, 한국)를 통해 혈당을 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 실험 시작 전 대조군은 190.3± 53.7 ㎎/㎗, 그리고 BNR17 투여군은 186.7± 57.6 ㎎/㎗ 이었으나, 유산균 투여군에서는 투여 7일째부터 혈중 포도당 농도가 감소하기 시작하여 실험 종료일까지의 평균 농도는 대조군이 223.31± 50.13 ㎎/㎗, 그리고 BNR17은 173.56± 30.77 ㎎/㎗의 결과를 얻었으며, 이것은 대조군에 비해 49.75 ㎎/㎗(22.3%)의 감소 효과를 나타내었다. 상기 결과로부터, BNR17 유산균이 뛰어난 혈당 강하 효과가 있음을 확인하였다.
<2-2-4> 당부하시험(
glucose
tolerance
test
)
당부하시험을 위하여, 포도당을 500 ㎎/㎏ BW의 용량으로 16시간 절식시킨 C57BLKS/J-db/db 마우스에 경구투여 하였으며, 락토바실러스 가세리 BNR17은 1× 109 cfu/0.2 ㎖의 용량으로 포도당 투여 30분 전에 경구투여 하였다. 그 후, 0, 30, 60, 90, 120 및 150분 간격으로 꼬리정맥에서 채혈하여 혈당측정기를 통해 혈당을 측정하였다.
대조군과 BNR17 투여군을 대상으로 35일간 투여 후 당부하 시험을 실시한 결과, 포도당 (500 ㎎/㎏ BW) 투여 후 30분 까지는 포도당 농도 변화가 관찰되지 않았으나, 투여 후 60, 90, 120, 150분이 경과하였을 때는 유산군 투여군에서 혈당 감소 효과가 현저하게 나타나 실험 종료시 대조군에 비해 약 53% 정도 수준으로 뛰어난 혈당강하 효과가 있음을 확인하였다(도 7a 및 도 7b). 반면, 대조군에서는 측정 전체시간에 걸쳐 포도당 농도의 감소를 관찰할 수 없었다. 상기 결과로부터, 락토바실러스 가세리 BNR17 유산균이 뛰어난 혈당강하 효과가 있음을 재확인하였다.
<2-2-5>
혈액화학치
분석
대조군과 BNR17 투여군을 대상으로 7일에 한번씩 12주 동안 투여 후, 안와정맥을 통해 혈액을 0.5 ㎖ 채취하였으며, 냉장고속원심분리기(HA-1000-3, Hanil, 한국)를 이용하여 3,000 rpm에서 20분간 원심 분리하였다. 상기 원심분리에 의해 분리된 혈장을 초저온 냉동고(-80℃)에 보관하였으며, 혈액생화학적분석기(7020, Hitachi, 일본)를 사용하여 혈중 TC(총 콜레스테롤), HDL, LDL, 중성지방, 포도당 농도를 각각 2회 반복 측정하였다.
당뇨병 환자에게서 빈번하게 관찰되는 '지질대사의 이상'으로 혈중 중성지방과 콜레스테롤의 증가 및 HDL-콜레스테롤의 감소를 들 수 있는데, 상기 분석에 의한 결과로서 혈중 중성지방 함량은 대조군에 비해 BNR17 투여군에서 약간의 감소효과가 나타났고 혈중 포도당 농도는 대조군에 비해 감소한 것으로 나타났다, 그러나 혈중 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 및 HDL-콜레스테롤의 함량은 대조군에 비해 BNR17 투여군에서 효과는 관찰되지 않았다(도 8a 내지 도 8e). 상기 결과로부터, 본 발명의 유산균은 지질대사의 이상을 개선시키는 효과는 없는 것으로 나타났다.
실시예
3. 제2형 당뇨 모델을 이용한 동물실험 Ⅱ
본 발명자들은 락토바실러스 가세리 BNR17의 당뇨 예방 및 치료효과를 보다 명확히 확인하기 위하여, 다양한 농도의 BNR17 투여군 및 경구용 혈당강하제인 로지글리타존(Rosiglitazone, 한국화학연구원)과 아카보스(Acarbose, 바이엘, 독일)투여군을 추가하여 실시예 2와 동일한 실험을 반복하였다.
<3-1> 유산균 분말의 제조
실험에 사용한 균주는 다음의 동결건조 과정을 거쳐 준비하였다. -70℃에 동결하여 보관한 락토바실러스 가세리 BNR17는 37℃ 항온조에서 해동시킨 후, 1계대 배지(Lactobacilli MRS broth, Difco, 미국)에 접종하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 24시간 정치배양하였다. 상기 1계대 배양액을 최종농도 4%가 되도록 2계대 배지(LFC 배지, 표 5)에 접종하여 150 rpm, 37℃ 조건에서 24시간 진탕배양하였다. 상기 배양액을 최종농도 8%가 되도록 3계대 배지(LFC 배지)에 접종하여 200 rpm, 37℃에서 11시간 배양한 후, LFC 배지 600L에 접종하여 60 rpm, 37℃에서 13시간 배양하였다.
상기 배양액을 25℃로 냉각시킨 다음 무균 SUS관을 통해 질소충진한 후, 원심분리기로 압력차이에 의한 자동이송을 실시하여 유산균 케이크(cake)를 얻었다. 이를 멸균된 인산염 완충액 100 L로 1회 세척한 후 원심분리시켜 pH가 안정된 유산균을 얻고, 여기에 80℃에서 30분 동안 멸균한 동결건조보호제(탈지유:트레할로스:프룩토올리고사카라이드=2:1:1)와 배양액을 넣어 혼합하였다. 이 때, 배양액 1L당 동결건조보호제 25 ㎖의 비율로 골고루 섞어주었으며 동결건조보호제의 농도는 정제수를 첨가하여 조절하였다.
상기 혼합액을 동결건조기에서 서서히 동결하여, -35℃에 도달하면 -70cmHg 이하로 압력을 낮추어 48시간 이상 동결 건조함으로써 수분량 5% 미만의 건조분말을 획득하였다. 이를 분쇄하여 원하는 입도의 분말 원료로 제조한 뒤 4℃의 암소에 보관하였다.
표 2: LFC 배지의 성분
구 성 성 분 |
함량(w/v %) |
구 성 성 분 |
함량(w/v %) |
가수분해된 카세인 단백질 321 |
0.5 |
나트륨 아세테이트 |
0.5 |
효모 추출물-0202 |
2.0 |
황산 마그네슘 |
0.01 |
덱스트로스 |
2.0 |
황산 망간 |
0.005 |
폴리소르베이트 80 (Tween 80) |
0.1 |
칼슘 카보네이트 |
1.0 |
인산2칼륨 |
0.2 |
|
|
상기 LFC 배지는 50%(w/v) NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 조절하였고 배지 구성성분 중 가수분해된 카세인 단백질 321은 Tatua사(뉴질랜드), 효모 추출물-0202는 Bio springer사(프랑스)의 제품을 사용하였다.
<3-2>
실험군
및 투여방법
제2형 당뇨병 모델인 C57BLKS/J-db/db 마우스(수컷, 4-5주령)를 10 마리씩 7군으로 나누어 대조군(db-대조군)에는 동결건조보호제를 현탁시킨 PBS(pH 7.4) 0.3 ㎖을 경구투여하였고, 실험군(db-BNR17)에는 락토바실러스 가세리 BNR17을 최종 107, 108, 109 및 1010 CFU 가 되도록 현탁시킨 PBS 0.3 ㎖을 경구투여하였다(1일 2회, 12주 동안). 나머지 두 군에는 시판되고 있는 경구용 혈당강하제인 로지글리타존(db-로지글리타존)과 아카보스(db-아카보스)를 각각 8 mg/kg체중/일, 40 mg/kg체중/일의 농도로 투여하여 효과를 비교하였다.
본 실험에 있어서, 실험동물 사육환경은 실시예 <2-2>와 동일하게 하였고, 실험 결과는 SPSS 11.0 버전의 변량분석(ANOVA) 통계 프로그램을 이용하여 검증하였으며 p<0.05를 실험군 간의 유의성 있는 차이로 판정하였다.
<3-3> 실험방법 및 결과
<3-3-1> 체중 및
급이량
측정
체중은 7일에 한번씩 측정하였고, 급이량은 7일 간격으로 측정하여 1일 기준으로 결과를 산출하였다. 급이량의 경우 1일 간격으로 측정하기 어렵기 때문에 7일에 한번씩 측정한 후 다시 7로 나누어 1일 값으로 나타내었다.
그 결과, 대조군은 당뇨병으로 인한 체중 감소가 뚜렷하게 나타났으나, 로지글리타존 투여군은 체중이 증가하였다 (p<0.05). 락토바실러스 가세리 BNR17 투여군은 비록 유의적 차이는 없었지만 BNR17 투여량이 많아질수록 체중 감소가 뚜렷하게 적어졌으며, 그 효과는 아카보스 보다 우수하였다(도 9).
또한, 모든 실험군에서 대조군에 비해 급이량이 적었고 특히 락토바실러스 가세리 BNR17 투여군은 BNR17 투여량에 비례하여 급이량 역시 감소되었다(p<0.05,도 10).
상기 결과는 락토바실러스 가세리 BNR17이 당뇨병의 주요 증상 중 하나인 다식과 체중 감소를 방지할 수 있음을 나타낸다.
<3-3-2>
음수량
및
분변량
측정
음수량은 3일 간격으로 측정하여 1일 기준으로 결과를 산출하였고, 분변량은 새로운 깔짚 교체 후, 3일 간격으로 배설되는 분변을 수집하여 무게를 측정하였다.
그 결과, 대조군을 제외한 모든 군에서 음수량 및 분변량이 대조군보다 현저하게 감소하였으며, 특히 락토바실러스 가세리 BNR17 투여군은 체중과 마찬가지로 BNR17 투여량이 증가함에 따라 음수량 및 분변량이 감소하였다(p<0.05, 도 11 및 도 12).
상기 결과는 락토바실러스 가세리 BNR17이 당뇨병의 주 증상인 다뇨 및 다음 현상을 개선시킬 수 있음을 나타낸다.
<3-3-3> 혈당 측정
혈당은 7일에 한번씩 측정하였는데, 식전 혈당은 16시간 절식 후 꼬리정맥에서 채혈하여 측정하였고 식후 혈당은 식전 혈당 측정 후 사료를 섭취시키고 2시간 후에 측정하였다.
그 결과 식전 혈당에 있어서는, 대조군의 혈당이 실험기간 동안 계속 증가하여 12주째에는 357.7± 115.1 ㎎/㎗을 나타내었다. 락토바실러스 가세리 BNR17 투여군은 BNR17 투여량이 커질수록 혈당 증가가 적었으며, 증가폭은 대조군보다 크지 않았다. 특히 1010 CFU를 투여한 군의 혈당은 12주째에 207.9± 95.9 ㎎/㎗로서, 대조군에 비해 약 30.3% 감소되었다. 로지글리타존 투여군은 95.0± 10.5 ㎎/㎗로 정상 혈당치를 나타내었으며, 아카보스 투여군도 237.5± 125.4 ㎎/㎗로 유의적 감소를 나타내었다(도 13).
식후 혈당 역시 대조군은 12주 동안 계속 증가하여 12주째 혈당이 576.0± 32.2 ㎎/㎗인 반면, 락토바실러스 가세리 BNR17 투여군은 실험기간 동안 투여량이 증가함에 따라 전반적으로 감소되어 BNR17의 투여량별 효과를 확인할 수 있었다. 한편, 식전 혈당에서는 유의적 감소를 보였던 아카보스 투여군은 식후 혈당에서는 유의적 감소를 나타내지 않았다(도 14).
<3-3-4>
당부하
시험
당부하 시험은 3주 간격으로 실시하였는데, 구체적으로 16시간 절식시킨 C57BLKS/J-db/db 마우스에 로지글리타존, 아카보스 또는 락토바실러스 가세리 BNR17을 경구투여한 지 30분 후, 1 g/kg체중의 용량으로 포도당을 경구투여하고 0, 30, 60, 90, 120 및 150분 간격으로 꼬리정맥에서 채혈하여 혈당을 측정하였다.
그 결과, 로지글리타존 투여군은 저혈당 증상을 나타냈으며, 아카보스 투여군은 대조군과 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나 락토바실러스 가세리 BNR17 투여군은 실험기간이 경과할수록 혈당 농도가 크게 감소하였으며, 특히 투여량에 따른 혈당 농도 차이가 커짐으로써 BNR17의 용량별 효과를 확실히 알 수 있었다(도 15a 내지 15e).
<3-3-5>
당화혈색소
(
HbA1c
) 측정
당화혈색소는 6주 간격으로 혈당측정 지표인 혈중 당화 헤모글로빈(HbA1c)의 양을 측정하였다.
그 결과, 대조군은 HbA1c의 초기 농도가 4.7± 0.5%였으나 12주째에는 8.7± 0.6 ㎎/㎗로 크게 증가하였고 로지글리타존 투여군은 변화가 없었으며, 아카보스 투여군도 적은 증가를 나타내었다. 락토바실러스 가세리 BNR17 투여군은 109 CFU까지는 효과가 없었으나, 1010 CFU를 투여한 경우에는 1.26%의 유의적 감소를 확인할 수 있었다(표 3).
표 3: 서로 다른 실험식이를 섭취한 db/db 마우스군들의 HbA1c 변화
시료 |
0 주 |
6 주 |
12 주 |
db-대조군 |
4.700±0.515 |
7.860±0.598 |
8.700±0.606 |
db-로지글리타존 |
4.480±0.476 |
4.180±0.507*** |
4.060±0.358*** |
db-아카보스 |
4.120±0.217 |
4.900±1.005*** |
5.620±1.521** |
db-BNR17 (7) |
4.520±0.753 |
7.540±0.472 |
8.220±0.614 |
db-BNR17 (8) |
4.600±0.255 |
7.520±0.716 |
8.940±0.859 |
db-BNR17 (9) |
4.460±0.261 |
6.940±0.733 |
8.380±0.931 |
db-BNR17 (10) |
4.340±0.207 |
6.800±0.515* |
7.440±0.623** |
*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001
<3-3-6> 장기무게
장기무게는 12주 후에 모든 실험동물을 해부한 후 간, 신장, 비장, 췌장을 적출하여 무게를 측정하였다.
그 결과, 로지글리타존 투여군은 육안 관찰시 간이 크게 비대해져 있었고, 무게 또한 다른 실험군에 비해 큰 것으로 나타났다. 간의 GOP와 GPT 수치도 다른 실험군에 비해 대단히 크게 나타났는데, 이는 로지글리타존이 간에 부작용을 일으킬 수 있음을 의미한다. 반면, 락토바실러스 가세리 BNR17 투여군은 모든 장기에 큰 변화가 없어 독성이나 부작용을 일으키지 않는 것으로 나타났다(표 4 및 표 5).
표 4: 서로 다른 실험식이를 섭취한 db/db 마우스군들의 장기 무게의 변화
표 5: 서로 다른 실험식이를 섭취한 db/db 마우스군들의 간 수치
시료 |
간 |
신장1 ) |
비장 |
이자 |
정소상체 지방조직 |
db-대조군 |
3.050±0.522 |
0.567±0.064 |
0.104±0.046 |
0.252±0.075 |
2.382±0.507 |
db-로지글리타존 |
4.578±0.716 |
0.484±0.047 |
0.089±0.016 |
0.285±0.184 |
2.545±0.400 |
db-아카보스 |
2.949±0.355 |
0.520±0.037 |
0.078±0.038 |
0.252±0.067 |
2.795±0.125 |
db-BNR17 (7) |
3.736±0.777 |
0.610±0.094 |
0.100±0.090 |
0.260±0.070 |
2.607±0.166 |
db-BNR17 (8) |
3.174±0.540 |
0.569±0.068 |
0.099±0.039 |
0.261±0.053 |
2.639±0.519 |
db-BNR17 (9) |
3.538±0.748 |
0.616±0.066 |
0.169±0.107 |
0.261±0.046 |
2.827±0.335 |
db-BNR17 (10) |
3.274±0.639 |
0.520±0.087 |
0.086±0.043 |
0.274±0.056 |
2.618±0.174 |
1) 두 개의 신장 무게의 평균.
시료 |
GOT (IU/l) |
GPT (IU/l) |
0 주 |
12 주 |
0 주 |
12 주 |
db-대조군 |
152.240±60.998 |
215.160±90.036 |
90.340±58.990 |
188.120±30.586 |
db-로지글리타존 |
168.240±47.548 |
591.000±209.451** |
92.080±30.154 |
605.650±213.399** |
db-아카보스 |
157.060±45.366 |
209.520±65.026 |
78.400±19.947 |
241.600±44.697 |
db-BNR17 (8) |
115.540±27.380 |
212.440±119.915 |
77.840±22.270 |
196.920±130.089 |
db-BNR17 (10) |
143.020±42.531 |
292.960±60.911 |
81.140±41.126 |
281.040±107.395 |
**P < 0.01
<3-3-7> 췌장의 조직학적 분석
췌장은 H&E 염색을 이용한 조직학적 분석을 통해 락토바실러스 가세리 BNR17 및 경구 혈당강하제가 당뇨 관련 세포에 미치는 영향을 조사하였다.
그 결과, 아카보스 및 BNR17 1010 CFU 투여군은 랑게르한스섬 세포(islet cell)의 증식이 관찰된 반면, 대조군 및 타 투여군은 이자의 형태학적 변화는 관찰되지 않았다(도 16).
제조예
1. 발효유의 제조
탈지분유를 이용하여 무지유고형분 함량을 8~20 중량%로 조정한 원료유를 72~75℃에서 15초간 살균하였다. 살균된 원료유를 일정온도까지 냉각시킨 후, 본 발명의 락토바실러스 가세리 BNR17 균주를 106 cfu/㎖의 농도로 접종하여 pH 4~5가 될 때까지 배양하였다. 배양완료 후 배양액을 냉각시켰다. 한편, 과즙농축액 0.1~50 중량%, 식이섬유 0.1~20 중량%, 포도당 0.5~30 중량%, 올리고당 0.1~15 중량%, 칼슘 0.001~10 중량%, 비타민 0.0001~5 중량%를 녹여 시럽을 제조하였다. 이렇게 제조된 시럽을 살균한 후 냉각하여 상기 배양액과 일정비율로 혼합ㆍ교반하여 균질화시킨 후 용기에 포장하여 발효유를 제조하였다. 이렇게 제조된 발효유는 관능검사 결과 풍미, 물성, 전체적인 맛에 있어서 양호한 결과를 보였다.
제조예
2. 유산균 분말의 제조
본 발명의 락토바실러스 가세리 BNR17을 MRS 액체배지에 106 cfu/㎖의 농도로 접종하여 37℃에서 18~24시간 동안 pH-조절 발효(pH-control fermentation)를 실시하였다. pH 조절(control)은 30 부피% NaOH를 중화제로 하여 pH 5.7± 0.2로 실시하였다. 배양완료 후 4℃에서 10,000 × g로 원심분리하여 균체를 회수하였다. 전체 조성물에 대해 5 중량% 탈지유, 2.5 중량% 유장(whey), 5 중량% 수크로스(sucrose)가 함유된 보호제를 준비하고, 상기에서 회수한 균체를 보호제와 동량으로 혼합한 후 동결건조기를 통해 분말화하였다. 이렇게 제조된 락토바실러스 가세리 BNR17의 건조분말은 모두 1×1011 cfu/g 이상의 생균수를 나타내었다. 상기 보호제는 10 중량% 트레할로즈(trehalose), 10 중량% 말토덱스트린(maltodextrine), 7.5 중량% 락토즈(lactose)를 추가로 함유하고 있어도 무방하다.
제조예
3. 유산균 제제 제조
제조예 2에서 제조한 유산균 분말을 이용하여 유산균 식품, 정장제 등의 유산균 제제를 제조하였다. 이를 위하여, 락토바실러스 가세리 BNR17의 건조 균말 20 중량%에 올리고당 10 중량%, 무수포도당 20 중량%, 결정과당 5 중량%, 비타민 C 2 중량%, 과일분말향 5 중량%, 알로에 5 중량%, 식이섬유 15 중량%, 차전자피 18 중량%를 혼합하여 스틱 또는 병에 일정량 분주하여 포장하였다. 이렇게 제조된 유산균 제제는 5× 108 cfu/g 이상의 생균수를 유지하였다.