KR102085900B1

KR102085900B1 - 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 rwl-1 균주 배양액에서 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102085900B1
Application number: KR1020180120780A
Authority: KR
Inventors: 이인중; 라힘 샤흐자드; 강상모; 라티프 칸 압둘
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2018-10-10
Filing date: 2018-10-10
Publication date: 2020-03-06

Abstract

본 발명은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) RWL-1 균주의 배양액으로부터 분리한 화합물을 포함하는 당뇨병의 예방, 개선, 및 치료용 조성물에 관한 것으로 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 종으로부터 분리된 생물활성 화합물의 효소 저해활성을 최초로 기술한 것이다. 본 발명의 조성물은 우수한 알파-글루코시다아제 저해활성을 가짐으로써, 장에서 당의 흡수를 저해하여 당뇨병 치료, 예방, 및 개선에 효과적이며 미생물의 2차 대사물을 이용한 것으로, 높은 치료 가치를 지닌 생물 활성 대사산물의 중요한 공급원으로 이용하여 의료 및 식품 산업분야에서 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

Description

바실러스 아밀로리퀘파시엔스 RWL-1 균주 배양액에서 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes comprising as an active ingredient a compound isolated from Bacillus amyloliquefaciens RWL-1 culture medium}

본 발명은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) RWL-1 균주의 배양액으로부터 분리한 화합물을 포함하는 당뇨병의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

당뇨병이란 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등의 대사질환의 일종으로, 혈중 포도당의 농도가 높아지는 고혈당을 특징으로 하며, 고혈당으로 인하여 여러 증상 및 징후를 일으키고 소변에서 포도당을 배출하게 된다. 제1형 당뇨병은 인슐린 치료가 필요하며 제2형 당뇨병은 생활 습관 교정을 기본으로 하며 추가로 약물 투여가 필요할 수 있는데 알파-글루코시다아제 억제제는 그 중 하나의 약물로서 녹말이 장에서 분해되는 것을 막아줌으로써, 식사 후에 혈당이 증가하는 것을 늦추어 혈당을 낮추는 데 도움을 준다. 대표적인 알파-글루코시다아제 억제제는 아카보즈(acarbose)가 있다.

한편, 식물내생생물(endophyte)이란 명백한 질병을 일으키지 않고 식물 조직 내에서 살고 식물의 내부 조직에 콜로니를 형성하는 능력을 갖는 미생물을 의미한다. 식물내생생물은 식물의 모든 부분에 퍼져 있으며 식물의 다른 부분으로부터 분리되어 있다. 이들은 식물을 손상시키지 않으며 숙주식물과 상호 관계를 형성하지만, 상호 작용은 많은 요소들에 달려 있으며 시간이 지남에 따라 변할 수 있다. 이러한 공생관계에서 식물은 식물내생생물에게 쉘터, 보호 및 필수 영양소를 제공하며 그 대신 식물내생생물은 내인성 식물 호르몬과 영양소의 조절을 통해 숙주식물과 유익한 상호관계를 형성하고 빠르게 변화하는 환경에 대해 식물의 적응력을 향상시킨다. 다만, 식물내생생물은 모든 식물 종에 존재하지만 식물내생생물과 숙주간의 상호작용은 아직 완전히 연구되지 않았다.

또한, 식물내생생물은 식물과 미생물의 상호작용 이외에도 많은 중요한 생물학적 활동을 보여준다. 식물내생생물 중 많은 박테리아는 휘발성 유기 화합물, 항생제, 면역 억제 화합물, 항암제, 항 바이러스제 및 항진균제와 같은 다양한 생체 활성 및 건강 증진 화합물을 생산하는 것으로 알려져 있다. 임상에서는 항암제의 60% 이상이 천연물이며 식물내생생물 박테리아인 바실러스 아밀로리퀘파시엔스에 대한 첫번째 연구에서 항종양 효능을 갖는 엑소폴리사카라이드(exopolysaccharide)가 발견되었다. 이러한 항종양 물질 이외에도 바실러스 속(Bacillus genus)에 속하는 식물내생생물은 다양한 2 차 대사 산물을 생성한다. 예를 들어 바실러스 투링기엔시스(B. thuringiensis)는 항감염 화합물 안트라센(anthracene)을 생산하고 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)는 항생 단백질 YbdN을 생산하며 이러한 결과는 바실러스 속의 유망한 의학적 가능성을 제시하고 있다.

최근 몇 년 사이 생물학적 활성이 있는 알파-글루코시다아제 저해제의 분리 및 동정은 생화학적 과정을 이해하고 유망한 치료제로서의 기능을 하는 도구로 활용 될 수 있어 관심이 더욱 높아지고 있으며 비록 식물이 생물활성 대사산물의 중요한 원천이지만, 미생물도 높은 치료 가치를 지닌 생물 활성 대사산물의 중요한 공급원으로 여겨지고 있다. 이와 관련하여, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스의 생물학적 잠재성이 널리 보고되었지만, 아직 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 종으로부터 분리된 생물활성 화합물의 효소 저해활성에 대한 연구는 미비한 실정이다.

대한민국특허등록공보 10-0943747

본 발명자들은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 RWL-1 균주 배양액 조추출물의 알파-글루코시다아제(α-Glucosidase) 억제 효과를 확인하여 상기 조추출물로부터 특정 구조를 갖는 화합물을 분리하였으며 분리된 화합물이 알파-글루코시다아제 저해활성이 우수함을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명의 목적은, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 당뇨병 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 일 구현예로, 상기 화합물은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) RWL-1 균주(KCTC 13637BP)의 배양액으로부터 분리된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 알파-글루코시다아제(α-Glucosidase) 저해활성 효과를 가질 수 있다.

또한 본 발명은, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로 포함하는, 당뇨병 개선용 식품 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료방법을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의, 당뇨병 예방 또는 치료용도를 제공한다.

[화학식 1]

본 발명은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) RWL-1 균주의 배양액으로부터 분리한 화합물을 포함하는 당뇨병의 예방, 개선, 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 우수한 알파-글루코시다아제 저해활성을 가짐으로써, 장에서 당의 흡수를 저해하여 당뇨병 치료, 예방, 및 개선에 효과적이며 미생물의 2차 대사물을 이용한 것으로, 높은 치료 가치를 지닌 생물 활성 대사산물의 중요한 공급원으로 이용할 수 있어 의료 및 식품산업 분야에 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 화합물을 분리하고 이의 구조를 확인하기 위한 실험방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2a는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 RWL-1 배양액 조추출물의 알파-글루코시다아제 억제활성 효과를 실험한 결과이다.
도 2b는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 RWL-1 배양액 조추출물의 세포독성을 MTT 어세이(assay)로 실험한 결과이다.
도 2c는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 RWL-1 배양액 조추출물의 AChE(acetylcholinesterase) 억제활성 효과를 실험한 결과이다.
도 3은 아밀로리퀘파시엔스 RWL-1 배양액 조추출물로부터 분리된 화합물의 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 조추출물로부터 분리된 화합물의 알파-글루코시다아제 저해활성을 실험한 결과이다.

본 발명자들은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 RWL-1 균주 배양액 조추출물의 알파-글루코시다아제 억제 효과를 확인하여 상기 조추출물로부터 특정 구조를 갖는 화합물을 분리하였으며 분리된 화합물이 알파-글루코시다아제 저해활성이 우수함을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 RWL-1 균주 배양액 조추출물을 처리하여 알파-글루코시다아제 저해활성, 세포독성, AChE 저해활성을 실험한 결과 조추출물의 알파-글루코시다아제 저해활성이 우수함을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 RWL-1 균주 배양액 조추출물로부터 분리한 화합물을 분석하여 그 화학구조를 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 화합물의 효소 저해활성을 평가한 결과 알파-글루코시다아제 억제 활성이 우수함을 확인하였다(실시예 4 참조).

따라서, 상기 내용을 고려하여 볼 때 상기 화합물은 알파-글루코시다아제 저해활성이 우수하므로 당뇨병의 치료, 예방, 또는 개선 용도로 이용할 수 있다.

이에, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 당뇨병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 당뇨병에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) RWL-1 균주(KCTC 13637BP)의 배양액으로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "약제학적으로 허용 가능한 이의 염"은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있는 것으로, 예를 들면, 염산, 브롬화수소, 황산, 황산수소나트륨, 인산, 탄산 등의 무기산과의 염 또는 개미산, 초산, 옥살산, 벤조산, 시트르산, 타르타르산, 글루콘산, 게스티스산, 푸마르산, 락토비온산, 살리실릭산, 또는 아세틸살리실릭산(아스피린)과 같은 유기산과 함께 약제학적으로 허용 가능한 이들의 산의 염을 형성하거나, 또는 나트륨, 칼륨 등의 알칼리금속이온과 반응하여 이들의 금속염을 형성하거나, 또는 암모늄 이온과 반응하여 또 다른 형태의 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 형성하는 것을 의미한다.

본 발명에서 상기 화합물은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) RWL-1 균주(KCTC 13637BP)의 배양액으로부터 분리된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) RWL-1 균주는 2018년 09월 06일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 13637BP 를 부여받았다.

본 발명의 상기 균주는 벼 종자로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 상기 조성물은 알파-글루코시다아제(α-Glucosidase) 저해활성 효과를 가질 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 “글루코시다아제”는 탄수화물 및 당단백질의 대사과정에서 당의 결합부분을 가수분해함으로써 단당류나 기타 흡수가능한 다당류로 분해하는 효소를 말한다. 이들은 복잡한 탄수화물의 가공 및 합성을 담당하고 있으며, 많은 생물학적 분자인식과정에서 필수적인 효소로 알려져 있으며 α-글라이코시데이스는 장액 중에, β-글라이코시데이스는 간, 신장, 비장 등 여러조직내에 있다. 또한 다양한 종류의 글루코시다아제는 전분, 수크로오스와 같은 다당류, 올리고당의 분해를 통하여 음식물 소화기구에 관여하고 있기 때문에, 이들에 대한 저해물질은 장에서 당의 흡수를 저해하여 항당뇨병제, 항비만제로서 유용하다고 보고되어 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로 포함하는, 당뇨병 개선용 식품 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 식품 조성물은 건강기능성 식품 조성물을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “개선”이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 식품 조성물에서 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.

본 발명의 건강기능성식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능성식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 실험재료 및 방법

실시예 1-1. 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 RWL -1 균주의 배양과 이차 대사물 추출

벼 종자로부터 분리한 내생균 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 RWL-1은 8리터의 LB배지에서 배양하였다(트립톤(tryptone), 10 g; 이스트 추출물(yeast extract), 5 g; 소듐 클로라이드(sodium chloride), 10 g; pH 7.0 ±0.2, 121 °C 에서 15분 동안 고압멸균). 접종된 RWL-1은 28°C에서 7일 동안 진탕배양기(120rpm)에서 배양된 후, 15분간 5000 × g에서 원심분리하여 균체를 분리하였으며, RWL-1 균체가 제거된 배양액을 pH 2.5로 조절하여 동일한 양의 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 3회에 걸쳐 완전히 추출하였다. 그 다음, 에틸 아세테이트 추출물을 회전증발기(rotary evaporator)에서 완전히 건조시켜 농축된 추출물(1.6g)을 얻었다.

실시예 1-2. 이차대사물질의 분리

생물검정 결과를 기초로 하여, 에틸 아세테이트 조추출물을 용매구배(1% 에틸 아세테이트/n-헥산(n-hexane) ~ 85% 에틸 아세테이트/n-헥산)를 사용한 실리카겔(silica gel) 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 분석하였다. 씬 레이어 크로마토그래피(TLC; pre-coated aluminum sheets, silica gel 60F-254, E. Merck, Darmstadt, Germany) 실험은 세균 배양액 추출물의 상이한 분획을 조사하고 결정하기 위해 수행되었다. TLC 플레이트는 254 nm와 365 nm의 자외선 아래에서 관찰하였다. 추가적인 정제를 위해, 생체 활성 분획은 UV-VIS 검출기 (SPD-10A)와 시마즈(Shimadzu) CBM-10이 결합된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 얻었다. 샘플은 C18 컬럼(Luna 5μm, 100 Å, 250 × 4.6mm)으로 분석하였다. 용매는 용매 A-100% 메탄올(MeOH) 및 5% 아세트산을 포함한 용매B-워터(Water)를 이용하였으며, 솔벤트 프로그램(Solvent program; 0-20 min (50% = A; 50% = B), 20-40 min (80% A, 20% B), 40-60 min (100% A, 0% B), flow rate of 1 mL/min)을 이용하여 분석하였다. 남은 불순물은 분취용 TLC 플레이트에 반정제된 2차 대사산물을 로딩하여 제거하고 화합물 4.5mg 을 DCM/n-헥산(95:5)에서 정제하였다(도 1 참조).

실시예 1-3. 조추출물로부터 분리한 화합물의 구조 확인

정제된 화합물의 동정 및 특성을 알기 위해 스펙트럼 분석(UV(Ultraviolet Ray), IR(infrared), 1H-NMR(nuclear magnetic resonance), 13C-NMR, ESI(electrospray ionization) 및 MS(mass spectrometry)/MS 연구)을 실시하였다. 광학 측정은 편광계(polarimeter; JASCO DIP360)를 사용하여 수행되었으며 IR 스펙트럼을 기록하기 위해 Bruker ATR-Tensor 37 분광광도계를 사용했다. ESI 질량 스펙트럼을 얻기 위해 5-5.5 kV의 QSTAR 질량 분석기를 사용했다. NMR 스펙트럼(1H과 13C)은 각각 600MHz와 150MHz로 작동하는 Bruker NMR 분광계를 사용하여 결과를 얻었다.

실시예 1-4. 알파-글루코시다아제 저해활성 평가

RWL-1의 에틸 아세테이트 조추출물과 분리된 화합물의 알파-글루코시다아제 활성에 대한 억제 효과를 평가하였다. 우선, 알파-글루코시다아제는 RWL-1의 조추출물의 다양한 농도와 혼합하고 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 아카보즈(Acarbose)를 양성 대조군으로 사용하였고, p-니트로페닐 알파-D-글루코피라노시드(p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside; PNP-G)를 기질로 사용하였고 PNP-G로부터 방출된 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 흡광도는 5분마다 405 nm에서 측정되었으며 저해율은 표준 곡선식을 작성하여 계산하였으며 그래프 값은 표준 오차와 함께 3 회 반복의 평균으로 나타내었다.

실시예 1-5. 세포독성 평가

에틸 아세테이트 조추출물과 분리된 화합물의 세포 독성평가는 MTT 분석에 의해 실시하였다. HCT-15 세포는 아메리카 타입 컬쳐 컬렉션 CCL-25(American Type Culture Collection CCL-25; USA)에서 구입하여 대기조건은 95 % 공기 및 5 % CO₂, 37℃에서 가습 서브컨플루언트(subconfluent) 조건하에 보관되었으며 10 % 소태아혈청(fetal bovine serum) 및 1 % (v/v) 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 RPM-1640 배지를 계대배양에 사용하였다. HCT-15 세포를 24시간, 48시간 및 72시간 동안 RWL-1의 에틸 아세테이트 조추출물을 각각의 농도 (250, 500, 750μg / mL) 및 무처리의 96-웰 플레이트에서 10⁵ cells / well의 밀도로 계대 배양하였다. 배지를 제거하고 20μL MTT 용액(5mg / mL in PBS(phosphate buffered saline))을 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 배양 후, MTT 배지를 디메틸설폭사이드(DMSO; 200㎕)로 대체하였다.

그 다음, 플레이트를 1분간 부드럽게 진탕시키고 흡광도를 540nm에서 측정하였으며 세포 생존력을 계산하기 위해 하기의 식을 이용하였으며 그래프 값은 표준 오차와 함께 3 회 반복의 평균으로 나타내었다.

생존 세포(Viable cells) % = (OD 처리 샘플/OD 무처리 샘플) × 100

실시예 1-6. AChE ( acetylcholinesterase ) 저해활성 평가

AChE 저해활성 평가는 엘만즈 컬러리메트릭(Ellman's colorimetric) 방법을 토대로 수행하였다. 0.1 M 소듐클로라이드(NaCl)와 0.02 M MgCl₂6H₂O를 포함하는 15 mM 아세틸티오콜린 아이오디드-디이오나이즈드 워터(acetylthiocholine iodide-deionized water, 25 μL) 용액, 3 mM 5,5-디티오비스-2-니트로벤조익 에시드(5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid; DTNB, 125 μL), 50 mM 트리스-하이드로겐 클로라이드 버퍼(Tris-HCl buffer, pH 8.0)를 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 0.1 % 소혈청알부민(bovine serum albumin, 50μL)과 에틸 아세테이트 조추출물 (25μL)을 함유한 50 mM 트리스-하이드로겐 클로라이드 버퍼 (pH 8.0)를 각각 다른 농도 (50μg / g ~ 600μg / g)로 첨가하였다. AChE (25 μL, 0.2 U / mL)를 첨가하고 412 nm에서 45초 간격으로 흡광도를 측정하였고 갈란타민(Galantamine, 0.5-5 μg / mL)을 표준 억제제로 사용했으며 AChE 저해는 하기의 식을 이용하여 계산하였으며 그래프 값은 표준 오차와 함께 3 회 반복의 평균으로 나타내었다.

AChE 저해활성(%) = 1 - (샘플 반응률/블랭크(blank) 반응률) × 100

실시예 2. 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 RWL -1 조추출물의 생물학적 활성 평가

바실러스 아밀로리퀘파시엔스 RWL-1조추출물의 생물학적 잠재력은 다양한 효소에 대한 저해활성과 세포독성을 통해 평가하였으며 다양한 농도의 RWL-1 조추출물 처리를 통하여, 실시예 1-4의 방법에 따라 알파-글루코시다아제 저해활성을, 실시예 1-5의 방법으로 HCT-15 세포에 대한 세포 독성을, 실시예 1-6의 방법으로 AChE 저해활성을 조사하였다.

그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이 RWL-1 조추출물은 농도가 증가함에 따라 (10-100 μg / mL) 알파-글루코시다아제의 억제 효과가 높게 나타났고 높은 투여량 (100 μg / mL)에서 알파-글루코시다아제(37 ± 0.09 %)를 유의하게 억제하였으며, 양성 대조군은 74.85 ± 0.06 % 억제를 나타냈다.

한편, 세포 독성의 경우는 도 2b에 나타난 바와 같이 RWL-1 조추출물은 대조군 (100 %)과 비교하여 고농도 (750 ㎍ / mL)에서 작은 세포 독성 효과 (25 ± 0.16 %)를 나타냈다. AChE 저해활성은 도 2c에 나타난 바와 같이 비교적 높은 용량 (250-750 μg / mL)에서 용량 의존적으로 발생하였으나 양성 대조 화합물이 AChE (94.45 ± 0.31 %)를 유의하게 억제 한것에 비하여 AChE 활성의 유의한 감소는 확인되지 않았다.

실시예 3. 조추출물로부터 분리된 화합물의 구조 분석

화합물의 구조는 이전 연구에서 보고된 데이터와 비교하여 실시예 1-3의 방법에 따라 NMR 및 MS 스펙트럼 데이터의 분석에 의해 수행되었다. 1H-NMR 스펙트럼은 3개의 치환기를 가진 벤젠 및 불포화 γ락톤 잔기에 기인한 방향족 영역 (δ8.76-7.59)에서 5개의 양성자에 대한 신호를 나타냈으며 δ9.15의 다운필드(downfield) 영역에서의 넓은 일중선은 분자 내의 아미드 양성자 NH에 할당되었다. 이러한 방향족 신호 외에도 1H-NMR 스펙트럼에서 3개의 옥시-메틴 프로톤즈(oxy-methine protons, δ 4.24-3.84)와 2개의 메틸 그룹 (6H, d, J = 7.4 Hz)이 관찰되었다.

나아가, 13C-NMR 스펙트럼에서, 불포화 γ락톤은 δ157.7과 132.4에서 두 개의 특징적인 sp2 메틴 신호에 더하여, δ176.2에서 카르보닐 탄소의 존재로 나타났으며 방향족 메틴 탄소의 치환된 벤젠 링이 δ139.3, 129.9 및 125.3에서 나타났다.

또한, 화합물(명칭: (S)-2-하이드록시-N-((S)-1-((S)-8-하이드록시-1-옥소이소크로만-3-일)-3-메틸부틸)-2-((S)-5-옥소-2,5-디히드로퓨란-2-일)아세트아마이드, (S)-2-hydroxy-N-((S)-1-((S)-8-hydroxy-1-oxoisochroman-3-yl)-3-methylbutyl)-2-((S)-5-oxo-2,5-dihydrofuran-2-yl)acetamide)을 문헌에 보고된 것들과 비교하였다.

그 결과 화합물의 전반적인 물리적 및 스펙트럼 데이터는 이전에 바실러스 푸밀러스의 박테리아 균주와 알테르나리아 테누이스의 균주로부터 분리된 항생제 Al 77F와 동일함이 밝혀졌다(도 3 참조).

실시예 4. 조추출물로부터 분리된 화합물의 효소 저해활성 평가

RWL-1 조추출물의 생물학적 가능성에 기초하여, 실시예 1-4의 방법으로 화합물의 알파-글루코시다아제 저해활성을 다양한 농도에서 실험하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 IC50 값의 94.37 μg/mL에서 화합물(Compound 1)의 농도가 증가함에 따라 알파-글루코시다아제의 억제율이 증가하였으며 화합물이 100 μg / mL인 경우 유의한 저해 (52.98 ± 0.8 %)를 보였다. 한편, 양성 대조군으로 사용된 표준 약물은 IC50 값이 62.03 μg / mL와 80 μg / mL에서 79.14±1.9%을 보였으며 음성 대조군은 0.08 ± 0.1 % 억제를 나타냈다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC13637BP

수탁일자 : 20180906

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 화합물은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) RWL-1 균주(KCTC 13637BP)의 배양액으로부터 분리된 것을 특징으로 하는, 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 알파-글루코시다아제(α-Glucosidase) 저해활성 효과를 가지는 것을 특징으로 하는, 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로 포함하는, 당뇨병 개선용 식품 조성물.
[화학식 1]
제4항에 있어서,
상기 화합물은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) RWL-1 균주(KCTC 13637BP)의 배양액으로부터 분리된 것을 특징으로 하는, 당뇨병 개선용 식품 조성물.
제4항에 있어서,
상기 조성물은 알파-글루코시다아제(α-Glucosidase) 저해활성 효과를 가지는 것을 특징으로 하는, 당뇨병 개선용 식품 조성물.