KR20080027392A - 미세유체장치와 미세유체장치의 제작 및 사용방법 - Google Patents

미세유체장치와 미세유체장치의 제작 및 사용방법 Download PDF

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Abstract

미세유체장치는 유입 챔버, 선택적인 반응 챔버, 그리고 적어도 하나 이상의 검출 챔버가 유체와 접촉해 있는 포토레지스트 층, 포토레지스트 층 아래 배치된 지지체, 그리고 포토레지스트 층 위에 배치된 덮개를 포함한다. 그리고 상기 마지막 검출 챔버의 하류에 흡수 채널 세트를 부가적으로 포함할 수 있다. 상기 반응 챔버와 검출 챔버(들) 내부에는 생물유래성 혹은 면역 반응성 물질들이 배치되어 있다. 액채 샘플이 유입 챔버로 떨어지면, 그 샘플 액체는 모세관 작용에 의해 장치를 통과해 빨려들어가게 된다. 검출방법에는 전기화학적 검출법, 비색 분석법, 그리고 형광검출법을 포함한다.

Description

미세유체장치와 미세유체장치의 제작 및 사용방법{MICROFLUIDIC DEVICES AND METHODS OF PREPARING AND USING THE SAME}
본 발명의 분야는 미세 유체 장치(microfluidic devices), 미세 유체 장치의 제조방법 및 생물학적 분석에서의 미세 유체 장치의 이용과 관련되어 있다.
현장분석법(Point of care test, POCT), 즉 현장(point of care, POC)에서 수행되는 진단법(test)은 병원, 의원, 작업장 또는 유해가능한 환경에서의 진단 방법으로 일반화되었다. 현장분석법을 이용하면 약물 남용에 대한 작업장에서의 검사, 오염원에 대한 환경검사, 그리고 전장에서 생물학전에 사용된 인자(bio-warfare agent)의 검사와 같은 일들을 쉽고 간편하게 수행할 수 있다. 이러한 검사들은 종종 임상진단교육을 거의 받지 않거나 아예 받지 않은 사람들에 의해 수행되는바, 현장분석은 간단하고, 빠르고 사용하기 쉬울 것이 요구된다. 또한, 이상적으로는 최소한의 장비가 요구된다. 현행의 현장분석법의 대부부분은 주로 막(membrane)을 이용한 면역크로마토그래피분석법(immunochromatography assay)을 사용하는데, 이는 미세공성(microporous) 막의 모세관작용(capillary action)의 이 점을 가지기 때문이다. 면역크로마토그래피 분석법에서, 이동상 시료 용액에 포함된 분석물(analytes)는 다른 화합물로부터 분리되는데 이는 고정된 고체상에 고정화된 포획분자들(capture molecules)과의 결합 친화도(affinity)에 의한다. 니트로셀룰로오스(nitrocellulose)나 나일론(nylon)으로 만들어진 막은 친화크로마토그래피(affinity chromatography)의 고체상이나 분배크로마토그래피(partition chromatography)의 액체상의 매트릭스(matrix)로 작용하여, 모세관작용에 의해 면역복합입자(immunocomplex particles)를 다른 액체용액과 분리되도록 한다.
나일론이나 니트로셀룰로오스로 만들어진 미세공성막(microporous membranes)은 단백질이 막을 투과하여 수송될 수 있다는 것이 처음 소개된 약 1979년도 이래, 항원/항체 검사에 사용되어 왔다. 니트로셀룰로오스는 웨스턴블로팅(western blotting)이나 측방유동면역진단법(lateral-flow immunodiagnostics)과 같은 검색 기술에서 고정 단백질의 표면(surface)으로 빈번하게 활용되어 왔다. 미세공성과 니트로셀룰로오스는 신속 면역크로마토그래피 분석법(rapid immunochromatography assay)에서 많은 이점을 제공하는데, 예를 들면 높은 결합능력, 단백질과의 비공유결합, 안정적인 장기간의 고정화 환경 (immobilization enviroment)등이 이에 해당된다.
선행기술에서의 전형적인 신속 면역 분석 키트는 형광(fluorescence)표지나 금 표지 또는 기타의 표지가 부착된 1차 포획 항체(capture antibody)를 갖는 반응 패드(pad)로 구성된다. 2차 포획 항체는 니트로셀룰로오스나 나일론 막 스트립(membrane strip)에 부착된. 니트로셀룰로오스나 나일론 막 스트립의 한쪽 말단은 시약패드(reagent pad)와 바로 접해 있다. 2차 포획항체 (capture antibody)는 종종 막과 경계를 지어 "선형 (line)" 과 같은 특정 기하학적 패턴을 형성하기도 한다. 분석될 분석물이 포함된 시료가 시약 패드(reagent pad)에 제공되면, 반응물은 1차 표지 된 포획 항체와 결합하여 결합복합체(binding complex)를 형성하고 이 결합 복합체가 포함된 용액이 막 스트립을 통과하게 된다. 막 스트립 속에서 복합체는 막과 결합 된 2차 포획항체와 결합하게 된다. 이 2차 결합은 막과 부착된 포획항체로 구성된 기하학적 패턴을 따른 표지의 집중으로 시각화될 수 있고 혹은 이러한 결합은 형광 검출(fluorescence detection)이나 전기화학적 검출(electrochemical detection)과 같은 다른 수단으로도 검출할 수 있다.
면역크로마토그래피의 신호 강도를 조절하는 핵심적인 인자는 모세관 유속(capillary flow rate)과 막의 단백질 결합능력(protein binding capacity)이다. 모세관 유속과 결합능력은 세공의 크기(pore size)와 다공성(porosity) 그리고 막의 두께에 의해 결정되어 진다. 막의 단백질 결합능력은 그것의 세공크기, 표면의 성질에 의해 결정된다. 니트로셀룰로오스막은 종종 표면습윤(surface wetting)을 위해 계면활성제로 처리되어 지는 경우가 있다. 이런 계면활성제를 사용할 때의 고려할 점은 이러한 계면활성제가 막의 모세관 흐름 형태를 변화시킬 수 있고 그 변화 정도를 예측하기 어렵다는 점이다.
막의 단백질 결합능력과 입자(particle)의 막 통과시의 이동속도는 막의 세공크기에 의존적이다. 불행히도 막 제작자들은 막의 생산시에 세공크기나 다공성을 일정하게 유지할 수 없다. 이는 제조과정이 복잡하고 정밀하기 때문이다. 세공크기와 다공성의 높은 다양성은 다른 생산분(manufacturing lot)간 뿐만 아니라, 심지어 동일 생산 분(manufacturing lot)에서도 나타난다. 같은 조건 하에서의 서로 다른 시료 분석 키트(sample test kit)간에서 20% 이상의 신호 강도(signal intensity)의 차이를 보이는 경우를 흔하게 볼 수 있다. 이러한 다양성은 정량실험에서의 막을 기반의 면역분석법(membrane-based immunoassay)이 바람직 않게 되는 가장 큰 이유가 된다. 높은 다양성(variability)에 의해 현장분석이 정성분석으로 그 사용이 제한되게 된다. 이러한 미세공성 막의 특성을 개선하기 위한 많은 시도들이 있어 왔지만 일정한 질을 유지하는 것이 여전히 문제로 남아있다.
신호강도의 변화가능성을 해결하기 위해서 많은 해결책들이 제시되고 연구되어 왔는데, 검출기의 기능을 향상시키던가, 입자에 대한 선택적 표지화(labeling), 반응식의 최적화와 같은 것들이 있었다. 불행히도 약간의 개선만이 결과로 나타났다.
앞서 말한 현장분석법과 제조상의 약점들 때문에 더 정확한 현장분석법과, 분석의 정확성을 향상시키고 정성 분석뿐 아니라 정량분석에까지 사용될 수 있는 현장분석의 제조 방법들을 제공하는 것이 요구된다.
일부 현장분석법은 미세유체분석장치를 사용한다. 다양한 물질들, 예를 들어 실리콘, 유리, 혹은 플라스틱 등과 같은 물질들이 미세유체분석장치의 채널(channel)을 제공하는데 사용되어 왔다. 이런 물질들 각각은 단점들을 가지고 있다. 실리콘과 유리는 비용적인 면에서 효율적이지 않다. 실리콘은 대규모의 화학적 에칭(etching)과정을 거칠 것이 요구되는데 이는 미세 채널의 제조과정에서 생체적응물질(biomaterials)을 비활성화시켜서 생체적응물질들과 양립할 수 없게 한다. 플라스틱은 일반적으로 소수성(hydrophobic)이어서, 수동 모세관 수송(passive capillary transportation)을 사용하는 다공성 막과는 달리, 분석물들을 채널로 흘러들어가게 하는 능동 수송 수단(active transportation)을 필요로 한다. 필름타입의 미세유체장치가 고안되었으나 이는 유체채널을 만들기 위해서 다이절단 접착테이프(diecutting adhesive tape)를 사용한다( 예를 들어 미국특허번호 제6,790,599호-O'Coner 등, 미국 특허번호 제6,857,449호-Chow등 을 참조할 수 있다). 또 다른 방법으로서 미국 특허번호 제6,790,599 Madou등 에는 광식각법(photolithography)을 이용한 미세 유체 채널제조 방법에 대해 기술되고 있으나, 상기 발명은 생화학적 물질 분석을 위한 실질적으로 사용가능한 미세유체장치를 제공하고 있지 않다.
대부분의 면역크로마토그래피 분석법은 빠르고 단일 단계이며 분리를 필요로 하지 않으며 시료 전처리를 요구하지 않는 균질한 분석법(homogenous assay)처럼 보인다. 그러나, 비결합 리간드들을 수용체와 결합된 것들로부터 분리하는 것이 검사 공정(test procedure)에 속해 있으며, 이는 슈도균질분석법(pseudo homogenous assay)로 명명된다. 이러한 분리는 분석 용액이 비고정된 분석라인(test line)을 통과할 때 발생된다. 전기화학적 분석법은 글루코오스이나 유당, 또는 무기물 같이 작은 분자들의 정량적인 측정에 널리 사용되고 있다. 그리고 또한 큰 분자들에서도 사용되는데 이는 그 방법의 간단성(simplicity)이나 비용효율성(cost effective)에 기인한다.
막 기반의 면역 크로마토그래피 같은 단일단계 분석법(one step assay)에 의해 큰 분자들을 검출할 때 이 기술이 사용될 경우, 이 기술은 문제점들을 갖는다. 전기 화학적 반응들은 신호를 발생시키기 위해 효소반응의 기질(substrate)들을 요구하기 때문이다. 결합 물질(binding substance)과 결합된 효소는 기질과 분리된 상태로 두어야 하고, 순차적으로 제공되어야 하는데 이는 분석물(analyte)과 반응하기 전에 효소와 기질이 자기반응(self reaction)해 버리는 것을 막기 위함이다. 이 과정을 수행하기 위해서는 결합정도(binding level)을 측정하기에 앞서 비결합 리간드를 수용체와 결합된 것들로부터 분리하기 위한 세척단계가 필요하다. 1995년에 이브니티스키(Ivnitiski) 등은 분리단계가 없는 단일단계의 전류 면역 측정장치를 이전의 효소채널면역 분석법(enzyme-channeling immunoassay)을 변형하여 발명하였다. 이러한 변형에도 불구하고 다공성 막 기반의 면역크로마토그래피분석법들은 일정한 유속이나 이동시간을 제공하지 못하므로 정량분석에는 매우 부적절 하다.
발명의 목적 및 요약
새롭고 개선된 미세유체장치와 분석키트(assay kit)를 제공하는 것이 현 발명의 목적이다.
본 발명의 또 다른 목적은 현 분석 기술의 약점들을 보완하고 더 빠르고 더 저렴하고 사용하기 간편하고 더욱이 정량분석에도 사용될 수 있는 새롭고 개선된 미세유체장치를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 검사의 정확도가 증가되고 정성 분석뿐 아니라 정량 분석에도 사용될 수 있는 일회용 현장분석기(POC test)를 제작하는 새롭고 개선된 방법들을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 이전에 언급했던 선행 제조 기술의 단점을 제거한 일회용 현장분석기 제조에 있어서 새롭고 개선된 방법들을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 유속과 이동 시간 길이의 일정성을 제공할 수 있는 미세유체장치를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 현재 분석 기술에서 나타난 문제점들을 해결하고 빠르고 저렴하고 사용하기 쉽고 정량분석 시스템에서도 사용할 수 있는 미세유체장치들을 사용하는데 있어서 새롭고 개선된 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 새롭고 개선된 전기 화학 센서 장치( electrochemical sensor devices)를 제공하는 데 있다.
이러한 목적들 중 적어도 하나 이상의 목적들을 달성하기 위해서 신속 면역분석법을 수행할 수 있는 본 발명의 미세유체장치의 구체적인 실시태양으로서 예를 들면 3개의 층, 소위 하부지지층(bottom support layer), 중간 포토레지스트층(photoresist layer), 덮개 층(cover layer)을 갖는 다층의(multilayer) 적층물(laminate)을 들 수 있다. 비록 지지층(support layer)에 어떤 형태의 지지체(support), 바닥(base), 기판(substrate) 또는 소재층 또는 이들의 결합이 사용될지라도, 한 바람직한 실시태양에서 지지층(support layer)은 결합물질이 혼합할 수 있는 중합필름(polymeric film)을 포함한다. 이때, 지지기판(backing substrate)은 지지층에 결합하여 더 큰 힘을 제공하도록 한다. 선택적으로 중합 필름은 한쪽 면 또는 한쪽 면의 일부분이 금속 필름(metallic film)이나 또는 다른 것으로 코팅될 수 있으며 이는 결합물질이 결합 될 수 있도록 하기 위함이다. 금속 필름은 전극의 일부분을 구성할 수 있다. 생물유래성(biogenic), 또는 면역반응성(immunoreactive) 항체나 항원과 같은 결합 물질들은 하나 또는 그 이상은 중합필름이나 기타 코팅체(coating) 또는 금속 필름에 직접 흡수되거나 또는 폴리피롤(polypyrrole), 설폰화 테트라플루오르에틸렌 코폴리머(sulfonated tetrafluorethylene copolymer, NAFION®), 알콕시실란(alkoxysilane) 또는 이들의 혼합물과 같은 얇은 단일 층과의 결합에 의해서 고정될 수 있다. 중간필름(intermediate film)은 금속필름이나 기타 코팅체(coating)들과 같은 면에 중합 필름(polymeric film)과 직접적으로 결합되어 있어, 이 중간필름은 에칭 처리된 미세유체채널과 챔버(chamber)를 포함하는 포토레지스트 필름(photoresist film)을 포함할 수 있다. 이러한 포토레지스트 필름은 DuPon사의 RISTON®과 같은 폴리이마이드(polyimide) 포토레지스트 필름으로 구성될 수 있다. 에칭은 예를 들면 광식각법(photolithography)과 같이 당업계에서 잘 알려진 방법들에 의해 수행될 수 있다. 덮개 층은 중합필름(polymer film)을 포함하는데, 이는 포토레지스트층과 직접 결합하여 접촉하고 있어 본 발명의 적층물(laminate)을 형성한다.
하나의 구체적인 태양으로서, 포토레지스트 층(photoresist layer)은 적어도 세 개의 미세유체 부분들을 포함하고 있다: 즉, 유입 챔버(inlet chamber) 또는 유입부분(inlet region), 반응시약(ragent) 또는 반응(reaction) 챔버(chamber) 또는 부분, 그리고 적어도 하나의 검출 챔버(detection chamber) 또는 검출 부분이 포함된다. 여기에 하나 또는 그 이상의 혼합부분(mixing region)이 예를 들어 유입 챔버와 반응 챔버 사이에 제공될 수 있고, 하나 또는 그 이상의 흡수지역은 예를 들어 마지막 검출 챔버의 하류에 제공될 수 있으며, 에어벤트부분(air vent region)이 제공될 수도 있다. 챔버나 부분들은 미세유체채널에 의해 서로 연결되어 있어서 시료 유체(sample fluid)의 흐름 경로(flow path)를 형성하게 된다.
사용시에 있어서, 분석될 분석물을 포함한 액체 시료가 시료 유입 챔버로 유입되면, 액체 시료는 모세관작용(capillary action)에 의해서 시료 유입 챔버로 빨려들어가게 되고, 이어서 반응 챔버(reaction chamber)로 흘러들어가게 되는데, 여기서 시료는 표지 된 항체(labelled antibody)와 같은 반응시약과 혼합되게 된다. 이 표지들은 형광표지나 전기화학적 표지 또는 당해 분야에서 잘 알려진 기타 표지들로 구성될 수 있다. 시료가 반응 챔버를 흘러나오게 되면 이는 검출 챔버로 흘러들어간다. 이때 선택적으로 혼합채널(mixing channel)이 반응 챔버와 1차 검출 챔버 사이에 위치할 수 있다. 혼합 채널에서의 시료와 반응시약의 완벽한 혼합이 분석시료와 반응시약들 간의 반응을 확실히 할 수 있도록 한다. 일반적으로 면역복합체는 분석물과 표지 된 항체(antibody)사이에서 만들어진다. 검출 챔버 또는 검출 챔버들에서 분석물-항체 혼합물은 2차 항체와 결합하게 되는데 이는 검출 챔버와 바로 결합되어 있다. 따라서 분석물-항체 복합체는 포획되어 검출 챔버에 고정되게 된다.
이러한 포획된 복합체(captured complex)의 양은 형광 검출계 (fluorescence detector), 광학 검출계(optical detector) 또는 전기 검출계 (electrical detector)에 의해 측정될 수 있다. 액체 시료는 선택적으로 검출 챔버를 통과하여 흡수 지역으로 흘러들어가게 되는데 이 지역은 하나 또는 그 이상의 흡수채널(absorbent channel)들의 한 세트의 형태를 취하고 있다. 액체시료는 흡수 지역이 액체로 가득 찰 때까지 계속 흘러들어가게 된다. 미세유체 시스템(microfluidic system) 내의 공기는 검출 챔버(들)이나 흡수 지역으로 연결된 하나 또는 그 이상의 에어벤트를 통해 빠져나가게 된다.
본 발명의 미세유체장치는 인라인 롤 투 롤 프로세스(in-line roll to roll process)에 의해 제작된다. 본 발명에서 하나의 예시화된 제조방법을 보면 원료 물질들은 하부 층(bottom layer)의 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET, polyethylene terephthalate) 필름 롤(roll)과 중간층(middlelayer)의 건조 포토레지스트 롤(dry photoresist roll), 그리고 PET필름이나 접착테이프(adhesive tape)와 상부 덮개 층(top cover layer)의 세개의 롤(roll)들로 되어 있다. 이러한 롤들은 적층화(lamination), 자외선 노출(UV-exposure), 알칼리 세척(alkaline washing), 건조, 금속 층이나 기타 다른 층들의 부가, 결합시약의 부가 등과 같이 일련의 프로세스 단계를 거치게 된다. 그리고나서 이 세 필름들은 함께 적층화된다. 끝으로 이 적층판은 개개의 적층판칩(laminate chip)들로 절단되어 신속 면역분석법이나 분석 키트로 사용되게 된다.
본 발명에서의 미세유체장치는 많은 장점들을 가진다. 이 장치를 제작하는데 사용되는 물질은 이용가능하고(available) 입수가 용이하며(affordable) 굴절성이 있으며(flexible) 그리고 니트로셀룰로오스 막만큼이나 얇아서 현장면역분석법(point of care immuno assay)에 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 미세유체장치는 정밀하게 규격화된 플로우 채널(flow channel)들을 가지고 있어 공정간 유속(flow rate)의 일관성(consistency)을 가지고 정성분석뿐만 아니라 정량분석에도 이 장치는 사용될 수 있다.
더욱이 본 발명의 미세유체장치는 시료 용액 내 특이적인 분석물의 정성, 정량적인 성질들을 쉽고 빠르게 탐지할 수 있는데 이는 결합물질 쌍들, 특히 생물유래성의 또는 면역반응성 구성요소들 간의 결합 반응이나 및/또는 기질과 활성화된 효소(active enzyme)간 효소반응 분석함에 의한다. 이러한 구성요소들 (햅텐, 특이적 생물 유래 리포터, 특이적 생물유래성 리간드, 항체, 항원, 핵산)은 특이적으로 서로 결합하거나 또는 다른 분자들(효소, 기질, 전자 매개체(electron mediator), 또는 핵산)과 수성의 분석용액 상에서 결합하는 능력을 갖는다. 그리고 구성물질 들의 결합 또는 반응에 대한 정량적인 수치는 전기화학적, 형광 또는 광학적 검출에 의해 측정되게 된다.
따라서 본 발명의 가장 중요한 특징은 한 쌍의 결합 물질들 또는 효소와 기질 간의 결합반응이나 효소반응이 가능하게 하도록 협력하는 일련의 미세유체 채널 또는 챔버로 된 독특한 구조에 있다.
결합 분석 시스템(binding assay system)에서 반응 챔버 또는 지역은 건조된 형태의 버퍼반응시약(buffer reagent), 생화학적 반응시약, 금입자, 효소 또는 형광 염료로 표지된 항체나 항원을 포함하고 있다. 반응 챔버나 지역은 코팅된 고정항체나 항원으로 구성되어 있어서 항원-항체 복합체를 포획한다.
또한 전기화학분석시스템은 시료유입 챔버(sample inlet chamber), 반응 챔버, 적어도 하나의 검출 챔버 그리고 흡수 지역 또는 챔버로 구성될 수 있다. 각각의 검출 챔버는 코팅된 특이적 효소나 기질로 구성되어 있어서 특이적으로 시료 용액 속 분석물과 반응할 수 있다.
본 발명에서, 분석될 분석물을 함유한 액체 시료는 흡수지역 또는 챔버가 다 채워질 때까지 시스템을 통과하여 흐르게 된다. 이러한 흐름은 흡수지역이나 챔버가 다 채워지면 멈추게 된다. 따라서 과량의 적하(loading)는 불가능하다. 이러한 유체의 흐름 현상은 모세관 흐름에서 일반적이며 이는 주어진 분석 용액의 정밀한 샘플링을 제공할 수 있는 장점이 있다. 막에 기반의 분석법의 흡수패드의 비예측성과는 반대로, 미세유체장치는 정량분석의 수행에도 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 장점은 분석될 분석물이 포함된 액체시료가 유입 챔버에 유입될 때 모세관 작용에 의해 일정한 속도를 유지하면서 액체가 유입 챔버로 들어가게 된다는 것이다. 시료는 반응 챔버에 도달하여 그곳에 있는 건조한 반응시약들을 적시게 된다. 혼합물은 혼합 챔버를 함께 통과하게 되고 이때 설계된 흐름 채널(flow channel)에 의해 활발하게 혼합된다. 건조 반응시약의 주요 구성성분은 표지된 항체 또는 항원이나 기타 구성물과 결합하는 반응시약이 함유되어 있다. 이들이 혼합 챔버를 통과함에 따라서 분석물과 반응시약은 강한 복합체를 형성하게 된다.
검출 챔버 또는 하나 이상이 있는 경우라면 검출 챔버들에서, 분석물 복합체로 구성된 액체 시료는 적층류 프로필(laminate flow profile)을 형성하면서 흐르게 된다. 각각의 검출 챔버 내에는 고정된 항체 항원 또는 기타 분석물 결합 입자들이 존재하여 복합체를 형성하게 된다. 이 복합체와 접촉함으로써 두 번째 결합이 발생되어 복합체가 검출 챔버 표면에 포획된다. 결합되지 않은 복합체들과 다른 결합되지 않은 물질들은 흡수 챔버(absorbent chamber)로 세척되어 나가게 된다. 흡수 챔버가 다 채워지면 흐름은 멈추게 되고 이로써 정량 분석에서 요구되는 정확한 샘플링이 가능하게 된다.
효소가 표지된 항체 또는 항원 또는 기타 결합 복합체의 전기 화학검출은 잘 알려져 있다. 금 전극이나 탄소전극뿐 아니라 은/염화은(silver/silver chloride) 기준전극도 사용될 수 있다. 또한, 다른 방법으로는 형광염료의 형광을 또는 입자들｛유레피움(europium)이나 양자입자(quantum particle)로 표지된 항체, 항원 또는 다른 결합체의 광학적 검출법을 사용할 수도 있다.
따라서 본 발명의 미세유체장치들은 분석물이나 하나 또는 그 이상의 결합 물질들, 예를 들어 생물유래성의 또는 면역 반응성 물질들과 같은 물질들의 결합 성질을 분석함으로 인해서 시료용액의 분석물들을 정량적으로나 정성적으로 모두 측정할 수 있다. 햅텐이나 특이적인 생물유래성 리포터들, 특이적인 생물유래성 리간드들, 항원, 그리고 항체와 같은 이러한 결합 물질들은 수용성의 시료 용액 속에서 분석물과 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 가진다. 몇몇의 구체화된 사례에서 이러한 분석물들은 하나 또는 그 이상의 결합 에피토프(epitope) 들로 구성되어 있으며 1차 결합 에피토프에서의 결합이 2차 결합 에피토프에서의 결합을 방해하지 않는다. 결합물질과 반응물질들은 결합해서 복합체를 형성하게 되는데 이 복합체는 광학적 검출이나 형광검출 또는 전기 화학적 검출법으로 검출될 수 있다.
발명의 상세한 설명
함께 첨부된 도면에 의하면 참조번호(reference numbers)는 같거나 또는 비슷한 구성요소를 의미하는 것이고, 본 발명의 미세유체장치의 한 구체적 태양으로서 도 1에 기재된 장치는 일반적으로 10으로 표시한다. 미세유체장치 10은 지지체 22, 지지체 22 위에 배열되어 있는 포토레지스트층 14 , 포토레지스트층 14 위에 위치한 덮개 층 16, 지지체 22와 연결된 전기연결유니트(electrical interconnection unit) 18이 포함되어 있다.
지지체 22는 미세유체장치 10의 지지구조(support structure) 전부 또는 그 일부를 구성하여 포토레지스트 층 14의 견고한 기초기판(underlying substrate)을 형성할 수 있도록 한다. 이러한 지지구조는 바닥(base)이나 기판(substrate), 소재층 각각 또는 그것들의 다양한 조합으로 구성될 수 있다. 상기 구체 태양에서 지지구조는 단단한 지지기판 20과 지지체 22를 포함하고 있으며 지지기판은 힘과 견고함을 미세유체장치에 제공하고 지지체 22는 1차 PET 필름 22 로서 이의 하부 표면은 지지기판 20의 상부표면과 바로 결합해 있거나 부착되어 있다. 본 발명의 바람직한 한가지 예로서 지지체 22는 비전도성(non-conductive) 중합 필름으로 될 수 있다. 지지체는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)나 폴리에틸렌(PE) 또는 폴리카보네이트로 구성될 수 있다. 지지체가 PET로 구성됨이 바람직하다. 지지기판 20은 폴리프로필렌, 폴리카보네이트 또는 폴리스티렌 플리스틱 카드로 구성될 수 있다. 당업자는 힘과 견고함을 제공하는 다른 사용 가능한 지지기판을 도입할 수도 있다.
포토레지스트층 14는 폴리이마이드 폴리머(polyimide polymer)로 구성될 수 있으며 이의 하부표면은 1차 PET필름과 결합 또는 접해 있다. 포토레지스트 층 14의 상층 표면은 덮개 층 16과 결합 또는 접해 있다. 선호되는 실시태양에서 포토레지스트 층 14는 건조 포토레지스트 필름으로 구성되는데, 예를 들어 DuPont RISTON®, Pyralux PC1025, Pylalin PI2721 또는 SU8코팅필름 등을 들 수 있다. 건조 폴리이마이드 포토레지스트 필름, (예를 들어서 Dupont 사의 RISTON®)은 전자업계에서 인쇄회로기판 (printed circuitboard)의 생산에 널리 사용된다. 건조 포토레지스트 필름은 약 염기용액에서 쉽게 분해되어 진다. 하지만, 자외선에 노출시키면 포토레지스트 필름은 중합화(polymerization)되어 염기성 용액에서의 분해(dissolution)에 저항성을 갖게 된다. 더욱이 일단 포토레지스트 필름이 중합화되면 이는 수용액에서 안정화되고 높은 습윤성(good wetting properties)을 갖게 된다. 따라서 이러한 건조 포토레지스트 소재(photoresist materials)들은 채널이나 챔버, 그리고 후에 논의될 다를 구조들의 형성에 유일하게 적합하게 된다.
덮개 층 16은 2차 PET 필름(film)이 될 수 있다. 이 덮개 층 16은 중합 필름이거나 접착 필름(adhesive film)일 수 있다. 덮개 층 16은 투명이거나 반투명일 수 있다. 형광이나 광학적 검출 방법을 사용할 경우에는 덮개 층 16이 투명한 것이 유리하다. 하나의 비제한적인(non limiting) 예로서 덮개 층 16은 PET나 폴리에틸렌(PE), 폴리카보네이트 습윤성 폴리이마이드 또는 접착 필름 중에서 선택할 수도 있다. 이하 본원 미세유체장치의 다른 덮개 층뿐 아니라 본 덮개 층 16까지도 간단히 덮개(cover)라 칭하겠다.
본 발명의 선호되는 한 면에 있어서 전기연결유니트(electrical interconnection unit) 18은 전기적으로 포토레지스트 층 14(구체적인 위치는 후에 기술함)와 판독장치(reading unit)를 연결하고 이 판독장치는 미세유체장치 10을 감싸는 틀(housing) 50과 연결되어 있다 (도 7 참조). 전기 연결부위 18은 전극 30과 33을 포함한다. 한 실시 예로 전기연결부위 18은 전기전도성 물질로 만들어진 L형 연결핀 28 한 쌍을 더 포함할 수 있다. 전극 30과 33은 공지된 제조방법들 예를 들어 광식각법 , 스크린 프린팅(screen printing) 또는 스퍼터링(sputtering)과 같은 방법들에 의해서 1차 PET 필름 22와 연결되거나 그 위에 형성된다. 한 예로서 전극 30과 33의 일부분은 포토레지스트 층 14의 지정된 부분 주위에 광식각법적으로 패턴된(photolithopraphically patterned) 금속 필름의 형태로 구성되고 이 필름에서 핀 28까지 뻗어지게 된다. 바람직하게는 전극 30과 33은 직접적으로 1차 PET필름 22와 결합될 수 있다.
전기 연결 부위 18에 사용되는 전도성 있거나 금속의 물질들로는 금이나, 인듐 틴 옥사이드(indium tin oxide,ITO), 은, 백금(platinium), 팔라듐(palladium)등 각각 또는 이들의 혼합물 등이 있다. 미세유체장치가 형광 또는 광학적 검출에 사용되는 경우에는, 전기연결유니트 18은 불필요하다.
본 발명의 하나의 예시화 된 구성을 보면, 전극 30 과 33 은 실질적으로 U-자 형태를 가지고, 한쪽 끝에는 전극패드 32 를 가지고 있으며, 이는 각각의 연결핀 28 과 바로 연결되어 있다. 패드 32의 반대편에는 전극( electrodes) 30 과 33의 작동부위 34와 35가 있고 이는 포토레지스트 층 14의 지정된 부분의 아래 위치하게 된다. 단 패드 32의 형태나 작동부위 34와 35의 형태는 하나의 예시일 뿐이고 도 2의 특정 형태에 국한되지 않는다. 덮개 층 16 은 패드 32와 나란히 배열된 틈(aperture)들을 가지고 있다. 포토레지스트 층 14와 덮개 층 16에서의 이러한 틈들은 도면 2에서와 같이 전극 30, 33이 노출 되도록 하여 연결핀 28 과 연결될 수 있도록 한다. 전극 30 과 33 중에서 어느 하나는 작동전극( working electrode)이고 다른 하나는 기준전극(reference electrode)으로 작용하게 되는데 이는 당업자들에게 잘 알려져 있다.
전극들은 전기전도성을 가지는 어떠한 물질로도 구성될 수 있으며 예를 들어서 금, 인듐틴옥사이드, 은, 백금, 팔라듐, 또는 이들의 결합을 예로 들 수 있으며 다만 이는 예시일 뿐 상기의 물질들로 한정되지는 않는다.
연결핀(connector pins) 28의 한가지 예시로서, 연결핀 28은 분리된 플랜지(flange)들을 갖는데 이는 지지 PET 필름 22와 지지기판 20의 반대 편에 연결되어 있어 패드32에 압력을 가함으로써 연결핀 28과 패드 32 사이의 안정된 전기적 연결을 제공하게 한다. 패드 32에서 핀까지의 전기적 통로를 형성하는 다른 전기적 연결 메커니즘은 본 발명의 범위와 이념을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명에 사용될 수 있다.
미세유체장치 10의 구성에 대한 한 실시 예로서, 덮개 16과 지지 PET 필름 22의 두께는 대략 100μm 두께로 할 수 있다. 포토레지스트 층 14의 두께는 약 25 에서 100 μm 정도이고 바람직하게는 50μm 의 두께를 가질 수 있다. 미세유체장치 10 은 지지기판 20 위로 약 250 μm 의 두께를 갖는 것이 바람직하다. 전극(electrodes) 30, 33 의 두께는 50μm이하가 바람직하고 이는 미세유체장치 10의 포토레지스트층14의 두께 보다는 얇아야 한다. 전극(electrodes) 30, 33 의 두께는 약 2에서 20μm 가 더욱 바람직하다. 전극 물질 (electrode material) 이 ITO일 경우에는, 그 전극의 두께는 2μm일 수 있다.
도 2B 와 2C 는 미세유체장치 구성에 있어서 또 하나의 다른 구성을 보여준다.
도 2B에 의하면 미세유체장치 210 은 지지체 222와, 지지체 222의 위에 위치하는 포토레지스트 층 214 , 포토레지스트 층 214의 위에 배열된 덮개 층 216 그리고 지지체 222와 연결되어 있는 전기연결유니트 218 을 포함하고 있다.
다른 대안으로서 커버 216 은 2개의 시트(sheet)로 구성되며 이 두 개의 시트 사이에는 접합 갭 (junction gap) 201이 존재한다. 이 접합 갭 201 은 도면 2에서의 지연 채널 (delay channel)38 과 유사하여 분석물 분석 시간을 지연시킴으로써 흐름의 안정화에 유용하게 사용된다. 그러나 이러한 접합 갭은 시료 액의 유출(leakage)을 유발할 수 있을 정도로 너무 넓어서는 안 된다. 반응지역 240 은 시료 유입 챔버 236 와 혼합 지역 242를 연결하는 채널 내에 위치한다.
전기연결유니트 218 은 전극 230 과 233을 포함한다. 전극 230 과 233 의 각 말단에서, 전극의 작동 부위(working portion) 234 와 235 은 검출 챔버 244로 정의되는 포토레지스트 층 214의 지정된 지점의 밑에 존재한다.
덮개 층 216의 길이는 포토레지스트 층 214보다 짧으며, 따라서 전극 부분이 노출되게 되어 연결핀과 연결될 수 있도록 되어 있다 (이번 예시에는 보여지지 않으나 이는 상기에서 설명한 바와 동일하다). 흡수채널( absorbent channel)의 열린 말단은 에어벤트를 형성한다. 전극 패드에서 덮개 층 216 의 길이는 바람직하게는, 포토레지스트 층 214 보다 약간 짧아서 에어 벤트들을 제공하게 된다.
도면 2C에 의하면, 미세유체장치 310 는 지지체 322, 이 지지체 322의 위에 배치된 포토레지스트 층 314 그리고 포토레지스트 층 341위에 위치하는 덮개 층 316 으로 구성된다. 미세유체장치 310 은 접합 갭 301을 포함하는데 이는 덮개 층 316 의 두 시트 사이에 존재하게 된다. 바람직하게는, 본 발명에서 미세유체장치는 분석될 여러 분석물들을 동시에 처리할 수 있다. 이러한 미세유체장치는 하나 또는 그 이상의 검출 챔버 또는 지역을 포함하고 있을 것이다. 하나의 예시로서, 미세유체장치 310 은 3개의 검출 챔버 또는 지역 344를 포함한다(도 2C 참조). 세 개의 검출 챔버 중 하나는 기준(reference) 을 위함이고 다른 검출 챔버들은 분석될 분석물(analytes)을 위함이다. 검출 챔버 344 각각은 금속필름이나 중합필름과 결합 된 서로 다른 물질(substance)을 포함하고 있다. 물질과 금속 필름 또는 중합 필름 사이의 소수상호작용(hydrophobic interaction)과 정정기적 상호작용(electrostatic interactions)에 의해 물질이 세척되어서 흡수채널로 흘러들어가는 것을 방지할 수 있다. 또는 물질은 자기응축 단일층(self-assembled monolayer) 예를들면, 폴리피롤, 설폰화 테트라플루오르에틸렌 코폴리머 (NAFION®), 알콕시실란 또는 이들의 복합체 등으로 코팅된 금속 필름 또는 중합 필름과 직접 결합할 수 있다. 이런 자기 응축 단일 층(SAM)들은 결합 효율을 높여주고 결합력을 증가시켜 준다. 물질은 자기응축 단일 층으로 코팅된 금속 전극, ITO 또는 중합 필름과 잘 결합한다. 검출 챔버에서 금속전극 이나 중합필름에 항체를 고정시키거나 분자들을 포획시키기 위하여 금속 전극이나 중합 필름의 표면을 자기 응축 단일층 으로 제조하거나 소수성 폴리머 프린팅(hydrophobic polymer printing)으로 제조할 수 있다. SAM 은 단방향 층(unidirectional layer)으로서 SAM-필름을 형성하는 분자들의 자발적인 응축(spontaneous aggregation)에 의해 표면에 형성된다.
티올기(thiol)를 포함하는 SAM 형성 분자들은 금과 결합하는 것으로 잘 알려진 분자들 중의 하나이다. 카르복실알칼라인티올(Carboxyalkanethiol) 화합물과 숙신이미딜 알칸디설파이드 화합물(숙신이미딜 에스테르기를 말단에 가지는 알킬디설파이드류)은 금 표면에 SAM을 형성하는 것으로 널리 사용되는데 이는 카르복실 그룹이나 아민 반응성 부위(amine reactive sites)를 끌어들인다. 숙신이미딜 에스테르기를 말단에 가지는 알킬디설파이드는 카르복실디설파이드의 아민 반응성 아날로그가 된다. 카르복시알칸티올의 카르복실 그룹은, 활성화된 N-하이드록시 숙신이마이드 에스테르(N-hydroxysuccinimide ester)로 변환되어 항체나 포획분자들의 아민과 결합하게 된다. SAM으로 코팅된 표면은 항체나 포획분자를 고정하기 위한 더 이상의 결합제(coupling agent)를 필요로 하지 않는다. SAM-형성 분자들은 스파팅(spotting) 이나 건조과정을 통해서 금 전극이나 중합 필름의 표면에 제공된다.
도 2B 와 2C 의 구체화된 방안에서 덮개 층 216, 316 은 접합 갭 201,301 을 형성하는데 이런 갭들은 반응 챔버 240, 340과 혼합 채널 240.340 각각의 사이에서의 흐름 속도를 연장할 수 있도록 한다.
도 2 A에서, 포토레지스트 층 14는 간단하고 효율적인 분석물 분석(analyte testing)을 제공하는 독특한 구조를 가진다. 특히 아래에서 언급하는 방법으로 형성된 경우, 포토레지스트 층 14는 독특한 패턴의 챔버와 채널로 구성되는데 이들은 신속한 분석물 분석이 되도록 서로 협력하게 된다. 도 2A는 예시화 된 패턴을 보여주는데 여기서 포토레지스트 층 14는 한쪽 끝에 위치한 유입 챔버, 이 유입 챔버와 연결된 지연채널 38, 지연채널 38과 연결되고 1차 분석물을 포함한 반응 혼합물을 담고 있는 반응 챔버 40 , 반응 챔버 40과 연결되어 주로 1차 분석물을 포함한 반응 혼합물을 담고 있는 혼합 채널 42, 이 혼합채널 42와 연결된 검출 챔버, 그리고 검출 챔버 44와 연결된 한 세트의 흡수채널 46 으로 구성된다. 비록 선형(linear) 방식으로 나타냈지만, 다양한 챔버와 채널은 비선형 방식을 포함하여 다른 방식으로 배열될 수 있다. 흡수채널 46 세트는 단지 하나의 채널을 포함할 수 있고 또는 다수의 채널을 포함할 수도 있는데, 이들의 예시들은 아래에서 언급하며 또한 도 2B 와 2C에도 나타나 있다.
유입 챔버 36 는 포토레지스트층 14 의 일부를 구성하며 이 안에는 분석 될 유체가 존재한다. 덮개 층 16 에는 유입 챔버 36과 나란히 위치한 틈(aperture) 48이 존재하는데 이는 유체가 유체챔버로 흘러가는 것이 방해받는 것을 방지하기 위함이다. (도 1 참조).
지연 채널 38 은 분석물 분석 시간을 지연시키는 역할을 하며, 또한 흐름의 안정화(flow stabilization), 예를 들어 시료 유체의 흐름을 안정화하는데 유용하게 사용된다. 지연채널 38은 일련의 횡단구획들(transverse sections)과 인접한 횡단구획들을 연결하는 종단구획들(longitudinal sections)로 구성되어 사(蛇)형의 (meandering) 경로를 형성하게 된다.
혼합 채널 42 은 포토레지스트 층 14 너비의 많은 부분을 가로지르는 일련의 횡단 구획들과, 인접한 횡단 구획들을 연결하는 종단구획들로 구성되어 사형의 경로를 형성한다.
전극 34 와 35 의 작용부위는 검출 챔버 44와 나란히 배치되어 있거나 적어도 그 일부분을 형성하고 있다. 그래서 작동부위 34, 35와 나란한 포토레지스 트층 14부분은 검출 챔버 44가 된다.
흡수 채널 46의 세트들은 긴 종단 구획과 종단 구획의 위쪽 끝 부분을 가로지르는 횡단 분배 구획으로 구성되어 있다. 검출 챔버 44로부터의 유입 부분(inflow section)은 횡단 분배 채널이 있는 중간 지점으로 연결된다.
흡수 채널세트 46 의 다양한 예들은 도3 A, 3B, 3C에 나타나 있다. 예를 들어, 수행되어 지는 분석에 따라서 채널들의 폭과 길이, 챔버들의 볼륨이 다양하게 된다. 세척과정을 요구하는 분석에서 흡수채널의 볼륨은 다른 부분의 채널과 챔버의 총 볼륨보다 큰 것이 좋으며, 다른 부분의 채널 볼륨보다 대략 3배 이상 큰 것이 바람직하다.
미세유채 채널 38, 42, 46 의 폭(width)은 약 50미크론(microns)에서 약 1000 미크론까지 다양하고, 바람직하게는 약 50 미크론에서 500 미크론 사이가 된다. 또한, 약 300 미크론 정도가 더욱 바람직하다. 채널의 높이(height)는 약 25 미크론에서 약 300 미크론까지 다양하며, 바람직하게는 약 50 미크론이 바람직하다.
챔버 36, 40, 44뿐만 아니라, 채널 38, 42, 46도 지지체 22의 일부(채널과 챔버의 하부), 포토레지스트 층 14의 일부 (채널과 챔버들의 벽 부분), 그리고 덮개 층 16의 일부분(채널과 챔버의 윗부분)으로 구성된다. 상기 지지체 22, 포토레지스트 층 14 그리고 덮개 층 16의 적층화는, 예를 들어 아래에서 설명한 방법에 의할 경우, 미세유체장치 10에서의 잘 규정된 흐름 경로(well-defined flow path)를 제공한다.
중간층 14 는 건조 포토레지스트 필름으로서 엄밀하게 정의된 미세유체채널구조를 제공한다. 중간필름은 일반적으로 50 미크론의 두께를 가지는 네거티브 포토레지스트 물질(negative photoresist material)로 되어 있다. 마스크(mask)에 의해 차폐되지 않은 부분은 강한 자외선 하에서 중합화 되어 불용성의(insoluble) 중합필름으로 변화된다. 필름의 차광 되지 않은 부분은 알칼리 용액의 스프레이에 의해 쉽게 부식되게 된다. 중합 화 되고 강화된 필름은 친수성을 가지며, 이는 본 장치의 장점이 된다.
도3A, 3B 그리고 3C에서, 흡수 채널의 일련의 세트 46, 246 와 346 은 긴 종단 구획과 종단 구획의 상단을 가로 질로 뻗어 있는 횡단분배구획을 포함하고 있다. 검출 챔버 44의 유입구획(inlet section)은 횡단 분배 채널과 연결되어 있다.
도 3D 와 E에서 반응채널세트는 단일 채널을 가지는데 이는 일련의 긴 종단 구획과 짧은 횡단 연결 구획으로 구성되어서 사형의 경로를 형성하게 된다.
도 3G에서 채널 세트는 일련의 타원형구획(oval sections)을 포함하는데 이는 시료용액의 흐름 속도를 조절하는 기능을 한다.
도 3F에서, 채널세트는 일련의 종단 구획과 횡단 연결 구획을 갖아 사형의 경로를 형성하며, 채널의 중간 부분에는 확장된 챔버(enlarged chamber)가 위치한다.
도 2A에서 보여진 바와 같이, 반응 챔버 40과 검출 챔버 44는 실제로 직사각형의 형상을 띌 수 있다. 또한, 이 챔버들은 도 3 G 에서 보여지는 바와 같이 점차 직경이 증가하는 원형으로 형성될 수도 있다. 검출 챔버 44 및/또는 흡수 채널 세트에 연결된 에어벤트 지역(air vent areas)을 통과함에 따라서 포토레지스 트층 14에 있는 챔버들과 채널들로부터 공기가 제거되게 된다. 하나 또는 그 이상의 흡수 채널 46들의 열린 말단들은 에어벤트 지역을 형성하거나 포함할 수 있다.
미세유체장치 10 는 예를 들어 플라스틱 등으로 만들어진 틀 속에 설치되어 아주 튼튼한(complete robust) 신속 분석 키트를 형성할 수 있다. 최소한으로, 틀은 유입 챔버 36 으로 분석 될 유체의 유입이 허용되어야만 하고 바람직하게는 검출 챔버 44가 보이게 할 수 있다. (이는 적어도 검출 챔버 44에 도달된 분석 유체 부분을 확인하기 위함이다). 이러한 틀은 다양한 형태들(multiple forms)을 가질 수 있다.
이러한 틀의 한 예가 도면 4 내지 6 에 기재되어 있는데, 여기서 미세유체장치 10은 틀의 상부 52 와 하부 54로 구성된 틀 50의 내부에 위치하게 된다. 틀의 하부 54는 평면 바닥(planar base) 56, 바닥 56으로부터 위쪽으로 확장된 외벽(peripheral wall) 58, 움푹한 지역(recessed area) 60, 바닥 56의 내부 면에 형성된 포지셔닝 리지(positioning ridges) 62 그리고 그 사이로 지지기판 20이 들어갈 수 있도록 다른 부분들과 떨어진 사이 공간을 포함하여 구성될 수 있다. 틀 하부(Lower housing part) 54 는 또한, 접합 구조(mating structure) 64를 포함할 수 있는데 이는 틀 상부 52의 상응하는 접합구조와 접할 수 있도록 한다.
틀 하부 54 또한 바닥 56에 한 쌍의 틈이 존재하는데 (보이진 않는다) 이를 통해서 연결핀 28은 틀 50의 외부로 뻗어나가 판독장치 24 와 전기적 연결이 될 수 있게 된다(도 7). L형 핀 28 대신에, 핀 28 은 직각의 벤드(perpendicular bend)가 없는 형태로 구성되어 바로 미세유체장치 10을 빠져나갈 수 있으며 이 경우, 이런 핀들이 틀 50의 바깥으로 통과하기 위한 틈들은 상부 틀, 하부 틀, 또는 둘 다에 제공되어 있어야 한다. 키트 24에서, 당업자는 발명의 기본 범위나 이념을 벗어나지 않는 범위에서 다른 판독장치 24 와의 전기적인 연결법 들을 사용할 수 있다.
틀 상부 52 와 틀 하부 54를 연결하여 틀 50 형성하기 전에, 필터(filter) 66을 유입 챔버 36위에 두어야 하는데 이는 분석 될 유체를 여과(filter)하기 위함이다(도 5 참조). 필터 66 (그리고 필터 266과 366)은 결합신호 생성을 방해하거나 포토레지스트 층 14의 미세유체채널을 막을 가능성이 있는 입자들을 제거하기 위해 구성된다.
틀 상부 52는 시료 웰(sample well) 70을 갖는 평면 바닥 68을 포함하게 되는데 이 시료웰 70은 덮개 층 16 에 있는 틈 48 과 나란히 위치해 있고, 따라서 유입 챔버 36과도 나란히 위치한다. 바닥 68은 검출 챔버 44와 나란히 위치한 검출 챔버창 74을 포함할 수 있다. 또한, 반응 챔버 40과 나란히 위치한 반응 챔버창 72를 포함할 수도 있다. 반응 챔버 40 과 검출 챔버 44가 상기의 창들 72, 74를 통해 보이기 위해서는 덮개 층 16 은 투명한 물질로 만들어져야 한다. 덮개 16 과 검출 챔버 창 74가 투명한 경우 형광 또는 광학적 검출 방법을 사용할 때 이점을 가지게 된다. 건조된 반응시약의 수화(wetting)는 반응 챔버창 72에서 모니터링 할 수 있고, 검출 챔버 44는 검출 챔버 창 74를 통해서 시각적 관찰을 할 수 있다.
한 구체화 방안에서 도 2C와 같이 하나 이상의 검출 챔버가 존재할 수 있으며, 도 2C에서는 3개의 검출 챔버 344 들이 존재하고, 그 바닥 68에는 도 2C에서 보이는 바와 같이 각각의 검출 챔버 344를 위한 검출 챔버창이 포함되어 있을 수 있다.
1차 에피토프와의 결합이 2차 에프토프와의 결합을 방해하지 않는, 결합 물질들과 반응할 수 있는 하나 또는 그 이상의 에피토프(epitopes)를 갖는, 분석물에 대한 분석기로서 키트 26의 사용법에 관하여 이하 기술한다. 분석될 액체 시료가 제공되어 시료웰 70의 안에, 필터 66위에 놓이게 되면, 이는 필터 66을 통과하여 유입 챔버 36 안으로 들어가게 된다. 그 액체 시료는 유입 챔버 36에서부터 지연채널 38을 통과하여 반응 챔버 40으로 빨려들어가게 되고, 반응 챔버 40에서 1차 분석물 결합 물질(analyte binding substance)과 상호작용하게 된다. 1차 결합물질은 반응 챔버 40에 위치한다. 반응 챔버 40에서 액체 시료가 반응시약 혼합물을 적심에 따라, 분석물은 1차 분석물결합물질(analyte binding substance)과 반응하여 분석물-결합물 복합체(analyte-binding substance complex)를 형성하게 되는데, 이 첫 결합물질은 그 분석물의 첫 에피토프와 반응하게 된다. 반응 챔버 40으로부터, 그 액체 시료는 혼합 채널 42로 흘러들어가게 되는데 이곳에서 반응되지 않은 분석물은 첫 반응물질과 접촉되게 된다. 액체시료는 혼합채널 42에서 빠져나와, 검출 챔버 44로 흘러들어가게 된다. 2차 분석물 결합 물질은 검출 챔버 44의 작동 전극(working electrode)의 작동부분에 존재하여 분석물의 2차 에피토프와 결합하게 되는데 이에 의해 1차 결합물질-분석물의 복합체가 포획되게 된다.
액체 시료는 계속해서 흘러 검출 챔버 44를 빠져나가 흡수채널( absorbent channel) 세트 46으로 들어가게 된다. 비결합 단백질(unbound protein), 복합체, 반응시약 그리고 액체 시료의 기타 구성물질들은 검출 챔버 44를 통하여 흡수 채널세트 46으로 흘러들어가게 된다. 일단 흡수채널 46이 가득 차게 되면 액체시료의 흐름은 멈추게 된다.
1차 분석물결합물질-분석물 복합체와 두 번째 분석물결합물질의 결합에 의해 복합체는 포획되게 된다. 두 번째 분석물결합물질과 혼합물 간의 결합은 전극 30의 전기용량(capacitance), 임피던스(impedance), 저항(resistance) 또는 전류(current) 또는 전기적 상태를 변화시킨다. 전극의 전기적 상태 변화 크기( magnitude)는 결합 정도와 관계되어 있어 액체시료의 분석물 존재 정도와 관련되게 된다. 전극(electrodes) 30 과 33 은 패드(pad) 32와 연결되어 있고, 이는 이어서 연결핀 28과 연결되어 있기 때문에, 작동 전극과 기준전극 사이의 전기적 상태 변화의 차이는 연결 핀 28과 연결된 전기용량(capacitance), 임피던스(impedance) 또는 전류 측정계로 측정될 수 있다. 이러한 전기적 검출 판독장치는 판독장치 24에 존재하며 이는 연결핀 28과 전기적으로 연결된 전기적 연결체 한 쌍과 이들과 검출기를 연결하는 전기적 연결 구조를 포함한다. 당업자는 키트 26에 눈금교정전극 (calibration electrode)을 포함시킬 수 있다.
키트 26 을 보다 전문적으로 사용하면, 급성심근경색(Acute Myocardial Infarction) 진단을 위한 단일단계 면역분석장치의 수행 메커니즘을 보여주는 제안된 면역전기화학적 분석 장치로 사용될 수 있다.
흉통(Chest pain)은 예를 들어 심근 이상(heart muscle problem)등 다양한 원인들에 의해 발생하게 된다. 심혈관에 작은 혈전(blood clot)이 발생하게 되면 흉통이 발생한다. 만일 혈전이 용해되면, 흉통은 사라지게 된다. 이러한 혈전이 계속 있게 되면, 혈관은 막히고 심장 근육 부분에 산소와 영양이 공급되지 않게 된다. 죽어가는 심근 세포는 트로포닌(Troponin) I을 분비하게 되고, 따라서 상승된 트로포닌(Troponin) I 수치는 종종 심근이상(heart muscle problem)을 의미하기도 한다. 따라서 가슴 통증을 호소하는 환자의 트로포닌 I 레벨을 측정하는 것은 문제를 진단하는데 도움이 될 수 있다. 본 발명의 미세유체장치는 트로포닌I 분석 키트를 고안하는데 사용될 수 있다.
트로포닌 I이 분석물로 선택된 이러한 분석 키트를 위해서 반응 챔버40 에는, 표시표지를 붙인 건조 항 트로포닌 I 항체 , 세제(detergents) 0.01% 의tween 20, 버퍼(buffer reagent) 1OmM 의 인산나트륨(sodium phosphate) pH 7.2 그리고 안정화제(stabilizer) 0.5% 트레할로스(trehalose), 0.5% BSA 와 0.5% PEG 이 혼합되어 존재한다. 검출 챔버 44에는, 2차 항 트로포닌 I 항체가 전극표면에 공유 또는 비공유결합을 하여 고정되어 있으며 이는 트로포닌 I의 다른 에피토프와 결합하게 된다. 2차 항 트로포닌 I 항체는 0.5% BSA를 포함하는 10 mM 의 인산염 버퍼(phosphate buffer)내 농도 30μg/ml 에서 3mg/ml으로 희석되어 있다. 2차 항 트로포닌 I 항체 용액은 ㎠ 당 50μl-100μl 양이 전극 표면에 점적(spot) 되어 지고 온도 25˚C 습도 40%에서 1시간 동안 건조된다.
사용시, 트로포닌 I 을 포함한 약 5-10 ㎕의 전체 혈액시료 유체가 시료웰 70에 위치하게 되고, 혈장 시료 유체가 혈액 분리 필터 66을 통과하여 유입 챔버 36로 흘러들어간다. 그리고 지연채널 38을 통과해서 반응 챔버 40으로 흘러간다. 혈장이 반응 챔버 40에 있는 건조된 반응시약들을 적시면, 트로포닌 I 항체와 트로포닌은 항원-항체 복합체를 형성하여 혼합 채널 42로 흘러들어간다. 결합하지 않는 항체는 혼합채널 42의 혼합효과의 도움에 의해 트로포닌 I 분자와 결합하게 된다. 검출 챔버 44에서는, 2차 트로포닌 I 항체가 전극 표면에 고정되어 있어 이는 트로포닌 I 의 다른 에피토프와 결합하게 된다. 유체가 검출 챔버 44를 지나가게 되면, 항원-항체 복합체는 그곳의 2차 항체와 결합하게 된다. 비결합 복합체들과 다른 물질들은 시료 유체의 계속적인 흐름과 함께 씻겨져 나간다. 그 시료 유체는 흡수채널이 혈장으로 채워질 때까지 흡수채널 46으로 흘러들어가게 된다. 흡수채널이 채워지면 시료 유체 흐름은 멈추고 면역화학 반응은 검출 챔버 44 내에서 안정화된다.
전극 표면에 포획된 항원-항체 복합체의 양은 작동 전극 30의 전기용량이나 전압에 영향을 준다. 항원-항체 복합체가 포획되면 전극 30의 전기용량에 약간의 변화가 발생한다. 전기용량변화는 신속분석키트 26가 판독장치 24로 삽입될 때 전기용량 측정기로 측정할 수 있다. 판독장치 24 는 전기적 상태 변화를 가지고 트로포닌 I 항원의 양을 직접 판독할 수 있도록 설계되어 있다.
전술한 내용은 본 발명의 미세유체장치 10을 포함하는 키트 26의 사용에 대한 단지 하나의 예시에 불과하다. 미세유체장치 10을 포함하는 키트 26을 사용하여 도구화될 수 있는 다른 검사 방법들에는 형광, 광학컬러링(optical coloring), 전류측정(amperometric), 임피던스/전위차측정계(impedance/potentiometer) 또는 입자분석법(particle assay)이 포함될 수 있다.
형광검사법에서, 반응 챔버 40의 침전된 반응시약들은 결합물질, 예를 들어 양자(quantum) 또는 유레피움(europium) 같은 형광염료 또는 입자들과 같은 결합물질들과 결합된 항원 또는 항체들이다. 검출 챔버 44 내에 고정된 반응물질은 포획항체와 항원들이다. 광학컬러링에서, 반응 챔버 40의 침전된 반응시약들은 산화 또는 환원 효소와 결합된 항원 또는 항체들이다. 전류측정 검출법에서, 반응실 40 내의 침전된 반응시약들은 호스래디시퍼록시데이즈( horseradish peroxidase, HRP) 효소와 기질인 포도당과 결합 된 항원 항체들이다. 검출 챔버 44의 전극 30에 고정된 물질들(materials)은 포획항체 또는 항원, 글루코오스옥시데이즈(glucose oxidase) 이다. 효소 알카라인 포스파테이즈(alkaline phosphatase ,APase)와 결합된 항원, 항체는 반응 챔버 40 내에서 침전될 수 있다. 상기의 다양성들은 당업자들에게 잘 알려져 있다.
임피던스/전위차 측정계의 사용시는, 반응 챔버 40에 침전이 생기지 않는다. 전극 30에 고정된 결합물질들은 포획 항체, 항원들이다. 이 경우에 있어서 지연채널 38 과 반응 챔버 40은 제거될 수 있다. 당업자는 반응 챔버 40과 검출 챔버 44의 결합물질로 생물유래성 이나 면역반응성 물질들, 예를 들어 항원-항체, 항체-햅텐(antibody/hapten) , 효소-기질, 리포터-호르몬(reporter/hormone), 뉴클레오타이드-뉴클레오타이드 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 미세유체장치 10이 광학 컬러링 또는 전류측정 검출법에 사용될 경우, HRP 효소의 액티브한(active) 기질인 과산화수소(hydrogen peroxide)는 포획항체와 함께 전극 30의 전기전도성 표면에 고정된 글루코오스 옥시다제에 의해 생산된다. 포도당과 HRP-결합된 항체는 결합반응이 일어나는 반응 챔버 40 앞에 건조된 상태로 존재한다. 시료용액은 건조된 반응시약들을 용해시켜서 반응 챔버 40으로 들어가게 된다. 결합 감도(binding sensitivity)를 증가시키기 위해서, 포획항체 대신에 스트렙타비딘(streptavidine) 이나 아비딘(avidine) 을 고정할 수도 있다. 이 경우에, HRP-결합 항체와 비오틴(biotin)과 결합한 두번째 포획항체가 반응 챔버 40에 존재하게 된다.
상기에서 언급한 검출방법들(detection methods)은 단지 예시에 불과하고 이들이 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며 본 발명의 최근 바람직한 구체화 방안들을 제공하는 것이다.
도면 7에서 보는 바와 같이, 판독장치 24 는 분석 키트 26이 그곳의 슬롯(slot)에 삽입될 때 전기적인 신호를 읽도록 설계되어 있다. 판독장치 24는 슬롯의 경계를 짓는 틀 76 , 디스플레이 78, 버튼 80 그리고 틀 76 내부에 있는 프로세서(processor) 또는 마이크로컨트롤러(microcontroller)를 포함한다. 판독장치 24는 또한 핀 28과 연결되도록 설계된 전기적 연결장치(electrical contacts)를 포함하고 이는 마이크로 컨트롤러와 연결되어 전극 30,33을 포함한 전기회선 (circuit)을 형성할 수 있도록 한다. 틀 76에 의해 규격화된 슬롯으로 분석 키트 26을 삽입하고 , 버튼 80 이 눌러지게 되면 마이크로 컨트롤러와 연결되어 전극 30, 33을 포함하는 전기회선이 형성되게 되고, 전기적 상태 변화를 검출하게 된다. 전기적인 상태의 변화는 디스플래이 78에 나타나지는 분석 결과와 관계된다. 더 자세히 말해서, 키트 26이 판독장치 24의 연결부분과 연결되고 버튼 80이 사용자에 의해서 눌러지게 되면, 분석장치 24의 마이크로컨트롤러는 디지털 시그날(digital signal)을 생성하게 된다. 판독장치 24는 시스템의 사용자들에게 의미있는 결과를 나타내도록 조정될 수 있다.
반응 챔버 40과 검출 챔버 44가 존재한다면 검출 챔버에 배열된 물질들(substances)과 판독장치 24의 구성에 따라서, 본 발명의 키트 26 내 미세유체장치 10은 다음의 타입의 분석들에서 사용될 수 있다.:
1. 헤로인(heroin), 모르핀(morphine), 코카인(***e), 엘에스디(LSD), 암페타민(amphetamines), 피씨피(PCP), 티헤이치씨(THC), 바비츄레이트(barbiturates), 그리고 기타 진정제(sedatives), 마약(narcotics), 그리고 환각제(hallucinogens)와 같은 분석물에 대한 약물 남용분석.
2. 연쇄상구균A(Streptococcus A), 인간면역결핍바이러스(HIV), 간염 (Hepatitis) A, B , C 바이러스, 헬리코박터 파일로리(H. pylori), 단핵세포증 (Mononeuclosis), 클라미디아(Chlamydia), 임질(Gonorrhea) 그리고 기타 성병(STDs)등 감염성 질병 분석(Infectious disease assays).
3. 치료적 약물 모니터링(Therapeutic Drug Monitoring: TDM)
4. 인간 융모성 성선자극호르몬(hCG), 난포자극호르몬(FSH), 또는 황체형성호르몬(LH) 등을 포함한 테스팅 관련 복제(reproduction)
5. 혈중 포도당 또는 헤모글로빈1Ac(HbIAc)수치 모니터링과 같은 당뇨진단
6. 씨케이(CK), 엠비(MB), 트로포닌(Troponin), 미오글로빈(myoglobin), 비엔피(BNP), 프로비엔피(proBNP), 인간씨알피(hCRP), D-다이머(dimer), 호모씨스테인(homocystein)과 같은 심장 마커(cardiac marker)
7. 에이치디엘(HDL), 엘디엘(LDL), 또는 아포엘피(ApoLP)와 같은 콜레스테롤 모니터링(Cholesterol monitoring)
8. 혈액 응고 분석(Blood Coagulation Testing)
9. 씨에에이(CEA), 에이에프피(AFP), 피에스에이(PSA) 5, 블래더 씨에이(BladderCa)(BTag) 와 같은 암 마커들(Cancer Markers)
10. 골 재흡수 분석 11(bone resorption testing 11)과 같은 골다공증 모니터링
11. 이소프로스탄(isoprostane), 신경사상단백질(neural thread protein)을 검출하는, 알츠하이머와 같은 정신장애(Mental Disorders)분석
12. 마이크로어레이(micro array)와 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용한 유전자 분석을 위한 DNA 진단
13. 알러지 진단(allergy testing)
14. 소변 분석(urine analysis)
15. 혈액 가스/전해질
16. 동물 건강 진단
미세유체장치 10은 다양한 방법으로 생산될 수 있다. 하나의 비제한된 제조방법에서, 첫 번째로 지지체 22를 PET 필름과 같은 것으로 선택하고, PET 필름에 전극 30,33을 프린트한다. 그리고 포토레지스트 층 14에 사용될 예를 들어 DuPont RISTON® 과 같은 폴리이마이드 포토레지스트 필름으로 전극 30, 33이 프린트된 PET 필름을 덮는다. 그리고 포토레지스트 필름을 보호덮개(protective covering)로 포토마스크(photomask)와 함께 덮는데 여기에는 채널들과 챔버의 패턴에 대한 개요가 있다. 그 후 자외선 노출을 통해 포토레지스트 물질을 중합하고 덮개를 제거하고, 알칼리용액을 통해서 노출되지 않고 차광 된 포토레지스트 필름을 세척해서 제거한다. 그리고 포토레지스트 층 14를 덮개 층 16으로 덮는다. 덮개 층 16 은 비전도성 중합 필름이다. 접착필름은 포토레지스트 층 14를 보호하기 위한 덮개 층 16으로 사용될 수 있다.
덮개 층 16은 보호커버가 제거된 2차 포토레지스트 필름일 수도 있는데, 이는 1차 포토레지스트 층과 바로 접해서 위치할 수 있다. 2차 포토레지스트 층은 예를 들어서 열의 사용 등을 통해서 첫 번째 포토레지스트 층과 결합된다. 적층화과정 동안에, 온도는 약 450°C 에서 약 110°C 정도가 사용될 수 있고 바람직하게는 약 9O0°C 가 사용될 수 있다. 열 노출시간은 열 압력 롤러(heat pressure rollers )의 크기에 따라서 약 5초에서 약 500초까지 다양하며 바람직하게는 약 30초 이하가 되고, 더욱더 바람직하게는 약 7초가 된다. 포토레지스트 층 의 결합에 이어서, 그 집합(assembly)은 더 많은 자외선에 노출되어 폴리이마이드 포토레지스트 폴리머의 완전한 중합을 이룰 수 있도록 한다. 미세유체장치 10 의 제작에서 적층화과정은 당업자들에게 잘 알려져 있다.
그 후에 ,미세유체장치 10의 남은 부분은 지지체 22와 결합 된다. 그러면 미세유체장치 10은 틀 50 에 설치되어 신속 분석 키트 26을 형성할 수 있게 된다.
도 8-14에서, 도 8 과 9에는 본 발명의 전류측정의 또는 전압측정의 전기 화학적 검출을 할 수 있는 전기화학센서 장치 100의 대체가능한 예시 디자인이 기재되어 있다. 전기화학적 센서 100은 분석물의 화학적 또는 효소적 반응으로 부터 형성된 생산물을 검출할 수 있도록 설계되어 있다. 전기화학센서장치 100은 분석될 분석물이 다른 비결합 리간드들과 세척에 의해 분리될 것을 요하지 않는다. 이 장치는 분리에서 자유로운 화학적 또는 효소 반응 분석을 수행한다.
전기화학센서장치 100은 그 위에 기준전극 104 와 작동전극 106이 배열된 하부지지층 102, 기준전극 104와 작동전극 106의 옆에 위치한 유입채널 110과 검출 챔버를 구성하는 중간 포토레지스트 층 108, 그리고 에어벤트 틈 114를 포함하는 덮개 층 112를 포함하고 있다.
유입채널 110은 기준, 작동 전극 104,106위에 나란히 배열된 검출 챔버와 연결되어 있어서, 분석물의 화학, 효소 반응에 의해 생성된 생산물이 검출 챔버에 존재하는 경우에는, 그 생산물들이 전극 104와 104의 전류 통과(current transmission)에 영향을 주게 된다.
기준전극 104 와 작동전극 106은 전기전도성의 금속 및/또는 탄소로부터 제작될 수 있다. 그리고,이들은 판독장치 24의 연결핀과 연결된 선-인쇄된 ITO, 탄소, 또는 전기전도성 금속으로 된 회로 116, 118과 연결되어 있다. (도면상 기재되지는 않음). 주로 기준전극 104는 은/염화은(Ag/AgCl)을 포함할 수 있고, 작동전극 106는 금, ITO 또는 탄소를 포함할 수 있다. 판독장치 24의 연결핀과 연결될 수 있도록 금속 전기 회선 116,118의 일부가 노출되어 있는데 따라서 중간 포토레지스트 층 108 과 덮개 층 112의 길이는 하부지지층 102보다 다소 짧게 되어있다.
도 10-13는 위에서 설명한 전기화학센서장치 100의 제조의 한 예시를 보여주며, 이는 또한 미세유체장치 10의 제조에 사용될 수 있다. 제조과정의 다양한 단계들에는 스크린프린팅(screen printing), 전기센서의 디포지팅(depositing)을 위한 스퍼터링(sputtering), 광식각법, 또는 열 압력방법을 통한 화학적 에칭이나 적층화과정 등이 포함된다. 첫 번째 단계는 지지층 102위에 있는 기준전극 104 그리고/또는 작동전극 106의 프린팅 또는 스퍼터링 단계이다.
도 10 은 전극마스크(electrode mask)를 갖는 스크린 메시(screen mesh)를 사용한 전극-프린팅 방법의 한 예시를 보여준다. 금, 은, 탄소 또는 이와 같은 죽상 또는 액상의 전도성 물질이 메시 스크린(mesh screen )122 에 놓여진다. 메시스크린 122 은 포토레지스트 필름 108보다 두께가 얇다. 전기화학센서장치 122의 두께는 약 50 ㎛이하고, 바람직하게는 약 5㎛ 에서 약 20㎛ 가 적당하며, 더욱 바람직하게는 약 8㎛에서 약 20㎛ 사이가 적당하다.
전극(들)을 프린팅 한 후, 금 전극이 프린트된 - 페트(PET) 필름 판은 가공된 피란하(Piranha) 용액에 10-15 분간 적시고 정제수로 세척한다. 피란하 용액 원액은 강한 산화제로서 중합 필름을 부식시킬 수 있는바, 가공된 피란하 용액이 사용된다. 가공된 피란하 용액은 1N 황산과 20% 과산화 수소가 1 대 1 비율로 포함되어 있다. 자기 집합 단일층 (self-assembled monolayer,SAM)-형성 분자 용액은 에타놀에서 약 1 mM 에서 20 mM의 농도로 제공된다. 금 전극-프린트된 PET 필름 판을 용액에 적시는 시간은 SAM-형성 분자들의 농도와 처리 표면의 크기에 따라서 다양하다. 2 mM N-숙신이미딜 헥산디설파이드(succinimidyl hexanedisulfide)용액이 사용될 경우, 기간은 대략 45 분에서 2 시간 사이 정도이다. 처리 후에, SAM-코팅된 판은 에타놀과 물로 세척되고, 만일 필요하다면, 질소환경 하에서 건조된다.
도 10 과 11에서는, 전극(들)과 금속 회선 104, 106, 116, 118을 하부 지지 층 102위에 프린팅 한 후에, 건조 포토레지스트 필름 108 은 전극(들)과 회선들 104.106.116.118과 함께 지지층 102를 덮는데 사용되고 이는 열 압력 롤러(heat pressure roller) 126에 의해 적층화된다(도 11 참조). 전극과 회로를 프린팅하는 방법은 당업자들에게 잘 알려져 있으며 예를 들어서 스크린 프린팅을 통하여 할 수 있다. 적층화 온도는 여려가지 요인들, 예를 들어서, 필름 물질들의 성질 등에 의해 정해지며, 그 범위는 약 45˚C에서 약 110˚C사이 정도이다.
도 12에서 보는 바와 같이, 포토레지스트 필름 108의 중합 전에, 미세유체채널디자인(검정부분)으로 구성된 포토마스크 128 필름은 포토레지스트 필름 108 의 적층화된 집합과 하부 지지층과 접촉되도록 놓인다. 포토마스크(photomask) 128 은 전극(들)과 회로 104, 106, 116, 118의 위에 위치해서, 그 부분들을 덮을 수 있도록 해야 한다. 지지층 102위에서 적층화 된 건조 포토레지스트 필름 108은 자외선 조사(UV illumination)에 의해 중합된다. 포토레지스트 필름 108의 중합은 예를 들어 1 KW 자외선 원으로 약 5분에서 약 120분 사이의 자외선 노출에 의해 만들 수 있다. 시간과 발광 강도(radiation intensity)는 다양한 요소들, 예를 들어 매트릭스의 두께, 포토레지스트 필름 108에 형성될 채널의 구조(geometry), 또는 자외선 원에 따라 결정된다. 노출 기간(exposure duration)은 1 KW 자외선 원에서 약 20초에서 약 80초가 적당하다. 자외선에 노출된 중합부분은 포토레지스트 필름 108 에 있는 단일 채널, 복수채널, 또는 챔버의 벽을 형성한다. 포토마스크 128에 의해 덮여 있는 부분 130은 자외선에 노출되지 않아서 부드럽고 유연한(labile) 상태로 남아 있게 된다.
도 13에서 보는 바와 같이, 다음 단계는 포토레지스트 필름 108과 염기용액(예를 들어, 0.1 M 탄산 나트륨 버퍼 pH 9.2)을 접촉시켜서 포토레지스트 필름 108의 불안정하고 미노출된 지역 130을 씻어내리고 그래서 구멍(cavity)이나 셀 132를 적층화된 집합(laminated assembly)에 형성시키는 과정이다. 그 결과 형성된 집합은 덮개 층 112에 의해 덮여진다. 덮여지거나 노출된 전극과 회선들 104, 106, 116, 118 사이의 연결 부분(들) 131, 다시 말해서 채널의 벽은 전기화학센서장치 100의 제조과정에서 형성된다. 그 결과 형성된 집합은 덮개 층 112에 의해 덮여진다. 중합된 습윤 상태의 포토레지스트 층은 덮개 층 112로 사용될 수 있는데, 이는 접합 부분을 타이트 하게 봉인하여 시료 액체들이 유입 챔버 110 또는 검출 챔버 에 있을 때, 이들이 접합 부분의 간격으로 스며드는 것을 방지하는 역할을 한다. 이렇게 해서 전기화학센서장치 100이 도 9에서 보여지는 구성을 얻게 된다.
포토레지스트 층과 덮개 층 108, 112의 길이는 하부지지층 102의 그것보다 짧으며, 이로써 전극 104, 106가 노출되어 연결핀들과 연결될 수 있게 된다.
전기화학센서장치 100을 만들기 위해서는, 유입채널 110을 상부 커버층 112로 덮기 전에 효소, 및/또는 결합 물질들이 검출 챔버와 나란한 전극 104,106의 표면에 가라앉아야 한다. 효소 및/또는 결합 물질을 전극에 가라앉히기 위해서는 공유 또는 비공유 결합이 사용될 수 있다. 비공유 결합은 전극에 항체나 효소를 가라앉히게 한다. 이런 과정은 전극 104,106 위 분자 용액의 나노리터(nano-liter) 규모 볼륨을 마이크로 리터(micro-liter)규모 볼륨으로 스팟팅 하는 과정이다. 단백질 분자들과 전극 104,106 사이에서 소수성의 그리고 전기적 상호작용이 발생한다. 이런 상호작용의 힘은 검출 챔버에서 분자들이 씻겨 흘러나가는 것으로부터 분자들을 유지시키는데 충분하다. 결합 효율과 강도를 증가시키기 위해서, 전극 104, 106 은 폴리피롤이나 NAFION® 또는 알콕시실란과 같이 자기 집합 단일층(SAM)으로 코팅될 수 있다. 단백질 분자는 화학적 또는 광학적 활성화에 의해 작용기가 전극들과 공유적으로 결합할 수 있다.
도 14 의 그래프는 500㎛의 폭(width)과 약 50㎛의 깊이(depth)의 채널을 만드는데 사용되는 자외선 방사 시간을 보여준다. 특히, 이 데이타는 100㎛의 PET필름 위에 적층화된 50㎛의 포토레지스트 필름이 있는 미세유체장치의 제조로부터 유래 된다. 그리고나서 이는 폭이 약 500㎛인 채널로 구성된 포토마스크에 의해 덮여지고 약 20에서 약 55분간 자외선에 의해 노출되어 진다. 시료는 정해진 시간에 제거되고 탄산 버퍼에 의해 세척된다. 채널제조의 결과들이 측정된다. 중합의 정도는 600nm에서 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 청색 빛 흡수도를 측정하여 측정할 수 있고,채널의 폭(width)은 캘리퍼스(calipers)를 사용하여 측정할 수 있다. 노출시간(exposure time)이 증가할수록 600nm에서 중합필름의 빛 흡수(light absorbance)는 증가하지만 채널 폭은 서서히 감소한다. 중합된 포토레지스트 필름의 색은 중합 정도에 따라서 밝은 청색에서 어두운 청색으로 변하게 된다.
유속은 크로마토그래피 분석법에서 분석물 분리의 해상도(resolution)를 결정하는 가장 중요한 인자들(parameters) 중 하나이다. 막 기반의 분석법과는 다르게, 유속과 모세관작용은 미세유체 채널 시스템에 의해서 조절될 수 있다. 도 3A - 3F에서 보는 바와 같이, 다른 폭과 길이의 챔버와 채널들의 결합에 의해서 다양한 타입의 장치들을 제조할 수 있다. 큰 횡단 구획을 가진 채널 그곳을 지나는 흐름은 더 작은 횡단 구획을 가지는 채널을 지날 때보다 더 커지게 된다. 따라서, 예를 들어 지연채널 38이나 혼합채널 42와 같은 포토레지스트 층에 있는 채널의 폭과 깊이가 조절됨으로서 반응 챔버 40이나 검출 챔버 44 각각으로의 적절한 흐름이 형성될 수 있도록 할 수 있다. 면역크로마토그래피 분석법을 위한 미세유체장치의 제작에 있어서, 시료의 유속은 결합 물질들이 충분히 반응할 수 있도록 지속적이고 천천히 흘러야 한다.
도 15 와 16에서, 15개의 미세유체장치가 분석되었다. 시료 유입부에 10 ul 의 컬러잉크가 유입되고 각각의 설정된 지점인, P1-P3에서의 도착시간이 측정되었다. 측정된 시간은 방사상 그래프로 나타내었다. 도착시간은 채널의 길이에 비례한다. 도면 16은 미세유체장치의 유속과 이동 길이가 분석된, 15개의 장치 사이에서 일정하게 유지되었음을 보여준다.
포토레지스트 층의 채널 깊이와 폭을 정밀하게 결정할 수 있는 능력은 일정한 유속과 이동시간 길이를 제공할 수 있기 때문에 본 발명의 미세유체장치가 정성 분석뿐 아니라 정량분석에서도 사용될 수 있도록 해 준다.
본 발명의 전기화학센서장치 100이 산소, 요소, 약물 또는 포도당과 같이 작은 분자들을 검출하는데 사용되는 경우에, 전기화학센서장치 100은 (미세유체장치에서 요구되는) 분리단계를 요구하지 않을 수 있다. 따라서 검출센서는 매우 간단하고 사용하기 편리하다. 산화 또는 환원된 효소는 전기화학센서장치 100에서 사용될 수 있다. 전기화학센서 100의 한 바람직한 실시 방안으로서 클루코오스 메터 (glucose meter)가 있다. 분석될 글루코오스 포함 시료 용액이 시료 유입 챔버 110에 놓이고 이는 시료 용액 속 글루코오스가 검출 챔버에 고정된 글루코오스 옥시다제와 접촉하는 검출 지역으로 흘러들어간다. 글루코오스 옥시다제는 시료 내 포도당의 비율에 비례하여 과산화수소를 생산하게 된다. 발생 된 과산화수소는 전류에 영향을 주고, 전류의 변화는 전극 104 와 106을 통해서 판독장치 24로 전달된다.
본 발명 및 그로 인한 목적이나 이점들은 이하의 설명과 함께 첨부된 도면을 참조하면 이해가 용이할 것이며, 하기 설명에서의 참조 번호들은 각각 구성요소를 의미하는 것이다.
도 1 은 본 발명의 미세유체장치의 첫 번째 실시 예의 분해도(exploded view) 이다.
도 2는 도면 1의 미세유체장치의 상부 평면도(top view)로서 덮개 층이 제거된 포토레지스트 층의 도면을 제공하고 있다.
도 2B는 본 발명의 미세유체장치의 다른 예시의 상부평면도에 대한 도면이다.
도 2C 는 본 발명의 한 예시에서의 상부와 하부 틀을 포함하는 미세유체장치의 외부 틀 부분에 대한 상부평면도이다.
도 3A-3C는 포토레지스트 층의 흡수 지역의 다양한 패턴들을 보여준다.
도 3D-3F는 포토레지스트 층의 검출 챔버와 반응 채널의 여러 가능한 패턴들을 보여주고 있다.
도 4는 도 1에서 보여지는 미세유체장치를 포함하는 신속 분석 키트의 사시도(perspective view)이다.
도 5는 상부 덮개가 제거된 도 4에서 보여지는 신속 분석 키트의 사시도이다.
도 6은 도 4에서 6-6 단면을 따르는 신속 분석 키트의 횡단면도(cross-sectional view)이다.
도 7은 도 4에서 보인 신속 분석 키트와 함께 사용되는 판독 유니트의 한 예시이다.
도 8은 본 발명의 전기화학적 센서 장치에 관한 도면이다.
도 9는 도 8에서 보여지는 전기화학적 센서장치의 분해도이다.
도 10-13은 도 8의 전기화학적 센서 장치의 제조단계를 나타낸다.
도 14는 자외선에의 노출시간에 따른 포토레지스트 필름의 견고함(rigidity) 과 형성된 채널의 폭 사이의 관계를 보여주는 그래프를 보여준다.
도 15는 시료 유체의 유속의 측정 지점을 보여준다.
도 16은 다른 미세유체 채널들에서의 시료 유체 유속에 대한 결과를 보여주는 그래프이다.

Claims (30)

  1. 분석될 시료유체(sample fluid)를 받아들이는 유입 챔버(inlet chamber), 상기 유입 챔버로부터 유체 소통(fluid communication)하는 반응 챔버, 상기의 반응 챔버로부터 유체 소통하는 적어도 하나 이상의 검출 챔버(detection chamber)를 포함하는 것을 특징으로 하는 포토레지스트 층(photoresist layer);
    상기 포토레지스트 층의 아래 위치하여 상기의 포토레지스트 층에 견고한 지지체(support)를 제공하는 지지구조(support structure); 및
    상기 포토레지스트 층 위에 존재하여 상기의 반응 챔버(reaction chamber)와 상기 적어도 하나 이상의 검출 챔버(detection chamber)를 보호하는 덮개(cover)를 포함하는 미세유체장치(microfluidic device).
  2. 제 1항에 있어서, 상기의 포토레지스트 층이 시료 유체의 흐름에 있어서 상기의 하나 이상의 검출 챔버의 하류 부분에 한 세트의 흡수 채널(absorbent channel)을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유체장치.
  3. 제 2항에 있어서, 상기의 흡수 채널들은 단일 사(蛇)행채널(meandering channel)인 것을 특징으로 한 미세유체장치.
  4. 제 2항에 있어서, 상기의 흡수 채널 세트가 유입 말단(inlet end)과 상기의 적어도 하나 이상의 검출 챔버 중 마지막과 연결된, 복수의 평행 채널(parallel channel)인 것을 특징으로 하는 미세유체장치.
  5. 제 1항에 있어서, 상기의 포토레지스트 층에 상기의 유입 챔버와 상기의 반응 챔버 사이에 지연 채널(delay channel)이 포함되는 것을 특징으로 하는 미세유 체장치.
  6. 제 1항에 있어서 , 상기의 포토레지스트 층에서 상기의 반응 챔버와 상기의 적어도 하나의 검출 챔버 사이에 혼합채널(mixing channel)이 부가되는 것을 특징으로 하는 미세유체장치.
  7. 제 1항에 있어서, 상기의 적어도 하나 이상의 검출 챔버가 하나의 검출 챔버인 것을 특징으로 하는 미세유체장치.
  8. 제 1항에 있어서, 상기의 적어도 하나 이상의 검출 챔버는 서로 분리된 다수의 검출 챔버 들로 구성된 것을 특징으로 하는 미세유체장치.
  9. 제 1항에 있어서, 상기의 지지구조가 하나의 필름층(film layer)으로 구성된 것을 특징으로 하는 미세유체장치.
  10. 제 1항에 있어서, 상기의 지지체(support)는 상기의 필름층(film layer) 아래 견고한 지지기판(backing substrate)을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유체장치.
  11. 제 1항에 있어서, 상기의 덮개가 투명(transparent)한 것을 특징으로 하는 미세유체장치.
  12. 제 6항에 있어서, 상기의 덮개는 상기의 반응 챔버와 상기의 혼합 채널사이에 접합 갭(junction gap)을 갖는 것을 특징으로 하는 미세유체장치.
  13. 제 1항에 있어서, 상기의 반응 챔버에 1차 생물유래성(biogenic) 또는 면역반응성(immunoreactive) 물질(substances)이 배열되고, 상기의 적어도 하나의 검출 챔버에 2차 생물유래성 또는 면역반응성 물질이 배열된 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유체장치.
  14. 제 1항에 있어서, 상기의 적어도 하나 이상의 검출 챔버들에 또는 그 일부에 전기전도성 표면(conductive surface)이 부가되는 것을 특징으로 하는 미세유체장치.
  15. 제 14항에 있어서, 상기의 전기전도성 표면이 전극(electrode)인 것을 특징으로 하는 미세유체장치.
  16. 제 14항에 있어서, 상기의 반응 챔버에 하나 또는 그 이상의 1차 생물유래성또는 면역반응성 물질이 배열되고, 적어도 하나 이상의 상기 검출 챔버내 또는 그 일부에 있는 각각의 전기전도성 표면과 연결되어 배열된 하나 또는 그 이상의 2차 생물유래성 또는 면역반응성 물질이 부가되는 것을 특징으로 하는 미세유체장치.
  17. 제 14항에 있어서, 적어도 하나 이상의 상기 검출 챔버들 또는 그 일 부분에 상기 전기전도성 표면이 구성되어 있고, 상기의 전기전도성 표면 반대편에 연결핀으로 구성되어서 시료 유체 내 입자들이 상기 전기전도성 표면과 반응하고 상기의 전기전도성 표면을 통해 다양한 전류 흐름이 유발되며 이는 상기연결핀과의 전기회선을 형성함으로서 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 전기연결유니트(electrical interconnection unit).
  18. 제 16항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 2차 바이오제닉 또는 면역반응성 물질들이 상기 전기전도성 표면과 결합(bonded) 되어있는 것을 특징으로 하는 미세유체장치.
  19. 분석될 시료 유체를 받아들이는 유입 챔버, 상기 유입 챔버로 부터 유체 소통하는 반응 챔버, 상기 반응 챔버와 유체 소통하는 혼합 채널, 상기 반응 챔버와 유체소통하는 적어도 하나 이상의 검출 챔버, 상기 검출 챔버의 시료 유체 흐름방향의 하류(downstream)에 있는 한 세트의 흡수 채널들을 포함하는 것을 특징으로 하는 포토레지스트 층;
    상기 포토레지스트 층의 아래 위치하여 상기의 포토레지스트 층을 견고하게 지지하는 지지구조; 및
    상기 포토레지스트 층 위에 존재하여 상기 반응 챔버와 상기 적어도 하나 이상의 검출 챔버를 보호하는 덮개를 포함하는 미세유체장치.
  20. 제 19항에 있어서, 상기의 반응 챔버가 하나 또는 그 이상의 생물유래성이나 면역반응성 물질들의 배열을 가지고 , 상기 적어도 하나 이상의 검출 챔버가 하나 또는 그 이상의 2차 생물유래성 또는 면역반응성 물질들의 배열을 갖는 것을 특징으로 하는 미세유체장치.
  21. 분석될 시료 유체를 받아들이는 유입 챔버, 상기 유입 챔버로부터 유체 소통하는 반응 챔버, 상기 반응 챔버와 유체 소통하는 혼합 채널, 상기 반응 챔버와 유체소통하는 적어도 하나 이상의 검출 챔버, 상기의 검출 챔버의 시료 유체 흐름방향의 하류에 있는 한 세트의 흡수 채널들을 포함하고, 상기 적어도 하나 이상의 검출 챔버의 내부 또는 적어도 그 일부에 전기전도성 표면을 포함하는 것을 특징으로 하는 포토레지스트 층;
    상기 포토레지스트 층의 아래 위치하여 상기의 포토레지스트 층을 견고하게 지지하는 지지구조; 및
    상기 포토레지스트 층 위에 존재하여 상기 반응 챔버와 상기 적어도 하나 이상의 검출 챔버를 보호하는 덮개를 포함하는 미세유체장치.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 반응 챔버는 하나 또는 그 이상의 생물유래성 또는 면역반응성 물질들의 배열을 가지고 , 내부 또는 적어도 그 일부에 상기 전기전도성 표면을 포함하는 상기 적어도 하나 이상의 검출 챔버에 하나 또는 그 이상의 두번째 생물유래성 또는 면역반응성 물질들의 배열을 갖는 것을 특징으로 하는 미 세유체장치.
  23. 시료웰(sample well)의 경계를 짓는 틀(housing);
    상기 유입 챔버와 상기 시료웰이 나란히 있는 제 1항의 장치; 및
    상기 시료 웰과 상기 유입 챔버 사이에 존재하는 필터(filter)를 구성성분으로 하는 신속분석키트(rapid assay kit).
  24. 제 23항에 있어서, 상기 틀이 상기 반응 챔버에 시료유체의 존재 여부를 탐지할 수 있도록 반응 챔버와 나란히 배열된 창(window)을 가지는 것을 특징으로 하는 신속 분석 키트.
  25. 제 23항에 있어서, 상기 틀이 상기 적어도 하나 이상의 검출 챔버 각각과 일렬로 배열된 적어도 하나 이상의 창(window)을 포함하는 것을 특징으로 하는 신속분석키트.
  26. 시료웰의 경계를 짓고 틈(aperture)을 포함하는 것을 특징으로 하는 틀(housing); 및
    상기 유입 챔버와 시료웰이 나란히 배열되고, 상기 전기 연결 유니트가 상기 틈(aperture)까지 연결되어 있어 신속 분석 키트와 판독장치(reading unit)가 연결될 수 있게 하는 제 7항의 장치를 포함하는 신속 분석 키트
  27. 시료웰의 경계를 형성하고 틈을 포함하는 틀 내부에 제 17항의 장치를 배치하여 상기 유입 챔버가 상기 시료웰과 나란하게 하고 상기 전기 연결 유니트가 상기 틈(aperture)를 통과하여 확장되도록 하는 단계;
    상기 시료웰에 일정량의 시료 유체를 놓고 그 시료 유체가 상기 포토레지스트 층을 통해 흘러가도록 하는 단계;
    판독장치가 상기 전기 연결 유니트와 닿도록 상기 틀을 판독 장치에 삽입하는 단계
    상기 판독장치의 마이크로컨트롤러(microcontroller)를 활성화시켜 상기 전기 연결 유니트의 전기회선을 완성시키고, 상기 전기 연결 유니트를 통해서 전기용량(capacitance)이나 전압(voltage)변화를 측정하는 단계; 및
    그물질의 존재 유무와 측정된 전기용량이나 전압 변화와의 관련짓는 단계로 구성된 하나 또는 그 이상의 특이적 물질(specific material)의 존재를 검사하기 위한 시료 유체 검사방법
  28. 시료웰의 경계를 형성하고 적어도 하나 이상의 창(window)을 포함하는 틀 내부에 제 1항의 장치를 배치하여 상기 유입 챔버와 상기 시료웰이 나란하게 하고,적어도 하나 이상의 상기 창은 상기 적어도 하나 이상의 검출 챔버와 나란하게 하는 단계;
    상기 시료웰에 일정량의 시료 유체를 놓고 그 시료 유체가 상기 포토레지스트 층을 통해 흘러가도록 하는 단계;
    시료 유체가 상기 적어도 하나 이상의 검출 챔버의 마지막에 도착하였을 때 이를 확인하기 위하여 상기 적어도 하나 이상의 창의 마지막 창을 모니터링 하는 단계;
    상기 적어도 하나 이상의 검출 챔버의 형광 또는 광학(optical) 강도(intensity)를 측정하는 단계; 및
    그 물질의 존재 유무와 측정된 형광 또는 광학 강도의 변화를 관련짓는 단계를 포함하는 하나 또는 그 이상의 특이적 물질의 존재를 검사하기 위한 시료 유체 검사방법
  29. 분석될 시료 유체를 받아들이는 유입 챔버, 상기 유입 챔버로부터 유체 소통하는 적어도 하나 이상의 검출 챔버를 포함하는 것을 특징으로 하는 포토레지스트 층;
    상기 포토레지스트 층의 아래 위치하여 상기의 포토레지스트 층을 견고하게 지지하는 지지구조;
    상기 포토레지스트 층 위에 존재하여 상기의 반응 챔버와 상기 적어도 하나 이상의 검출 챔버를 보호하는 덮개; 및
    상기 적어도 하나 이상의 검출 챔버 또는 적어도 그 일부를 구성하는 전기전도성 표면으로 구성됨을 특징으로 하는 전기화학센서 장치(electrochemical sensor device).
  30. 제 29항에 있어서, 적어도 하나 이상의 검출 챔버 또는 그 일부에 상기의 전기전도성 표면을 가지고, 그 전기전도성 표면의 반대 부분에 연결핀을 가진, 그것에 의해서 시료유체 내 입자들이 상기의 전기전도성 표면과 반응하여 상기 전기전도성 표면을 통하는 전류의 변화를 유발하고 상기의 연결 핀과의 전류 형성에 의해 검출할 수 있는 전기적 연결 유니트를 포함하는 전기화학센서장치.
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