JP5066498B2

JP5066498B2 - アッセイ方法

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Publication number: JP5066498B2
Application number: JP2008240201A
Authority: JP
Inventors: 幹永森; 順一片田; 浩之知久; 孝嘉小山田
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2008-09-19
Filing date: 2008-09-19
Publication date: 2012-11-07
Anticipated expiration: 2028-09-19
Also published as: JP2010071827A; US20100075440A1; US8663910B2

Description

本発明は、分析対象物（被験物質）を含む試料を高感度に定性及び定量を行うことができるアッセイ方法に関するものである。

近年、検体溶液を展開し、検体溶液中の分析対象物を検出する簡便なデバイスが数多く開発されており、体外診断薬や毒物検出等の各種デバイスが市販されている。このようなデバイスの一例としてイムノクロマトグラフ法を利用したものが挙げられる。イムノクロマトグラフ法は、その判定・測定に重厚な設備・機器を必要とせず、操作が簡便であり、分析対象物を含む可能性のある検体溶液を担体上に滴下した後、約５〜10分間静置するだけで測定結果が得られるもので、簡便・迅速・特異性の高い判定・測定手法として、多くの場面、例えば病院における臨床検査あるいは研究室における検定試験等に広く使われている。

ところで、天然物、毒素、ホルモン、又は農薬等の生理活性物質あるいは環境汚染物質は、従来の一般的なイムノクロマトグラフ法では検出できない極微量で生体に作用する物質が多いため、それらの物質の迅速、簡便、且つ高感度なイムノクロマトグラフ法の開発が求められている。このため、分析対象物を含む検体溶液を担体に滴下して分析対象物を検出するといった単純な工程のものだけでなく、例えば、分析対象物を含む検体溶液を担体に滴下して、分析対象物を担体に固定化した後、これを洗浄液で洗浄し、固定化した分析対象物に反応基質液や増幅溶液等を接触させて、分析対象物からのシグナルを増幅して検出する等の方法が行われるようになってきている。

このような高感度なイムノクロマトグラフ法の一例として、例えば特許文献１には、分析物捕捉試薬が結合された固相担体に対して、分析対象物を含む検体溶液を酵素標識抗体と接触させてから流し、担体上に分析対象物−酵素標識抗体を結合させた後、検体溶液の流れとは逆方向に洗浄液、酵素基質液を流すことによって、分析対象物−酵素標識抗体−酵素基質との複合体を形成させ、酵素基質に起因する着色等のシグナルを検出し、分析対象物を測定するイムノクロマトグラフ法が記載されている。

この特許文献１に記載されているイムノクロマトグラフ法によれば、酵素基質によって分析対象物からのシグナルを増幅することができ、また、検体溶液の流れとは逆方向に洗浄液、酵素基質液を流すという可逆的流動によって、担体上における分析物捕捉試薬と分析対象物−酵素標識抗体の接触を向上させることができるため、微量の分析対象物を分析することが可能である。
特許第３３０９９７７号公報

しかし、特許文献１に記載されているイムノクロマトグラフ法では、検体溶液が流れた流路全体に洗浄液を流すため、充分な洗浄効果を得るためには、多量の洗浄液が必要になるという問題がある。また、洗浄液と酵素基質液は検体溶液の流れとは逆方向、つまり検体溶液が流れた下流側から流れることになるため、担体上の分析物捕捉試薬に結合しなかった未結合酵素標識抗体や未結合分析対象物が、洗浄液と酵素基質液によって再度担体上を流れることとなり、高精度、高感度の検出を行うことには限界がある。

本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、洗浄によって新たな汚染が起こることがなく、洗浄液が少なくても充分な洗浄効果を得ることが可能であって、高精度かつ高感度な測定を行うことが可能なアッセイ方法を提供することを目的とするものである。

本発明のアッセイ方法は、少なくとも１以上の被験物質を含有する検体溶液と、試薬溶液、増幅溶液または検出溶液のいずれか２種類以上の液体とを含む３種類以上の複数の液体を、前記被験物質に対する特異的結合物質を含有する検出部位に送液することによって、前記検体溶液中に含まれる前記被験物質の定性または定量を行うアッセイ方法であって、前記複数の液体全ての送液方向が異なっており、かつ前記複数の液体を前記検出部位上で交差させることを特徴とするものである。

ここで、試薬溶液とは、増幅溶液や検出溶液の補足的な役割を持つ薬品を含む溶液を意味し、アッセイにおいて洗浄機能を有する液もこれに含まれる。増幅溶液とは、含まれる薬剤が標識物質や被験物質の作用により、触媒的に反応することで、着色した化合物や発光などを生じ、シグナルの増幅を起こすことができる溶液を意味し、検出溶液とは、含まれる薬剤が標識物質や被験物質などと反応し、変色、着色した化合物の生成、発光等の変化が生じる溶液を意味する。

本発明のアッセイ方法は、抗原抗体反応のような特異結合を用いるものとしては、ＤＮＡのハイブリダイゼーションやアプタマーによる特定のタンパク質との結合を利用するものや、検体中の披験物質が酵素である場合にはそれ自身を触媒に反応基質を発色させる検出や逆に披験物質を基質として検出する生化学検査などが好適に挙げられる。

本発明のアッセイ方法は、１つの態様として前記検出部位が不溶性担体上に形成されており、前記送液が前記不溶性担体による毛細管力により行われることが好ましい。
前記披験物質または前記特異的結合物質のいずれか一方と結合可能な物質で修飾した標識物質の複合体からの標識物質シグナルを検出することが好ましい。前記複数の液体が増幅溶液を含み場合には、該増幅溶液の送液によって増幅された前記標識物質の複合体からの標識物質シグナルを検出することが好ましい。

本発明のアッセイ方法は、前記複数の液体が、前記検体溶液、前記増幅溶液、前記検出溶液または前記試薬溶液であって、前記検体溶液を前記不溶性担体に送液し、前記試薬溶液を送液するための送液用不溶性担体および前記試薬溶液を吸収するための吸収用不溶性担体をそれぞれ前記不溶性担体に接触させ、前記試薬溶液を送液することによって、前記不溶性担体上の検出部位に特異的に結合した前記標識物質以外を洗浄し、前記増幅溶液および前記検出溶液を、前記検体溶液および前記試薬溶液の交差部位に送液することが好ましい。

前記不溶性担体が帯状であって、該不溶性担体の主面に対して前記増幅溶液の送液方向が垂直方向であることが好ましい。
前記標識物質は金属微粒子を含む物質からなることが好ましい。この場合、前記増幅溶液が銀イオンを含む液体であることが好ましい。
前記試薬溶液として、前記増幅溶液に含まれる銀イオンの還元剤を含む液体を用いることが好ましい。

本発明のアッセイ方法は、少なくとも１以上の被験物質を含有する検体溶液と、増幅溶液、検出溶液または試薬溶液のいずれか２種類以上の液体とを含む３種類以上の複数の液体を、前記被験物質に対する特異的結合物質を含有する検出部位に送液することによって、前記検体溶液中に含まれる前記被験物質の定性または定量を行うアッセイ方法であって、前記複数の液体全ての送液方向が異なっており、かつ前記複数の液体を前記検出部位上で交差させるので、３種類以上の複数の液体が流れる流路の交差する部位を検出部位に限ることが可能である。

従って、例えば、検体溶液の送液によって送液方向の下流に溜まった未結合の被験物質や検体溶液に含まれる夾雑物が再度、検出部位に流れることがないため、試薬溶液を多量に用いなくても、検出部位の洗浄を効果的に行うことが可能であり、高精度の検出を行うことが可能である。また、標識物質に結合していない検体容液中の被験物質は、検出部位上の特異的結合物質との結合効率がよくなるため、最終的なサンドイッチ結合の効率が向上することになり高感度の検出を行うことができる。

特に、３種類以上の複数の液体に増幅液を含む場合には、披験物質または特異的結合物質のいずれか一方と結合可能な標識物質で修飾した複合体からの標識物質シグナルが増幅液の送液によって増幅されるため、検体溶液を可逆流動させることによって、披験物質の特異的結合物質への接触を稼がなくても、高感度の検出をおこなうことが可能である。

以下、本発明のアッセイ方法の一実施の態様を図面を用いて詳細に説明する。図１は本発明のアッセイ方法の一例として、イムノアッセイ（免疫学的測定法）に使用することができるイムノクロマトグラフキットの一実施の態様を示す分解模式図、図２はイムノクロマトグラフ用ストリップと送液用不溶性担体および吸収用不溶性担体の接触状態を示す平面模式図を、図３は図２のIII−III線断面図である。

図１に示すイムノクロマトグラフキット10は、イムノクロマトグラフ用ストリップ（不溶性担体）１を保持する第１のデバイス部品11と、送液用不溶性担体２と吸収用不溶性担体３を保持する第２のデバイス部品12とが、位置決め部材14によって繋がってなるものである。位置決め部材14はイムノクロマトグラフ用ストリップ１と送液用不溶性担体２および吸収用不溶性担体３とがそれぞれ接触しない状態で第１のデバイス部品11と第２のデバイス部品12を固定するとともに、第１のデバイス部品11と第２のデバイス部品12とが向かい合うように閉じられた時には、第１のデバイス部品11に保持されているイムノクロマトグラフ用ストリップ１と、第２のデバイス部品12に保持されている送液用不溶性担体２と吸収用不溶性担体３とが、図２に示すように接触する状態となるように固定することが可能なように構成されている。

第１のデバイス部品11には液体を充填するための液体貯蔵ポッド13が設けられており、この液体貯蔵ポッド13は、第１のデバイス部品11と第２のデバイス部品12が、イムノクロマトグラフ用ストリップ１と、送液用不溶性担体２および吸収用不溶性担体３とが接触する位置に位置決めされ固定されたときに、送液用不溶性担体２の一端が液体貯蔵ポッド13に浸漬するように構成されている。

また、第２のデバイス部品12に保持されている送液用不溶性担体２と吸収用不溶性担体３の間には、イムノクロマトグラフ用ストリップ１と、送液用不溶性担体２および吸収用不溶性担体３とが接触する位置に位置決めされ固定されたときに、第２のデバイス部品の裏面からイムノクロマトグラフ用ストリップ１に対して液体を点着するための点着孔15が設けられている。

イムノクロマトグラフ用ストリップ１は、検体溶液を滴下する部分である試料添加パッド４、披験物質または特異的結合物質のいずれか一方と結合可能な標識物質が固定化された標識物質保持パッド５、披験物質に対する特異的結合物質を含有する検出ライン6a（検出部位）を有するクロマトグラフ担体６、及び送液された検体溶液を吸収する吸収パッド７が、粘着シ−ト８上に配置されてなるものである。なお、ここでは説明を簡単にするために検出部位として検出ライン6aを１つ設けた態様について説明するが、検出ラインはそれぞれ異なる特異的結合物質を含有するものを複数設けてもよい。こうすることによって検体溶液に複数の披験物質が含まれる場合に、一度に複数の披験物質を検出することが可能となる。また、クロマトグラフ担体６には、所望により、コントロ−ル用特異的結合物質を固定化した領域（コントロ−ル部位）を設けてもよい。

本発明のアッセイ方法の手順を図４を参照しながら説明する。ここでは複数の液体として検体溶液、試薬溶液として洗浄液および増幅溶液を用いる場合を例にとって説明する。まず、検体溶液をイムノクロマトグラフ用ストリップ１の試料添加パッド４に点着する。点着した検体溶液はイムノクロマトグラフ用ストリップ１の毛細管力によって矢印Ａ方向へと送液される。標識物質保持パッド５には披験物質と結合可能な標識物質が含有されているため、検体溶液中の披験物質は、標識物質保持パッド５を矢印Ａ方向へと送液される間に、この標識物質によって標識される。

標識された披験物質はイムノクロマトグラフ用ストリップ１の毛細管力によってさらに矢印Ａ方向へと移動し、特異的結合物質を固定化した領域である検出ライン6aで捕捉される。つまり、検出ライン6aでは特異的結合物質−披験物質−標識物質の複合体が形成されることになる。捕捉されなかった披験物質や結合しなかった未反応標識物質等は吸収パッド７に吸収される（図4(a)）。この検体溶液を送液する段階においては、第１のデバイス部品11と第２のデバイス部品12は、イムノクロマトグラフ用ストリップ１と、送液用不溶性担体２および吸収用不溶性担体３とが接触しない状態で位置決め部材14によって固定されている。

なお、上記では検体溶液中の披験物質が標識物質保持パッド５に含有されている標識物質と結合する場合を説明したが、標識物質は、検出ライン6aに固定化されている特異的結合物質に結合するものであってもよい。この場合には、検出ライン6aでは特異的結合物質−標識物質−披験物質の複合体が形成されることになる。

次ぎに、クロマトグラフ担体６上の検出ライン6aに特異的結合反応以外で残存している未反応標識物質等を洗浄する（図4 (b)）。この洗浄工程においては、第１のデバイス部品11と第２のデバイス部品12とが向かい合うように閉じられ、帯状のイムノクロマトグラフ用ストリップ１のクロマトグラフ担体６の端部において、送液用不溶性担体２および吸収用不溶性担体３が部分的に接触する状態となるように、第１のデバイス部品11と第２のデバイス部品12が位置決め部材14によって固定される。

このとき、第１のデバイス部品11に設けられている液体貯蔵ポッド13には送液用不溶性担体２の一端が浸漬する。そして、送液用不溶性担体２の毛細管力によって、送液用不溶性担体２から吸収用不溶性担体３に向けて（矢印Ｂ方向）、洗浄液が送液される。つまり、検体溶液を流す送液方向（矢印Ａ）と洗浄液を流す送液方向（矢印Ｂ）とが、検出ライン6a上で交差するように送液される。このように送液することにより、検体溶液が流れる流路（イムノクロマトグラフ用ストリップ１）と洗浄液が流れる流路（送液用不溶性担体２および吸収用不溶性担体３）の交わりを最小限にすることが可能である。また、披験物質の検出は検出ライン6aで行うため、この検出ライン6aを含むクロマトグラフ担体６上を洗浄液で洗浄することにより、少ない洗浄液であっても検出ライン6a上に特異的に結合した標識物質以外を充分に洗浄することが可能である。

検体溶液を流す送液方向と洗浄液を流す送液方向とが、仮に同じ方向であった場合（検体溶液を流す送液方向と洗浄液を流す送液方向が共に矢印Ａの方向）には、洗浄液によって標識物質保持パッド５に含有されている標識物質が流れ出して検出ライン6a上に未結合標識物質が付着し、仮にクロマトグラフ担体６上にコントロール部位が設けられていてもバックグラウンドが高くなって、高精度の測定を行うことができない。また、これをさけるためには、多量の洗浄液で洗浄する必要があるが、洗浄液を流す量によっては精度にばらつきが生じたり、検出ライン6aに結合している特異的結合物質−披験物質−標識物質の複合体が洗浄液とともに流れるという問題がある。

一方、検体溶液を流す送液方向と洗浄液を流す送液方向とが、仮に逆方向であった場合には、吸収パッド７で吸収された捕捉されなかった披験物質や結合しなかった未反応標識物質が流れ出して検出ライン6a上に付着し、この場合にも上記と同様に高精度の測定を行うことができず、多量の洗浄液で洗浄する必要があるという問題がある。

本発明のアッセイ方法においては、上記のとおり、検体溶液が流れる流路（イムノクロマトグラフ用ストリップ１）と洗浄液が流れる流路（送液用不溶性担体２および吸収用不溶性担体３）の交わりを最小限にすることが可能であるため、検体溶液の送液によって送液方向の下流に溜まった未結合の被験物質や検体溶液に含まれる夾雑物が再度、検出部位に流れることがなく、洗浄液を多量に用いなくても、検出部位の洗浄を効果的に行うことが可能であり、高精度の検出を行うことが可能である。

続いて検出ライン6aに第２のデバイス部品12に設けられた点着孔15から増幅溶液を送液する（図4 (c)）。この増幅溶液の送液方向は、紙面に対して垂直方向（矢印Ｃ）、すなわち、検出ライン6aの上方から送液する。このように送液することによって、増幅溶液の液量を節約することが可能であるとともに、増幅ムラを抑制することが可能である。増幅溶液を送液後には、イムノクロマトグラフ用ストリップ１から送液用不溶性担体２および吸収用不溶性担体３とを分離すれば容易に定性、定量を行うことができる。

なお、ここでは検体溶液を流す方向（矢印Ａ）、洗浄液を流す方向（矢印Ｂ）、増幅溶液を流す方向（矢印Ｃ）が互いに垂直方向である場合について説明したが、送液方向が検出ライン6a上で交差するように送液されていれば、垂直方向に限定されるものではない。また、ここでは、検体溶液、洗浄液（試薬溶液）、増幅溶液の３種類の複数の液体を例にとって説明したが、検体溶液を含むものであれば、検体溶液、増幅溶液および検出溶液といった組合せ、検体溶液、試薬溶液および検出溶液といった組合せであってもよい。

また、上記では検出部位が不溶性担体上に形成されており、送液が不溶性担体による毛細管力により行われる場合を例にとって説明したが、本発明のアッセイ方法では不溶性担体を用いないアッセイ方法にも適用することが可能であり、例えばプラスチック基盤に流路となる溝を掘り込んで構成されるマイクロ液体チップにおいて、このチップの流路を３次元的に配置し、複数の液体全ての送液方向を異なるものとし、流路の交差において検出部位を設けるようなアッセイ方法にも適用することができる。
以下、本発明のアッセイ方法に用いられる検体溶液、試薬溶液などの各種溶液、標識物質、不溶性担体等について説明する。

（検体溶液）
本発明のアッセイ方法で分析することのできる検体溶液としては、被験物質（天然物、毒素、ホルモンまたは農薬等の生理活性物質あるいは環境汚染物質等）を含む可能性のあるものである限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（特にヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰）若しくは***物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる搾過検体（スワブ）、うがい液、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を後述の希釈液で希釈したもの等を挙げることができる。

上記検体溶液はそのままで、あるいは、検体溶液を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、さらには、この抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形、若しくは抽出液を適当な方法で濃縮した形で用いることができる。抽出用溶媒としては、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒（例えば、水、生理食塩液、又は緩衝液等）、あるいは、これらの溶媒で希釈することにより直接特異的な結合反応（例えば、抗原抗体反応）を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。

（標識物質）
本発明で使用することができる標識物質としては、一般的なイムノクロマトグラフ法で用いられるような金属微粒子、着色ラテックス粒子、酵素など、有色で視認できる、または、反応により検出できるようになる標識物であれば特に限定されることなく用いることができるが、標識物質を触媒とした金属イオンの還元反応によって、標識物質への金属の沈着でシグナルを増幅する場合には、その触媒活性の観点から金属微粒子が好ましい。

金属微粒子としては、金属コロイド又は金属硫化物、その他金属合金、また金属を含むポリマ−粒子標識を用いることができる。粒子（又はコロイド）の平均粒径は、0.02〜10μｍの範囲が好ましい。より詳細には、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、鉄コロイド、水酸化アルミニウムコロイド、およびこれらの複合コロイドなどが挙げられ、好ましくは、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、およびこれらの複合コロイドであることが望ましい。特に、金コロイドと銀コロイドが適当な粒径において、金コロイドは赤色、銀コロイドは黄色を示し視認度が高いという観点からより好ましい。金属コロイドの平均粒径としては、約１〜500nmが好ましく、さらには１〜50nmがより好ましい。

（特異的結合物質）
特異的結合物質としては、被検物質に対して親和性を持つものならば特に限定されることはなく、一例として抗体を挙げることができる。例えば、その被験物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その被験物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、F(ab’)₂、Fab、Fab’、又はFv］を用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。

（標識物質のシグナル増幅）
本発明のアッセイ方法が、標識物質として金属コロイド標識又は金属硫化物標識、その他金属合金標識、また金属を含むポリマ−粒子標識を用いるアッセイ方法による場合には、金属系標識の信号を増幅させることができる。具体的には、被験物質と標識物質の複合体の形成後に、無機銀塩、有機銀塩などの銀を含む化合物から供給される銀イオンおよび還元剤を接触させ、還元剤によって銀イオンを還元して銀粒子を生成させると、その銀粒子が金属系標識を核として金属系標識上に沈着するので、金属系標識が増幅され、被験物質の分析を高感度に実施することができる。

（イムノクロマトグラフ用ストリップ（不溶性担体））
イムノクロマトグラフ用ストリップは図２および３に示すように、被験物質と結合可能な特異的結合物質を含む少なくとも１つの検出ラインを有する担体であり、展開方向の上流から下流に向かって、試料添加パッド、標識物質保持パッド、クロマトグラフ担体、及び吸収パッドに分画され、この順に、粘着シート上に配置されてなる。イムノクロマトグラフ用ストリップの材質は、多孔性であることが好ましく、例えば、ニトロセルロース膜、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布、または糸等が好ましく挙げられる（なお、各パッド、クロマトグラフ担体のより好ましい材質は下記にそれぞれ記載する）。

クロマトグラフ担体には、披験物質に対する特異的結合物質を固定化させて検出ラインや所望によりコントロール部位が作製される。特異的結合物質は、特異的結合物質をクロマトグラフ担体の一部に物理的または化学的結合により直接固定化させてもいいし、特異的結合物質をラテックス粒子などの微粒子に物理的または化学的に結合させ、この微粒子をクロマトグラフ担体の一部にトラップさせて固定化させてもいい。なお、クロマトグラフ担体は、特異的結合物質を固定化後、不活性蛋白による処理等により非特異的吸着防止処理をして用いるのが好ましい。

標識物質保持パッドは、前述の標識物質を含む懸濁液を調製し、その懸濁液を適当なパッド（例えば、グラスファイバーパッド）に塗布した後、それを乾燥することにより調製することができる。標識物質保持パッドの材質としては、例えば、セルロース濾紙、グラスファイバー、及び不織布等が挙げられる。

試料添加パッドは添加された被験物質を含む検体試料を点着する部分であって、試料中の不溶物粒子等を濾過する機能をも兼ねる部分である。その材質は、セルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、及び綿布等の均一な特性を有するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。なお、分析の際、試料中の被験物質が試料添加部の材質に非特異的に吸着し、分析の精度を低下させることを防止するため、試料添加パッドには、予め非特異的吸着防止処理して用いることもある。

吸収パッドは、添加された試料がクロマト移動により物理的に吸収されると共に、クロマトグラフ担体の検出ラインに不溶化されない未反応標識物質等を吸収除去する部位であり、セルロ−ス濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等吸水性材料が用いられる。添加された試料のクロマト先端部が吸収部に届いてからのクロマトの速度は、吸収材の材質、大きさなどにより異なるので、その選定により被験物質の測定に合った速度を設定することができる。

（送液用不溶性担体）
送液用不溶性担体は、洗浄液を添加できれば特に限定されるものではなく、グラスファイバーパッドやセルロースメンブレン、ニトロセルロースメンブレンなどを用いることができる。

（吸収用不溶性担体）
吸収用不溶性担体は、洗浄液を吸水することができる物質であれば特に限定されるものではなく、セルロース、ニトロセルロース、グラスファイバー、それらの混合体などを用いることができる。

（試薬溶液）
試薬溶液は、増幅溶液や検出溶液の補足的な役割を持つ薬品を含む溶液を意味し、例えば、増幅溶液が後述する銀イオン溶液である場合には、その銀イオンの還元剤となるハイドロキノンや２価鉄イオン溶液などが挙げられる。ペルオキシダーゼ酵素での増幅をする場合には、過酸化水素の溶液が試薬溶液となる。また、アッセイ系において洗浄機能を有する洗浄液もこれに含まれる。

洗浄液は特異的な結合反応以外でクロマトグラフ担体内に残存している、つまり非特異的に残存している標識物質を洗浄するための液体であれば特に限定されるものではなく、単なる水やエタノールなどの溶剤単独でも良いし、例えば１％BSA入りのPBSバッファーや界面活性剤等の溶液等を用いることができる。また、洗浄液として、後述する銀イオンを含む液体、銀イオンの還元剤を含む液体を用いることもできる。なお、洗浄液は展開途中に非特異的に残存した標識物質を洗浄しながら展開するので標識物質を含みながら展開されることになるが、展開される前の洗浄液は洗浄効果を高めるために、標識物質を含んでいない液を用いる。なお、洗浄効果を上げる為にそのpHを調整したり、界面活性剤成分やBSAなどのタンパク質、ポリエチレングリコールなどの高分子化合物を加えた洗浄液を用いてもよい。

（増幅溶液）
増幅溶液は、含まれる薬剤が標識物質や被験物質の作用により、触媒的に反応することで、着色した化合物や発光などを生じ、シグナルの増幅を起こすことができる溶液であり、例えば、金属標識上で、物理現像により金属銀の析出を起こす銀イオン溶液や、ペルオキシダーゼ標識と過酸化水素の作用により色素となる、フェニレンジアミン化合物とナフトール化合物の溶液などが挙げられる。

詳細には、写真化学の分野での一般書物（例えば、「改訂写真工学の基礎-銀塩写真編-」（日本写真学会編、コロナ社）、「写真の化学」（笹井明、写真工業出版社）、「最新処方ハンドブック」（菊池真一他、アミコ出版社））に記載されているような、いわゆる現像液を用いることができ、液中に銀イオンを含み、液中の銀イオンが現像の核となるような金属コロイド等を中心に還元される、いわゆる物理現像液であれば、特に限定されることなく増幅溶液として用いることができる。
以下、増幅溶液として銀イオンを含む化合物と銀イオンの還元剤等について説明する。

（銀イオンを含む化合物）
銀イオン含有化合物としては、有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体を用いることができる。好ましくは、水などの溶媒に対して溶解度の高い銀イオン含有化合物であり、硝酸銀、酢酸銀、乳酸銀、酪酸銀、チオ硫酸銀などが挙げられる。特に好ましくは硝酸銀である。銀錯体としては、水酸基やスルホン基など水溶性基を有する配位子に配位された銀錯体が好ましく、ヒドロキシチオエーテル銀等が挙げられる。
無機銀塩、もしくは銀錯体は、銀として一般に0.001モル／ｍ²〜0.2モル／ｍ²、好ましくは0.01モル／ｍ²〜0.05モル／ｍ²含有されることが好ましい。

（銀イオンの還元剤）
銀イオンの還元剤は、銀イオンを銀に還元することができれば、無機・有機のいかなる材料、またはその混合物でも用いることができる。
無機還元剤としては、Fe²⁺、V²⁺、Ti³⁺、などの金属イオンで原子価の変化し得る還元性金属塩、還元性金属錯塩を好ましく挙げることができる。無機還元剤を用いる際には、酸化されたイオンを錯形成するか還元して、除去するか無害化する必要がある。例えば、Fe²⁺を還元剤として用いる系では、クエン酸やEDTAを用いて酸化物であるFe³⁺の錯体を形成し、無害化することができる。本系ではこのような無機還元剤を用いることが好ましく、より好ましくはFe²⁺の金属塩が好ましい。

なお、湿式のハロゲン化銀写真感光材料に用いられる現像主薬（例えばメチル没食子酸塩、ヒドロキノン、置換ヒドロキノン、３−ピラゾリドン類、ｐ−アミノフェノール類、ｐ−フェニレンジアミン類、ヒンダードフェノール類、アミドキシム類、アジン類、カテコール類、ピロガロール類、アスコルビン酸（またはその誘導体）、およびロイコ色素類）、および本分野での技術に熟練しているものにとって明らかなその他の材料、例えば米国特許第6,020,117号に記載されている材料も用いることができる。

還元剤としては、アスコルビン酸還元剤が好ましい。有用なアスコルビン酸還元剤は、アスコルビン酸と類似物、異性体とその誘導体を含み、例えば、Ｄ−またはＬ−アスコルビン酸とその糖誘導体（例えばγ−ラクトアスコルビン酸、グルコアスコルビン酸、フコアスコルビン酸、グルコヘプトアスコルビン酸、マルトアスコルビン酸）、アスコルビン酸のナトリウム塩、アスコルビン酸のカリウム塩、イソアスコルビン酸（またはＬ−エリスロアスコルビン酸）、その塩（例えばアルカリ金属塩、アンモニウム塩または当技術分野において知られている塩）、エンジオールタイプのアスコルビン酸、エナミノールタイプのアスコルビン酸、チオエノ−ルタイプのアスコルビン酸等を好ましく挙げることができ、特にはＤ、ＬまたはＤ，Ｌ−アスコルビン酸（そして、そのアルカリ金属塩）若しくはイソアスコルビン酸（またはそのアルカリ金属塩）が好ましく、ナトリウム塩が好ましい塩である。必要に応じてこれらの還元剤の混合物を用いることができる。

（色素増幅液）
色素増幅液は、非特許文献「臨床検査 Vol.41 no.9 1020 H₂O₂-POD系を利用した染色」に記載されているような、西洋わさびペルオキシダーゼ検出の発色基質などを、好適に用いることがでる。また、特願2007-332287号記載の発色基質は特に好ましく用いることができる。

（検出溶液）
検出溶液とは、含まれる薬剤が標識物質や被験物質などと反応し、変色、着色した化合物の生成、発光等の変化が生じる溶液を意味例えば、被験物質であるカルシウムイオンと錯体化することで呈色するオルソクレゾールフタレインコンプレキソンや、被験物質であるタンパク質と反応し変色する銅イオン溶液などが挙げられる。また、被験物質に対して特異的に結合する標識化された複合体の溶液もこれに含まれる。例えば、ハイブリダイゼーションによりＤＮＡやＲＮＡを検出する標識化ＤＮＡや標識化ＲＮＡ、抗原を検出する抗体感作粒子や抗体標識化酵素などが挙げられる。

（その他の助剤）
増幅溶液のその他の助剤としては、緩衝剤、防腐剤、例えば酸化防止剤または有機安定剤、速度調節剤を含む場合がある。緩衝剤としては、例えば、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムまたはこれらのどれかの塩、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いた緩衝剤、その他一般的化学実験に用いられる緩衝剤を用いることができる。これら緩衝剤を適宜用いて、その増幅溶液に最適なｐＨに調整することができる。また、カブリ防止剤としてアルキルアミンを添加剤として用いることができ、特に好ましくはドデシルアミンである。
以下に本発明のアッセイ方法を実施例を用いてさらに詳細に説明する。

（１）インフルエンザＡ型Ｂ型検出用イムノクロマトグラフ用ストリップの作製
(1-1) 抗インフルエンザＡ型Ｂ型抗体修飾金コロイドの作製
(1-1-1) 抗インフルエンザＡ型抗体修飾金コロイドの作製
直径50nm金コロイド溶液（EM.GC50、BBI社）９mlに50mM KH₂PO₄バッファー（pH 7.5）１mlを加えることでpHを調整した金コロイド溶液に、90μg/mlの抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体（Anti-Influenza A SPTN-5 7307、Medix Biochemica社）溶液１mlを加え攪拌した。10分間静置した後、１%ポリエチレングリコール（PEG Mw.20000、品番168-11285、和光純薬）水溶液を550μl加え攪拌し、続いて10％牛血清アルブミン（BSA FractionV、品番A-7906、SIGMA）水溶液を1.1ml加え攪拌した。この溶液を8000×ｇ、４℃、30分間遠心（himacCF16RX、日立）した後、１ml程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、20mlの金コロイド保存液（20mM Tris-HClバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG（Mw.20000）, 150mM NaCl, １% BSA, 0.1％NaN₃）に分散し、再び8000×ｇ、４℃、30分間遠心した後、１ml程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド（50nm）溶液を得た。

（1-1-2）抗インフルエンザB型抗体修飾金コロイドの作製
直径50nm金コロイド溶液（EM.GC50、BBI社）９mlに50mM KH₂PO₄バッファー（pH 8.0 ）１mlを加えることでpHを調整した金コロイド溶液に、80μg/mlの抗インフルエンザＢ型モノクローナル抗体（MONOTOPE aby Influenza B Virus (nuclear) Purified 1131、ViroStat, Inc.）溶液１mlを加え攪拌した。10分間静置した後、１％ポリエチレングリコール（PEG Mw.20000、品番168-11285、和光純薬）水溶液を550μl加え攪拌し、続いて10％牛血清アルブミン（BSA FractionV、品番A-7906、SIGMA）水溶液を1.1ml加え攪拌した。この溶液を8000×ｇ、４℃、30分間遠心（himacCF16RX、日立）した後、１ml程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、20mlの金コロイド保存液（20 mM Tris-HClバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG（Mw.20000）, 150mM NaCl,１％BSA, 0.1 % NaN3）に分散し、再び8000×ｇ、４℃、30分間遠心した後、１ml程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド（50nm）溶液を得た。

（1-2）金コロイド抗体保持パッド（標識物質保持パッド）の作製
（1-1）で作製したインフルエンザＡ型、Ｂ型抗体修飾金コロイドを、１:１で混合し、金コロイド塗布液（20mM Tris-Hclバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG（Mw.20000）, ５％スクロース）及び水により希釈し、520nmのOD（optical density）が3.0となるように希釈した。この溶液を、８mm×150mmに切ったグラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社）1枚あたり0.8mlずつ均一に塗布し、一晩減圧乾燥し、金コロイド抗体保持パッドを得た。

（1-3）抗体固定化メンブレン（クロマトグラフ担体）の作製
25mm×200mmに切断したニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、HiFlow Plus HF120、ミリポア社）に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作製した。メンブレンの長辺を下にし、下から７mmの位置に、1.5mg/mlとなるように調製した固定化用抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体（Anti-Influenza A SPTN-5 7307、Medix Biochemica社）溶液をインクジェット方式の塗布機（BioDot社）を用いて幅0.7mm程度のライン状に塗布した。同様に、下から10mmの位置に、1.5mg/mlとなるように調製した固定化用抗インフルエンザＢ型モノクローナル抗体（MONOTOPE aby Influenza B Virus (nuclear) Purified 1131、ViroStat, Inc.）溶液を幅0.7mm程度のライン状に塗布した。さらに同様に、下から13 mmの位置に、0.5mg/mlとなるように調製したコントロール用抗マウスIgG抗体（抗マウスIgG(H+L),ウサギF(ab')₂, 品番566-70621、和光純薬）溶液をライン状に塗布した。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で50℃、30分間乾燥した。ブロッキング液（0.5 w%カゼイン（乳由来、品番030-01505、和光純薬）含有50mMホウ酸バッファー(pH 8.5)）500mlをバットに入れ、そのまま30分間静置した。その後、同様のバットに入れた洗浄・安定化液（0.5w%スクロースおよび0.05w%コール酸ナトリウムを含む50mM Tris-HCl（pH 7.5）バッファー）500mlに移して浸し、そのまま30分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で一晩乾燥し、抗体固定化メンブレン（ライン塗布）とした。

（1-4）イムノクロマトグラフ用ストリップの作製
バック粘着シート（ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社）に、（1-3）で作製した抗体固定化メンブレンを貼り付けた。その際メンブレン長辺側のうち、抗インフルエンザＡ型抗体ライン側を下側とした。抗体固定化メンブレンの下側に約２mm重なるように（1-2）で作製した金コロイド抗体保持パッドを貼り付け、約４mm重なるようにして金コロイド抗体保持パッド下側に試料添加パッド（18mm×150mmに切ったグラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社））を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約５mm重なるように吸収パッド（80 mm×150 mmに切ったセルロース・グラス膜（CF6、ワットマン社））を重ねて貼り付けた。これら重ね張り合わせた部材（イムノクロマト本体部材）を、部材の長辺側を15mm幅になるように短辺に平行にギロチン式カッター（CM4000、ニップンテクノクラスタ社）で切断していくことで、15mm×55mmのイムノクロマトグラフ用ストリップを作製した。

（1-5）銀増幅溶液の作製
（1-5-1）還元剤溶液の作製
水290gに、硝酸鉄(III)九水和物（和光純薬、095-00995）を水に溶解して作製した１mol/lの硝酸鉄水溶液23.6ml、クエン酸（和光純薬、038-06925）13.1gを溶解させた。全て溶解したら、スターラーで攪拌しながら硝酸（10重量%）を36ml加え、硫酸アンモニウム鉄（II）六水和物（和光純薬、091-00855）を60.8g加えこれを還元剤溶液とした。

（1-5-2）銀イオン溶液の作製
水66ｇに、硝酸銀溶液８ｍl（10ｇの硝酸銀を含む）と１mol/lの硝酸鉄水溶液24mlを加えた。さらに、この溶液と、硝酸（10重量%）5.9ml、ドデシルアミン（和光純薬、123-00246）0.1g、界面活性剤Ｃ₉Ｈ₁₉-Ｃ₆Ｈ₄-Ｏ-（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）₅₀Ｈ 0.1gをあらかじめ47.6ｇの水に溶解した溶液を混合し、これを銀イオン溶液とした。

（1-6）色素増幅溶液の作製
４-クロロナフトールが0.6ｍM、過酸化水素が200ｍM、下記構造で表す化合物が1.2ｍMとなるようにｐH9.3に調整したリン酸水素２ナトリウム-NaOHバッファー水溶液で希釈し、10mlとなるように混合液を作製した。その際４-クロロナフトールの溶解を促すために100μlのアセトニトリルを滴下し、これを色素増幅溶液とした。

＜実施例1＞
（デバイスのセッティング）
図１に示したイムノクロマトグラフキットを用いて実験を行った。図１の第１のデバイス部品11に（1-4）で作製したイムノクロマトグラフストリップを取り付け、第２のデバイス部品12に、送液用不溶性担体２（18 mm×8mmに切ったグラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社）に13mm×8mmのバック粘着シート（ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社）を貼ったもの、および吸収用不溶性担体３（25mm×8mmに切ったセルロースメンブレン（CF6、ワットマン社）に20mm×8mmに切ったバック粘着シート（ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社）を貼ったものをそれぞれ取り付けた。

（抗原液の点着・展開）
検体液として、クイックＳ-インフルＡ・Ｂ「生研」陰性/陽性コントロール（品番322968、デンカ生研）を使用した。１質量％BSAを含むPBSバッファーでこの陽性コントロール液を希釈した。市販イムノクロマト検出キット「キャピリアFluA・B」（アルフレッサファーマ）によるクイックＳ-インフルＡ・Ｂ「生研」の検出限界はＡ型Ｂ型ともに1／40であったが、ここでは１質量％BSAを含むPBSバッファーで、この陽性コントロールを1／200に希釈し、これを検体液として用いた。（1-4）で作製したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに、検体液300μlを均一になるように滴下し、10分静置した。

（洗浄）
抗原液を10分間展開した後、図１に示した第１のデバイス部品11の液体貯蔵ポッド13に（1-5-1）で作製した還元剤溶液500μlを入れた。第１のデバイス部品11を第２のデバイス部品13に向かい合わせて閉じて、送液用不溶性担体２の端を液体貯蔵ポッド13の還元剤溶液に浸すとともに、送液用不溶性担体２及び吸収用不溶性担体３をイムノクロマトグラフストリップ１に長手方向横から装着した。こうして還元剤溶液をイムノクロマトグラフストリップ１に展開させ３分間送液した。この工程によりイムノクロマトグラフストリップ１が還元剤溶液に浸され、さらに特異的に吸着していない材料が洗浄された。

（増幅溶液によるシグナル増幅）
第２のデバイス部品12に設けられた点着孔15から（1-5-2）で作製した銀イオン溶液を滴下し、検出ラインに吸着された金コロイド標識を１分間増幅した。増幅後、イムノクロマトグラフストリップ１を取り出し、３分間水洗した。

＜比較例1＞
（洗浄）までは実施例１と同様に操作し、（増幅溶液によるシグナル増幅）において、第１のデバイス部品11に設けられた液体貯蔵ポッド13の還元剤溶液の残液を廃却し、空になった液体貯蔵ポッド13に（1-5-2）で作製した銀イオン溶液を500μl入れ、送液用不溶性担体２から吸収用不溶性担体３に向けて送液し、検出ラインに吸着された金コロイド標識を１分間増幅した。増幅後、イムノクロマトグラフストリップ１を取り出し、３分間水洗した。

＜比較例２＞
（洗浄）までは実施例１と同様に操作し、（増幅溶液によるシグナル増幅）において、第１のデバイス部品11に設けられた液体貯蔵ポッド13の還元剤溶液の残液を廃却し、空になった液体貯蔵ポッド13に（1-5-2）で作製した銀イオン溶液と還元剤溶液を１対４の割合で混合し作製した増幅溶液を500μl入れ、送液用不溶性担体２から吸収用不溶性担体３に向けて送液し、検出ラインに吸着された金コロイド標識を1分間増幅した。増幅後、イムノクロマトグラフストリップ１を取り出し、３分間水洗した。

＜評価＞
水洗後のイムノクロマトグラフストリップ１をルミノイメージアナライザー（LAS-4000富士フイルム社製）のDigitzeEPIモードで撮影し、検出ラインの光学濃度（ピークのバックグラウンドとのΔAbs.）を、イムノクロマトグラフストリップの呈色していない部分に相当する位置の出力信号強度Ｔ₀、検出ラインの出力信号強度Ｔ_iとして、下記式に基づいて吸光度ABSを算出し、予め作成した検量特性線を参照して検体中に含まれる披験物質の濃度を求めた。
ＡＢＳ＝ｌｏｇ（Ｔ₀／Ｔ_i）
また、目視により、増幅の濃淡のムラを評価した。送液の方向と評価結果をまとめたものを表１に示す。なお、表中のＡ、Ｂ、Ｃの方向は図４に示す送液方向である。また、表中の濃度（ｍＡＢＳ）はミリＡＢＳ（1000×ＡＢＳ）である。

実施例１では検出ラインが明瞭に増幅され、目視でも容易に確認できた。比較例１は、抗体固定化メンブレンに浸っていた還元剤溶液が後から送液した銀イオン溶液に追い出されることになり、増幅がまったく進まなかった。比較例２は還元剤溶液を銀イオン溶液に添加してＢ方向に流したものであるが、この場合には比較例１よりも濃度は高く検出されたものの、増幅される部位によってムラが大きく実用に耐えるものではなかった。

＜実施例２＞
（抗原液の点着・展開）
検体液として、クイックS-インフルA・B「生研」陰性/陽性コントロール（品番322968、デンカ生研）を使用した。１質量％BSAを含むPBSバッファーでこの陽性コントロール液を1／80に希釈し検体液とした。実施例１と同様に、デバイスをセッティングし、図１に示した第１のデバイス部品11の液体貯蔵ポッド13に上記検体液500μlを入れた。第２のデバイス部品12を第１のデバイス部品11に向かい合わせて閉じ、送液用不溶性担体２の端を液体貯蔵ポッド13の端を液体貯蔵ポッド13の検体液に浸すとともに、送液用不溶性担体２及び吸収用不溶性担体３をイムノクロマトグラフストリップに長手方向横から装着した。こうして検体液をイムノクロマトグラフストリップ１に展開させ10分間送液した。

（金コロイド標識抗体の展開）
（1-4）で作製したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに、１質量％BSAを含むPBSバッファーを300μl均一になるように滴下し、金コロイド抗体指示パッドに固定化されている金コロイド標識抗体を展開し、10分間静置した。

（色素増幅溶液によるシグナル増幅）
第２のデバイス部品12の点着孔15から（1-6）で作製した色素増幅溶液を滴下し、検出ラインに吸着された金コロイド標識を1分間増幅した。増幅後、イムノクロマトグラフ用ストリップを取り出し、３分間水洗した。

＜実施例３〜５＞
実施例２において、抗原希釈液の倍率を1/120、1/140、1/160とした以外は実施例２と同様にしてイムノクロマトグラフ用ストリップを得た。

＜比較例３＞
実施例２の（抗原液の点着・展開）の代わりに、(1-4)で作製したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに、実施例２で準備した検体液を300μl均一になるように滴下し、20分間静置した他は、実施例２と同様にしてイムノクロマトグラフ用ストリップを得た。

＜比較例４〜６＞
比較例３において、抗原希釈液の倍率を1/120、1/140、1/160とした以外は比較例３と同様にしてイムノクロマトグラフ用ストリップを得た。

実施例１および比較例１で行った評価と同様にして評価した。送液の方向と評価結果をまとめたものを表２に示す。なお、表中のＡ、Ｂ、Ｃの方向は表１と同様、図４に示す送液方向である。

表２から明らかなように、実施例２〜５では検体溶液、標識抗体、増幅溶液の送液方向が異なっており、いずれの希釈倍率においても披験物質が検出され、検体溶液と標識抗体溶液の送液方向を変えることによって、検出部位での吸着標識量が増加し、サンドイッチ結合の効率が向上するため高感度な検出が可能であることがわかる。一方、比較例３〜６では検体溶液と標識抗体の送液方向が同じであるため、抗原希釈液の倍率が1/140、1/160では検出することができなかった。

本発明のアッセイ方法に使用することができるイムノクロマトグラフキットの分解模式図イムノクロマトグラフ用ストリップと送液用不溶性担体および吸収用不溶性担体の接触状態を示す平面模式図図２のIII−III線断面図本発明のアッセイ方法の手順を示す平面模式図

符号の説明

１不溶性担体（イムノクロマトグラフ用ストリップ）
２送液用不溶性担体
３吸収用不溶性担体
４試料添加パッド
５標識物質保持パッド
６クロマトグラフ担体
6a 検出ライン
７吸収パッド
８粘着シ−ト
10 イムノクロマトグラフキット
11 第１のデバイス部品
12 第２のデバイス部品
13 液体貯蔵ポッド
14 位置決め部材
15 点着孔

Claims

少なくとも１以上の被験物質を含有する検体溶液と、
洗浄液、増幅溶液または検出溶液のいずれか２種類以上の液体とを含む、
３種類以上の複数の液体を、前記被験物質に対する特異的結合物質を含有する検出部位に送液することによって、前記検体溶液中に含まれる前記被験物質の定性または定量を行うアッセイ方法であって、
前記複数の液体全ての送液方向が異なっており、かつ前記複数の液体を前記検出部位上で交差させることを特徴とし、
さらに、前記披験物質または前記特異的結合物質のいずれか一方と結合可能な物質で修飾した標識物質の複合体からの標識物質シグナルを検出するものであり、
前記複数の液体が増幅溶液を含み、該増幅溶液の送液によって増幅された前記標識物質の複合体からの標識物質シグナルを検出することを特徴とするアッセイ方法。
前記検出部位が不溶性担体上に形成されており、前記送液が前記不溶性担体による毛細管力により行われることを特徴とする請求項１記載のアッセイ方法。
前記複数の液体が、前記検体溶液、前記洗浄液、前記増幅溶液および前記検出溶液であって、
前記検体溶液を前記不溶性担体に送液し、
前記洗浄液を送液するための送液用不溶性担体および前記洗浄液を吸収するための吸収用不溶性担体をそれぞれ前記不溶性担体に接触させ、
前記洗浄液を送液することによって、前記不溶性担体上の検出部位に特異的に結合した前記標識物質以外を洗浄し、
前記増幅溶液および前記検出溶液を、前記検体溶液および前記洗浄液の交差部位に送液することを特徴とする請求項１記載のアッセイ方法。
前記不溶性担体が帯状であって、該不溶性担体の主面に対して前記増幅溶液の送液方向が垂直方向であることを特徴とする請求項３記載のアッセイ方法。
前記標識物質が金属微粒子を含む物質からなることを特徴とする請求項１〜４いずれか１項記載のアッセイ方法。
前記増幅溶液が銀イオンを含む液体であることを特徴とする請求項５記載のアッセイ方法。
前記洗浄液として、前記増幅溶液に含まれる銀イオンの還元剤を含む液体を用いることを特徴とする請求項６記載のアッセイ方法。