KR20080011403A - 미오스타틴에 대한 항체 - Google Patents

미오스타틴에 대한 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미오스타틴과 결합하여 미오스타틴을 억제하는 기능을 하는 사람의 항체를 포함하는 항체 및 이것의 항원-결합부에 관한 것이다. 본 발명은 또한 사람의 항-미오스타틴 항체 및 이것의 항원-결합부에 관한 것이다. 본 발명은 또한 키메라성의, 2-특이적인, 유도된 단일사슬 항체로서의 항체, 또는 융합단백질 부분에 관한 것이다. 본 발명은 또한 사람의 항-미오스타틴 항체로부터 유래된 단리된 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 및 이러한 면역글로불린을 코드화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 사람의 항-미오스타틴 항체의 생산방법, 및 항체를 포함하는 조성물, 항체를 사용하는 방법, 및 진단 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 사람의 항-미오스타틴 항체를 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 면역글로불린 분자를 코드화하는 핵산 분자를 사용하는 유전자 치료법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 형질전환 동물 또는 식물체에 관한 것이다.
미오스타틴, 항-미오스타틴 항체, 면역글로불린

Description

미오스타틴에 대한 항체{ANTIBODIES TO MYOSTATIN}
본 발명은 미오스타틴(myostatin)에 결합하여 미오스타틴을 억제하는 기능을 하는 사람의 항체를 포함하는 항체, 즉 사람의 항-미오스타틴 항체 및 이것의 항원-결합부에 관한 것이다.
신체 성장 증거는 미오스타틴(mstn, 성장 및 분화인자-8, 또는 GDF-8)이 골격근 성장을 네거티브 방식으로 조절한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 유아에서 미오스타틴의 무효 변이(null mutation)가 일어난 경우, 이는 외견상으로는 어떠한 눈에 띄는 비정상적인 징후가 없으면서 상당한 근육 비대와 연관되어 있다[Schuelke et al. (2004) Myostatin Mutation Associated with Gross Muscle Hypertrophy in a Child. New Engl . J. Med . 350:2682-8]. 근육 미오스타틴 단백질 수준과 골격 근육량 간의 음성적 상관관계도 입증되어 왔다[Schulte, J.N. and Yarasheski, K.E. (2001), Effects of resistance training on the rate of muscle protein synthesis in frail elderly people. Int . J. Sport Nutr . Exerc . Metab . 11 Suppl:S111-820; Walker KS et al. (2004) Resistance training alters plasma myostatin but not IGF-1 in healthy men. Med Sci Sports Exerc . 36(5):787-93.]. 예를 들어, 나이에 따라 근육 미오스타틴의 발현 수준이 증가하고, 미오스타틴 발 현 증가는 또한 HIV-감염 환자에서 근육 소모의 원인이 되는 것으로 알려졌다[Gonzalez-cadavid et al. (1998) Organization of the human myostatin gene and expression in healthy men and HIV-infected men with muscle wasting. PNAS 95:14938-4321]. 또한, 중장년층에서 미오스타틴 수준이 상승되는 것으로 확인되었다[Yarasheski KE et al., (2002) Serum myostatin-immunoreactive protein is increased in 60-92 year old women and men with muscle wasting. J Nutr . Health Aging. 6(5):343-8]. 또한, 미오스타틴 결핍 마우스는 골 미네랄 밀도가 증가되었으며 이는 미오스타틴이 뼈의 질량에도 영향을 미친다는 것이다[Hamrick et al., (2003) Bone Architecture and Disc Degeneration in the Lumbar Spine of Mice Lacking GDF-8 (myostatin). J. Orthopaedic Res . 21 : 1025-1032 (또한, 상기 문헌의 인용문헌을 참고)].
순환하는 미오스타틴에 대한 항체는 2형 당뇨병에 걸린 마우스 모델에서 근육량의 증가 및 글루코스 항상성의 개선을 야기하는 것으로 밝혀졌다. 비만성 당뇨병 마우스에 중화 항체를 복강내 주사하여 미오스타틴을 억제하면 골격 근육량이 증가하고, 공복 혈당이 저하되며 글루코스 감응성이 개선된다[Li X. et al. (2002) Inhibition of myostatin increases muscle mass and improves glucose sensitivity in obese, diabetic mice. Poster #224, in Keystone Symposia: Diabetes Mellitus: Molecular Mechanisms, Genetics and New Therapies]. 또한, A y /a 마우스는 인슐린 내성을 발달시키는 것으로 알려져 있으며, 2형 당뇨병 모델로 서 사용된다. 상기 A y /a 마우스를, 미오스타틴 부위의 결실을 통해 미오스타틴이 결핍되도록 만들었을 때, 이 마우스들은 정상적으로 공급되는 글루코스 및 인슐린 수준을 갖는데, A y /a 마우스들에 비해 외부에서 글루코스 공급이 수행된 후에는 상당하게 글루코스 수준이 감소되었다 [McPherron et al. (2002) J. Clin . Invest . 109:595-601].
미오스타틴과 관련된 치명적인 근육, 골 및 대사 결함을 고려해볼 때, 미오스타틴에 특이적이고 미오스타틴 활성 감소를 통해 병태를 예방 또는 치료할 수 있는 치료제로서의 항체뿐만 아니라, 미오스타틴 활성을 저하시키는 치료가 요구되는 개체를 확인하기 위한 진단제로서의 항체가 시급하게 요구되고 있는 실정이다.
본 발명은 항-미오스타틴 항체, 상기 항체를 코드화하는 핵산, 벡터, 및 상기 항체를 생산하는 숙주 세포, 상기 항체를 포함하는 조성물 및 키트, 그리고 상기 항체를 생산하여 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 다양한 구현예는 하기에 열거된 구체예를 포함하지만 이에 국한되는 것은 아니다.
1. 미오스타틴과 특이적으로 결합하는 사람, 키메라 또는 인간화된 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
2. 상기 1에 따른 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부로서, 미오스타틴이 사람의 미오스타틴인 것인 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
3. 상기 1에 따른 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부로서, 상기 항체 또는 이것의 항원-결합부가 GDF11에 50배 이상 선택적으로 결합하는 것인 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
4. 상기 3에 따른 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부로서, 액티빈 I형 또는 II형 수용체에 대한 미오스타틴의 결합을 억제하는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
5. 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부로서,
(a) 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 및 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체와, 미오스타틴과의 결합에 대하여 경합하는 특성;
(b) 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L211; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H_I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 및 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V로 이루어지는 군으로부터 선택된 항체와 동일한 미오스타틴의 에피토프에 결합하는 특성;
(c) 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 및 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체와 실질적으로 동일한 KD로 미오스타틴과 결합하는 특성; 및
(d) 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L211; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H_I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 및 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V로 이루어지는 군으로부터 선택된 항체와 실질적으로 동일한 오프-레이트(off-rate)로 미오스타틴과 결합하는 특성
들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1가지 이상의 특성을 가지는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
6. 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부로서,
(a) 서열 번호 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85 및 118 중 어느 하나의 아미노산 서열에 포함되는 중쇄 CDR들로서 순서대로 함께인 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한, 순서대로 함께인 CDR1, CDR2 및 CDR3의 CDR 세트;
(b) 서열 번호 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 83, 87 및 120 중의 어느 하나의 아미노산 서열에 포함되는 경쇄 CDR들로서 순서대로 함께인 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한, 순서대로 함께인 CDR1, CDR2 및 CDR3의 CDR 세트; 또는
(c) 상기 (a)의 제1 CDR 세트 및 상기 (b)의 제2 CDR 세트
를 포함하는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
7. 상기 1에 따른 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부로서, 상기 항체는, 서열 번호 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85 및 118 중의 어느 하나의 아미노산 서열에 포함되는 중쇄 CDR들로서 순서대로 함께인 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한, 순서대로 함께인 CDR1, CDR2 및 CDR3의 중쇄 CDR들을 포함하는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
8. 상기 1에 따른 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부로서, 상기 항체는 서열 번호 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 83, 87 및 120 중의 어느 하나의 아미노산 서열에 포함되는 경쇄 CDR 세트들로서 순서대로 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한, 순서대로 함께인 CDR1, CDR2 및 CDR3의 경쇄 CDR들을 포함하는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
9. 상기 1에 따른 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부로서, 상기 항체 또는 이것의 항원-결합부가 서열 번호 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85 및 118 중 어느 하나에서 발견되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
10. 상기 1에 따른 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부로서, 상기 항체 또는 이것의 항원-결합부가 서열 번호 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 83, 87 및 120 중의 어느 하나에서 발견되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
11. 상기 1에 따른 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부로서, 상기 항체 또는 이의 부분이 사람 VH 1-02 유전자, 사람 VH 3-21 유전자 또는 사람 VH 3-23 유전자를 이용하는 중쇄를 포함하는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
12. 상기 1에 따른 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부로서, 상기 항체 또는 이의 일부가 사람 VK L2 유전자, 사람 VK A3 유전자 또는 사람 VK A30 유전자를 이용하는 경쇄를 포함하는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
13. 상기 1에 따른 단일클론 항체로서, 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42 또는 115 중 어느 하나의 VH 도메인과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 VH 도메인을 포함하는 단일클론 항체.
14. 상기 1에 따른 단일클론 항체로서, 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 또는 117 중 어느 하나의 VL 도메인과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 VL 도메인을 포함하는 단일클론 항체.
15. 상기 1에 따른 미오스타틴과 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부로서,
(a) 중쇄가 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L211; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 및 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V로 이루어지는 군으로부터 선택된 항체의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나;
(b) 경쇄가 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L211; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 및 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V로 이루어지는 군으로부터 선택된 항체의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(c) 항체가 상기 (a)의 중쇄 및 상기 (b)의 경쇄를 포함하는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
16. 상기 12에 따른 단일클론 항체로서, 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 또는 117 중의 어느 하나의 VL 도메인과 아미노산 서열이 90% 이상 동일한 VL 도메인을 더 포함하는 단일클론 항체.
17. 단일클론 항체로서,
(a) 서열 번호 2 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
(b) 서열 번호 6 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
(c) 서열 번호 10 및 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
(d) 서열 번호 14 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
(e) 서열 번호 18 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
(f) 서열 번호 22 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
(g) 서열 번호 26 및 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
(h) 서열 번호 30 및 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
(i) 서열 번호 34 및 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
(j) 서열 번호 38 및 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
(k) 서열 번호 42 및 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
(l) 서열 번호 115 및 서열 번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 항체
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단일클론 항체.
18. 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부로서,
(a) 서열 번호 2 및 서열 번호 4의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
(b) 서열 번호 6 및 서열 번호 8의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
(c) 서열 번호 10 및 서열 번호 12의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
(d) 서열 번호 14 및 서열 번호 16의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부
(e) 서열 번호 18 및 서열 번호 20의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
(f) 서열 번호 22 및 서열 번호 24의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
(g) 서열 번호 26 및 서열 번호 28의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
(h) 서열 번호 30 및 서열 번호 32의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
(i) 서열 번호 34 및 서열 번호 36의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부
(j) 서열 번호 38 및 서열 번호 40의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
(k) 서열 번호 42 및 서열 번호 44의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부; 및
(l) 서열 번호 115 및 서열 번호 117의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
19. 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부로서, 제1 CDR1, 제1 CDR2 및 제1 CDR3를 포함하는 제1 CDR 서열 세트; 및 제2 CDR1, 제2 CDR2 및 제2 CDR3를 포함하는 제2 CDR 서열 세트를 포함하고, 순서대로 함께 상기 각 제1 CDR 세트 및 상기 제2 CDR 세트는,
(a) 각각, 서열 번호 2 및 서열 번호 4;
(b) 각각, 서열 번호 6 및 서열 번호 8;
(c) 각각, 서열 번호 10 및 서열 번호 12;
(d) 각각, 서열 번호 14 및 서열 번호 16;
(e) 각각, 서열 번호 18 및 서열 번호 20;
(f) 각각, 서열 번호 22 및 서열 번호 24;
(g) 각각, 서열 번호 26 및 서열 번호 28;
(h) 각각, 서열 번호 30 및 서열 번호 32;
(i) 각각, 서열 번호 34 및 서열 번호 36;
(k) 각각, 서열 번호 38 및 서열 번호 40;
(l) 각각, 서열 번호 42 및 서열 번호 44; 및
(m) 각각, 서열 번호 115 및 서열 번호 117
의 순서대로 함께인 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 90% 이상 동일한 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
20. 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부로서, 제1 CDR1, 제1 CDR2 및 제1 CDR3를 포함하는 제1 CDR 서열 세트; 및 제2 CDR1, 제2 CDR2 및 제2 CDR3를 포함하는 제2 CDR 서열 세트를 포함하고, 상기 각 제1 CDR 세트 및 상기 제2 CDR 세트는
(a) 각각, 서열 번호 2 및 서열 번호 4;
(b) 각각, 서열 번호 6 및 서열 번호 8;
(c) 각각, 서열 번호 10 및 서열 번호 12;
(d) 각각, 서열 번호 14 및 서열 번호 16;
(e) 각각, 서열 번호 18 및 서열 번호 20;
(f) 각각, 서열 번호 22 및 서열 번호 24;
(g) 각각, 서열 번호 26 및 서열 번호 28;
(h) 각각, 서열 번호 30 및 서열 번호 32;
(i) 각각, 서열 번호 34 및 서열 번호 36;
(k) 각각, 서열 번호 38 및 서열 번호 40;
(l) 각각, 서열 번호 42 및 서열 번호 44; 및
(m) 각각, 서열 번호 115 및 서열 번호 117
의 순서대로 함께인 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열인 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
21. 서열 번호 115의 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 117의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 미오스타틴과 특이적으로 결합하는 단일클론 항체.
22. 서열 번호 115 및 서열 번호 117에 포함된 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
23. 서열 번호 115 및 서열 번호 117에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 미오스타틴과 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
24. 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부로서, 상기 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부는 미오스타틴의 펩티드 1 부분 및 펩티드 5 부분에 결합하고, 상기 펩티드 1은 서열 번호 103의 아미노산 서열을 포함하며, 펩티드 5는 서열 번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
25. PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575, 및 PTA-6576으로 이루어지는 군으로부터 선택된 ATCC 기탁 번호를 갖는 포에 의해 생산되는 항체.
26. 상기 1 내지 25에 따른 항체 또는 항원-결합부 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물.
27. 상기 26에 있어서, 1종 이상의 치료제를 추가로 포함하는 조성물.
28. 상기 1 내지 25에 따른 항체 또는 항원-결합부 또는 상기 26에 따른 약학 조성물을 검체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 항체, 항원-결합부 또는 약학 조성물은 미오스타틴 활성을 억제하며, 상기 검체는 근육량 증가, 골격근 발달의 촉진, 근육소모성 질병의 치료 또는 골격근 성장의 강화가 요구되는 방법.
29. 상기 1 내지 25에 따른 항체 또는 항원-결합부, 또는 상기 항체 또는 항원-결합부의 중쇄 또는 경쇄를 생산하는 단리된 세포주.
30. 상기 1 내지 25에 따른 항체의 중쇄 또는 이것의 항원-결합부, 또는 상기 항체의 경쇄 또는 이것의 항원-결합부를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
31. 상기 30에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터로서, 상기 핵산 분자에 발현 조절서열이 작동 가능하게 연결된 벡터.
32. 상기 31에 따른 벡터 또는 상기 31에 따른 핵산 분자를 포함하는 숙주세포.
33. 상기 32에 따른 숙주 세포 또는 상기 29에 따른 세포주를 적당한 조건에서 배양하는 단계; 및 상기 항체 또는 항원-결합부를 회수하는 단계를 포함하는 항-미오스타틴 항체 또는 이것의 항원-결합부를 생산하는 방법.
34. 상기 30에 따른 핵산을 염색체 상에 또는 염색체 외부에 보유하는 사람 이외의 형질전환 유기체로서, 상기 사람 이외의 형질전환 유기체가 상기 핵산을 발현하는 것인 사람 이외의 형질전환 유기체.
35. 미오스타틴과 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합부를 단리하는 방법으로서, 상기 34에 따른 사람 이외의 형질전환 유기체로부터 항체를 단리하는 단계를 포함하는 방법.
36. 미오스타틴과 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합부를 사용하여 검체를 치료하는 방법으로서,
(a) 상기 30에 따른 단리된 핵산 분자의 유효량을 상기 검체에 투여하는 단계; 및
(b)상기 핵산 분자를 발현시키는 단계
를 포함하는 방법.
37. 미오스타틴과 특이적으로 결합하는 사람의 단일클론 항체의 생산 방법으로서,
(a) 사람의 항체를 생산할 수 있는 사람 이외의 형질전환 동물을 미오스타틴, 미오스타틴의 면역원성 부분, 또는 미오스타틴을 발현하는 세포 또는 조직으로 면역화하는 단계;
(b) 사람 이외의 형질전환 동물에 미오스타틴에 대한 면역반응이 일어나도록(mount) 하는 단계;
(c) 사람 이외의 형질전환 동물로부터 β 림프구를 단리하는 단계; 및
(d) 미오스타틴과 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 상기 단리된 β 림프구로부터 단리하는 단계
를 포함하는 방법.
38. 상기 37에 따른 방법으로 제조되는 단리된 항체.
39. 액티빈 II형 또는 IIB형 수용체를 발현시키는 세포에 대한 미오스타틴의 결합을 억제하는 방법으로서, 미오스타틴을 상기 1 내지 25 중의 하나에 따른 항체 또는 이것의 항원-결합부와 접촉시켜서 상기 항체 또는 이것의 항원-결합부가 미오스타틴 활성을 억제하도록 하는 단계를 포함하는 방법.
40. 근육모세포의 활성을 촉진시키는 방법으로서, 근육모세포와 미오스타틴을 포함하는 조성물을 상기 1 내지 25 중의 하나에 따른 항체 또는 이것의 항원-결합부와 접촉시켜서 상기 항체 또는 이것의 항원-결합부가 미오스타틴 활성을 억제하도록 하는 단계를 포함하는 방법.
41. 상기 1 내지 25 중의 어느 하나에 따른 항체 또는 항원-결합부를 검체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 항체 또는 항원-결합부는 미오스타틴 활성을 억제하며, 상기 검체는 글루코스 항상성의 개선, 지방 함량의 감소, 인슐린 민감성의 증가, 신장 기능 개선, 지방 축적의 감소, 골다공증, 골감소증, 골관절염 및 골절을 포함하는 골-상실을 특징으로 하는 질병 또는 병상의 치료, 예방 또는 억제, 대사증후군의 치료, 또는 글루코코르티코이드 또는 스테로이드 호르몬으로 치료 받는 기간 중에 글루코코르티코이드 또는 스테로이드 호르몬의 지속적 투여로 인한 근육소모성 질병에 대한 반대 작용이 요구되는 것인 방법.
42. 검체 내에서 미오스타틴 활성을 감소시키는 방법으로서, 상기 1 내지 25 중의 어느 하나에 따른 단일클론 항체 또는 항원-결합부를 검체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 단일클론 항체 또는 항원-결합부가 미오스타틴 활성을 억제하는 방법.
43. 검체 내에서 노화에 따른 근육 중량의 감소를 역전(reverse)시키는 방법으로서, 상기 1 내지 25 중의 어느 하나에 따른 단일클론 항체 또는 항원-결합부를 검체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 항체 또는 항원-결합부가 미오스타틴 활성을 억제하는 방법.
44. 검체 내에서 근육모세포의 증식 및 분화를 증진시키는 방법으로서, 상기 1 내지 25 중의 어느 하나에 따른 단일클론 항체 또는 항원-결합부를 검체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 항체 또는 항원-결합부가 미오스타틴 활성을 억제하는 방법.
45. 검체 내에서 미오스타틴-유도 액티빈 IIA형 또는 IIB형 막 수용체-매개 세포 신호화 작용을 감소시키는 방법으로서, 상기 1 내지 25 중의 어느 하나에 따른 단일클론 항체 또는 항원-결합부를 검체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 항체 또는 항원-결합부가 미오스타틴 활성을 억제하는 방법.
46. 검체 내에서 액티빈 I형 막 수용체의 미오스타틴-매개 활성화를 저하시키는 방법으로서, 상기 1 내지 25 중의 어느 하나에 따른 단일클론 항체 또는 항원-결합부를 검체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 항체 또는 항원-결합부가 미오스타틴 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
47. 검체 내에서 Smad 2 및 Smad 3로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 R-smad 단백질의 미오스타틴-매개 인산화를 감소시키는 방법으로서, 상기 1 내지 18 중의 어느 하나에 따른 단일클론 항체 또는 항원-결합부를 검체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 항체 또는 항원-결합부가 미오스타틴 활성을 억제하는 방법.
48. 검체 내에서 myoD, myf5 및 미오게닌(myogenin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자의 발현을 증진시키는 방법으로서, 상기 1 내지 25 중의 어느 하나에 따른 단일클론 항체 또는 항원-결합부를 검체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 항체 또는 항원-결합부가 미오스타틴 활성을 억제하는 방법.
49. 소, 돼지, 양, 닭, 칠면조, 말, 어류, 개 및 고양이에게 근육의 성장, 체중 증가를 촉진하고 허약증(frailty) 예방을 보조하는 방법으로서, 상기 1 내지 25 중의 어느 하나에 따른 단일클론 항체 또는 항원-결합부를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 항체 또는 항원-결합부가 미오스타틴 활성을 억제하는 방법.
50. 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부로서,
(a) 서열 번호 45 및 서열 번호 47의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
(b) 서열 번호 49 및 서열 번호 51의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
(c) 서열 번호 53 및 서열 번호 55의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
(d) 서열 번호 57 및 서열 번호 59의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
(e) 서열 번호 61 및 서열 번호 63의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
(f) 서열 번호 65 및 서열 번호 67의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
(g) 서열 번호 69 및 서열 번호 71의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
(h) 서열 번호 73 및 서열 번호 75의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
(i) 서열 번호 77 및 서열 번호 79의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
(j) 서열 번호 81 및 서열 번호 83의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
(k) 서열 번호 85 및 서열 번호 87의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부; 및
(l) 서열 번호 118 및 서열 번호 120의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
51. 검체 내에서 대사증후군을 치료하는 방법으로서, 상기 1 내지 25 중의 어느 하나에 따른 항체 또는 항원-결합부를 검체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 항체 또는 항원-결합부가 미오스타틴 활성을 억제하는 방법.
52. 미오스타틴과 결합하는 것에 대하여 항체 또는 이것의 항원-결합부와 경합하는 사람의 항체, 키메라 항체 또는 인간화된 단일클론 항체를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 포유동물 숙주 세포주로서, 상기 항체 또는 항원-결합부는
(a) 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 및 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체와, 미오스타틴과의 결합에 대하여 경합하는 특성;
(b) 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L211; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H_I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 및 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V로 이루어지는 군으로부터 선택된 항체와 동일한 미오스타틴 에피토프에 결합하는 특성;
(c) 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 및 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체와 실질적으로 동일한 KD로 미오스타틴과 결합하는 특성; 및
(d) 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L211; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H_I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 및 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V로 이루어지는 군으로부터 선택된 항체와 실질적으로 동일한 오프-레이트(off-rate)로 미오스타틴과 결합하는 특성
들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1가지 이상의 특성을 가지는 포유동물 숙주 세포.
53. 미오스타틴과의 결합에 대하여 항체와 경합하는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부의 중쇄 및 경쇄를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 포유동물 숙주 세포주로서,
(a) 사람 VH 1-02 유전자, 사람 VH 3-21 유전자 또는 사람 VH 3-23 유전자를 사용하는 중쇄; 및
(b) 사람 Vκ L2 유전자, 사람 Vκ A3 유전자 또는 사람 Vκ A30 유전자를 사용하는 경쇄
를 포함하는 포유동물 숙주 세포주.
54. 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부의 중쇄 및 경쇄를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 포유동물 숙주 세포주로서, 상기 단일클론 항체의 항원-결합부가 PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575, 및 PTA-6576으로 이루어지는 군으로부터 선택된 ATCC 기탁번호를 가지는 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 항체와 아미노산 서열이 동일한 포유동물 숙주 세포주.
55. PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575 및 PTA-6576으로 이루어지는 군으로부터 선택된 ATCC 기탁번호를 가지는 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 항체와 아미노산 서열이 동일한 항체를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 포유동물 숙주세포주.
56. 상기 52 내지 55 중의 어느 하나에 따른 상기 포유동물 숙주 세포주 내에서 상기 사람 단일클론 항체를 발현시키는 단계; 및 상기 사람 단일클론 항체를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
57. ATCC 기탁번호 PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575 및 PTA-6576으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하이브리도마 세포주.
58. 사람, 키메라 또는 인간화된 단일클론 항체를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 다음의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 가지는 포유동물 숙주 세포주:
(a) 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L211; 1_314_1 H- T92A; 1_46_1 H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 및 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V로 이루어진 군으로부터 선택된 항체와, 미오스타틴과의 결합에 대하여 경합하는 특성;
(b) 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; and 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V로 이루어진 군으로부터 선택된 항체와 동일한 미오스타틴의 에피토프에 결합하는 특성;
(c) APTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575 및 PTA-6576으로 이루어지는 군으로부터 선택된 ATCC 기탁번호를 가지는 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 항체와 아미노산 서열이 동일한 항체; 및
(d) ATCC 기탁번호 PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575 및 PTA-6576으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하이브리도마 세포주.
용어 정의 및 일반적 기술
별도의 언급이 없는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 용어들은 당업자에게 통상적으로 이해될 수 있는 의미인 것으로 간주하기로 한다. 또한, 문맥상 필요한 경우가 아니면, 단수 용어는 복수 의미를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함하는 것으로 이해하기로 한다. 일반적으로, 본 명세서에 사용된 세포 및 조직 배양, 분자생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화에 관한 명명법 및 기법은 당업자에게 널리 알려져 있고, 통상적으로 사용되는 것들이다.
본 발명의 방법 및 기술은 별도의 지시가 없는 한, 본 명세서에 전반적으로 인용되고 논의된 바와 같이 당해 기술분야에 널리 공지된 통상의 기술에 따라 일반적으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 문헌들[Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual . 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates (1992), Harlow and Lane Antibodies : A Laboratory Manual . Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)]을 참조할 수 있다. 효소반응과 정제기술은 당해 기술분야에서나 본원에 기재된 바대로 제조사의 명세서에 따라 수행하였다. 분석화학, 합성유기화학 및 의약화학과 관련되어 사용된 용어나 실험방법 및 기술은 당해 기술분야에 널리 공지되어 통상적으로 사용되는 것들이다. 표준 기술은 화학합성, 화학분석, 약제의 제조, 제형화 및 공급, 그리고 환자의 치료에 적용된다.
별도의 언급이 없는 한, 다음의 용어들은 다음과 같은 의미를 가지는 것으로 이해되어야 할 것이다.
용어 "폴리펩티드(polypeptide)"는 천연 또는 인공 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩티드 유사체를 포함한다. 폴리펩티드는 단량체일 수도 있고 중합체일 수도 있다.
용어 "단리된 단백질(isolated protein)", "단리된 폴리펩티드(isolated polypeptide)" 또는 "단리된 항체(isolated antibody)"는, 그 원천이나 유래된 근원으로 인해, (1) 자체의 천연 상태에서 이를 수반하는 천연적으로 연관된 성분과 결부되지 않거나, (2) 동일한 종으로부터 유래하는 다른 단백질이 배제되거나, (3) 다른 종으로부터 유래되는 세포에 의해서 발현되거나, (4) 천연 상태에서 발생하지 않는 것이다. 그러므로, 화학적으로 합성된 폴리펩티드, 또는 천연적으로 유래된 세포와는 다른 세포 시스템에서 합성된 폴리펩티드는 자체의 천연적으로 연관된 성분으로부터 "단리된" 상태가 된다. 단백질은 당해 기술분야에 공지된 단백질 정제기술을 사용하여, 단리에 의해서 천연적으로 연관된 성분이 실질적으로 배제된다.
다양한 구현예에 있어서, 단리된 항-미오스타틴 항체는 단백질-A 정제된 것(실시예 16 참조), 생체 외에서 하이브리도마 또는 다른 세포주에 의해 합성된 것, 및/또는 형질전환 마우스로부터 유래된 사람 항-미오스타틴 항체이다.
단백질 또는 폴리펩티드는 샘플의 60 내지 75% 이상이 단일한 폴리펩티드 종을 나타낼 때 "실질적으로 순수한", "실질적으로 균질한" 또는 "실질적으로 정제된" 것이라고 한다. 폴리펩티드 또는 단백질은 단량체성일 수도 있고, 다합체성일 수도 있다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 단백질은 중량을 기준으로 통상적으로 단백질 샘플의 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상이, 보다 일반적으로는 약 95%가, 바람직하게는 99% 이상이 순수한 경우를 의미한다. 단백질의 순도나 균질도는, 예컨대 단백질 샘플의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 및 이에 이어서 겔을 당해 기술분야에 공지된 염색제로 염색하여 단일의 폴리펩티드 밴드를 가시화함으로써, 당해 기술분야에 널리 공지된 다수의 수단에 의해 확인할 수 있다. 목적에 따라서는, HPLC 또는 정제 기술분야에 널리 공지된 다른 수단들을 사용함으로써 더 높은 해상도가 제공될 수도 있다.
본 발명에 사용된 용어 "사람이 아닌 형질전환 유기체(non-human transgenic organism)"는 사람이 아닌 모든 형질전환 동물, 식물, 박테리아, 원생생물 또는 균류를 포함하는 사람이 아닌 살아 있는 형질전환 개체를 지칭한다.
본 발명에 사용되는 용어 "폴리펩티드 단편(polypeptide fragment)"은, 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단 결실을 가지지만 나머지 아미노산 서열이 자연적으로 발생하는 서열 내의 대응 위치와 동일한 폴리펩티드를 지칭하는 것이다. 어떤 실시예에서, 단편들의 길이는 적어도 5, 6, 8 또는 10개의 아미노산이다. 다른 구체예에서, 단편들은 아미노산 길이가 14 이상, 20 이상, 50 이상, 또는 70, 80, 90, 100, 150 또는 200개 이상인 것이다.
본 발명에 사용된 용어 "폴리펩티드 유사체(polypeptide analog)"는, 아미노산 서열의 일부분에 대한 실질적 동일성을 가지고, 다음 특성들 중 1가지 이상을 가지는 단편을 포함한다: (1) 적당한 결합조건에서 미오스타틴에 대한 특이적 결합하는 특성, 및 (2) 미오스타틴을 억제하거나 활성화시키는 능력. 전형적으로, 폴리펩티드 유사체는 천연 서열을 기준으로 하였을 때 보존적 아미노산 치환(또는 삽입 또는 결실)을 포함한다. 유사체의 아미노산 길이는 전형적으로, 20 내지 25개 이상, 바람직하게는 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 또는 200개 이상이고, 흔히 폴리펩티드 길이 전체만큼 길 수도 있다. 본 발명의 어떤 구현예에는, 배아세포주(germline) 아미노산 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개의 치환이 이루어진 폴리펩티드 단편 또는 폴리펩티드 유사체 항체를 포함한다.
어떤 구현예에서는, 항-미오스타틴 항체 또는 이것의 항원-결합부에 대한 아미노산 치환은: (1) 단백질 분해에 대한 민감성을 저하시키고, (2) 산화에 대한 민감성을 저하시키고, (3) 단백질 복합체를 형성할 수 있는 결합 친화도를 변화시키며, (4) 상기 유사체들의 기타 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변성시키지만, 미오스타틴에 대한 특이적 결합을 여전히 유지시키는 것이다. 예를 들어, 1개 또는 여러 개의 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환은 자연발생 서열 내에서 제공되고, 바람직하게는 분자 간 접촉을 형성하는 도메인 외부의 폴리펩티드 부분일 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 부모 서열의 구조적 특성을 실질적으로 변화시키지 않아야 하며; 예를 들어, 치환 아미노산은 부모 서열에서 발생되는 항-평행 β-시트를 변화시켜도 안되고 부모 서열을 특징짓는 다른 타입의 2차 구조를 붕괴시켜서도 안된다. 일반적으로, 글리신과 프롤린은 항-평행 β-시트에 사용되지 않는다. 당해 기술에서 인식되는 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 본원에서 참고로 한 문헌들[Proteins , Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); Thornton et al., Nature 354:105 (1991)]에 개시되어 있다.
비-펩티드 유사체는 주형 펩티드와 유사한 특성을 가지는 약제로서 제약산업에 통상적으로 사용된다. 이러한 타입의 비-펩티드 화합물은 "펩티드 모방체(peptide mimetics)" 또는 "펩티도미메틱(peptidomimetics)"으로 불리우며, 이는 본 발명에서 참조하였다[Fauchere, J. Adv . Drug Res . 15:29 (1986); Veber and Freidinger, TINS p.392 (1985); Evans et al., J. Med . Chem . 30:1229 (1987)). 이러한 화합물들은 전산화된 분자 모델링의 도움을 통해 개발되는 경우가 있다. 치료학적으로 유용한 펩티드들과 구조적으로 유사한 펩티드 모방체들은 동등한 치료적 또는 진단적 효과를 거두기 위해 사용될 수도 있다. 일반적으로, 펩티도미메틱은 예컨대 사람의 항체와 같은 패러다임 폴리펩티드(즉, 원하는 생화학적 특성 및 약리학적 활성을 가지는 폴리펩티드)와 구조적으로 유사하지만, 1개 이상의 펩티드 연결들이 공지의 방법으로, 하기의 군으로부터 선택된 연결로 선택적으로 교체될 수 있다: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(cis 및 trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, 및 -CH2SO-. 공통서열의 1개 이상의 아미노산을 동일한 타입의 D-아미노산으로 계통적 치환(예를 들어, L-라이신 대신에 D-라이신)을 하는 방법을 사용하여, 더욱 안정한 펩티드를 제조할 수 있다. 또한, 공통서열 또는 실질적으로 동일한 공통서열 변이를 포함하는 펩티드들은 당해 기술분야에 공지된 방법으로, 예를 들어, 펩티드를 환형화하는 분자 간 이황화 결합을 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 첨가함으로써 발생될 수 있다[Rizo and Gierasch, Ann . Rev . Biochem . 61 :387 (1992), 본 발명에서 참조함].
본 발명에 있어서, "항체(antibody)"가 언급되는 경우 항원-결합부 또한 사용될 수 있는 것으로 이해하기로 한다. 항원-결합부는 특이적 결합을 두고 본래의 항체와 경합한다[Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989), 전부를 본 발명에서 참조함]. 항원-결합부는 DNA 재조합 기술 또는 미손상 항체의 효소적 또는 화학적 분리에 의해 제조될 수 있다. 어떤 구현예에서, 항원-결합부는 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, 및 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단쇄 항체(scFv), 키메라 항체, 다이어바디(diabodies), 및 폴리펩티드에 대한 특이적 항원결합을 부여하기에 충분한 항체의 일부 이상을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.
N-말단으로부터 C-말단에 이르기까지, 성숙한 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 각각, 순서대로, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 영역을 포함한다. 각 도메인 대한 아미노산의 할당은 문헌[Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), Chothia & Lesk, J. MoI . Biol . 196:901-917 (1987) 또는 Chothia et al, Nature 342:878-883 (1989)]의 정의에 따른다.
본 발명에 있어서, 번호로 표시되는 항체는 동일 번호의 하이브리도마로부터 얻어진 단일클론 항체와 동일하다. 예를 들어, 단일클론 항체 2_112는 하이브리도마 2_112 또는 이것의 서브클론, 예컨대 2_112_1, 2_112_2 등으로부터 얻어진 것과 동일한 항체이다. 유일한 예외로서, 1_136-3은 1_136_1 및 1_136_2와는 다른 서브클론으로부터 얻어진 하이브리도마이다.
본 발명에서, Fd 단편은 VH 및 CH1 도메인으로 구성된 항체 단편을 의미하고, Fv 단편은 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지며; dAb 단편[Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)]은 VH 도메인을 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 항체는 VL 및 VH 도메인이 짝을 이루어, 단일 단백질 사슬로 만들어 줄 수 있는 합성 링커를 거쳐 1가 분자를 형성하는 단일사슬 항체(scFv)이다[Bird et al., Science 242:423-426 (1988); 및 Huston et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 85:5879-5883 (1988)]. 일부의 구현예에 있어서, 항체는 다이어바디(diabodies)로서, 즉 1개의 펩티드 사슬에 VH 및 VL 도메인이 발현된 2가 항체로서, 동일한 사슬 내에서 2개의 도메인들 사이에 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써 도메인들이 다른 사슬의 도메인들과 짝을 이루도록 하고 2개의 항원결합 부위를 발생시킨다. 예를 들어, 문헌들[Holliger P. et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 90:6444-6448 (1993), 및 Poljak R. J. et al., Structure 2:1121-1123 (1994)]을 참조. 어떤 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 항체로부터의 1개 이상의 CDR은 공유 결합에 의해 또는 비공유 결합에 의해 분자 내에서 일체화되어 미오스타틴과 특이적으로 결합하는 면역 점착성을 제공한다. 이러한 실시예에 있어서는 CDR은 보다 큰 폴리펩티드의 일부로서 일체화되어 다른 폴리펩티드 사슬에 공유결합에 의해서 결합되거나, 비공유 결합에 의해서 일체화될 수 있다. 또한, 프레임워크 영역(FR)은 1개 이상의 CDR을 제공한 1개의 항-미오스타틴 항체 또는 1개 이상의 상이한 사람 항체로부터 유래될 수 있다.
1개 이상의 결합부위를 가지는 구현예에 있어서, 이 결합부위들은 서로 같거나 다를 수 있다.
본원에 있어서, 용어 "사람 항체(human antibody)"는 가변 도메인 및 불변 도메인 서열이 사람의 서열인 모든 항체를 의미한다. 이 용어는, 사람의 유전자로부터 유래되었으나(즉, 사람 유전자를 사용) 변화된, 즉 가능한 면역원성이 감소되었거나, 친화도가 증가되었거나, 원치 않는 접힘(folding)을 야기할 수 있는 시스테인을 배제한 항체를 포함하는 의미이다. 이 용어는 사람이 아닌 세포 내에서 재조합 방법으로 제조되고 사람 세포에서는 전형적이지 않은 글리코실화 작용을 전가하는 항체를 포함하는 의미이다. 이러한 항체들은 하기와 같이 다양한 방법으로 제조된다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항체(chimeric antibody)"는 2개 이상의 상이한 항체로부터 유래한 영역을 가지는 항체를 의미한다. 일구현예에 있어서, 키메라 항체의 1개 이상의 CDR은 사람 항-미오스타틴 항체로부터 유래한다. 다른 구현예에 있어서, 모든 CDR은 사람의 항-미오스타틴 항체로부터 유래한다. 다른 구현예에 있어서, 1개의 사람 항-미오스타틴 항체로부터의 CDR은 키메라 항체에 결합된다. 예를 들어, 키메라 항체는 제1 사람 항-미오스타틴 항체의 경쇄로부터의 CDR1, 제2 사람 항-미오스타틴 항체의 경쇄로부터의 CDR2, 제3 사람 항-미오스타틴 항체의 경쇄로부터의 CDR3, 및 1개 이상의 다른 항-미오스타틴 항체의 경쇄로부터의 CDR들을 포함할 수 있다. 또한, 프레임워크 영역은 1개 이상의 CDR이 제공된 1개의 항-미오스타틴 항체 또는 1개 이상의 다른 사람 항체로부터 유래된 것일 수 있다.
일부 구현예에 잇어서, 본 발명의 키메라 항체는 인간화 항-미오스타틴 항체일 수 있다. 본 발명에 따른 인간화 항-미오스타틴 항체는 1개 이상의 프레임워크 영역의 아미노산 서열 및/또는 본 발명에 따른 1개 이상의 사람 항-미오스타틴 항체의 1개 이상의 불변영역의 적어도 일부 이상의 아미노산 서열을 포함하며, 사람이 아닌 항-미오스타틴 항체의 서열, 예를 들어 CDR 서열을 포함한다.
항체나 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 본 명세서의 교시에 따라 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있는 것이다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노-말단 및 카르복시-말단은 기능적 도메인의 경계 부근에서 발생된다. 구조적 및 기능적 도메인은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 데이터를 무료 또는 유료 서열 데이터베이스와 비교함으로써 확인될 수 있다. 바람직하게는 전산화된 비교 방법을 사용하여 서열 모티프(motif) 또는 공지의 구성 및 기능을 가지는 다른 단백질에서 발생된 예견된 단백질 구성 도메인을 확인할 수 있다. 알려진 3차원 구조 내로 폴딩되는 단백질 서열을 확인하는 방법은 공지되어 있다[Bowie et al, Science 253:164 (1991)].
본 발명에서 용어 "표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)"은 바이오센서 매트릭스 내에서 단백질 농도의 변화를 검출함으로써, 예컨대 BIACORE(상표명) 시스템[파마시아 바이오센서사(Pharmacia Biosensor AB, 스웨덴 웁살라 및 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)]을 사용하여 생물학적 특이성 상호작용을 실시간 분석할 수 있는 광학적 현상을 지칭한다. 참조문헌으로서는 다음의 것들이 있다[Johnsson U. et al., Ann . Biol . Clin . 51:19-26 (1993); Jonsson U. et al., Biotechniques 11:620-627 (1991); Jonsson B. et al., J. MoI . Recognit . 8:125-131 (1995); 및 Johnsson B. et al., Anal . Biochem . 198:268-277 (1991)].
용어 "KD"는 특정의 항원-항체 상호작용의 평형 해리상수이다.
용어 "오프-레이트(off rate)"는 특정의 항원-항체 상호작용의 해리속도 상수이다.
용어 "에피토프(epitope)"는 면역글로불린 또는 T-세포 리셉터에 특이적으로 결합할 수 있거나 분자와 다른 방식으로 상호작용할 수 있는 모든 단백질 결정인자를 지칭한다. 에피토프 결정인자는, 예컨대 아미노산이나 탄수화물 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적 활성 표면의 그룹핑을 포함하고, 일반적으로는 특이적 3차원 구조특성 및 특이적 전자특성을 가진다. 에피토프는 "선형" 또는 "배좌(conformational)"일 수 있다. 선형 에피토프에 있어서, 단백질 및 이와 상호작용하는 분자들(예컨대 항체)간의 상호작용의 모든 지점들은, 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형적으로 존재한다. 배좌 에피토프에 있어서, 상호작용의 지점들은 서로 분리된 단백질 상의 아미노산 잔기를 가로질러 존재한다. 항체는, 해리상수가 1 mM 이하, 바람직하게는 100 nM 이하, 가장 바람직하게는 10 nM 이하일 때, 항원에 특이적으로 결합한다고 할 수 있다. 어떤 구현예에서, KD는 1 pM 내지 500 pM이다. 다른 구현예에 있어서, KD는 500 pM 내지 1 μM이다. 다른 구현예에서, KD는 1 uM 내지 100 nM이다. 다른 구현예에 있어서, KD는 100 mM 내지 1 nM이다. 일단 항원 상에서 원하는 에피토프가 결정되면, 본 발명에 따른 기술을 이용하여 상기 에피토프에 대한 항체를 발생시킬 수 있다. 대안적으로는, 발견 단계에서, 항체의 발생 및 특성 확인은 원하는 에피토프에 관한 정보를 명료화할 수 있다. 이 정보로부터, 동일한 에피토프에 결합하는 항체들을 완전하게 스크리닝할 수 있다. 이를 달성하는 방법은, 서로 완전하게 결합하는 항체들, 즉 항체들이 항원에 결합하려고 경합을 벌이는 것을 발견하려는 교차-경합 연구를 수행하는 것이다. 자체의 교차-경합을 기초로 항체들을 "비닝(binning)"하는 고도의 처리공정은 국제특허출원공개 WO 03/48731호에 개시되어 있다.
본 발명에 있어서, 통상의 20개 아미노산 및 그 약어는 통상의 사용에 따른다[Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)].
용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 염기 길이가 10개 이상인 중합체 형태의 뉴클레오티드로서, 리보뉴클레오티드이거나, 데옥시리보뉴클레오티드이거나, 이들 중 어느 하나의 변형된 형태이다. 이 용어는 단일 및 2중 스트랜드 형태를 포함한다.
용어 "단리된 폴리뉴클레오티드(isolated polynucleotide)"는 게놈, cDNA, 또는 합성되거나 조합된 폴리뉴클레오티드를 지칭하며, 상기 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 그 근원에 따라서 (1) "단리된 폴리뉴클레오티드"가 천연 상태에서 발견되는 "폴리뉴클레오티드"의 전부 또는 일부와 결부되지 않거나, (2) 천연 상태에서는 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되거나, (3) 천연 상태에서는 보다 큰 서열의 부분으로서 발생되지 않는다.
용어 "자연발생 뉴클레오티드(naturally occuring nucleotides)"는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "변성 뉴클레오티드(modified nucleotides)"는 변성되거나 당 그룹 등이 치환된 뉴클레오티드를 의미한다. 용어 "올리고뉴클레오티드 결합(oligonucleotide linkages)"은 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), 포스포로셀레노에이트(phosphoroselenoate), 포스포로디셀레노에이트(phosphorodiselenoate), 포스포로아닐로티오에이트(phosphoroanilothioate), 포스포르아닐라데이트(phoshoraniladate), 포스포로아미데이트(phosphoroamidate), 등과 같은 올리고뉴클레오티드 결합을 포함한다. 문헌[LaPlanche et al., Nucl . Acids Res . 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am . Chem . Soc . 106:6077 (1984); Stein et al., Nucl . Acids Res . 16:3209 (1988); Zon et al., Anti - Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); 미국 특허 제5,151,510호; Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990)] 참조. 올리고뉴클레오티드에는 필요에 따라 검출용 라벨을 포함할 수 있다.
"작동 가능하게 연결된(Operably linked)" 서열은 목적 유전자와 인접한 발현 조절서열 및 트랜스 위치 또는 일정 거리에서 목적 유전자를 조절하도록 활동하는 발현 조절서열을 모두 포함한다. 용어 "발현 조절 서열(expression control sequnce)"은 리게이션된 코드 서열의 발현 및 프로세싱에 영향을 미치기 위해 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 발현 조절서열은 적당한 전사의 개시, 종료, 프로모터 및 인핸서 서열; 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 시그널과 같은 효과적인 RNA 프로세싱 시그널; 세포질 mRNA를 안정화하는 서열 번역 효율을 증강시키는 서열(즉, Kozak 공통서열); 단백질 안정성을 증강시키는 서열; 그리고 필요에 따라 단백질 분비를 증가시키는 서열을 포함한다. 이러한 조절서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 다른데, 원핵세포에서는 이러한 조절서열에 프로모터, 리보솜 결합부위 및 전사종료 서열이 포함되고, 진핵세포에서는 일반적으로 이러한 조절서열에 프로모터 및 전사종료 서열이 포함된다. 용어 "조절 서열(control sequnces)"은 최소한 발현 및 프로세싱에 있어서 존재 자체가 필수적인 모든 성분들을 포함하고, 예컨대 리더서열(leader sequence) 및 융합 파트너 서열과 같이 유리함을 제공하는 추가의 성분을 또한 포함할 수 있다.
용어 "벡터(vector)"는, 연결된 다른 핵산 분자를 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 어떤 실시예에 있어서는, 벡터가 플라스미드, 즉 DNA 스트랜드 조각의 환형 2중 구조물로서 추가의 DNA 단편이 그 내측에 연결되어 있는 것이다. 어떤 구현예에서는 벡터가 바이러스 벡터로서, 추가의 DNA 단편이 바이러스 게놈 내에 연결되어 있다. 어떤 구현예에 있어서, 벡터는 자신이 도입된 숙주세포 내에서 자발적인 복제를 할 수 있는 것이다(예를 들어, 박테리아 복제원을 가지는 박테리아벡터 및 포유동물의 에피솜 벡터). 다른 구현예에서, 벡터(예를 들어, 포유동물의 비-에피솜 벡터)는 숙주세포에 도입될 때 숙주세포의 게놈 내로 일체화됨으로써, 숙주의 게놈과 함께 복제된다. 또한, 어떤 벡터는 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 본원에서, 이러한 벡터를 "재조합 발현 벡터(recombinant expression vectors)"[또는 간략히 "발현 벡터(expression vectors)"]라고 한다.
용어 "재조합 숙주 세포(recombinant host cell)"[또는 간단히 "숙주 세포(host cell)"]는 재조합 발현벡터가 도입되는 세포이다. "재조합 숙주 세포" 및 "숙주 세포"는 특정 대상 세포뿐만 아니라 상기 세포의 자손 세포들도 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 변이 또는 환경적 영향에 기인한 계속적 발생 중에 어떤 변형이 일어날 수 있기 때문에, 이러한 후손들은 사실상 모세포와는 동일하지 않을 수 있으나, 이 경우에도 본 발명의 "숙주 세포"의 범위에 포함된다.
용어 "선택적으로 하이브리드화하다(selectively hybridize)"는 것은 검출 가능하게 특이적으로 결합한다는 것이다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 이것의 단편들은 비특이적 핵산에 검출 가능하게 결합하는 양을 최소화하는 하이브리드화 및 세척 조건 하에서 핵산 스트랜드에 선택적으로 하이브리드화된다. "매우 엄중한(high stringency)" 또는 "고도로 엄중한(highly stringent)" 조건을 이용하여 당업계에 공지된 본 발명의 선택적 하이브리드화 조건을 달성할 수 있다. "매우 엄중한" 또는 "고도로 엄중한" 조건의 한 가지 예로서, 폴리뉴클레오티드 또는 다른 폴리뉴클레오티드의 인큐베이션으로서, 1개 폴리뉴클레오티드를 예컨대 멤브레인과 같은 고체 표면에 부착시키고, 6X SSPE 또는 SSC, 50% 포름아미드, 5X Denhardt 시약, 0.5% SDS, 100 ㎍/ml의 변성 및 단편화된 연어의 정자 DNA로 이루어지는 하이브리드화 완충액에서, 42℃의 하이브리드화 온도에서 12 내지 16시간 동안 인큐베이션한 후, 1X SSC, 0.5% SDS의 세척용 완충액을 사용하여 55℃에서 2시간 동안 세척한다[Sambrook et al., supra, pp. 9.50-9.55].
용어 "서열 동일성 백분율(percent sequence identity)"은 핵산 서열의 맥락에 있어서, 최대 일치성에 대하여 정렬하였을 때 2개 서열들 내의 동일한 잔기들을 의미한다. 서열 동일성 비교의 길이는 약 9개 이상의 뉴클레오티드, 약 18개 이상의 뉴클레오티드, 약 24개 이상의 뉴클레오티드, 약 28개 이상의 뉴클레오티드, 약 32개 이상의 뉴클레오티드, 약 36개 이상의 뉴클레오티드 또는 약 48개 이상의 뉴클레오티드 이상의 길이일 수 있다. 당해 기술분야에는 뉴클레오티드 서열 동일성을 측정하기 위해 이용되는 다수의 상이한 알고리즘이 존재한다. 예를 들면, Wisconsin Package Version 10.0[지네틱스 컴퓨터그룹(GCG: Genetics Computer Group, 위스콘신주 매디슨 소재]의 프로그램들인 FASTA, Gap 또는 Bestfit를 사용하여 폴리뉴클레오티드 서열을 비교할 수 있다. FASTA는 예를 들어 FASTA2 및 FASTA3 프로그램을 포함하며, 대상서열(query sequence) 및 검색서열(search sequnce)이 가장 잘 중첩되는 영역의 정렬 및 서열 동일성 백분율을 제공한다[Pearson, Methods Enzymol . 183:63-98 (1990); Pearson, Methods MoI . Biol . 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol . 266:227-258 (1996); Pearson, J. MoI. Biol . 276:71-84 (1998); 본 발명에서 참조함]. 별도의 언급이 없는 한, 특정 프로그램이나 알고리즘에 대하여 디폴트 파라미터를 사용한다. 예를 들어, 핵산 서열들 간의 서열 동일성 백분율은 디폴트 파라미터(6워드 크기 및 매트릭스의 채점용 NOPAM 인자)를 사용한 FASTA를 이용하거나 결정하거나, 디폴트 파라미터를 사용한 GCG Version 6.1에서 제공되는 Gap을 이용하여 결정할 수 있다.
뉴클레오티드 서열의 참조는 별도의 언급이 없는 한 상보적 서열까지도 포함한다. 그러므로, 특정 서열을 가지는 핵산의 참조는 이것의 상보적인 스트랜드 및 상보적 서열을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서, 용어 "서열 동일성 백분율(percent sequence identity)" 및 "서열 상동성 백분율(percent sequence homology)"은 호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 핵산 또는 그 단편과 관련되어, 용어 "실질적 유사성(substantial similarity)" 또는 "실질적 서열 유사성(substantial sequence similarity)"은 다른 핵산(또는 이것의 상보적 스트랜드)과의 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실과 함께 최적으로 정렬되었을 때, 예컨대 FASTA, BLAST 또는 Gap과 같은 널리 공지된 서열 동일성 알고리즘에 의해 측정하는 경우, 뉴클레오티드 염기의 약 85% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상에서 서열 동일성이 있는 것을 뜻한다.
본 발명에 있어서, 폴리펩티드와 관련되어, 용어 "실질적 동일성(substantial identity)"은 예컨대 프로그램과 함께 공급된 디폴트 갭(gap) 중량을 사용하여 GAP 또는 BESTFIT 프로그램에 의해 최적으로 정렬화하였을 때, 2개의 펩티드 서열이 70%, 75% 및 80% 이상의 서열 동일성을 가지는 것을 의미한다. 일부 구현예에 있어서, 동일하지 않은 잔기 부분은 보존적 아미노산 치환 부분이 상이하다. "보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)"은 1개의 아미노산 잔기가, 화학적 특성(예컨대, 전하 또는 소수성)이 유사한 측쇄 R 그룹을 가지는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것을 의미한다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않는다. 2개 이상의 아미노산이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우, 서열 동일성 백분율은 상향 조정되어 치환의 보존적 특성에 맞도록 보정될 수 있다. 이러한 조정을 달성하는 수단은 당업자에게 널리 공지되어 있다[Pearson, Methods MoI . Biol . 243:307-31 (1994)]. 유사한 화학적 특성을 가지는 측쇄를 갖는 아미노산 그룹의 예로서는 다음과 같은 것들이 있다: 1) 지방족 측쇄 : 글리신, 알라닌, 발린, 로이신 및 이소류신; 2) 지방족-히드록실 측쇄 : 세린 및 트레오닌; 3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 라이신, 아르기닌 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파르트산 및 글루탐산; 및 7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌. 보존적 아미노산 치환 그룹에는 발린-류신-이소류신; 페닐알라닌-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르긴산염 및 아스파라긴-글루타민이 있다.
대안적으로, 보존적 치환은 본원에서 참조한 문헌[Gonnet et al. Science 256:1443-45 (1992)]에 개시된 PAM250 로그-가능성(log-likelihood) 매트릭스에서 양(positive)의 값을 가지는 모든 변화이다. "보통의 보존적인(moderately conservative)" 치환은 PAM250 로그-가능성 매트릭스에서 음이 아닌(nonnegative) 값을 가지는 모든 변화를 의미한다.
폴리펩티드의 서열 동일성은 서열분석용 소프트웨어를 사용하여 측정하는 것이 통상적이다. 단백질 분석용 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및 예컨대 보존적 아미노산 치환을 포함하는 기타 변형들의 유사성 측정을 통해 서열들을 매칭한다. 예를 들어, GCG는 예컨대 "Gap" 및 "Bestfit"와 같은 프로그램을 포함하는데, 이것은 프로그램에서 특정되는 디폴트 파라미터와 함께 사용되어 밀접하게 연관된 예컨대 상이한 종의 유기체로부터의 동종 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드들 간의 서열 상동성 또는 서열 동일성, 또는 야생형 단백질과 이것의 변이체 간의 상동성 또는 동일성을 측정할 수 있다[예컨대, GCG Version 6.1(위스콘신대학, 위스콘신주 소재)]. 폴리펩티드 서열은 또한, 예컨대 GCG Version 6.1와 같은, 디폴트 파라미터 또는 추천 파라미터를 사용하여 FASTA를 이용하여 비교할 수 있다. FASTA(예컨대 FASTA2 및 FASTA3)는 대상서열 및 검색서열들 사이의 최고 중첩 영역의 정렬 및 서열 동일성 백분율을 제공한다[Pearson, Methods Enzymol . 183:63-98 (1990); Pearson, Methods MoI . Biol . 132:185-219 (2000)]. 본 발명의 서열을 상이한 유기체로부터의 다수의 서열을 포함하는 데이터베이스와 비교하기 위한 다른 바람직한 알고리즘은 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 blastp 또는 tblastn으로서, 프로그램과 함께 공급된 디폴트 파라미터를 사용한다. 예컨대, 문헌[Altschul et al., J. MoI . Biol . 215:403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res . 25:3389-402 (1997)]을 참조.
동질성 비교시 폴리펩티드 서열의 길이는 통상적으로 아미노산 잔기가 약 10개 이상, 일반적으로는 약 20개 이상, 보다 일반적으로는 약 24개 이상, 전형적으로는 약 28개 이상, 바람직하게는 약 35개 이상인 것이다. 다수의 상이한 유기체로부터의 서열을 포함하는 데이터베이스를 검색하는 경우, 아미노산 서열을 비교하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 용어 "표지(label)" 또는 "표지화(labeled)"는 사람 항-미오스타틴 항체 내에 다른 분자를 혼입시키는 과정이다. 일구현예에 있어서, 상기 표지는 검출 가능한 마커, 예를 들어 방사성 표지화 아미노산의 혼입, 또는 마킹된(marked) 아비딘(avidin)에 의해 검출 가능한 비오티닐 기의 폴리펩티드에 부착하는 것이다[예를 들어, 형광성 마커를 함유하는 스트렙트아비딘(streptavidin) 또는 광학적 또는 색도계 측정법에 의한 효소활성 측정]. 다른 구현예에 있어서, 표지 또는 마커는 예컨대 약제 콘주게이트(drug conjugate) 또는 독소와 같은 치료제일 수 있다. 폴리펩티드와 당단백질을 표지화하는 다양한 방법들은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 사용될 수 있다. 폴리펩티드에 대한 표지물질의 예로서는 다음의 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종이 있으며, 이에 국한되지는 않는다: (예를 들어, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 1251, 131I), 형광성 표지물질(예를 들어, FITC, 로다민, 란탄 화합물, 인), 효소 표지물질(예를 들어, 양고추냉이 과산화제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리포스파타제), 화학형광 마커, 비오티닐기, 2차 리포터에 의해 인식된 예정 폴리펩티드 에피토프(예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열(leucine zipper pair sequences), 2차 항체용 결합부위(binding sites for secondary antibodies), 금속결합 도메인(metal binding domains), 에피토프 태그(epitope tags)), 예컨대 가돌리늄 킬레이트(gadolinium chelates)와 같은 자기성 작용제(magnetic agents), 예컨대 백일해 독소와 같은 독소, 택솔(taxol), 사이토칼라신(cytochalasin) B, 그라미시딘(gramicidin) D, 브롬화 에티듐(ethidium bromide), 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 테노포시드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜히친(colchicine), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디히드록시 안트라신 디온(dihydroxy anthracin dione), 미토크산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 악티노마이신(actinomycin) D, 1-데히드로테스토스테론(dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoid), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로프란올롤(propranolol), 및 푸로마이신 및 이것의 유사체 및 동종 구조체. 어떤 구현예에 있어서, 표지물질은 다양한 길이의 스페이서 아암에 의해 부착되어 잠재적인 입체적 장애를 감소시킨다
본 명세서와 특허청구범위 젠체에 걸쳐서, 용어 "포함하다(comprise)" 또는 그 변형인 예컨대 "포함한다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"은 이미 언급된 정수 또는 정수의 그룹을 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이며, 다른 어떠한 정수 또는 정수 그룹도 배제하지는 않는다는 것을 이해해야 할 것이다.
사람의 항- 미오스타틴 항체 및 그 특성확인
본 발명은 항-미오스타틴 항체를 제공한다. 일부의 구현예에 있어서, 항체는 사람 항체이다. 다른 구현예에 있어서, 항체는 인간화 항체이다. 어떤 구현예들에 있어서는, 사람이 아닌 형질전환 동물, 예를 들어 사람의 면역글로불린 유전자를 포함하는 게놈을 가지는 설치류를 면역화하여 형질전환 동물이 사람의 항체를 생산하도록 함으로써 사람 항-미오스타틴 항체를 생산한다.
본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체는 사람의 카파(κ) 또는 사람의 람다(λ) 경쇄 또는 이로부터 유도된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 카파 경쇄를 포함하는 어떤 실시예에 있어서, 경쇄 가변 도메인(VL)은 사람의 A30, A3 또는 L2 Vκ 유전자를 포함한다.
어떤 구현예에 있어서, 항-미오스타틴 항체의 VL은 배아(germline) Vκ 아미노산 서열에 비해서, 1개 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입(추가)을 포함한다. 어떤 구현예에 있어서, 항-미오스타틴 항체의 VL은 배아 Vκ 아미노산 서열에 비해서, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 포함한다. 어떤 구현예에 있어서는, 배아로부터 1개 이상의 치환이 경쇄의 CDR 영역 내에 있게 된다. 어떤 구현예에 있어서는, Vκ아미노산 치환이 본 발명에 따라 제공되는 항체의 1개 이상의 VL에서 발견되는 배아에 비해 치환과 동일한 1개 이상의 위치에 있게 된다. 예를 들면, 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체의 VL은 항체 1_257_1의 VL에서 발견되는 배아에 비해, 1개 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 항체 1_116_1의 VL에서 발견되는 배아에 비해 1개 이상의 아미노산 치환이 있을 수 있는데, 이는 항체 1_257_1와 동일한 Vκ 유전자를 이용한다.일부 실시예에 있어서, 아미노산은 동일 위치에서 1개 이상 변화하지만, 기준 항체에 있어서와는 다른 치환을 포함하게 된다. 모든 경우에 있어서, 항체 클론을 표시할 때 사용된 기호 밑줄(_)은 마침표(.)와 동일한 의미이다(예컨대, 1_257_1 = 1.257.1).
어떤 실시예에 있어서, 배아를 기준으로 한 아미노산 치환은 항체들 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116J_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 또는 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V 중 어느 VL에 있어서의 배아로부터의 치환과 동일한 1개 이상의 위치에서 발생하지만, 이때 치환은 기준 항체 내의 아미노산을 기준으로 상기 위치에서 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 예를 들어, 만일 상기 항체들 중의 하나에 있어서의 특정 위치가 배아를 기준으로 변화되었고, 그것이 글루타메이트였다면, 이것은 제 위치에서 아스파르테이트로 치환될 수 있다. 마찬가지로, 만일 예시된 항체 내에서 배아에 비해 1개의 아미노산 치환이 있었고 그것이 세린이라면, 그 위치에서 세린을 트레오닌으로 보존적으로 치환시킬 수 있다. 본 출원 전반에 걸친 보존적 아미노산 치환은 앞에서 논의하였다.
어떤 구현예에 있어서는, 항-미오스타틴 항체는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40 및 44로 이루어지는 군으로부터 선택된 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에 있어서, 경쇄는 항체 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V 또는 2_112_1L-F58I, I85V의 경쇄 아미노산 서열로 이루어진다. 어떤 구현예에 있어서는 사람 항-미오스타틴 항체의 경쇄가 항체 1_116_1(서열 번호 4); 1_136_3(서열 번호 12); 1_257_1(서열 번호 16); 1_46_1(서열 번호 24); 2_112_1(서열 번호 28); 1_314_1(서열 번호 20); 1_66_1(서열 번호 36); 2_43_1(서열 번호 44); 2_177_1(서열 번호 40); 1_132_1(서열 번호 8); 또는 1_268_1(서열 번호 32)의 VL 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개까지의 보존적 아미노산 치환을 갖고/갖거나 총 3개까지의 비-보존적 아미노산 치환을 갖는 상기 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에 있어서, 사람의 항-미오스타틴 항체의 경쇄는 항체 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V 또는 2_112_1L-F58I, I85V의 VL 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 구현예에 있어서, 경쇄는 전술한 항체들 중 어느 하나의 CDR1의 시작부터 CDR3의 끝까지를 포함한다.
어떤 일부의 구현예에 있어서, 경쇄는 각각 1_116_1(서열 번호 4); 1_136_3(서열 번호 12); 1_257_1(서열 번호 16); 1_46_1(서열 번호 24); 2_112_1(서열 번호 28); 1_314_1(서열 번호 20); 1_66_1(서열 번호 36); 2_43_1(서열 번호 44); 2_177_1(서열 번호 40); 1_132_1(서열 번호 8); 또는 1_268_1(서열 번호 32)으로부터 선택되는 2개 이상의 단일클론 항체들의 각각의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들로부터 독립적으로 선택되는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들의 아미노산 서열들을 포함할 수 있거나, 또는 각각 3개 이하 또는 2개 이하의 보존적 아미노산 치환 및/또는 총 3개 이하의 비보존적 아미노산 치환을 갖는 상기 CDR 영역들을 포함한다.
어떤 구체예에 있어서, 항-미오스타틴 항체의 경쇄는 하기의 것들로부터 선택되는 항체의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열 또는 각각 3개 이하 또는 2개 이하의 보존적 아미노산 치환 및/또는 총 3개 이하의 비보존적 아미노산 치환을 포함하는 상기 CDR 경쇄 영역들의 아미노산 서열을 포함한다: 1_116_1(서열 번호 4); 1_136_3(서열 번호 12); 1_257_1(서열 번호 16); 1_46_1(서열 번호 24); 2_112_1(서열 번호 28); 1_314_1(서열 번호 20); 1_66_1(서열 번호 36); 2_43_1(서열 번호 44); 2_177_1(서열 번호 40); 1_132_1(서열 번호 8); 또는 1_268_1(서열 번호 32).
어떤 구현예에 있어서, 중쇄와 관련하여, 가변 도메인(VH)은 사람의 VH 1-02, VH 3-21 또는 VH 3-23 유전자를 이용한다. 어떤 구현예에서, 항-미오스타틴 항체의 VH 서열은 배아 VH 아미노산 서열을 기준으로 1개 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입(추가), 총칭하여 "변이"를 포함한다. 어떤 구체예에 있어서, 중쇄의 가변 도메인은 배아 VH 아미노산 서열로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 변이를 포함한다. 어떤 구체예에 있어서, 변이(들)는 배아 아미노산 서열을 기준으로 할 때 비보존적 치환이다. 어떤 구현예에서는 변이가 중쇄의 CDR 영역 내에서 발생한다.
어떤 실시예에 있어서, 아미노산 치환들은, 항체들: 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 또는 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V의 1개 이상의 VH 이내에서 배아로부터의 치환과 동일한 1개 이상의 위치에 있게 된다. 다른 구현예에 있어서, 아미노산 변화는 1개 이상의 동일한 위치에 있게 되지만, 기준 항체에 있어서와는 다른 치환을 포함한다.
어떤 구현예에 있어서, 중쇄는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38 및 42로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에 있어서, 중쇄는 항체 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 또는 2_112_1H-I12V의 중쇄 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 구현예에 있어서, 중쇄는 항체 1_116_1(서열 번호 2), 1_136_3(서열 번호 10), 1_257_1(서열 번호 14), 1_46_1(서열 번호 22), 2_112_1(서열 번호 26), 1_314_1(서열 번호 18), 1_66_1(서열 번호 34), 2_43_1(서열 번호 42), 2_177_1(서열 번호 38), 1_132_1(서열 번호 6) 및 1_268_1(서열 번호 30)의 VH 아미노산 서열, 또는 보존적 아미노산 치환이 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10 또는 11개 이하이고 및/또는 비-보존적 아미노산 치환이 3개 이하인 VH 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에 있어서, 중쇄는 항체 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 또는 2_112_1H-I12V의 VH 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 구현예에 있어서, 중쇄는 전술한 항체들 중 하나의 CDR1의 시작으로부터 CDR3의 끝까지의 아미노산 서열을 포함한다.
어떤 구현예에 있어서, 중쇄는 항체 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 또는 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들, 또는 각각 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하, 또는 3개 이하의 보존적 아미노산 치환 및/또는 총 3개 이하의 비-보존적 아미노산 치환을 포함하는 상기 중쇄 CDR 영역들을 포함한다.
어떤 구현예에 있어서, 중쇄 CDR 영역은 다음 항체들로부터 선택되는 2개 이상의 항체들의 CDR 영역으로부터 독립적으로 선택된다: 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 또는 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V. 다른 구현예에 있어서, 항체는 전술한 경쇄 및 전술한 중쇄를 포함한다. 또다른 구현예에 있어서, 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR은 동일한 항체로부터 유래된 것이다.
다양한 구현예에 있어서, 항-미오스타틴 항체는 중쇄 전체 길이 및 경쇄 전체 길이의 아미노산 서열(들), VH 및 VL 아미노산 서열, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 또는 중쇄 아미노산 서열 또는 항-미오스타틴 항체의 CDR1의 시작부터 CDR3의 끝까지의 경쇄 아미노산 서열 및 항-미오스타틴 항체의 CDR1의 시작부터 CDR3의 끝까지의 중쇄 아미노산 서열을 가진다.
가능한 한 가지 유형의 아미노산 치환은 항체 내에서 1개 이상의 시스테인을 변화시키는 것으로서, 이 경우 비제한적인 예로서 알라닌이나 세린과 같은 다른 잔기들에 대하여 화학적 반응성을 가질 수 있다. 일실시예에 있어서, 비-정형적(non-canonical) 시스테인의 치환이 있다. 치환은 CDR 내에서 이루어질 수도 있고, 항체의 가변 도메인 또는 불변 도메인의 프레임워크 영역에서 이루어질 수도 있다. 어떤 실시예에 있어서는, 시스테인이 정형적(canonical)이다.
가능한 다른 유형의 아미노산 치환은 항체 내에서 잠재적인 단백질 분해 위치를 제거하는 것이다. 그러한 위치들은 CDR 내 또는 항체의 가변 도메인이나 불변 도메인의 프레임워크 영역에 존재할 수 있다. 시스테인 잔기의 치환, 또는 단백질 분해 위치의 제거는 항체 생산물에서 이질성(heterogeneity)의 위험을 감소시킴으로써 동질성을 증가시키게 된다. 다른 유형의 아미노산 치환은 아스파라긴-글리신 쌍을 제거하는 것으로서, 이에 따라 상기 잔기들 중 1개 또는 2개 모두를 변성시켜서 잠재적 탈아미드화(deamidation) 부위를 형성하게 된다.
어떤 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체의 중쇄의 C-말단 라이신을 분리시킨다. 본 발명의 다양한 구현예에 있어서, 항-미오스타틴 항체의 중쇄 및 경쇄는 선택적으로 시그널 서열을 포함할 수 있다.
일면에 있어서, 본 발명은 11개까지의 억제성 사람 항-미오스타틴 단일클론 항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다. 표 1에는 중쇄 및 경쇄 전체 길이를 코드화하는 핵산의 서열 번호 및 상기 사슬들의 일부를 함유하는 가변 도메인 및 이에 대응하는 전체 길이를 추정하는 아미노산 서열을 개시하였다.
서열 번호
Mab 전체 길이 V 도메인 포함부분
중쇄 경쇄 중쇄 경쇄
DNA 단백질 DNA 단백질 단백질 DNA 단백질 DNA
1_116_1 1 2 3 4 45 46 47 48
1_132_1 5 6 7 8 49 50 51 52
1_136_3 9 10 11 12 53 54 55 56
1_257_1 13 14 15 16 57 58 59 60
1_314_1 17 18 19 20 65 66 67 68
1_46_1 21 22 23 24 69 70 71 72
2_112_1 25 26 27 28 77 78 79 80
1_268_1 29 30 31 32 61 62 63 64
1_66_1 33 34 35 36 73 74 75 76
2_177_1 37 38 39 40 81 82 83 84
2_43_1 41 42 43 44 85 86 87 88
본 발명은 또한 1개 이상의 아미노산 변형을 포함하는 사람의 항-미오스타틴 항체의 전술한 임의의 중쇄 및/또는 경쇄 변종을 제공한다. 변이체의 표시에 있어서, 첫 번째 문자는 자연-발생 항체 사슬의 아미노산을 표시하는 문자 기호이고, 숫자는 아미노산의 위치(예컨대, 위치 1은 FRI의 N-말단 아미노산이다)를 나타내며, 2번째 문자는 변종 아미노산을 표시하는 문자 기호이다.
본 발명은 1_116_1L-Q45K로 불리우고 서열 번호 4의 45번 위치에 라이신을 가지는 단일클론 항체의 경쇄 변이체를 제공한다. 다른 경쇄 변이체는 1_257_1L-L21I로 불리우고 서열 번호 16의 21번 위치에 이소류신을 가진다.
본 발명은 또한 1_314_1H-T92A로 명명되고 서열 번호 18의 92번 위치에 알라닌 잔기를 가지는 단일클론 항체 1_314_1A의 중쇄 변이체를 제공한다.
본 발명은 또한 1_46_1H-L81M으로 명명되고 서열 번호 22의 81번 위치에 메티오닌을 가지는 단일클론 항체 1_46_1의 중쇄 변이체를 제공한다.
본 발명은 단일클론 항체 2_112_1의 1개의 중쇄 변이체(112V) 및 2개의 경쇄 변이체(F58I 및 I85V)를 제공한다. 2_112_1H-I12V로 불리우는 중쇄 변이체는 서열 번호 26의 12번 위치에 발린을 가진다. 1개의 경쇄 변이체 2_112_1L-F85I는 서열 번호 28의 85번 위치에 이소류신을 가진다. 또다른 경쇄 변이체 2_112_1L-I85V는 서열 번호 28의 85번 위치에 발린을 가진다. 본 발명은 또한 2개의 변이, 즉 2_112_1L-F85I, I85V를 포함하는 경쇄 변이체를 제공한다. 본 발명은 또한 1개 또는 2개의 경쇄 변이, 즉 2_112_1H-I12V, L-F58I; 2_112_1H-I12V, L-I85V; 및 2_112_1H-I12V, L-F58I, I85V를 수반하는 중쇄 변이체를 포함한 항체를 포함한다.
또다른 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 나열된 사람의 항-미오스타틴 항체들 중 하나 이상의 가변 도메인 아미노산 서열에 대하여 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 96% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 가변 도메인 아미노산 서열로 이루어지는 항체를 포함한다.
항- 미오스타틴 항체의 클래스 및 서브클래스
항-미오스타틴 항체의 클래스 및 서브클래스는 공지의 어떠한 기술로라도 결정할 수 있다. 일반적으로, 항체의 클래스 및 서브클래스는 특정 클래스 및 서브클래스에 대하여 특이적인 항체를 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 항체는 구입이 가능하다. 클래스 및 서브클래스는 ELISA 또는 웨스턴 블롯 및 기타 기술로도 결정할 수 있다. 대안적으로, 클래스 및 서브클래스는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 불변 도메인 전체 또는 일부분을 서열화하고, 면역글로불린의 다양한 클래스 및 서브클래스의 공지의 아미노산 서열에 대하여 자체의 아미노산 서열을 비교하고, 항체의 클래스 및 서브클래스를 결정함으로써 결정될 수 있다.
어떤 구체예에 있어서, 항-미오스타틴 항체는 단일클론 항체이다. 항-미오스타틴 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD 분자일 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 항-미오스타틴 항체는 IgG 클래스이고 IgGI, lgG2, lgG3, lgG4 서브클래스이다. 다른 바람직한 구현예에 있어서, 항체는 서브클래스 lgG2이다.
항- 미오스타틴 항체에 의해 인식되는 미오스타틴 에피토프의 확인
본 발명은 미오스타틴과 결합하고 하기와 같은 에피토프에 경합하거나 상호경합 및/또는 결합하는 사람 항-미오스타틴 단일클론 항체를 제공한다:
(a) 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 또는 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V로부터 선택된 항체;
(b) 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81 또는 85 중의 하나에 있는 VH 도메인의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체;
(c) 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83 또는 87 중의 하나에 있는 VL 도메인의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체; 또는
(d) 상기 (b)에 정의된 중쇄 가변 도메인 및 상기 (c)에 정의된 경쇄 가변 도메인을 모두 포함하는 항체.
항체가 동일한 에피토프에 결합하는지 또는 항-미오스타틴 항체와 결합하기 위해 상호 경합하는지는 당해 기술분야에 공지된 방법으로 결정할 수 있다. 일구현예에 있어서, 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체가 포화 조건 하에서 미오스타틴과 결합하도록 한 후, 시험 항체가 미오스타틴과 결합하는 능력을 측정할 수 있다. 만일, 기준 항-미오스타틴 항체와 동시에 시험 항체가 미오스타틴에 결합할 수 있다면, 시험 항체는 기준 항-미오스타틴 항체와는 다른 에피토프에 결합한다. 그러나, 만일 항체가 미오스타틴에 결합할 수 없다면, 시험 항체는 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일하거나, 중복되거나 아주 근접한 에피토프에 결합한다. 이 실험은 ELISA, RIA, BIACORE(상표명), 또는 흐름 세포측정법(flow cytometry)을 이용하여 수행할 수 있다. 항-미오스타틴 항체가 다른 항-미오스타틴 항체와 상호경합할 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 전술한 경합 방법을 2 방향으로 사용할 수 있다. 즉 공지의 항체가 시험 항체를 차단할 수 있는지, 그리고 그 역도 가능한지를 측정할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 실험은 ELISA를 이용하여 수행될 수 있다.
항- 미오스타틴 항체에 의한 미오스타틴 활성의 억제
다수의 검정법을 이용하여 미오스타틴 결합을 억제하는 항-미오스타틴 단일클론 항체를 확인할 수 있다. 예를 들어, 중화 항-미오스타틴 항체는 실시예 III에 설명된 바와 같이 Smad 반응 원소/루시페라제 구조물을 사용하여 트랜스펙션된 A204 세포 내에서 미오스타틴-유발 루시페라제 활성을 차단하는 자체의 능력에 의해 확인될 수 있다. 바람직한 항-미오스타틴 항체는 IC50이 50O nM, 250 nM, 100 nM, 75 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 1 nM, 0.5 nM 또는 0.1 nM 이하이다.
Smad 2/3-결합원소/베타 락타마제 구조물로 트랜스펙션된 L6 래트 근육모세포를 실시예 IV에 설명된 바와 같이 항-미오스타틴 항체와 접촉시킴으로써, 항-미오스타틴 항체가 항미오스타틴-유발 Smad 단백질 활성을 차단할 수 있는 능력을 측정할 수 있다. 다양한 구현예에서, 바람직한 항-미오스타틴 항체는 이 검정법에 있어서 IC50이 50O nM, 250 nM, 100 nM, 75 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 1 nM, 0.5 nM 또는 0.1 nM 이하이다.
대안적으로, 중화 항-미오스타틴 항체는 실시예 V에 설명된 바와 같이 웨스턴 블롯에서 Smad 2 또는 3 포스포릴화 작용을 억제할 수 있는 능력에 의해 확인될 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체는 근육세포의 증식 및 분화와 관련된 유전자의 발현을 조절한다. 이러한 조절에는 세포 사이클 조절자 P21 단백질 및 프로-아포프토시스(pro-apoptotic) Bax 단백질의 발현을 감소시키는 것, Rb의 포스포릴화를 증가시키는 것, 및 Cdk2의 발현을 증가시키는 것이 포함되지만, 이에 국한되지는 않는다. 어떤 구현예에 있어서는, 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체 길항제는 MyoD, 미오게닌(myogenin) 및 Myf5의 발현을 증가시킨다. 유전자 발현에 대한 항-미오스타틴 항체의 효과는 다수의 통상적인 기술들을 사용하여 측정할 수 있다(예를 들어 실시예 VI 참조).
본 발명의 일부 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 중화 항-미오스타틴 항체는 근육모세포 분화를 증강시킨다. 이러한 증식 및 분화를 증강시키는 항체의 능력은 예를 들어 실시예 VII에 설명된 바와 같이 C2C12 세포를 사용하는 검정법에 의해 측정될 수 있다.
경합적 및 비-경합적 사람 항- 미오스타틴 항체
본 발명에 따른 사람 항-미오스타틴 항체는 면역침전 실험을 이용하여, 다른 억제 미오스타틴 결합 단백질과 경합적인 것 및 비경합적인 것으로 분류할 수 있다. 예를 들어, 성숙한 GDF8과 복합체를 형성하는 펩티드는 억제성 단백질이다. GDF8을 발현하는 293T 세포로부터 조건화된 배지는 성숙 GDF8, 성숙 GDF8/프로펩티드 복합체 및 처리되지 않은 GDF8를 포함한다. 상기 조건화 배지를 이용하는 면역침전 연구를 수행하여, 본 발명에 따른 사람 항-미오스타틴 항체가 성숙 GDF8/프로펩티드 복합체에 결합하는 것을 테스트하였다. 실시예 X에 설명된 바와 같이, 항체 2_112_1, 2_43_1 및 2_177_1는 성숙 GDF8, 성숙 GDF8/프로펩티드 복합체 및 처리되지 않은 GDF8와 결합하여 면역침전을 형성하였다. 항체 1_66_1은 성숙 GDF8 및 성숙 GDF8/프로펩티드 복합체와 결합하여 면역침전을 형성하였다. 다른 항체들은 어떤 것도 성숙 GDF8, 펩티드 또는 처리되지 않은 GDF8와 결합하여 면역침전을 형성하지 않았다. 그러므로, 항체 2_112_1, 2_43_1 및 2_177_1은 비-경합적 항체이고, 항체 1_66_1 역시 비-경합적 항체이지만 미오스타틴의 다른 에피토프와 결합한다. 비-경합적 중화항체, 즉 다른 억제성 단백질들의 존재 하에 미오스타틴과 결합하는 항체는 경합성 항체보다 높은 생체 내 효율을 가진다. 다른 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체는 마우스 혈청으로부터의 성숙 GDF8을 면역침전시킨다. 실시예 XI에 설명된 바와 같이, 단일클론 항체 2_112, 2_43_1 및 2_177은 1_116_1 및 1_66_1보다 더 많은 GDF8을 풀다운(pull-down)시킨다.
종 특이성 및 분자 선택성
본 발명의 다른 태양에 있어서, 항-미오스타틴 항체는 종 특이성 및 분자 선택성을 모두 보인다. 본 발명의 어떤 구현예에 있어서, 항-미오스타틴 항체는 사람, 마우스, Rattus norvegicus(시궁쥐), Cynomolgus macaque(원숭이), Macaca fascicularis(게잡이원숭이), Meleagris gallopavo(칠면조), Sus scrofa(돼지), Gallus gallus(닭), Canis familiaris(개), Equus caballus(말), Coturnix chinensis(메추라기), Cotumix coturnix(뉴질랜드메추라기), 및 Columba livia(집비둘기)의 미오스타틴과 결합한다. 본 명세서의 교시에 따르면, 당해 기술분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 항-미오스타틴 항체에 대한 종-특이성을 측정할 수 있다. 예를 들어, BIAcore, ELISA, 면역침전법 또는 RIA와 같은 표면 플라스몬 공명법 또는 웨스턴 블롯을 이용하여 종 특이성을 측정할 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 항-미오스타틴 항체는 미오스타틴에 대한 선택성을 GDF11보다 50배 이상 또는 100배 이상 가진다. GDF11은 자체의 성숙 단백질에서 90%의 동질성을 공유하는 미오스타틴의 구성원이다. 본 발명의 어떤 구현예에 있어서, 항-미오스타틴 항체는 미오스타틴 이외의 다른 단백질에 대한 어떤 유의적인 특이적 결합도 나타내지 않는다. 본 명세서의 교시에 따라 당해 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 미오스타틴에 대한 항-미오스타틴 항체의 선택성을 결정할 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블롯, 흐름 세포측정법, ELISA, 면역침전법 또는 RIA를 이용하여 선택성을 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 다른 구현예에 있어서, 항-미오스타틴 항체는 GDF8에 대하여 GDF11보다 더 높은 선택성을 가지지 않는다.
항체 및 항체를 생산하는 세포주의 생산방법
면역화
본 발명의 어떤 구현예에 있어서, 사람의 항체는, 게놈 내에 사람의 일부 또는 전체 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 좌(locus)를 포함하는 사람 이외의 형질전환 동물을 미오스타틴 항원으로 면역화시켜서 생산한다. 바람직한 구현예에 있어서, 사람이 아닌 동물은 XENOMOUSE[상표명, 압제닉스사(Abgenix, Inc.), 캘리포니아주 프레몬트 소재]이다.
XENOMOUSE(상표명) 마우스는 사람 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 좌의 대단편(large fragments)을 포함하는, 마우스의 항체 생산이 결핍된 유전자조작 마우스 스트레인이다. 예를 들어, 문헌[Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994)] 및 미국 특허 제5,916,771호, 제5,939,598호, 제5,985,615호, 제5,998,209호, 제6,075,181호, 제6,091,001호, 제6,114,598호, 제6,130,364호, 6,162,963호 및 제6,150,584호 참조. 또한 WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560, 및 WO 00/037504호 참조.
본 발명의 다른 일면에 있어서, 본 발명은 사람의 면역글로불린 좌를 포함하는 사람 이외의 형질전환 동물을 미오스타틴 항원으로 면역화시켜서 사람 이외의, 마우스가 아닌 동물로부터 항-미오스타틴 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 이러한 동물은 상기 인용된 문헌들에 개시된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 인용된 문헌에 개시된 방법은, 본 발명에서 전적으로 참조한 미국 특허 제5,994,619호에 개시된 바에 따라 변형될 수도 있다. 미국 특허 제5,994,619호는 돼지와 소에서 유래된 신규의 배양 내부세포 덩어리(CICM: cultured inner cell mass) 세포 및 세포주, 그리고 이형 DNA가 삽입된 형질전환 CICM 세포들의 제조방법을 개시하고 있다. CICM 형질전환 세포를 사용하여 클로닝된 형질전환 배아, 태아 및 자손을 생산할 수 있다. 상기 미국 특허 제5,994,619호는 또한 이형 DNA를 자신의 자손에게 전파할 수 있는 형질전환 동물을 생산하는 방법을 교시하고 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 사람이 아닌 동물은 포유동물, 특히 쥐, 양, 돼지, 염소, 소, 말 또는 닭일 수 있다.
XENOMOUSE(상표명) 마우스는 사람 항체 전체의, 사람의 성인-유사(adult-like) 레퍼토리를 생산할 수 있으며, 항원-특이적 사람 항체를 생성할 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, XENOMOUSE(상표명) 마우스는 효모 인공염색체(YAC: yeast artificial chromosome) 내에 사람의 중쇄 좌 및 카파 경쇄 좌의 메가베이스(megabase) 크기의 배아 구성 단편(germline configuration fragments)의 도입을 거쳐, 약 80%의 사람 항체 V 유전자 레퍼토리를 함유할 수 있다. 다른 구현예에 있어서, XENOMOUSE(상표명) 마우스는 사람 람다 경쇄 좌를 거의 전부 함유할 수도 있다[Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green and Jakobovits, J. Exp. Med . 188:483-495 (1998), 및 WO 98/24893호](본원에서 전적으로 참조함).
어떤 구현예에 있어서, 사람의 면역글로불린 유전자를 포함하는 사람 이외의 동물은 사람의 면역글로불린 "소좌(minilocus)"를 가지는 동물이다. 이러한 소좌와 관련하여, 외인성 Ig 좌는 상기 Ig 좌로부터의 개별적 유전자를 포함시키는 과정을 통해 모방된다. 이렇게 해서, 1개 이상의 VH 유전자, 1개 이상의 DH 유전자, 1개 이상의 JH 유전자, 뮤(mu) 불변 도메인, 및 제2 불변 도메인(바람직하게는 감마 불변 도메인)이 동물 내 삽입용 구조체로 형성된다. 이러한 방법은 미국 특허 제5,545,807호, 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,661,016호, 제5,770,429호, 제5,789,650호, 제5,814,318호, 제5,591,669호, 제5,612,205호, 제5,721,367호, 제5,789,215호, 및 제5,643,763호에 개시되어 있고, 그 전체가 본원에서 인용으로 참조된다.
다른 태양에 있어서, 본 발명은 인간화 항-미오스타틴 항체의 생산방법을 제공한다. 어떤 구현예에 있어서, 사람 이외의 동물은 항체의 생산를 허용하는 조건 하에 하기의 방법에 따라 미오스타틴 항원으로 면역화시킬 수 있다. 항체-생산 세포는 동물로부터 단리할 수 있고, 목적으로 하는 항-미오스타틴 항체의 중쇄 및 경쇄를 코드화하는 핵산은 상기 세포들로부터 제조된 불멸화 세포주 또는 단리된 항체-생산 세포들로부터 단리된다. 이어, 이러한 핵산은 당업자에게 공지되어 있고 이하에 후술되는 기술을 이용하여 유전공학적으로 처리함으로써, 사람 이외의 동물의 서열의 양을 감소, 즉 항체를 인간화시켜서 사람에게서 일어나는 면역반응을 줄일 수 있다.
어떤 구현예에 있어서, 미오스타틴 항원은 단리 및/또는 정제된 미오스타틴이다. 그러나, 사람, 마우스, 쥐, 개, 메추라기, 닭, 칠면조, 돼지, 말 및 원숭이로부터의 C-말단 성숙 미오스타틴은 동일하고 세포 내에서 글리코실화되지 않기 때문에, 이러한 종 및 동일한 성숙 단백질 서열을 가지는 다른 종들로부터의 미오스타틴도 면역원으로서 사용될 수 있다. 다른 구현예에 있어서, 미오스타틴 항원은 미오스타틴을 발현 또는 과잉 발현하는 세포이다. 다른 구현예에 있어서, 미오스타틴은 효모, 곤충 세포, 예컨대 E. coli와 같은 박테리아 또는 다른 근원으로부터 재조합 기술로 발현된 재조합 단백질이다.
동물의 면역화는 당해 기술분야에 공지된 기술일 수 있다. 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990] 참조. 예컨대 마우스, 쥐, 양, 염소, 돼지, 소 및 말과 같은 사람 이외의 동물을 면역화하는 방법은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예컨대, 문헌[Harlow and Lane, supra] 및 미국 특허 제5,994,619호 참조. 바람직한 구현예에 있어서, 미오스타틴 항원은 면역반응을 자극하는 보조제와 함께 투여된다. 예시적으로 보조제로서는 프로인트(Freund) 완전보조제 또는 불완전보조제, RIBI(무라밀 디펩티드) 또는 ISCOM(면역자극용 복합체)가 있다. 이러한 보조제는 폴리펩티드를 국소적 위치에 격리시킴으로써 급속히 퍼지는 것을 방지할 수도 있고, 숙주가 마크로파지 및 면역계의 다른 성분들에 대하여 화학적 주성을 가지는 인자들을 분비하는 것을 자극하는 물질을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩티드가 투여될 때, 면역화 계획 중에 수 주간에 걸쳐서 2회 이상의 폴리펩티드 투여가 포함되어야 한다는 것이다. 실시예 I은 XenoMouse(상표명) 마우스 내에서 항-미오스타틴 단일클론 항체를 생산하는 방법을 예시한 것이다.
항체의 생산 및 항체-생산 세포주
미오스타틴 항원으로 동물을 면역화한 후, 항체 및/또는 항체-생산 세포들을 해당 동물로부터 취할 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 채혈하거나 동물을 희생시켜서 항-미오스타틴 항체-함유 혈청을 동물로부터 취한다. 혈청은 동물로부터 취한 후 그대로 사용할 수도 있고, 혈청으로부터 면역글로불린 단편을 얻을 수도 있으며, 혈청으로부터 항-미오스타틴 항체를 정제해 낼 수도 있다.
어떤 구현예에 있어서, 면역화 동물로부터 단리된 세포로부터 항체-형성 세포주를 제조한다. 면역화 후에 동물을 희생시키고, 림프절 및/또는 지라 B 세포를 공지의 방법으로 불멸화시킨다. 세포를 불멸화시키는 방법으로서는 종양유전자(oncogene)으로 트랜스펙트시키는 방법, 종양유전자 바이러스로 감염시킨 후 불멸화 세포를 선택하는 조건에서 배양시키는 방법, 종양원성(carcinogenic) 또는 변이유발(mutating) 화합물에 접촉시키는 방법, 예컨대 골수종 세포와 같은 불멸화 세포와 융합시키는 방법 및 종양억제 유전자의 불활성화 방법 등이 있으나, 이에 국한되지 않는다. 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, supra] 참조. 골육종 세포와의 융합방법을 이용되는 경우, 골육종 세포는 면역글로불린 폴리펩티드를 분비하지 않는 것(비-분비성 세포주)이 바람직하다. 불멸화 세포는 미오스타틴 또는 이것의 일부를 사용하여 스크리닝한다. 바람직한 구현예에서, 최초의 스크리닝은 효소-결합 면역검정법(ELISA: enzyme-linked immunoessay) 또는 방사성 면역검정법을 사용하여 수행한다. ELISA 스크리닝의 실시예는 본원에서 참조하는 WO 00/37504호에 개시되어 있다.
예컨대 하이브리도마와 같은 항-미오스타틴 항체-생산 세포를 선택하고, 클로닝한 후, 강건한 성장, 높은 항체 생산성 및 후술하는 원하는 항체 특성을 포함하는 원하는 특성을 가지는지 더 스크리닝한다. 하이브리도마는 공통유전자(syngeneic) 동물 내에서, 예컨대 누드 마우스와 같이 면역계가 결여된 동물 내에서, 또는 생체 외 세포배양물 내에서 생체 내 확장될 수 있다. 하이브리도마의 선택, 클로닝 및 확산 기술은 당업자에게 공지되어 있다.
바람직한 구현예에 있어서, 면역화된 동물은 사람의 면역글로불린 유전자를 발현하는 사람 이외의 동물이고, 비장의 B 세포는 사람 이외의 동물과 동종으로부터 유래된 골육종 세포주에 융합된다. 더 바람직한 구체예에서, 면역화된 동물은 XENOMOUSE(상표명) 마우스이고, 골육종 세포주는 비-분비성 마우스 골육종이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 골육종 세포주는 P3-X63-Ag8.653(미국 모식균 배양 수집소:ATCC)이다. 예를 들어, 실시예 I 참조.
따라서, 한 가지 구현예에 있어서, 본 발명은 미오스타틴에 대한 사람의 단일클론 항체 또는 그 단편을 생산하는 세포주의 제조방법을 제공하며, 그 방법은 다음 단계들을 포함한다: (a) 본 발명에 설명된 사람 이외의 형질전환 동물을 미오스타틴, 미오스타틴의 일부, 또는 미오스타틴을 발현하는 세포 또는 조직으로 면역화하는 단계; (b) 형질전환 동물에 미오스타틴에 대한 면역반응을 부여하는 단계; (c) 형질전환 동물로부터 항체-생산 세포를 단리하는 단계; (d) 항체-생산 세포를 불멸화하는 단계; (e) 불멸화된 항체-생산 세포의 개별적 단일클론 개체군을 형성하는 단계; 및 (f) 불멸화된 항체-생산 세포를 스크리닝하여 항-미오스타틴 항체를 확인하는 단계.
다른 태양에 있어서, 본 발명은 사람의 항-미오스타틴 항체를 생산하는 세포주를 제공한다. 어떤 구현예에 있어서, 세포주는 하이브리도마 세포주이다. 어떤 구현예에 있어서, 하이브리도마는 전술한 바와 같이 마우스 하이브리도마이다. 다른 구현예에 있어서, 하이브리도마는 사람 이외의, 마우스가 아닌 예컨대 쥐, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말과 같은 종에서 생산된다. 다른 구현예에 있어서, 하이브리도마는 사람의 하이브리도마이다.
다른 구현예에 있어서, 형질전환 동물을 미오스타틴 항원으로 면역화시키고, 1차 세포, 예컨대 비장이나 말초혈액 B 세포를 면역화된 형질전환 동물로부터 단리시키며, 원하는 항원에 대하여 특이적인 항체를 생산하는 개개의 세포들을 확인한다. 각각의 개별적 세포들로부터 유래된 폴리아데닐화 mRNA를 단리하고, 예컨대 사람의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 유전자의 FRI 영역의 전부 또는 거의 전부를 인식하는 퇴화성(degenerate) 프라이머와 같이 가변 도메인 서열에 대하여 어닐링하는 감작(sense) 프라이머, 및 불변영역 서열이나 결합(joining) 영역 서열에 대하여 어닐링하는 항-감작서열을 사용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR: reverse transcription polymerase chain reaction)을 수행한다. 그 다음으로는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 cDNA를 클로닝하고, 적당한 숙주세포, 예컨대 골육종 세포 내에서, 예컨대 중쇄와 같은 각각의 면역글로불린 불변영역, 및 κ 또는 λ 불변 도메인과 함께 키메라 항체로서 발현시킨다. 문헌[Babcook, J. S. et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA 93:7843-48, 1996] 참조. 이어, 항-미오스타틴 항체를 확인하고 본 명세서에 설명된 대로 단리할 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 파지 디스플레이(phage display) 기술을 사용하여, 미오스타틴에 대한 친화도를 다양화하여 항체 레퍼토리를 포함하는 라이브러리를 제공한다. 이러한 레퍼토리의 제조를 위해, 면역화 동물로부터 B 세포를 불멸화시키는 것은 불필요하다. 오히려, 1차 B 세포를 mRNA원으로서 직접 사용할 수 있다. 예컨대 비장으로부터 유래된 B 세포로부터 얻은 cDNA 혼합물을 사용하여, 예를 들어 E. coli 내로 트랜스펙션된 파지 디스플레이 라이브러리와 같은 발현 라이브러리를 제조한다. 얻어진 세포들에 대하여, 미오스타틴에 대한 면역반응성을 테스트한다. 상기 라이브러리에서 유래된 친화도가 높은 사람 항체의 특성을 확인하는 기술은 개시된 바 있다. 문헌[Griffiths et al., EMBO J., 13:3245-3260 (1994); Nissim et al., ibid, pp. 692-698 및 Griffiths et al., ibid, 12:725-734] 참조(본 발명에서 참고로 함). 결과적으로, 상기 라이브러리로부터의 클론은, 항원에 대한 원하는 크기의 결합 친화도를 생성하는 것으로 확인되며, 그러한 결합을 담당하는 산물을 코드화하는 DNA를 회수 및 조작하여 표준 재조합체를 발현한다. 파지 디스플레이 라이브러리는 또한 미리 조작된 핵산 서열을 사용하여 구성할 수 있으며, 유사한 방법으로 스크리닝할 수 있다. 일반적으로, 중쇄 및 경쇄를 코드화하는 cDNA는 독자적으로 공급되기도 하고, 파지 라이브러리내의 제조를 위해 Fv 유사체를 형성하도록 연결되기도 한다.
이어, 미오스타틴에 대하여 최고의 친화도를 가지는 항체 및 적당한 클론으로부터 회수된 유전물질에 대하여 파지 라이브러리를 스크리닝한다. 이러한 스크리닝 통해 단리된 원래 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다.
핵산, 벡터, 숙주세포 및 재조합체 , 항체의 생산방법
핵산
본 발명은 항-미오스타틴 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 코드화하는 핵산 분자를 포함하는 것이다. 어떤 구현예에 있어서, 상이한 핵산 분자들이 항-미오스타틴 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄를 코드화한다. 다른 구현예에 있어서, 동일한 핵산 분자들이 항-미오스타틴 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄를 코드화한다.
어떤 구현예에 있어서, 경쇄(VL)의 가변 도메인을 코드화하는 핵산 분자는 사람의 A3, A30 또는 L2 VK 유전자, 및 사람의 JK1, JK3 또는 JK4 유전자를 활용한다. 어떤 구현예에 있어서, 핵산 분자는 사람의 A30, A3 또는 L2 VK 유전자, 및 사람의 JK4 유전자를 활용한다. 다른 구현예에 있어서, 핵산 분자는 사람의 A30, A3 또는 L2 VK 유전자, 및 사람의 JK1 유전자를 활용한다. 어떤 구현예에 있어서, 경쇄를 코드화하는 핵산 분자는 배아 아미노산 서열로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 치환을 포함하는 아미노산 서열을 코드화한다. 어떤 구현예에 있어서, 핵산 분자는 배아 VK 및 JK 서열에 비해 1, 2, 3, 4 또는 5개의 보존적 아미노산 치환 및/또는 1, 2 또는 3개의 비-보존적 치환을 포함한 VL 아미노산 서열을 코드화하는 핵산 서열을 포함한다. 치환은 CDR 영역, 프레임워크 영역 또는불변 도메인 내에 있을 수 있다.
어떤 구현예에 있어서, 핵산 분자는 항체들: 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 또는 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V 중의 어느 하나의 VL에서 발견되는 배아로부터의 변이와 동일한 배아 서열에 비해, 1개 이상의 변이를 포함하는 VL 아미노산 서열을 코드화한다.
어떤 구현예에 있어서, 핵산 분자는 항체: 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L211; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 또는 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V 중의 어느 하나의 VL에서 발견되는 배아 서열에 비해 3개 이상의 아미노산 치환을 코드화한다.
어떤 구현예에 있어서, 핵산 분자는 단일클론 항체 1_116_1(서열 번호 4); 1_136_3(서열 번호 12); 1_257_1(서열 번호 16); 1_46_1(서열 번호 24); 2_112_1(서열 번호 28); 1_314_1(서열 번호 20-_); 1_66_1(서열 번호 36); 2_43_1(서열 번호 28); 2_177_1(서열 번호 40); 1_132_1(서열 번호 8); 또는 1_268_1(서열 번호 32)의 VL 아미노산 서열, 또는 이의 변종이나 그 일부를 코드화한다. 어떤 구현예에 있어서, 핵산은 상기 목록의 항체들 중 하나의 경쇄 CDR을 포함하는 아미노산 서열을 코드화한다. 어떤 구현예에 있어서, 상기 일부는 CDR1 내지 CDR3를 포함하는 인접 부분이다.
어떤 구현예에 있어서, 핵산 분자는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83 또는 87 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구현예에 있어서, 핵산 분자는 서열 번호 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 48, 52, 56, 60, 68, 72, 80, 64, 76, 84 또는 88의 뉴클레오티드 서열 또는 그 일부를 포함한다. 어떤 구현예에 있어서, 핵산은 상기 항체의 1개, 2개 또는 3개의 CDR 모두의 경쇄의 아미노산 서열을 코드화한다. 어떤 구현예에 있어서, 상기 일부는 항-미오스타틴 항체의 CDR1 내지 CDR3로부터의 근접 영역을 코드화한다.
어떤 구현예에 있어서, 핵산 분자는 항체 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L211; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 또는 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 또는 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V 중의 어느 하나의 VL 아미노산 서열; 또는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83 또는 87중의 어느 하나의 VL 영역의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 VL 아미노산 서열을 코드화한다. 본 발명에 따른 핵산 분자는 전술한 바와 같은 고도로 엄격한 조건 하에서 하이브리드화되는 핵산을 포함하거나, 또는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83 또는 87의 VL 영역의 아미노산 서열을 코드화하는 핵산; 또는 서열 번호 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 48, 52, 56, 60, 68, 72, 80, 64, 76, 84 또는 88의 VL 영역 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 핵산이다.
다른 바람직한 구현예에 있어서, 핵산 분자는 사람의 1-02, 3-21 또는 3-23 VH 유전자 서열 또는 그로부터 유도된 서열을 사용하는 중쇄(VH) 가변 영역을 코드화한다. 다양한 구현예에 있어서, 핵산 분자는 사람 VH 1-02 유전자, D4-23 유전자 및 사람 JH6b 유전자; 사람 VH 3-21 유전자, 사람 D3-16 또는 D5-12 유전자 및 사람 JH6b 유전자; 사람 VH 3-21 유전자, 사람 D1-26 또는 D5-5 유전자 및 사람 JH4b 유전자; 사람 VH 3-23 유전자, 사람 D1-7 유전자 및 사람 JH3b 유전자를 활용한다.
어떤 구현예에 있어서, 핵산 분자는 사람의 V, D 또는 J 유전자의 배아 아미노산에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 변이를 포함하는 아미노산을 코드화한다. 어떤 구현예에 있어서, 상기 변이는 VH 영역 내에 있다. 어떤 구현예에 있어서, 상기 변이는 CDR 영역 내에 있다.
어떤 구현예에 있어서, 핵산 분자는 단일클론 항체 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 또는 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V의 VH에서 발견되는 아미노산 변이와 동일한 배아 VH 서열에 비해, 1개 이상의 아미노산 변이를 포함하는 VH 서열을 코드화한다. 어떤 구현예에 있어서, 핵산은 전술한 단일클론 항체 목록 중의 1개에서 발견되는 3개 이상의 아미노산 변이와 동일한 배아 서열에 비해, 3개 이상의 아미노산 변이를 코드화한다.
어떤 구현예에 있어서, 핵산 분자는 1_116_1(서열 번호 2); 1_136_3(서열 번호 10); 1_257_1(서열 번호 14); 1_46_1(서열 번호 22); 2_112_1(서열 번호 26); 1_314_1(서열 번호 18); 1_66_1(서열 번호 34); 2_43_1(서열 번호 42); 2_177_1(서열 번호 38); 1_132_1(서열 번호 6); 또는 1_268_1(서열 번호 30)으로 이루어지는 단일클론 항체 중 VH 아미노산 서열의 일부 이상을 코드화하는 뉴클레오티드 서열, 이것의 변이체, 또는 상기 서열 중 보존적 아미노산 변이를 가지는 서열, 및/또는 총 3개 또는 그 이하의 비-보존적 아미노산 치환을 가지는 서열을 포함한다. 다양한 구현예에 있어서, 상기 서열은 상기 목록 중 항-미오스타틴 항체의 1개 이상의 CDR 영역, 바람직하게는 CDR3 영역, 3개 모두의 CDR 영역, CDR1 내지 CDR3를 포함하는 근접부, 또는 VH 영역 전체를 코드화한다.
어떤 구현예에 있어서, 핵산 분자는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81 또는 85 중의 하나의 아미노산 서열을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직한 다양한 구체예에 있어서, 핵산 분자는 서열 번호 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82 또는 86의 뉴클레오티드 서열의 일부 이상을 포함한다. 어떤 구현예에 있어서, 상기 일부분은 VH 영역, CDR3 영역, 3개 모두의 CDR 영역, 또는 CDR1 내지 CDR3를 포함하는 근접 영역을 코드화한다.
어떤 구현예에 있어서, 핵산 분자는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81 또는 85 중의 어느 하나에 있는 VH 아미노산 서열에 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 VH 아미노산 서열을 코드화한다. 본 발명에 따른 핵산 분자는, 전술한 바와 같이 고도로 엄밀한 조건 하에서 하이브리드화되는 핵산, 또는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38 또는 42의 아미노산 서열을 코드화하는 핵산 또는 이것의 VH 영역; 또는 서열 번호 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37 또는 41의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 또는 이것의 VH 영역을 코드화하는 뉴클레오티드 서열에 대하여 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 가지는 핵산 분자를 포함한다.
다른 구현예에 있어서, 핵산은 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 또는 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V로부터 선택되는 항체의 총 길이의 중쇄, 또는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38 또는 42의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 코드화한다.
항-미오스타틴 항체 또는 그 일부분의 중쇄 또는 경쇄를 코드화하는 핵산 분자는 상기 항체를 생산하는 모든 근원으로부터 단리시킬 수 있다. 다양한 구현예에 있어서, 핵산 분자는 미오스타틴으로 면역화된 동물로부터, 또는 상기 B 세포에서 유래된 불멸화 세포로부터 단리된 항-미오스타틴 항체를 발현하는 B 세포로부터 단리된다. 항체를 코드화하는 핵산의 단리방법은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, Sambrook et al.의 문헌 참조. mRNA를 단리하여 항체 유전자의 중합효소 연쇄반응(PCR) 또는 cDNA 클로닝에 사용하기 위한 cDNA를 생산하는 데 이용할 수 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 핵산 분자는, 사람 이외의 형질전환 동물로부터 유래되고 사람의 면역글로불린을 생산하는 세포를 하나의 융합 대상으로 가지는 하이브리도마로부터 단리된다. 더욱 바람직한 구체예에 있어서, 사람의 면역글로불린을 생산하는 세포는 XENOMOUSE(상표명) 동물로부터 유래한다. 다른 구현예에 있어서, 사람의 면역글로불린을 생산하는 세포는, 전술한 바와 같이, 사람 이외의, 마우스가 아닌 형질전환 동물로부터 단리된다. 다른 구현예에 있어서, 핵산은 사람 이외의 비-형질전환 동물로부터 단리된다. 사람 이외의 비-형질전환 동물로부터 단리된 핵산 분자는 예를 들어 본 발명에 따른 사람의 항-미오스타틴 항체로부터 유래된 1개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체를 위해 사용될 수 있다.
어떤 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체의 중쇄를 코드화하는 핵산은, 모든 근원으로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 코드화하는 뉴클레오티드 서열에 인-프레임(in-frame) 결합된 본 발명에 따른 VH 도메인을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 마찬가지로, 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체의 경쇄를 코드화하는 핵산은, 모든 근원으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인을 코드화하는 뉴클레오티드 서열에 인-프레임(in-frame) 결합된 본 발명에 따른 VL 도메인을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 또다른 일면에 있어서, 중쇄(VH) 및/또는 경쇄(VL)의 가변 도메인을 코드화하는 핵산 분자는 전체-길이 항체 유전자로 변환된다. 일 구현예에 있어서, VH 또는 VL 도메인을 코드화하는 핵산 분자는, 중쇄 불변(CH) 도메인 및 경쇄(CL) 도메인을 각각 코드화하는 발현벡터 내에 사전에 삽입하여 VH 단편이 벡터 내의 CH 단편(들)에 작동 가능하게 연결되고 및/또는 VL 단편이 벡터 내의 CL 단편(들)에 작동 가능하게 연결되도록 함으로써, 전체 길이의 항체 유전자로 변환된다. 다른 구현예에 있어서, 중쇄(VH) 및/또는 경쇄(VL) 도메인을 코드화하는 핵산 분자는, 표준적인 분자생물학적 기술을 이용하여, 중쇄(VH) 및/또는 경쇄(VL) 도메인을 코드화하는 핵산 분자를, CH 및/또는 CL 도메인을 코드화하는 핵산 분자에 연결, 즉 결합시킴으로써, 전체 길이의 항체 유전자로 변환된다. 사람의 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 불변 도메인 유전자의 핵산 서열은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publ. No. 91-3242, 1991] 참조. 그 다음으로, 전체 길이 중쇄 및/또는 경쇄를 코드화하는 핵산 분자는 이것이 도입된 세포에서 발현되어 항-미오스타틴 항체가 단리될 수 있다.
핵산 분자를 사용하여 항-미오스타틴 항체를 재조합 방법으로 대량 발현시킬 수 있다. 또한, 핵산 분자를 사용하여, 후술하는 바와 같은 키메라 항체, 2-특이성(bispecific) 항체, 단쇄 항체, 면역결합물질(immunoadhesin), 다이어바디(diabody), 변이유발 항체 및 항체 유도체를 생산할 수도 있다. 핵산 분자가 사람 이외의 비-형질전환 동물로부터 유래된 것이라면, 핵산 분자는 후술하는 바와 같이 항체의 인간화에 사용될 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 특이적 항체 서열용 프로브 또는 PCR 프라이머로서 사용된다. 예를 들어, 핵산은 진단방법에서의 프로브로서, 또는 PCR 프라이머로서 사용되어 특히 사용 가능한 DNA의 영역을 증폭시킴으로써, 항-미오스타틴 항체의 가변 영역을 코드화하는 추가의 핵산 분자를 단리할 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 핵산 분자는 올리고뉴클레오티드이다. 어떤 구현예에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 목적 항체의 경쇄 및 중쇄의 고도의 가변 도메인으로부터 유래된다. 어떤 구현예에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 하기 항체들 또는 본 발명에 따른 이것들의 변이체를 전부 또는 일부 코드화한다: 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 또는 2_112_1H-L81M, L-I85V; 또는 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V.
벡터
본 발명은 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체 또는 그 항원-결합부의 중쇄를 코드화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체 또는 그 항원-결합부의 경쇄를 코드화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 융합 단백질, 변형 항체, 항체 단편 및 이들의 프로브를 코드화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
어떤 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체 또는 항원-결합부는, 전술한 바와 같이 얻어진 경쇄 및 중쇄의 전체 길이 또는 일부를 코드화하는 DNA를 발현벡터 내에 삽입하여 유전자가 예컨대 전사 및 번역 조절서열과 같은 필요한 발현 조절서열에 작동 가능하게 연결되도록 함으로써 발현된다. 발현벡터로서는 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-결합 바이러스(AAV: adeno-associated viruses), 예컨대 콜리플라워(cauliflower) 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러스 등과 같은 식물성 바이러스, 코스미드(cosmids), YAC, EVB-유래의 에피솜 등이 있다. 항체 유전자는 벡터 내에 연결(ligation)되어, 벡터 내의 전사 및 번역 조절서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 자체의 본연의 기능을 하도록 한다. 발현벡터 및 발현 조절서열은 사용된 발현 숙주세포와 공존할 수 있도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자와 항체 중쇄 유전자는 별도의 다른 벡터 내에 삽입될 수도 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 2개 유전자는 동일한 벡터 내에 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법(즉, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적 제한부위에 연결되거나, 제한부위가 없을 경우에는 평활 말단에 연결)에 의해 발현벡터 내로 삽입된다.
유용한 벡터는, 기능적으로 완전한 사람의 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 코드화하는 것으로서, 전술한 바와 같이 VH 및 VL 서열이 용이하게 삽입 및 발현될 수 있도록 적당한 제한부위가 유전공학적으로 처리된 것이다. 이러한 벡터에 있어서는, 삽입된 J 영역 내의 접착 공여부위와 사람 C 도메인 앞쪽의 접착 수용부위 사이에서 스플라이싱(splicing)이 일어나고, 그리고 사람의 CH 엑손 이내에서 발생하는 접착 영역에서 스플라이싱이 발생한다. 폴리아데닐화 및 전사의 종료는 코드 영역의 다운스트림에 있는 천연 염색체 부위에서 일어난다. 재조합 발현벡터는 또한, 숙주세포에서 항체 사슬의 분비를 촉진하는 시그널 펩티드를 코드화할 수 있다. 항체 연쇄유전자(antibody chain gene)는 벡터 내로 클로닝되어, 시그널 펩티드가 면역글로불린 사슬의 아미노 말단에 인-프레임(in-frame) 식으로 연결되도록 할 수 있다. 시그널 펩티드는 면역글로불린 시그널 펩티드일 수도 있고, 이종 기원의 시그널 펩티드일 수도 있다(즉, 시그널 펩티드가 비-면역글로불린 단백질을 형성한다).
항체 연쇄유전자 이외에도, 본 발명에 따른 재조합 발현벡터는 숙주세포 내에서 항체 연쇄유전자의 발현을 조절하는 조절서열을 수반한다. 당업자라면, 조절서열의 선택을 포함하는 발현벡터의 설계가 형질전환시킬 숙주세포 및 원하는 단백질의 발현 수준 등의 선택과 같은 인자들에 의존한다는 것을 인식할 수 있을 것이다. 포유동물 숙주세포의 발현을 위한 바람직한 조절서열로서는, 예컨대 레트로바이러스 LTR로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서, 사이토메갈로바이러스(CMV: cytomegalovirus)(예컨대 CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스(SV40: Simian Virus 40)(예컨대 SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스(AdMLP: adenovirus major late promoter), 폴리오마(polyoma) 및 예컨대 천연 면역글로불린 및 액틴 프로모터와 같은 강력한 포유동물 프로모터와 같이, 포유동물 세포 내에서 높은 수준의 단백질 발현을 지향하는 바이러스원이 포함된다. 추가의 바이러스 조절원 및 이것의 서열로서는 미국 특허 제5,168,062호, 미국 특허 제4,510,245호 및 미국 특허 제4,968,615호를 참조하기로 한다. 프로모터 및 벡터의 기재를 포함하여 식물체에서 항체를 발현시키는 방법 및 식물체의 형질전환에 관한 사항은 당해 기술분야에 공지되어 있다(미국 특허 제6,517,529호 참조, 본원에서 참조하였음). 박테리아 세포 또는 예컨대 효모 세포와 같은 진균류 세포 내에서 폴리펩티드를 발현시키는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다.
항체 연쇄유전자 및 조절서열 이외에, 본 발명에 따른 재조합 발현벡터는 예컨대 숙주세포 내에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(즉, 복제원) 및 선택 가능한 마커 유전자와 같은 추가의 서열을 수반할 수 있다. 선택 가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주세포의 선택을 촉진시킨다(예컨대, 미국 특허 제4,399,216호, 미국 특허 제4,634,665호 및 미국 특허 제5,179,017호, 본 발명에서 참조함). 선택 가능한 마커 유전자의 전형적인 예로서, 벡터가 도입된 숙주세포에서 예컨대 G418, 히그로마이신(hygromycin) 또는 메토트렉세이트(methotrexate)와 같은 약제에 대한 내성을 부여하는 유전자가 있다. 바람직한 선택 가능한 마커 유전자로서는 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR: dihydrofolate reductase) 유전자(dhfr-숙주세포 내에서 메토트렉세이트 선택/증폭용으로 사용됨), 네오(neo) 유전자(G418 선택용), 및 글루타메이트 합성효소 유전자가 있다.
비- 하이브리도마 숙주세포 및 재조합 방법에 의한 단백질 생산방법
항-미오스타틴 항체를 코드화하는 핵산 분자 및 이 핵산 분자를 포함하는 벡터를 적당한 포유동물, 식물체, 박테리아 또는 효모 숙주세포의 트랜스펙션을 위해 사용할 수 있다. 형질전환은 숙주세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하는 공지의 방법일 수 있다. 포유동물 세포 내로 이종기원의 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있고, 덱스트란 매개의 트랜스펙션, 인산칼슘 침전법, 폴리브렌(polybrene)-매개의 트랜스펙션, 원형질체(protoplast) 융합, 일렉트로포레이션(electroporation), 리포좀 내 폴리뉴클레오티드의 캡슐화, 및 핵 내로 DNA의 직접 마이크로인젝션 방법이 있다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포 내로 도입될 수 있다. 세포의 형질전환 방법은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다(미국 특허 제4,399,216호, 제4,912,040호, 제4,740,461호 및 제4,959,455호, 본원에서 참조함). 예를 들어 아그로박테리움-매개의 형질전환, 바이올리스틱(biolistic) 형질전환, 직접 주입, 일렉트로포레이션 및 바이러스 형질전환을 포함하는 식물세포의 형질전환 방법은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 박테리아 및 효모 세포의 형질전환 방법은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다.
발현용 숙주로서 사용 가능한 포유동물 세포는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 미국 미생물 보존 센터(ATCC: American Type Culture Collection)로부터 입수 가능한 다수의 불멸화 세포주들이 있다. 이러한 것들로는, 특히 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, NSO 세포, SP2 세포, HEK-293T 세포, NIH-3T3 세포, HeLa 세포, 햄스터 새끼 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, 아프리카초록원숭이 신장 세포(COS), 사람 간장 세포 악성종양세포(hepatocellular carcinoma cell)(예를 들어 Hep G2), A549 세포 및 다수의 기타 세포주들이 있다. 특히 바람직한 세포주들은 어떤 세포주가 고도의 발현 수준을 가지는지 측정하여 선택된다.
포유동물에서 유래되지 않은 다른 세포주들도 사용될 수 있다. 이러한 것으로서는 곤충 세포주(예컨대 Sf9 또는 Sf21 세포), 식물세포[담배, 아라비돕시스(Arabidopsis), 개구리밥, 옥수수, 밀, 감자 등을 포함], 박테리아 세포(E. coli 및 스트렙토마이세스 포함) 및 효모 세포[쉬조삭카로마이세스 폼브(Schizosaccharomyces pombe), 삭카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 포함]가 있다.
항체 유전자를 코드화하는 재조합 발현벡터를 숙주세포 내로 도입할 때, 숙주세포 내에서 항체가 발현될 수 있는 충분한 기간 동안 숙주세포를 배양함으로써, 더욱 바람직하게는 숙주세포가 성장하는 배양 배지 내로 항체를 분비시킴으로써 항체를 생산한다. 항체는 표준 단백질 정제방법을 통해 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
생산 세포주로부터 본 발명에 따른 항체를 발현시키는 방법은 다수의 공지의 기술을 사용하여 증강될 수 있다. 예를 들어, 글루타민 합성유전자 발현시스템(GS 시스템)은 일정한 조건에서 발현을 증강시키기 위한 통상의 접근방법이다. GS 시스템은 전적으로 또는 부분적으로 유럽특허 제0,216,846호, 제0,256,055호, 제0,323,997호 및 제0,338,841호와 관련하여 설명하기로 한다.
상이한 세포주에 의해서 또는 형질전환 동물에서 발현된 항체는 서로 다른 글리코실화 단계를 가지는 것으로 추측된다. 그러나, 본 발명에 따라 제공되는 핵산 분자에 의해 코드화되거나 본 발명에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 항체들은 항체의 글리코실화와 무관하게 본 발명의 일부를 구성한다.
형질전환 동물 및 식물
본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 목적 서열에 대하여 유전자 전이성(transgenic)인 포유동물 또는 식물체의 발생, 및 이로부터 회수 가능한 형태로 항체를 생산하는 과정을 거쳐 형질전환 방법으로 생산할 수도 있다. 포유동물에 있어서 형질전환 생산방법과 관련하여, 항-미오스타틴 항체는 염소, 소 또는 기타의 포유류로부터 제조 및 회수될 수 있다(미국 특허 제5,827,690호, 제5,756,687호, 제5,750,172호 및 제5,741,957호, 본원에서 참고함). 어떤 구현예에 있어서, 사람 면역글로불린 좌를 포함하는 사람 이외의 형질전환 동물을 전술한 방법에 따라 미오스타틴 또는 이것의 면역원성 부분으로 면역화한다. 식물체 내에서 항체를 생산하는 방법은 미국 특허 제6,046,037호 및 제5,959,177호에 개시되었고 본원에서는 이를 참조하였다.
어떤 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체를 코드화하는 1개 이상의 핵산 분자를 표준 형질전환 기술로 동물이나 식물체에 도입시킴으로써 사람 이외의 형질전환 동물 또는 식물체를 생산한다. Hogan의 문헌과 미국 특허 제6,417,429호 참조. 형질전환 동물의 제조에 사용되는 형질전환 세포는 배아 줄기세포, 체세포 또는 수정란일 수 있다. 사람 이외의 형질전환 유기체는 키메라성, 비-키메라성 이형접합체 및 비-키메라성 동형접합체일 수 있다. 문헌[Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo : A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics : A Practical Approach, Oxford University Press (2000); 및 Pinkert, Transgenic Animal Technology : A Laboratory Handbook, Academic Press (1999)] 참조(본원에서 전체를 참조함). 어떤 구현예에 있어서, 사람 이외의 형질전환 동물은 목적 중쇄 및/또는 경쇄를 코드화하는 구조물을 표적화함으로써 목적하는 파괴(disruption) 및 치환을 달성하게 된다. 바람직한 구현예에 있어서, 형질전환 동물은 미오스타틴, 바람직하게는 사람의 미오스타틴과 특이적으로 결합하는 중쇄 및 경쇄를 코드화하는 핵산 분자를 포함 및 발현한다. 어떤 구현예에 있어서, 형질전환 동물은 예컨대 단쇄 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체와 같은 변형 항체를 코드화하는 핵산 분자를 포함한다. 항-미오스타틴 항체는 모든 형질전환 동물 내에서 제조될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 사람 이외의 동물은 마우스, 쥐, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말일 수 있다. 사람 이외의 형질전환 동물은 혈액, 젖, 소변, 타액, 눈물, 점액 및 기타 체액 내에서 상기 코드화된 폴리펩티드를 발현한다.
파지 디스플레이 라이브러리( Phage Display Libraries )
본 발명은 항-미오스타틴 항체 또는 이것의 항원-결합 부위를 생산하기 위한, 다음 단계들로 이루어지는 방법을 제공한다: 사람 항체의 라이브러리를 파지 상에서 합성하는 단계; 미오스타틴 또는 이것의 항체-결합부로 라이브러리를 스크리닝하는 단계; 미오스타틴과 결합하는 파지를 단리시키는 단계; 및 파지로부터 항체를 얻는 단계. 예로서, 파지 디스플레이 기술에 사용하기 위하여 항체 라이브러리를 제조하는 한 가지 방법은, 다음 단계들로 이루어진다: 사람의 면역글로불린 좌를 포함하는 사람 이외의 동물을 미오스타틴 또는 이것의 항원성 부분으로 면역화하여 면역반응을 발생시키는 단계; 면역화 동물로부터 항체-생산 세포를 추출하는 단계; 추출된 세포로부터 본 발명에 따른 항체의 경쇄 및 중쇄를 코드화하는 RNA를 단리하는 단계; RNA를 역전사하여 cDNA를 생산하는 단계; 프라이머를 사용하여 cDNA를 증폭하는 단계; 및 cDNA를 파지 디스플레이 벡터에 삽입하여 항체가 파지에서 발현되도록 하는 단계. 본 발명에 따른 재조합 항-미오스타틴 항체는 이 방법으로 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 항-미오스타틴 항체는 재조합 항체 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 바람직하게는 라이브러리는 B 세포로부터 단리된 mRNA로부터 제조된 사람의 VL 및 VH cDNA를 이용하여 발생된다. 이러한 라이브러리의 제조 및 스크리닝 방법은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생성시키는 키트는 상업적으로 구입할 수 있다[예를 들어 Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, 카탈로그 번호 27-9400-01; 및 Stratagene SurfZAP(상표명) 파지 디스플레이 키트, 카탈로그 번호 240612]. 항체 디스플레이 라이브러리를 생성 및 스크리닝하는 데 사용될 수 있는 다른 방법 및 시약들도 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,223,409호; PCT 공개번호 WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; 문헌들[Fuchs et al., Bio / Technology 9:1370-1372 (1991); Hay et al., Hum . Antibod. Hyhridomas 3:81-85 (1992); Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993); Hawkins et al., J. MoI . Biol . 226:889-896 (1992); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Gram et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 89:3576-3580 (1992); Garrad et al., Bio / Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nuc . Acid Res . 19:4133-4137 (1991); 및 Barbas et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:7978-7982 (1991)] 참조.
일구현예에 있어서, 원하는 특성을 가지는 사람 항-미오스타틴 항체를 단리 및 제조하기 위하여, 본원에 설명된 사람 항-미오스타틴 항체를 최초로 사용하여, PCT 공개번호 WO 93/06213호에 개시된 에피토프 임프린팅 방법으로 미오스타틴에 대한 유사한 결합 활성을 가지는 중쇄 및 경쇄 서열을 선택한다. 본 발명에 따른 방법에 사용되는 항체 라이브러리는 PCT 공개번호 WO 92/01047호, 문헌들[McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); 및 Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 개시된 바에 따라 제조 및 스크리닝된 scFv 라이브러리가 바람직하다. scFv 항체 라이브러리는 사람 미오스타틴을 항원으로 사용하여 스크리닝하는 것이 바람직하다.
일단 초기의 사람 VL 및 VH 도메인이 선택되면, "믹스 앤 매치(mix and match)" 실험을 수행하는데, 초기에 선택된 사람 VL 및 VH 단편들의 상이한 쌍을 미오스타틴 결합에 대하여 스크리닝하여 바람직한 VL/VH 쌍 조합을 선택한다. 추가로, 항체의 질을 더욱 개선하기 위하여, 바람직한 VL/VH 쌍의 VL 및 VH 단편을, 바람직하게는 VH 및/또는 VL의 CDR3 영역 내에서 천연 면역반응 동안에 항체의 친화도 성숙을 담당하는 생체 내 체세포 변이과정과 유사한 공정으로 임의로 변이시킨다. 이러한 생체 외 친화도 변이는 VH CDR3 또는 VL CDR3에 대하여 각각 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 VH 및 VL 도메인을 증폭시킴으로써 달성될 수 있다. 이렇게 임의로 변이 유발된 VH 및 VL 단편들은 미오스타틴에 대한 결합을 위해 재-스크리닝할 수 있다.
재조합 면역글로불린 디스플레이 라이브러리로부터 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체의 스크리닝 및 단리에 이어서, 선택된 항체를 코드화하는 핵산을 디스플레이 패키지로부터(즉, 파지 게놈으로부터) 회수하고, 표준 DNA 재조합 기술에 의해서 다른 발현벡터 내로 서브클로닝할 수 있다. 원하는 바에 따라, 후술하는 바와 같이 본 발명에 따른 다른 항체 형태를 생성하도록 핵산을 더 조작할 수도 있다. 조합 라이브러리의 스크리닝에 의해서 단리된 재조합 사람 항체를 발현시키기 위해서, 항체를 코드화하는 DNA를 재조합 발현벡터 내로 클로닝하고, 상기와 같이 포유동물 숙주 내로 도입한다.
클래스 스위칭( Class switching )
본 발명의 다른 태양에 따르면, 본 발명은 항-미오스타틴 항체의 클래스 및 서브클래스를 다른 클래스 또는 서브클래스로 변환시키는 방법을 제공한다. 어떤 구현예에 있어서, CL 또는 CH를 코드화하는 서열을 포함하지 않는 VL 또는 VH를 코드화하는 핵산 분자를 당해 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 단리한다. 그 다음으로, 핵산 분자를, 원하는 면역글로불린 클래스 또는 서브클래스로부터 CL 또는 CH를 코드화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결한다. 이것은 전술한 대로, CL 또는 CH 사슬을 포함하는 벡터나 핵산 분자를 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 원래는 IgM이었던 항-미오스타틴 항체는 IgG로 클래스를 바꾸게 된다. 또한, 이러한 클래스 스위칭을 이용하면, 1개의 IgG 서브클래스를 다른 서브클래스로, 예를 들어, IgGI에서 lgG2로 바꿀 수 있다. 원하는 아이소타입(isotype)을 포함하는 본 발명에 따른 항체를 생산하는 다른 방법은 다음 단계들로 이루어진다: 항-미오스타틴 항체의 중쇄를 코드화하는 핵산 및 항-미오스타틴 항체의 경쇄를 코드화하는 핵산을 단리하는 단계; VH 영역을 코드화하는 서열을 단리하는 단계; 원하는 아이소타입의 중쇄 불변 도메인을 코드화하는 서열에 상기 VH 서열을 연결하는 단계; 세포 내에서 경쇄 유전자 및 중쇄 구조물을 발현시키는 단계; 및 원하는 아이소타입을 가지는 항-미오스타틴을 수집하는 단계.
탈면역화 ( deimmunized ) 항체
본 발명에 따른 다른 구현예에 있어서, 항체는 PCT 공개번호 WO 98/52976호 및 WO 00/34317호(본 발명에서 참조함)에 개시된 기술을 사용하여 탈면역화함으로써 면역원성을 감소시킬 수 있다.
변이 항체
다른 구현예에 있어서, 핵산 분자, 벡터 및 숙주세포를 사용하여 변이된 항-미오스타틴 항체를 생산할 수 있다. 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인에서 변이되어, 예컨대 항체의 결합특성을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 변이는 1개 이상의 CDR 영역에서 생성되어 항-미오스타틴 항체의 KD를 증가 또는 감소시키거나, Koff를 증가 또는 감소시키거나, 항체의 결합특이성을 변화시킬 수 있다. 부위-지정 변이발생에 있어서의 기술은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다[Sambrook et al. and Ausubel et al., supra]. 다른 구현예에 있어서, 단일클론 항체 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 또는 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V에 있어서의 배아에 비해 변화된 것으로 공지된 아미노산 잔기에서 1개 이상의 변이가 생성된다. 변이는 가변 도메인의 CDR 영역이나 프레임워크 영역에서 또는 불변 도메인에서 생겨날 수 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 변이는 가변 도메인에서 만들어진다. 어떤 구현예에 있어서는, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 또는 87로부터 선택된 아미노산 서열을 가지거나 그 핵산 서열이 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 또는 88인 가변 도메인의 CDR 영역 또는 프레임워크 영역 내의 배아에 비해 변화된 것으로 알려진 아미노산 서열 잔기에서 1개 이상의 변이가 만들어진다.
다른 구현예에 있어서, 프레임워크 영역은 결과적으로 프레임워크 영역(들)이 대응되는 배아 유전자의 아미노산 서열을 가지도록 변이된다. 변이는 프레임워크 영역이나 불변 도메인에서 만들어져서 항-미오스타틴 항체의 반감기를 증가시킬 수 있게 된다(PCT 공개번호 WO 00/09560호 참조). 또한, 프레임워크 영역이나 불변 도메인 내에서 변이가 만들어지면 항체의 면역원성을 변화시킬 수 있게 되거나, 다른 분자에 대한 공유결합 또는 비공유결합을 위한 부위가 제공되거나, 예컨대 보완적 고정, FcR 결합, 및 항체-의존적 세포-매개의 세포독성(ADCC: antibody-dependent cell-mediated cytoxicity)과 같은 특성들을 변화시킨다. 본 발명에 따르면, 단일 항체는 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역들 중 어느 하나에서 또는 불변 도메인 내에서 변이를 가진다.
어떤 구현예에 있어서는, 변이 이전의 항-미오스타틴 항체에 비해, 변이된 항-미오스타틴 항체의 VH 또는 VL 도메인 중 어느 하나에는 아미노산 변이가 1개 내지 8개가 있게 된다. 상기의 어느 것이라도, 변이는 1개 이상의 CDR 영역 내에서 발생한다. 또한, 어떠한 변이라도 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 어떤 구현예에 있어서는, 불변 도메인 내에 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이내의 아미노산 변화가 있다.
변성 항체
다른 구현예에 있어서는, 다른 폴리펩티드에 결합된 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체의 전부 또는 일부를 포함하는 융합항체 또는 면역접합체(immunoadhesin)가 제조될 수 있다. 바람직한 구현예에 있어서는, 항-미오스타틴 항체의 가변 도메인만이 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 항-미오스타틴 항체의 VH 도메인은 제1 폴리펩티드에 결합하지만, 항-미오스타틴 항체의 VL 도메인은 제2 폴리펩티드에 결합하고, 제2 폴리펩티드는 VH 및 VL 도메인이 서로 상호작용하여 항원결합 부위를 형성하는 방식으로 제1 폴리펩티드에 연합된다.
다른 바람직한 구현예에 있어서, VH 도메인은 VH 및 VL 도메인이 서로 상호작용을 할 수 있도록 링커에 의해서 VL 도메인과 이격되어 있다(하기의 단쇄 항체 참조). 이어, VH-링커-VL 항체는 목적하는 폴리펩티드와 결합한다. 또한, 융합 항체가 생성되어 2개(이상)의 단쇄 항체가 서로 결합될 수 있다. 이는 하나의 폴리펩티드 사슬 상에 2가 또는 다가의 항체를 생성하고자 할 때, 또는 2방향 특이적(bispecific) 항체를 생성하고자 할 때 유용하다.
단쇄 항체를 생성하기 위해, (scFv) VH- 및 VL-코드화 DNA 단편들을, 탄성 링커(flexible linker)를 코드화하는, 즉 아미노산 서열 (GIy4 -Ser)3(서열 번호 122)을 코드화하는 다른 단편들에 작동 가능하게 연결하여, VH 및 VL 서열을 근접 단쇄 단백질로서 발현시키고 VL 및 VH 도메인들을 상기 탄성 링커로 결합시킨다[Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc . Natl . Acad . Sci.USA 85:5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)]. 단일사슬 항체는, 단 1개의 VH 및 VL만을 사용하는 경우에는 1가이고, 2개의 VH 및 VL를 사용하는 경우에는 2가이고, 2개 이상의 VH 및 VL를 사용하는 경우에는 다가이다. 미오스타틴 및 다른 분자와 특이적으로 결합하는 2방향-특이적(bispecific) 또는 다가 항체들을 생성할 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 핵산 분자를 코드화하는 항-미오스타틴 항체를 사용하여 다른 변성 항체들을 제조할 수 있다. 예를 들어, "카파 바디(Kappa bodies)"[III et al., Protein Eng . 10: 949-57 (1997)], "미니바디(Minibodies)"[Martin et al., EMBO J. 13: 5303-9 (1994)), "다이어바디(Diabodies)"[Holliger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 6444-6448 (1993)], 또는 "야누신(Janusins)"[Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) 및 Traunecker et al., Int . J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)]은 본 명세서에 개시된 바에 따라 표준 분자생물학 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
하이브리도마의 융합 또는 Fab 단편의 결합을 포함하는 다양한 방법들에 의해서, 2방향-특이적(bispecific) 항체 또는 항원-결합 단편들을 제조할 수 있다[Songsivilai & Lachmann, Clin . Exp . Immunol . 79: 315-321 (1990), Kostelny et al., J. Immunol . 148:1547-1553 (1992)]. 또한, 2방향-특이적 항체들은 "다이어바디(diabodies)" 또는 "야누신(Janusins)"으로서 형성될 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 2방향-특이적 항체는 미오스타틴의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 어떤 구현예에 있어서, 2방향-특이적 항체는 단일클론 항체 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 또는 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V로부터의 제1 중쇄 및 제1 경쇄, 그리고 추가의 항체 중쇄 및 경쇄를 가진다. 어떤 구현예에 있어서, 추가의 경쇄 및 중쇄는 또한 상기 단일클론 항체들 중 하나로부터 유래할 수 있지만, 제1 중쇄 및 경쇄와는 다르다.
어떤 구현예에 있어서, 전술한 변성 항체는 본원에 제공된 사람 단일클론 항체로부터 유래된 1개 이상의 가변 도메인 또는 CDR 영역을 이용하여 제조될 수 있다.
유도 및 표지화된 항체
본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체 또는 항원-결합부는 유도되거나 또는 다른 분자(예컨대 다른 펩티드 또는 단백질)에 연결될 수 있다. 일반적으로, 항체 또는 이것의 일부분은 미오스타틴 결합이 유도(derivatization) 또는 표지화에 의해 악영향을 받지 않도록 유도된다(derivatized). 따라서, 본 발명에 따른 항체 및 항체부는 본원에 개시된 원래 형태와 변성된 형태의 사람 항-미오스타틴 항체를 모두 포함한다. 예를 들면, 본 발명에 따른 항체 및 항체 부분은, 상기 항체 및 항체 부분이 다른 분자[예컨대 스트렙트아비딘(streptavidin) 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그]와 결합하는 것을 중개할 수 있는 예컨대 다른 항체(예를 들어 2방향-특이적 항체 또는 다이어바디), 검출제, 제약용 작용제 및/또는 단백질 또는 펩티드와 같은 1종 이상의 다른 분자종에 기능적으로 결합(화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유결합 등에 의해서)할 수 있다.
한 가지 타입의 유도된 항체는 2개 이상의 항체를 교차결합(동일 유형의 또는 다른 유형의, 예를 들어 2방향-특이적 항체를 생성하는 것)하여 제조된다. 적당한 교차결합제로서는, 2개의 따로 떨어진 반응성 기를 가지고 적당한 스페이서(예컨대 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르)에 의해 격리된 이형 2관능성(heterobifunctional)인 것이거나, 동형 2관능성(homobifunctional)(예컨대 디숙신이미딜 수베레이트)인 것일 수 있다. 이러한 링커는 피어스 케미컬사(Pierce Chemical Company, 일리노이주 락포드 소재)로부터 구입할 수 있다.
다른 타입의 유도 항체는 표지화 항체이다. 본 발명에 따른 항체 및 항원-결합부가 유도된 유용한 검출작용제로서는 예컨대 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌술포닐 클로라이드, 피코에리트린(phycoerythrin), 란탄 화합물, 인 등과 같은 형광성 화합물이 있다. 항체는 또한, 예컨대 양고추냉이 과산화효소, β-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리 포스파타제, 당산화효소 등과 같이 검출에 유용한 효소로 표지화할 수 있다. 항체를 검출 가능한 효소로 표지화할 때, 항체는 효소를 사용하여 분별될 수 있는 반응 산물을 생산하는 추가의 시약을 첨가함으로써 검출된다. 예를 들어, 양고추냉이 과산화효소가 존재하는 경우, 과산화수소와 디아미노벤제니딘의 첨가는 검출 가능한 착색반응 산물을 초래한다. 항체는 비오틴으로 표지화할 수도 있고, 아비딘 또는 스트렙트아비딘 결합을 간접 측정하여 검출할 수도 있다. 항체는 2차 리포터(예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체용 결합부위, 금속결합 도메인, 에피토프 태그)로 인식 가능한 예정된 폴리펩티드 에피토프를 사용하여 표지화할 수도 있다. 어떤 구현예에 있어서, 표지물질은 다양한 길이의 스페이서 아암에 의해 부착되어 잠재적인 입체적 장애가 감소되도록 할 수 있다.
예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메틸기 또는 에틸기 또는 탄수화물 기와 같은 화학적 기를 가지는 항-미오스타틴 항체가 유도될 수도 있다. 이러한 기들은 항체의 생물학적 특성을 개선하는 데, 즉 혈청 반감기를 증가시키는 데 유용하다.
약제학적 조성물 및 키트
본 발명은 또한 억제 특성을 가지는 사람의 항-미오스타틴 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 길항제 항-미오스타틴 항체는 골격근 중량 및/또는 골 질량을 증가시키는 것이 요구되는 광범위한 증상 및 질환을 예방 또는 치료하는 데 유용하다. 어떤 구현예에 있어서, 그러한 상태와 질환은 연령에 관련되기도 하고 질병에 관련되기도 한다. 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체 길항제를 사용하여, 예컨대 고정화(immobilization)로부터 초래되는 근위축증을 포함한 근육의 중량 및 강도의 연령-관련 손실을 치료, 예방 또는 억제할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체 길항제는 근육 중량의 상실과 연관된 소모성 질병 또는 기타 질병이나 증상에서 근육의 상실을 치료 또는 예방하는데 유용하고, 이러한 질병으로는 다음과 같은 것들이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다: 외상(근육, 신경 및 골 외상을 포함), 화상, AIDS, 암, 엉덩이 골절(특히 성인에 있어서), 관절 교체, 급성 무릎손상, 관절염, 만성 신부전증(CRF: chronic renal failure), 울혈성 심장기능상실(CHF: congestive heart failure), 만성폐쇄폐병(COPD: chronic obstructive plumonary disease), 다발경화증(MS: multiple sclerosis), 파킨슨병, 만성 중증, 중추신경계(CNS) 손상, 뇌졸증, 종말증(cachexia), 근육 영양장애 증후군, 수술 및 관절 손상.
본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체는 또한 대사 병상의 치료에도 유용하다. 이러한 병상으로는, 타입2 당뇨병, 예컨대 증후군 X와 같은 대사증후군, 인슐린 내성, 손상된 글루코스 내성 및 비만증이 있다.
또한, 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체는 골 손실과 관련된 질환의 치료 및 예방에 유용하며, 연령- 또는 호르몬-관련 골다공증, 골감소증, 골관절염 및 골다공증-관련 골절을 포함하지만 이에 국한되는 것은 아니다.
치료는 본 발명에 따른 1종 이상의 항-미오스타틴 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 억제성 항-미오스타틴 항체 및 이것을 포함하는 조성물은 1종 이상의 다른 치료제, 진단제 또는 예방제와 조합하여 사용될 수 있다. 추가의 치료제로서는 항-근육퇴행위축제(프렌디손, 데플라자코트 등의 스테로이드 포함), 및 동화(anabolic) 스테로이드, 알부테롤(albuterol), 예컨대 크레아틴(creatine)과 같은 영양 보충제, 및 예컨대 젠타마이신과 같은 항생제가 있다. 추가의 치료제로서는 또한 항-당뇨병 작용제로서 메트포르민(metformin), 설포닐우레아, 인슐린, 프람린티드[pramlintide, SYMLIN(상표명)], 예컨대 로시글리타존[Avandia(상표명)] 및 피오글리타존[pioglitazone, Actos(상표명))과 같은 TZD, 예컨대 엑세니티드(exenitide)와 같은 GLP-1 유사체, 및 예컨대 LAF237와 같은 DPP-IV 억제제가 있으나 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 추가의 치료제로서는 골다공증 방지제, 예컨대 비스포스포네이트, 알렌드로네이트[alendronate, Fosamax(상표명)] 및 리세드로네이트[risedronate, Actonel(상표명)], 칼시토닌[calcitonin, Miacalcin(상표명)], 랄록시펜[Evista(상표명)], 예컨대 에스트로겐 및 파라티로이드과 같은 호르몬제. 이러한 추가의 작용제는 동일 조성물에 포함시킬 수도 있고 별도로 투여될 수도 있다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 혼용 가능한 모든 용매, 분산매질, 코팅재, 항균 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 의미한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 물, 식염, 인산 완충 식염, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 그리고 이것들의 조합 등이 있다. 많은 경우에, 조성물 내에 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알코올 예를 들어 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 약제학적으로 허용되는 물질의 추가적 예로서는 습윤제 또는 예컨대 습윤 또는 유화제, 방부제 또는 완충제와 같은 소량의 보조물질이 있으며, 이들은 항체의 유효기간 및 효과를 증진시키는 작용을 한다.
본 발명에 따른 조성물은 다양한 형태, 예를 들면 액체 용액(예컨대 주사용 및 주입용), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환약, 분말, 리포좀 및 좌약과 같이 액체, 반고체 및 고체 투여 형태일 수 있다. 바람직한 형태는 의도된 투여 형태 및 치료 용도에 따라 달라진다. 전형적으로 바람직한 조성물은 예컨대 사람의 수동 면역용으로 사용되는 것과 유사한 조성물과 같은 주사용 또는 주입용 용액이다. 바람직한 투여 형태는 비경구적 투여 방식이다(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내, 근육 내). 바람직한 구현예에 있어서, 항체는 정맥 내 주입 또는 주사에 의해서 투여된다. 다른 구현예에 있어서, 항체는 근육 내 주사 또는 피하 주사에 의해서 투여된다.
치료용 조성물은 필히 멸균되어 있어야 하고 제조 및 보관 조건에서 안정해야 한다. 본 발명에 따른 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 기타 높은 약물 농도에 적합한 계층 구조로서 제형화될 수 있다. 멸균 주사용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 그 조합을 함유하는 적절한 용매에 필요량의 항-미오스타틴 항체를 혼입하고, 여과 및 살균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산매질과 전술한 것들로부터의 기타 필요한 성분들을 함유하는 멸균 비히클 내에 활성 화합물을 혼입시켜서 제조할 수 있다. 멸균 주사용액 제조용 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조방법은 활성 성분과, 전술한 멸균-여과 용액으로부터 추가의 원하는 성분들을 혼합하는 진공건조 및 동결건조법이다. 용액의 적당한 유동성은 예를 들어 레시틴(lecithin)과 같은 코팅을 사용하거나, 분산액의 경우에는 원하는 입경을 유지시키거나, 계면활성제를 사용함으로써 유지시킬 수 있다. 주사용 용액의 연장된 흡수는 예를 들어 모노스테아레이트, 염, 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 작용제를 조성물에 포함시킴으로써 달성할 수 있다.
한 가지 구현예에 있어서, 항체는 pH가 5.0 내지 6.5인 멸균 수용액에 약 1 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 항체, 약 1 mM 내지 약 100 mM의 히스티딘 완충액, 약 0.01 mg/ml 내지 약 10 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 약 100 mM 내지 약 400 mM의 트레할로스 및 약 0.01 내지 약 1.0 mM의 디소듐 EDTA 디하이드레이트를 포함된 제형으로서 투여된다.
많은 치료 용도에 대하여 바람직한 투여 경로/형태는 피하, 근육 내 또는 정맥 내 주입이지만, 본 발명에 따른 항체는 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 당업자에게는 자명한 사실이지만, 투여경로 및/또는 형태는 원하는 결과에 따라 다양하게 가변적이다.
어떤 구현예에 있어서, 항체 조성물의 활성 화합물은 예컨대 임플란트, 경피용 패취 및 마이크로캡슐화 전달시스템을 포함하는 방출조절 제형과 같이, 항체를 급속한 방출로부터 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생물학적 혼화성을 가지는 중합체들을 사용할 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 많은 방법들은 특허 등록되었거나 당해 기술분야에 공지되어 있다[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978].
어떤 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체는 예를 들어 비활성 희석제 또는 동화 가능한 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 화합물(및 필요에 따라 기타 성분들)은 경질 또는 연질의 외피를 가지는 젤라틴 캡슐로 캡슐화할 수도 있고, 압축하여 정제화할 수도 있고, 피용자의 음식물에 직접 혼입할 수도 있다. 구강투여 치료용으로, 항-미오스타틴 항체는 보조제와 함께 일체화될 수 있고, 먹을 수 있는 정제, 구강용 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르제, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수도 있다. 다른 비경구적 투여방법으로 본 발명에 따른 화합물을 투여하기 위해서, 화합물을 비활성화를 피할 수 있는 물질로 피복하거나 그와 함께 투여할 수 있다.
추가의 활성 화합물 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체는 1종 이상의 추가적 치료제와 함께 공동 제형화 및/또는 공동 투여할 수 있다. 이러한 작용제는 다른 표적, 항-신생종양제, 항암제, 화학요법제, 미오스타틴을 억제하는 펩티드 유사체, 또는 타입 II 막수용체에 결합하여 미오스타틴에 대한 결합 또는 그의 활성화를 방지하는 항체 또는 기타 분자들에 결합하는 항체를 비-제한적으로 포함한다. 이러한 조합 치료법은 억제성 항-미오스타틴 항체 및 공동 투여제를 보다 적은 투여량만큼 필요로 하기 때문에, 다양한 여러 단일요법을 적용함에 따른 독성 또는 복잡성을 회피할 수 있다.
본 발명에 따른 억제성 항-미오스타틴 항체, 및 이것을 포함하는 조성물은 또한 다른 치료 처방과 조합으로, 구체적으로는 운동 및/또는 식이요법(영양제를 포함)용 보충물과 조합으로 투여될 수도 있다.
어떤 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 억제용 항-미오스타틴 항체는 앞서 논의된 1종 이상의 추가적 치료제와 함께 공동 제형화 및/또는 공동 투여될 수 있다. 또한, 이러한 조합 요법은 전술한 질병 및 병상 중의 어느 것이라도 치료, 예방 또는 억제할 수 있다. 이러한 조합요법은 낮은 투여량의 억제성 항-미오스타틴 항체 및 공동투여제를 요구하므로, 다양한 여러 단일요법을 적용함에 따른 독성 또는 합병증을 회피할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합부를 "치료적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"으로 포함할 수 있다. "치료적 유효량"은 원하는 치료 결과를 달성하는 데 필요한 효과적인 투여량 및 시간을 언급하는 것이다. 항체 또는 항체부의 치료적 유효량은 예컨대 질병 상태, 개체의 연령, 성별 및 중량과 같은 인자들, 그리고 개체 내에서 원하는 반응을 도출하는 항체 또는 항체부의 능력에 따라 다양할 수 있다. 치료적 유효량은 또한, 항체 또는 항체부의 모든 독성 또는 유해 효과가 치료학적 이득효과에 의해 도출되는 양을 지칭한다. "예방학적 유효량"은 원하는 예방 결과를 달성하는 데 필요한 효과적인 투여량 및 시간을 언급하는 것이다. 전형적으로, 예방 목적의 투여는 질병의 병발 전이나 초기에 피용자에게 행해지기 때문에, 예방학적 유효량은 치료적 유효량보다는 적을 수 있다.
투여 형태는 최적의 원하는 반응(예컨대 치료적 또는 예방적 반응)을 제공하도록 조절할 수 있다. 예를 들면, 단일 투여량(a single bolus)을 투여할 수도 있고, 경시적으로 수회에 걸쳐 분할된 투여량을 투여할 수도 있으며, 치료 상태의 위급성에 의해 지시되는 바에 따라 투여량을 점차적으로 줄이거나 늘일 수 있다. 비경구적 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성 측면에서 투여 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 발명에 사용된 투여량 단위 형태는 치료 대상 포유동물용 1회분 투여용으로 적용된 물리적 분할 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체 및 관련된 원하는 치료효과를 거둘 수 있도록 계산된 일정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명에 따른 투여단위 형태의 세부사항은 (a) 항-미오스타틴 항체 또는 이것의 일부의 특성, 및 달성하고자 하는 특정 치료 및 예방 효과; 및 (b) 개체 내 민감성 치료용 항체를 합성해 내는 기술에 있어서의 본질적 제한에 의해 결정되고 이에 직접적으로 의존하게 된다.
본 발명에 따른 항체 또는 항체 부분의 치료적 또는 예방학적 유효량의 예시적인 비-제한적 범위는 0.025 내지 50 mg/kg, 바람직하게는 0.1 내지 50 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 25 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 10 mg/kg, 또는 0.1 내지 3 mg/kg이다. 어떤 구현예에 있어서, 제형은 2O mM 시트르산나트륨, pH 5.5, 140 mM NaCl 및 0.2 mg/ml 폴리소르베이트 80의 완충액 내에 5 mg/ml의 항체를 함유한다. 투여량 수치는 치유를 원하는 병상의 유형 및 심한 정도에 따라 가변적임을 유의해야 한다. 또한, 모든 특정 검체에 대하여, 특이적 투여량 처방은, 개별적인 필요에 따라, 그리고 조성물의 투여를 관리 또는 조정하는 자의 전문적 판단에 따라 경시적으로 조절되어야 하고, 본 명세서에 개시된 투여량 범위는 오로지 예시적인 것일 뿐 본 발명의 사상이나 그에 따른 조성물의 사용을 제한하고자 하는 의도는 아니다.
본 발명에 따른 다른 태양에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체 또는 항원-결합부를 포함하는 키트, 또는 상기 항체 또는 항원-결합부를 포함하는 조성물을 제공한다. 키트에는 항체나 조성물 이외에 진단제 또는 치료제가 포함될 수 있다. 키트는 또한 진단방법이나 치료방법에 사용될 수 있는 지침이 포함될 수도 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 키트에는 항체 또는 이것을 포함하는 조성물, 및 후술되는 방법에 사용될 수 있는 진단제가 포함된다. 다른 바람직한 구현예에 있어서, 키트에는 항체 또는 이것을 포함하는 조성물, 및 후술되는 방법에 사용될 수 있는 치료제가 포함된다.
진단방법
다른 태양에 있어서, 본 발명은 진단방법을 제공한다. 항-미오스타틴 항체는 생체 외에서나 생체 내에서 생물학적 샘플 내의 미오스타틴을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
항-미오스타틴 항체는 ELISA, RIA, 흐름 세포측정(flow cytometry), 조직 면역조직화학, 웨스턴 블롯 또는 면역침전법을 비제한적으로 포함하는 통상의 면역검정법에 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체는 사람으로부터 유래된 미오스타틴을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구현예에 있어서, 항-미오스타틴 항체는 예를 들어 마우스, 초록원숭이(cynomolgus monkeys), 쥐, 개, 메추라기, 닭, 칠면조, 돼지 및 말로부터 유래된 미오스타틴을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 생물학적 샘플 내에서 미오스타틴을 검출하기 위하여, 생물학적 샘플을 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체와 접촉시키는 단계; 및 결합 항체를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 한 가지 구현예에서, 항-미오스타틴 항체는 탈착 가능한 표지물질로 직접 표지화된다. 다른 구현예에 있어서, 항-미오스타틴 항체(제1 항체)는 표지화하지 않고, 제2 항체 또는 항-미오스타틴 항체에 결합할 수 있는 다른 분자가 표지화된다. 당업자에게 인식된 바와 같이, 제2 항체는 특정 종 및 제1 항체의 클래스에 특이적으로 결합할 수 있는 것으로 선택한다. 예를 들어, 항-미오스타틴 항체가 사람의 IgG이면, 제2 항체는 항-사람-IgG일 수 있다. 항체에 결합할 수 있는 다른 분자로서는 비제한적으로 단백질 A 및 단백질 G가 있으며, 이것들은 모두 예컨대 피어스 케미컬사로부터 구입할 수 있다.
항체 또는 2차 항체용으로 적합한 항체에 대해서는 전술한 바 있으며, 다양한 효소, 배합군(prosthetic groups), 형광물질, 발광물질 및 방사성 물질이 포함된다. 적당한 효소의 예로서는 양고추냉이 과산화효소, β-갈락토시다제, 알칼리 포스파타제 또는 아세틸콜린에스테라제가 있고; 적당한 배합군 복합체의 예로서는 스트렙트아비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 있으며; 적당한 형광물질의 예로서는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민(rhodamine), 디클로로트리아지닐아민 플루오레신, 덴실 클로라이드(dansyl chloride) 또는 피코에리트린이 있으며; 적당한 발광물질의 예로서는 루미놀이 있으며; 적당한 방사성 물질의 예로서는 125I, 131I, 35S 또는 3H가 있다.
다른 구현예에 있어서, 미오스타틴은, 검출가능 물질로 표지화된 미오스타틴 표준 및 표지화되지 않은 항-미오스타틴 항체를 사용하는 경합 면역검정법에 의해서 생물학적 샘플 내에서 검정할 수 있다. 이 검정법에 있어서, 생물학적 샘플, 표지화 미오스타틴 표준 및 항-미오스타틴 항체를 혼합한 후, 표지화되지 않은 항-미오스타틴 항체에 결합되는 표지화된 미오스타틴 표준물질의 양을 측정한다. 생물학적 샘플 내의 미오스타틴의 양은 항-미오스타틴 항체에 결합된 표지화된 미오스타틴 표준물질의 양에 반비례한다.
전술한 면역검정법은 여러가지 목적으로 이용될 수 있다. 예를 들어 항-미오스타틴 항체를 사용하여 배양세포 내의 미오스타틴을 검출할 수 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 항-미오스타틴 항체를 사용하여 다양한 화합물로 치료된 세포들에 의해 제조된 미오스타틴의 양을 측정할 수 있다. 이 방법을 이용하여, 미오스타틴 단백질 농도를 조절하는 화합물을 확인할 수 있다. 이 방법에 따르면, 1개의 세포 샘플은 일정 기간 동안 시험용 화합물로 처리하고, 다른 샘플은 처리하지 않은 채로 둔다. 미오스타틴의 총 수준을 측정하기 위하여, 세포들을 융해시키고 전술한 면역검정법중 한 가지를 이용하여 총 미오스타틴 수준을 측정한다. 처리 세포 및 미처리 세포 내의 총 미오스타틴 수준을 비교하여, 시험 화합물의 효과를 측정한다.
총 미오스타틴 수준을 측정하는 바람직한 면역검정법은 흐름 세포계측방법 또는 면역 조직화학이다. 예컨대 ELISA, RIA, 흐름 세포계측방법, 웨스턴 블롯, 면역 조직화학, 완전 막 단백질의 세포표면 표지화 및 면역침전법과 같은 방법들은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, supra] 참조. 또한, 미오스타틴 발현의 활성화 또는 억제를 위한 대량의 화합물을 테스트하기 위해, 면역검정법의 규모를 고성능 스크리닝으로 상향할 수 있다.
본 발명에 따른 항-미오스타틴을 사용하여, 조직 또는 혈청 내의 미오스타틴 수준을 측정할 수도 있다. 어떤 구현예에 있어서, 조직은 죽은 조직이다. 본 발명에 따른 방법의 어떤 구현예에 있어서, 환자로부터 조직을 취하여 생체검사를 실시한다. 본 발명에 따른 방법은, 탈착 가능하게 표지화된 항-미오스타틴 항체 또는 이것을 포함한 조성물을 진단 시험이 필요한 환자에게 투여하는 단계; 및 환자를 영상화 분석하여 미오스타틴-발현 조직의 위치를 결정하는 단계로 이루어진다. 영상화 분석은 의학 분야에 널리 공지되어 있고, 비제한적인 예로서 X-선 분석, 자기공명 영상화(MRI: magnetic resonance imaging) 또는 컴퓨터 단층촬영(CT: computed tomogrpahy)이 포함된다. 항체는, 생체 내 영상화용으로 적합한 모든 작용제, 예컨대 X-선 분석에 사용될 수 있는 바륨과 같은 조영제, 또는 예컨대 MRI나 CT용으로 사용될 수 있는 가돌리 킬레이트로와 같은 자기 조영제로 표지화할 수 있다. 다른 표지화 작용제로서는 비제한적으로 예컨대 99Tc와 같은 방사성 동위원소가 있다. 다른 구현예에 있어서, 항-미오스타틴 항체는 표지화하지 않고, 제2 항체 또는 탈착 가능하고 항-미오스타틴 항체에 결합할 수 있는 다른 분자들을 투여하여 영상화할 수 있다. 실시예에 있어서, 환자로부터 생체검사용 조직을 취하여 목적 조직이 미오스타틴을 발현하는지 측정한다.
치료방법
다른 구현예에 있어서, 본 발명은 항-미오스타틴 항체를 필요한 환자에게 투여하여 미오스타틴 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 개시된 모든 유형의 항체들이 치료적 목적으로 사용될 수 있다. 다양한 구현예에 있어서, 항-미오스타틴 항체는 사람, 키메라 또는 인간화 항체이다. 바람직한 구현예에 있어서, 미오스타틴은 사람 항체이고, 환자는 사람 환자이다. 대안적으로, 환자는 항-미오스타틴 항체가 상호작용하는 미오스타틴을 발현하는 포유동물일 수 있다. 항체는, 항체가 상호작용하는 미오스타틴을 발현하는 사람 이외의 포유동물(즉, 쥐, 마우스 또는 초록원숭이)에 수의과용 목적으로, 또는 사람 질병의 동물 모델로서 투여될 수 있다. 이러한 동물 모델은 본 발명에 따른 항체의 치료 효율을 평가하기 위해 유용하다.
이러한 항체들은 가축(소, 돼지, 양, 말, 돼지, 양, 말, 닭, 칠면조 및 어류) 또는 애완동물(개, 고양이 및 말)의 근육 성장 및 체중 증가를 촉진하고 약점을 방지하는 것을 보완하는 데에 사용될 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 본 발명은 소, 돼지, 양, 말, 돼지, 양, 말, 닭, 칠면조 및 어류, 개, 및 고양이의 근육 성장 및 체중 증가를 촉진하고 약점을 방지하는 것을 보완하는 방법으로서, 상기 피검체에 본 발명의 항체 또는 항원-결합부를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "미오스타틴 활성을 감소시켜서 예방 또는 치료될 수 있는 병상"은, 질병을 앓고 있는 검체 내의 높은 수준의 미오스타틴의 존재가, 질환의 병리생리학 또는 질환의 악화에 기여하는 인자에 대하여 책임이 있는 것으로 밝혀지거나 추측되는 질병 및 기타 질환을 포함하는 의미이다. 이러한 질환들은, 질환을 앓고 있는 검체의 세포 또는 조직 내에서, 예를 들어 조직 및 체액 내의 미오스타틴의 수준, 또는 근육세포 내의 포스포릴화 Smad2 및 3의 수준의 증가에 의해서 입증될 수 있다. 미오스타틴 수준의 증가는 예를 들어 전술한 바와 같이 항-미오스타틴 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
다른 바람직한 구현예에 있어서, 항-미오스타틴 항체는 부적절하게 높은 수준의 미오스타틴을 발현하는 환자에게 투여될 수 있다. 높은 수준의 미오스타틴 발현이 다양한 소모적 병상, 골 상실 및 지방 중량의 축적을 유도할 수 있다는 것은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 한 가지 구현예에 있어서, 상기 방법은, 미오스타틴의 효과를 중화시킴으로써, 골격근의 중량을 증가시키거나 상실을 감소시키거나, 골의 상실을 줄이거나 골 중량을 증가시키고 및/또는 지방 중량을 감소시키는 것이 필요한 질병과 증상을 치료하는 것에 관한 것이다.
다른 바람직한 구현예에 있어서, 항-미오스타틴 항체는, 부적절한(높거나 또는 낮은) 수준의 미오스타틴을 발현하지는 않지만, 항-미오스타틴 치료법을 사용함으로써 그 병상이 성공적으로 치료 또는 예방될 수 있는 환자에게 투여될 수 있다. 일구현예에 있어서, 상기 방법은, 미오스타틴 활성을 억제하여 골격근 중량의 손실을 치료하거나 골격근 중량을 증가시키고 및/또는 골 손실을 치료하거나 골 중량을 증가시키고 및/또는 미오스타틴의 효과를 중화하여 지방의 중량을 치료하는, 질병 및 병상의 치료에 관한 것이다. 이러한 질병과 병상은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 골의 상실 및 지방 축적을 포함하는 다양한 소모적 병상과 관련된 질병 및 병상, 예컨대 연령-관련 퇴행성 질환 및 비-퇴행성의 정상적 연령-관련 병상을 포함한다.
항체는 1회 투여될 수도 있지만, 더욱 바람직하게는 여러 차례 투여될 수 있다. 항체는 매일 3회 내지 매 6개월 이상마다 1회로 투여될 수 있다. 투여는 예컨대 매일 3회, 매일 2회, 매일 1회, 2일에 1회, 3일에 1회, 주 1회, 2주 1회, 월 1회, 2개월에 1회, 3개월에 1회 및 6개월에 1회와 같은 스케줄에 따라 이루어질 수 있다. 항체는 미니 펌프를 통해 계속적으로 투여될 수도 있다. 항체는 경구적, 점액, 구강 내, 비강 내, 흡입식으로, 정맥 내, 피하, 근육 내 또는 비경구적 경로로 투여될 수 있다. 항체는 1회, 또는 2회 이상 적어도 병상이 치료, 완화 또는 치유될 때까지 투여될 수 있다. 항체는 일반적으로 병이 존재하는 한 투여하는 것이 일반적이다. 항체는 전술한 약학 조성물의 일부로서 투여되는 것이 일반적이다. 항체 투여량은 일반적으로 0.1 내지 100 mg/kg, 바람직하게는 0.5 내지 50 mg/kg, 더욱 바람직하게는 1 내지 20 mg/kg, 가장 바람직하게는 1 내지 10 mg/kg의 범위로 투여되는 것이 일반적이다. 항체의 혈청 농도는 당해 기술분야에 공지된 방법으로 측정될 수 있다.
항체를 추가의 치료제와 함께 공동투여하는 것(조합 치료법)은, 항-미오스타틴 항체 및 추가의 치료제를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계, 및 2가지 이상의 별도의 약학 조성물, 즉 항-미오스타틴 항체를 포함하는 제1 제약조성물과, 추가의 치료제를 포함하는 제2 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 공동투여 또는 조합 치료법은 일반적으로, 항체 또는 추가의 치료제를 동시에 하나 더 투여하는 것을 의미하며, 이는 항체 또는 추가의 치료제를 다른 시간대에 투여하는 경우까지를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체는 3일에 한번 투여될 수 있고, 추가의 치료제는 매일 1회 투여될 수도 있다. 대안적으로, 항체는 추가의 치료제와 함께 질병의 치료 전후에, 예컨대 환자가 추가의 약제를 사용한 치료에 실패한 후에 투여될 수 있다. 마찬가지로, 항-미오스타틴 항체는 다른 치료법의 전후에, 예컨대 운동 및/또는 식이요법(영양식 포함) 보충과 같은 다른 치료법의 전후에 투여될 수 있다. 항체 및 1종 이상의 추가적 치료제(조합 치료법)는 1회, 또는 2회 이상 적어도 병상이 치료, 완화 또는 치유될 때까지의 기간동안 투여될 수 있다. 조합요법은 1일 3회 내지 6개월에 1회까지 범위로 투여될 수 있다. 투여는 예컨대 매일 3회, 매일 2회, 매일 1회, 2일에 1회, 3일에 1회, 주 1회, 2주 1회, 월 1회, 2개월에 1회, 3개월에 1회 및 6개월에 1회와 같은 스케줄에 따라 이루어질 수 있다. 항체는 미니 펌프를 통해 계속적으로 투여될 수도 있다. 조합 치료제는 경구적, 점액, 구강 내, 비강 내, 흡입식으로, 정맥 내, 피하, 근육 내 또는 비경구적 경로를 통해 투여될 수 있다.
유전자 치료법
본 발명에 따른 핵산 분자는 유전자 치료법으로 환자에게 투여될 수 있다. 이 치료는 생체 내에서 또는 생체 외에서 시술될 수 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 중쇄 및 경쇄를 모두 코드화하는 핵산 분자를 환자에게 투여한다. 바람직한 구현예에 있어서, 핵산 분자는, B 세포가 항체를 생산하도록 특화되었기 때문에 상기 세포의 염색체 내로 안정하게 통합시키도록 투여된다. 바람직한 구현예에서, B 세포의 전구세포는 생체 외에서 트랜스펙션 또는 감염되어, 필요한 환자에게 다시 이식된다. 다른 구현예에서, B 세포의 전구세포 또는 다른 세포는 생체 내에서 목적 세포 타입을 감염시키는 것으로 알려진 바이러스를 사용하여 생체 내에서 감염된다. 유전자 치료법에 사용되는 전형적인 벡터로는 리포좀, 플라스미드 및 바이러스 벡터가 있다. 바이러스 벡터의 예로서, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-결합 바이러스가 있다. 생체 내 또는 생체 외에서 감염된 후, 치료된 환자로부터 샘플을 취하고 당해 기술분야에 공지되거나 본 명세서에 개시된 어떤 면역검정법을 사용하여 항체 발현 수준을 모니터링할 수 있다.
바람직한 구현예에 있어서, 유전자 치료법은, 항-미오스타틴 항체의 중쇄나 경쇄 또는 항-미오스타틴 항체의 항원-결합부를 코드화하는 단리된 핵산 분자를 투여하는 단계; 및 핵산 분자를 발현시키는 단계로 이루어진다. 다른 구현예에서, 유전자 치료법은 항-미오스타틴 항체의 경쇄 또는 항원-결합부를 코드화하는 단리된 핵산 분자를 투여하는 단계; 및 핵산 분자를 발현시키는 단계로 이루어진다. 바람직한 방법에 있어서, 유전자 치료법은 항-미오스타틴 항체의 중쇄 또는 이것의 항원-결합부를 코드화하는 단리된 핵산 분자, 및 항-미오스타틴 항체의 경쇄 또는 이것의 항원-결합부를 코드화하는 단리된 핵산 분자를 투여하는 단계; 및 핵산 분자를 발현시키는 단계로 이루어진다. 유전자 치료법은 예컨대 전술한 바와 같은 1종 이상의 추가적 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
도 1은 미오스타틴 반응성 리포터 유전자 검정 결과를 도시한 것이다. 도시된 바와 같이, 중화 항-미오스타틴 항체는 A204 세포 내에서 미오스타틴-유도 루시페라제 활성을 억제한다. 사람의 항체 변이체인 1_116_1L-Q45K; 1_257-1L-L21I; 1_314_1H-T92A 및 2_112_1H-I12V, L-F 58I, I85V는 야생형 항체와 같은 정도로 루시페라제 활성을 억제한다.
도 2는 L6 오로라(Aurora) β-락타마제 검정 결과를 도시한다. 도시된 바와 같이, 중화 항-미오스타틴 항체는 L6 래트의 근모세포 내에서 미오스타틴-유도 β-락타마제 활성을 억제한다. 사람의 항체 변이체인 1_116_1L-Q45K; 1_257-1L-L21I; 1_314_1H-T92A 및 2_112_1H-I12V, L-F 58I, I85V는 야생형 항체와 같은 정도로 β-락타마제 활성을 억제한다.
도 3은 웨스턴 블롯 결과를 도시한다. 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 중화 항-미오스타틴 항체는 웨스턴 블롯에 의해 HepG2 세포 내에서 미오스타틴-유도 smad2 포스포릴화 작용을 억제한다.
도 4는 Myf5 mRNA 발현 검정 결과를 도시한다. (a) 중화 항-미오스타틴 항체 1_268_1, 2_177_1 및 2_112_1은 C2C12 마우스 근모세포 내에서 미오스타틴에 의해 억제된 myf5 유전자 발현을 구조하는 반면, 비-중화 항체 1_159_1은 구조하지 못ㅎ하였. Myf5 mRNA 농도는 TaqMan PCR에 의하여 검출하였다. (b) 1_116_1은 투여량-의존적 방식으로 myf5 유전자 발현을 구조하였다.
도 5는 C2C12 근육세포 분화의 검정 결과를 도시한 것이다. (a) 중화 항-미오스타틴 항체 2_43_1, 1_314_1 및 1_257_1은 C2C12 마우스 근육세포 내에서 미오스타틴-차단 근육 분화를 구조하였다. 배아 미오신 중쇄(MHC: myosin heavy chain) 단백질 수준을 마커로 사용하여 C2C12 분화를 측정하였다. (b) 항체 2_112_1, 1_46_1 및 1_116_1은 미오스타틴-차단 C2C12 근육 분화를 구조하였다.
도 6의 (a)는 성숙 GDF8(서열 번호 89)로부터 발생된 펩티드를 사용하여 항-미오스타틴 항체 결합을 테스트하는 것을 설명한다. 소문자로 표시한 아미노산들은 GDF11과 다른 아미노산이고, (b)는 펩티드 결합의 요약이다. 도시된 바와 같이, 어떤 항체들은 어느 펩티드와도 결합하지 않는다. 어떤 펩티드들은 인접하지 않은 펩티드에 결합한다. (C)는 예견된 GDF8 구조로서, 사람의 항-미오스타틴 항체의 펩티드 결합을 설명한다. GDF8 구조는 SWISS-MODEL을 사용하여 생성하였다. SWISS-MODEL은 완전 자동화된 단백질 구조 동질성-모델링 서버로서, ExPASy 웹 서버를 통해 접속할 수도 있고, DeepView 프로그램(Swiss Pdb-Viewer)을 이용할 수도 있다. 본 발명의 항체는 동형 2합체로서 GDF8에 결합한다. 도시된 바와 같이, 사람의 단일클론 항체 2_43_1, 2_112_1 및 2_177_1은 펩티드 1 및 5에 모두 결합한다. 펩티드 1 및 5는 공간적으로 근접하지만 기본 구조에 속하지는 않는다.
도 7은 펩티드 1 내지 11의 아미노산 서열 및 그에 대응하는 서열 번호(103 내지 113)를 도시한다.
도 8은 에피토프 비닝을 도시한다. 본 발명에 따른 사람의 항-미오스타틴 항체의 에피토프 결합은 BIAcoreTM 3000 기기를 사용하는 상호 경합 시험법에 의해 맵핑(mapping)되었다. 항체들은 박스로 표시하였다. 1개의 원 안에 있는 항체들은 겹친 원 안에 있는 항체들과 경합한다. 예컨대, 항체1_46_1은 항체 1_136_3과 경합하지만, 항체 1_46_1은 항체 1_268_1과는 경합하지 않는다. 동일한 원 안에 2개 이상의 항체가 있는 경우, 그들 각각의 결합은 구별되지 않는다.
도 9는 본 발명에 따른 사람의 항-미오스타틴 항체가 성숙한 GDF8 및 성숙한 GDF8/프로펩티드 잠복 복합체를 풀-다운(pull-down)하는 능력을 시험한 면역침전 연구결과를 도시한다. GDF8로 트랜스펙션된 293T 세포를 함유하는 조건화 배지를 사용하였다. 도시된 바와 같이, 항체 2_112_1, 2_43_1 및 2_177_1은 성숙한 GDF8, 성숙한 GDF8/프로펩티드 복합체 및 미처리 GDF8를 풀-다운하였다; 항체 1_66_1은 성숙한 GDF8 및 성숙한 GDF8/프로펩티드 복합체를 풀-다운하였다: 다른 어떠한 항체들도 성숙 GDF8, 프로펩티드 또는 미처리 GDF8를 풀-다운하지 않았다. 레인 4는 1/10 배지를 적하한 대조군이고 레인 7은 배지만으로 이루어진 면역침전 대조군이다.
도 10은 본 발명에 따른 항-미오스타틴 항체가 마우스 혈청으로부터 성숙한 GDF8을 풀-다운하는 능력을 시험한 면역침전 연구결과를 도시한다. 도시된 바와 같이, 항체 2_112_1, 2_43_1 및 2_177_1은 마우스 혈청으로부터 성숙 GDF8를 풀-다운하였으나, 항체 1_116_1 및 1_66_1은 그렇지 않았다.
도 11은 성숙한 사람 GDF8 및 GDF11의 서열이다. 성숙 GDF8(서열 번호 89) 및 GDF11(서열 번호 90)은 약 90%의 동일한 아미노산 서열을 가진다. 성숙 GDF8 및 GDF11은 동형 2합체를 형성한다. 성숙 GDF8 또는 GDF11은 9개의 시스테인을 가지는데, 이것들은 4개의 분자 내 이황화 결합과 1개의 분자 간 이황화 결합을 형성한다. 도시된 바와 같이, 이황화 결합을 형성하는 시스테인 쌍은 동일한 점(. 또는 :)으로 표시하였다. 분자 간 이황화 결합을 형성하는 1개의 시스테인(cys73)은 "별"로 표시하였다. SWISS-MODEL을 사용하여 GDF8 구조를 예상하였다(도 6c 참조).
도 12는 생체 외 검정 결과를 요약한 표이다.
도 13은 유전자의 사용, 에피토프 비닝 및 펩티드 결합을 요약한 표이다.
도 14 및 도 15는 항-미오스타틴 항체로 생체 내 처리한 마우스의 근육에 대 한 효과를 비복근-판타리스-슬뢰우스(GPS: gastrocnemius-pantaris-sloeus), 전경골근(TA: tibialis anterior) 및 사두근(Quads: quadriceps)에 대하여, 비히클과 비교하여 도시한 것이다.
도 16은 항-미오스타틴 항체(2_112_K)로 생체 내 처리한 SCID 마우스의 근육 중량 및 강도에 대한 효과를 도시한 것이다.
도 17은 다양한 투여량의 항-미오스타틴 항체(2_112_K)로 생체 내 처리한 SCID 마우스의 근육 중량 및 강도에 대한 효과를 도시한 것이다.
도 18은 다양한 투여량의 항-미오스타틴 항체(2_112_K)의 투여량 반응 분석(a) 및 농도 반응 분석(b) 및 근육량에 대한 효과를 나타낸 것이다.
도 19는 항체 2_112_1(중쇄 : 서열 번호 77; 경쇄 : 서열 번호 79) 및 2_112_K(중쇄 : 서열 번호 118; 경쇄 : 서열 번호 120)의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 나타낸다.
도 20은 항-미오스타틴 항체(2_112_K)로 코르티손을 생체 내 처리한 마우스에 있어서의 근육 중량(a) 및 지방 중량(b)에 대한 효과를 비복근-판타리스-슬뢰우스(GPS: gastrocnemius-pantaris-sloeus), 전경골근(TA: tibialis anterior) 및 사두근(Quads: quadriceps)에 대하여, 비히클과 비교(20a)하고, 서혜부, 표피 및 복부 지방층 중량과 비교(20b)하여 도시한 것이다.
본 발명의 이해를 돕기 위해, 하기의 실시예를 제공한다. 본 실시예들은 오로지 설명을 목적으로 제공되는 것으로서, 조금이라도 본 발명의 사상과 범위를 제 한하고자 하는 의도가 아니다.
실시예 I
항- 미오스타틴 항체를 제조하는 하이브리도마의 생성
본 발명의 항체를 다음과 같이 제조하고, 선택하고 검정하였다: 8 내지 10주령 XenoMouse(상표명) 마우스를, c-말단 성숙 미오스타틴 (10㎍/dose/mouse) (R&D Systems, Catalog #788-G8) 또는 푸른원숭이의 전체길이 성숙 미오스타틴을 사용하여 복막 내에 또는 발바닥 뒤축에 면역화하였다. 이 투여량을 3 내지 4주에 걸쳐 7회 반복하였다. 융합 4일 전, 마우스에게 PBS내의 미오스타틴을 최종주사하였다. 면역화된 마우스로부터의 비장 및 림프절 림프구를 비-분비성 골육종 P3-X63-Ag8.653 세포주와 함께 융합시키고, 이 융합세포를 전술한 바 [Galfre and Milstein, Methods Enzymol. 73:3-46, 1981]대로 HAT 선택시켰다. 미오스타틴 특이적 사람 lgG2 또는 lgG4 항체를 분비하는 모든 하이브리도마의 패널을 회수하였다.
GDF8 및 GDF11 ELISA 검정 프로토콜:
ELISA 검정법을 사용하여, 미오스타틴 또는 GDF11에 결합하는 항체를 검출하였다. 미오스타틴 또는 GDF11을 5OmM 중탐산나트륨 완충액 내의 4㎍/ml 농도로 하여 96-웰 이뮬론 마이크로타이터 플레이트(Immulon microtiter plate) [NUNC-lmmuno(상표명) 플레이트 MaxiSorp(상표명) 표면, Nalge Nunc International, Cat. No.439454]에 코팅하고 4℃에서 밤새 방치하였다. 플레이트를 세척하고나서, 0.1% Tween-20 및 0.5% 우혈청 알부민을 함유한 인산염 완충액(PBS)으로 블록 킹(blocking)하였다. 블록킹된 ELISA 플레이트에 항체를 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션한 후 Tween-20과 함께 PBS로 세척하였다. 항-사람 IgG-양고추냉이 과산화효소(Pierce Cat. No. 31420)로 결합을 측정한 다음, ABTS (Pierce Cat. No. 37615)를 첨가하였다. 마이크로플레이트 리더에서 405nm로 색도측정을 수행하였다(SpectraMax Plus 384, Molecular Devices를 사용하였다).
11개의 하이브리도마를 후속연구를 위해 선택하고 표시하였다: 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 및 1_268_1. 11개의 하이브리도마를 부다페스트 조약에 따라 2005년 2월 10일자로 미국 미생물 보존 센터[ATCC: American Type Culture Collection, VA 20110-2209, 버지니아주, 마나사스, 유니버시티(University Blvd.,) 10801 소재]에 기탁하였다.
Figure 112007084484414-PCT00001
실시예 II
본 발명에 따라 제조된 항- 미오스타틴 -항체의 서열
본 발명에 따라 생산된 항체의 구조를 분석하기 위해, 항-미오스타틴 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마로부터의 중쇄 및 경쇄 단편을 코드화하는 핵산을 클로닝하였다.
다음 방법으로, 항체 가변영역의 클로닝 및 서열화를 수행하였다: 미오스타틴으로 면역화된 XenoMouse(상표명) 마우스로부터의 약 2 X 105 개 하이브리도마 세포로부터의 유래된 Fast-Track kit [인비트로젠사(Invitrogen)]를 사용하여 폴리(A)+ mRNA를 단리하였다. 랜덤 프라이머를 사용하여 mRNA로부터 cDNA를 합성하였다. 사람 VH 또는 사람 VK 계열 특이적 가변도메인 프라이머; 또는 사람 Cγ2 불변영역, MG-40d [5'-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3'](서열 번호 92) 또는 Cκ 불변영역[hκP2; 상기 문헌(Green et al., 1994)]에 대하여 특이적인 프라이머와 관련된 유니버설 사람 VH 프라이머[MG-30, 5'-CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG-3'](서열 번호 91)를 사용하여 랜덤 프라이머로 처리한 cDNA를 증폭하였다[Marks et al., "Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes." Eur . J. Immunol . 21 :985-991 (1991)].
전술한 프라이머를 사용하여 폴리(A+) RNA로부터 PCR 증폭에 의해 하이브리도마를 제조하는 항-미오스타틴으로부터 사람 중쇄 및 κ 경쇄 전사체를 코드화하는 핵산 분자를 얻었다. TA cloning kit (인비트로젠사)를 사용하여 PCR 생산물을 pCRII (인비트로젠사) 내로 클로닝하고, 프리즘(Prism) 염료-종결(dye-terminator) 서열화 키트[어플라이드 바이오시스템 사(Applied Biosystems Inc)] 및 ABI 377 서 열화 장치(어플라이드 바이오시스템 사)를 사용하여 2개 스트랜드를 모두 서열화하였다. MacVector(상표명) [아실러스사(Accelrys), 캘리포니아주 샌디에고 소재] 및 Geneworks(상표명) [하인드마쉬사(Hindmarsh) 오스트레일리아 소재] 소프트웨어 프로그램을 이용하여, 모든 서열들을 "V 염기 서열화 디렉터"에 정렬함으로써 분석하였다 [Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK).
본 발명에 따라 제조된 항체의 전체-길이가 발현된 핵산 서열을 얻기 위해, 항-미오스타틴 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 중쇄 및 경쇄 코딩역역 전체길이를 코드화하는 핵산을 클로닝하였다. 클로닝 및 서열화는 다음과 같이 수행되었다: RNeasy Mini Kit [쿼아젠사(Qiagen)]를 사용하여 폴리(A)+ mRNA를 단리하고, Advantage RT-for-PCR kit [비디 바이오사어언스사(BD Biosciences)]를 사용하여 올리고(dT) 프라이밍 방법으로, mRNA로부터 cDNA를 합성하였다. IGHG2 또는 IGHG4 [G_3UTR_R, 5'TACGTGCCAAGCATCCTCGC] (서열 번호 93) 또는 IGK [K_3UTR_R, 5' AGGCTGGAACTGAGGAGCAGGTG] (서열 번호 94)의 3'UTR에 있는 영역에 특이적인 비-분해성 프라이머와 접합된 사람 VH 또는 사람 Vκ 유전자 단편들의 5' 미번역 영역(5'UTR)에 하이브리드화되도록 설계된 변성 프라이머를 이용하는 2개의 독립적인 반응에서 올리고(dT) 프라임 cDNA를 증폭하였다. Expand High Fidelity PCR kit [로체사(Roche)] 및 PTC-200 DNA Engine [엠제이 리서치사(MJ Research)]를 사용하여 다음과 같이 사이클링시키면서 증폭을 수행하였다: 94℃에서 2분; 23 x (94℃에서 30초, 52℃에서 50초, 72℃에서 2분); 72℃에서 8분.
경쇄 및 중쇄 연쇄반응을 위해, TOPO-TA 클로닝 키트를 사용하여 2개의 독립적 PCR로부터의 PCR 산물을 pCR2.1 내로 클로닝하고, Grills 16th BDTv3.1/dGTP chemistry (어플라이드 바이오시스템사) 및 373O xI DNA Analyzer (어플라이드 ㅂ바이오시스템사)를 사용하여 2개 클론의 스트랜드 모두를 서열화하였다.
중쇄 및 경쇄 5' 증폭 프라이머:
Figure 112007084484414-PCT00002
항- 미오스타틴 항체 중쇄 및 경쇄의 증폭에 사용된 5' 프라이머:
Figure 112007084484414-PCT00003
유전자 활용 분석
핵산 서열 및 항체의 예견된 아미노산 서열로부터, 각 항체 사슬에 대하여 유전자의 활용을 확인하였다. 표 3은 본 발명에 따른 항체의 선택된 하이브리도마클론의 유전자 활용을 나타낸다.
중쇄 및 경쇄 유전자 단편의 활용
Figure 112007084484414-PCT00004
프레임워크 영역의 항체가 성숙하는 동안에 진행된 변이는 서열 19의 서열 정렬에 설명된 바와 같이 생식계열 서열로 재-변형되었다. 구체적으로, 단일클론 항체 2_112_1(서열 번호 26 및 77)의 잔기 12는 Ile 로부터 VaI으로 변성되었다. 경쇄(서열 번호 28 및 79)에 있어서, 잔기 58은 Phe 로부터 Ile로 변형되었고, 잔기 85는 Ile 로부터 VaI으로 변형되었다. 항체 2_112_1의 경쇄 및 중쇄의 특정 잔기의 변이생성은, 프라이머를 설계하고, 제조사의 지침에 따라 QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit [스트라테이진사 (Stratagene)]를 사용하여 수행되었다. 변이는 자동서열화에 의해 확인되고, 변이생성된 삽입체는 발현벡터에 서브클로닝되었다. 이러한 발현 벡터는 NSO(ECACC # 85110503) 및 HEK-293T 세포(미국 미생물 보존 센터) 내로 트랜스팩트되어, 본 발명에 따른 재조합 항체가 발현된다. 복귀-변이된 프레임워크 영역을 가지는 최종 항체는 항체 2_112_K로 표시된다.
실시예 III
사람 항- 미오스타틴 항체에 의한 미오스타틴 억제(A204 루시페라제 검정)
미오스타틴 반응성 리셉터 유전자 검정법 [문헌 (Thies, et al., Growth Factors, (2001) 18:251-259]을 이용하여, 활성 미오스타틴의 생물학적 활성을 추정하였다. 이 검정법은 루시페라제에 커플링된 리포터 벡터 pGL3(CAGA)15를 사용한다. CAGA 박스 서열(AGCCAGACA)(서열 번호 101)은 TGF-β-유도 유전자, PAI-1의 프로모터 영역에 있는 TGF-β-반응성 원소인 것으로 보고되었다 [Zawel, et al. Mol . Cell, (1998) 1:611-617). 리포터 벡터는 15 개 복사체의 CAGA 박스를 pGL3-프로모터 벡터의 Smal 및 Xhol 부위에 삽입함으로써 생성되었다 (Promega, Cat. No. E1761). 사람의 횡문근육종(rhabdomyosarcoma) 세포주 A204(ATCC Cell No. HTB-82)는 Fugene 6 트랜스펙션 시약[로슈 다이아그노스틱스사(Roche Diagnostics), Cat. No. 1814443]을 사용하여 pGL3(CAGA)15 및 CMV β-GAL으로 일시적으로 트랜스펙션되었다. 트랜스펙션된 세포들을 10% 우태아혈청, 100 U/ml의 스트렙토마이신 및 100μg/ml 페니실린이 보충된 McCoy's 5A 배지 (인비트로젠사, Cat. No. 16600)에서 16시간 동안 배양하였다. 세포들을 기아 배지(스트렙토마이신, 페니실린 및 1 mg/ml 우혈청 알부민을 포함하는 McCoy's 5A 배지)로 바꾼 다음, 미오스타틴, GDF11 또는 액티빈으로 37℃에서 6시간 동안 처리하였다. Dual-light(상표명) 루시페라제 검정시스템 (어플라이드 바이오시스템사, Cat. No. T1004)을 사용하여 루시페라제 활성을 측정하였다. 미오스타틴은 약 8ng/ml의 EC50으로 리포터를 약 10배 활성화시킨다. GDF11은 이와 매우 유사한 반응으로 리포터를 활성화시킨다. 항체의 중화 활성은 A204 세포에 첨가하기 전에 항체를 미오스타틴으로 30분간 예비-인큐베이션하여 측정한다. 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 사람의 항-미오스타틴 항체는 A204 세포 내에서 미오스타틴-자극 루시페라제 활성을 자극한다. GDF11를 사용하는 유사한 실험을 수행하여, 본 발명에 따른 항체의 특이성을 연구하였다. 데이터는 도 1에 요약되어 있다. 대부분의 항체는 GDF11보다 GDF8에 대하여 훨씬 더 역가의 중화활성을 가진다. 단일클론 항체 1_46_1 및 1_132_1는 GDF8와 GDF11를 동일한 역가로 중화시킨다.
실시예 IV
사람 항- 미오스타틴 항체에 의한 미오스타틴의 억제( L6 β- 락타마제 검정)
항-미오스타틴 항체의 존재하에 타입 II 막 수용체에 결합하는 미오스타틴을 측정하는 생체 외 검정방법을 수행하여, 항-미오스타틴 항체가 상기 결합을 억제할 수 있는지, 그리고 억제도는 얼마나 되는지를 측정하였다.
L6 Aurora 수용체 검정방법을 수행하여 생체 외 활성 미오스타틴의 생물학적 활성을 추정하였다. L6 미오스타틴 LD10은 β-락타마제 리포터 유전자를 안정하게 발현시키는 세포주이다. 삽입된 리포터 내의 프로모터 영역은 16개 복사체의 Smad-결합 원소이다 [SBE, GTCTAGAC (서열 번호 102), Zawel et al., Mol. Cell 1: 611-17 (1998)]. 10% 열-비활성화 우태아 혈청(FES), 200-400 ㎍/㎖ Zeocin, 100 U/ml 스트렙토마이신 및 100㎍/ml 페니실린이 보충된 DMEM 고글루코스 (인비트로젠사, Cat. No. 11995) 내에서 세포들을 배양하였다. 제1일에 세포들을 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 제2일 오후에 기아 배지(Zeocin, 스트렙토마이신, 페니실린 및 0.1 % FBS를 포함하는 DMEM)로 바꾸었다. 제3일 아침에, 세포들을 37℃에서 미오스타틴, GDF11 또는 액티빈으로 4시간 동안 처리하였다. Aurora CCF2 로딩 키트를 사용하여, 제조사의 지침(인비트로젠사, Cat. No. K1032)에 따라 β-락타마제 활성을 분석하였다.
미오스타틴은 리포터의 Smad-매개 발현을 약 5ng/ml의 EC50으로 2 내지 3배 활성화시킨다. GDF11 및 액티빈은 이와 매우 유사한 반응으로 리포터를 활성화하였다.
항체의 중화활성은 항체를 L6 미오스타틴 LD10 세포에 첨가하기 전에 미오스타틴과 함께 30분간 예비인큐베이션하여 측정된다. 도 2 및 11에 도시된 바와 같이, 시험된 사람 항-미오스타틴 항체는 모두 Smad 단백질의 활성화를 약 1 내지 약 225 nM 범위 이내로 억제하였다.
실시예 V
미오스타틴 -유도 Smad 2 포스포릴화의 억제
(웨스턴 블롯)
10% 우태아혈청(FBS), 100 U/ml 스트렙토마이신 및 100㎍/ml 페니실린이 보충된 DMEM 고 글루코스 (인비트로젠사, Cat. No. 11995)배지에서, HepG2 사람 간 세포 암종 세포(ATTC Cell No. HB-8065)를 배양하였다. 60 내지 70% 융합성 세포들을 밤새 기아배지 (스트렙토마이신, 페니실린 및 0.5% FBS를 함유한 DMEM)로 옮겨 두었다. 세포들을 미오스타틴으로 30분간 처리하였다. 항체를 HepG2 세포에 첨가하기 전에, 항체를 미오스타틴과 함께 30분간 예비인큐베이션하여 항체의 중화 활성을 측정하였다. 세포를 융해시켜서 웨스턴 블롯을 하였다. 토끼의 항-포스포-Smad2 항체 [셀 시그날링사(Cell Signalling), Cat. No. 3101]를 사용한 다음, 항-토끼 Alex 680 [몰레큘러 프로브사(Molecular Probes), Cat. No. A21076]에 의해 검출함으로써 포스포릴화 Smad2를 검출하였다. 포스포릴화 Smad2의 양은 Odyssey Infrared Imager(Li-Cor)를 사용하여 정량하였다. 글리세르알데히드-3-인산염 탈수소효소(GAPDH)를 사용하여 정상화하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 시험된 사람의 중화 항-미오스타틴 항체는 모두 Smad 2 포스포릴화를 억제하였다.
실시예 Vl
사람 항- 미오스타틴 항체에 의한 mvf5 의 발현증강
10% 우태아혈청(FBS), 100 U/ml 스트렙토마이신 및 100㎍/ml 페니실린이 보충된 DMEM 고 글루코스(인비트로젠사, Cat. No. 11995)배지에서, C2C12 근육모세포(ATCC Cell No. CRL-1772)를 배양하였다. 세포들을 300ng/ml 미오스타틴으로 2시간 처리하였다. 항체를 C2C12 세포에 첨가하기 전에, 항체를 미오스타틴과 함께 30분간 예비인큐베이션하여 항체의 중화 활성을 측정하였다. 세포들을 수확하고, RNeasy miniprep kit[퀴아젠사(Qiagen) Cat. No. 74104]를 사용하여 RNA를 정제하였다. RiboGreen(상표명) RNA Quantitation Kit(몰레큘러 프로브사, Cat. No. R11490)를 사용하여, 정제된 RNA를 정량하였다. 동량의 토탈 RNA를 실시간 PCR 분석하여, myf5 RNA 발현을 검출하였다. 마우스 myf5 RNA 검출을 위한 프라이머/프로브 세트를 Assays-On-Demand(상표명) 유전자 발현 생성물(어플라이드 바이오시스템사, Cat. No. Hs00271574_m1)로부터 입수하였다. 사용된 검정조건은 제조사의 지침에 따랐다. 원-스톱 방식의 RT-PCR을 서열분석 시스템 ABI7900 (어플라이드 바이오시스템사)에서 수행하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 사람의 중화 항-미오스타틴 항체는 myf5의 발현을 증강시켰다. 1개의 중화되지 않은 사람 항-미오스타틴 항체 1_159_1는 myf5의 발현을 증강시키지 않았다.
실시예 VII
사람 항- 미오스타틴 항체에 의한 세포분화의 증강
항체가 근육모세포 분화의 미오스타틴-매개의 억제작용을 억제하는 능력을 C2C12 근육모세포에서 추정하였다. C2C12 세포를 96-웰 플레이트에 200㎕ DMEM/20% FBS/Penn-Strep.으로 25,000 세포/웰로 플레이팅하였다. 24시간 후, 매질을 흡출해내고, 세포들을 HIT 매질(DMEM/2% horse serum/Penn-Strep)로 1회 세척하고, 200㎕ HIT 매질 단독 또는 300 ng/ml GDF-8 [알엔드디 시스템사(R&D Systems)] 단독으로 보충되었거나 300 ng/ml GDF-8(알엔드디 시스템사) 단독 또는 다양한 농도의 항체가 첨가된 매질로 헹구었다. 48시간 후, 매질을 흡출해내고, 세포들을 100 ㎕/ml 의 라이시스 완충액 (25 mM 트리스 pH 7.5, 3 mM EDTA, 1% NP-40, 1% 디옥스콜레이트, 0.1% SDS 및 Roche Complete 프로테아제 억제제의 1 정제/ 라이시스 완충액 25 ml)에서 린스하였다. 융해물 내의 배아 미오신 중쇄(MHC) 수준을 다음의 순서에 따라 측정하였다: High Bind MA6000 플레이트(MSD#P11XB-1 , Meso Scale Discovery, MSD)의 각 웰에 융해물을 5㎕씩 스폿팅하는 단계; 1시간 동안 대기 중에서 건조시키는 단계; 100 ㎕의 Blocker A(MSD#R93BA-2)를 첨가하는 단계; 25℃에서 1시간 동안 진동하면서 인큐베이션하는 단계; PBS/0.05% Tween-20으로 4회 세척하는 단계; 50㎕의 배아 MHC 항체(ATCC #CRL-2039 하이브리도마로부터 조건화된 매질)을 첨가하는 단계; 25℃에서 1시간 동안 진동하면서 인큐베이션하는 단계; PBS/0.05% Tween-20으로 4회 세척하는 단계; 항체 희석제(MSD #R50AA-2) 내에서 1:1000으로 희석된 50㎕의 Sulfo-TAG 항-마우스 IgG (MSD #R32AC)를 첨가하는 단계; 25℃에서 1.5시간 동안 진동하면서 인큐베이션하는 단계; PBS/0.05% Tween-20으로 4회 세척하는 단계; 150㎕의 1X Read Buffer(MSD#R92TC-2)를 첨가하는 단계; 및 Sector Imager 6000 (MSD) 내에서 화학발광성을 분석하는 단계. 도 5에 도시된 바와 같이, 사람의 중화 항-미오스타틴 항체는 MHC 검정에 있어서 미오스타틴-차단된 근육의 분화를 역전시켰다.
실시예 VIII
미오스타틴 펩티드 결합
성숙 GDF8로부터 11개의 펩티드를 생성하여 항체결합을 테스트하고 국소화하였다(도 6 참조). 글루타르알데히드-피복된 ELISA 플레이트 및 피복되지 않은 ELISA 플레이트 [NUNC-lmmuno(상표명) plate MaxiSorp(상표명) surface, 날제 넉크 인터내셔널사(Nalge Nunc International), Cat. No. 439454]상에서 펩티드 ELISA를 수행하였다. 글루타르알데히드-피복된 플레이트는 250㎕ 글루타르알데히드(50% w/v)를 50ml 탈 이온수와 함께 혼합하고 각각의 웰에 200㎕의 용액을 가하여 제조하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 이상 인큐베이션시켰다. 글루타르알데히드를 흔들어서 플레이트로부터 분리시키고, 종이 타올 위에서 거꾸로 흔들어서 사용 전에 모든 액체를 제거하였다.
ELISA 플레이트는 1.0㎍/well/50㎕(중탄산나트륨 완충액, pH 9.6)의 펩티드로 약 4시간 이상 코팅하고 나서, 200㎕의 차단제(1% BSA, 1% Ethanolamine pH 7.4)로 4시간 이상 블로킹하였다. 플레이트를 PBST로 200㎕/well 3회 이상 세척하였다. 50㎕ 항체[PBST 내 1㎕/ml, 0.05% Tween-20을 포함하는 Phosphate-buffered saline (PBS)] 샘플을 1시간 동안 웰에 첨가하였다. 그 후, 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다. PBST 내에 희석된 5O㎕의 항-사람 IgG-양고추냉이 과산화효소(HRP) [피어스사(Pierce), Cat# 31420]를 추가로 1시간 동안 첨가하였다. 웰을 TBST로 다시 3회 다시 세척하고나서, 탈 이온수로 2회 세척하였다. 5O㎕ ABTS(MOSS)를 5 내지 20분간 첨가하고, 색도측정 플레이트 리더로 405nm에서 시그날을 검출하였다. 결합시험 결과를 도 6에 나타내었다. 11개의 펩티드를 도 7에 도시하였다.
실시예 IX
에피토프 맵핑 연구
BIACORE(상표명) 3000 기기 [비아코아 인터내셔널 에이비(Biacore International AB), 웁살라, 스웨덴 및 피스타웨이, 뉴저지주 소재)를 제조사의 지침에 따라 사용하여 상호-경합 실험을 수행하였다.
실험은 25℃의 0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCI, 3 mM EDTA, 0.005% Tween-20 조건의 BIACORE(상표명) 3000 장치 내에서 수행하였다. 표준 아민 커플링 방법을 이용하여 미오스타틴을 CM5 칩[Biacore(상표명)]에 고정시킨 결과 약 1300 RU (혼성단위)가 얻어졌다. 항체 샘플을 50nM로 제조하고 쌍을 이루어 주사하였다. 예를들어, 기준 mAb를 10분 동안 주사하는 즉시 시험용 mAb를 10분 주사하였다. 표면은 재생되었고, 주사를 역순으로 반복하였다. 이 순서를 가능한 모든 항체 쌍에 대하여 반복하였다. 각각의 개별적 항체를 1벌식으로 주사하여 1쌍의 항체에 대하여 얻어진 총 반응의 상호비교를 이용하여, 서로 경합식으로 결합하는 항체, 즉 항원에 대한 결합을 경합하는 항체를 찾아냈다. 1벌식 주사의 어느 하나에서 관찰된 것보다 큰 반응은 다른 에피토프에 대한 결합을 시사하는 것인 반면에, 1벌식 주사에서 관찰된 것들의 중간 정도의 반응은 동일 또는 중첩되거나 인접한 에피토프에 대한 결합을 시사한다. 이러한 실험의 결과는 도 8에 도시하였고, 도 13에 요약하였다.
실시예 X
세포배양 배지로부터 미오스타틴의 면역침전
면역침전 연구를 수행하여, 성숙 GDF8 및 성숙 GDF8/프로펩티드 복합체에 대한 미오스타틴 항체의 결합을 테스트하였다. GDF-8 발현 구조물로 293T 세포를 트랜스펙션하였다. 조건화 배지를 트랜스펙션 7일 후에 수확하였으며, 여기에는 성숙 GDF8 및 잠재성 복합체가 함유되어 있었다. 100㎕ 조건화 배지를 10㎍의 미오스타틴 항체와 함께 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 단백질 A Dynabeads [다이널사(Dinal), 노르웨이 소재]를 첨가하고 4℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. MPC-E 자기장 농축기(다이널사)를 사용하여 면역침전물을 수집하고, PBS로 4회 세척하였다. 면역침전물을 환원용 샘플 완충액에 재현탁하고, 4-12% Bis-Tris NuPage 겔 (인비트로젠사)에 적재하였다. 오딧세이 적외선 영상화 시스템(Li-Cor)을 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 염소의 항-미오스타틴 항체 (알엔드디 시스템사, Cat# AF788)를 사용하여, 성숙 GDF8 및 처리되지 않은 GDF8을 검출하였다. 토끼의 항-프로펩티드 폴리클로날 항체(자체 제조)를 사용하여 펩티드와 미처리 GDF8을 모두 검출하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 항체 2_112_1, 2_43_1, 및 2_177_1는 성숙 GDF8, 성숙 GDF8/프로펩티드 복합체, 및 미처리 GDF8를 면역침전시켰고; 항체 1_66_1은 성숙 GDF8 및 성숙 GDF8/프로펩티드 복합체를 면역침전시켰다. 다른 항체들은 성숙 GDF8, 펩티드 또는 미처리된 GDF8을 전혀 면역침전시키지 않았다. 레인 4는 1/10 매질을 적재한 대조군이고, 레인 7은 매질만을 사용한 면역침전 대조군이다.
실시예 XI
마우스 혈청으로부터의 미오스타틴 면역침전
면역침전 연구를 수행하여, 마우스 혈청으로부터 유래하는 성숙 GDF8에 대한 미오스타틴 항체의 결합을 테스트하였다. 200㎕의 마우스 혈청 [락랜드사(Rockland), Cat ## D208-00]을 20㎍의 미오스타틴 항체와 함께 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 단백질 A Dynalbeads를 첨가하고 4℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. MPC-E 자기장 농축기(다이널사)를 사용하여 면역침전물을 수집하고, PBS로 4회 세척하였다. 면역침전물을 환원샘플 완충액 내에 재현탁하고 4 내지 12% Bis-Tris NuPage gel (인비트로젠사)에 적재하였다. 오딧세이 적외선 영상화 시스템(Li-Cor)을 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 염소의 항-미오스타틴 항체 (알엔드디 시스템사, Cat # BAF788)를 사용하여 성숙 GDF8을 검출하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 항체 2_112_1, 2_43_1, 및 2_177_1는 마우스 혈청으로부터의 성숙 GDF8을 면역침전시켰고, 항체 1_116_1 및 1_66_1은 면역침전시키지 못했다. 혈청 내 성숙 GDF8는 프로펩티드, FLRG 및 GASAP1과 같은 많은 억제성 단백질에 결합한다는 것이 밝혀졌다 [Hill et al. (2002) The myostatin propeptide and the follistatin-related gene are inhibitory binding proteins of myostatin in normal serum. J. Biol. Chem. 277: 40735-40741. Hill et al. (2003) Regulation of myostatin in vivo by growth and differentiation factor-associated serum protein-1: a novel protein with protease inhibitor and follistatin domains. MoI. Endocrin. 17(6): 1144-1154]. 본 실험은 항체 2_112_1, 2_43_1 및 2_177_1이 진정한 비-경합성 중화 항체임을 시사한다. 즉, 항체는 미오스타틴을 중화하지만, 혈청 내에 존재하는 억제성 결합 단백질의 결합을 차단하지는 않는다. 이러한 비-경합성 중화항체는 생체 내에 유용할 것이다.
실시예 XII
생체 내 항- 미오스타틴 항체의 비교
5주령 KKAy/ 마우스 [잭슨 실험실(The Jackson Laboratory), 매인주 밥하버 소재)를 10 mg/kg의 모노클로날 항체 2_43_1, 2_177_1 및 2_112_K 또는 5주간 주 1회로 피하에 제공되는 비히클(PBS)로 처리하였다. 연구 종료시에, 동물을 안락사시키고 장딴지근(gastrocnemius)-장딴지빗근(plantaris)-가자미근(soleus) (GPS), 앞 경골근(bialis anterior, TA) 및 사두근(quadriceps, Quads) 근육 그룹을 절제하여 계량하였다. 2_112_k 항체로 처리한 결과, 절대근육 중량이 현저히 증가하였다 [(p<0.05), GPS(+15.5%) 및 Quads(+30.6%)]. 2_177_1 항체의 경우에는 Quads(+11.5%)만이 현저히 증가하였다. TA는 항체 2_112_K로 처리함에 따라 증가하였으나(+16.8%), 증가가 통계적으로는 현저하지 않았다 (p=0.330). 체중은 5주간에 걸쳐 증가하였으나, 연구진행 중에 처리군들간의 현저한 차이가 없었다. 근육 중량을 체중에 대하여 보정하였을 때(근육중량 지수), 2_112_K 처리군에 대해서만 차이가 현저하다(+11.4% GPS; +20.6% Quads). 실험결과는 도 14 및 15에 도시되었다.
실시예 XIII
생체 내 약리학 및 항체의 효율
마우스에서 항체 2_112_K의 생체 내 약리학 및 항체의 효율을 평가하였다. 마우스의 항-인간 항체(MAHA) 반응에 기인한 잠재적 면역조절작용을 피하기 위해, 면역-결핍 Severe Combined lmmunodecifient(SCID) 베이지 마우스 내에서의 생체 내 연구를 수행하였다. 상기 마우스에 항체 2_112_K를 10mg/kg/주 s.c.로 5주간 피하주사하면, 골격근 중량이 19 내지 25% 이상, 근육 강도가 약 15% 상승한다. 이 치료를 10주까지 연장해서 치료하는 경우, 근육 강도는 21%까지 더 증가하지만 근육 중량은 더 이상 증가하지 않는다 (18 내지 27%). 또한, 50 mg/kg/주 s.c.의 양으로 10주간 투여하는 것이 10 mg/kg/주의 투여량에 비해 근육의 중량이나 강도의 면에서 더 월등한 증가를 나타내지 않는다. 이러한 실험결과를 표 16에 도시하였다.
실시예 XIV
투여량 및 농도 반응 효과
SCID 마우스에 비 효능 투여량으로부터 최대 추정 투여량(0.01, 0.1, 1 및 10 mg/kg/주)에 걸쳐서 피하투여 하였을 때, 항체 2_112_K는 5주 후에, 각각 0%, 3%, 7% 및 28%의 골격근 중량의 투여량 의존적 증가를 나타낸다(도 17). 치료기간을 10주까지 연장시킨 경우에는 근육 중량에는 아무런 증가가 초래되지 않았으나, 경골근(tibialis muscle)의 강도가 추가로 약 5% 증가하는 경향을 볼 수 있었다. 또한, 0.01, 0.1, 1.0 및 10 mg/kg/주양으로 5주간 투여되었을 때, 항체는 상기 마우스의 체지방 조성물을 PBS 대조군에 비해 +10%, +1%, -10%, -22% 만큼 투여량-의존적으로 변화시켰다.
얻어진 투여량-반응 및 농도-반응 데이터의 비-선형, 4-파라미터 분석에서, 각각 ED50 및 EC50 추정값이 3.6 mg/kg/주 및 20.4 mg/mL(-136 nM)인 것으로 추정되었는 바, 이로부터 10 mg/kg/주 투여량으로 달성된 근육중량의 증가가 최대 효율을 달성하는 것으로 나타났다. 항체 2_112_K의 투여량 및 혈청 농도간의 관계 대 근육중량의 변화는 도 18에 도시되어 있다.
실시예 XV
근육 소모의 감쇠를 위한 항체의 효율
10주령 KK 마우스 (잭슨 실험실)를 임의의 3개 그룹으로 분류하였다: 위약/비히클, 코르티손/비히클, 및 코르티손/항체 2_112_K. 마우스에 비히클(PBS) 또는 10 mg/kg의 항체 2_112_K를 5주간 피하주입한 다음, 위약 또는 코르티손 펠릿을 이식하였다. 5일 후, 마우스를 안락사시키고, 근육 중량 및 지방층 중량을 추정하였다. 근육의 중량을 추정하기 위해서, 장딴지근(gastrocnemius)-장딴지빗근(plantaris)-가자미근(soleus)(GPS), 앞 경골근(bialis anterior, TA) 및 사두근(quadriceps, Quads) 근육 그룹을 절제하여 계량하였다. 코르티손 임플란트는 근육 중량의 현저한 감소(p<0.05)를 나타내는 바, 근육중량이 위약/비히클 수준의 85.1 ± 2.2%까지(GPS), 85.5 ± 3.9%까지(TA) 그리고 84.1 ± 3.7%까지 (quads)로 나타났다. 항체 2_112_K로 처리하였을 때, 코르티손-유발 소모증은 위약/비히클 수준에 비해 전체적으로 개선되었다 [GPS (102.0 ± 2.2%), TA (99.5 ± 3.6) 및 Quads (104.6 ± 2.8%)]. 수치는 체중 g당으로 정상화하였을 때 유사하다. 이러한 효과가 근육의 중량에 특이적인 것인지 테스트하기 위해, 지방층 중량을 측정하였다. 지방층의 중량을 정량하기 위해 서혜부, 표피 및 복부 지방층를 절제하고 계량하였다. 항체 2_112-K를 사용하여 처리하면 제공된 코르티손 임플란트에 기인한 지방층 중량의 손실을 현저하게 유도하지 않는다 (p<0.05); 서해부 (코르티손/비히클(75.1 ± 4.7%) 및 코르티손/2_112_K, (82.3 ± 5.3%)), 표피 (코르티손/비히클(79.3 ± 5.0%) 및 코르티손/2_112_K (87.1 ± 3.9%)), 또는 복부 지방층 (코르티손/비히클 (79.5 ± 5.5%) 및 코르티손/2_112_K (82.2 ± 4.2%)). 수치는 위약/비히클 지방층에 상대적으로 표현하였다. 이 실험의 결과는 도 20a 및 20b에 도시하였다.
실시예 XVI
미오스타틴 항체의 단백질 A 정제
1 내지 2ℓ의 농축(10배) HEK293 매질을 여과하고(2㎛) 평형을 이룬 단백질A 컬럼 [아메르삼 바이오사이언스사(Amersham Biosciences), 뉴저지주 피스카웨이 소재, 53 mL, 5컬럼 부피의 D-PBS로 평형, pH 7.0]에 2 mL/min으로 적재하였다. 컬럼을 5컬럼 부피의 아세테이트 완충액 (20 mM 아세트산나트륨, pH 5.5)으로 세척하고, 단백질을 4컬럼 부피의 아세트산나트륨(20mM, pH 3.2 내지 3.5)으로 용출시켰다. 수산화나트륨을 사용하여 용출물의 pH를 5.5로 조정하고, 필요에 따라 여과하였다. 최종적으로, 물질을 10 mg/mL까지 농축하고, 140mM의 염화나트륨, 20 mM의 아세트산나트륨, pH 5.5 내로 투석하고, 여과 및 4℃에 저장하였다.
본 명세서에 인용된 모든 공보 및 특허출원들은 각각의 개별적 공보나 특허출원이 구체적이고 개별적으로 본 발명에 일체화되었음을 시사하는 바와 같이 본 발명에서 참고로 하였다. 본 발명에 대한 이해의 명료성을 목적으로 설명 및 실시예의 예시를 통해 본 발명을 구체적으로 기재하였으나, 당업자에게는 본 발명의 교시에 따라 본 발명의 사상과 하기 청구범위 이내에서 다양한 변형과 변화가 가능함이 자명할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> PFIZER, INC. AMGEN FREMONT INC. <120> ANTIBODIES TO MYOSTATIN <130> ABX-PF7 AW <140> <141> <150> 60/674,933 <151> 2005-04-25 <160> 122 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 1338 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaattgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagtagtta catatactac 180 gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcgg 300 gggtacagct atggtcttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagcc 360 tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 420 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480 aactcaggcg ctctgaccag cggcgtgcac accttcccag ctgtcctaca gtcctcagga 540 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca acttcggcac ccagacctac 600 acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagacagt tgagcgcaaa 660 tgttgtgtcg agtgcccacc 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agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660 gagtccaaat atggtccccc atgcccatca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 720 tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 840 gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 1260 gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 1320 aagagcctct ccctgtctct gggtaaatga 1350 <210> 42 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu 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gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt accctcggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa ac 322 <210> 57 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 58 <211> 358 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagtagtta catatactac 180 gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatagg 300 ggatactact acggtatgga cgtctggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcag 358 <210> 59 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Ala 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 60 <211> 322 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 ctcacttgcc 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<213> Homo sapiens <400> 87 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 88 <211> 322 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 88 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccact ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca ggaccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa ac 322 <210> 89 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45 Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 90 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Asn Leu Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Glu 35 40 45 Tyr Met Phe Met Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Gln Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 Lys Ile Pro Gly Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 91 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (21) <223> Inosine <400> 91 caggtgcagc tggagcagtc ngg 23 <210> 92 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 92 gctgagggag tagagtcctg agga 24 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 93 tacgtgccaa gcatcctcgc 20 <210> 94 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 94 aggctggaac tgaggagcag gtg 23 <210> 95 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 95 ccctgagagc atcaymyarm aacc 24 <210> 96 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 96 hvthtccact yggtgatcrg cactg 25 <210> 97 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 97 attyrgtgat cagsactgaa casag 25 <210> 98 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 98 gsartcagwc ycwvycagga cacagc 26 <210> 99 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 99 caccaggkga tttgcatatt rtccc 25 <210> 100 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 100 atcaatgcct gkgtcagagc yytg 24 <210> 101 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 101 agccagaca 9 <210> 102 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 gtctagac 8 <210> 103 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 103 Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr <210> 104 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 104 Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala 1 5 10 15 Pro Lys <210> 105 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 105 Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu 1 5 10 15 Gln Lys <210> 106 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 106 Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 1 5 10 15 Gly Pro <210> 107 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 107 Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn 1 5 10 15 Gly Lys <210> 108 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 108 Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys 1 5 10 15 Gly Cys Ser <210> 109 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 109 His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe 1 5 10 15 Glu Ala <210> 110 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 110 Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr 1 5 10 15 Cys Ser <210> 111 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 111 Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu 1 5 10 15 Val His <210> 112 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 112 Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys 1 5 10 15 Met Ser <210> 113 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 113 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly 1 5 10 15 Lys Ile <210> 114 <211> 1347 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 114 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctttgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggaatg ggtctcaact attagtggta gtggtggtta cacattctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatgga 300 aggtataact ggaactacgg ggcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 420 tccgagagca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480 gtgtcgtgga actcaggcgc tctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540 tcctcaggac tctactccct cagcagcgta gtgaccgtgc cctccagcaa cttcggcacc 600 cagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagacagtt 660 gagcgcaaat gttgtgtcga gtgcccaccg tgcccagcac cacctgtggc aggaccgtca 720 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780 acgtgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg 840 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccacggg aggagcagtt caacagcacg 900 ttccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcgtg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 960 aagtgcaagg tctccaacaa aggcctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc 1020 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1080 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacacctcc catgctggac 1200 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacacagaag 1320 agcctctccc tgtctccggg taaatga 1347 <210> 115 <211> 448 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Gly Arg Tyr Asn Trp Asn Tyr Gly Ala Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys 210 215 220 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 116 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 116 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagt agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645 <210> 117 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 118 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Gly Arg Tyr Asn Trp Asn Tyr Gly Ala Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 119 <211> 367 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 119 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctttgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggaatg ggtctcaact attagtggta gtggtggtta cacattctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatgga 300 aggtataact ggaactacgg ggcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 tcctcag 367 <210> 120 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 121 <211> 322 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 121 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagt agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa ac 322 <210> 122 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 122 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims (22)

  1. 미오스타틴과 특이적으로 결합하는 사람, 키메라 또는 인간화된 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부로서,
    GDF11에 비해 50배 이상 선택적으로 미오스타틴과 결합하고, 액티빈 I형 또는 II형 수용체에 대한 미오스타틴 결합을 억제하는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
  2. (a) 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 및 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체와, 미오스타틴과의 결합에 대하여 경합하는 특성; 및
    (b) 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H_I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 및 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V로 이루어지는 군으로부터 선택된 항체와 동일한 미오스타틴의 에피토프에 결합하는 특성
    으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 가지는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
  3. (a) 서열 번호 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85 및 118 중 어느 하나의 아미노산 서열에 포함되는 중쇄 CDR들로서 순서대로 함께인 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한, 순서대로 함께인 CDR1, CDR2 및 CDR3의 CDR 세트;
    (b) 서열 번호 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 83, 87 및 120 중 어느 하나의 아미노산 서열에 포함되는 경쇄 CDR들로서 순서대로 함께인 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한, 순서대로 함께인 CDR1, CDR2 및 CDR3의 CDR 세트; 또는
    (c) (a)의 제1 CDR 세트 및 (b)의 제2 CDR 세트
    를 포함하는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
  4. 미오스타틴과 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부로서,
    (a) 중쇄가 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 및 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V 로 이루어지는 군으로부터 선택된 항체의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (b) 경쇄가 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 및 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V로 이루어지는 군으로부터 선택된 항체의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (c) 항체가 (a)의 중쇄 및 (b)의 경쇄를 포함하는
    단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
  5. (a) 서열 번호 2 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    (b) 서열 번호 6 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    (c) 서열 번호 10 및 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    (d) 서열 번호 14 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    (e) 서열 번호 18 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    (f) 서열 번호 22 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    (g) 서열 번호 26 및 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    (h) 서열 번호 30 및 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    (i) 서열 번호 34 및 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    (j) 서열 번호 38 및 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    (k) 서열 번호 42 및 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
    (l) 서열 번호 115 및 서열 번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 항체
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단일클론 항체.
  6. (a) 서열 번호 2 및 서열 번호 4의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
    (b) 서열 번호 6 및 서열 번호 8의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
    (c) 서열 번호 10 및 서열 번호 12의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
    (d) 서열 번호 14 및 서열 번호 16의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
    (e) 서열 번호 18 및 서열 번호 20의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
    (f) 서열 번호 22 및 서열 번호 24의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
    (g) 서열 번호 26 및 서열 번호 28의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
    (h) 서열 번호 30 및 서열 번호 32의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
    (i) 서열 번호 34 및 서열 번호 36의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
    (j) 서열 번호 38 및 서열 번호 40의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부;
    (k) 서열 번호 42 및 서열 번호 44의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부; 및
    (l) 서열 번호 115 및 서열 번호 117의 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이것의 항원-결합부
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
  7. 제1 CDR1, 제1 CDR2 및 제1 CDR3를 포함하는 제1 CDR 서열 세트, 및 제2 CDR1, 제2 CDR2 및 제2 CDR3를 포함하는 제2 CDR 서열 세트를 포함하며,
    각 순서대로 함께 상기 제1 CDR 세트 및 제2 CDR 세트는
    (a) 각각, 서열 번호 2 및 서열 번호 4;
    (b) 각각, 서열 번호 6 및 서열 번호 8;
    (c) 각각, 서열 번호 10 및 서열 번호 12;
    (d) 각각, 서열 번호 14 및 서열 번호 16;
    (e) 각각, 서열 번호 18 및 서열 번호 20;
    (f) 각각, 서열 번호 22 및 서열 번호 24;
    (g) 각각, 서열 번호 26 및 서열 번호 28;
    (h) 각각, 서열 번호 30 및 서열 번호 32;
    (i) 각각, 서열 번호 34 및 서열 번호 36;
    (k) 각각, 서열 번호 38 및 서열 번호 40;
    (l) 각각, 서열 번호 42 및 서열 번호 44; 및
    (m) 각각, 서열 번호 115 및 서열 번호 117
    의, 순서대로 함께인 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 90% 이상 동일한 것인 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
  8. 제1 CDR1, 제1 CDR2 및 제1 CDR3를 포함하는 제1 CDR 서열 세트, 및 제2 CDR1, 제2 CDR2 및 제2 CDR3를 포함하는 제2 CDR 서열 세트를 포함하며,
    상기 각 제1 CDR 세트 및 제2 CDR 세트는,
    (a) 각각, 서열 번호 2 및 서열 번호 4;
    (b) 각각, 서열 번호 6 및 서열 번호 8;
    (c) 각각, 서열 번호 10 및 서열 번호 12;
    (d) 각각, 서열 번호 14 및 서열 번호 16;
    (e) 각각, 서열 번호 18 및 서열 번호 20;
    (f) 각각, 서열 번호 22 및 서열 번호 24;
    (g) 각각, 서열 번호 26 및 서열 번호 28;
    (h) 각각, 서열 번호 30 및 서열 번호 32;
    (i) 각각, 서열 번호 34 및 서열 번호 36;
    (k) 각각, 서열 번호 38 및 서열 번호 40;
    (l) 각각, 서열 번호 42 및 서열 번호 44; 및
    (m) 각각, 서열 번호 115 및 서열 번호 117
    의, 순서대로 함께인 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열인 것인 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
  9. 서열 번호 115의 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 117의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 미오스타틴과 특이적으로 결합하는 단일클론 항체.
  10. 서열 번호 115 및 서열 번호 117에 포함된 가변 영역을 포함하는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
  11. 서열 번호 115 및 서열 번호 117에 포함된 CDR들인 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 미오스타틴과 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
  12. 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부로서,
    미오스타틴의 펩티드 1 부분 및 펩티드 5 부분과 결합하며, 상기 펩티드 1은 서열 번호 103의 아미노산 서열을 포함하고, 펩티드 5는 서열 번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 단일클론 항체 또는 이것의 항원-결합부.
  13. PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575 및 PTA-6576으로 이루어지는 군으로부터 선택된 ATCC 기탁번호를 갖는 세포에 의해 생산되는 항체.
  14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합부 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물.
  15. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합부 또는 제14항에 따른 약학 조성물을 검체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법으로서, 상기 항체, 항원-결합부 또는 약학 조성물은 미오스타틴 활성을 억제하며, 상기 검체는 근육량 증가, 골격근 발달 촉진, 근육소모 질병의 치료 또는 골격근 성장 강화가 요구되는 방법.
  16. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합부, 또는 상기 항체 또는 항원-결합부의 중쇄 또는 경쇄를 생산하는 단리된 세포주.
  17. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따른 항체의 중쇄 또는 이것의 항원- 결합부, 또는 상기 항체의 경쇄 또는 이것의 항원-결합부를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  18. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합부를 검체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법으로서, 상기 항체 또는 항원-결합부는 미오스타틴 활성을 억제하며, 상기 검체는 글루코스 항상성의 개선, 지방량의 감소, 인슐린 감응성의 증가, 신장 기능 개선, 지방 축적의 감소, 골다공증, 골감소증, 골관절염 및 골절을 포함하는 골-상실을 특징으로 하는 질병 또는 병태의 치료, 예방 또는 억제, 대사증후군의 치료, 또는 글루코코르티코이드 또는 스테로이드 호르몬으로 치료 받는 기간 중에 글루코코르티코이드 또는 스테로이드 호르몬의 지속적 투여로 인한 근육소모에 대한 반대 작용이 요구되는 방법.
  19. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 항원-결합부를 미오스타틴 활성 감소가 요구되는 검체에게 투여하는 단계를 포함하는 검체에서 미오스타틴 활성을 감소시키는 방법으로서, 상기 단일클론 항체 또는 항원-결합부가 미오스타틴 활성을 억제하는 방법.
  20. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 항원-결합부를 노화에 따른 근육량 감소를 역전(reverse)시키는 것이 요구되는 검체에게 투여하는 단계를 포함하는 검체 내에서 노화에 따른 근육량의 감소를 역전시키는 방법 으로서, 상기 항체 또는 항원-결합부가 미오스타틴 활성을 억제하는 방법.
  21. 사람, 키메라 또는 인간화된 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 포유 동물 숙주 세포주로서, 상기 항체 또는 이것의 일부는 하기 (a) 내지 (d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 가지는 포유 동물 숙주 세포주:
    (a) 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 및 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체와, 미오스타틴과의 결합에 대하여 경합하는 특성;
    (b) 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H_I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; 및 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V로 이루어지는 군으로부터 선택된 항체와 동일한 미오스타틴의 에피토프에 결합하는 특성;
    (c) PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575, 및 PTA-6576으로 이루어진 군으로부터 선택 되는 ATCC 기탁번호를 가지는 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 항체와 동일한 아미노산 서열을 갖는 항체; 및
    (d) ATCC 기탁번호 PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575, 및 PTA-6576으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하이브리도마 세포주.
  22. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합부를 근육 성장, 체중 증가의 촉진 또는 허약증(frailty)의 예방 보조가 요구되는 소, 돼지, 양, 닭, 칠면조, 말, 어류, 개 및 고양이에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 항체 또는 항원-결합부는 미오스타틴 활성을 억제하는 것인, 소, 돼지, 양, 닭, 칠면조, 말, 어류, 개 및 고양이에서의 근육 성장, 체중 증가의 촉진 또는 허약증의 예방 보조를 위한 방법.
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