KR20080006965A - 세포 배양 및 전달용 다공성 생분해성 고분자 미립 담체와그의 제조방법 - Google Patents

세포 배양 및 전달용 다공성 생분해성 고분자 미립 담체와그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생분해성 고분자인 지방족 폴리에스테르를 소재로 하는 세포 배양 및 조직 재생 시 주사용 세포 전달체로 사용되는 다공성 미립담체와 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 생분해성 다공성 미립담체는 지방족 폴리에스테르 고분자를 녹인 유기상에 발포성 염을 녹인 수용액을 첨가하여 빠른 속도의 교반을 통해 발포된 기체로 균일하고 안정된 W/O(Water-in-Oil) 유화액을 형성시키는 단계와, 상기의 발포된 기체를 포함하는 W/O 유화액을 친수성 계면활성제를 포함하는 수용액에 재분산, 유화시키는 W/O/W(Water-in-Oil-in-Water) 이중 유화단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된다. 상기 미립 담체는 생분해성, 높은 공극률, 공극간의 우수한 상호연결성 등의 특성을 지니며, 세포 배양에 적합하고 주사용으로 알맞은 크기를 가진다.
미립담체, 다공성, 생분해성, 세포 배양, 조직 재생, 세포 전달체

Description

세포 배양 및 전달용 다공성 생분해성 고분자 미립 담체와 그의 제조방법 {Porous Biodegradable Microcarriers for Cell Culture and Delivery and Fabrication Method Thereof}
도 1은 발포성 염에 의한 기체의 생성과 W/O/W 이중 유화법에 의한 다공성 미립구의 제조과정에 관한 모식도이다.
도 2a, 도 2b, 도 2c 및 도 2d는 본 발명에서 사용된 생분해성 고분자인 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산) (PLGA) 용액의 농도를 변화하여 실시예 1에 따라 제조한 다공성 미립 담체의 형태 변화를 관찰한 주사전자현미경 사진이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 다공성 미립 담체에 연골세포 (chondrocyte)를 접종하고 5일 배양 후 관찰한 공초점 레이저 주사현미경 사진 (a)과, 세포가 둘러싸고 있는 미립담체들(b), 다공성 표면에 점착된 세포(c)의 주사전자현미경 사진이다.
본 발명은 손상된 생체 조직 재생용 세포 배양 및 주사 전달을 위한 다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 미립 담체를 제작하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 W/O/W(Water-in-Oil-in-Water) 이중 유화 방식을 기반으로 생분해성 폴리에스테르계 고분자를 유기용매에 용해시켜 여기에 발포성 염을 녹인 수용액을 첨가하여 교반하면 생성된 W/O(Water-in-Oil) 유화액은 교반에 의해 발포된 기체에 의해 안정화되며, 이 유화 발포체를 친수성 계면활성제를 포함하는 용액에 재분산, 유화시켜 다공성 미립 담체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
다공성 생분해성 고분자 지지체는 다양한 조직 재생을 위한 일시적인 주형으로 널리 이용되고 있다. 지지체내 충분한 세포 접착 밀도, 그리고 세포 증식 및 분화를 위한 영양과 산소 공급을 촉진시키기 위해 공극간 연결이 우수하고 표면이 개방된 다공성 구조가 요구된다.
락트산과 글리콜산을 기본단위로 하는 지방족 폴리에스테르는 생체내 분해속도의 조절가능성과 생체적합성 때문에 조직재생용 지지체의 제조에 넓게 이용되며 미국식품의약국(FDA)에 승인을 받은 고분자이다.
지방족 폴리에스테르의 구체적인 예로는 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)(poly(D,L-lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(발레로락톤), 폴리(하이드록시 부티레이트) 및 폴리(하이드록시 발러레이트) 등이 포함된다.
이와 같이 다양한 형상을 갖는 다공성 생분해성 고분자 지지체들이 여러 방법에 의해 제조되고 있다. 그 중에서 공극형성입자 침출(porogen leaching)법이 가 장 널리 이용되고 있는데, 다양한 공극형성입자, 예를 들어 염 또는 발포성 염, 탄수화물, 탄화수소 왁스 등을 고분자/용매 혼합물에 고착시킨 후 선택적으로 입자만 녹여 내거나 발포시켜 공극을 형성하는 방법이다. 그 외 유화/동결건조, 상분리법, 임계 액체상에서의 팽창, 3차원 잉크 제트 프린팅 등의 방법도 널리 사용되고 있다(A. G. Mikos, G. Sarakinos, S. M. Leite, J. P. Vacanti, R. Langer, Biomaterials, 14 (1993) 323-330; Z. Ma, C. Gao, Y. Gong, J. Shen, J. Biomed. Mater. Res. 67B (2003) 610-617; A. Park, B. Wu, L. G. Griffith, J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 9 (1998) 89-110).
상기의 제조법에 의해 세포의 접착과 분화를 유도할 수 있는 다양한 삼차원 고분자 지지체가 제작되어 왔고, 높은 밀도의 세포 접착이 가능하여 뼈, 연골 및 간 재생의 잠재성이 증명되었다. 그러나 이런 지지체는 외과적 수술을 거치는 체내 이식 과정이 요구된다. 따라서 시술을 받아야 하는 환자의 불편을 최소화하기 위해 최근 부드러운 친수성 생분해성 고분자 재료가 주사형으로 세포를 결함 부위에 전달하는 용도로 각광받고 있다. 이는 세포를 포함한 고분자액을 주사한 후 광-가교 하거나 졸-젤 현상에 의해 하이드로 젤을 형성시키는 방법이다(J. J. Marler, A. Guha, J. Rowley, R. Koka, D. Monney, J. Upton, J. P. Vacanti, Plast. Reconstr. Surg. 105 (2000) 2049-2058; S. He, M. J. Yaszemski, A. W. Yasko, P. S. Engel, A. G. Mikos, Biomaterials, 21 (2000) 2389-2394).
그러나 이런 하이드로 젤은 고체 표면에 부착이 필요한 세포(anchorage dependent cell)에는 이상적인 환경을 제공하지 못하며, 기계적 강도가 약하여 내 부에 봉입된 세포를 보호하기 힘들다. 따라서 현재 대표적으로 사용되는 다공성 구조를 갖는 젤라틴으로 제조된 미립 담체인 컬티스퍼(CultiSpher)를 포함한 광범위한 천연 및 합성 미립담체가 부착 의존성 동물세포 배양에 이용되고 있으나 생체 적합하지 않거나, 기계적 강도가 만족스럽지 못하다.
생분해성 지방족 폴리에스터로 미립 담체 제조에 주로 사용하는 방법은 유화-용매 증발법(emulsification-solvent evaporation)이다. 그 중 W/O/W 이중 유화 방법은 두 번의 유화 단계를 거치는데 첫 번째 유화 단계인 W/O 유화액의 안정성에 따라 다공성 구조가 결정된다. 유화액은 열역학적으로 불안정한 상태이기 때문에 뭉침(coalescence), 융합(fusion), 상분리(creaming)라는 불안정화 과정을 거쳐 수상과 유기상이 서로 분리되려고 한다(M. Kanouni, H. L. Rosano, N. Naouli, Adv. Colloid Interface Sci. 99 (2002) 229-254; A. J. Webster, M. E. Cates, Langmuir, 14 (1998) 2068-2079). 따라서 일반적으로 이를 지연시키기 위해 첫 번째 수상에 염을 녹이거나, 유화제를 사용하나, 결과적으로 이중 유화법에 의해 제조된 미립 담체의 공극은 균일하지 못하고 외부로 닫혀있으며 유화제의 사용으로 공극의 크기를 줄이는 효과도 나타나기 때문에 높은 밀도의 세포를 운반하는 미립담체로 적당하지 못하다.
결론적으로 생체적합하고 생분해성이며, 높은 공극률과 세포가 침투할 수 있는 공극의 크기, 그리고 충분한 기계적 안정성이 있고 주사기로 주입 가능한 크기를 가진 미립 담체를 제조할 수 있는 방안이 요구되고 있다.
본 발명은 W/O/W 이중유화법을 기반으로 발포성 염을 사용한 발포방식을 결합시킴으로서 지방족 폴리에스테르계 고분자를 재료로 하고 높은 공극률, 우수한 공극간의 연결성, 외부로 열린 공극, 주사기로의 주입이 가능한 크기를 가진 생분해성 다공성 미립 담체와 그 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 발포성 염을 녹인 수용액을 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자를 녹인 유기상에 분산시켜 안정하고 균일한 W/O 유화액을 얻는 단계와, 이 유화액을 친수성 계면활성제를 포함하는 수용액에 재분산하여 유화시키는 W/O/W 이중유화 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 및 전달용 다공성 생분해성 고분자 미립 담체의 제조방법을 나타낸다.
상기에서 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자는 폴리(L-락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산), 폴리(카프로락톤), 폴리(발레로락톤), 폴리(하이드록시 부티레이트) 및 폴리(하이드록시 발러레이트) 중에서 선택된 고분자로서 평균분자량이 1,000∼200,000인 것을 사용할 수 있다.
상기에서 발포성 염은 암모늄 카보네이트 (ammonium carbonate), 암모늄 바이카보네이트 (ammonium bicarbonate), 또는 소듐 카보네이트 (sodium carbonate) 중에서 선택 된 어느 하나인 것을 사용할 수 있다.
상기에서 미립담체의 제조에 사용된 발포성 염의 수용액 농도는 1중량％ 내 지 20중량％인 것을 사용할 수 있다.
상기에서 친수성 계면활성제는 트윈, 트리톤, 브리즈, 폴리비닐프롤리돈 또는 폴리비닐알코올 중에서 선택된 어느 하나인 것을 사용할 수 있다.
상기에서 제조한 생분해성 다공성 미립담체는 직경이 50∼500㎛이다.
상기에서 생분해성 다공성 미립담체는 공극의 직경이 5∼100㎛이다.
상기에서 생분해성 다공성 미립담체는 공극률이 80％ 이상 99％ 이하이다.
본 발명은 상기에서 언급한 방법에 의해 제조한 세포 배양 및 전달용 다공성 생분해성 고분자 미립 담체를 포함한다.
본 발명은 상기의 생분해성 다공성 미립담체에 세포를 접종 배양하여 주사 가능한 세포 운반체로 사용하는 방법을 포함한다.
상기에서 언급한 방법에 의해 제조한 생분해성 다공성 미립담체는 발포성 염과 고분자 용액의 농도의 변화에 따라 공극률, 공극의 크기, 미립담체의 크기를 쉽게 조절할 수 있는 것을 특징으로 하며, 이에 각기 다양한 환경을 필요로 하는 여러 종류의 세포의 접종과 배양에 알맞은 다공성 미립담체를 제공할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 미립담체 제조법은 기본적으로 W/O/W 이중 유화 방식을 따른다. 이중 유화법은 두 번의 유화 단계를 거치는데 첫 번째, 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자를 유기 용매에 용해시킨 유기상에 발포성 염을 녹인 수상을 첨가하여 교반한다.
이때 상기의 생분해성 지방족 폴레에스테르계 고분자는 폴리(L-락트산), 폴 리(글리콜산), 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산), 폴리(카프로락톤), 폴리(발레로락톤), 폴리(하이드록시 부티레이트) 및 폴리(하이드록시 발러레이트) 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있으며 평균 분자량 50,000∼200,000인 것을 사용할 수 있다. 고분자의 종류에 의존하나 평균 분자량 100,000 정도가 가장 바람직하다. 작은 분자량에서는 기계적으로 안정된 구형의 미립담체를 얻기 어려우며, 큰 분자량에서는 미립담체의 크기를 제어하기 힘들다.
본 발명에서 사용된 생분해성 고분자를 녹인 유기용매로서 휘발성이 용이하고 수상과 섞이지 않는 메틸렌클로라이드, 클로로포름을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용된 발포성 염으로는 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate), 소듐 바이카보네이트(sodium bicarbonate), 소듐 카보네이트(sodium carbonate) 등이 사용될 수 있으며 그 농도는 20％ 이하로 사용하는 것이 좋다. 그 이상의 경우 많은 기체의 발포로 인해 안정된 구형의 미립담체가 형성되지 않는다.
본 발명은 W/O 유화액 형성시 발포성 염을 2차 증류수에 녹여 수상으로 첨가하여 유화액을 안정화 시키는 방법을 포함한다. 물에 녹아있는 발포성 염을 유기상에 첨가하여 5000rpm 이상의 빠른 속도로 2∼3분 정도 교반하게 되면 도 1에서 보듯이 분산질인 수상으로부터 암모니아와 이산화탄소 기체가 유기상으로 발포되어 분산된 물방울 주위를 둘러싸게 되고 물방울의 뭉침을 막아 수상이 균일하게 분산된 유화액을 얻을 수 있다. 이때 첨가되는 수상의 부피는 유기상의 부피를 넘을 수 없으며 안정한 구형의 미립담체를 얻기 위해서는 수상의 비율이 40％ 이하가 바람 직하다. 40％ 이상의 비율에서는 안정한 유화액을 얻기 어려우며, 최종 제조된 미립담체의 형태도 매우 불균일해진다. 발포성 염의 농도와 첨가되는 수상의 부피에 따라 생성되는 기체의 농도를 조절가능하며, 이에 공극의 구조도 제어할 수 있다.
두 번째 유화 단계에서는 상기 발포에 의해 안정화된 W/O 유화액을 두 번째 수상인 10∼15배 부피의 친수성 계면활성제를 포함하는 용액에 분산, 유화시킨다. 이 때 교반속도는 100∼300rpm 범위에서 적용가능하나, 500cc 비이커에서 200rpm 내외가 바람직하다. 교반속도의 선택은 반응 용기의 크기에 의존한다. 분산된 W/O 유화액 내부의 기체가 두 번째 수상으로 방출되는 과정과 유기용매의 증발/제거됨에 따른 폴리에스테르계 고분자가 경화되는 과정을 통해 외부로 열려진 공극을 갖는 다공성 미립 담체가 형성된다. 이를 자연히 침전시켜 과량의 2차 증류수로 계면활성제를 제거하고, -70℃에서 냉동 후 진공 건조하여 미립담체를 수거할 수 있다.
본 발명에서는 친수성 계면활성제로 0.1∼0.5중량％의 농도로 분자량 13,000∼23,000의 폴리비닐알코올을 사용하는데 다른 계면활성제로 트윈, 트리톤, 브리즈, 폴리비닐프롤리돈 중에서 어는 하나 이상을 선택하여 사용할 수 있다.
이하, 실시예에서는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
이들 실시예는 본 발명을 오로지 설명하기 위한 것으로 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 다공성 생분해성 고분자 미립담체의 제조
무게 평균 분자량 100,000이고 락트산과 글리콜산의 비율이 75:25인 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)(PLAG)을 125mg에서 500mg 까지 변화시켜 가면서 8ml의 메틸렌클로라이드에 용해시킨다. 마찬가지로 암모늄 바이카보네이트를 1중량％에서 10중량％의 농도로 변화시키면서 2.5ml의 2차 증류수에 녹인 후 두 액상을 교반기(homogenizer)를 이용하여 5,000rpm에서 2분간 유화시켰다. 이 W/O 유화액을 150ml의 0.1중량％ 폴리비닐알코올 용액에 넣고 프로펠러형 교반기를 사용하여 200rpm에서 4시간 동안 교반하였다. 용매가 증발한 후 미립담체를 침전시켜 2차 증류수로 3번 세척하고 -70℃에서 냉동 후 진공 건조하여 미립담체를 수거하였다.
PLGA의 농도와 암모늄 바이카보네이트 농도의 변화에 따른 공극과 미립담체 크기, 그리고 수분 흡수율의 변화를 표 1과 표 2에 나타냈다.
표 1. 암모늄 바이카보네이트 농도에 따른 공극과 미립담체의 크기 변화
암모늄 바이카보네이트 농도(중량％) 공극 직경(㎛) 수분 흡수율
0 - 2.37 ± 0.21
1 9.98 ± 3.71 6.22 ± 0.77
5 13.63 ± 4.70 11.00 ± 1.56
10 16.68 ± 6.62 23.32 ± 2.51
여기서 수분흡수율은 공극률의 간접적 표현이며 다음과 같이 계산한다.
수분흡수율=(담체의 습윤 무게 - 담체의 건조 무게)/ 담체의 건조 무게
표 1에서 보듯이 미립담체의 공극의 직경과 수분 흡수율은 발포성 염인 암모늄 바이카보네이트의 농도에 따라 조절가능하며, 암모늄 바이카보네이트의 농도가 10중량％ 일 때 공극률은 99％에 달하였다.
표 2. 고분자 용액의 농도에 따른 공극과 미립담체의 크기 변화
PLGA 농도 (w/v％) 공극 직경(㎛) 미립담체 직경(㎛)
6.3 7.9 ± 1.0 362 ± 12
3.8 14.8 ± 2.5 267 ± 11
2.5 24.2 ± 2.2 222 ± 9
1.9 27.1 ± 2.6 193 ± 10
1.6 29.4 ± 4.0 175 ± 5
도 2a, 도 2b, 도 2c, 도 2d는 표 2에서 PLGA 농도별로 제조한 다공성 미립담체의 주사전자현미경 사진으로서 유기상의 고분자 농도를 조절함으로서 여러 형태와 크기의 다공성 구조를 얻을 수 있음을 확인하였다.
<실시예 2> 세포 접종과 배양
실시예 1에서와 같이 제조한 다공성 미립담체의 세포 배양 적합성을 확인하기 위하여 연골세포(chondrocyte)를 사용하여 담체에 접종 후 배양하였다. 초기 2.1 × 106 농도로 세포를 미립담체에 주입하고 세포 배양 플레이트에서 37℃, 5％ CO2 배양기로 배양하였다. 24시간 후 세포가 점착된 미립담체를 나일론 메시로 걸러내어 스피너 플라스크로 옮겨 7일 동안 부유 배양을 시도하였다. 도 3은 5일 후의 세포가 점착된 미립담체의 공초점 레이저 주사현미경 사진과 주사전자현미경 사진으로 세포가 다공성 미립담체 표면과 내부에 걸쳐 골고루 분포하고 성장하였음을 확인할 수 있었다.
도 3a은 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 다공성 미립 담체에 연골세포 (chondrocyte)를 접종하고 5일 배양 후 관찰한 공초점 레이저 주사현미경 사진이고, 도 3b는 세포가 둘러싸고 있는 미립담체들의 주사전자현미경 사진이고, 도 3c는 다공성 표면에 점착된 세포의 주사전자현미경 사진이다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 W/O 유화액 형성시 발포성 염을 수상에 녹여 첨가하여 빠른 속도의 교반에 의해 기체를 발생시키고, 이 기체가 발포된 유화액을 재분산, 유화시키는 W/O/W 이중 유화과정을 통하여 상기 발생된 기체에 의해 외부로 열려진 다공성 구조를 갖는 미립 담체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이렇게 제조된 미립담체는 생분해성이며, 높은 공극율과, 공극간의 상호연결성을 지니고 있어 세포 배양에 적합한 특성을 지닌다. 또한 주사기를 통해 생체내 주입 가능한 크기를 가지고 있기 때문에 손상된 조직 재생용 세포 전달체로 효과적이다.

Claims (10)

  1. 발포성 염을 녹인 수용액을 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자를 녹인 유기상에 분산시켜 안정하고 균일한 W/O 유화액을 얻는 단계와, 이 유화액을 친수성 계면활성제를 포함하는 수용액에 재분산하여 유화시키는 W/O/W 이중유화 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 및 전달용 다공성 생분해성 고분자 미립 담체의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 생분해성 다공성 미립담체의 직경이 50∼500㎛인 것을 특징으로 하는 세포 배양 및 전달용 다공성 생분해성 고분자 미립 담체의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서, 생분해성 다공성 미립담체의 공극의 직경이 5∼100㎛인 것을 특징으로 하는 세포 배양 및 전달용 다공성 생분해성 고분자 미립 담체의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서, 생분해성 다공성 미립담체의 공극률이 80％ 이상 99％ 이하인 것을 특징으로 하는 세포 배양 및 전달용 다공성 생분해성 고분자 미립 담체의 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서, 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자는 폴리(L- 락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산), 폴리(카프로락톤), 폴리(발레로락톤), 폴리(하이드록시 부티레이트) 및 폴리(하이드록시 발러레이트) 중에서 선택된 고분자로서 평균분자량이 1,000∼200,000인 것을 특징으로 하는 세포 배양 및 전달용 다공성 생분해성 고분자 미립 담체의 제조방법.
  6. 제 1항에서 있어서, 발포성 염은 암모늄 카보네이트 (ammonium carbonate), 암모늄 바이카보네이트 (ammonium bicarbonate), 또는 소듐 카보네이트 (sodium carbonate) 중에서 선택 된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포 배양 및 전달용 다공성 생분해성 고분자 미립 담체의 제조방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 미립담체의 제조에 사용된 발포성 염의 수용액 농도는 1중량％ 내지 20중량％인 것을 특징으로 하는 세포 배양 및 전달용 다공성 생분해성 고분자 미립 담체의 제조방법.
  8. 제 1항에 있어서, 친수성 계면활성제는 트윈, 트리톤, 브리즈, 폴리비닐프롤리돈 또는 폴리비닐알코올 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포 배양 및 전달용 다공성 생분해성 고분자 미립 담체의 제조방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중에서 선택된 어느 하나의 방법에 의해 얻어진 세포 배양 및 전달용 다공성 생분해성 고분자 미립 담체.
  10. 제9항의 생분해성 다공성 미립담체에 세포를 접종 배양하여 주사 가능한 세포 운반체로 사용하는 방법.
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