KR20080006965A - Porous biodegradable microcarriers for cell culture and delivery and fabrication method thereof - Google Patents
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Abstract
Description
도 1은 발포성 염에 의한 기체의 생성과 W/O/W 이중 유화법에 의한 다공성 미립구의 제조과정에 관한 모식도이다.1 is a schematic view of the production of gas by the foaming salt and the manufacturing process of the porous microspheres by the W / O / W double emulsification method.
도 2a, 도 2b, 도 2c 및 도 2d는 본 발명에서 사용된 생분해성 고분자인 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산) (PLGA) 용액의 농도를 변화하여 실시예 1에 따라 제조한 다공성 미립 담체의 형태 변화를 관찰한 주사전자현미경 사진이다. 2a, 2b, 2c and 2d is prepared according to Example 1 by varying the concentration of the poly (D, L-lactic-co-glycolic acid) (PLGA) solution of the biodegradable polymer used in the present invention Scanning electron micrographs observed changes in the shape of the porous particulate carrier.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 다공성 미립 담체에 연골세포 (chondrocyte)를 접종하고 5일 배양 후 관찰한 공초점 레이저 주사현미경 사진 (a)과, 세포가 둘러싸고 있는 미립담체들(b), 다공성 표면에 점착된 세포(c)의 주사전자현미경 사진이다. 3 is a confocal laser scanning micrograph (a) observed after 5 days of inoculation of chondrocytes inoculated into a porous particulate carrier prepared according to Example 1 of the present invention, and microparticles surrounded by cells ( b) Scanning electron micrographs of cells (c) adhered to the porous surface.
본 발명은 손상된 생체 조직 재생용 세포 배양 및 주사 전달을 위한 다공성 구조를 갖는 생분해성 고분자 미립 담체를 제작하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 W/O/W(Water-in-Oil-in-Water) 이중 유화 방식을 기반으로 생분해성 폴리에스테르계 고분자를 유기용매에 용해시켜 여기에 발포성 염을 녹인 수용액을 첨가하여 교반하면 생성된 W/O(Water-in-Oil) 유화액은 교반에 의해 발포된 기체에 의해 안정화되며, 이 유화 발포체를 친수성 계면활성제를 포함하는 용액에 재분산, 유화시켜 다공성 미립 담체를 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a biodegradable polymer particulate carrier having a porous structure for cell culture and injection delivery for damaged biological tissue regeneration. More specifically, based on the W / O / W (Water-in-Oil-in-Water) double emulsification method, the biodegradable polyester-based polymer is dissolved in an organic solvent, and an aqueous solution in which an effervescent salt is dissolved is added thereto and stirred. The resulting water-in-oil (W / O) emulsion is stabilized by a foamed gas by stirring, and the emulsion foam is redispersed and emulsified in a solution containing a hydrophilic surfactant to prepare a porous fine carrier. It is about.
다공성 생분해성 고분자 지지체는 다양한 조직 재생을 위한 일시적인 주형으로 널리 이용되고 있다. 지지체내 충분한 세포 접착 밀도, 그리고 세포 증식 및 분화를 위한 영양과 산소 공급을 촉진시키기 위해 공극간 연결이 우수하고 표면이 개방된 다공성 구조가 요구된다. Porous biodegradable polymeric supports are widely used as temporary templates for various tissue regeneration. In order to promote sufficient cell adhesion density in the support and nutrition and oxygen supply for cell proliferation and differentiation, a porous structure with good interpore connectivity and an open surface is required.
락트산과 글리콜산을 기본단위로 하는 지방족 폴리에스테르는 생체내 분해속도의 조절가능성과 생체적합성 때문에 조직재생용 지지체의 제조에 넓게 이용되며 미국식품의약국(FDA)에 승인을 받은 고분자이다. Aliphatic polyesters based on lactic acid and glycolic acid are widely used for the preparation of scaffolds for tissue regeneration due to the controllability and biocompatibility of the degradation rate in vivo and are polymers approved by the US Food and Drug Administration (FDA).
지방족 폴리에스테르의 구체적인 예로는 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)(poly(D,L-lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(발레로락톤), 폴리(하이드록시 부티레이트) 및 폴리(하이드록시 발러레이트) 등이 포함된다.Specific examples of aliphatic polyesters include polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), poly (D, L-lactic acid-co-glycolic acid) (poly (D, L-lactic-co-glycolic acid), PLGA) , Polycaprolactone (PCL), poly (valerolactone), poly (hydroxy butyrate), poly (hydroxy valerate) and the like.
이와 같이 다양한 형상을 갖는 다공성 생분해성 고분자 지지체들이 여러 방법에 의해 제조되고 있다. 그 중에서 공극형성입자 침출(porogen leaching)법이 가 장 널리 이용되고 있는데, 다양한 공극형성입자, 예를 들어 염 또는 발포성 염, 탄수화물, 탄화수소 왁스 등을 고분자/용매 혼합물에 고착시킨 후 선택적으로 입자만 녹여 내거나 발포시켜 공극을 형성하는 방법이다. 그 외 유화/동결건조, 상분리법, 임계 액체상에서의 팽창, 3차원 잉크 제트 프린팅 등의 방법도 널리 사용되고 있다(A. G. Mikos, G. Sarakinos, S. M. Leite, J. P. Vacanti, R. Langer, Biomaterials, 14 (1993) 323-330; Z. Ma, C. Gao, Y. Gong, J. Shen, J. Biomed. Mater. Res. 67B (2003) 610-617; A. Park, B. Wu, L. G. Griffith, J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 9 (1998) 89-110). As described above, porous biodegradable polymer supports having various shapes are manufactured by various methods. Among them, porogen leaching is the most widely used method, and various pore-forming particles, for example, salts or effervescent salts, carbohydrates, hydrocarbon waxes, etc. are fixed to the polymer / solvent mixture and then selectively It is a method of forming voids by melting or foaming. In addition, emulsification / freeze drying, phase separation, expansion in critical liquid phases, and three-dimensional ink jet printing are widely used (AG Mikos, G. Sarakinos, SM Leite, JP Vacanti, R. Langer, Biomaterials, 14 ( 1993) 323-330; Z. Ma, C. Gao, Y. Gong, J. Shen, J. Biomed. Mater. Res. 67B (2003) 610-617; A. Park, B. Wu, LG Griffith, J Biomater.Sci.Polym.Ed. 9 (1998) 89-110).
상기의 제조법에 의해 세포의 접착과 분화를 유도할 수 있는 다양한 삼차원 고분자 지지체가 제작되어 왔고, 높은 밀도의 세포 접착이 가능하여 뼈, 연골 및 간 재생의 잠재성이 증명되었다. 그러나 이런 지지체는 외과적 수술을 거치는 체내 이식 과정이 요구된다. 따라서 시술을 받아야 하는 환자의 불편을 최소화하기 위해 최근 부드러운 친수성 생분해성 고분자 재료가 주사형으로 세포를 결함 부위에 전달하는 용도로 각광받고 있다. 이는 세포를 포함한 고분자액을 주사한 후 광-가교 하거나 졸-젤 현상에 의해 하이드로 젤을 형성시키는 방법이다(J. J. Marler, A. Guha, J. Rowley, R. Koka, D. Monney, J. Upton, J. P. Vacanti, Plast. Reconstr. Surg. 105 (2000) 2049-2058; S. He, M. J. Yaszemski, A. W. Yasko, P. S. Engel, A. G. Mikos, Biomaterials, 21 (2000) 2389-2394).By the above method, various three-dimensional polymer scaffolds that can induce cell adhesion and differentiation have been produced, and high density cell adhesion has been demonstrated, thereby proving potential for bone, cartilage, and liver regeneration. However, such scaffolds require an internal implantation procedure that undergoes surgical operations. Therefore, in order to minimize the inconvenience of patients who have to undergo a procedure, soft hydrophilic biodegradable polymer materials have recently been in the spotlight for the purpose of delivering cells to a defect site by injection. This is a method of hydrogel formation by photo-crosslinking or sol-gel development after injection of polymer fluid containing cells (JJ Marler, A. Guha, J. Rowley, R. Koka, D. Monney, J. Upton). , JP Vacanti, Plast.Reconstr . Surg. 105 (2000) 2049-2058; S. He, MJ Yaszemski, AW Yasko, PS Engel, AG Mikos, Biomaterials , 21 (2000) 2389-2394).
그러나 이런 하이드로 젤은 고체 표면에 부착이 필요한 세포(anchorage dependent cell)에는 이상적인 환경을 제공하지 못하며, 기계적 강도가 약하여 내 부에 봉입된 세포를 보호하기 힘들다. 따라서 현재 대표적으로 사용되는 다공성 구조를 갖는 젤라틴으로 제조된 미립 담체인 컬티스퍼(CultiSpher)를 포함한 광범위한 천연 및 합성 미립담체가 부착 의존성 동물세포 배양에 이용되고 있으나 생체 적합하지 않거나, 기계적 강도가 만족스럽지 못하다. However, these hydrogels do not provide an ideal environment for anchorage dependent cells that need to adhere to a solid surface, and their mechanical strength is weak, making it difficult to protect the cells enclosed. Therefore, a wide range of natural and synthetic particulate carriers including CultiSpher, a particulate carrier made of gelatin having a porous structure, which is typically used, are used for culturing attachment dependent animal cells, but they are not biocompatible or have satisfactory mechanical strength. It's unpleasant.
생분해성 지방족 폴리에스터로 미립 담체 제조에 주로 사용하는 방법은 유화-용매 증발법(emulsification-solvent evaporation)이다. 그 중 W/O/W 이중 유화 방법은 두 번의 유화 단계를 거치는데 첫 번째 유화 단계인 W/O 유화액의 안정성에 따라 다공성 구조가 결정된다. 유화액은 열역학적으로 불안정한 상태이기 때문에 뭉침(coalescence), 융합(fusion), 상분리(creaming)라는 불안정화 과정을 거쳐 수상과 유기상이 서로 분리되려고 한다(M. Kanouni, H. L. Rosano, N. Naouli, Adv. Colloid Interface Sci. 99 (2002) 229-254; A. J. Webster, M. E. Cates, Langmuir, 14 (1998) 2068-2079). 따라서 일반적으로 이를 지연시키기 위해 첫 번째 수상에 염을 녹이거나, 유화제를 사용하나, 결과적으로 이중 유화법에 의해 제조된 미립 담체의 공극은 균일하지 못하고 외부로 닫혀있으며 유화제의 사용으로 공극의 크기를 줄이는 효과도 나타나기 때문에 높은 밀도의 세포를 운반하는 미립담체로 적당하지 못하다.The primary method used for preparing particulate carriers with biodegradable aliphatic polyesters is emulsification-solvent evaporation. Among them, the W / O / W dual emulsification method undergoes two emulsification steps, and the porous structure is determined according to the stability of the first emulsification step, W / O emulsion. Since the emulsion is thermodynamically unstable, the aqueous phase and organic phase are separated from each other through destabilization processes such as coalescence, fusion, and creaming (M. Kanouni, HL Rosano, N. Naouli, Adv. Colloid). Interface Sci. 99 (2002) 229-254; AJ Webster, ME Cates, Langmuir , 14 (1998) 2068-2079). Therefore, in order to retard this, salts are dissolved in the first water phase or emulsifiers are used. As a result, the pores of the particulate carrier prepared by the double emulsification method are not uniform and closed to the outside. It is also not suitable as a carrier for carrying cells of high density because of its reducing effect.
결론적으로 생체적합하고 생분해성이며, 높은 공극률과 세포가 침투할 수 있는 공극의 크기, 그리고 충분한 기계적 안정성이 있고 주사기로 주입 가능한 크기를 가진 미립 담체를 제조할 수 있는 방안이 요구되고 있다.In conclusion, there is a need for a biocompatible, biodegradable, high porosity, pore size through which cells can penetrate, and a fine carrier having sufficient mechanical stability and a syringe-injectable size.
본 발명은 W/O/W 이중유화법을 기반으로 발포성 염을 사용한 발포방식을 결합시킴으로서 지방족 폴리에스테르계 고분자를 재료로 하고 높은 공극률, 우수한 공극간의 연결성, 외부로 열린 공극, 주사기로의 주입이 가능한 크기를 가진 생분해성 다공성 미립 담체와 그 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.The present invention combines a foaming method using an expandable salt based on the W / O / W double emulsification method, and is made of an aliphatic polyester-based material, and has high porosity, excellent connection between pores, open pores, and injection into a syringe. It is an object of the present invention to provide a biodegradable porous particulate carrier having a possible size and a method for producing the same.
본 발명은 발포성 염을 녹인 수용액을 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자를 녹인 유기상에 분산시켜 안정하고 균일한 W/O 유화액을 얻는 단계와, 이 유화액을 친수성 계면활성제를 포함하는 수용액에 재분산하여 유화시키는 W/O/W 이중유화 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 및 전달용 다공성 생분해성 고분자 미립 담체의 제조방법을 나타낸다. The present invention is to obtain a stable and uniform W / O emulsion by dispersing an aqueous solution in which the effervescent salt is dissolved in an organic phase in which the biodegradable aliphatic polyester polymer is dissolved, and redispersed in the aqueous solution containing a hydrophilic surfactant to emulsify It shows a method for producing a porous biodegradable polymer particulate carrier for cell culture and delivery, characterized in that it comprises a W / O / W bi-emulsification step.
상기에서 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자는 폴리(L-락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산), 폴리(카프로락톤), 폴리(발레로락톤), 폴리(하이드록시 부티레이트) 및 폴리(하이드록시 발러레이트) 중에서 선택된 고분자로서 평균분자량이 1,000∼200,000인 것을 사용할 수 있다.The biodegradable aliphatic polyester-based polymer is poly (L-lactic acid), poly (glycolic acid), poly (D, L-lactic acid-co-glycolic acid), poly (caprolactone), poly (valerolactone), As the polymer selected from poly (hydroxy butyrate) and poly (hydroxy valerate), those having an average molecular weight of 1,000 to 200,000 can be used.
상기에서 발포성 염은 암모늄 카보네이트 (ammonium carbonate), 암모늄 바이카보네이트 (ammonium bicarbonate), 또는 소듐 카보네이트 (sodium carbonate) 중에서 선택 된 어느 하나인 것을 사용할 수 있다. The effervescent salt may be any one selected from ammonium carbonate, ammonium bicarbonate, or sodium carbonate.
상기에서 미립담체의 제조에 사용된 발포성 염의 수용액 농도는 1중량％ 내 지 20중량％인 것을 사용할 수 있다.The aqueous solution concentration of the effervescent salt used in the preparation of the particulate carrier can be used 1 to 20% by weight.
상기에서 친수성 계면활성제는 트윈, 트리톤, 브리즈, 폴리비닐프롤리돈 또는 폴리비닐알코올 중에서 선택된 어느 하나인 것을 사용할 수 있다.The hydrophilic surfactant may be any one selected from tween, triton, breeze, polyvinylprolidone or polyvinyl alcohol.
상기에서 제조한 생분해성 다공성 미립담체는 직경이 50∼500㎛이다.The biodegradable porous particulate carrier prepared above is 50-500 μm in diameter.
상기에서 생분해성 다공성 미립담체는 공극의 직경이 5∼100㎛이다.In the biodegradable porous particulate carrier, the pore diameter is 5 to 100 μm.
상기에서 생분해성 다공성 미립담체는 공극률이 80％ 이상 99％ 이하이다.In the biodegradable porous particulate carrier, the porosity is 80% or more and 99% or less.
본 발명은 상기에서 언급한 방법에 의해 제조한 세포 배양 및 전달용 다공성 생분해성 고분자 미립 담체를 포함한다.The present invention includes a porous biodegradable polymeric particulate carrier for cell culture and delivery prepared by the above-mentioned method.
본 발명은 상기의 생분해성 다공성 미립담체에 세포를 접종 배양하여 주사 가능한 세포 운반체로 사용하는 방법을 포함한다. The present invention includes a method of inoculating and incubating cells in the biodegradable porous microcarriers and using the same as an injectable cell carrier.
상기에서 언급한 방법에 의해 제조한 생분해성 다공성 미립담체는 발포성 염과 고분자 용액의 농도의 변화에 따라 공극률, 공극의 크기, 미립담체의 크기를 쉽게 조절할 수 있는 것을 특징으로 하며, 이에 각기 다양한 환경을 필요로 하는 여러 종류의 세포의 접종과 배양에 알맞은 다공성 미립담체를 제공할 수 있다.The biodegradable porous particulate carrier prepared by the above-mentioned method is characterized in that the porosity, the pore size, and the size of the particulate carrier can be easily adjusted according to the change in the concentration of the effervescent salt and the polymer solution. It is possible to provide a porous microcarrier suitable for inoculation and culture of various kinds of cells that require the same.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 미립담체 제조법은 기본적으로 W/O/W 이중 유화 방식을 따른다. 이중 유화법은 두 번의 유화 단계를 거치는데 첫 번째, 생분해성 지방족 폴리에스테르계 고분자를 유기 용매에 용해시킨 유기상에 발포성 염을 녹인 수상을 첨가하여 교반한다. The preparation method of the particulate carrier of the present invention basically follows the W / O / W double emulsification method. In the double emulsification method, two emulsification steps are carried out. First, the biodegradable aliphatic polyester polymer is dissolved in an organic solvent and stirred by adding an aqueous phase in which an effervescent salt is dissolved.
이때 상기의 생분해성 지방족 폴레에스테르계 고분자는 폴리(L-락트산), 폴 리(글리콜산), 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산), 폴리(카프로락톤), 폴리(발레로락톤), 폴리(하이드록시 부티레이트) 및 폴리(하이드록시 발러레이트) 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있으며 평균 분자량 50,000∼200,000인 것을 사용할 수 있다. 고분자의 종류에 의존하나 평균 분자량 100,000 정도가 가장 바람직하다. 작은 분자량에서는 기계적으로 안정된 구형의 미립담체를 얻기 어려우며, 큰 분자량에서는 미립담체의 크기를 제어하기 힘들다. At this time, the biodegradable aliphatic polyester-based polymer is poly (L-lactic acid), poly (glycolic acid), poly (D, L-lactic acid-co-glycolic acid), poly (caprolactone), poly (valerolactone) ), Poly (hydroxy butyrate) and poly (hydroxy valerate) can be used, and those having an average molecular weight of 50,000 to 200,000 can be used. Depending on the type of polymer, an average molecular weight of about 100,000 is most preferred. At small molecular weights, it is difficult to obtain mechanically stable spherical particulate carriers, and at large molecular weights, it is difficult to control the size of the particulate carriers.
본 발명에서 사용된 생분해성 고분자를 녹인 유기용매로서 휘발성이 용이하고 수상과 섞이지 않는 메틸렌클로라이드, 클로로포름을 사용하는 것이 바람직하다. As an organic solvent in which the biodegradable polymer used in the present invention is dissolved, it is preferable to use methylene chloride and chloroform, which are easily volatile and do not mix with an aqueous phase.
본 발명에서 사용된 발포성 염으로는 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate), 소듐 바이카보네이트(sodium bicarbonate), 소듐 카보네이트(sodium carbonate) 등이 사용될 수 있으며 그 농도는 20％ 이하로 사용하는 것이 좋다. 그 이상의 경우 많은 기체의 발포로 인해 안정된 구형의 미립담체가 형성되지 않는다.As the effervescent salt used in the present invention, ammonium bicarbonate, sodium bicarbonate, sodium carbonate, and the like may be used, and the concentration thereof is preferably 20% or less. More than that, the foaming of many gases does not form a stable spherical particulate carrier.
본 발명은 W/O 유화액 형성시 발포성 염을 2차 증류수에 녹여 수상으로 첨가하여 유화액을 안정화 시키는 방법을 포함한다. 물에 녹아있는 발포성 염을 유기상에 첨가하여 5000rpm 이상의 빠른 속도로 2∼3분 정도 교반하게 되면 도 1에서 보듯이 분산질인 수상으로부터 암모니아와 이산화탄소 기체가 유기상으로 발포되어 분산된 물방울 주위를 둘러싸게 되고 물방울의 뭉침을 막아 수상이 균일하게 분산된 유화액을 얻을 수 있다. 이때 첨가되는 수상의 부피는 유기상의 부피를 넘을 수 없으며 안정한 구형의 미립담체를 얻기 위해서는 수상의 비율이 40％ 이하가 바람 직하다. 40％ 이상의 비율에서는 안정한 유화액을 얻기 어려우며, 최종 제조된 미립담체의 형태도 매우 불균일해진다. 발포성 염의 농도와 첨가되는 수상의 부피에 따라 생성되는 기체의 농도를 조절가능하며, 이에 공극의 구조도 제어할 수 있다.The present invention includes a method of stabilizing the emulsion by dissolving the effervescent salt in secondary distilled water when forming the W / O emulsion. When the effervescent salt dissolved in water is added to the organic phase and stirred for about 2 to 3 minutes at a high speed of 5000 rpm or more, as shown in FIG. 1, ammonia and carbon dioxide gas are bubbled into the organic phase from the dispersing aqueous phase and surrounded by the surrounding water droplets. As a result, the water droplets can be prevented from being aggregated to obtain an emulsion in which the aqueous phase is uniformly dispersed. At this time, the volume of the aqueous phase added cannot exceed the volume of the organic phase, and in order to obtain a stable spherical particulate carrier, the ratio of the aqueous phase is preferably 40% or less. It is difficult to obtain a stable emulsion at a ratio of 40% or more, and the form of the final prepared microcarrier also becomes very uneven. Depending on the concentration of the effervescent salt and the volume of the aqueous phase added, the concentration of the gas produced can be adjusted, thereby controlling the structure of the pores.
두 번째 유화 단계에서는 상기 발포에 의해 안정화된 W/O 유화액을 두 번째 수상인 10∼15배 부피의 친수성 계면활성제를 포함하는 용액에 분산, 유화시킨다. 이 때 교반속도는 100∼300rpm 범위에서 적용가능하나, 500cc 비이커에서 200rpm 내외가 바람직하다. 교반속도의 선택은 반응 용기의 크기에 의존한다. 분산된 W/O 유화액 내부의 기체가 두 번째 수상으로 방출되는 과정과 유기용매의 증발/제거됨에 따른 폴리에스테르계 고분자가 경화되는 과정을 통해 외부로 열려진 공극을 갖는 다공성 미립 담체가 형성된다. 이를 자연히 침전시켜 과량의 2차 증류수로 계면활성제를 제거하고, -70℃에서 냉동 후 진공 건조하여 미립담체를 수거할 수 있다.In the second emulsification step, the W / O emulsion stabilized by the foaming is dispersed and emulsified in a solution containing 10 to 15 times the volume of the hydrophilic surfactant. At this time, the stirring speed is applicable in the range of 100 to 300rpm, but is preferably about 200rpm in a 500cc beaker. The choice of stirring speed depends on the size of the reaction vessel. Porous particulate carriers having pores opened to the outside are formed through a process in which the gas inside the dispersed W / O emulsion is released to the second water phase and the polyester polymer is cured by evaporation / removal of the organic solvent. This may be naturally precipitated to remove the surfactant with excess distilled water, freeze at -70 ℃ and vacuum dried to collect the particulate carrier.
본 발명에서는 친수성 계면활성제로 0.1∼0.5중량％의 농도로 분자량 13,000∼23,000의 폴리비닐알코올을 사용하는데 다른 계면활성제로 트윈, 트리톤, 브리즈, 폴리비닐프롤리돈 중에서 어는 하나 이상을 선택하여 사용할 수 있다. In the present invention, a polyvinyl alcohol having a molecular weight of 13,000 to 23,000 is used as a hydrophilic surfactant at a concentration of 0.1 to 0.5% by weight. As another surfactant, one or more of freezing among twin, triton, breeze, and polyvinylprolidone can be selected and used. have.
이하, 실시예에서는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
이들 실시예는 본 발명을 오로지 설명하기 위한 것으로 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.These examples are only for illustrating the present invention, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited to these examples according to the gist of the present invention.
<실시예 1> 다공성 생분해성 고분자 미립담체의 제조 Example 1 Preparation of Porous Biodegradable Polymer Microcarriers
무게 평균 분자량 100,000이고 락트산과 글리콜산의 비율이 75:25인 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)(PLAG)을 125mg에서 500mg 까지 변화시켜 가면서 8ml의 메틸렌클로라이드에 용해시킨다. 마찬가지로 암모늄 바이카보네이트를 1중량％에서 10중량％의 농도로 변화시키면서 2.5ml의 2차 증류수에 녹인 후 두 액상을 교반기(homogenizer)를 이용하여 5,000rpm에서 2분간 유화시켰다. 이 W/O 유화액을 150ml의 0.1중량％ 폴리비닐알코올 용액에 넣고 프로펠러형 교반기를 사용하여 200rpm에서 4시간 동안 교반하였다. 용매가 증발한 후 미립담체를 침전시켜 2차 증류수로 3번 세척하고 -70℃에서 냉동 후 진공 건조하여 미립담체를 수거하였다. Poly (D, L-lactic-co-glycolic acid) (PLAG) having a weight average molecular weight of 100,000 and a ratio of lactic acid to glycolic acid of 75:25 is dissolved in 8 ml of methylene chloride, varying from 125 mg to 500 mg. Similarly, ammonium bicarbonate was dissolved in 2.5 ml of distilled water with a concentration of 1% by weight to 10% by weight, and then the two liquid phases were emulsified at 5,000 rpm using a homogenizer for 2 minutes. This W / O emulsion was placed in 150 ml of 0.1 wt% polyvinyl alcohol solution and stirred at 200 rpm for 4 hours using a propeller type stirrer. After evaporation of the solvent, the particulate carrier was precipitated, washed three times with secondary distilled water, frozen at −70 ° C., and vacuum dried to collect the particulate carrier.
PLGA의 농도와 암모늄 바이카보네이트 농도의 변화에 따른 공극과 미립담체 크기, 그리고 수분 흡수율의 변화를 표 1과 표 2에 나타냈다. Table 1 and Table 2 show changes in pore size, particle size, and water absorption according to the PLGA concentration and ammonium bicarbonate concentration.
표 1. 암모늄 바이카보네이트 농도에 따른 공극과 미립담체의 크기 변화 Table 1. Variation of pore size and particulate carrier according to ammonium bicarbonate concentration
여기서 수분흡수율은 공극률의 간접적 표현이며 다음과 같이 계산한다. Where water absorption is an indirect representation of the porosity and is calculated as:
수분흡수율=(담체의 습윤 무게 - 담체의 건조 무게)/ 담체의 건조 무게 Water absorption = (wet weight of carrier-dry weight of carrier) / dry weight of carrier
표 1에서 보듯이 미립담체의 공극의 직경과 수분 흡수율은 발포성 염인 암모늄 바이카보네이트의 농도에 따라 조절가능하며, 암모늄 바이카보네이트의 농도가 10중량％ 일 때 공극률은 99％에 달하였다. As shown in Table 1, the diameter and water absorption of the pores of the particulate carrier can be adjusted according to the concentration of the ammonium bicarbonate, which is an effervescent salt, and the porosity reached 99% when the concentration of the ammonium bicarbonate was 10% by weight.
표 2. 고분자 용액의 농도에 따른 공극과 미립담체의 크기 변화Table 2. Variation of pore size and particulate carrier according to the concentration of polymer solution
도 2a, 도 2b, 도 2c, 도 2d는 표 2에서 PLGA 농도별로 제조한 다공성 미립담체의 주사전자현미경 사진으로서 유기상의 고분자 농도를 조절함으로서 여러 형태와 크기의 다공성 구조를 얻을 수 있음을 확인하였다.2A, 2B, 2C, and 2D are scanning electron micrographs of porous particulate carriers prepared for each PLGA concentration in Table 2, and it was confirmed that porous structures having various shapes and sizes can be obtained by controlling the polymer concentration of the organic phase. .
<실시예 2> 세포 접종과 배양 Example 2 Cell Inoculation and Culture
실시예 1에서와 같이 제조한 다공성 미립담체의 세포 배양 적합성을 확인하기 위하여 연골세포(chondrocyte)를 사용하여 담체에 접종 후 배양하였다. 초기 2.1 × 106 농도로 세포를 미립담체에 주입하고 세포 배양 플레이트에서 37℃, 5％ CO2 배양기로 배양하였다. 24시간 후 세포가 점착된 미립담체를 나일론 메시로 걸러내어 스피너 플라스크로 옮겨 7일 동안 부유 배양을 시도하였다. 도 3은 5일 후의 세포가 점착된 미립담체의 공초점 레이저 주사현미경 사진과 주사전자현미경 사진으로 세포가 다공성 미립담체 표면과 내부에 걸쳐 골고루 분포하고 성장하였음을 확인할 수 있었다.In order to confirm the cell culture suitability of the porous particulate carrier prepared as in Example 1, the cells were cultured after inoculation into a carrier using chondrocytes. Cells were injected into the carrier at an initial 2.1 × 10 6 concentration and incubated in a cell culture plate at 37 ° C., 5% CO 2 incubator. After 24 hours, the cell-adhered particulate carriers were filtered with a nylon mesh and transferred to a spinner flask for suspension culture for 7 days. 3 shows confocal laser scanning micrographs and scanning electron micrographs of the cells to which the cells adhered after 5 days showed that the cells were evenly distributed and grown throughout the surface and the interior of the porous particles.
도 3a은 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 다공성 미립 담체에 연골세포 (chondrocyte)를 접종하고 5일 배양 후 관찰한 공초점 레이저 주사현미경 사진이고, 도 3b는 세포가 둘러싸고 있는 미립담체들의 주사전자현미경 사진이고, 도 3c는 다공성 표면에 점착된 세포의 주사전자현미경 사진이다. Figure 3a is a confocal laser scanning micrograph observed after inoculation of chondrocyte (chondrocyte) to the porous particulate carrier prepared according to Example 1 of the present invention after 5 days of culture, Figure 3b is the injection of the microparticles surrounding the cells An electron micrograph, Figure 3c is a scanning electron micrograph of the cells adhered to the porous surface.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 W/O 유화액 형성시 발포성 염을 수상에 녹여 첨가하여 빠른 속도의 교반에 의해 기체를 발생시키고, 이 기체가 발포된 유화액을 재분산, 유화시키는 W/O/W 이중 유화과정을 통하여 상기 발생된 기체에 의해 외부로 열려진 다공성 구조를 갖는 미립 담체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이렇게 제조된 미립담체는 생분해성이며, 높은 공극율과, 공극간의 상호연결성을 지니고 있어 세포 배양에 적합한 특성을 지닌다. 또한 주사기를 통해 생체내 주입 가능한 크기를 가지고 있기 때문에 손상된 조직 재생용 세포 전달체로 효과적이다.As described above, the present invention is to form a W / O emulsion in the form of a dissolved salt dissolved in the water phase to generate a gas by agitation of a high speed, the gas is foamed W / O / It relates to a method for producing a particulate carrier having a porous structure opened to the outside by the generated gas through W double emulsification process. The microcarriers thus prepared are biodegradable, have high porosity, and interconnection between pores, and thus have characteristics suitable for cell culture. It is also effective as a cell carrier for damaged tissue regeneration because it has a size that can be injected in vivo through a syringe.
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