KR20070073743A

KR20070073743A - 항체 및 그 이용

Info

Publication number: KR20070073743A
Application number: KR1020077005627A
Authority: KR
Inventors: 미나코 호시; 코지 나이토; 쇼우지 이데노
Original assignee: 미쓰비시 가가꾸 가부시키가이샤; 미츠비시 웰파마 가부시키가이샤
Priority date: 2004-08-11
Filing date: 2005-08-11
Publication date: 2007-07-10
Also published as: JPWO2006016644A1; EP1787998A4; JP4820757B2; WO2006016644A1; AU2005272396A1; CA2576405A1; US8168188B1; CN101080421A; EP1787998A1

Abstract

본 발명은, 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 섬유에 대한 반응성보다 높은 항체 등을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 상기 항체 중에는 아밀로스페로이드의 형성에 대한 저해활성, 또는 아밀로스페로이드에 의한 신경세포 사멸 유도에 대한 저해활성을 갖는 것이 있고, 이 항체는 알츠하이머병의 치료/및 예방약, 또는 그 스크리닝, 알츠하이머병 개체 검출 방법 및 시약등에 이용할 수 있다.

Description

항체 및 그 이용{ANTIBODY AND UTILIZATION OF THE SAME}

본 발명은, 아밀로스페로이드에 대한 높은 반응성을 갖는 신규의 항체 및 그 이용법에 관한 것이다.

알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴 무도병, 프리온병 등의 가령(加齡)에 따라 발증(發症)하는 복수의 신경변성질환에 있어서, 현재 「이상 구조 단백질」이 공통의 발증 기구로서 주목받고, 그 분자 실체의 탐색이 행해지고 있다. 알츠하이머병에 대해서는 아밀로이드 β 단백질(Aβ)을 주성분으로 하는 초로성반점[Selkoe, D.J., Annu. Rev. Neurosci., 12, 463-490(1989), 및 Glenner, G. G. and Wong, C. W., Biochem. Biophys. Res. Commun., 120(3), 885-890(1984)을 참조]과, 인산화된 타우 단백질을 주성분으로 하는 신경원섬유 변화(Paired Helical Filament; PHF)[Ihara, Y. et al., J. Biochem., 99, 1807-1810(1986), 및 Grundke-Iqbal, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 83, 4913-4917(1986)을 참조]의 2종의 섬유성 응집체가 뇌에 침착하는 것이 병리학적 특징으로서 보고되어 있다. 또한 최근, 복수의 다양한 병의 원인에 의해 발증한다고 생각되어 온 알츠하이머병 연구에 있어서, 아밀로이드 β 단백질의 침착이 모두 공통인 발증 경로라고 생각되어 왔다. 아밀로이드 β 단백질은, 그 전구체 물질(Amyloid Precursor Protein; APP)로부터 주로 40 잔기(Aβ_1-40) 내지는 42 잔기(Aβ_1-42)의 분자종으로서 추출되어 발생하는 펩티드이고, 정상인에 있어서도 항상성을 유지한 생성·분해 과정이 진행되고 있지만, 알츠하이머병에 있어서의 아밀로이드 β 단백질의 지나친 침착은 추출 과정, 또는 분해 과정에서의 탈 제어의 결과로 생각된다. 본 명세서에서는, 전자(Aβ_1-40)를 「아밀로이드 β 40」, 「아밀로이드 β 40 모노머」 또는 「아밀로이드 β 40 모노머 단백질」과, 또한 후자(Aβ_1-42)를 「아밀로이드 β 42」, 「아밀로이드 β 42 모노머」 또는 「아밀로이드 β 42 모노머 단백질」이라고 칭하는 경우가 있다. 또한, 43 잔기(Aβ_1-42)의 분자종으로서도 미량이지만 추출되어 발생하고, 이것을 「아밀로이드 β 43」, 「아밀로이드 β 43 모노머」 또는 「아밀로이드 β 43 모노머 단백질」이라고 칭하는 경우가 있다.

침착한 아밀로이드 β 단백질은 신경세포에 대하여 신경 독으로서 작용하여 시냅스의 변성과 그에 계속되는 신경세포 사멸을 야기하고, 이것이 알츠하이머병의 진행성 치매의 원인이 되는 선택적인 신경세포 탈락의 기구라고 생각되고 있다. 또한, 아밀로이드 β 단백질은 수용성 펩티드로서 세포 외에 방출된 상태에서는 신경세포 사멸 활성(이하, 본 명세서중에 있어서 신경세포 사멸 활성을 「독성」으로 칭하는 경우가 있음)을 나타내지 않고, 자기회합하여 아밀로이드 β 섬유를 형성하여 처음으로 독성을 획득하는 것이 보고되어 있다[Lorenzo, A. and Yankner, B. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91,12243-12247(1994)를 참조]. 이 아밀로이드 β 섬유를 포함하는 독성 아밀로이드 β 단백질 함유액을 신경계의 배양세포에 고 농도로 첨가하면, 이들 세포를 죽음에 이르게 하는 것이 알려져 있기 때문에, 알츠하이머병에 있어서는 이 아밀로이드 β 섬유가 신경세포 사멸을 유발하고 있는 본체라고 생각되어 왔다.

따라서, 이 아밀로이드 β 섬유를 포함하는 독성 아밀로이드 β 단백질의 첨가에 의해 신경계 세포 등에 세포사를 유발하는 실험계는 알츠하이머병에 있어서의 신경세포 사멸을 반영하고 있다고 간주되고, 신경세포 사멸 억제제의 스크리닝 등에 많이 이용되어 왔다. 그러나 최근, (1) 아밀로이드 β 섬유를 포함하는 독성 아밀로이드 β 단백질 함유액으로 신경세포 사멸을 유도하는 데 요구되는 농도는 수 10 μM이며[Yankner, B. A., et. al., Science, 250, 279-282(1990)를 참조], 알츠하이머병 환자의 뇌에 존재하는 아밀로이드 β 단백질 농도의 1000배 이상 높은 농도이다, (2) 알츠하이머병 환자의 뇌에 있어서 아밀로이드 β 섬유의 침착량이 기억이나 인지기능 등의 고차기능의 장해 정도와 반드시 상관하지 않고, 대량의 아밀로이드 β 섬유의 침착을 가지면서 어떠한 임상증상을 나타내지 않는 경우도 있는 것, (3) 또한, 뇌 속의 아밀로이드 β의 침착 부위와 신경세포 탈락 부위가 반드시 일치하지 않는다, (4) APP 과잉 발현 마우스의 뇌에 있어서 아밀로이드 β 섬유의 침착 이전, 또는 침착없이 학습 행동 이상이 발생한다, (5) 알츠하이머병 환자의 뇌에 있어서의 수용성 아밀로이드 β 단백질 함량의 증가는 침착보다 10년 이상 선행하는 등, 아밀로이드 β 단백질의 독성의 본체가 아밀로이드 β 섬유가 아닌 것을 시사하는 사실이 보고되어 왔다.

본 발명자들은, 먼저 알츠하이머병 등의 환자의 생체 내에 존재하는 자기회 합한 아밀로이드 β 단백질과 동등한 농도로 신경계 세포에 세포사를 유도하는, 높은 독성을 갖는 자기회합형 아밀로이드 β 단백질 함유액, 및 그 조제 방법을 제안하였다(일본 특허 공개 제2001-247600호 공보). 또한, 상기 자기회합형 아밀로이드 β 단백질 함유액에 포함되는 신경세포독성의 본체를 분리하는 방법을 발견하고, 해석을 행한 바, 입자 지름 약 10 내지 약 20 nm 정도의 입상의 형태를 갖는 자기회합형 아밀로이드 β 단백질인 것을 알고, 이것을 아밀로스페로이드라고 명명하였다. 본 명세서에서는, 이 명명에 따라 입자 지름 약 10 내지 약 20 nm 정도의 입상의 형태를 갖는 자기회합형 아밀로이드 β 단백질을 「아밀로스페로이드」라고 칭하는 경우가 있다.

아밀로스페로이드는, 알츠하이머병 환자의 뇌 속에 존재하는 아밀로이드 β 단백질과 동등한 농도로 신경세포 사멸을 유도하고, 또한 아밀로스페로이드에 의해 신경이 죽음에 이르는 과정에서 또 하나의 병리학적 마커인 타우 단백질의 인산화를 야기하는 등, 알츠하이머병으로 일어나고 있는 병태와 합치하기 때문에, 뇌 속에 있어서의 아밀로이드 β 단백질의 독성의 본체라고 생각되었다. 따라서 (1) 아밀로스페로이드의 형성을 저해하는 항체, 또는 (2) 아밀로스페로이드의 신경계 세포에 대한 독성을 저해하는 항체를 취득하면, 알츠하이머병의 치료 또는 예방약으로서 이용할 수 있다. 또한, (3) 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 모노머나 아밀로이드 β 섬유 등에 대한 반응성보다 높은 항체를 취득하면 알츠하이머병의 진단을 위한 측정에의 응용도 가능하다.

아밀로스페로이드를 항원으로 하는 항체의 제작 방법은, 이미 공지한 방법이 다. 그러나 이하의 이유에 의해, 상기 (1) 내지 (3)에 기재한 성질을 갖는 항체는 취득되어 있지 않았다; (a) 아밀로스페로이드는 아밀로이드 β 단백질의 회합체이며, 일반적으로 회합체 단백질에 대한 항체의 취득은 곤란하다, (b) 아밀로스페로이드의 회합 기구나 구조와 기능과의 관련이 불명한 것이나, (1)이나 (2)의 기능을 항체가 갖기 위해서 필수적인 항원 부분도 불명한 것 등으로부터, 특히 아밀로스페로이드에 특이적으로 반응하고, 이 단백질의 신경계 세포에 대한 독성을 저해하는 항체의 취득은 곤란하다.

본 발명은, 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 섬유에 대한 반응성보다 높은 항체, 아밀로스페로이드에 대한 높은 반응성을 가지면서, 아밀로스페로이드의 신경계 세포에 대한 독성의 저해활성이나 아밀로스페로이드의 형성 저해활성을 갖는 항체, 및 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 높은 반응성을 가지며, 아밀로스페로이드의 형성 저해활성을 갖는 항체를 취득하는 것을 해결해야 할 과제로 한다. 또한 본 발명은, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공하는 것을 해결해야 할 과제로 한다. 또한 본 발명은, 상기 항체를 이용한 알츠하이머병의 치료 및/또는 예방약의 스크리닝 방법, 및 알츠하이머병 개체의 검출 방법을 제공하는 것을 해결해야 하는 과제로 한다. 또한 본 발명은, 상기 항체를 이용한 신경세포 보호제, 아밀로스페로이드 형성 저해제, 알츠하이머병의 검출을 위한 시약, 및 알츠하이머병의 치료 및/또는 예방약 등의 의약을 제공하는 것을 해결해야 하는 과제로 한다. 또한 본 발명은, 상기 항체를 검출하기 위한 고상담체를 제공하는 것을 해결해야 할 과제로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 뉴질랜드 화이트종 집토끼 1마리에 대하여, 아밀로스페로이드를 피하에 면역하고, 이것을 아쥬반트의 종류를 바꿔 9회 반복하였다. 이 동물로부터 취득한 혈청에 대해서 도트블롯 해석이나 전자현미경 관찰에 의해 아밀로스페로이드와의 결합성을 해석하여 폴리크로날 항체를 취득한 바, 이 항체는 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 섬유에 대한 반응성보다 높은 것, 아밀로스페로이드에 의한 신경세포 사멸 유도에 대한 저해활성을 더 가지며, 또한 아밀로스페로이드의 형성을 저해하는 활성을 갖는 것을 발견하였다. 또한, 아밀로스페로이드 및/또는 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 높은 반응성을 갖는 항체는 아밀로스페로이드의 형성을 저해하는 활성을 갖는 것을 발견하였다. 또한, 아밀로스페로이드를 면역된 BALB/c 마우스 비장 세포로부터, 상기 폴리크로날 항체와 유사한 에피토프를 인식하는 모노크로날 항체의 수립에도 성공하였다. 본 발명은 이들의 지견에 기초하여 행해진 것이다.

즉 본 발명에 의하면, 이하의 발명이 제공된다.

(1) 이하의 어느 하나 이상의 특징을 갖는 항체:

(i) 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 섬유에 대한 반응성보다 높음;

(ii) 아밀로스페로이드에 대한 높은 반응성을 가지며, 아밀로스페로이드에 의한 신경세포 사멸 유도에 대한 저해활성을 가짐;

(iii) 아밀로스페로이드에 대한 높은 반응성을 가지며, 아밀로스페로이드의 형성에 대한 저해활성을 가짐;

(iv) 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 높은 반응성을 가지며, 아밀로스페로이드의 형성에 대한 저해활성을 가짐.

(2) 항체의 아밀로스페로이드 및 아밀로이드 β 섬유에 대한 반응성을 동일한 항체 농도 및 항체량 및 동일한 항원 단백질 농도 및 항원 단백질량을 이용하여 비교하는 시스템에 있어서, 항체의 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 섬유에 대한 반응성의 2배 이상인 (1)에 기재한 항체.

(3) 항체의 아밀로스페로이드 및 아밀로이드 β 섬유에 대한 반응성을 동일한 항체 농도 및 항체량 및 동일한 항원 단백질 농도 및 항원 단백질량을 이용하여 비교하는 시스템에 있어서, 항체의 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 섬유에 대한 반응성의 10배 이상인 (1) 또는 (2)에 기재한 항체.

(4) 항체의 아밀로스페로이드 및 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 반응성을 동일한 항체 농도 및 항체량 및 동일한 항원 단백질 농도 및 항원 단백질량을 이용하여 비교하는 시스템에 있어서, 항체의 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 반응성의 2배 이상인 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재한 항체.

(5) 항체의 아밀로스페로이드 및 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 반응성을 동일한 항체 농도 및 항체량 및 동일한 항원 단백질 농도 및 항원 단백질량을 이용하여 비교하는 시스템에 있어서, 항체의 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 반응성의 5배 이상인 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재한 항체.

(6) 아밀로스페로이드를 항원으로서 이용하여 얻어지는 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재한 항체.

(7) 폴리크로날 항체인 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재한 항체.

(8) 모노크로날 항체인 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재한 항체.

(9) 아밀로스페로이드에 대한 해리정수(dissociation constant)가 10^-9이하인 (8)에 기재한 모노크로날 항체.

(10) 아밀로이드 β 모노머 단백질의 N 말단을 에피토프로서 인식하는 (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재한 항체.

(11) 수탁 번호(수령 번호) FERM ABP-10392, FERM ABP-10393, 또는 FERM ABP-10394 중 어느 하나를 갖는 하이브리도마에 의해 생산되는 모노크로날 항체.

(12) 수탁 번호(수령 번호) FERM ABP-10392, FERM ABP-10393, 또는 FERM ABP-10394 중 어느 하나를 갖는 하이브리도마.

(13) 피검물질과 (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재한 항체를 아밀로스페로이드에 접촉시키고, 피검물질의 아밀로스페로이드에의 결합성을 지표로서 후보 물질을 선택하는 것을 포함하는 알츠하이머병의 치료 및/또는 예방약의 스크리닝 방법.

(14) 알츠하이머병의 의심이 있는 개체로부터 취득한 생체 시료를 (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재한 항체와 접촉시키고, 이 샘플중의 이 항체와 반응하는 물질의 유무를 측정하는 것을 포함하는 알츠하이머병 개체의 검출 방법.

(15) (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재한 항체를 포함하는 신경세포 보호제.

(16) (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재한 항체를 포함하는 아밀로스페로이드 형성 저해제.

(17) (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재한 항체를 포함하는 알츠하이머병의 검출을 위한 시약.

(18) (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재한 항체를 포함하는 의약.

(19) (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재한 항체를 포함하는 알츠하이머병의 치료 및/또는 예방약.

(20) 아밀로스페로이드를 피복하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재한 항체를 검출하기 위한 고상담체.

본 발명의 항체는, 이하의 (i) 내지 (iv) 중 어느 하나 이상의 특징을 갖는 항체이다(이하, 이들을「항 아밀로스페로이드 항체」라고 칭하는 경우가 있다).

(i) 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 섬유에 대한 반응성보다 높다;

(ii) 아밀로스페로이드에 대한 높은 반응성을 가지며, 아밀로스페로이드에 의한 신경세포 사멸 유도에 대한 저해활성을 갖는다;

(iii) 아밀로스페로이드에 대한 높은 반응성을 가지며, 아밀로스페로이드의 형성에 대한 저해활성을 갖는다;

(iv) 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 높은 반응성을 가지며, 아밀로스페로이드의 형성에 대한 저해활성을 갖는다.

본 발명은 또한, 상기 항체를 이용한 알츠하이머병의 치료 및/또는 예방약의 스크리닝 방법, 알츠하이머병 개체의 검출 방법, 및 알츠하이머병의 치료 및/또는 예방약등의 의약에 관한 것이다. 이들을 이하에 상세히 설명하지만, 이하에 기재하는 구성 요건의 설명은 본 발명의 실시형태의 일례(대표예)이며, 이들의 내용에는 특정되지 않는다.

(1) 항 아밀로스페로이드 항체

제1 형태에 의하면, 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체는 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 섬유에 대한 반응성보다 높은 항체이다. 「아밀로스페로이드에 대한 반응성」이란, 후술하는 방법으로 형성된 아밀로스페로이드에 반응하는 것을 의미한다. 이 항체의 반응성 측정은, 그 자체 통상 이용되는 방법에 의해 행할 수 있고, 이들의 방법으로 측정한 경우에, 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 섬유에 대한 반응성보다 높으면, 그 항체는 본 발명의 항체에 포함된다. 바람직한 형태에 의하면 항체의 아밀로스페로이드에 대한 반응성은 아밀로이드 β 섬유에 대한 반응성의 약 2배 이상이며, 더 바람직하게는 약 10배 이상이다. 또한, 아밀로스페로이드에 특이적으로 반응하고, 아밀로이드 β 섬유에 반응하지 않는 것을 특징으로 하는 항체도 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체에 포함된다. 또한, 아밀로이드 β 모노머 단백질과 비교하여도 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 높은 항체도 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체에 포함된다. 이 경우의 항 아밀로스페로이드 항체의 아밀로스페로이드에 대한 반응성은, 바람직하게는 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 반응성의 약 2배 이상이고, 더 바람직하게는 약 5배 이상이다(이들의 경우, 동일한 항체 농도 및 양, 동일한 항원 단백질 농도 및 항원 단백질량을 이용하였을 때의 반응성으로 비교함). 이러한 아밀로스페로이드에 대한 항체가 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 반응성보다 높은 항체 중, 반응성이 약 5 내지 약 10배 정도의 차이인 것은 특히 후술하는 아밀로스페로이드의 형성에 대한 저해활성이 높다.

본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체가 높은 반응성을 나타내는 「아밀로스페로이드」란, 아밀로이드 β 모노머 단백질이 자기회합하고, 입상의 형태를 갖는 것이다. 「입상의 형태」란 입상을 나타내고 있으면 어떠한 형상이라도 좋고, 과립형, 세립형, 결정, 응집 덩어리 등을 모두 포함한다. 입자 지름은 통상 약 10 내지 약 20 nm, 바람직하게는 약 10 내지 약 15 nm, 보다 바람직하게는 약 10 내지 약 12 nm, 특히 바람직하게는 약 12 nm 부근이다. 또한, 아밀로스페로이드는 단백질 농도 약 1 μg/ml 이하, 바람직하게는 약 0.45 μg/ml 이하에서 신경계 세포에 세포사를 유도하는 높은 신경세포 사멸 활성을 갖는다. 또한, 이러한 물성을 갖는 아밀로스페로이드는 글리세롤 밀도경사 원심법에 의해 분획하였을 때에, 글리세롤 농도가 약 15% 이상의 분획으로 얻어진다.

본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체의 항원에 대한 반응성의 측정 방법으로서는, 예컨대 웨스턴블롯팅법, 도트블롯팅법, ELISA법 등의 그 자체 기지의 면역학적 측정법이나, 전자현미경 관찰에 의한 방법 등을 들 수 있다. 또한 이 경우의 비교 대조로서의 아밀로이드 β 단백질 모노머란, 약 40의 아미노산 잔기로 이루어지는 단백질이며, 생체에 있어서는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로부터 프로테아제에 의한 프로세싱으로 생산된다. 이 프로테아제의 종류나 그 후의 수식에 의해 여러 가지 종류가 존재하는 것이 알려져 있지만, 분비 직후에는 C 말단의 아미노산 잔기의 길이의 차이에 의해 아밀로이드 β 40(Aβ_1-40: 서열 번호 1)과 아밀로이드 β 42(Aβ_1-42: 서열 번호 2)가 주로 존재하고, 또한 아밀로이드 β 43(Aβ_1-43: 서열 번호 3)이 미량으로 존재하며, 아밀로이드 β 단백질 모노머는, 이들 중 어느 하나를 포함한다. 또한, 이들의 부분 폴리펩티드나 유도체도 포함된다. 또한 아밀로이드 β 섬유란, 아밀로이드 β 단백질이 자기회합하여 섬유상으로 된 것을 의미하고, 신경세포 사멸 활성을 갖는다. 이러한 아밀로이드 β 섬유는, 예컨대 생체 내로부터 취득되는 것이나, Lorenzo, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91,12243-12247(1994)에 기재한 방법으로 제조되는 것도 포함한다.

제2 형태에 의하면, 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체는, 아밀로스페로이드에 대한 높은 반응성을 가지며, 아밀로스페로이드에 의한 신경세포 사멸 유도에 대한 저해활성을 갖는 항체이다. 「아밀로스페로이드에 의한 신경세포 사멸 유도」란, 상기한 또는 후술의 방법으로 조제되는 아밀로스페로이드가 신경세포에 대하여 세포사를 유도하는 활성을 의미하고, 유도되는 세포사는 아포토시스 또는 네크로시스 중 어느 것이라도 좋다. 또한, 신경세포란, 신경계 세포이면 특별히 제한은 없고, 포유동물(사람, 래트, 마우스, 원숭이, 돼지 등) 유래의 신경계 세포가 이용된다. 초대 배양세포로서는, 상기 동물의 해마, 및 전뇌 기저부·대뇌피질 등으로부터 취득한 것을 들 수 있다. 또한 상기 동물의 해마 등의 기관을 배양한 세포도 포함된다. 이러한 활성을 갖는 항 아밀로스페로이드 항체의 특징으로서는, 예컨대 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 섬유나 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 반응성보다 높은 것 등을 들 수 있다. 이들 중, 아밀로스페로이드에의 반응성이 아밀로이드 β 모노머 단백질에의 반응성의 약 10 내지 약 20배의 항 아밀로스페로이드 항체가 바람직하게 이용된다.

본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체가 갖는, 신경세포 사멸 유도에 대한 저해활성이란, 상기의 아밀로스페로이드에 의한 신경세포 사멸 유도를 완전히 저해하는 능력을 갖는 것을 의미하지만, 항체의 투여량에 의해서는 부분적으로 저해하는 경우도 포함한다. 저해활성의 구체적인 측정 방법에 대해서는 후술과 같다.

제3 형태에 의하면, 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체는 아밀로스페로이드에 대한 높은 반응성을 가지며, 아밀로스페로이드의 형성에 대한 저해활성을 갖는 항체이다. 「아밀로스페로이드의 형성에 대한 저해활성을 갖는다」란, 상기 아밀로이드 β 모노머 단백질이 자기회합하여 아밀로스페로이드가 형성되는 조건하에서, 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체를 적량 존재시키는 것에 의해, 아밀로스페로이드가 형성되지 않는 것을 의미한다. 이 경우의 항 아밀로스페로이드 항체의 존재량은 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 각 항체의 반응성에 따라 변화되지만, 예로서는 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대하여 2 내지 20배량(몰비) 정도가 바람직하다. 이와 같은 항 아밀로스페로이드 항체로서는, 특히 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 높은 반응성을 갖는 것도 포함된다. 또한, 아밀로스페로이드와 함께 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대해서도 높은 반응성을 나타내는 것으로, 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 반응성의 약 5 내지 약 10배 정도인 것 등도 아밀로스페로이드의 형성을 저해하는 활성을 갖는 항체로서 들 수 있다.

아밀로스페로이드가 형성되지 않는 것은, 상기한 아밀로스페로이드의 특징이 보이지 않는 것을 관찰할 수 있는 것이면 어떠한 방법에 의해서도 확인할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대 아밀로스페로이드의 입도분포 및 입자 지름은 전자현미경 관찰에 의한 방법, 인시튜(in situ) 원자간력 현미경에 의한 방법, 체분석법, 크로마토그래피법, 침강법 등이 이용되지만, 그 중에서도 전자현미경 관찰에 의한 방법이 바람직하다. 이하에, 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체의 구체적인 제조 방법, 및 상기한 특징의 해석 방법에 대해서 상세히 설명한다.

제4 형태에 의하면, 본 발명의 항체는 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 높은 반응성을 가지며, 아밀로스페로이드의 형성에 대한 저해활성을 갖는 항체이다.

(2) 아밀로스페로이드(항원)의 제작

본 발명의 항체는, 이하의 성질을 갖는 아밀로스페로이드를 항원으로서 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서 아밀로스페로이드란, 아밀로이드 β 단백질이 자기회합하고, 입상의 형태를 갖는 것이다. 「입상의 형태」란 입상을 나타내고 있으면 어떠한 형상이라도 좋고, 과립형, 세립형, 결정, 응집 덩어리 등을 모두 포함한다. 입자 지름은 통상 약 10 내지 약 20 nm, 바람직하게는 약 10 내지 약 15 nm, 보다 바람직하게는 약 10 내지 약 12 nm, 특히 바람직하게는 약 12 nm 부근이다. 또한, 아밀로스페로이드는 단백질 농도 약 1μg/ml 이하, 바람직하게는 약 0.45 μg/ml 이하에 신경계 세포에 세포사를 유도하는 높은 신경세포 사멸 활성을 갖는다. 또한, 이러한 물질을 갖는 아밀로스페로이드는 글리세롤 밀도경사 원심법에 의해 분획하였을 때에, 글리세롤 농도가 약 15% 이상의 분획으로 얻어진다.

이러한 아밀로스페로이드는, 우선 아밀로이드 β 단백질을 포함하는 수용액을 대류시킴으로써(제1 공정) 조제할 수 있다. 또한, 아밀로스페로이드가 고효율로 함유되는 용액을 조제하기 위해서는 대류시킨 수용액중의 아밀로스페로이드를 분획하는(제2 공정) 방법이 이용된다. 본 발명의 항체의 항원에는, 상기한 어느 하나의 아밀로스페로이드 함유액도 이용할 수 있다.

상기에서 「아밀로이드 β 단백질」이란, 약 40의 아미노산 잔기로 이루어지는 단백질이며, 생체에 있어서는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로부터 프로테아제에 의한 프로세싱으로 생산된다. 이 프로테아제의 종류나 그 후의 수식에 의해 여러 가지 종류가 존재하는 것이 알려져 있지만, 분비 직후에는 C 말단의 아미노산 잔기의 길이의 차이에 의해 아밀로이드 β 40(Aβ_1-40: 서열 번호 1)과 아밀로이드 β 42(Aβ_1-42: 서열 번호 2)가 주로 존재하고, 아밀로이드 β 43(Aβ_1-43: 서열 번호 3)이 미량으로 존재한다. 아밀로스페로이드의 조제에는, 예컨대 분비 직후의 아밀로이드 β 단백질의 전체 길이 분자종인 Aβ_X-40, Aβ_X-42또는 Aβ_X-43, 또는 이들의 변이체 또는 유도체가 바람직하게 이용되지만, 그 중에서도 특히 Aβ_1-40 또는 Aβ_1-42가 바람직하다. 또한, 아밀로이드 β 단백질은 펩티드 합성기 등을 이용하여 합성한 것, 시판의 것, 또는 생체 시료로부터 추출 정제한 것 등, 어떠한 것을 이용하여도 좋다. 아밀로이드 β 단백질로서 합성 펩티드를 이용하는 경우, 그 합성, 추출 정제 방법은 그 자체 공지의 통상 이용되고 있는 방법을 이용할 수 있다. 또한, 합성 펩티드의 정제도는 고속액체크로마토그래피에 있어서 단일의 피크를 얻을 수 있는 정도 행하면 충분하지만, 정제 방법으로서는, 예컨대 겔 여과, 고속액체크로마토그래피 등이 이용된다. 본 명세서에서는 「아밀로이드 β 단백질」을 「아밀로이드 β 모노머」, 「아밀로이드 β 모노머 단백질」이라고 칭하는 경우도 있다. 이와 같이 하여 얻어진 아밀로이드 β 단백질은, 예컨대 멸균 정제수에 용해하고, 아밀로스페로이드 함유액의 조제에 사용한다. 용해에 이용하는 멸균 정제수의 양은 아밀로이드 β 단백질이 용해하는 범위이면 좋지만, 바람직하게는 수용액중의 아밀로이드 β 단백질의 농도가 약 50 nM 내지 약 2 mM, 바람직하게는 약 1μM 내지 약 1 mM, 더 바람직하게는 약 50 내지 약 700 μM가 되는 범위이다. 이 용액을 적당한 염농도로 조절하는 것이 바람직하다. 염농도는, 아밀로이드 β 단백질이 용해되는 범위이면 어떠한 것이어도 좋지만, 예컨대 최종 pH가 약 3 내지 약 11, 바람직하게는 약 5.5 내지 약 8.5, 보다 바람직하게는 약 7.5이고, 염이 약 1M 이하인 것이 바람직하다. 이러한 염농도로 조절하는 방법으로서, 예컨대 PBS(-)를 아밀로이드 β 단백질 수용액과 등량 추가하는 방법이 이용된다. 용해 방법은 아밀로이드 β 단백질이 적당한 양의 적당한 염농도의 용액에 완전히 용해하는 방법이면 특별히 제한은 없다.

아밀로스페로이드 함유액의 조제 방법의 제1 공정은, 예컨대 일본 특허 공개 제2001-247600호 공보에 기재되어 있는 것을 들 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 아밀로스페로이드 함유액은, 이대로도 신경세포 사멸을 유도하는 활성을 가지며, 본 발명의 항원으로서 이용하는 것은 가능하지만, 제2 공정으로서 분획을 행하고, 더 높은 신경세포 사멸 활성을 갖는 분획을 얻을 수 있다. 분획의 방법으로서는, 예컨대 일본 특허 공개 제2002-105099호 공보에 기재한 방법이 이용된다. 이렇게 하여 얻어지는 아밀로스페로이드 함유액은 필요에 따라 농축 등의 처리를 행한 후, 항원으로서 이하의 면역 공정에 이용된다.

아밀로스페로이드가 형성되어 있는 것의 확인 방법으로서는, 후술의 신경세포 사멸 활성을 해석하는 방법이나, 전자현미경에 의해 측정하는 방법 등을 들 수 있다. 전자현미경의 측정 방법은 아밀로스페로이드의 입자 지름을 분석할 수 있는 방법이고, 또한 아밀로스페로이드의 자기회합이 손상을 받지 않고 관찰할 수 있는 방법이면 어떠한 방법이라도 좋다. 구체적으로는, 예컨대 우선, 직경 18 mm 정도의 페트리 접시 등에 30 내지 40℃의 증류수를 넣고, 그 수면에 콜로디온 1.5%(W/V) 초산이소아밀 용액 등을 약 30 μl 정도 적하하며, 즉시 용매가 휘발하여 발생하는 박막을 얻는다. 이 지지막을 그리드에 붙여 건조시킨 후, 카본을 진공증착하여 글로 방전에 의한 친수화 처리 장치를 이용하여 표면을 친수화한다. 다음에, 이 지지막을 붙인 그리드면을 밑으로 하여 조제한 아밀로스페로이드를 포함하는 용액의 작은 물방울을 닿게 하고, 즉시 여과지로 여분의 수분을 닦아 낸 후, 초산우라늄 용액을 첨가하여 관찰을 행한다. 전자현미경은, 안정시킨 100 내지 120 kV의 고압 가속으로 사용하고, 시료의 전자선에 의한 파손을 막기 위해 그리드의 단 등을 이용하여 비점수차 보정을 행한 후, 전자선 손상 저감법을 이용하여 관찰하는 방법 등이 바람직하다.

(3) 아밀로스페로이드를 항원으로 하는 항체의 조제

상기 (2)에 기재한 아밀로스페로이드를 항원으로 한 항체를 취득하는 방법은, (a) 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 섬유에 대한 반응성보다 높다, (b) 아밀로스페로이드에 대한 높은 반응성을 나타내면서, 아밀로스페로이드에 의한 신경세포 사멸 유도에 대한 저해활성을 갖는다, (c) 아밀로이드 β 모노머 단백질 및/또는 아밀로스페로이드에 대한 높은 반응성을 나타내고, 또한 아밀로스페로이드의 형성 저해활성을 갖는 항체를 얻을 수 있는 방법이면 특별히 제한은 없다. 구체적으로는, 이하에 상세히 기재하는 방법이 바람직하게 이용된다.

항원은, 상기 (2)에 기재한 아밀로스페로이드를 일반적으로는 캐리어로서 KLH[열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)], BSA(우혈청 알부민), OVA(오브알부민) 등의 단백질 또는 고분자체에 결합 또는 중합시킨 것을 면역용 항원으로서 사용하지만, 반드시 캐리어는 필요하지 않다. 또한, 면역용 항원은 다른 캐리어의 결합법에 의해 조제된 것 복수 종을 혼합하여 면역용 항원으로 하여도 좋다.

면역에 사용하는 동물은 특별히 한정되지 않지만, 토끼, 염소, 양, 마우스, 래트, 몰모트, 닭 등은 모두 사용할 수 있다. 면역용 항원의 동물에의 접종은 피하, 근육 내, 복강 내에 완전 프로인트 아쥬반트나 불완전 프로인트 아쥬반트와 면역용 항원을 잘 혼화하여 행한다. 접종은 2주 내지 5주마다 실시하고, 접종한 항원에 대한 면역 동물의 항체의 반응성이 충분히 상승할 때까지 계속한다. 1회에 면역하는 항원은, 면역 동물의 항체의 반응성이 충분히 상승하는 양이면 특별히 제한은 없지만, 구체적으로는 약 1 내지 약 100 μg이 바람직하다. 또한, 면역의 횟수는 면역한 동물로부터 채혈을 행하고, 이 혈중에 포함되는 항체에 대해서 후술하는 방법으로 항원에 대한 반응성을 측정하며, 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 모노머 단백질보다 오를 때까지 반복하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 5 내지 20회가 바람직하다. 또한, 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체를 취득하기 위해서는 첫회의 면역에는 완전 프로인트 아쥬반트를 이용하고, 그 이후의 면역에는 불완전 프로인트 아쥬반트를 이용하는 것이 바람직하다.

최후의 면역으로부터 7 내지 10일 후에, 이 동물로부터 혈액, 복수 등을 채취한다. 바람직하게는, 예컨대 전체 채혈을 행하고, 원심 분리 등의 방법으로 혈청을 조제한다. 이 혈청중에 포함되는 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체의 반응성의 측정 방법은, 상기 (2)에서 조제한 아밀로스페로이드와의 반응성을 분석할 수 있는 방법이면 어느 것이라도 좋지만, 예컨대 상기 아밀로스페로이드를 형광 물질 등으로 표지하고, 이것을 상기 혈청과 반응시킨 후, 이 항체에 결합한 표지제의 활성을 측정하는 방법 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 상기한 전자현미경 관찰에 의한 방법이나, 후술하는 ELISA법 등의 산소 면역측정법, 웨스턴블롯팅법, 또는 도트블롯팅법 등을 들 수 있다. 이 중, 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체에 있어서, 아밀로이드 β 섬유와의 반응성을 측정 비교하는 경우에는, 전자현미경 관찰에 의한 방법이 바람직하게 이용되고, 또한 아밀로이드 β 모노머 단백질과, 그 자기회합체인 아밀로스페로이드와의 반응성을 측정 비교하는 경우에는 도트블롯팅법이나 ELISA법 등의 효소 면역측정법이 바람직하게 이용된다. 또한, 아밀로이드 β 섬유나 아밀로이드 β 모노머 단백질, 또는 그 부분 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 항체와의 반응성을 비교하여, 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체를 선택 취득할 수 있다.

항체의 분리정제는, 그 자체 기지의 면역글로불린의 분리정제법에 의해 정제할 수 있다. 구체적으로는, 염석법, 알코올침전법, 등전점침전법, 전기영동법, 이온교환체에 의한 흡착법, 초원심분리법, 겔 여과법, 항원 항체 결합물 또는 활성 흡착제에 의해 특이적 항체만을 흡착분리하는 방법 등을 들 수 있다.

이와 같이 하여 제작된 항체는, 폴리크로날 항체이며, IgG를 주된 성분으로 하고, IgM, IgA 등의 다른 면역글로불린을 포함하는 것이라도 좋다.

한편, 모노크로날 항체를 조제하는 경우, 상기 면역 동물에 대하여, 통상 항원인 아밀로스페로이드만의 정맥 주사를 행하고, 그 2 내지 5일, 바람직하게는 3일 후에 항체 생산 세포를 포함한다고 생각되는 비장 또는 림프절을 채취하며, 이 비장 세포 또는 림프 세포를 종양 세포와 세포 융합시킨다. 이 후, 세포 융합하여 불사화한 항체 생산 세포(하이브리도마)를 단리한다. 여기서 사용하는 종양 세포는 일반적으로 면역을 행한 동물로부터 조제되는 비장 세포 또는 림프 세포와 동일종인 것이 바람직하지만, 이종 동물간의 것이라도 가능하다.

종양 세포의 예로서, p3(p3/x63-Ag8), P3U1, NS-1, MPC-11, SP2/0-Ag14, FO, x63.6.5.3, S194, R210 등의 골수종세포가 사용된다. 세포 융합은, 일반적으로 행해지고 있는 방법, 예컨대 「단클론 항체 실험 메뉴얼」(코단샤 사이언티픽 1987년 출판), G. KOHLERANDC. MILSTEIN, Nature, 256, 495(1975)에 기재한 방법 등에 따라서 실시하면 좋다. 세포 융합은 융합시키는 세포를 현탁한 융합 배지에 세포 융합 촉진제를 첨가하는 것으로 실시할 수 있다. 세포 융합 촉진제로서는 센다이 바이러스나 평균 분자량 1000 내지 6000의 폴리에틸렌글리콜 등을 들 수 있다. 이 때, 융합 효율을 더 높이기 위해 디메틸설폭시드 등의 보조제나 IL-6 등의 사이토카인을 융합 배지에 첨가할 수도 있다. 면역을 행한 비장 세포 또는 림프 세포에 대한 종양 세포의 혼합비는, 예컨대 종양 세포에 대하여, 비장 세포 또는 림프 세포를 약 1배 내지 약 10배 정도 이용하면 좋다.

상기한 융합 배지로서 ERDF 배지, RPMI-1640 배지, MEM 배지, GIT 배지 등의 통상의 각종 배지를 사용할 수 있고, 융합시는 통상, 우태아혈청(FBS) 등의 혈청을 배지로부터 뽑아 두는 것이 좋다. 융합은, 상기한 면역을 행한 비장 세포 또는 림프 세포와 종양 세포와의 소정량을 상기한 배지 내에서 잘 혼합하고, 미리 37℃ 정도로 가온해 둔 폴리에틸렌글리콜 용액을 약 20 내지 약 50% 정도 첨가하며, 바람직하게는 30 내지 37℃로 1 내지 10분 정도 반응시키는 것에 의해 실시한다. 이후, 적당한 배지를 순차 첨가하여 원심하고, 상청을 제거하는 조작을 반복한다.

목적으로 하는 하이브리도마는, 통상의 선택 배지, 예컨대 HAT 배지(하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배지)로 배양한다. 이 HAT 배지에서의 배양은, 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(미융합 세포 등)가 사멸하는 데 충분한 시간, 통상에서는 수일 내지 수주간 행하면 좋다.

얻어진 하이브리도마가 생산하는 항체는, 상기 하이브리도마의 배양상청에 포함된다. 이 항체의 반응성이나 반응 특이성 등은 상기 폴리크로날 항체를 측정하는 방법과 마찬가지로 하여 측정하고, 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택 취득할 수 있다.

얻어진 하이브리도마는, 한계 희석법에 의해 클로닝함으로써, 단일의 모노크로날 항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 얻을 수 있다. 이 하이브리도마 클론은 미리 FBS중에 포함되는 소의 항체(IgG)를 제외한 FBS를 약 1 내지 약 10% 정도 첨가한 배지 또는 무혈청용 배지를 이용하여 배양을 행하고, 얻어진 배양상청을 원하는 모노크로날 항체를 정제하는 원료로 한다. 한편, 얻어진 하이브리도마 클론을 미리 프리스텐을 투여한 Balb/c 마우스, 또는 Balb/c(nu/nu) 마우스의 복강 내에 이식하고, 10 내지 14일 후에 모노크로날 항체를 고농도로 포함하는 복수를 채취하며, 원하는 모노크로날 항체를 정제하는 원료로 하여도 좋다. 모노크로날 항체를 정제하는 방법은, 통상의 면역글로불린 정제법을 이용하면 좋고, 예컨대 유안분획법, 폴리에틸렌분획법, 에탄올분획법, 음이온교환 크로마토그래피, 프로틴 A, 프로틴 G 또는 항 마우스 면역글로불린 항체 등이 결합한 어피너티 크로마토그래피 등에 의해 실시할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체는, 그대로 이용하여도 좋고, 정법인 파파인 처리에 의해 얻어지는 Fab 또는 펩신 처리에 의해 얻어지는 F(ab')₂ 또는 F(ab')의 형태로서 이용하여도 좋다. 또한, 이 항체의 H쇄와 L쇄의 양 가변 도메인 내의 상보성 결정 영역(CDR), 또는 초가변 영역 등을 포함하는 단편이나, 이것을 코드하는 유전자를 그 자체 기지의 방법으로 취득하고, 또한 인간형으로 하는 항체도 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체에 포함된다. 또한, 파지 디스플레이법이나 인간 항체 생산 마우스 등을 이용하여 작성된 완전 인간 항체도 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체에 포함된다. 또한, 전술한 모노크로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포계도 본 발명에 포함된다.

(4) 항 아밀로스페로이드 항체의 항원에 대한 반응성의 측정

본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체의 항원에 대한 반응성을 측정하기 위한 ELISA, 도트블롯팅의 구체적 방법의 예를 이하에 설명한다. ELISA로서, 예컨대 고상 ELISA, 액상 ELISA 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체의 항원에 대한 해리정수를 측정하여도 좋다. 항체의 해리정수의 측정은 BIACore(BIACORE사제) 등의 기기를 이용하여 또는 그에 준한 방법에 의해 행할 수 있다.

(a) 아밀로스페로이드를 피복하는 고상담체 및 아밀로스페로이드 고상 ELISA

아밀로스페로이드를 피복한 고상담체를 이용하여, 항 아밀로스페로이드 항체의 항원에 대한 반응성을 측정함으로써, 항 아밀로스페로이드 항체를 검출할 수 있다. 여기서 고상담체로서는 폴리스티렌, 폴리프로필렌 등의 플라스틱제의 구형, 봉형, 플레이트형 등의 담체를 들 수 있지만, 플라스틱제 플레이트가 바람직하다. 고상담체에 아밀로스페로이드를 피복시키기 위해서는, 상법 예컨대 흡착법, 가교화제를 이용하는 방법 등을 들 수 있지만, 간편성으로부터 아밀로스페로이드를 물리적으로 흡착시키는 흡착법을 이용하는 것이 바람직하다.

아밀로스페로이드를 피복하는 고상담체를 이용한 측정법으로서, 구체적으로는 아밀로스페로이드 ELISA를 들 수 있다. 우선, Nunc사제 등의 ELISA 플레이트에 상기 (2)에서 조제한 아밀로스페로이드를 코팅한다. 이 경우, 용매는 아밀로스페로이드를 탈회합시키지 않는 것이면 어떠한 것이라도 좋지만, 예컨대 PBS(-)가 바람직하게 이용된다. 이 플레이트를 적당한 용액, 예컨대 0.05% Tween20 등의 계면활성제와 포함하는 생리적 식염수 등에 의해 세정하고, 우혈청 알부민/인산 완충액(Phosphate buffered saline:PBS) 등으로 블로킹한 후에, 상기에서 얻어진 항체와 반응시킨다. 그 후, 추가로 세정한 후에 2차 항체로서 면역 동물의 면역글로불린과 반응하는 항체를 접촉시킨다. 마찬가지로 세정 후, 플레이트에 결합하고 있는 이 2차 항체를 표지화물질의 활성 등을 지표로서 검출한다. 이러한 표지화물질의 활성은, 예컨대 ELISA 플레이트 리더 등을 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 아밀로스페로이드 ELISA를 이용하여, 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체의 항원 결정 부위(에피토프)를 결정할 수 있다. 구체적으로는, 아밀로스페로이드 ELISA에 의해 아밀로이드 β 모노머 단백질의 단편과 항 아밀로스페로이드 항체의 결합 경합 저해를 측정하여 에피토프를 결정할 수 있다. 아밀로이드 β 모노머 단백질의 단편은 복수 조합하여도 좋다. 또한, 아밀로스페로이드 ELISA에 의해 에피토프가 기지의 항체와 항 아밀로스페로이드 항체의 결합 경합 저해를 측정하여 에피토프를 결정할 수 있다. 또한, 에피토프의 결정은 "Antibodies: ALABORATORY MANUAL"[Ed Harlow et al., Cold SpringHarbor Laboratory(1988)] 등의 실험서에 기재한 방법 또는 그에 준한 방법에 의해서도 행할 수 있다.

(b) 아밀로스페로이드액상 ELISA

아밀로스페로이드와, 아밀로스페로이드에 대한 항체를 포함하는 검체, 예컨대 하이브리도마 배양상청을 실온 1시간 이상 혼화하여 반응시킨다. 미리 적당량의 토끼 항 아밀로스페로이드 IgG를 코팅하고, 예컨대 우혈청 알부민/PBS로 블로킹한 ELISA 플레이트에 일정량의 상기 혼합액을 첨가하여 실온 1시간 이상 반응시킨다. 그 후, 추가로 세정한 후에 2차 항체로서 검체중의 면역글로불린과 반응하는 항체, 예컨대 항 마우스 IgG 항체, 항 마우스 IgM, 항 마우스 면역글로불린을 접촉시킨다. 마찬가지로 세정 후, 플레이트에 결합하고 있는 이 2차 항체를 표지화물질의 활성 등을 지표로서 검출한다. 이러한 표지화물질의 활성은, 예컨대 ELISA 플레이트 리더 등을 이용하여 측정할 수 있다.

(c) 아밀로이드 β 모노머 ELISA

N 말단에 비오틴이 결합한 아밀로이드 β 모노머 단백질 또는 C 말단에 비오틴이 결합한 아밀로이드 β 모노머 단백질과, 항체를 포함하는 검체, 예컨대 하이브리도마 배양상청을 혼합하여 실온 1시간 이상 반응시킨다. 이 혼합액을 미리 우혈청 알부민/PBS로 블로킹한 스트렙트아비딘 ELISA 플레이트에 첨가하여 실온 30분 이상 반응시킨다. 그 후, 세정한 후에 2차 항체로서 검체중의 면역글로불린과 반응하는 항체, 예컨대 항 마우스 IgG 항체, 항 마우스 IgM, 항 마우스 면역글로불린을 접촉시킨다. 마찬가지로 세정 후, 플레이트에 결합하고 있는 이 2차 항체를 표지화물질의 활성 등을 지표로서 검출한다. 이러한 표지화물질의 활성은, 예컨대 ELISA 플레이트 리더 등을 이용하여 측정할 수 있다.

(d) 도트블롯팅

본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체의 항원에 대한 반응성을 측정하기 위한 도트블롯팅의 구체적 방법의 예를 이하에 설명한다. 우선, Bio Rad사제 등의 시판의 블로터 등을 이용하여, 상기 (2)에서 조제한 아밀로스페로이드를 니트로셀룰로오스막 등에 적당량 블롯한다. 이 경우, 용매는 아밀로스페로이드를 탈회합시키지 않는 것이면 어떠한 것이라도 좋지만, 예컨대 PBS(-)가 바람직하게 이용된다. 블롯팅은 아밀로스페로이드 이외에도 대조로서, 아밀로이드 β 모노머 단백질 또는 그 부분 펩티드나, 용매에 대해서만 행하는 것이 바람직하다. 이 막을 적당한 완충액, 예컨대 인산 완충액(Phosphate buffered saline: PBS) 등에 의해 세정하고, 탈지유/TTBS(Tween-Tris buffered saline) 등으로 블로킹한 후에, 상기에서 얻어진 항체와 막을 접촉시키며, 그 후 TTBS 등으로 더 세정한 후에, 2차 항체로서 면역 동물의 면역글로불린과 반응하는 항체를 접촉시키고, 이것도 마찬가지로 세정한 후, 막에 결합하고 있는 이 2차 항체를 표지화물질의 활성 등을 지표로서 검출한다. 대조로서, 아밀로이드 β 모노머 단백질에 반응하는 항체를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 항체로서는, 예컨대 「6E10」(Senetek사제) 등을 들 수 있다.

(5) 아밀로스페로이드에 의한 신경세포 사멸 유도에 대한 저해활성의 해석

본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체가 갖는, 아밀로스페로이드에 의한 신경세포 사멸 유도를 저해하는 활성(이하, 이것을「신경세포독성 중화활성」 또는 「신경세포 사멸 유도 저해활성」이라고 칭하는 경우가 있다)의 해석 방법의 예를 이하에 설명한다.

우선, 아밀로스페로이드를 이용한 신경세포 사멸의 유도는, 신경계의 세포 등의 배양액에 상기 아밀로스페로이드를 첨가하고, 통상의 방법에 따라 배양함으로써 행할 수 있다. 그래서 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체가 이 신경세포독성 중화활성을 갖는지 여부를 해석하는 경우에는, 항 아밀로스페로이드 항체의 존재하에서 상기한 신경세포와 아밀로스페로이드와의 배양을 행하고, 신경세포 사멸이 유도되지 않는 것을 확인함으로써 행할 수 있다. 아밀로스페로이드에 의해 유도되는 세포사는 아포토시스 또는 네크로시스 중 어느 것이라도 좋다. 또한, 이용되는 세포로서는 신경계 세포이면 특별히 제한은 없고, 포유동물(사람, 래트, 마우스, 원숭이, 돼지 등) 유래의 신경계 세포가 바람직하다. 또한, 초대 배양세포가 바람직하다. 초대 배양세포로서는, 상기한 동물의 해마, 및 전뇌 기저부·대뇌피질 등으로부터 취득한 것이 바람직하다. 또한 상기 동물의 해마 등의 기관을 배양한 것을 그대로 이용하는 것도 가능하다. 또한, ES 세포로부터 분화 유도시킨 신경세포를 이용하는 것도 가능하다.

이들의 세포나 기관은 통상의 배양법에 따라 배양할 수 있다. 구체적으로는, 신경계 세포의 초대 배양, 및 신경계 수립 세포주의 배양 방법으로서는 Hoshi, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93, 2719-2723(1996), 및 Schubert, D. et al., Nature, 249(454), 224-227(1974)에 기재되어 있는 방법 등을 이용할 수 있고, 기관 배양은 Gary Banker and Kimbery Goslin, Culturing nerve cel1s, 2nd Edition, MIT Press, Cambridge(1998)에 기재되어 있는 방법 등을 이용할 수 있다. 이와 같이 하여 배양된 신경계의 세포, 및 기관에 세포사를 유도하기 위해 첨가하는 아밀로스페로이드의 양은 적절하게 선택 가능하지만, 아밀로스페로이드는, 통상 알츠하이머병 등의 환자의 뇌 속에 존재하는 독성 아밀로이드 β 단백질과 실질적으로 동등한 농도로 세포사를 유도할 수 있다. 예컨대, 상기 (2)에서 얻어지는 아밀로스페로이드는, 상기한 바와 같이, 초대 배양세포에 대하여 배양액중의 아밀로이드 β 단백질 농도 약 1μg/ml 이하, 더 바람직하게는 약 0.45 μg/ml 이하 등의 양으로 세포사를 유도할 수 있다. 다만, 상기한 농도는 예시를 위한 것이고, 이 양에 한정되지 않는다.

이 배양중에 존재시키는 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체의 양은 이용되는 항체의 항원에 대한 반응성에 의해 적절하게 선택되지만, 구체적으로는, 예컨대 약 0.0001 내지 약 1 mg/ml를 존재시키는 것이 바람직하다. 또한, 항 아밀로스페로이드 항체의 이 배양액에의 첨가 시기는 신경세포독성 중화활성을 확인할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없지만, 아밀로스페로이드에 의한 신경세포 사멸 유도는, 배양 후 약 6시간 정도부터 유도되기 때문에 그 전, 바람직하게는 배양 초기에 첨가해 둔다. 또한, 대조로서, 아밀로스페로이드와는 반응하지 않는 항체 또는 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 낮고 그 반응성이 신경세포 사멸 유도에 영향을 미치지 않는 항체를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 항체로서는, 예컨대 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 항체, 구체적으로는, 예컨대 「6E10」(Senetek사제) 등이 바람직하게 이용된다.

아밀로스페로이드에 의해 유도되는 신경세포 사멸은, 통상 아밀로스페로이드의 유효량을 첨가한 후, 약 6 시간 정도로부터 발생하고, 약 48시간 정도 후에는 현저한 세포사의 모습을 관찰할 수 있다. 따라서 이 해석 방법에 있어서, 신경세포 사멸의 유도를 측정하는 경우에는 배양을 시작한 후 약 20시간 이후가 바람직하지만, 이용하는 아밀로스페로이드의 세포사 활성에 따라 적절하게 선택된다.

이들의 신경세포 사멸 활성을 측정하는 방법으로서는, 통상 이용되는 세포사 검출법을 이용할 수 있다. 구체적으로는, MTT 활성 측정법[Mossman, T., J.Immunol. Methods, 65, 55(1983)], 프로피디움 요오드화물[Ankarcrona, M.et al., Neuron, 15, 961(1995)]등에 의한 염색법, 또는 트리판블루 색소배제법[Woo, K. B., Funkhouser, W. K., Sullivan, C. and Alabaster, O., Cell Tissue Kinet., 13(6), 591-604(1980)], TUNEL이나 단편화 DNA를 검출하는 ELISA(Roche사제) 등이 이용된다. 이 중, 프로피디움 요오드화물 등에 의한 염색법 또는 단편화 DNA를 검출하는 ELISA가 특히 바람직하다. 프로피디움 요오드화물 등에 의한 염색법은, 사세포를 선택적으로 염색하는 프로피디움 요오드화물에만 의한 단일 염색이라도 좋고, 다른 복수의 염색 색소와 조합하여 행하여도 좋다. 조합하는 염색 색소로서는, 구체적으로는 생세포를 선택적으로 염색하는 Calcein-AM(Molecular Probes사제), 전체 세포를 염색하는 Hoechst33258(H33258; Bisbenzimide H33258) 등이 바람직하다.

또한, 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체의 신경세포 사멸 유도 저해활성은, 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체를 동물 개체에 직접 투여함으로써 행할 수도 있다. 아밀로스페로이드에 의해 유도되는 세포사는 아포토시스 또는 네크로시스 중 어느 것이라도 좋다. 또한, 이용되는 동물로서는 포유 동물(마우스, 래트, 영장류 등) 등의 신경계 세포를 갖는 동물이면 특별히 제한은 없지만, 알츠하이머병의 모델 동물 등의 특히 신경세포 사멸이 일어나고 있는 동물이 바람직하게 이용된다. 또한, 투여 방법은 뇌 등의 신경계 세포의 존재하는 부위에 직접 투여하는 방법 외, 경구 투여법, 정맥 주사법, 복강 투여법 등의 통상 약품 투여에 이용되는 방법을 이용할 수 있다. 뇌 등의 신경계 세포의 존재하는 부위에 직접 투여하는 방법으로서는, 구체적으로는, 예컨대 래트 또는 마우스 등의 뇌조직의 경우, 삼투압 펌프를 이용하여 목표 부위 근방의 뇌실 내에 투여하는 방법, 마이크로 파이펫 등을 이용하여 목표 부위의 뇌실질에 마이크로 퓨전하는 방법 등이 이용되고, 일정 기간 투여한 후, 뇌기능의 변이를 PET·MRI를 이용하여 계측한 후에, 투여 부위 주변의 조직을 신속하게 추출하고, 조직 절편을 제작하여 신경세포 사멸의 유무를 검증할 수 있다. 신경세포 사멸의 유무의 검증은 조직 염색법이나 웨스턴블롯법 등에 의해 행할 수 있고, 조직 염색법으로서는 TUNEL 염색, 또는 항 Caspase 항체 등에 의한 면역 염색 등을 들 수 있다.

(6) 아밀로스페로이드 형성 저해활성의 해석

본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체의 아밀로스페로이드 형성에 대한 저해활성의 해석 방법으로서는, 상기 (2)의 아밀로스페로이드의 조제 방법의 제1 공정에 있어서, 물에 용해한 아밀로이드 β 모노머 단백질과 함께, 상기에서 얻어진 항 아밀로스페로이드 항체를 혼합한 후, 상기 (2)와 마찬가지로 하여 아밀로스페로이드를 조제하는 공정을 행하고, 얻어진 용액을 상기 (2)에 기재한 신경세포 사멸 유도활성이나 전자현미경 관찰 등에 의해 아밀로스페로이드가 형성되어 있는지를 관찰하는 방법을 들 수 있다. 여기서, 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체의 첨가량은 아밀로이드 β 단백질에 대하여 등배량 이상(몰비)이 바람직하다. 또한, 대류를 행하는 시간은, 통상 아밀로스페로이드가 형성되는 데에 충분한 시간 이상이 바람직하다. 구체적으로는, 약 4시간 이상이다. 아밀로스페로이드의 형성은, 예컨대 상기 (2)에 기재한 방법 등에 의해 분석할 수 있다.

이 측정으로, 아밀로스페로이드가 형성되어 있지 않으면, 이 항 아밀로스페로이드 항체에는 아밀로스페로이드 형성을 저해하는 활성이 있다고 판단할 수 있다.

(7) 알츠하이머병의 치료/및 예방약 및 스크리닝 방법

아밀로스페로이드는, 신경계의 배양세포에 첨가하면 이 세포를 죽음에 이르게 할 수 있기 때문에, 알츠하이머병에 있어서는, 마찬가지로 아밀로이드 β 단백질이 자기회합한 아밀로스페로이드가 신경 변성을 유도하고 있다고 생각되고 있다.

본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체는, 이 아밀로스페로이드에 대한 높은 반응성을 나타내고, 아밀로스페로이드에 의한 신경세포 사멸 유도에 대한 저해활성을 갖기 때문에, 피검물질을 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체와 경합시켜 아밀로스페로이드에 결합시키고, 그 반응성을 지표로서 물질을 선택함으로써, 알츠하이머병의 치료/및 예방약의 스크리닝을 행할 수 있다. 또한, 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체 그 자체도 알츠하이머병의 치료/및 예방약의 유효 성분이 될 수 있다.

이 물질의 스크리닝 방법의 구체예에 대해서 이하에 설명한다. 피검물질로서는, 예컨대 펩티드, 단백, 비 펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 등을 들 수 있고, 이들 화합물은 신규의 화합물이어도 좋고, 공지의 화합물이어도 좋다. 아밀로스페로이드와의 반응성은, 상기 (4)의 항 아밀로스페로이드 항체와 아밀로스페로이드와의 반응성을 해석하는 방법에 있어서, 반응액중에 상기 피검물질을 첨가하여 행하는 방법 등을 들 수 있다. 아밀로스페로이드, 항 아밀로스페로이드 항체, 및 피검물질의 혼합량은 각각 적당한 농도를 선택하여 행할 수 있다.

피검물질은, 표지 물질 등으로 표지화해 두는 것이 바람직하다. 이 해석에 의해 아밀로스페로이드에 결합한 물질은 알츠하이머병의 치료/및 예방약의 유효 성분으로서 이용한다고 판단할 수 있다. 또한, 선택된 물질을 상기 (5)에 기재한 방법에 있어서의 항 아밀로스페로이드 항체 대신에 이용하여, 아밀로스페로이드에 의한 신경세포 사멸 유도를 저해하는지를 확인하는 것이 바람직하다.

이렇게 하여 선택된 물질 및 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체는, 그 자체 알츠하이머병의 예방 및/또는 치료를 위한 의약의 유효 성분으로서 유용하지만, 생리학적으로 허용되는 이들의 염, 수화물 및 용매화물 등이어도 좋다. 또한, Fe나 Zn 등의 금속 이온이나 당쇄, 당단백질이 부가된 것도 바람직하다. 생리학적으로 허용되는 염으로서는, 예컨대 염산염, 황산염 등의 무기산류의 염, 시트르산염, 수산염, p-톨루엔술폰산염 등의 유기산의 염, 글리신 등의 아미노산의 염 등을 들 수 있다. 또한, 항 아밀로스페로이드 항체는, 상기한 방법에 의해 인간형으로 개변된 것 또는 완전 인간 항체가 보다 바람직하게 이용된다. 항체의 인간 등에의 투여에 적합한 개변은, 그 자체 공지의 방법을 적절하게 조합하여 행할 수 있고, 당업자에 의하면 이들은 용이하게 행할 수 있다.

본 발명에 의해 제공되는 의약은, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 신경세포 사멸에 대하여 억제 작용을 갖는다고 판정된 물질을 유효 성분으로서 포함하고, 알츠하이머병의 예방 및/또는 치료를 위한 의약으로서 이용할 수 있다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 신경세포 사멸에 대하여 억제 작용을 갖는다고 판정된 물질 및 항 아밀로스페로이드 항체는, 그 자체를 의약으로서 환자에게 투여하여도 좋지만, 일반적으로는, 이들 유효 성분의 1종 또는 2종 이상을 포함하는 의약조성물을 제조하여 환자에게 투여하는 것이 적합하다. 이러한 의약조성물로서, 정제, 캡슐제, 과립제, 세립제, 산제, 환제, 트로키, 설하(舌下)제, 또는 액제 등의 경구 투여 제제, 또는 주사제, 좌제, 연고, 첨부제 등의 비경구 투여용 제제를 예시할 수 있다.

경구 투여용 정제 또는 캡슐제는, 통상은 단위 투여물로서 제공되고, 결합제, 충전제, 희석제, 타정제, 활택제, 붕괴제, 착색제, 향미제 및 습윤제와 같은 통상의 제제용 담체를 첨가하여 제조할 수 있다. 정제는, 이 당업계에서 주지의 방법에 따라, 예컨대 장용성 코팅제 등을 이용하여 코팅할 수 있고, 예컨대 충전제, 붕괴제, 활택제, 습윤제 등을 이용하여 제조하여도 좋다.

경구 투여용 액제는, 예컨대 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 에멀젼, 시럽제 또는 엘릭시르제 등 외, 사용 전에 물 또는 적당한 매체에 의해 재용해될 수 있는 건조제제로서 제공된다. 이러한 액제에는 통상의 첨가제, 예컨대 침전 방지제, 유화제, 보존제 및 필요에 따라 통상의 향미제 또는 착색제를 배합할 수 있다.

경구 투여제의 제제는 혼합, 충전, 또는 타정 등의 당업계에서 주지의 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 반복 배합 조작을 이용하여 다량의 충전제 등을 사용한 제제중에 유효 성분을 분포시켜도 좋다. 비경구 투여용 제제는, 일반적으로는 유효 성분인 물질과 멸균 매체를 함유하는 액체 담체 투여량 제제로서 제공된다. 비경구 투여용 용제는, 통상 유효 성분인 물질을 매체에 용해시켜 멸균 여과하고, 다음에 적당한 바이알 또는 앰풀에 충전하여 밀봉함으로써 제조된다. 안정성을 높이기 위해 조성물을 동결시킨 후에 바이알중에 충전하고, 물을 진공하에서 제거하여도 좋다. 비경구 현탁액은 실질적으로 비경구 용액의 경우와 동일한 방법으로 제조되지만, 유효 성분을 매체에 현탁시켜 에틸렌옥사이드 등에 의해 멸균함으로써 적합하게 제조할 수 있다. 또한, 유효 성분이 균일 분포가 되도록 필요에 따라 계면활성제, 습윤제 등을 첨가하여도 좋다.

유효 성분인 물질의 투여량은, 물질의 활성 강도, 치료나 예방의 목적, 환자의 증상, 체중, 연령이나 성별 등을 고려하여 적절하게 결정하면 좋다. 또한, 1일당 1 내지 수회에 걸쳐 투여하는 것이 바람직하다. 예컨대 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체가 유효 성분인 경우, 그 투여량은 1회의 투여에 있어서 1 kg 체중당 일반적으로는 약 1μg 내지 약 100 mg, 바람직하게는 약 10 μg 내지 약 50mg의 양으로 투여할 수 있다.

(8) 항 아밀로스페로이드 항체를 이용한 알츠하이머병 개체의 검출 방법 및 검출용 시약

아밀로스페로이드는, 신경계의 배양세포에 첨가하면 이 세포를 죽음에 이르게 할 수 있기 때문에, 알츠하이머병에 있어서는, 마찬가지로 아밀로이드 β 모노머 단백질이 자기회합한 아밀로스페로이드가 신경 변성을 유도하고 있다고 생각되고 있다. 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체는, 이 아밀로스페로이드에 대한 높은 반응성을 갖기 때문에, 이 항체를 이용하여 생체 시료중에 아밀로스페로이드를 검출함으로써 알츠하이머병 개체의 검출을 행할 수 있다.

생체 시료로서는, 알츠하이머병의 의심이 있는 개체로부터 얻어지는 혈액, 뇌 척수액, 뇨 등의 체액 등을 들 수 있지만, 그 중에서도 특히 혈액이 바람직하다. 이 시료의 취득은, 예컨대 혈액의 경우에는, 알츠하이머병의 의심이 있는 개체의 주정맥 등으로부터 채혈관 등에 의해 채혈하고, 원심 분리 등의 방법에 의해 혈전 또는 혈청을 분리함으로써 얻어진다. 또한, 뇌 척수액을 시료로 하는 경우는, 알츠하이머병의 의심이 있는 개체로부터, 예컨대 마취하의 요추천자에 의해 채취하고, 원심 분리함으로써 얻어진다. 취득된 생체 시료는 시료중의 아밀로스페로이드의 변화나, 혈액의 응고 등을 방지하기 위해 효소 저해제를 시료 채취시 또는 샘플 채취 후에 첨가하는 것이 바람직하다. 효소 저해제로서는, 단백질 분해 효소 저해제로서, 예컨대 아프로티닌, 안티파인, 펩스타틴, 루펩틴, EGTA, PMSF(페닐메틸술포닐플루오라이드), TLCK(토실리신클로로메틸케톤) 등이 이용된다. 취득된 생체 샘플은, 필요에 따라 농축 등을 더 행하는 것에 의해 아밀로스페로이드의 검출 감도를 올릴 수 있다.

이 항 아밀로스페로이드 항체를 이용한 생체 시료중의 아밀로스페로이드의 검출은, 그 자체 기지의 면역학적 측정법을 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대 샌드위치법, 경합법, 면역메트릭법, 네펠로메트리 등이 이용된다. 샌드위치법에 있어서는, 고상화한 본 발명의 항 아밀로스페로이드 항체에 생체 시료를 접촉시키고, 표지화한 항 아밀로스페로이드 항체를 더 반응시킨 후에, 고상에 결합한 표지 물질의 신호를 측정함으로써, 생체 시료중의 아밀로스페로이드량을 측정할 수 있다. 이러한 면역학적 측정 방법에 의해 생체 시료중의 아밀로스페로이드량을 측정하는 경우에는, 기지량의 아밀로스페로이드를 포함하는 표준액을 이용하여 제작한 표준 곡선에 의해 산출하는 것이 바람직하다. 상세한 것은, 생화학 실험법 11「효소면역검사법」(Tijssen P. 저, 동경화학동인), "Antibodies: A LABORATORY MANUAL"[Ed Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory(1988)] 등의 실험서에 따라, 적절하게 선택 조합하여 행할 수 있다. 또한, 본 발명에는, 이들의 검출에 이용되는 항 아밀로스페로이드 항체를 포함하는 알츠하이머병 개체 검출을 위한 시약도 포함된다.

도 1은 본 발명의 모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체의 반응성을 해석한 아밀로스페로이드 고상 ELISA의 결과를 도시하는 그래프이다.

도 2는 본 발명의 폴리크로날 항 아밀로스페로이드 항체의 반응성을 해석한 도트블롯의 결과를 도시하는 도면이다.

도 3에서, 도 3A는 본 발명의 모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체 및 폴리크로날 항 아밀로스페로이드 항체의 반응성을 해석한 도트블롯의 결과를 도시하는 도면이다. 도 3B는 A의 각 도트의 강도를 수치화한 결과를 도시하는 그래프이다. ASD2는, 폴리크로날 항 아밀로스페로이드 항체를 도시한다.

도 4에서, 도 4A는 본 발명의 폴리크로날 항 아밀로스페로이드 항체의 아밀로이드 β 섬유에 대한 반응성을 도시하는 면역 전자현미경 사진의 도면이다. 도면 중의 바는 20 nm를 나타낸다. 도 4B는 모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체 MASD3의 아밀로이드 β 섬유에 대한 반응성을 검증한 면역 전자현미경 사진의 도면이다. 도면 중의 바는 50 nm를 나타낸다.

도 5는 본 발명의 폴리크로날 항 아밀로스페로이드 항체의 아밀로스페로이드 형성 저해를 해석한 결과를 도시하는 그래프이다.

도 6은 본 발명의 폴리크로날 항 아밀로스페로이드 항체의 아밀로스페로이드에 의한 신경세포 사멸 유도에 대한 저해활성을 해석한 결과를 도시하는 그래프이다.

도 7은 시판 N 말단 항체의 아밀로스페로이드에 의한 신경세포 사멸 유도에 대한 저해활성을 해석한 결과를 도시하는 그래프이다.

도 8은 본 발명의 폴리크로날 항 아밀로스페로이드 항체와 모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체의 신경세포 사멸 유도 저해활성을 비교한 결과를 도시하는 그래프이다.

도 9는 본 발명의 모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체에 의한 면역 침강의 결과를 도시하는 그래프이다. 위의 그래프는 면역 침강 후에 잔존한 아밀로스페로이드량을 도시하고, 아래 그래프는 면역 침강 후의 용액에 포함되는 신경세포 사멸 활성을 도시한다.

도 10은 본 발명의 폴리크로날 항 아밀로스페로이드 항체의 아밀로스페로이드에 의한 비정상적인 세포 내 칼슘 유입 억제 효과를 도시하는 그래프이다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이것의 실시예로부터 전혀 한정되는 것이 아니다. 또한, 하기의 실시예 및 본 명세서중에 있어서, 「PBS」는 「Phosphate Buffered Saline」, 「TTBS」는 「Tween-Tris Buffered Saline」, 「HRP」는 「Horseradish Peroxidase」를 나타낸다.

실시예 1: 아밀로스페로이드 함유액의 조제

(1) 아밀로이드 β 40(서열 번호 1) 수지의 제조

Fmoc-Val 수지 342 mg(아민 함량 0.73 mmol/g 수지)을 퍼킨엘머 어플라이드 바이오시스템스사제 A433형 자동 펩티드 합성기에 세팅하고, 이것에 Fmoc-Val-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-His(Trt)- OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH를 공급하며, HBTU[2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1, 1, 3, 3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate]를 축합제로서 순차 축합시켜 측쇄 보호 아밀로이드 β 40 수지 1.515 g을 얻었다.

(2) 트리플루오로 초산 처리

상기 (1)에서 얻은 측쇄 보호 아밀로이드 β 40 수지중의 304 mg을 채취하고, 이것에 페놀 0.75 ml와 티오아니솔 0.5 ml와 트리플루오로 초산 8.25 ml와 에탄디티올 0.25 ml와 증류수 0.5 ml를 첨가하며, 빙냉하 5분, 계속해서 실온에서 1.5 시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 빙냉한 디에틸에테르 200 ml를 첨가하여 펩티드를 침전시켰다. 전체 내용물을 유리필터로 여과하고, 냉 디에틸에테르로 세정한 후, 35%의 아세토니트릴을 포함하는 0.1% 트리플루오로 초산(약 200 ml)으로 추출 처리하여 H-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-OH로 나타내는 조(粗) 펩티드 191 mg을 얻었다.

(3) 펩티드의 정제

이 조 펩티드를 35%의 아세토니트릴을 포함하는 0.1% 트리플루오로 초산(40 ml)에 용해하여 ODS(옥타데실실란)를 실리카에 결합한 역상계의 컬럼(내경 2 cm, 길이 25 cm)을 이용한 HPLC에 의해 정제하였다. 용출은 0.1% 트리플루오로 초산중, 아세토니트릴 농도를 22% 내지 42%에 직선적으로 20분간 상승시킴으로써 행하였다. 정제물의 수량은 35 mg이었다. 본 물질의 구조는 MALDI-TOF 질량 분석에 의해 확인되었다. 측정값[M+H]+4330.99에 대하여, 계산값은 (C₁₉₄H₂₉₅N₅₃O₅₈S₁+H)4330.89였다. 또한, 아밀로이드 β 42에 대해서는, 상기한 방법에 준하여 합성·생성을 행한 것과, Bachem사로부터 구입한 것의 양쪽 모두를 이후의 실험에 제공하였다.

(4) 아밀로스페로이드 함유액의 조제

상기 (3)에서 정제를 행한 10 nmol의 아밀로이드 β 40을 1.5 ml 용량의 에펜돌프 튜브에 넣고, 이것에 500 μl의 초순수와 500 μl의 둘베코 인산 완충액(-)[닛스이사제; 이하, PBS(-)라고 칭한다]을 순차 첨가하며, 아밀로이드 β 단백질을 완전히 용해시켰다. 이 아밀로이드 β 단백질 수용액이 들어간 에펜돌프 튜브를 덕 로터(TAITEC사제, 로터: RT50)에 부착하고, 37℃에 있어서 35 rpm의 속도로 7일간 회전시켜, 아밀로스페로이드 40을 조제하였다. 아밀로이드 β 42[상기 (3)에서 정제를 행한 것 또는 Bachem사제]에 대해서도, 상기한 방법에 준하고, 약 10시간 회전시켜 아밀로스페로이드 42를 조제하였다.

실시예 2: 항 아밀로스페로이드 항체의 조제

(1) 토끼 폴리크로날 항 아밀로스페로이드 항체의 조제

실시예 1에서 조제한 아밀로스페로이드 40 및 아밀로스페로이드 42를 항원으로서, 뉴질랜드 화이트종 토끼 1마리에 대해 상기 아밀로스페로이드가 60 μg이 되도록 완전 프로인트 아쥬반트에 혼합하여 피하에 투여하였다. 이 후 2주에 한 번 간격으로, 같은 양의 아밀로이드 β 단백질을 불완전 프로인트 아쥬반트에 혼합하 여 합계 8회 투여하였다. 최종 면역을 행한 후 10일 후에 전체 채혈을 행하였다.

전체 채혈 후, 이것을 37℃에서 1시간 방치하고, 발생한 혈병을 원심에 의해 제거하며, 혈청을 회수하였다. 다음에 이 혈청을 30분간, 57℃로써 비동화 처리를 행하며, ProClin300(시그마알드리치사제)을 1 ppm이 되도록 첨가하여 보존하였다. 혈청으로부터의 IgG의 분리는 이하와 같이 행했다. 2 ml의 Protein-G 세파로오스(아머샴 바이오 사이언스사제)를 적당한 컬럼에 충전하고, PBS(-)로 평형화하였다. 이것에 2 내지 3 ml의 혈청을 첨가하고, 비흡착 분획을 20 ml의 PBS(-)로 세정하였다. 흡착 분획을 0.1 M Glcine-HCl, 0.15 M NaCl pH 2.5를 2 ml씩 컬럼에 첨가하여 용출하였다. 용출한 분획은 10분의 1양의 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5를 첨가한 시험관에 회수하여 즉시 중화하였다. 이 용출액을 PBS(-)에 투석하고, 정제 IgG로 하였다. 순도 분석은 0.1 M 초산나트륨, 0.3 M NaCl을 전개 완충액으로 하는 G 3000 SWsL(도소사제)에 의한 겔 여과 HPLC 등에 의해 실시하였다.

(2) 마우스 모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체의 조제

PBS중에서 조제한 아밀로스페로이드 42와 등량의 완전 프로인트 아쥬반트(WAKO사제)를 혼합하여 유화하였다. BALB/c 자성　마우스　배부 피하에 0.2 ml를 면역하였다(1 내지 8 μg/0.2 ml/mouse). 2주 걸러서 불완전 프로인트 아쥬반트(Sigma-Aldrich사제)로 유화한 아밀로스페로이드를 마찬가지로 면역하였다. 안저 또는 미정맥으로부터 정기적으로 채혈하여 혈청 혈장을 조제하였다. 1% 우혈청 알부민(BSA, fraction V; Sigma-Aldrich사제) 용액(PBS중)으로 혈청 혈장을 연속 희석하고, 하기의 아밀로스페로이드 고상 ELISA법으로 항 아밀로스페로이드 항체의 아밀로스페로이드에 대한 반응성을 측정하였다.

8 내지 10회 면역하여 충분히 반응성이 상승한 개체에 대해서, 최종적으로 아밀로스페로이드 8 μg(PBS 0.1 ml중)을 정맥 내에 투여하여 부스트하였다. 부스트 3일 후에 비장 세포를 회수하고, 폴리에틸렌글리콜 4000을 이용한 통상법에 의해, 비장 세포수의 1/2수의 마우스 미에로마 세포(SP2/0-Ag14)와 세포 융합하였다. 융합한 세포를 10% 우태아 혈청, 10% BM condimed H-1(Roche Diagnostics사제) 및 HAT(Sigma-Aldrich사제)를 포함하는 GIT 배지(WAKO사제)중에 현탁하고, 각 구멍 5x 10⁴미에로마 세포/0.1 ml 배양액이 되도록 96 구멍 플레이트(FALCON사제)중에 파종하였다. 3일 후 배양액을 추가, 7일 후에 배양액을 교환하고, 2 내지 3일 더 배양하여 상청을 회수하였다. 하기의 ELISA법으로써 상청중의 항 아밀로스페로이드 항체를 조사하고, 특이적인 항체를 생산하는 세포를 24 구멍 플레이트(IWAKI사제)에 확대하였다. 한계 희석법으로써 클로닝할 때에는 96 구멍 플레이트에 200 μl 배양액중에서 0.3/well이 되도록 하이브리도마를 파종하고, 일주일에 한번 배양액을 반량 교환하면서 배양하였다.

이와 같이 하여 수립한 마우스 모노크로날 항체 3 클론을 표 1에 나타낸다. 이들 항체의 서브 클래스는 아머샴 바이오 사이언스사제의 마우스 모노크로날 항체 아이소타입 타이핑키트를 이용하여 결정하였다. 항체 MASD1, MASD2 및 MASD3을 생산하는 하이브리도마를 각각 Mouse-Mouse hybridoma MASD1, Mouse-Mouse hybridoma MASD2, 및 Mouse-Mouse hybridoma MASD3이라고 칭한다. Mouse-Mouse hybridoma MASD1, Mouse-Mouse hybridoma MASD2, 및 Mouse-Mouse hybridoma MASD3은 각각 수탁 번호(수령 번호) FERM ABP-10392, FERM ABP-10393, 또는 FERM ABP-10394로서, 2005년 8월 3일부로, 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터[일본 이바라기현 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반치 1츄오 제6(우편 번호 305-8566)]에 기탁되어 있다.

하이브리도마 MASD1, MASAD2, MASD3으로부터의 항체의 분리정제는 이하와 같이 행하였다. 약 11의 CD Hybridoma 배지(인비트로젠사제)로 1주간 하이브리도마를 배양하고, 배양상청을 원심 분리로 회수하였다. 이것을 0.45 μm의 필터로 여과하고, 이것을 PBS(-)로 평형화한 2 ml의 Protein-G 세파로오스에 첨가하며, 이하 상기 실시예 2(1)와 마찬가지로 IgG 항체를 분리정제하였다.

[표 1]

마우스 모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체

실시예 3: 항체의 성상 해석

(1) 아밀로스페로이드 고상 ELISA법(아밀로스페로이드와의 반응성의 확인)

96 구멍 ELISA 플레이트(Nunc사제 맥시소프)에 인산 완충 생리적 식염수(Ca, Mg 불함, pH 7.2; PBS)중에서 1 μg/ml에 희석한 아밀로스페로이드 40 또는 42를 50 μl 첨가하고, 4℃로 밤새 코팅하였다. 1% 우혈청 알부민(BSA, fraction V; Sigma-Aldrich사제) 용액(PBS중)을 실온 1시간 이상 첨가하고, 비특이적 결합 부위를 블록한 후, 물로 플레이트를 세정하였다. 1% 우혈청 알부민 용액(PBS중)으로 희석한 항혈청 또는 하이브리도마 배양상청 50 μl를 첨가하여 실온 1시간 이상 반응시켰다. 플레이트를 0.05% Tween 20을 포함하는 생리 식염액으로 5회 세정한 후 마찬가지로 1 μg/ml에 희석한 페록시다아제 표지 2차 항체[항 마우스 IgG 항체(Zymed사제), 항 마우스 IgM(Biosource사제), 항 마우스 면역글로불린(DAKO사제)]를 첨가하여 실온 1시간 반응시켰다. 5회 세정 후, 기질 용액을 첨가하여 일정 시간 발색시키고, 플레이트 리더로써 흡광도를 측정하였다.

실시예 2에서 수립한 마우스 모노크로날 항체와 시판 항체를 비교한 결과를 도 1에 도시한다. 실시예 2에서 수립한 항체는 모두, 시판항체 「6E10」(Sigma-Aldrich사제), 「IBL10027」(면역 생물 연구소사제)보다 1/100 정도 낮은 농도로 강한 반응성을 나타내었다.

(2) 도트블롯 해석(아밀로스페로이드 및 아밀로이드 β 모노머와의 반응성의 확인)

블로터(Bio Rad사제)를 이용하고, 용매인 1,1,1,3,3,3,-헥사플루오로-2-프로판올(Sigma-Aldrich사제)에 녹인 아밀로이드 β 40모노머 단백질과 실시예 1에서 조제한 아밀로스페로이드 40 함유액과, 컨트롤로서 용매를 각각 2 ng씩 니트로셀룰로오스막(Schleicher & Schuell, 0.2 μ)에 블로트하고, 이 막을 PBS(-)로써 세정 후, 블로터로부터 떼었다.

상기 단백질을 블로트한 막을, 5% 탈지유/0.05% TTBS로 1시간 블로킹한 후, 0.1 μg/ml가 되도록 조제한 실시예 2에서 취득한 항체에 침지하고, 습윤 상자중에서 밤새, 4℃로 반응시켰다. 그 후, 이 막을 0.05% TTBS로 세정하고, 2차 항체로서 0.05 내지 1μg/ml의 서양 와사비 유래 페록시다아제가 결합한 항 토끼 IgG 또는 항 마우스 IgG(Zymed사제)와 1시간 반응시켰다. 그 후, 0.05% TTBS로 세정하여 미반응의 2차 항체를 제거하고, SuperSignal West-Femto(Pierce사제)에 침지하여 5분간 인큐베이트한 후, 이미지 분석기 「LAS-1000 plus」(후지사진필름사제)로 화학 발광 시그널의 검출 및 화상 데이터의 취입을 행하였다. 상기 항체의 반응성의 컨트롤로서는, 1차 항체에 0.5 μg/ml의 항 아밀로이드 β 항체 「6E10」(Senetek사제)을 이용하였다.

이 결과를 도 2 및 도 3에 도시한다. 도 2중, 아밀로스페로이드는 실시예 1에서 조제한 아밀로스페로이드 40 함유액의 도트를, 용매는 컨트롤의 도트를, 또한 Aβ는 아밀로이드 β 40 모노머 단백질(Bachem사제)의 도트를 도시한다. 도 2로부터 명백한 바와 같이, 시판의 항 아밀로이드 β 항체「6E10」은 실시예 1에서 조제한 아밀로스페로이드 40과 아밀로이드 β 40 모노머 단백질(Bachem 사제) 모두 같은 정도 반응하는 데 대하여, 상기에서 얻어진 항체는 실시예 1에서 조제한 아밀로스페로이드 40과의 반응성과, 아밀로이드 β 40 단백질(Bachem사제)과의 반응성을 비교하면 아밀로스페로이드 40과의 반응성이 높은 것을 알 수 있었다. 즉 LAS-1000 plus를 이용한 정량적 해석으로부터, 이번에 제작한 항체는 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 미회합인 아밀로이드 β 모노머에의 반응성의 10배 이상 있었다. 정제 한 아밀로스페로이드 40을 이용한 경우에도 같은 결과를 얻을 수 있었다. 또한, 아밀로스페로이드 42를 이용하여도 같은 결과를 얻을 수 있었다. 이것들의 아밀로스페로이드와의 반응성이 높은 것이 나타난 폴리크로날 항체를, 이후 「항 아밀로스페로이드 항체」 또는 「폴리크로날 항 아밀로스페로이드 항체」의 예로서 이와 같이 칭하는 경우가 있다.

도 3A 및 도 3B에서는 40SR 및 42SR은 각각, 실시예 1에서 조제한 아밀로스페로이드 40 함유액 및 아밀로스페로이드 42 함유액(42SR)의 도트를, B는 컨트롤 단백질로서 이용한 우혈청 알부민의 도트를, 또한 M은 아밀로이드 β 40 단백질의 도트를 도시한다. 시판의 항 아밀로이드 β 항체 「6E10」「4G8」은 실시예 1에서 조제한 아밀로스페로이드 40, 아밀로스페로이드 42, 아밀로이드 β 40 단백질 중 어느 것이라도 반응하는 데 대하여, 실시예 2에서 수립한 마우스 모노크로날 항체는 아밀로스페로이드 40 및 아밀로스페로이드 42에 선택적으로 높게 반응하는 것을 알 수 있었다. 이들의, 아밀로스페로이드와의 반응성이 높은 것이 나타난 모노크로날 항체를, 이후 「항 아밀로스페로이드 항체」 또는 「모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체」의 예로서 이와 같이 칭하는 경우가 있다.

(3) 면역 전자현미경 관찰(아밀로스페로이드 및 아밀로이드 β 섬유와의 반응성의 확인)

아밀로이드 β 40을 고농도(100 μM 이상)로 회합시킨 후, 침강법 내지는 원심에 의해 섬유만을 회수하였다. 이와 같이 조제한 아밀로이드 β 섬유 1μg에 대하여, 실시예 2에서 취득한 폴리크로날 항 아밀로스페로이드 항체 및 시판의 항 아 밀로이드 β 항체「4G8」(Senetek사제)를 각각 5 μl섞고, 4℃로 밤새 반응시켰다. 그 후, 반응 용액에 염소 항 마우스 IgG-6 nm-Gold(오리온사제)를 첨가하고, 4℃로 1시간 반응시켰다. 이것을 초산우라늄을 이용한 네거티브 염색법에 의해 검출하고, 전자선 손상 저감법을 이용하여 관찰 및 사진 촬영을 행하였다. 도 4A에 도시한 바와 같이, 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 시판 항체 「4G8」은 아밀로이드 β 섬유를 잘 인식하였지만, 실시예 2에서 취득한 항 아밀로스페로이드 항체는 아밀로이드 β 섬유를 인식하지 않았다. 같은 실험을 모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체 MASD3을 이용하여 행한 바, 도 4B에 도시한 바와 같이, 아밀로이드 β 섬유를 인식하지 않았다.

(4) 해리정수 측정

BIACore3000(BIAcore사제)의 CM5 센서칩에 50 mM 초산 완충액중에서 10 μg/ml 아밀로스페로이드를 커플링하였다. 10 mM HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Durfactant P20중에서, 최고 농도 100 nM로부터 연속 2배 희석한 항체 용액을 이용하여 결합 속도 정수 및 해리 속도 정수를 구했다. 이들 정수로부터 다음 식에 의해 해리정수를 계산하였다.

해리정수=해리 속도 정수/결합 속도 정수

표 2에 마우스 모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체 및 시판항체의 아밀로스페로이드에 대한 해리정수를 나타낸다.

[표 2]

마우스 모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체의 해리정수

실시예 4: 항 아밀로스페로이드 항체의 항원 결정 부위(에피토프)의 결정

(1) 항 아밀로스페로이드 항체의 항원 결정 부위(에피토프)

항 아밀로스페로이드 항체의 에피토프를 결정하는 목적으로, 아밀로이드 β 모노머 단백질의 부분 배열을 N 단으로부터 5잔기씩 순차 화학 합성함으로써, 38 종류의 아밀로이드 β 5잔기 부분 배열 펩티드(금후, 5PA로 생략하고, N 단측으로부터 5PA1, 5PA2, …, 5PA38이라고 부르기로 한다. 표 3 참조)를 얻었다. 각 5PA는 HPLC에 의해 단일 피크가 될 때까지 정제한 후, 일정량마다 동결 건조를 행하고, 사용 직전까지 -20℃로써 보존하였다.

[표 3]

펩티드	서열 번호 2에 있어서의 아미노산 번호
5PA1	1 내지 5
5PA2	2 내지 6
5PA3	3 내지 7
5PA4	4 내지 8
5PA5	5 내지 9
5PA6	6 내지 10
5PA7	7 내지 11
5PA8	8 내지 12
5PA9	9 내지 13
5PA10	10 내지 14
5PAl1	11 내지 15
5PA12	12 내지 16
5PA13	13 내지 17
5PA14	14 내지 18
5PA15	15 내지 19
5PA16	16 내지 20
5PA17	17 내지 21
5PA18	18 내지 22
5PA19	19 내지 23
5PA20	20 내지 24
5PA21	21 내지 25
5PA22	22 내지 26
5PA23	23 내지 27
5PA24	24 내지 28
5PA25	25 내지 29
5PA26	26 내지 30
5PA27	27 내지 31
5PA28	28 내지 32
5PA29	29 내지 33
5PA30	30 내지 34
5PA31	31 내지 35
5PA32	32 내지 36
5PA33	33 내지 37
5PA34	34 내지 38
5PA35	35 내지 39
5PA36	36 내지 40
5PA37	37 내지 41
5PA38	38 내지 42

상기한 각 5PA를 멸균 완료 초순수에 녹이고, IgG에 정제한 각항 아밀로스페로이드 항체에 대하여 각 5PA 펩티드가 몰비로 100 내지 100만배가 되도록 5PA-항체 혼합 용액을 조제하였다. 실시예 3(1)에서 조제한 아밀로스페로이드 40 고상 플레이트에 각 5PA-희석액을 첨가하고, 4℃로써 밤새 진탕하며, 0.01% Tween 20-PBS(-) 용액으로 세정 후, 1만분의 1로 희석한 페록시다아제가 결합한 2차 항체(폴 리크로날 항체의 경우 항 토끼 항체, 모노크로날 항체의 경우 항 마우스 항체, 모두 Jackson Laboratories사제)를 첨가하여 1시간 진탕하였다. 이것을 0.01% Tween20-PBS(-) 용액으로써 세정하고, TMB Substrate Kit(PIERCE사제)를 이용하여 발색을 행하였다. 발색을 정지 후, 450 nm의 흡수를 플레이트 리더(Benchmark; BioRad사제)로 측정하여 결과를 얻었다. 그 결과, 이번에 얻은 폴리크로날 항 아밀로스페로이드 항체는 아밀로이드 β 모노머 단백질의 N 말단의 펩티드(5PA1)에 의해, 또한 각 모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체는 N 말단의 펩티드(5PA2)에 의해, 각각 가장 강하게 경합 저해가 걸리는 것이 명백해졌다. 한편, 아밀로이드 β 모노머에 대한 항체인 시판 N 말단 항체 「6E10」은 N 말단 펩티드(5PA5)에, 동일하게 아밀로이드 β 모노머에 대한 항체이며, 아밀로스페로이드보다 모노머에 대하여 약 2배 이상 강하게 반응하는 IBL사제 시판 N 말단 항체 「82E1」은 N 말단 펩티드(5PA1)에 의해, 각각 가장 강하게 저해가 결려 있었다.

(2) 경합 시험

각종 모노크로날 항체 및 토끼 폴리크로날 항체를 0.1M 탄산수소나트륨에 대하여 투석하였다. 항체 1 mg에 대하여 몰비로 10배량의 NHS-LC-Biotin(Pierce Chemical사)을 첨가하고, 4℃ 2시간 반응시켰다. PBS에 대하여 투석하고, 비오틴 표지 항체로서 사용하였다.

아밀로스페로이드 고상 ELISA법에 따라 경합 시험을 실시하였다. 비오틴화 항 아밀로스페로이드 항체(종농도 0.1 μg/ml)와 연속 희석한 각종 비표지 항체(종농도 0.1 내지 10 μg/ml)의 혼합액 50 μl를, 아밀로스페로이드를 고상화한 ELISA 플레이트에 첨가하여 실온 1시간 반응시켰다. 플레이트를 세정 후, 1 μg/ml에 희석한 페록시다아제 표지 Avidin D를 첨가하여 실온 1시간 반응시켰다. 플레이트를 세정하고 기질 용액(스미론사제)을 첨가하여 일정 시간 발색시키고, 플레이트 리더로써 흡광도를 측정하였다.

실시예 2에서 제작한 토끼 폴리크로날 항체, 마우스 모노크로날 항체 및 시판 항체의 경합 시험 결과를 표 4에 정리하였다. 2 종류의 토끼 폴리크로날 항 아밀로스페로이드 항체(ASD2, ASD3)와 3 종류의 마우스 모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체는 서로 경합하고, 공통의 에피토프를 인식하는 것이 시사되었다. 또한 이들의 항체는 시판 항체 「6E10」「4G8」「IBL10027」과 경합하지 않고, 이들 항체와는 인식하는 에피토프가 다른 것이 나타내어졌다.

[표 4]

실시예 5: 항 아밀로스페로이드 항체에 의한 아밀로스페로이드 형성 저해

(1) 항 아밀로스페로이드 항체 존재하에 있어서의 아밀로스페로이드의 조제

실시예 1에 기재한 방법에 따라 아밀로스페로이드 40 함유액을 조제하였다. 그 때, 항 아밀로스페로이드 항체를 0.1 mg/ml가 되도록 첨가하고, 7일간 회전을 행하였다. 대조로서, 시판의 항 단량체 아밀로이드 β 항체 「6E10」(Senetek사)을 같은 농도를 이용하고, 동일한 조작을 행한 것을 조제하였다.

(2) 항 아밀로스페로이드 항체에 의한 아밀로스페로이드의 형성 저해(전자현미경에 의한 해석)

(1)에 기재한 바와 같이 각종 항체 존재하에서 아밀로스페로이드 40 함유액 을 조제하였다. 각 함유액의 작은 물방울(수 μl)을, 초산우라늄 용액을 이용한 네거티브 염색법에 의해 전자선 손상 저감법을 이용하여 관찰과 사진 촬영을 행하였다. 촬영한 현미경 사진을 이용하여 각 조건하에 있어서의, 구형의 아밀로스페로이드의 형성을 해석하고, 입자 해석에 의해 입자 지름 및 입도분포를 구하였다. 그 결과, 폴리크로날 항 아밀로스페로이드 항체 존재하에서는 아밀로스페로이드 즉 10 내지 15 nm의 구상의 단백질은 형성되지 않았다. 이러한 형성 억제 효과는 「6E10」에서는 확인되지 않고, 회합하지 않는 아밀로이드 β 모노머 단백질을 인식하는 기존 항체에서는 형성 저해 효과는 얻어지지 않는 것이 명백해졌다

(3) 삼중 염색에 의한 신경세포 사멸 활성 평가법을 이용한 아밀로스페로이드 형성 저해의 해석

래트 18일 태아의 전뇌 기저부로부터 분산 배양에 의해 초대 배양세포를 조제하였다. 조제한 초대 배양세포는 폴리에틸렌이민(Sigma사제)에 의해 코팅한 배양 플레이트에 2×10⁵ cells/cm²가 되도록 파종하여 배양하였다. 3일간, 5% 우태아 혈청(하이크론사제)/5% 말의 혈청(Equitech사제)/1 mM Pyruvate/50 μg/ml Gentamicin(인비트로젠사제)/DMEM high glucose 배지(인비트로젠사제)로 배양 후, 무혈청 배지[0.5 mM L-Glutamine/50 μg/ml Gentamicin(인비트로젠사제)/B27 Supplement(인비트로젠사제)/Neurobasal medium(인비트로젠사제)]으로 교환하였다. 이 배양세포에 대하여, (1)에서 조제한 각종 항체 존재하에서 조제한 아밀로스페로이드 용액을, 각각 최종 농도 1 μM(아밀로이드 β 모노머 단백질 환산)가 되도록, 1웰씩 첨가하고, 신경 독성을 검증하였다. 신경 독성은 아무것도 첨가하지 않는 상태에서 조제한 아밀로스페로이드 용액의 독성과 비교함으로써 평가하였다. 백그라운드로서 용매를 같은 용량 웰에 첨가하였다. 첨가 후, 40 시간 배양을 행한 후에 PBS(-)로 세정하고, 최종 농도가 1 μg/ml의 Calcein-AM의, 최종 농도가 5 μg/ml의 프로피디움 요오드화물 희석액(20 mM Hepes pH 7.3, 130 mM NaCl, 5. 4 mM KCl, 5.5 mM glucose, 2 mM CaCl)으로 30분간 염색을 행하였다. 그 후, 10% 중성 포르말린중에 있어서 4℃에서 30분간 세포를 고정 처리를 행하고, 다음에 PBS(-)로 세정 후, 1 μg/ml Hoechst33258(Molecular Probes사제)과 5분간 반응시켜 삼중 염색을 행하였다.

이 시료에, 형광 현미경(Zeiss사제)하에서, 여기 레이저를 조사하고, 여기된 형광을 냉각 CCD 카메라(CoolSNAP HQ: Roper사제)로 검출하여 화상을 취입하고, 화상 데이터로서 보존하였다. 각 형광 색소의 여기 파장은 각각, Calcein-AM은 460 내지 490 nm, 프로피디움 요오드화물은 510 내지 550 nm, H 33258은 364 nm에서 행하였다. 얻어진 화상 데이터에 대해서, Hoechst33258로 염색된 전체 세포수, 및 프로피디움 요오드화물로 염색된 사세포수를 계수하였다. 하나의 시료에 대해 계수한 전체 세포수는 평균으로 대략 1000 내지 1200개 정도였다. 얻은 사세포수를 전체 세포수로 나눠 100을 곱한 값을 세포사 활성(%)으로서 계산하였다. 또한, 「사세포」는 프로피디움 요오드화물로 염색된 세포로 핵의 분단이나 위축 등의 아포토시스와 같은 변화를 나타낸 세포로 하였다.

이 결과, 도 5에 도시한 바와 같이, 폴리크로날 항 아밀로스페로이드 항체의 존재하에서 회전한 아밀로이드 β 단백질에는 신경세포 사멸 활성이 확인되지 않았다. 한편, 시판의 항 아밀로이드 β 단백질 항체「6E10」의 존재하에서 회전한 아밀로이드 β 단백질은 항체를 첨가하지 않고 형성시킨 경우와 같은 강한 신경세포 사멸 활성을 도시하였다.

따라서 실시예 5(2)에 기재한 전자현미경 사진의 결과와 맞추면, 실시예 2에서 취득한 항 아밀로스페로이드 항체는 아밀로스페로이드의 형성을 저해하는 활성을 갖는 것이 명백해졌다. 이에 대하여, 시판의 회합하지 않는 아밀로이드 β 모노머를 인식하는 「6E10」에는 아밀로스페로이드 형성을 저해하는 활성이 없는 것을 알 수 있었다.

실시예 6: 아밀로스페로이드의 세포독성의 중화활성의 평가

(1) 폴리크로날 항 아밀로스페로이드 항체에 의한 아밀로스페로이드 독성의 중화

실시예 5에 기재한 방법에 의해 준비한 래트 전뇌 기저부 유래 초대 배양 신경세포 1.1×10⁶ cell/ml에 대하여, 실시예 2에서 얻은 각 폴리크로날 항 아밀로스페로이드 항체 0.4 mg을 미리 첨가하고, 거기에 실시예 1에 기재한 방법에 기초하여 조제한 아밀로스페로이드 함유액을 10 ml 첨가하였다. 그 후, 40 시간 후에 실시예 4에 기재한 삼중 염색법을 이용하여 신경세포 사멸 활성의 평가를 실시하였다. 컨트롤로서, 각 항 아밀로스페로이드 항체만을 첨가한 경우의 신경세포 사멸 활성을 평가하고, 용매를 첨가한 백그라운드와 비교하였다. 대조로서, 시판 아밀로 이드 β 항체 「6E10」을 미리 투여하는 실험을 동시에 실시하였다. 도 6에 도시한 바와 같이, 항 아밀로스페로이드 항체 및 시판 항체 「6E10」 모두, 단독 투여로는 신경 독성을 발휘하지 않는다. 그에 대하여, 미리 항 아밀로스페로이드 항체를 투여한 경우에는, 아밀로스페로이드에 의한 신경 독성은 백그라운드 레벨 근처에 억제되었다. 한편, 시판 항체 「6E10」을 사전에 첨가한 경우에는, 아밀로스페로이드에 의한 신경 독성은 영향을 받지 않았다. 즉, 실시예 2에서 얻은 항 아밀로스페로이드 항체에는 아밀로스페로이드에 의한 신경 독성을 중화하는 활성이 확인되었지만, 회합하지 않는 아밀로이드 β 단백질 모노머를 인식하는 시판 항체 「6E10」에는 중화활성은 확인되지 않았다. 전뇌 기저부와 마찬가지로 알츠하이머병에 있어서 주 병변이 확인되는 해마 및 대뇌피질로부터 각각 초대 배양 신경을 조제하고, 같은 실험을 행한 바, 도 6의 결과와 동일한 효과를 얻을 수 있었다. 즉, 항 아밀로스페로이드 항체만 아밀로스페로이드에 의한 신경 독성을 백그라운드 레벨에 까지 억제하고 있었다. 따라서 항 아밀로스페로이드 항체는 알츠하이머병으로 상해를 주로 받는 뇌의 부위 어느 하나에 있어서도, 아밀로스페로이드에 의한 신경 독성으로부터 신경을 보호하는 효과가 있는 것이 나타났다.

(2) 시판 N 말단 항체에 의한 아밀로스페로이드 독성의 중화

실시예 5에 기재한 방법에 의해 준비한 래트 전뇌 기저부 유래 초대 배양 신경세포에 대하여, 실시예 6(1)에 도시한 바와 같이, 미리 항 아밀로스페로이드 항체 또는 시판의 항 N 말단 항체를 첨가하고, 거기에 실시예 1에 기재한 방법에 기초하여 조제한 아밀로스페로이드 42 함유액을 일정량 첨가하였다. 그 후, 40시간 후에 실시예 5에 기재한 삼중 염색법을 이용하여 신경세포 사멸 활성의 평가를 실시하였다. 그 후, 신경세포에 첨가한 용액중에 포함되는 아밀로이드 β 함량을 정량적 아미노산 분석에 의해 결정하고, 신경세포 사멸 비활성을 구하였다. 도 7에 도시한 바와 같이, 시판의 IBL사제 N 말단 항체는 아밀로스페로이드에 의한 신경 독성을 억제하지 않는 것을 알 수 있었다. cell signaling사제의 N 말단 항체도 아밀로스페로이드에 의한 신경 독성을 중화하지 않았다. 실시예 3에서 도시한 바와 같이, 항 아밀로스페로이드 항체의 가장 강한 에피토프는 N 말단에 있지만, N 말단 부분 펩티드를 이용하여 만들어진 시판의 N 말단 항체, Senetek사제 6E10, IBL사제 N 말단 항체, cell signaling사제 N 말단 항체는 모두 아밀로스페로이드에 의한 신경 독성을 억제할 수는 없고, 아밀로스페로이드를 항원에 이용한 항 아밀로스페로이드 항체만이 현저한 중화활성 나타내는 것을 알 수 있었다. 또한, 항 아밀로스페로이드 항체는 아밀로스페로이드 40 및 아밀로스페로이드 42 중 어느 하나에 대해서도, 보호 효과를 발휘하는 것이 명백해졌다.

(3) 모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체에 의한 아밀로스페로이드 독성의 중화

실시예 2(2)에서 얻은 각 모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체를 이용하여, 아밀로스페로이드 독성의 중화활성을 평가하였다. 평가 방법으로서는, (a) 실시예 5에 나타낸 방법에 따라, 래트 전뇌 기저부 유래 초대 배양 신경세포 및 래트 대뇌피질 유래 초대 배양세포를 이용하여 삼중 염색법에 의한 평가와, (b) 래트 대뇌피질을 이용하여, 아포토시스의 결과 발생하는 단편화한 뉴클레오솜(DNA와 히스톤의 혼합체)을, 항 히스톤 항체와 항 DNA 항체에 의한 샌드위치 ELISA에 의해 검출하는 평가의 2 종류를 이용하여 행하였다. 샌드위치 ELISA는 세포사 ELISA kit(Roche사제)를 이용하고, kit의 프로토콜에 따라 평가를 행하였다. 대뇌피질의 초대 배양은 기본적으로 실시예 4에 기재한 전뇌 기저부의 경우와 마찬가지로 조제를 행하였지만, 배양 밀도는 1.5x 10⁵ cells/cm²에 파종하고, 2시간 후에 무혈청 배지로 교환하였다. 아밀로스페로이드는, 실시예 2에 기재한 방법에 따라 조제한 아밀로스페로이드 40 및 아밀로스페로이드 42를 각각 이용하였다.

모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체 MASD1, 2, 3은 모두, 전뇌 및 대뇌피질 어느 하나의 초대 배양 신경세포에 있어서도, 아밀로스페로이드에 의한 신경 독성을 중화하는 효과를 발휘하고 있었다.

또한, 도 8에 아밀로스페로이드 42를 이용한 세포사 ELISA의 결과를 도시하지만, 폴리크로날 항 아밀로스페로이드 항체가 대뇌피질 유래 초대 배양 신경세포에 있어서는 1.2 mg/ml으로 거의 완전히 신경 독성을 억제하는 데 대하여, 모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체 MASD2는 0.15 mg/ml로 동등한 억제 효과를 발휘하고 있었다. 모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체 MASD1 및 MASD3도, MASD2와 동등한 억제 효과를 갖고 있었다. 따라서 모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체는 폴리크로날 항체의 대략 10배 강한 효과를 갖는 것이 도시되었다.

(4) 모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체에 의한 아밀로스페로이드의 제거에 의한 신경 독성의 억제

모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체를 이용하여 아밀로스페로이드의 면역 침강 실험을 행하였다. 면역 침강은 Antibodies-A laboratory manual(Ed Harlow & David Lane, Cold Springer Harbor Laboratory 1988)의 기재에 따라 실시하였다. 구체적으로는, 1% BSA-PBS(-)중으로써 아밀로스페로이드 42와 각종 모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체를 섞고, 실온에서 1시간 반응시킨 후에, 1/4량의 프로틴 G 세파로오스(아머샴 바이오 사이언스사제)를 첨가하며, 추가로 30분간 실온에서 교반 반응을 행하였다. 원심으로써 항체-프로틴 G 세파로오스의 회합물을 제거하였다. 대조로서 정상 마우스 혈청을 같은 양 이용하여, 같은 실험을 행하였다.

상기한 바와 같이 조제한 상청을 이용하여, 아밀로스페로이드 잔존율과 신경세포 사멸 활성을 해석하였다. 아밀로스페로이드 잔존율은 폴리크로날 항 아밀로스페로이드 항체와 시판 β 아밀로이드 항체(IBL10027)에 의한 샌드위치 ELISA로써 해석하였다. 즉, 회수한 상청을 1% BSA-PBS(-)로써 적절하게 희석을 행하고, 미리 폴리크로날 항 아밀로스페로이드 항체를 흡착시킨 96 구멍 ELISA 플레이트(Nunc사제 맥시소프)에 첨가하여 1시간 실온에서 반응시킨 후, 0.05% Tween20-PBS(-)에 의해 세정함으로써 미반응물을 제거하며, 시판 β 아밀로이드 항체(IBL10027)를 첨가, 실온에서 추가로 1시간 반응시켰다. 정량은 실시예 3에 기재한 바와 같이, 2차 항체로서 서양 와사비 페록시다아제 표지 항 마우스 IgG 항체를 첨가하고, 발색 반응에 의해 행하였다. 도 9는 면역 침강전의 용액에 포함되어 있던 아밀로스페로이드 42의 양에 대한 %로서 도시되어 있다. 상청에 포함되는 신경세포 사멸 활성은 실시예 6(1)에 기재한 방법에 따라, 아포토시스 활성을 정량하였다.

도 9에는 항체 MASD3의 결과를 나타내었지만, 항체 MASD2에 의해서도 거의 같은 결과를 얻었다. 도 9에 도시한 바와 같이, 모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체를 이용함으로써 95% 이상의 아밀로스페로이드 42를 제거하는 것에 성공하였다. 정상 마우스 혈청을 이용한 경우, 프로틴 G 세파로오스에 대한 비특이적 흡착에 의해 대략 40%의 아밀로스페로이드 42를 잃고, 신경세포 사멸 활성도 그에 상관하여 저하되었지만, 아직 강한 신경 독성이 검출되었다. 이에 대하여, 거의 완전하게 항 아밀로스페로이드 항체에 의해 아밀로스페로이드 42를 제거한 용액에는, 신경 독성은 전혀 확인되지 않았다. 이상으로부터, 확실히 아밀로스페로이드 42가 신경 독성의 본체이며, 이번 조제한 항 아밀로스페로이드 항체는 그것을 유효하면서 특이적으로 제거함으로써 신경 독성을 저지할 수 있는 것이 도시되었다.

실시예 7: 항 아밀로스페로이드 항체에 의한 칼슘 동태 이상의 억제

실시예 4에 기재한 방법을 이용하고, 래트 18일 태아의 해마로부터 분산 배양에 의해 초대 배양 신경세포를 조제하였다. 조제한 초대 배양세포는 1.0x10⁵cells/cm²가 되도록 파종하고, 배양 5 내지 6일째의 세포를 실험에 이용하였다. 신경세포는 2 mM CaCl₂을 포함한 balanced salt solution(130 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 5.5 mM glucose, 20 mM HEPES, pH 7.3)[BSS(+)로 약칭]으로써 fura-PE3/AM(800 μMTEF Labs사제)에 의해 충분히 염색한 후, 도립형 형광 현미경(올림푸스사제)하로써, 각 세포의 칼슘 동태 변화를 실시간으로 관측하였다. 구체적으로는 여기 필터를 연속적으로 전환함으로써 F340(340 nm 여기시의 480 nm 부근의 형광 강도)과 F380(380 nm 여기시의 480 nm 부근의 형광 강도)을 연속적으로 측정하고, 그것을 냉각 CCD 카메라에 의해 취입하며, Aqua Cosmos를 이용하여 F340/F380의 비로서 구함으로써 세포중의 칼슘 농도 변화를 추적하였다. 도 10의 결과가 도시하는 바와 같이, 해마 초대 배양 신경세포에 아밀로스페로이드 42 함유액을 투여한 순간, 세포 내 칼슘 농도의 급격한 증가가 확인되었다. 이 때, 미리 신경세포 사멸을 중화하는 데 충분한 농도의 폴리크로날 항 아밀로스페로이드 항체를 초대 배양 신경세포에 투여해 둠으로써, 이 급격한 세포 내에의 칼슘 유입을 억제할 수 있는 것이 명백해졌다. 항 아밀로스페로이드 항체에 의한 세포 내 칼슘 유입의 저지는 아밀로스페로이드를 포함하는 자기회합형 아밀로이드 β 단백질 함유액에 특이적이고, 글루타민산 투여에 의해 야기되는 급격한 세포 내에의 칼슘 유입에는 전혀 억제 효과를 나타내지 않았다. 모노크로날 항 아밀로스페로이드 항체 MASD1, 2, 3 중 어느 것이나 마찬가지로 세포 내 칼슘 유입을 억제하는 경향을 나타내었다.

본 발명의 항체는, 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 섬유에 대한 반응성보다 높고, 아밀로스페로이드에 의한 신경세포 사멸 유도에 대한 저해활성, 및/또는 아밀로스페로이드의 형성에 대한 저해활성을 더 갖는다. 또한, 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 높은 반응성을 나타내고, 아밀로스페로이드의 형성에 대한 저해활성을 갖는 항체도 포함한다. 아밀로스페로이드는, 알츠하이머병 환자 뇌 속에 존재하는 아밀로이드 β 단백질과 동등한 농도로 신경세포 사멸을 유도하기 위해 (1) 아밀로스페로이드의 형성에 대한 저해활성을 갖는 항체, 또는 (2) 아밀로스페로이드에 의한 신경세포 사멸 유도에 대한 저해활성을 갖는 항체를 취득하면, 알츠하이머병의 치료 또는 예방약으로서 이용할 수 있다. 또한, (3) 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 모노머 단백질이나 아밀로이드 β 섬유에 대한 반응성보다 높은 항체를 취득하면 알츠하이머병 개체의 검출에의 응용도 가능하다.

SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Chemical Corporation <120> A antibody and use thereof <130> A51616A <160> 3 <210> 1 <211> 40 <212> PRT <213> Human <400> 1 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40 <210> 2 <211> 42 <212> PRT <213> Human <400> 2 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 3 <211> 43 <212> PRT <213> Human <400> 3 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr 35 40

Claims

이하의 어느 하나 이상의 특징을 갖는 항체:

(i) 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 섬유에 대한 반응성보다 높음;

(ii) 아밀로스페로이드에 대한 높은 반응성을 가지며, 아밀로스페로이드에 의한 신경세포 사멸 유도에 대한 저해활성을 가짐;

(iii) 아밀로스페로이드에 대한 높은 반응성을 가지며, 아밀로스페로이드의 형성에 대한 저해활성을 가짐;

(iv) 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 높은 반응성을 가지며, 아밀로스페로이드의 형성에 대한 저해활성을 가짐.
제1항에 있어서, 항체의 아밀로스페로이드 및 아밀로이드 β 섬유에 대한 반응성을 동일한 항체 농도 및 항체량 및 동일한 항원 단백질 농도 및 항원 단백질량을 이용하여 비교하는 시스템에 있어서, 항체의 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 섬유에 대한 반응성의 2배 이상인 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 항체의 아밀로스페로이드 및 아밀로이드 β 섬유에 대한 반응성을 동일한 항체 농도 및 항체량 및 동일한 항원 단백질 농도 및 항원 단백질량을 이용하여 비교하는 시스템에 있어서, 항체의 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 섬유에 대한 반응성의 10배 이상인 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 아밀로스페로이드 및 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 반응성을 동일한 항체 농도 및 항체량 및 동일한 항원 단백질 농도 및 항원 단백질량을 이용하여 비교하는 시스템에 있어서, 항체의 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 반응성의 2배 이상인 항체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 아밀로스페로이드 및 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 반응성을 동일한 항체 농도 및 항체량 및 동일한 항원 단백질 농도 및 항원 단백질량을 이용하여 비교하는 시스템에 있어서, 항체의 아밀로스페로이드에 대한 반응성이 아밀로이드 β 모노머 단백질에 대한 반응성의 5배 이상인 항체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로스페로이드를 항원으로서 이용하여 얻어지는 것인 항체.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리크로날 항체인 항체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 모노크로날 항체인 항체.
제8항에 있어서, 아밀로스페로이드에 대한 해리정수(dissociation constant)가 10^-9이하인 모노크로날 항체.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드 β 모노머 단백질의 N 말단을 에피토프로서 인식하는 항체.
수탁 번호(수령 번호) FERM ABP-10392, FERM ABP-10393, 또는 FERM ABP-10394 중 어느 하나를 갖는 하이브리도마에 의해 생산되는 모노크로날 항체.
수탁 번호(수령 번호) FERM ABP-10392, FERM ABP-10393, 또는 FERM ABP-10394 중 어느 하나를 갖는 하이브리도마.
피검물질과 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재한 항체를 아밀로스페로이드에 접촉시키고, 피검물질의 아밀로스페로이드에의 결합성을 지표로서 후보 물질을 선택하는 것을 포함하는, 알츠하이머병의 치료 및/또는 예방약의 스크리닝 방법.
알츠하이머병의 의심이 있는 개체로부터 취득한 생체 시료를 제1항 내지 제 11항 중 어느 하나에 기재한 항체와 접촉시키고, 상기 샘플중의 상기 항체와 반응하는 물질의 유무를 측정하는 것을 포함하는 알츠하이머병 개체의 검출 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재한 항체를 포함하는 신경세포 보호제.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재한 항체를 포함하는 아밀로스페로이드 형성 저해제.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재한 항체를 포함하는 알츠하이머병의 검출을 위한 시약.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재한 항체를 포함하는 의약.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재한 항체를 포함하는 알츠하이머병의 치료 및/또는 예방약.
아밀로스페로이드를 피복하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재한 항체를 검출하기 위한 고상담체.