JP4227275B2 - 高い毒性を有するアミロイドβ蛋白質の調製方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高い毒性を有する自己会合型アミロイドβ蛋白質の調製方法、および該方法で調製された高い毒性を有する自己会合型アミロイドβ蛋白質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アミロイドβ蛋白質はアミノ酸約４０残基の非常に凝集性の高い蛋白質であり、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ＡＤ）の主要な病理学的変化のひとつである老人斑の主要な構成成分である。また、この蛋白質は、突然変異によって早期発症型アルツハイマー病の原因遺伝子となるアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）からプロテアーゼによるプロセッシングにより産生されることが判明している（Ｋａｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２５，７３３−７３６（１９８７）；Ｇｏｌｄｇａｂｅｒ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５，８７７−８８０（１９８７）；Ｒｏｂａｋｉｓ，Ｎ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，４１９０−４１９４（１９８７））。
【０００３】
このプロセッシングによりアミロイドβ蛋白質は水溶性のペプチドとして細胞外に放出されるが、その状態では神経細胞死誘発活性（以下、本明細書において神経細胞死誘発活性を「毒性」と称することがある。）を発揮せず、自己会合してアミロイドβ線維を形成することにより初めて毒性を獲得することが知られている（Ｌｏｒｅｚｏ，Ａ．ａｎｄ Ｙａｎｋｅｒ，Ｂ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，１２２４３−１２２４７（１９９４）；以下、自己会合して毒性を示すアミロイドβ蛋白質を「自己会合型アミロイドβ蛋白質」又は「毒性アミロイドβ蛋白質」と呼ぶ場合がある。）。Ｌｏｒｅｚｏらの方法は、アミロイドβ1-40を超純水に７００μＭになるように溶解し、同量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で塩濃度を調節した後、３７℃で５日間インキュベートする工程を含んでいる。アミロイドβ1-42を用いる場合には、超純水に３５０μＭになるように溶解し、３７℃で３日間インキュベートする工程を含む。
【０００４】
この自己会合型アミロイドβ蛋白質を神経系の培養細胞に高濃度で添加すると細胞を死に至らしめることができることから、アルツハイマー病においては自己会合して毒性を獲得した自己会合型アミロイドβ蛋白質が神経変性を誘発していると考えられている。従って、自己会合型アミロイドβ蛋白質の添加により神経系細胞等に細胞死を誘発する実験系は、アルツハイマー病における生体内での神経細胞死を反映していると考えることができ、神経細胞死の抑制剤のスクリーニング系などに有用である。
【０００５】
しかしながら、上記のＬｏｚｅｒｏらによる細胞死を誘発する系において用いられた自己会合型アミロイドβ蛋白質はその毒性が低く、試験管内で神経細胞死を誘発するために必要な濃度は、アルツハイマー病等の患者の生体内に存在する毒性アミロイドβ蛋白質の１，０００倍以上であった。また、上記の方法では毒性を有するアミロイドβ蛋白質含有液が再現性よく調製できず、調製された毒性を有するアミロイドβ蛋白質含有液を保存すると、ある期間を過ぎて毒性が失われるという問題もあった。従って、アルツハイマー病の研究に供するなどの目的のため、アルツハイマー病等の患者の生体内に存在するアミロイドβ蛋白質と同等の高い毒性を有し、かつその毒性が維持される自己会合型アミロイドβ蛋白質の調製方法の開発が望まれていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、アルツハイマー病等の患者の生体内に存在する自己会合型アミロイドβ蛋白質と同等の高い毒性を有し、かつその毒性が維持される自己会合型アミロイドβ蛋白質を提供することにある。また、本発明の別の課題は、上記アミロイドβ蛋白質の調製方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、アミロイドβ蛋白質を含む水溶液を対流させて一定時間処理することにより、あるいは該水溶液中にアミロイドβ蛋白質の凝集媒体を添加してアミロイドβ蛋白質の自己会合を誘起させることによってアミロイドβ蛋白質の自己会合を再現性よく誘発できること、及びこの処理によって得られる自己会合型アミロイドβ蛋白質が生体内に存在する自己会合型アミロイドβ蛋白質と同等の高い毒性を有しており、かつその毒性が長期にわたって保持されることを見いだした。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、アミロイドβ蛋白質を含む水溶液を対流させることにより得られる高い毒性を有する自己会合型アミロイドβ蛋白質、及びアミロイドβ蛋白質を含む水溶液中にアミロイドβ蛋白質の凝集媒体を添加することにより得られる高い毒性を有する自己会合型アミロイドβ蛋白質を提供するものである。この発明の好ましい態様によれば、アルツハイマー病等の患者の生体内に存在する自己会合型アミロイドβ蛋白質と実質的に同等の毒性を有する上記自己会合型アミロイドβ蛋白質；その毒性がアルツハイマー病等の患者の生体内に存在する自己会合型アミロイドβ蛋白質と実質的に同等の濃度で神経系細胞に細胞死を誘発するのに十分な毒性である上記の自己会合型アミロイドβ蛋白質；及び、５００ｎＭ以下の濃度で神経系細胞に細胞死を誘発する上記自己会合型アミロイドβ蛋白質が提供される。
【０００９】
別の観点からは、高い毒性を有する自己会合型アミロイドβ蛋白質の製造方法であって、アミロイドβ蛋白質を含む水溶液を対流させる工程を含む方法が提供される。上記工程は、好ましくは、上記水溶液を含む容器を回転させることにより、さらに好ましくは一定速度で回転させることにより行うことができる。また、本発明により、高い毒性を有する自己会合型アミロイドβ蛋白質の製造方法であって、アミロイドβ蛋白質を含む水溶液中にアミロイドβ蛋白質の凝集媒体を添加してアミロイドβ蛋白質の自己会合を誘起する工程を含む方法が提供される。凝集媒体としてはポリエチレングリコールが好ましい。さらに別の観点からは、上記の自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液；該含有液を含む試薬；及び、上記の自己化合型アミロイドβ蛋白質を用いて神経系細胞に細胞死を誘発する方法が提供される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質の調製のための原料として用いられるアミロイドβ蛋白質の種類は特に限定されない。アミロイドβ蛋白質は、約４０のアミノ酸残基からなる蛋白質であり、アミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）からプロテアーゼによるプロセッシングで産生される。このプロテアーゼの種類やその後の修飾によってさまざまな種類が存在することが知られているが、分泌直後にはＣ末端のアミノ酸残基の長さの違いによりアミロイドβ４０（ＡβX-40）とアミロイドβ４２（ＡβX-42）が存在する。
【００１１】
本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質の調製には、例えば、分泌直後のアミロイドβ蛋白質の全長の分子種であるアミロイドβ４０（Ａβ1-40：配列番号１）若しくはアミロイドβ４２（Ａβ1-42：配列番号２）、又はそれらの変異体、あるいはそれらの誘導体が好ましく用いられる。アミロイドβ蛋白質は、ペプチド合成機などを用いて合成したもの、市販のもの、又は生体内から抽出精製したもの、いかなるものを用いてもよい。アミロイドβ蛋白質の合成、抽出精製は、それ自体公知の通常用いられている方法で行うことができる。合成ペプチド等の精製は高速液体クロマトグラフィにおいて単一のピークが得られる程度行えば十分であるが、精製方法として、例えば、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィ等が用いられる。
【００１２】
本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質の調製は、通常、このようにして得られたアミロイドβ蛋白質を滅菌精製水に溶解し、得られた溶液に対流を惹起して維持することにより行われる。溶解に用いる滅菌精製水の量は、アミロイドβ蛋白質が溶解する範囲であればよいが、好ましくは水溶液中のアミロイドβ蛋白質の濃度が５０ｎＭ〜２ｍＭ、好ましくは１μＭ〜１ｍＭ、さらに好ましくは１００〜７００μＭとなる範囲である。この溶液を適当な塩濃度に調節することが望ましい。塩濃度は、アミロイドβ蛋白質が溶解される範囲であればいかなるものでもよいが、例えば、最終ｐＨが３〜１２、好ましくは５〜１０で、塩が１Ｍ以下であることが好ましい。このような塩濃度に調節する方法として、例えば、ＰＢＳ（−）をアミロイドβ蛋白質水溶液と等量加える方法が用いられる。溶解の方法はアミロイドβ蛋白質が適当な量の適当な塩濃度の溶液に完全に溶解する方法であれば特に制限はない。
【００１３】
上記水溶液中のアミロイドβ蛋白質を自己会合させるために上記水溶液を対流させるが、対流の流速及び維持時間は、水溶液中のアミロイドβ蛋白質が自己会合し、アルツハイマー病の患者の生体内における毒性アミロイドβ蛋白質と同等の濃度で神経細胞死を誘導する活性を有するようになるものであれば特に制限はない。ここで、アミロイドβ蛋白質の自己会合とは、該蛋白質の２分子以上が共有結合以外の分子間相互作用によって結合し、１個の分子のように行動する現象を意味しており、通常は、さらに多数の分子が会合することにより、顆粒状、線維状等の分子が形成され、その結果としてアミロイドβ蛋白質の毒性が獲得される。
【００１４】
例えば、アミロイドβ蛋白質水溶液を含む容器を、適当な温度範囲中で一定時間、適当な速度で回転し続ける方法が有効である。また、アミロイドβ蛋白質水溶液が常に対流し、かつ疎水性の界面に接触する状態を維持させてもよい。例えば、超音波分散機やスターラー等で該水溶液を攪拌する方法、またはアミロイドβ蛋白質水溶液を適当な流速で疎水性チューブ内で対流させる方法等も挙げられる。
【００１５】
また、アミロイドβ蛋白質水溶液中にアミロイドβ蛋白質の凝集媒体を添加する方法では、凝集媒体としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ：分子量３０００〜６０００程度のもの）などを添加し、１Ｍ以下程度の適当な塩濃度の存在下で静置することによる方法が挙げられる。アミロイドβ蛋白質の自己会合を誘起する凝集媒体としては、一般的に、蛋白質の結晶化を誘起する物質を用いることができる。例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウム、ギ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウムセチルトリメチルアンモニウム塩、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムなどの無機塩類；ＰＥＧ１００、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ１００００などのポリエチレングリコール類；アセトニトリル、アセトン、イソプロパノール、エタノール、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ブタノール、１，３−ブチロラクトン、１，３−プロパンジオール、２，５−ヘキサンジオール、メタノール、２−メチル−２，４−ペンタンジオールなどの有機溶媒を挙げることができる。凝集媒体の添加方法としては、一般的に蛋白質の結晶化に用いられる添加方法を採用することができる。これらの技術については、例えば、「生命科学のための結晶解析入門−タンパク質結晶解析のてびき、平山令明著、丸善株式会社」などに記載されている。
【００１６】
対流を維持するにあたり一定温度を維持することが望ましいが、その温度範囲はアミロイドβ蛋白質が変性しない範囲であれば特に制限はない。具体的には４〜５０℃、好ましくは４〜４０℃、さらに好ましくは４〜３７℃の範囲が挙げられる。容器に回転を加え続ける方法としては、アミロイドβ蛋白質の水溶液を含む容器を回転培養機、攪拌機、振とう機等を用いて回転させる方法が用いられるが、この中で回転培養器を用いるのが最も好ましい。回転速度は、通常２００ｒｐｍ以下、好ましくは５〜５０ｒｐｍ、さらに好ましくは２０〜４０ｒｐｍで行われる。また、回転を維持する時間は、水溶液中のアミロイドβ蛋白質が自己会合して十分な毒性を獲得するまで行われるが、具体的には回転の速度等の条件により４時間〜７日程度行われる。
【００１７】
アミロイドβ蛋白質水溶液を充填する容器としては、アミロイドβ蛋白質以外の蛋白質の混入が防げるものであればいかなるものでもよいが、一般的には、蛋白質が吸着しない素材の容器が望ましい。具体的には、プラスチック容器や、市販のエッペンドルフチューブ等がさらに望ましい。容量にも特に制限はない。また、他の蛋白質の混入を防ぐために、容器をあらかじめオートクレーブ等を用いて滅菌しておくことは効果的である。容器に充填するアミロイドβ蛋白質水溶液の量は、容器の全容積の３０〜９０％、さらには５０〜８０％が望ましい。容器中でアミロイドβ蛋白質水溶液に十分な対流を惹起させ、その対流を一定に維持することが望ましい。
【００１８】
このようにして得られた自己会合型アミロイドβ蛋白質は、このままでも神経系細胞に細胞死を誘導することができ、薬理学や生化学の実験などに供することが可能である。もっとも、実験などの使用目的に応じて、さらにアミロイドβ線維を取り除く等の精製を行ってもよい。精製の方法としては、自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液を遠心分離してその上清を分取する方法や、例えば０．４５μｍ以上の孔径を有するフィルター（例えば０．６５μｍのフィルターと３０ｋダルトン以上の分子量の物質をカットするフィルターとの組み合わせなど）で線維を除去する方法、ＬＰＦＦＤ（βシート破壊ペプチドｉＡβ５、ペプチド研究所；アミノ酸配列は一文字標記で示した）やＫＬＶＦＦ（アミノ酸配列は一文字標記で示した）等のβシート破壊ペプチドで線維を分解して取り除く方法、ゲル濾過等なども用いることが可能である。
【００１９】
本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液を用いた神経細胞死の誘導は、神経系の細胞等の培養液に本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液を添加し、通常の方法に従って培養することにより行うことができる。本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質により誘導される細胞死は、アポトーシス又はネクローシスのいずれでもよい。また、用いられる細胞としては、神経系細胞であれば特に制限はなく、哺乳動物（ヒト、ラット、マウス、サル、ブタ等）由来の神経系細胞や、これらの細胞に分化が可能な細胞等でもよい。また、初代培養細胞又は樹立培養株のいずれでもよい。初代培養細胞としては、上記した動物の海馬、および前脳基底野等から取得したものが好ましく、樹立培養株としては、例えば、ＰＣ−１２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７２１）、Ｂ１０３（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２４９（４５４），２２４−２２７（１９７４））等が好ましい。また上記動物の海馬等の器官をそのまま用いることも可能である。
【００２０】
これらの細胞や組織は、通常の培養法により培養することができる。具体的には、神経系細胞の初代培養、および神経系細胞の培養方法としては、Ｈｏｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９３，２７１９−２７２３（１９９６）、およびＳａｈｕｂｅｒｔ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２４９（４５４），２２４−２２７（１９７４）に記載されている方法等を用いることができ、器官培養は、Ｇａｒｙ Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄＫｉｍｂｅｒｙ Ｇｏｓｌｉｎ，Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｎｅｒｖｅ ｃｅｌｌｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭＩＴ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ（１９９８）に記載された方法等を用いることができる。このようにして培養された神経系の細胞、および器官に細胞死を誘導するために添加する本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質の量は適宜選択可能であるが、通常、アルツハイマー病等の患者の生体内に存在する毒性アミロイドβ蛋白質と実質的に同等の濃度で細胞死を誘導できる。例えば、初代培養(１．２５×１０6個／ｍｌ)あたり１０ｎＭ以上、４００μｍ海馬スライス／１ｍｌ培養液あたり１００ｐＭ以上などの量で細胞死を誘導できる。もっとも、上記の濃度は例示のためのものであり、この量に限定されることはない。
【００２１】
本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質によって誘導される神経系細胞の細胞死は、通常の場合、本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質の有効量を添加した後、約６時間程度から起こり、４８時間程度の後には顕著な細胞死の様子が観察できる。これらの細胞死を測定する方法としては、通常用いられる細胞死検出法を用いることができる。具体的には、被検体が細胞の場合、ＭＴＴアッセイ（Ｍｏｓｓｍａｎ，Ｔ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５，５５，（１９８３）、またはトリパンブルーダイエクスクルージョン法（Ｗｏｏ，Ｋ．Ｂ．，Ｗ．Ｋ．Ｆｕｎｋｈｏｕｓｅｒ，Ｃ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，ａｎｄ Ｏ．Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｎｅｔ．，１３（６），５９１−６０４（１９８０））、プロピディウムイオダイド等による染色法などが用いられ、器官スライス等の場合にはプロピディウムイオダイド等による染色法等が用いられる。
【００２２】
神経系細胞または神経系器官の培養液に本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質を添加することによりこれらの神経細胞死を誘導する系は、例えば、毒性アミロイドβ蛋白質による神経系細胞の細胞死に対して抑制作用を有する薬剤のスクリーニングに用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、神経系細胞または組織培養液に予め被検物質を添加した後、本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質を添加し、あるいは神経系細胞または組織培養液に本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質を添加した後に被検物質を添加して、該神経系細胞や組織の細胞死が被検薬物により抑制されるか否かを検出することにより行うことができる。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液の調製
（１）アミロイドβ（Ａβ1-40：配列番号１）樹脂の製造
Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ樹脂３４２ｍｇ（アミン含量０．７３ｍｍｏｌ／ｇ樹脂）をパーキンエルマーアプライドバイオシステムズ社製Ａ４３３型自動ペプチド合成機にセットし、これにＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨを供給し、ＨＢＴＵ［２−（１Ｈ−Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ）−１，１，３，３，−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ］を縮合剤として順次縮合させて上記の側鎖保護アミロイドβ（Ａβ1-40）樹脂１．５１５ｇを得た。
【００２４】
（２）トリフルオロ酢酸処理
上記（１）で得た側鎖保護アミロイドβ（Ａβ1-40）樹脂中の３０４ｍｇを採取し、これにフェノール０．７５ｍｌとチオアニソール０．５ｍｌとトリフルオロ酢酸８．２５ｍｌとエタンジチオール０．２５ｍｌと蒸留水０．５ｍｌを加え、氷冷下５分、続いて室温で１．５時間反応させた。反応終了後、氷冷したジエチルエーテル２００ｍｌを加えてペプチドを沈殿させた。全内容物をグラスフィルターで濾取し、冷ジエチルエーテルで洗浄した後、３５％のアセトニトリルを含む０．１％トリフルオロ酢酸（約２００ｍｌ）で抽出処理してＨ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＯＨで表される粗ペプチド１９１ｍｇを得た。
【００２５】
（３）ペプチドの精製
この粗ペプチドを３５％のアセトニトリルを含む０．１％トリフルオロ酢酸（４０ｍｌ）に溶解しＯＤＳ（オクタデシルシラン）をシリカに結合した逆相系のカラム（内径２ｃｍ、長さ２５ｃｍ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。溶出は０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル濃度を２２％から４２％へ直線的に２０分間で上昇させることによりおこなった。精製物の収量は３５ｍｇであった。本物質の構造はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により確認された。測定値［Ｍ＋Ｈ］＋４３３０．９９、計算値（Ｃ194Ｈ295Ｎ53Ｏ58Ｓ1＋Ｈ）４３３０．８９。
【００２６】
（４）自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液の調製
上記（３）で精製を行ったアミロイドβ蛋白質０．４μｍｏｌを１．５ｍｌ容量のエッペンドルフチューブに入れ、これに５３２μｌの超純水と５３２μｌのＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ社製）を順次加え、アミロイドβ蛋白質を完全に溶解させた。このアミロイドβ蛋白質水溶液の入ったエッペンドルフチューブをダックローター（ＴＡＩＴＥＣ社製、ローター：ＲＴ５０）に取り付け、３７℃において３５ｒｐｍの速度で７日間回転させた。
【００２７】
例２：自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液の毒性の検定
（１）初代培養細胞の調製
ラット１８日胎児（２腹分）の前脳基底野より分散培養によって初代培養細胞を調製した。この初代培養細胞をポリエルリジン（ナカライテスク社製）によりコーティングした２４ウェルプラスチック細胞培養プレート中で培養した。コーティングは０．５ｍｇポリエルリジン／１ｍｌ ０．１５Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８．３）のポリエルリジン溶液に培養プレートを１晩浸漬した後、滅菌精製水で洗浄し、自然乾燥させて行った。初代培養細胞は培養プレート１ウェルの底面積に対して、３×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の密度となるように、５％牛胎児血清（ハイクローン社製）／５％馬血清（ライフテックオリエンタル社製）１ｍＭ Ｐｙｒｕｖａｔｅ／５０μｇ／ｍｌ Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ライフテックオリエンタル社製）／ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地（ライフテックオリエンタル社製）で調製した。培養は３７℃、１０％ＣＯ2中で４日間行った。
【００２８】
（２）自己会合型アミロイドβ蛋白質の添加
上記（１）で得られた初代培養細胞について、培養液をＢ２７（ライフテックオリエンタル社製）、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（ライフテックオリエンタル社製）、０．５ｍＭ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、５０μｇ／ｍｌ Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ライフテックオリエンタル社製）培地０．５ｍｌ／１ウェルに交換した。培地交換後、３７℃、１０％ＣＯ2中で３日間さらに培養を行った。この培養細胞に対し、例１で得られた自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液を最終アミロイドβ蛋白質濃度が１、２、５、１０μＭ／１ウェル、またコントロールとしてＰＢＳ／Ｈ2Ｏを等容量２ウェルのそれぞれ細胞外液に添加した。添加後、３７℃、１０％ＣＯ2中で１６時間培養を行った。
【００２９】
（３）ＭＴＴ活性測定
上記（２）で自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液を添加していない２ウェルのうちの１つにＴｒｉｔｏｎＸ−１００を最終濃度が０．１％となるように添加し、３７℃、１０％ＣＯ2中で１０分間培養した。このようにして毒性アミロイドβ蛋白質含有液を添加した４ウェル、コントロールの１ウェル、及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加してウェル内の培養細胞を死滅させた１ウェルの計６ウェルについて培地を除去し、２５０μｇ ＭＴＴ（シグマ社製）／ＰＢＳ５０μｌを注入した。これらを３７℃、１０％ＣＯ2中で３時間培養した後、２０％ ＳＤＳ（ナカライテスク社製）、５０％ ＤＭＦ（ｄｉｍｅｔｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）ｐＨ３．５／Ｈ2Ｏを５０μｌ添加した。これをさらに３７℃、１０％ＣＯ2中で２時間静置し、細胞を完全に融解させた。この各ウェル中の細胞融解液について５７０ｎｍの吸光度を測定した。この５７０ｎｍの吸光度について、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えて細胞をすべて死滅させたウェルにおける値をバックグラウンドとして他のウェルにおける値から差し引いた値の結果を図１（白丸）に示した。
【００３０】
例３：アミロイドβ蛋白質水溶液を回転を加えず調製したアミロイドβ蛋白質含有液の毒性の検定
アミロイドβ蛋白質を可溶化後、回転を加えないで調製したアミロイドβ蛋白質含有液を用いた他は、例２と同様の実験を行った。結果を図１（黒四角）に示した。例２で得られた結果との比較から、アミロイドβ蛋白質を可溶化後、回転をさせて自己会合型アミロイドβ蛋白質を調製した場合にのみ、神経系細胞に細胞死を誘導する活性を有する毒性アミロイドβ蛋白質を調製できることが明らかになった。
【００３１】
例４：自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液が有する毒性の持続性の検定
上記例１及び３で調製した自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液について、調製後それぞれ４℃に７〜１４日間静置した。これらのアミロイドβ蛋白質含有液について、上記例２と同様の方法で毒性を検定した。ラット１８日胎児の前脳基底野より分散培養によって調製した初代培養細胞の各細胞外液に対し、最終濃度５μＭとなるようにアミロイドβ蛋白質含有液を添加した。添加後、３７℃、１０％ＣＯ2中で１６時間培養を行った後、上記例２（３）に記載のとおりにＭＴＴ活性を測定した。この結果を図２に示した。以上の結果より、アミロイドβ蛋白質を可溶化後、容器を回転させて自己会合型アミロイドβ蛋白質を調製した場合にのみ、神経系細胞に細胞死を誘導する活性が１４日保持されることが明らかになった。
【００３２】
【発明の効果】
本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質は、アルツハイマー病患者の生体内に存在する毒性アミロイドβ蛋白質と同等の強い毒性を有しており、かつその毒性が保持される特性を有する。従って、神経系細胞又は神経系器官の培養液に本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質を添加することにより、生体内で惹起されている神経細胞死をインビトロで忠実に再現することができる。また、本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質を用いることにより、神経系細胞の細胞死を抑制する作用を有する物質のスクリーニングを行うことができる。
【００３３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の方法で調製した自己会合型アミロイドβ蛋白質が神経系細胞に細胞死を誘導する高い毒性を有することを示した図である。図中、白丸は本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質の結果を示し、黒四画はアミロイドβ蛋白質の溶液に回転を加えずに調製したアミロイドβ蛋白質溶液についての結果を示す。
【図２】 本発明の方法で調製した自己会合型アミロイドβ蛋白質を保存したときの毒性の変化を示した図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、高い毒性を有する自己会合型アミロイドβ蛋白質の調製方法、および該方法で調製された高い毒性を有する自己会合型アミロイドβ蛋白質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アミロイドβ蛋白質はアミノ酸約４０残基の非常に凝集性の高い蛋白質であり、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ＡＤ）の主要な病理学的変化のひとつである老人斑の主要な構成成分である。また、この蛋白質は、突然変異によって早期発症型アルツハイマー病の原因遺伝子となるアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）からプロテアーゼによるプロセッシングにより産生されることが判明している（Ｋａｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２５，７３３−７３６（１９８７）；Ｇｏｌｄｇａｂｅｒ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５，８７７−８８０（１９８７）；Ｒｏｂａｋｉｓ，Ｎ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，４１９０−４１９４（１９８７））。
【０００３】
このプロセッシングによりアミロイドβ蛋白質は水溶性のペプチドとして細胞外に放出されるが、その状態では神経細胞死誘発活性（以下、本明細書において神経細胞死誘発活性を「毒性」と称することがある。）を発揮せず、自己会合してアミロイドβ線維を形成することにより初めて毒性を獲得することが知られている（Ｌｏｒｅｚｏ，Ａ．ａｎｄ Ｙａｎｋｅｒ，Ｂ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，１２２４３−１２２４７（１９９４）；以下、自己会合して毒性を示すアミロイドβ蛋白質を「自己会合型アミロイドβ蛋白質」又は「毒性アミロイドβ蛋白質」と呼ぶ場合がある。）。Ｌｏｒｅｚｏらの方法は、アミロイドβ1-40を超純水に７００μＭになるように溶解し、同量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で塩濃度を調節した後、３７℃で５日間インキュベートする工程を含んでいる。アミロイドβ1-42を用いる場合には、超純水に３５０μＭになるように溶解し、３７℃で３日間インキュベートする工程を含む。
【０００４】
この自己会合型アミロイドβ蛋白質を神経系の培養細胞に高濃度で添加すると細胞を死に至らしめることができることから、アルツハイマー病においては自己会合して毒性を獲得した自己会合型アミロイドβ蛋白質が神経変性を誘発していると考えられている。従って、自己会合型アミロイドβ蛋白質の添加により神経系細胞等に細胞死を誘発する実験系は、アルツハイマー病における生体内での神経細胞死を反映していると考えることができ、神経細胞死の抑制剤のスクリーニング系などに有用である。
【０００５】
しかしながら、上記のＬｏｚｅｒｏらによる細胞死を誘発する系において用いられた自己会合型アミロイドβ蛋白質はその毒性が低く、試験管内で神経細胞死を誘発するために必要な濃度は、アルツハイマー病等の患者の生体内に存在する毒性アミロイドβ蛋白質の１，０００倍以上であった。また、上記の方法では毒性を有するアミロイドβ蛋白質含有液が再現性よく調製できず、調製された毒性を有するアミロイドβ蛋白質含有液を保存すると、ある期間を過ぎて毒性が失われるという問題もあった。従って、アルツハイマー病の研究に供するなどの目的のため、アルツハイマー病等の患者の生体内に存在するアミロイドβ蛋白質と同等の高い毒性を有し、かつその毒性が維持される自己会合型アミロイドβ蛋白質の調製方法の開発が望まれていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、アルツハイマー病等の患者の生体内に存在する自己会合型アミロイドβ蛋白質と同等の高い毒性を有し、かつその毒性が維持される自己会合型アミロイドβ蛋白質を提供することにある。また、本発明の別の課題は、上記アミロイドβ蛋白質の調製方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、アミロイドβ蛋白質を含む水溶液を対流させて一定時間処理することにより、あるいは該水溶液中にアミロイドβ蛋白質の凝集媒体を添加してアミロイドβ蛋白質の自己会合を誘起させることによってアミロイドβ蛋白質の自己会合を再現性よく誘発できること、及びこの処理によって得られる自己会合型アミロイドβ蛋白質が生体内に存在する自己会合型アミロイドβ蛋白質と同等の高い毒性を有しており、かつその毒性が長期にわたって保持されることを見いだした。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、アミロイドβ蛋白質を含む水溶液を対流させることにより得られる高い毒性を有する自己会合型アミロイドβ蛋白質、及びアミロイドβ蛋白質を含む水溶液中にアミロイドβ蛋白質の凝集媒体を添加することにより得られる高い毒性を有する自己会合型アミロイドβ蛋白質を提供するものである。この発明の好ましい態様によれば、アルツハイマー病等の患者の生体内に存在する自己会合型アミロイドβ蛋白質と実質的に同等の毒性を有する上記自己会合型アミロイドβ蛋白質；その毒性がアルツハイマー病等の患者の生体内に存在する自己会合型アミロイドβ蛋白質と実質的に同等の濃度で神経系細胞に細胞死を誘発するのに十分な毒性である上記の自己会合型アミロイドβ蛋白質；及び、５００ｎＭ以下の濃度で神経系細胞に細胞死を誘発する上記自己会合型アミロイドβ蛋白質が提供される。
【０００９】
別の観点からは、高い毒性を有する自己会合型アミロイドβ蛋白質の製造方法であって、アミロイドβ蛋白質を含む水溶液を対流させる工程を含む方法が提供される。上記工程は、好ましくは、上記水溶液を含む容器を回転させることにより、さらに好ましくは一定速度で回転させることにより行うことができる。また、本発明により、高い毒性を有する自己会合型アミロイドβ蛋白質の製造方法であって、アミロイドβ蛋白質を含む水溶液中にアミロイドβ蛋白質の凝集媒体を添加してアミロイドβ蛋白質の自己会合を誘起する工程を含む方法が提供される。凝集媒体としてはポリエチレングリコールが好ましい。さらに別の観点からは、上記の自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液；該含有液を含む試薬；及び、上記の自己化合型アミロイドβ蛋白質を用いて神経系細胞に細胞死を誘発する方法が提供される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質の調製のための原料として用いられるアミロイドβ蛋白質の種類は特に限定されない。アミロイドβ蛋白質は、約４０のアミノ酸残基からなる蛋白質であり、アミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）からプロテアーゼによるプロセッシングで産生される。このプロテアーゼの種類やその後の修飾によってさまざまな種類が存在することが知られているが、分泌直後にはＣ末端のアミノ酸残基の長さの違いによりアミロイドβ４０（ＡβX-40）とアミロイドβ４２（ＡβX-42）が存在する。
【００１１】
本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質の調製には、例えば、分泌直後のアミロイドβ蛋白質の全長の分子種であるアミロイドβ４０（Ａβ1-40：配列番号１）若しくはアミロイドβ４２（Ａβ1-42：配列番号２）、又はそれらの変異体、あるいはそれらの誘導体が好ましく用いられる。アミロイドβ蛋白質は、ペプチド合成機などを用いて合成したもの、市販のもの、又は生体内から抽出精製したもの、いかなるものを用いてもよい。アミロイドβ蛋白質の合成、抽出精製は、それ自体公知の通常用いられている方法で行うことができる。合成ペプチド等の精製は高速液体クロマトグラフィにおいて単一のピークが得られる程度行えば十分であるが、精製方法として、例えば、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィ等が用いられる。
【００１２】
本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質の調製は、通常、このようにして得られたアミロイドβ蛋白質を滅菌精製水に溶解し、得られた溶液に対流を惹起して維持することにより行われる。溶解に用いる滅菌精製水の量は、アミロイドβ蛋白質が溶解する範囲であればよいが、好ましくは水溶液中のアミロイドβ蛋白質の濃度が５０ｎＭ〜２ｍＭ、好ましくは１μＭ〜１ｍＭ、さらに好ましくは１００〜７００μＭとなる範囲である。この溶液を適当な塩濃度に調節することが望ましい。塩濃度は、アミロイドβ蛋白質が溶解される範囲であればいかなるものでもよいが、例えば、最終ｐＨが３〜１２、好ましくは５〜１０で、塩が１Ｍ以下であることが好ましい。このような塩濃度に調節する方法として、例えば、ＰＢＳ（−）をアミロイドβ蛋白質水溶液と等量加える方法が用いられる。溶解の方法はアミロイドβ蛋白質が適当な量の適当な塩濃度の溶液に完全に溶解する方法であれば特に制限はない。
【００１３】
上記水溶液中のアミロイドβ蛋白質を自己会合させるために上記水溶液を対流させるが、対流の流速及び維持時間は、水溶液中のアミロイドβ蛋白質が自己会合し、アルツハイマー病の患者の生体内における毒性アミロイドβ蛋白質と同等の濃度で神経細胞死を誘導する活性を有するようになるものであれば特に制限はない。ここで、アミロイドβ蛋白質の自己会合とは、該蛋白質の２分子以上が共有結合以外の分子間相互作用によって結合し、１個の分子のように行動する現象を意味しており、通常は、さらに多数の分子が会合することにより、顆粒状、線維状等の分子が形成され、その結果としてアミロイドβ蛋白質の毒性が獲得される。
【００１４】
例えば、アミロイドβ蛋白質水溶液を含む容器を、適当な温度範囲中で一定時間、適当な速度で回転し続ける方法が有効である。また、アミロイドβ蛋白質水溶液が常に対流し、かつ疎水性の界面に接触する状態を維持させてもよい。例えば、超音波分散機やスターラー等で該水溶液を攪拌する方法、またはアミロイドβ蛋白質水溶液を適当な流速で疎水性チューブ内で対流させる方法等も挙げられる。
【００１５】
また、アミロイドβ蛋白質水溶液中にアミロイドβ蛋白質の凝集媒体を添加する方法では、凝集媒体としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ：分子量３０００〜６０００程度のもの）などを添加し、１Ｍ以下程度の適当な塩濃度の存在下で静置することによる方法が挙げられる。アミロイドβ蛋白質の自己会合を誘起する凝集媒体としては、一般的に、蛋白質の結晶化を誘起する物質を用いることができる。例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウム、ギ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウムセチルトリメチルアンモニウム塩、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムなどの無機塩類；ＰＥＧ１００、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ１００００などのポリエチレングリコール類；アセトニトリル、アセトン、イソプロパノール、エタノール、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ブタノール、１，３−ブチロラクトン、１，３−プロパンジオール、２，５−ヘキサンジオール、メタノール、２−メチル−２，４−ペンタンジオールなどの有機溶媒を挙げることができる。凝集媒体の添加方法としては、一般的に蛋白質の結晶化に用いられる添加方法を採用することができる。これらの技術については、例えば、「生命科学のための結晶解析入門−タンパク質結晶解析のてびき、平山令明著、丸善株式会社」などに記載されている。
【００１６】
対流を維持するにあたり一定温度を維持することが望ましいが、その温度範囲はアミロイドβ蛋白質が変性しない範囲であれば特に制限はない。具体的には４〜５０℃、好ましくは４〜４０℃、さらに好ましくは４〜３７℃の範囲が挙げられる。容器に回転を加え続ける方法としては、アミロイドβ蛋白質の水溶液を含む容器を回転培養機、攪拌機、振とう機等を用いて回転させる方法が用いられるが、この中で回転培養器を用いるのが最も好ましい。回転速度は、通常２００ｒｐｍ以下、好ましくは５〜５０ｒｐｍ、さらに好ましくは２０〜４０ｒｐｍで行われる。また、回転を維持する時間は、水溶液中のアミロイドβ蛋白質が自己会合して十分な毒性を獲得するまで行われるが、具体的には回転の速度等の条件により４時間〜７日程度行われる。
【００１７】
アミロイドβ蛋白質水溶液を充填する容器としては、アミロイドβ蛋白質以外の蛋白質の混入が防げるものであればいかなるものでもよいが、一般的には、蛋白質が吸着しない素材の容器が望ましい。具体的には、プラスチック容器や、市販のエッペンドルフチューブ等がさらに望ましい。容量にも特に制限はない。また、他の蛋白質の混入を防ぐために、容器をあらかじめオートクレーブ等を用いて滅菌しておくことは効果的である。容器に充填するアミロイドβ蛋白質水溶液の量は、容器の全容積の３０〜９０％、さらには５０〜８０％が望ましい。容器中でアミロイドβ蛋白質水溶液に十分な対流を惹起させ、その対流を一定に維持することが望ましい。
【００１８】
このようにして得られた自己会合型アミロイドβ蛋白質は、このままでも神経系細胞に細胞死を誘導することができ、薬理学や生化学の実験などに供することが可能である。もっとも、実験などの使用目的に応じて、さらにアミロイドβ線維を取り除く等の精製を行ってもよい。精製の方法としては、自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液を遠心分離してその上清を分取する方法や、例えば０．４５μｍ以上の孔径を有するフィルター（例えば０．６５μｍのフィルターと３０ｋダルトン以上の分子量の物質をカットするフィルターとの組み合わせなど）で線維を除去する方法、ＬＰＦＦＤ（βシート破壊ペプチドｉＡβ５、ペプチド研究所；アミノ酸配列は一文字標記で示した）やＫＬＶＦＦ（アミノ酸配列は一文字標記で示した）等のβシート破壊ペプチドで線維を分解して取り除く方法、ゲル濾過等なども用いることが可能である。
【００１９】
本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液を用いた神経細胞死の誘導は、神経系の細胞等の培養液に本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液を添加し、通常の方法に従って培養することにより行うことができる。本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質により誘導される細胞死は、アポトーシス又はネクローシスのいずれでもよい。また、用いられる細胞としては、神経系細胞であれば特に制限はなく、哺乳動物（ヒト、ラット、マウス、サル、ブタ等）由来の神経系細胞や、これらの細胞に分化が可能な細胞等でもよい。また、初代培養細胞又は樹立培養株のいずれでもよい。初代培養細胞としては、上記した動物の海馬、および前脳基底野等から取得したものが好ましく、樹立培養株としては、例えば、ＰＣ−１２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７２１）、Ｂ１０３（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２４９（４５４），２２４−２２７（１９７４））等が好ましい。また上記動物の海馬等の器官をそのまま用いることも可能である。
【００２０】
これらの細胞や組織は、通常の培養法により培養することができる。具体的には、神経系細胞の初代培養、および神経系細胞の培養方法としては、Ｈｏｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９３，２７１９−２７２３（１９９６）、およびＳａｈｕｂｅｒｔ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２４９（４５４），２２４−２２７（１９７４）に記載されている方法等を用いることができ、器官培養は、Ｇａｒｙ Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄＫｉｍｂｅｒｙ Ｇｏｓｌｉｎ，Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｎｅｒｖｅ ｃｅｌｌｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭＩＴ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ（１９９８）に記載された方法等を用いることができる。このようにして培養された神経系の細胞、および器官に細胞死を誘導するために添加する本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質の量は適宜選択可能であるが、通常、アルツハイマー病等の患者の生体内に存在する毒性アミロイドβ蛋白質と実質的に同等の濃度で細胞死を誘導できる。例えば、初代培養(１．２５×１０6個／ｍｌ)あたり１０ｎＭ以上、４００μｍ海馬スライス／１ｍｌ培養液あたり１００ｐＭ以上などの量で細胞死を誘導できる。もっとも、上記の濃度は例示のためのものであり、この量に限定されることはない。
【００２１】
本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質によって誘導される神経系細胞の細胞死は、通常の場合、本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質の有効量を添加した後、約６時間程度から起こり、４８時間程度の後には顕著な細胞死の様子が観察できる。これらの細胞死を測定する方法としては、通常用いられる細胞死検出法を用いることができる。具体的には、被検体が細胞の場合、ＭＴＴアッセイ（Ｍｏｓｓｍａｎ，Ｔ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５，５５，（１９８３）、またはトリパンブルーダイエクスクルージョン法（Ｗｏｏ，Ｋ．Ｂ．，Ｗ．Ｋ．Ｆｕｎｋｈｏｕｓｅｒ，Ｃ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，ａｎｄ Ｏ．Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｎｅｔ．，１３（６），５９１−６０４（１９８０））、プロピディウムイオダイド等による染色法などが用いられ、器官スライス等の場合にはプロピディウムイオダイド等による染色法等が用いられる。
【００２２】
神経系細胞または神経系器官の培養液に本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質を添加することによりこれらの神経細胞死を誘導する系は、例えば、毒性アミロイドβ蛋白質による神経系細胞の細胞死に対して抑制作用を有する薬剤のスクリーニングに用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、神経系細胞または組織培養液に予め被検物質を添加した後、本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質を添加し、あるいは神経系細胞または組織培養液に本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質を添加した後に被検物質を添加して、該神経系細胞や組織の細胞死が被検薬物により抑制されるか否かを検出することにより行うことができる。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液の調製
（１）アミロイドβ（Ａβ1-40：配列番号１）樹脂の製造
Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ樹脂３４２ｍｇ（アミン含量０．７３ｍｍｏｌ／ｇ樹脂）をパーキンエルマーアプライドバイオシステムズ社製Ａ４３３型自動ペプチド合成機にセットし、これにＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨを供給し、ＨＢＴＵ［２−（１Ｈ−Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ）−１，１，３，３，−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ］を縮合剤として順次縮合させて上記の側鎖保護アミロイドβ（Ａβ1-40）樹脂１．５１５ｇを得た。
【００２４】
（２）トリフルオロ酢酸処理
上記（１）で得た側鎖保護アミロイドβ（Ａβ1-40）樹脂中の３０４ｍｇを採取し、これにフェノール０．７５ｍｌとチオアニソール０．５ｍｌとトリフルオロ酢酸８．２５ｍｌとエタンジチオール０．２５ｍｌと蒸留水０．５ｍｌを加え、氷冷下５分、続いて室温で１．５時間反応させた。反応終了後、氷冷したジエチルエーテル２００ｍｌを加えてペプチドを沈殿させた。全内容物をグラスフィルターで濾取し、冷ジエチルエーテルで洗浄した後、３５％のアセトニトリルを含む０．１％トリフルオロ酢酸（約２００ｍｌ）で抽出処理してＨ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＯＨで表される粗ペプチド１９１ｍｇを得た。
【００２５】
（３）ペプチドの精製
この粗ペプチドを３５％のアセトニトリルを含む０．１％トリフルオロ酢酸（４０ｍｌ）に溶解しＯＤＳ（オクタデシルシラン）をシリカに結合した逆相系のカラム（内径２ｃｍ、長さ２５ｃｍ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。溶出は０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル濃度を２２％から４２％へ直線的に２０分間で上昇させることによりおこなった。精製物の収量は３５ｍｇであった。本物質の構造はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により確認された。測定値［Ｍ＋Ｈ］＋４３３０．９９、計算値（Ｃ194Ｈ295Ｎ53Ｏ58Ｓ1＋Ｈ）４３３０．８９。
【００２６】
（４）自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液の調製
上記（３）で精製を行ったアミロイドβ蛋白質０．４μｍｏｌを１．５ｍｌ容量のエッペンドルフチューブに入れ、これに５３２μｌの超純水と５３２μｌのＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ社製）を順次加え、アミロイドβ蛋白質を完全に溶解させた。このアミロイドβ蛋白質水溶液の入ったエッペンドルフチューブをダックローター（ＴＡＩＴＥＣ社製、ローター：ＲＴ５０）に取り付け、３７℃において３５ｒｐｍの速度で７日間回転させた。
【００２７】
例２：自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液の毒性の検定
（１）初代培養細胞の調製
ラット１８日胎児（２腹分）の前脳基底野より分散培養によって初代培養細胞を調製した。この初代培養細胞をポリエルリジン（ナカライテスク社製）によりコーティングした２４ウェルプラスチック細胞培養プレート中で培養した。コーティングは０．５ｍｇポリエルリジン／１ｍｌ ０．１５Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８．３）のポリエルリジン溶液に培養プレートを１晩浸漬した後、滅菌精製水で洗浄し、自然乾燥させて行った。初代培養細胞は培養プレート１ウェルの底面積に対して、３×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の密度となるように、５％牛胎児血清（ハイクローン社製）／５％馬血清（ライフテックオリエンタル社製）１ｍＭ Ｐｙｒｕｖａｔｅ／５０μｇ／ｍｌ Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ライフテックオリエンタル社製）／ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地（ライフテックオリエンタル社製）で調製した。培養は３７℃、１０％ＣＯ2中で４日間行った。
【００２８】
（２）自己会合型アミロイドβ蛋白質の添加
上記（１）で得られた初代培養細胞について、培養液をＢ２７（ライフテックオリエンタル社製）、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（ライフテックオリエンタル社製）、０．５ｍＭ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、５０μｇ／ｍｌ Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ライフテックオリエンタル社製）培地０．５ｍｌ／１ウェルに交換した。培地交換後、３７℃、１０％ＣＯ2中で３日間さらに培養を行った。この培養細胞に対し、例１で得られた自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液を最終アミロイドβ蛋白質濃度が１、２、５、１０μＭ／１ウェル、またコントロールとしてＰＢＳ／Ｈ2Ｏを等容量２ウェルのそれぞれ細胞外液に添加した。添加後、３７℃、１０％ＣＯ2中で１６時間培養を行った。
【００２９】
（３）ＭＴＴ活性測定
上記（２）で自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液を添加していない２ウェルのうちの１つにＴｒｉｔｏｎＸ−１００を最終濃度が０．１％となるように添加し、３７℃、１０％ＣＯ2中で１０分間培養した。このようにして毒性アミロイドβ蛋白質含有液を添加した４ウェル、コントロールの１ウェル、及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加してウェル内の培養細胞を死滅させた１ウェルの計６ウェルについて培地を除去し、２５０μｇ ＭＴＴ（シグマ社製）／ＰＢＳ５０μｌを注入した。これらを３７℃、１０％ＣＯ2中で３時間培養した後、２０％ ＳＤＳ（ナカライテスク社製）、５０％ ＤＭＦ（ｄｉｍｅｔｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）ｐＨ３．５／Ｈ2Ｏを５０μｌ添加した。これをさらに３７℃、１０％ＣＯ2中で２時間静置し、細胞を完全に融解させた。この各ウェル中の細胞融解液について５７０ｎｍの吸光度を測定した。この５７０ｎｍの吸光度について、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えて細胞をすべて死滅させたウェルにおける値をバックグラウンドとして他のウェルにおける値から差し引いた値の結果を図１（白丸）に示した。
【００３０】
例３：アミロイドβ蛋白質水溶液を回転を加えず調製したアミロイドβ蛋白質含有液の毒性の検定
アミロイドβ蛋白質を可溶化後、回転を加えないで調製したアミロイドβ蛋白質含有液を用いた他は、例２と同様の実験を行った。結果を図１（黒四角）に示した。例２で得られた結果との比較から、アミロイドβ蛋白質を可溶化後、回転をさせて自己会合型アミロイドβ蛋白質を調製した場合にのみ、神経系細胞に細胞死を誘導する活性を有する毒性アミロイドβ蛋白質を調製できることが明らかになった。
【００３１】
例４：自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液が有する毒性の持続性の検定
上記例１及び３で調製した自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液について、調製後それぞれ４℃に７〜１４日間静置した。これらのアミロイドβ蛋白質含有液について、上記例２と同様の方法で毒性を検定した。ラット１８日胎児の前脳基底野より分散培養によって調製した初代培養細胞の各細胞外液に対し、最終濃度５μＭとなるようにアミロイドβ蛋白質含有液を添加した。添加後、３７℃、１０％ＣＯ2中で１６時間培養を行った後、上記例２（３）に記載のとおりにＭＴＴ活性を測定した。この結果を図２に示した。以上の結果より、アミロイドβ蛋白質を可溶化後、容器を回転させて自己会合型アミロイドβ蛋白質を調製した場合にのみ、神経系細胞に細胞死を誘導する活性が１４日保持されることが明らかになった。
【００３２】
【発明の効果】
本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質は、アルツハイマー病患者の生体内に存在する毒性アミロイドβ蛋白質と同等の強い毒性を有しており、かつその毒性が保持される特性を有する。従って、神経系細胞又は神経系器官の培養液に本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質を添加することにより、生体内で惹起されている神経細胞死をインビトロで忠実に再現することができる。また、本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質を用いることにより、神経系細胞の細胞死を抑制する作用を有する物質のスクリーニングを行うことができる。
【００３３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の方法で調製した自己会合型アミロイドβ蛋白質が神経系細胞に細胞死を誘導する高い毒性を有することを示した図である。図中、白丸は本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質の結果を示し、黒四画はアミロイドβ蛋白質の溶液に回転を加えずに調製したアミロイドβ蛋白質溶液についての結果を示す。
【図２】 本発明の方法で調製した自己会合型アミロイドβ蛋白質を保存したときの毒性の変化を示した図である。
Claims (5)
- 自己会合型アミロイドβ蛋白質の製造方法であって、アミロイドβ蛋白質を含む水溶液を対流させる工程を含む方法。
- 上記水溶液を含む容器を回転させる工程を含む請求項１に記載の方法。
- 前記工程が回転培養器を用いて行われる請求項２に記載の方法。
- 回転が５〜５０ｒｐｍで４時間〜７日間行われる請求項２又は３に記載の方法。
- 請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法により得られた自己会合型アミロイドβ蛋白質を用意する工程および得られた自己会合型アミロイドβ蛋白質をインビトロで神経系細胞に添加する工程を含む神経系細胞の細胞死を誘発する方法。
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