KR20070057266A - 복합 여과 제품 - Google Patents

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KR20070057266A
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제럴드 케이. 라스무센
앤드류 더블유. 라빈스
제임스 아이. 헴브리
칸난 세샤드리
켈리 제이. 기븐스
마사유끼 나까무라
로버트 티. 주니어 피츠시몬스
시몬 케이. 샤논
스티븐 비. 로스코
래리 제이. 카슨
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쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니
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Abstract

본 발명은 하나 이상의 다공성 섬유상 여과층, 및 평균직경이 50 마이크로미터 미만인 유기 또는 무기 입자, 연질 입자 및 분쇄된 모노리쓰형 입자 중에서 선택된, 하나 이상의 흡수성 고정상 입자의 층을 포함하는 여과요소를 포함하는 복합 여과매체를 제공한다. 입자는 예를 들면 흡착, 이온교환, 소수성 결합 및 친화성 결합에 의해 표적 분자와 결합할 수 있다. 입자는 통상적인 공정 규모의 크로마토그래피 수지 입자가 혼입된 여과매체를 사용하여 달성될 수 있는 결합용량보다 높은 결합용량을 제공한다.
복합 여과매체, 생체거대분자, 표적 분자, 고정상 입자, 생체 분리

Description

복합 여과 제품{COMPOSITE FILTRATION ARTICLE}
본 발명은 하나 또는 여러 종의 생체거대분자(biomacromolecule)를 포함하는 용액으로부터, 특히 대규모로, 생체 거대분자를 분리 및 정제하는 제품 및 방법에 관한 것이다. 정제된 생체거대분자는 유용한 치료용 또는 진단용 약제이다.
생체거대분자는 살아있는 세포로 된 성분 또는 생성물이며, 단백질, 탄수화물, 지질 및 핵산을 포함한다. 이러한 물질의 검출 및 정량 뿐만 아니라 단리 및 정제가 오랫동안 연구원들의 연구대상이 되어 왔다. 검출 및 정량은 예를 들면 질병과 같은 다양한 생리학적 상태의 지표로서 진단학적으로 중요하다. 생체거대분자의 단리 및 정제는, 생체거대분자가 특정 생체거대분자의 결핍증을 갖는 환자에 투여되는 경우 또는 몇몇 약물의 생체적합성 담체로서 사용되는 경우와 같은 치료적 목적, 및 생체의학적 연구에서 중요하다. 화학반응을 촉진할 수 있는 특수 단백질군인, 효소와 같은 생체거대분자는 산업적으로도 유용한데, 효소는 단리되고 정제된 후, 감미제, 항생제 및 다양한 유기 화합물, 예를 들면 에탄올, 아세트산, 리신, 아스파르트산, 및 생물학적으로 유용한 생성물, 예를 들면 항체 및 스테로이드의 제조에 사용되어 왔다.
이러한 생체거대분자는 고유한 생체내 상태로 있을 때에는, 이것의 구조 및 상응하는 생물학적 활성은 일반적으로 상당히 좁은 범위의 pH 및 이온세기 내에서 유지된다. 따라서, 임의의 분리 및 정제 작업을 할 경우에는, 결과물인 가공된 생체거대분자가 역가를 갖게 하기 위해서, 이러한 인자들을 고려해야 한다.
크로마토그래피는 생물학적 생성물의 혼합물 상에서 흔히 수행되는 분리 및 정제 작업이다. 이것은 기체 또는 액체일 수 있는 이동상과 고정상 사이에서의 용질의 교환에 근거를 둔 기술이다. 용액 혼합물의 다양한 용질의 분리는, 각각의 용질과 고정상의 다양한 결합 상호작용에 근거를 두고 수행되는데, 결합 상호작용을 보다 강하게 하는 용질은, 이동상의 탈결합(de-binding) 효과를 받을 때, 덜 강하게 상호작용하는 용질에 비해 일반적으로 보유시간이 보다 길고, 이러한 방식으로 분리 및 정제가 수행될 수 있다.
생체분리(bioseparation)는 개질된 여과기 카트리지를 사용해서 수행되어 왔다. 미국특허 제 5,155,144 호에는 중합체성 매체 내에 분산된 전형적인 이온교환 크로마토그래피 고정상인 디에틸아미노에틸 셀룰로스와 같은 개질된 다당류 입자를 포함하는 미세다공성 시트가 개시된다. 이러한 시트는 추가로 전량여과식 여과기 카트리지(dead end filter catridge)로 구성될 수 있다는 것도 제시되어 있다.
납 이온-처리된 수지가, 유출물의 재순환을 이용하는, 일반적으로 D-자일로스의 분석적 분리를 위한 두 스테인레스강 격자들 사이의 얕은 칼럼으로서 평가되었다(문헌[A.M.Wilhelm 및 J.P.Riba, J.Chromatog., 1989, 484, 211-223]을 참고). 그 결과의 충전된 베드 반응기 시스템은, 비교적 높은 시스템 압력 및 낮은 유속에서 액체 크로마토그래피의 제조를 위한 칼럼에서 궁극적으로 사용되기 위한 입자에 대한 유체역학적 조건을 결정하는 것으로 평가되었다.
분석 규모에서 유용한, 비교적 신규한 유형의 크로마토그래피 매체는 모노리쓰(monolith)이다. 이러한 유형의 매체는, 크로마토그래피 칼럼에 적당한 단량체, 용매 및 개시제를 충전하고, 중합체-형성 반응을 그 자리에서 수행함으로써, 제조된다. 다공성 중합체의 플러그가 칼럼을 완전히 충전하도록 형성되므로, 조심스럽게 칼럼을 충전할 필요가 없게 된다. 모노리쓰형 매체는 입자상 매체보다 개선된 분리 특성을 가질 수 있다. 그러나, 중합 공정 동안에 일어나는 열 발생 및 열 전달 문제 때문에, 대형 칼럼으로 규모를 확대시키는 것이 문제이다.
발명의 요약
요약하자면, 본 발명은 하나 이상의 다공성 섬유상 여과층(예를 들면 직조(woven) 또는 부직조(non-woven) 다공성 물질의 층), 및 평균직경이 50 마이크로미터 미만인 입자, 연질 중합체성 입자 및 파쇄된 모노리쓰형 중합체 입자의 군에서 선택된, 표적 물질과 결합할 수 있는 하나 이상의 흡수성(sorbent) 고정상 입자의 층을 포함하는 여과요소를 포함하는 복합 여과매체를 제공한다.
비록 "생체거대분자"라는 용어가 본원 전체에 걸쳐 바람직한 양태인 것으로 사용되지만, 고정상 입자는 후술되는 기타 표적 분자들과도 흡착 또는 결합할 수 있다는 것을 알아야 한다. 상기 입자는 예를 들면 흡착, 이온교환, 소수성 결합 또는 친화성 결합에 의해 생체거대분자와 결합할 수 있다. 입자는 통상적인 공정 규모 크로마토그래피 수지 입자가 혼입된 여과매체를 사용하여 달성될 수 있는 결합용량 및/또는 포착(capture)효율 및 처리량보다 더 높은 결합용량 및/또는 포착 효율 및 처리량을 제공한다.
대규모 생체분리 공정(예를 들면 생체약제학적 제조 공정)은 전형적으로, 직경이 큰, 충전된 크로마토그래피 칼럼에서 수행되며, 평형화(equilibration), 적재, 세척, 용출 및 재생/세정이 순차적으로 수행된다. 단백질의 흡착에 대한 역학적 한계(크로마토그래피 입자들 내에서의 단백질 입자의 느린 입자내 확산) 때문에, 이러한 칼럼들은 전형적으로 칼럼의 평형 용량의 일부까지만 적재된다. 그 결과 상당히 낮은 처리량을 갖는 비교적 느린 공정이 초래된다.
본원에서 사용된 "대규모 생체분리"란, 부피가 100 리터 이상인 생체반응기 내에서 제조된 생체거대분자 생성물의 분리 및/또는 정제를 수행하는, 생체약제학적 제조 공정의 하류에 위치한 단계로서 정의된다. 생체분자 생성물의 열화를 방지하기 위해서는, 이러한 생체분리를 24 시간 이하 이내에 수행해야 한다. 생체 반응기에서 유체 매체 내에서 제조되는 전형적인 생체거대분자 농도가 약 1 그램/리터라고 추정해 볼 때, 이는 24 시간 이내에 100 g 이상의 생성물을 정제하는 능력과 유사하다.
소규모의 분석적 정제의 경우, 소직경의 칼럼(예를 들면 직경이 약 5 ㎝ 미만인 칼럼)에 의해 제공된 벽효과(wall effect)로 인해, 크기, 형상, 강성도, 기공률 등에 있어서 광범위한 성질을 갖는 크로마토그래피 수지를 사용할 수 있게 된다. 소형 크로마토그래피 칼럼에서, 충전된 크로마토그래피 수지의 베드는 칼럼벽에 의해 잘 지지되므로, 비교적 광범위한 성질을 갖는 수지가 사용될 수 있고, 이러한 수지는 수지 입자가 손상되지 않게 하면서 200 psi(1.38 MPa)를 초과하는 차 등 압력을 잘 견딜수 있다. 이러한 벽효과는 칼럼의 직경이 증가함에 따라 감소하고, 칼럼의 직경이 20 ㎝를 초과하면 덜 중요해진다.
따라서, 치료용 단백질의 대규모 정제에 요구되는 대직경 칼럼의 경우, 경제적으로 실현가능한 처리량을 달성하려면, 크로마토그래피 입자에 엄격한 요건이 부가된다. 이러한 칼럼은 비교적 빠른 유속 및 합당하게 낮은 압력강하를 달성할 수 있어야 한다. 일반적으로, 합당한 처리량을 달성하기 위해서는, 200 psi(1380 kPa) 미만, 바람직하게는 50 psi(345 kPa) 미만의 차등 압력에서, 150 ㎝/hr 이상의 겉보기 속도(또는 선형 유속)가 요구되며, 500 내지 1000 ㎝/hr의 유속이 바람직하다. 이러한 압력/유속 요건은, 유용한 크로마토그래피 수지는 매우 경질이어야 하며(예를 들면 칼럼에서 사용되는 유속에서 낮은 압축률을 가짐), 비교적 큰 평균입자크기를 가져야 하며(예를 들면 약 50 초과 내지 150 마이크로미터의 입자크기를 가짐), 비교적 좁은 입자크기분포를 가져야 한다(예를 들면 편류(channeling) 등을 초래하지 않고서 칼럼 내에 용이하게 충전되도록, 미세 입자 및 큰 입자가 제거되도록 분급되어야 함)는 것을 보여준다.
그러나, 실제로, 직경이 1 ㎝인 칼럼 내에서 압력/유속 시험이, 대형 공정 규모의 칼럼에서의 실제적 유용성을 암시해줄 수 있다. 예를 들면, 직경이 1 ㎝인 칼럼 내에서 50 psi에서 특정 유속을 견디는 수지는 전형적으로, (동일한 베드 높이에서) 직경이 10 ㎝ 이상인 칼럼 내에 충전되는 경우, 상기 값의 단지 30 내지 40％의 유속을 견딜 것이다. 일반적으로, 수지가 공정 규모의 크로마토그래피 생체분리에서 임의의 유용성을 가지려면, 1 ㎝ × 10 ㎝ 칼럼 내에 충전되는 경우, 50 psi(0.34 MPa)에서 300 ㎝/hr(4 ㎖/min) 초과, 바람직하게는 600 ㎝/hr 초과의 유속을 견뎌내야 한다고 생각된다.
다양한 크로마토그래피 입자가 생물학적 분자의 정제용으로서 상업적으로 입수가능하다. 이러한 많은 수지들 및 이것들의 조성이 문헌["Immobilized Affinity Ligand Techniques", G.T.Hermanson, A.K.Mallia, P.K.Smith, Academic Press, NY, 1992, 1 내지 41 페이지]에 상세하게 기술되어 있다. 이러한 물질 대부분이 분석 규모의 분리용으로는 유용하지만, 공정 규모 또는 대규모의 경우에는 특정한 물질만이 유용한 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 천연 다당류 아가로스 및 셀룰로스를 기재로 하는 지지체는 친수성, 높은 용량 및 낮은 비특이성 결합 등이라는 바람직한 성질을 갖는다. 아가로스 물질이 공정 규모에서 유용하려면, 아가로스 물질은 합당하게 높은 유속을 견디기에 필요한 강성도를 달성하기 위해 상당히 높은 수준(예를 들면 6％ 이상)의 수준으로 가교되어야 한다. 그러나 가교 공정은 용량이 감소되게 한다. 폴리아크릴아미드-기재의 지지체는 우수한 pH 안정성, 탁월한 화학적 안정성, 낮은 비특이성 결합 및 미생물의 공격에 대한 내성이라는 유리한 성질을 갖지만, 일반적으로 매우 연질이며 통상적으로 수 ㎝/hr에 불과한 유속을 허용할 것이다. 다당류 덱스트란과 합성 단량체의 복합체를 기재로 하는 세파크릴 지지체도 소규모의 정제용으로는 우수한 지지체이지만, 일반적으로 연질 및 압축성이라는 본질을 갖기 때문에 낮은 유속을 허용한다는 단점을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명은 효율적인 대규모 생체분리를 위해, 연질 압축성 고정상의 사용을 허용하는 복합 여과매체를 제공한다. 이러한 복합 여과매체는 연 질 입자를 사용하여 높은 용량, 높은 처리량 및 우수한 유속을 제공한다. 본원에서 사용된 "연질"이란 가해진 힘의 축방향을 따라 10％ 이상 변형될 수 있는 입자를 지칭한다. 구형 비드의 경우, 이러한 연질 입자는 그 입자의 종횡비가 10％ 이상 변형될 것이다. 예를 들면, 50 psi(0.34 MPa) 이상의 압력에서 크로마토그래피 칼럼에서 최초 종횡비가 1인 연질 구형 비드는 종횡비가 0.9 이하가 되도록 변형될 것이다.
매우 경질이며 높은 압력을 견딜 수 있는 무기 및 유기 중합체를 기재로 하는 크로마토그래피 수지는 제조될 수 있다. 그러나, 입자크기 및 입자크기분포도 공정 규모의 충전된 베드 칼럼에 필요한 높은 선형 유속을 달성하는데에는 매우 중요한 변수이다. 작은 입자(예를 들면 직경이 약 50 마이크로미터 미만인 입자)가 분석 규모에서 유리할 수 있으며, 이것은 매우 높은 배압(예를 들면 100's 내지 1000's의 psi)을 초래할 수 있다. 이러한 압력은 공정 규모에서는 허용될 수 없기 때문에, 이러한 입자의 제조는 통상적으로 "미세 입자" 또는 작은 입자를 제거하는 분급 또는 입자크기 분류 작업을 포함한다. 크거나 과도한 크기의 입자는 칼럼에서 균일한 충전 및 유동 분배를 위해 비교적 좁은 입자크기분포를 제공하도록 제거된다. 이러한 분급 공정은 수율을 감소시키고, 수지의 제조 비용을 증가시키고, 궁극적으로는 최종 생체의약품의 가격을 증가시킨다. 기타 경질 매트릭스, 예를 들면 제어된 기공을 갖는 유리는 매우 취약하므로, 대규모에서의 압력/유동 성질에 해로울 수 있는 미세 입자를 생성시킬 수 있는 입자의 파괴 및 분쇄를 피하기 위해서 매우 조심스럽게 취급되어져야 한다.
본 발명은, 효율적인 대규모 생체분리를 위해, 평균입자크기가 50 마이크로미터 미만, 바람직하게는 30 마이크로미터 미만인 고정상을 사용하는 것을 허용하는 복합 여과매체를 제공함으로써, 해당 분야의 상기 문제점을 극복한다. 이러한 복합 여과매체는 이러한 입자를 사용하여 높은 용량, 예상외로 높은 처리량, 우수한 유속 및 낮은 압력강하를 제공한다. 본 발명은 효율적인 대규모 생체분리를 위해 분급되지 않은 수지의 사용도 허용한다.
또다른 양태에서, 본 발명은, 생체거대분자(또는 관련된 생체거대분자들의 경우 하나 초과의 생체거대분자)가 고정상 입자에 선택적으로 결합하여 생체거대분자:고정상 입자 생성물을 형성하도록, 생체거대분자와 결합할 수 있는 고정상 입자를 상류 표면 상에 포함하는 복합 여과매체를 포함하는 여과기 카트리지를 함유하는 분리 시스템을 제공하는 단계를 포함하는, 생체거대분자의 (정제를 포함할 수 있는) 분리 방법을 제공한다. 바람직하게는, 여과기 카트리지는 전량여과식 여과기 카트리지이다. 사용된 방법은 용질로서의 하나 이상의 생체거대분자를 포함하는 용액을 함유하는 저장기, 및 바람직하게는 폐쇄 루프(closed loop) 조립체를 형성하는 펌프 및 이것과 연결된 튜브, 및 임의적으로는 생체거대분자가 유리되도록 생체거대분자:고정상 입자 생성물 결합 상호작용을 역전시킬 수 있는, 폐쇄 루프 조립체를 통해 용출 용액을 펌핑시키는 수단을 포함할 수 있다. 또다른 양태에서는, 복합 여과매체를 포함하는 여과기 카트리지가 제공된다.
또다른 양태에서, 여과기 카트리지, 여과기 카트리지 하우징, 및 생체거대분자와 결합할 수 있는 본 발명의 복합 여과매체의 고정상 입자를 포함하는 분리 여 과기 조립체가 제공된다. 또한 본 발명은 생체거대분자 용질을 기타 생체거대분자 용질 화합물을 함유하는 용액으로부터 분리, 정제 또는 농축시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 비교적 저압에서 수행되며, 특히 대규모 생체분리에서 적합하다.
더욱 특히는, 본 발명의 방법은, 펌프 및 용액 저장기에 연결된 적합한 하우징 내에 함유된 복합 여과매체를 포함하는 액체 여과기 카트리지를 제공한다. 하나 이상의 흡착, 이온결합, 친화성 및 소수성 결합성 고정상 입자를 액체(일반적으로는 물) 내에 포함하는 슬러리를, 고정상 입자가 주로 다공성 여과층의 상류 표면 상에 위치하도록, 여과층을 통해 펌핑시켜 여과층에 부분적으로 적재하는 공정에 의해, 복합 여과매체를 제조할 수 있다. 이어서 관심있는 생물학적 용질을 고정상과 결합시킴으로써 용액으로부터 분리하기 위해서, 분리될 생물학적 혼합물의 용액을 여과기 카트리지를 통해 펌핑시킨다. 이러한 절차를 통상적으로 수행하여 분리된(예를 들면 결합된) 생물학적 용질을 회수한다.
이어서 용출 또는 단리 단계 동안에, 고정상에의 결합을 역전시킬 수 있는 용액을 여과기 카트리지를 통해, 바람직하게는 생물학적 용액 혼합물의 최초 부피보다 적은 용액 부피로 펌핑시킨다. 여과요소를 통과한 용액으로부터의 선택된 생체거대분자 용질과의 결합은 흡수 또는 화학적 상호작용에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 결합 메카니즘은 흡착, 이온교환, 소수성 결합 및 친화성 결합을 포함한다. 별도의 단계에서, 결합을 역전시켜 이미 결합된 생체거대분자를 단리 및 정제할 수 있다.
본원에서, "생체거대분자"란 분자량이 500 이상인 세포의 성분 또는 생성물, 예를 들면 단백질, 탄수화물, 지질 또는 핵산을 의미한다.
"여과층"이란 단일 시트를 제공하도록 조합될 수 있는 하나 이상의 개별적인 층들을 포함할 수 있는 시트-유사 직조 또는 부직조 다공성 물질을 의미하고, 이것의 평균 기공 크기는 1 마이크로미터 초과 내지 50 마이크로미터 이하이다.
"복합 여과매체"란, 상류 표면 상에 위치한 고정상 입자의 층을 포함하는 여과층을 의미하고; 이러한 매체는 0.25 메가파스칼(MPa) 이하의 여과기 카트리지 압력에서 0.01 ㎝/분 이상의 플럭스 속도를 견딜 수 있고, "복합 여과매체"는 하나 이상의 여과층 및 유체 통과에 적합하도록 구성된 상기 여과층의 상류 표면 상에 위치한 흡수성 입자층을 포함하고; 이것이 실제로 여과/분리/정제 작업을 실행하는 분리 여과기 조립체의 성분이다.
"표적 분자"란 본원에서 기술된 복합 여과 제품에 의해 액체 공급 스트림 또는 용액 혼합물 공급 스트림으로부터 분리되도록 디자인된 하나 이상의 화학 물질을 지칭한다. 표적 분자는 예를 들면 약학적 물질, 생체거대분자, 예를 들면 박테리아, 효모, 포유류, 식물 또는 곤충 세포에 의해 발현되는 단백질, 항체(단클론성 또는 다클론성), DNA 및 RNA, 광물질 및 인공 화학 물질, 예를 들면 작은 합성 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 올리고당 및 당-개질된 단백질을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 표적 분자는 하나 이상의 불순물 또는 폐기된 생성물, 예를 들면 단백질, 무기 물질, 예를 들면 금속, 금속 이온 또는 이온, 예를 들면 탄산염, 황산염, 산화물, 인산염, 중탄산염, 및 산업용, 가정용 및 생물학적 공급 스트림에서 통상적으로 발견되는 기타 이온, 작은 유기 분자, 예를 들면 염료, 살충제, 비 료, 첨가제, 안정화제, 공정 부산물 및 오염물, DNA, RNA, 인지질, 바이러스 또는 생체공정으로부터 유래된 기타 세포 잔사를 포함하지만 여기에만 국한되지는 않는 작은 유기 분자일 수 있다. 추가의 실시양태에서, 침출된 리간드, 예를 들면 상류 친화성 분리 공정으로부터 유래된 단백질 A 또는 기타 친화성 리간드도 표적 분자일 수 있다. 기타 실시양태에서, 본원에서 기술된 복합 여과 제품은 예를 들면 흡착 또는 효소작용적 반응을 통해, 폐수 또는 식수 스트림으로부터 다양한 화학적 또는 생물학적 물질을 제거하는데 사용될 수 있다.
"여과기 카트리지"란 고정상 입자가 적재될 수 있는 여과 장치를 의미한다.
"여과기 카트리지 하우징"이란 여과기 카트리지를 위한 지지 구조물을 의미한다.
"거대다공성"이란 건조한 상태에서도 영구적인 다공성 구조를 갖는 입자를 지칭한다. 수지는 용매와 접촉되면 팽창할 수 있지만, 다공성 구조를 통해 입자의 내부에 접근하는 것을 허용하는데에 팽창은 필요하지 않다.
"겔-형 수지" 또는 "겔"은 건조한 상태에서는 영구적인 다공성 구조를 갖지 않지만 입자 내부로의 접근을 허용하기 위해서는 적합한 용매에 의해 팽창되어야 한다. 거대다공성 및 겔 입자는 추가로 문헌[Sherrington, Chem. Commun., 2275-2286(1998)]에 기술되어 있다. 거대다공성 이온교환 수지는 전형적으로 크기가 20 내지 3000 Å인 기공을 갖는다(즉 기공 크기는 극저온 조건 및 다양한 상대적 압력에서의 질소 흡착 또는 수은 압입 기공측정에 의해 특성화될 수 있음).
"분리 여과기 조립체"란 상류 표면 상에 위치한 고정상 입자를 포함하는 복 합 여과매체를 포함하는 여과기 카트리지, 바람직하게는 전량여과식 여과기 카트리지를 함유하는 하우징을 의미한다.
"분리 시스템"이란, 저장기 내에 함유된 하나 이상의 생체거대분자 용질을 포함하는 용액 혼합물, 분리 여과기 조립체 또는 크로마토그래피 칼럼, 펌프 및 이것과 연결된 튜브를 의미한다.
"분리 장치"란 이러한 장치를 통해 유체를 통과시키는 하나 이상의 수단 및 이러한 장치 내에서 고정상 입자를 보유하는 수단을 포함하는 용기를 의미한다.
"플럭스 속도(flux rate)"란 여과요소를 통과하는 액체 스트림의 속도를 의미하며, 유속을 여과층의 횡단표면적으로써 나눈 것과 같다. 액체 스트림의 유동은 이러한 방식으로 기술됨으로써 특성화될 수 있고, 이것은 여과층의 크기와는 상관이 없다. 플럭스 속도는 여과기를 가로지르는 압력강하에도 기여하는데, 즉 증가된 플럭스 속도는 일반적으로 증가된 시스템 압력을 의미한다. 상업적인 여과기 카트리지 용도에서는, 최대량의 액체 스트림을 처리하는 최소 크기의 여과기를 제공하는 것이 매우 바람직하다. 따라서, 유속을 증가시킴으로써 플럭스 속도를 증가시키는 것이 바람직하다.
"고정상 입자"란 용액 혼합물 내에서 관심있는 성분과 결합을 형성할 수 있는 불용성 입자를 의미한다. 특이성 결합은 흡착, 이온교환, 소수성 및 친화성 상호작용을 포함한다.
"불용성"이란 23 ℃에서 100 부의 용매에 1부 이하의 입자가 용해됨을 의미한다.
"여과기 카트리지 압력"이란 분리 시스템에서 여과기 카트리지 장치를 가로지르는 입구 압력 또는 상류 압력과, 출구 압력 또는 하류 압력 사이의 차이를 의미한다.
본 발명은 생체거대분자의 분리에 사용되는 통상적인 거대다공성 입자를 포함하는 종래 기술의 여과기가 갖는 문제점을 극복한다. 여과요소 내에 고정상 입자를 함유하는 종래 기술의 여과기는 제조상 난제를 제공하며 단지 제한된 용량을 제공할 뿐이다. 입자의 적재량이 많을수록 감소된 기공률 및 이에 상응하는 증가된 작동 시스템 압력을 갖는 여과요소가 초래된다. 본 발명은 비교적 낮은 여과기 카트리지 압력에서 높은 입자 적재용량을 제공함으로써 종래 기술의 여과기가 갖는 문제점을 극복한다.
도 1은 상류 표면 상에 위치한 고정상 입자층을 포함하는 여과층을 포함하는 복합 여과매체의 횡단면을 도시하는 도면이다.
도 2는 본 발명의 복합 여과매체 상의 엠보싱 패턴의 투시도이다.
도 3은 본 발명의 원통형으로 주름잡힌 여과요소의 투시도이다.
도 4는 본 발명의 원통형 여과기 카트리지를 위한 지지체 부재의 투시도이다.
도 5는 본 발명의 분리 여과기 조립체의 투시도이다.
도 6은 본 발명의 분리 시스템의 투시도이다.
도면의 상세한 설명
도 1은 상류 표면 상에 위치한 불용성 고정상 입자(12)를 포함하는, 하나 이상의 개별적 층일 수 있는 표면여과층(11)으로서 바람직한 부직포를 포함하는 복합 여과매체(10)의 횡단면도이다. 균일한 기공률 및 잘 한정된 기공을 갖는 부직조 여과층(11)은 성긴 상류 예비여과층(13), 하류쪽으로 갈수록 점점 미세해지는 기공률을 갖는 여러개의 부직조 여과층을 포함하는 여과층(14) 및 하류 부직조 커버층(15)을 포함할 수 있다.
도 2는 본 발명의 바람직한 실시양태의 도면이다. 이것은 여과기 카트리지를 제조하는데 사용되는 복합 여과매체(20) 상의 엠보싱 형상의 패턴(22)의 주름잡히지 않은 부분을 도시하는 투시도이다. 정면의 표면적을 증가시키고, 표면 여과요소를 보다 완전히 한정짓도록 엠보싱이 수행된다. 명확한 도시를 위해, 불용성 고정상 입자는 도면에 도시되어 있지 않다.
도 3은 본 발명의 바람직한 실시양태의 종방향으로 연장된 원통형 주름형 여과요소(30)의 투시도인데, 여기에는 본 발명의 바람직한 복합 방사상 주름형 여과요소(30)의 방사상 주름(32)이 도시되어 있으며, 여기서도 역시 명확한 도시를 위해 고정상 입자는 도시되어 있지 않다.
도 4는 본 발명의 바람직한 실시양태인 원통형 여과기 카트리지(40)를 위한 내부 및 외부 부속 지지체 부재를 도시하는 투시도이다. 외부 지지체 구조물(41), 예를 들면 여러개의 구멍을 갖는 스크림 또는 그물망은, 내향-외측(inward-out) 유체 유동 모드를 갖는 추가의 지지체를 제공하여 여과요소의 파열 가능성을 감소시킬 수 있다. 마찬가지로, 스크림 또는 그물망으로 이루어진 내부 지지체 구조 물(42), 또는 다공성 케이스 또는 유사한 구조물은 고압 용도에서 바람직한 외향-내측(outward-in) 유체 유동 모드에서 여과요소(도시되지 않음)가 붕괴하는 것을 방지하는 지지체를 제공할 수 있다. 두 경우에서, 부속 지지체 구조물은 일체형 장치를 제공하도록 통상적으로 여과기 카트리지의 말단(43)에 부착된다.
도 5는 본 발명의 분리 여과기 조립체(70)의 투시도이며, 이것은 본 발명의 바람직한 실시양태이다. 여과기 하우징(71)은 여과기 카트리지(도시되지 않음)를 함유한다. 분리 루프에서, 입구(72)는 용액 혼합물이 바람직한 외향-내측 모드로 여과기 카트리지에 들어가는 것을 허용한다. 액체는 출구(73)를 통해 분리 여과기 조립체(70)를 빠져나간다. 바람직한 조립체에서, 분리 헤드(74)는, 조절놉(control knob)(76)을 조정하는 장력에 의해 나사 볼트(도시되지 않음)를 사용하는 기계적 클램프(75)에 의해 여과기 하우징(71)에 부착된다. 단리 루프에서, 입구(77)는 탈결합된 용액이 바람직한 외향-내측 모드로 여과기 카트리지에 들어가는 것을 허용하며, 그 결과 원하는 생체거대분자 용질을 함유하게 된 용액은 출구(78)를 통해 분리 여과기 조립체(70)를 빠져나간다.
도 6은 본 발명의 분리 시스템(80)의 도면이다. 저장기(81)는 수성 고정상 입자 슬러리(82) 및/또는 생체거대분자 용액 혼합물(82)을 함유하고, 교반 장치(83)를 통해 교반을 제공한다. 슬러리 또는 용액(82)은 펌프(85)에 의해 출구 튜브(84)로부터 분리 여과기 조립체(86)(여과기 카트리지(도시되지 않음)의 여과층의 상류 표면 상에 위치한 고정상 입자를 함유함)를 통해 펌핑되고, 입구 튜브(87)를 통해 저장기로 복귀한다(화살표는 액체 유동 방향을 보여줌).
본 발명은 여과층의 상류 표면 상에 생체거대분자에 결합될 수 있는 고정상 입자를 포함하는 복합 여과매체를 포함하는 분리 여과기 조립체를 포함하는, 생체거대분자를 단리 및 정제하는 제품 및 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 여과층의 상류 표면 상에 생체거대분자에 결합할 수 있는 고정상 입자를 포함하는 분리 장치를 사용하는 대규모 생체분리 방법을 제공한다. 이러한 고정상 입자는 평균 직경이 50 마이크로미터 미만인 유기 또는 무기 입자, 연질 입자 및 파쇄된 다공성 모노리쓰형 물질을 포함할 수 있다.
분리 여과기 조립체는, 전술된 복합 여과매체를 포함하는 액체 여과기 카트리지 및 하나 또는 바람직하게는 둘 이상의 생체거대분자를 포함하는 용액의 저장기에 연결된 여과요소를 위한 적합한 카트리지 하우징을 포함한다. 여과기 카트리지는, 적합한 튜브에 의해, 결합된 생체거대분자를 방출시키도록 입자 또는 용출 용액에 결합됨으로써 분리되는 선택된 생체거대분자를 포함할 수 있는 용액을 복합 여과매체를 통해 통과시키고 저장기로 복귀시킬 수 있는 펌프에 연결되는데, 그 결과의 용액은 자유 생체거대분자를 추가로 포착하기 위해 복합 여과매체를 통해 반복적으로 순환됨으로써, 결합된 생체거대분자의 분리, 또는 원한다면 용출을 종결할 수 있다. 이러한 제품 및 방법은 대규모 생체분리에서 유용하다.
더욱 특히는, 본 발명은, (1) 상류 표면 상에 위치한, 생체거대분자와 흡착, 이온교환, 소수성 또는 친화성 결합할 수 있는 (전술된 바와 같은) 고정상 입자를 포함하는 복합 여과매체를 포함하는 여과기 카트리지(바람직하게는 전량여과식 여과기 카트리지), 하나 이상의 생체거대분자 용질을 포함하는 용액 혼합물을 함유하는 저장기, 펌프 및 이것과 연결된 튜브(바람직하게는 폐쇄 루프 시스템을 형성함)를 함유하는 분리 시스템을 제공하는 단계; (2) 0.34 MPa 이하, 바람직하게는 0.25 MPa 이하의 여과기 카트리지 압력에서, 0.01 ㎝/분 이상, 바람직하게는 0.10 ㎝/분 이상, 더욱 바람직하게는 0.30 ㎝/분 이상의 플럭스 속도에서, 용액 혼합물을 여과기 카트리지 조립체를 통해 펌핑시켜, 선택된 생체거대분자가 고정상 입자에 결합하게 하고(임의적으로는 재순환을 수행함); (3) 임의적으로는, 개방 루프 또는 일회-통과(one-pass) 공정에서, 선택된 흡착, 이온교환, 소수성 또는 친화성 결합 상호작용을 통해 고정상 입자에 결합되지 않은 원치않는 생체거대분자 및 기타 용질을 제거하기에 적합한 액체로써 생체거대분자:고정상 입자 생성물을 세척하는 단계; (4) 임의적으로는, 생체거대분자:고정상 입자 결합 상호작용을 역전시켜 분리되고 정제된 생체거대분자를 유리시키는, 바람직하게는 (원래의 용액 혼합물 부피에 비해) 감소된 부피의 탈결합 용액을 펌핑시키는 단계를 포함하는 생체거대분자의 분리 또는 정제 방법을 제공한다.
액체 스트림의 여과에 의한 입자의 제거를 하기 여과 메카니즘들 중 하나 또는 조합을 통해 수행할 수 있고, 각각의 메카니즘에 의해 작동되는 액체 여과기 카트리지가 현재 상업적으로 입수가능하다. 본 발명은 유동 분리 시스템에서 여과층으로 하여금 고정상 입자를 보유하게 하는데 있어 이러한 여과 메카니즘을 사용한다:
(i) 심층 여과 - 이러한 메카니즘은 입자-함유 액체 스트림을 크기별로 분류된 구멍 또는 기공의 분포를 갖는 여과요소에 통과시키는 메카니즘으로서, 입자는 여과층을 통해 다소 구불구불한 경로를 통과하게 된다. 종래 기술에서 입자는 주로 여과층 자체 내에서 흡착 및/또는 포획에 의해 제거되었다. 종종 성긴 또는 제 1 여과 절차로서 시스템에 적용되는, 크기가 수백 마이크로미터(최대 직경) 내지 약 1 마이크로미터인 입자를 제거하도록 디자인된 심층 여과는, 잘못 한정된 기공 크기로 인해 입자의 제거가 불완전하고 여과기가 적재됨에 따라 여과기 카트리지 압력이 꾸준히 급속히 증가한다는 문제점을 갖는다.
(ii) 표면(케이크) 여과 - 이러한 메카니즘은 본 발명에서 바람직하고, 종종 액체 스트림의 처리에서 심층 여과에 뒤이어 일어난다. 종래 기술에서, 이러한 메카니즘은 일반적으로 잘 한정된 기공 크기를 갖는 유리 또는 중합체성 극세사의 다층을 사용하여 수행되며, 입자는 일반적으로 여과층 내로 침투하지는 않지만 층의 상류 표면 상에 포획된 채로 있다. 약 0.1 마이크로미터까지의 입자크기가 높은 효율로서 적재될 수 있다. 높은 플럭스 속도가 용이하게 달성될 수 있고, 비교적 다량의 입자가 비교적 낮은 시스템 압력에서 여과기가 거의 완전히 충전될 때까지 적재된다. 본 발명에서는, 액체 유동을 여러번 역전시킴으로써, 여과된 입자를 여과층의 표면 상에 적재 또는 재정렬하는 것이 유리할 수 있는데, 이러한 기회는 심층 여과기에서는 주어지지 않는 것이다.
(iii) 멤브레인(분급 또는 체질) 여과 - 이러한 여과 메카니즘은, 크기가 0.05 마이크로미터 정도로 작은 입자를 적재할 수 있는, 정확하게 한정된 매우 작은 기공이 존재한다는 것만 제외하고는, 표면 여과와 매우 유사하다.
본 발명은 접선유동식(tangential flow) 및 "전량여과식" 카트리지 여과기에서 사용될 수 있다. 접선유동식 또는 방사상 멤브레인 카트리지 여과기에서, 여과요소는 액체 스트림 유동에 대해 평행한 평면 내에 제공되고, 두 가지의 유출수 또는 투과수(permeate), 즉 여과된(또는 여과요소를 통과함으로써 처리된) 것과 여과되지 않은 것이 생성된다. 이러한 여과기 배열은 저압에서 작동되고 미처리 투과수는 이론상으로는 재순환될 수 있지만, 이러한 시스템은 원래 보다 복잡하고, 여과요소를 통한 유동이 비교적 느리기 때문에 액체 스트림을 완전히 처리하는데 시간이 보다 많이 소요되고, 여과요소가 생체거대분자를 보유하기 위해 몇몇 방식으로 개질된 경우, 여과요소를 통한 일회 통과에서 완전한 보유가 요구된다.
"전량여과식" 여과기에서는, 모든 액체 스트림이 여과요소를 통과할 것이 요구되고, 단 하나의 투과수만이 생성된다. 이러한 전량여과식 카트리지 여과기는, 분리가 여과요소 상 또는 여과요소 내의 고정상과의 상호작용에 의해 일어나는 분리장치로서 고려되는 경우, 매우 넓지만 얕은 칼럼과 유사할 수 있다. 높은 유속에서, 생체거대분자의 일회 통과 보유율은 비교적 낮을 수 있지만, 반복적인 순환에 의해, 높은 비율의 유출 생체거대분자가 보유될 수 있다.
본 발명에서 유용한 표면 여과기 카트리지는 미국특허 제 3,058,594 호의 표준 수직 주름형(vertical pleated) 여과기를 포함하지만, 미국특허 제 4,842,739 호의 수평 복합 방사상 주름형 여과기가 특히 바람직하다. 수평 배열의 주름(도 3에 도시된 바와 같음)이 본 발명에서 바람직한데, 왜냐하면 여과기 카트리지는 일반적으로 수직으로 사용되고, 유동이 불연속적이고 카트리지가 사용 후 다음 사용 전까지 보관되는 경우, 보다 많은 비율의 입자가 수평 주름 내에 보유되기 때문이다. 수평 배열의 주름은 일반적으로 카트리지 내에 보다 큰 여과층 표면적의 충전을 허용하므로, 수직 주름형 카트리지의 경우보다 더 큰 입자적재용량을 제공한다. 권선형(string wound), 수지 결합형(resin bonded) 및 분무 방사식(spray spun) 심층 여과기와 같은 기타 여과기 카트리지도 사용될 수 있지만, 이것들은 일반적으로 표면 여과기만큼 많은 입자를 수용함과 동시에 비교적 낮은 시스템 압력을 유지하는 능력을 갖지 않는다.
표준 원통형 수직 주름형 여과기 카트리지는, 다양한 크기로서, 여과요소 물질, 예를 들면 셀룰로스, 셀룰로스-폴리에스테르, 유리-셀룰로스, 폴리에스테르, 폴리프로필렌 및 세라믹을 갖고, 예를 들면 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30 및 50 마이크로미터의 평균 공칭 기공 크기를 갖는 형태로서, 아메텍/유에스 필터(Ametek/US Filter)(미국 팬실바니아주 워렌데일 소재)에서 입수가능하다. 전체가 폴리프로필렌으로 이루어진 구조의 바람직한 원통형 복합 수평 방사상 주름형 표면 여과기 카트리지는, 다양한 크기로서, 2, 5, 10 및 20 마이크로미터의 평균 공칭 기공 크기를 갖는 형태로서, 쓰리엠 필트레이션 프로덕츠(3M Filtration Products)(미국 미네소타주 세인트폴 소재)에서 구입될 수 있다. 보다 소규모의 분리에 유용한, 보다 소형의 일회용 캡슐 여과기는, 다양한 크기로서, 여과요소 물질, 예를 들면 아크릴 코팅된 나일론 및 폴리프로필렌과 같은 폴리아미드를 갖고, 예를 들면 1, 3 및 5 마이크로미터의 평균 공칭 기공 크기를 갖는 형태로서, 팔 코포레이션(Pall Corporation)(미국 뉴욕주 이스트 힐즈 소재)에서 입수가능하다.
여과기 카트리지 제조사로부터 입수가능한 여과기 카트리지 하우징을 사용하여, 결합(분리 단계) 및 용출 또는 탈결합(단리 단계) 상호작용을 수행할 수 있지만, 이러한 하우징은 일반적으로 단지 한 셋트의 입구 및 출구를 갖는다. 그 결과, 탈결합 용액이 혼입될 때, 정제된 생체거대분자의 매우 바람직한 농도를 달성하기가 어렵다. 바람직한 여과기 카트리지 하우징은 크기가 보다 작은 추가의 셋트의 입구 및 출구를 갖는다. 이러한 셋트의 보다 작은 입출구는, 정제된 생체거대분자가 해당 공정에서 보다 진한 용액 내에서 수득되도록, 일반적으로는 현저하게 감소된 총부피의 용액 중에서, 생체거대분자의 탈결합을 달성하는데에 유리하게 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 여과매체의 조성은 상류 표면 상에 무작위적으로 배치된 불용성 고정상 입자들을 포함하는 하나 이상의 부직층을 포함한다. 기계적인 관점에서 및 사용된 용매와 관련하여, 생체분리를 수행할 때, 여과매체의 조성은 중요하지 않은데, 왜냐하면 물이 거의 독점적으로 사용되고 본질적으로 모든 전술된 여과층 물질들이 일반적으로 물에서 기능을 잘 수행하기 때문이다. 폴리프로필렌이, 이용가능성, 비용 및 불활성을 이유로, 바람직한 물질이다.
여과층의 기공 크기는 직접적으로 여과층의 상류 표면 상에 보유되는 고정상 입자의 크기 범위에 따라 선택되는데, 일반적으로는 가장 작은 입자크기에 해당한다. 그러나, 입자의 일부가 여과층의 기공 크기보다 더 작은 크기를 갖는 경우에서 조차도, 유용한 복합 여과매체가 수득될 수 있다고 결론지어졌다. 이러한 보다 작은 입자들은 조기 사이클에서 여과요소를 통과할 것이며, 이후의 사이클에서는 입자의 베드로서 축적되어, 장치로 하여금 심층 여과기의 본질을 띠게 하며, 이러한 보다 작은 입자들은 본 발명에서 제거되고 사용될 수도 있다. 그러나 바람직한 표면 여과 모드에서, 시간, 효율 및 여과기 카트리지의 활용도의 관점에서는, 고정상 입자의 95％ 이상이 여과기의 최초 통과시에 제거되는 표면 여과기 카트리지 장치를 사용하는 것이 바람직하다.
일반적으로, 공칭 평균이 0.1 내지 10 마이크로미터인 여과기 카트리지가 이러한 조건을 충족시키며, 본 발명에서 사용되는 입자에 대한 효율적인 여과요소를 제공하고, 낮은 여과기 카트리지 압력에서 비교적 높은 플럭스 속도를 전달할 수 있다. 다공성 비-섬유상 멤브레인과 같이, 평균 기공 크기가 0.1 마이크로미터 미만인 여과층은 일반적으로 유용하지 않은데, 왜냐하면 이것은 우연히 존재할 수 있는 입자에 의해서 뿐만 아니라 종종 매우 진한 생물학적 용액 혼합물에서 존재하는 현탁된 생물학적 물질에 의해서 막히기 쉽기 때문이다.
본 발명의 취지상, 고정상 입자는 흡착, 이온교환, 소수성 결합 및 친화성 결합 중 하나 또는 이것들의 조합에 의해 용액 혼합물 내의 관심있는 생체거대분자와 결합하거나 강하게 연결될 수 있다. 본 발명에서 유용한 하나 초과의 유형의 활성 흡수성 입자가 임의의 비율로 예비-혼합될 수 있다.
본 발명에서 유용한 고정상 입자의 크기는, 사용된 여과기 카트리지의 본질에 따라서, 입자의 적은 부분, 예를 들면 5％ 미만이, 파쇄된 모노리쓰형 입자의 경우 서브마이크로미터(최대 평균 직경) 내지 수 밀리미터, 연질 입자의 경우 1000 마이크로미터, 경질 무기 또는 유기 입자의 경우 50 마이크로미터인 범위를 가질 수 있다.
연질 고정상 입자의 입자크기는 직경이 바람직하게는 서브마이크로미터 내지 400 마이크로미터, 더욱 바람직하게는 1 내지 200 마이크로미터, 가장 바람직하게는 5 내지 100 마이크로미터이다. 몇몇 예에서는 넓은 범위에 속하는 둘 이상의 입자크기범위를 갖는 입자 물질을 사용하는 것이 유리하다는 것이 밝혀졌다. 임의의 경질 또는 연질 입자는 구형, 직사각형 또는 불규칙적 형상을 가질 수 있다. 파쇄된 모노리쓰형 입자는 불규칙적 형상을 갖는다.
본 발명의 복합 여과매체에서는, 50 마이크로미터 미만의 경질입자크기가 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서는 30, 20 또는 10 마이크로미터 미만의 입자크기가 사용될 수 있다. 이전에는 이러한 "미세 입자"는 칼럼의 충전 및 사용 동안에 겪는 높은 압력 때문에 유용하지 못한 것으로 생각되었다. 본 발명의 복합 여과기는 이러한 미세 입자도 대규모 생체분리에서 전형적으로 0.34 MPa 미만의 압력에서 사용되는 것을 허용한다. 특히, 50 마이크로미터 미만의 입자크기가 유리하게 사용될 수 있는데, 왜냐하면 보다 작은 직경의 입자는 흡착 공정에서 보다 작은 확산 장벽을 갖기 때문이다. 따라서, 본 발명의 분리 장치에서 작은 입자를 사용하면 생체분리 공정에서 보다 빠른 포착 역학 및 증가된 총 처리량을 달성할 수 있게 된다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명에서 유용한 입자는 입자 중량에 비해 높은 수-흡수용량을 갖는다. 이전에는 수-팽창성 또는 완충제 또는 pH 변화로 인해 크기가 변하는 입자는 덜 바람직한 것으로 생각되었는데, 왜냐하면 이것은 사용 도중에 크기가 변할 수 있기 때문이다. 이것은 특히 충전된 크로마토그래피 칼럼에서 바람직하지 못한데 왜냐하면 이것은 극적인 압력 변화를 초래하거나 편류를 초래하거나 유동을 억제할 수 있기 때문이다. 그런데 연질 겔 입자에서 전형적인 이러한 크기 변화는 본 발명의 분리 장치에 나쁜 영향을 주지 않는 것으로 밝혀졌다. 오히려 이와 반대로, 이러한 연질 겔 입자는 통상적인 크로마토그래피 입자보다 더 높은 용량을 가질 수 있다는 것이 밝혀졌다.
본 발명의 중요한 특징은, 관심있는 생체거대분자와의 결합 상호작용과 관련된 작용기를 비교적 높은 농도로 갖는 입자상 지지체를 사용함으로써, 일반적으로 보다 많은 양의 선택된 생체거대분자를 분리할 수 있다는 것이다. 지지체 입자의 경우, 이용가능한 작용기를 높은 농도로 제공하는데에는 표면적이 비교적 큰 것이 바람직하다. 바람직하게는, 입자의 표면적은 (기체 흡착법에 의해 결정시) 10 ㎡/g 이상, 더욱 바람직하게는 50 ㎡/g 이상, 가장 바람직하게는 100 ㎡/g 이상, 심지어는 5000 ㎡/g 이하이다. 연질 또는 겔 유형의 입자의 경우, 가교밀도를 감소시켜 작용기의 농도를 종종 증가시킬 수 있는데, 이렇게 해도 연질 입자가 생성된다. 최적 가교밀도는 입자 물질의 화학적 조성에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 아가로스-기재의 지지체의 경우, 6％ 미만의 가교밀도는 지지체에 보다 높은 작용기 밀도 및 동시에 보다 높은 생체거대분자 용량을 제공할 것이다. 아크릴 및 스티렌-기재의 입자의 경우, 20％ 미만의 가교밀도는 보다 많은 양의 적당한 작용기의 혼입을 허용할 것이다.
용질과 고정상 입자 사이의 다양한 상호작용은 쌍극자-쌍극자, 이온-쌍극자 및 이온-이온 상호작용과 같은 비교적 약한 결합력을 포함할 수 있다. 본 발명에서 분자량이 500 이상인 생체거대분자가 효율적으로 결합되는 비결은, 이러한 여러 상호작용이 생체거대분자와 고정상 사이의 비교적 큰 접촉 면적 상에서 일어나서 전체적으로 강한 결합력을 형성한다는데 있다.
흡착 분리는 고정상 상의 극성 기와 생체거대분자 상의 다양한 극성 기의 결합을 활용한다. 이러한 결합은 일반적으로 쌍극자-쌍극자 및 이온-쌍극자 상호작용의 형태이다. 전술된 고정상과 생체거대분자 용질 사이의 결합을 최대화하여 결합을 달성할 수 있도록, 정제 작업의 결합상 또는 분리상을 통상적으로 비교적 낮은 이온세기를 갖는 수성 완충된 용매를 사용하여 수행한다. 낮은 이온세기의 완충된 수용액으로써의 세척 후, 통상적으로 사용되는 용출 용액은 비교적 많은 양의 용해된 염 및 동시에 높은 이온세기를 함유하므로, 고정상과 용해된 염 사이의 상호작용으로 인해 고정상으로부터 생체거대분자가 이동하여 재-용해되고 분리 시스템으로부터 보다 순수한 형태로 회수될 수 있다.
바람직한 흡착 고정상 입자는 히드록시아파타이트, 알루미나 및 지르코니아(미국특허 제 5,015,373 호에 개시됨)를 포함한다. 이온교환 분리는 많은 생체거대분자가 이온으로서 하전된다는 사실의 이점을 취한다. 또한, 많은 이러한 이온으로서 하전된 기, 예를 들면 양성자화 아민 및 카르복실레이트는 pH의 변화에 의해 중성 비-하전 상태로 된다. 이는, 종종 전하가 중성으로 되거나 분자 내에서의 음성으로 하전된 기의 개수와 양성으로 하전된 기의 개수가 동일해지는 pH인 pI 값으로서 표시되는 등전점을 근거로 하여 생체거대분자를 분리하는 민감하고 매우 강력한 기술을 제공한다. pH가 pI보다 높게 유지되면, 음이온교환수지는 생체거대분자와 결합하는데 사용될 수 있고, 이와 반대로 pH가 pI보다 낮으면, 양이온교환수지는 용액 혼합물로부터의 생체거대분자의 결합 및 제거를 달성할 수 있다. 이러한 기술을 사용하여, 생체거대분자 상의 접근가능한 또는 표면 전하들의 작은 차이를 사용해서도 효과적인 분리를 달성할 수 있다. 불용성화된 생체거대분자:고정상 입자 생성물을 세척한 후, 일반적으로는, 생체거대분자와 교환하여 생체거대분자를 고정상 입자로부터 이동시키는 이온에 상응하는 염 용액을 비교적 높은 농도로 혼입시킴으로써, 결합된 생체거대분자를 이온교환 고정상 입자로부터 용출시킨다. 또다르게는, 용출 용액의 pH를 변화시킴으로써 용출을 수행할 수 있다. 이러한 경질 무기 입자는 50 마이크로미터 미만, 바람직하게는 30 마이크로미터 미만의 평균입자직경을 가질 수 있다.
입자의 중합체성 매트릭스는, 가교된 아가로스, 가교된 폴리스티렌, 친수성 폴리에테르 수지, 아크릴릭 수지 및 메타크릴레이트-기재의 수지를 포함하지만 여기에만 국한되지는 않는 다양한 물질을 함유할 수 있다. 이온교환기의 작용기 성분은 술포프로필 양이온교환기, 카르복시메틸 양이온교환기, 술폰산 교환기 및 포스폰산 교환기로 이루어진 군에서 선택된 양이온교환기를 포함할 수 있지만 여기에만 국한되지는 않는다. 기타 실시양태에서, 이온교환기 성분은 디에틸아미노에틸(DEAE), 트리메틸아미노에틸(TMAE) 및 디메틸아미노에틸(DMAE)로 이루어진 군에서 선택된 음이온교환기를 포함할 수 있지만 여기에만 국한되지는 않는다. 몇몇 실시양태는 양이온성 상호작용과 음이온성 상호작용과 소수성 상호작용의 조합을 포함할 수 있다.
유용한 음이온교환수지는 3차 및 4차 암모늄기를 함유하도록 개질된 아가로스, 덱스트란 및 셀룰로스 중합체를 특징으로 한다. 양이온교환수지는 카르복실레이트 및 술포네이트 기를 갖는 동일한 기본 중합체를 특징으로 한다.
미국특허 제 4,501,826 호, 제 4,382,124 호, 제 4,297,220 호 및 제 4,224,415 호(Meitzner 등)에 기술된 일반적 기술을 사용하여 유용한 이온교환수지를 제조할 수 있다. 몇몇 실시양태에서는, 보다 적은 양의 가교제가 사용되는데, 이것은 기술된 거대다공성 입자보다는 오히려 겔 입자를 형성하기에 충분한 양이다. 가교제의 양은 0.5보다 큰 팽창도를 제공하는 양이고, 총 중합체 100부를 기준으로 일반적으로 20 중량부 미만이다. 아크릴아미드-유형의 단량체를 기재로 하는 유용한 이온교환수지는 본 발명의 출원인의 동시계류중인 특허출원 U.S.S.N. 10/849,700에 개시되어 있다.
소수성 상호작용 및 역상 크로마토그래피는 많은 생체거대분자의 소수성을 활용한다. 생체거대분자의 소수성 부분과 고정상 입자의 소수성 작용기와의 상호작용으로 인해 용액 혼합물로부터 생체거대분자의 결합 및 분리가 이루어진다. 이러한 절차는 통상적으로 비교적 높은 이온세기를 갖는 수용액으로부터의 결합에 의해 수행된다. 이러한 방식으로, 생체거대분자는 다소 불확실하게 가용성이어서 용액으로부터 거의 "염으로서 석출"되기 시작하고 소수성 고체 지지체에 용이하게 결합할 것이다. 용출은 감소된 이온세기(및 생체거대분자에 대한 증가된 용매 효율)의 수용액을 사용하여 통상적으로 수행되거나, 또다르게는 생체거대분자를 고정상 입자와의 불용성 착물로부터 제거하는데에, 50 중량％ 이하의 양의, 아세톤, 아세토니트릴, 에탄올, 메탄올 및 N,N-디메틸포름아미드와 같은 유기 용매가, 공용매로서의 물과 함께 사용될 수 있다.
유용한 소수성 상호작용 고정상 입자는 예를 들면 부틸, 옥틸 및 페닐 기의 봉입에 의해 개질된 아크릴 지지체 및 아가로스-기재의 지지체를 포함하지만 여기에만 국한되지는 않는다. 유용한 역상 입자는 스티렌-디비닐벤젠 지지체 및 유기실란-개질된 실리카 지지체를 포함하지만 여기에만 국한되지는 않는다.
친화성 크로마토그래피는 일반적으로 리간드 또는 생체특이성 효과기(biospecific effector)가 고정상 입자에 공유결합함으로써 수행된다. 이러한 리간드 또는 효과기는 "자물쇠-열쇠(lock and key)" 관계에 의해 생체거대분자와 상호작용할 수 있는 있기 때문에 선택된 것이다. 예를 들면 단백질이, 분리가 요구되는 생체거대분자라면, 공유결합된 리간드 또는 효과기는 종종 단백질의 활성부위("자물쇠")에 강하게 결합되는 기재 또는 저해제("열쇠" 분자)이다. 이러한 공정의 높은 선택성은 착물 혼합물로부터 생체거대분자가 1-단계로 정제되는 것을 허용한다. 용출은 종종 단순히 pH의 변화에 의해 수행되지만, 탈결합 용액 및 기술은 각각의 생체거대분자-리간드 쌍에 대해 특이성이므로, 각각의 쌍에 대한 특수한 설명서를 제조사로부터 입수할 수 있다.
유용한 친화성 크로마토그래피 고정상 입자는, 아가로스, 셀룰로스, 및 아르기닌 및 벤즈아미딘(세린 프로테아제)을 포함하는 (상응하는 생체거대분자 친화성을 갖는) 여러개의 리간드를 갖는 비닐 중합체, 시바크론 블루(Cibacron Blue)(아데닐-함유 공-효과기, 알부민, 응집인자, 인터페론을 필요로 하는 효소), 칼모듈린(ATP 가수분해효소(ATPase), 단백질 키나제, 포스포디에스테라제, 신경전달물질), 젤라틴(피브로넥틴), 글루타티온(스트란스페라제(Stransferase), 글루타티온-의존성 단백질, 융합 단백질), 헤파린(성장인자, 응집 단백질, 스테로이드 수용체, 제한효소(restriction endonuclease), 지질단백질, 리파제), 단백질 A 및 G(IgG 및 아강(subclass)), L-리신(플라스미노겐, 플라스미노겐 활성화제, 리보좀 RNA), 프로시온 레드(procion red)(NADP+ 의존성 효소, 카르복시펩티다제 G), 콘카나발린 A(concanavalin A) 및 렉틴(당단백질, 막 단백질, 당지질, 다당류) 및 DNA(DNA 중합효소, RNA 중합효소, T-4 폴리뉴클레오티드 키나제, 핵산외부가수분해효소(exonuclease))를 포함하는 다양한 기본 매트릭스를 갖는다.
본 발명의 복합 여과매체를 사용하여, 50 마이크로미터 미만의 고정상 입자크기를 사용할 수 있다. 이전에는 이러한 "미세 입자"는 칼럼의 충전 및 사용 동안에 겪는 높은 압력 때문에 유용하지 못한 것으로 생각되었다. 본 발명의 복합 여과기는 놀랍게도 이러한 미세 입자를 대규모 생체분리에서 약 50 psi(0.34 MPa) 미만의 압력에서 사용하는 것을 허용한다. 또한 연질 입자상 겔도 사용될 수 있다. 이전에는 연질 입자는 변형됨으로써 높은 압력 및/또는 낮은 유속을 초래하기 때문에 예비-분리에는 유용하지 못한 것으로 생각되었다.
바람직한 실시양태에서, 파쇄 또는 분쇄된 모노리쓰형 수지가 흡수성 고정상 입자로서 사용될 수 있다. 전통적인 모노리쓰형 물질의 경우, 필요한 단량체 및 기공형성물질(porogen)을 크로마토그래피 칼럼에 충전하고, 제자리에서(in situ) 중합시켜 수지의 연속적 고체 플러그를 형성한다. 이전에는 이러한 공정은 비교적 소규모 칼럼에서의 분리에만 적용되었다.
본 발명의 출원인은 이러한 모노리쓰형 물질을 적합한 용기에서 제조하여 플러그를 형성하고 이어서 분쇄하여 불규칙적 형상의 입자를 형성할 수 있다는 것을 발견하였다. 제조된 바와 같은 이러한 입자는 비교적 넓은(일반적으로는 약 0.1 내지 1000 마이크로미터) 입자크기분포를 갖고, 이것은 본 발명의 복합 여과기에서 사용될 수 있다. 이렇게 하여, 모노리쓰형 물질의 독특한 다공성 및 역학적 흡착 성질을 대규모 생체분리에 맞도록 적응시킬 수 있다. 원한다면, 분쇄된 불규칙적 형상의 입자를 체로써 분급하거나 형성된 그대로 사용할 수 있다. 이전에는, 현탁 중합에 의해 제조된 규칙적 형상(즉 구형)의 입자를 좁은 범위의 입자크기로 분급시키고/시키거나 미세 입자를 제거하도록 분급시켰다. 이러한 미세 입자는, 제거되지 않는다면, 보다 큰 입자들 사이의 틈새 공간을 충전함으로써, 유동을 감소시키고/시키거나 압력을 현저하게 증가시킬 것이다. 분급되지 않은 분쇄된 모노리쓰형 입자는 이러한 분급 또는 미세 입자의 제거를 필요로 하지 않고, 적당한 유동을 유지하고 50 psi(0.34 MPa)를 초과하는 높은 압력을 회피하면서 본 발명의 복합 여과기에서 사용될 수 있다.
중합체성 모노리쓰는 이러한 다공성 모노리쓰형 중합체를 형성하도록 제자리 중합에 적합한 혼합물 내에 존재하는 단량체로써 만들어진다. 이러한 혼합물은 예를 들면 단량체 또는 단량체들의 혼합물, 기공형성물질 및 개시제를 포함한다.
전형적으로, 중합체성 모노리쓰는 친수성 기, 친수성 기의 전구체, 이온화가능한 기 또는 이것의 전구체, 소수성 기 또는 이것의 전구체, 또는 이것들의 혼합물을 갖는 중합된 단량체 단위를 포함한다. 임의적으로, 중합체성 모노리쓰는 친화성 리간드를 함유할 수도 있다. 상기 단량체 단위들의 임의의 조합이 본 발명의 범위 내에 포함된다.
친수성 기 또는 친수성 기의 전구체를 갖는 중합된 단량체 단위를 포함하는 다공성 중합체 모노리쓰에 있어서, 이러한 단량체는 일반적으로 2-히드록시에틸 메타크릴레이트, 부틸 메타크릴레이트, 2-히드록시에틸 아크릴레이트, 글리시딜 메타크릴레이트, 글리시딜 아크릴레이트, 아세톡시스티렌, 클로로메틸스티렌, t-부톡시카르보닐옥시스티렌 및 이것들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 아크릴레이트, 메타크릴레이트 또는 스티렌이다.
소수성 기 또는 소수성 기의 전구체를 갖는 중합된 단량체 단위를 포함하는 다공성 중합체 모노리쓰에 있어서, 이러한 단량체는 일반적으로 아크릴레이트 에스테르, 메타크릴레이트 에스테르, 아크릴레이트 아미드, 메타크릴레이트 아미드, 스티렌, 스티렌 유도체 및 이것들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되고, 소수성 기를 포함하는 바람직한 단량체는 알킬 아크릴레이트, 알킬 메타크릴레이트, 스티렌, 알킬스티렌 또는 이것들의 조합이다.
이온화가능한 기 또는 이온화가능한 기의 전구체를 갖는 중합된 단량체 단위를 포함하는 다공성 중합체 모노리쓰에 있어서, 이러한 중합된 단량체는 일반적으로 아미노기, 카르복실산기, 술폰산기 및 인산기(또는 이것들의 염)와 같은 작용기를 함유하고, 바람직한 이온화가능한 단량체는 아크릴산, 메타크릴산, 이타콘산, 말레산 무수물, 스티렌 술폰산, 2-아크릴아미도-2-메틸-3-프로판술폰산, 2-(메타크릴옥시) 에틸포스페이트, 아미노산의 아크릴릭 아미드, 아미노산의 메타크릴릭 아미드, 2-비닐피리딘, 4-비닐피리딘, 2-(디알킬아미노) 에틸 아크릴레이트, 2-(디알킬아미노)에틸 메타크릴레이트, 2-(모르폴리노)에틸 아크릴레이트, 2-(모르폴리노)에틸 메타크릴레이트, [2-(메타크릴옥시)에틸]트리메틸암모늄 클로라이드, [2-(메타크릴옥시)에틸]트리메틸암모늄 메틸술페이트, 및 이것들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 모노리쓰의 제조에 바람직한 단량체는 아크릴레이트, 메타크릴레이트 및 이것들의 유도체이다.
다공성 중합체성 모노리쓰는 추가로 가교 단량체를 포함한다. 가교 단량체는 바람직하게는 디아크릴레이트, 디메타크릴레이트, 트리아크릴레이트, 트리메타크릴레이트, 디아크릴아미드, 디메타크릴아미드 또는 디비닐방향족 단량체로 이루어진 군에서 선택된 폴리비닐 단량체이고, 바람직한 폴리비닐 단량체는 에틸렌 디아크릴레이트, 에틸렌 디메타크릴레이트, 트리메틸올프로판 트리아크릴레이트, 트리메틸올프로판 트리메타크릴레이트, N,N'-메틸렌 비스-아크릴아미드 또는 피페라진디아크릴아미드, 디비닐벤젠 또는 디비닐나프탈렌이다.
한 바람직한 실시양태에서, 다공성 중합체 모노리쓰는 단량체와 관련해 약 10 내지 약 90％의 하나 이상의 모노비닐 단량체, 약 5 내지 약 90％의 하나 이상의 폴리비닐 단량체 및 약 0.01 내지 약 2％의 개시제를 포함한다.
본 발명의 다공성 중합체 모노리쓰는 임의적으로 약 1 내지 약 50％의 친화성 리간드를 포함할 수도 있다. 리간드는 이미 형성된 모노리쓰 내에 공유결합적으로 고정화되거나, 단량체 형태로서 중합 전에 중합체성 혼합물에 첨가된다. 리간드는 생물학적 또는 합성 화합물일 수 있고, 생물학적 친화성 리간드는 다당류, 항체, 효소, 렉틴, 항원, 세포표면수용체, 세포간 수용체, 바이러스 외피 단백질, DNA 및 이것들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되고, 합성 친화성 리간드는 반응성 염료, 탄닌산, 갈릭산, 이미노디아세트산, 에틸렌디아민트리아세트산, [2-(메타크릴로일옥시)에틸]디메틸(3-술포프로필)암모늄 수산화물의 불활성 염 및 이것들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다.
원하는 기공 구조를 달성하기 위해서, 중합은 일반적으로 기공형성물질을 포함한다. 이것의 기능은 첫번째는 모든 단량체 및 개시제를 용해시키는 것이고, 두번째는 균질한 용액을 형성하는 것이고, 세번째는 중합 동안에 상분리 절차를 제어하는 것이다.
전형적으로, 기공형성물질은 물, 유기 용매 또는 이것들의 혼합물이다. 기공형성 유기 용매는 탄화수소, 알콜, 케톤, 알데히드, 유기 산 에스테르, 에테르, 가용성 중합체 용액 및 이것들의 혼합물, 예를 들면 시클로헥산올, 1-도데칸올, 메탄올, 헥산, 프로판올, 도데칸올, 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 부탄디올, 메틸-t-부틸에테르, 디이소프로필케톤, 부탄올 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트) 및 이것들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다. 기공형성물질은 전형적으로 약 30 내지 약 80 부피％의 양으로 존재하고, 바람직한 범위는 약 40 내지 약 60 부피％이다.
본 발명의 모노리쓰는 제자리에서 개시된 중합에 의해 제조된다. 제자리 중합은 중합 혼합물이 성형틀 또는 기타 적합한 용기 내에 침착될 때 이러한 중합 혼합물을 모노리쓰형 구조로 효과적으로 중합시키는 임의의 공정 또는 절차일 수 있다. 제자리 중합 공정은 다공성 고체 모노리쓰를 제조할 것이다. 이러한 공정은 가열, 산화환원반응 또는 광개시에 의해 개시될 수 있다.
다양한 모노리쓰형 중합체 물질이 해당 분야에 공지되어 있다. 문헌[Frechet 등, Adv. Matls., 1999, 제 11 권, 제 14 호, 1169 내지 1181 페이지] 및 여기에서 언급된 참고문헌 및 미국특허 5,453,185, 미국특허 5,334,310 및 미국특허 제 6,887,384를 참고할 수 있다. 중합된 모노리쓰의 형성에 관한 유용한 기술 중 하나가 미국특허출원공개 2004/0166534(Roscoe 등)에 수록되어 있다.
중합을 수행하여 모노리쓰형 중합체를 형성한 후에는 일반적으로 기공형성물질을 제거한다. 이어서 중합된 모노리쓰를 분쇄 또는 파쇄하여, 크기분포가 약 0.1 내지 1000 마이크로미터인 불규칙적 형상의 입자를 수득한다. 기공 크기 범위는 선택된 중합 혼합물 및 특히 기공형성물질의 사용에 따라 달라진다. 그 결과의 기공 크기는 일반적으로 약 200 마이크로미터 미만, 바람직하게는 100 마이크로미터 미만, 더욱 바람직하게는 50 마이크로미터 미만이다.
임의의 적합한 분쇄 또는 파쇄 기술을 사용할 수 있고, 중합체를 유리전이온도 미만의 온도로 냉각시켜 분쇄를 용이하게 할 수 있다.
전술된 여과기 카트리지, 여과기 하우징 및 고정상 입자를 사용하여, 분리 시스템을 제조하는 방법이 지금부터 상세하게 설명될 것이다. 공정은 (i) 하우징 내에 함유된 본 발명의 복합 여과매체를 포함하는 여과기 카트리지, 0.01 ㎝/분 이상의 플럭스 속도를 전달할 수 있는 펌프 및 이것과 연결된 튜브를 포함하는 조립체를 제공하는 단계; (ii) 하나 이상의 생체거대분자 용질을 포함하는 생물학적 용액 혼합물을, 이것이 분리 여과기 조립체 내에서 순환하여 생체거대분자를 분리할 수 있게 하도록, 저장기에 혼입시키는 단계를 포함한다.
평균입자크기가 50 마이크로미터 미만인 고정상 입자, 연질 입자 또는 파쇄된 모노리쓰형 입자를 포함하는 복합 여과기는 대규모 생체분리, 즉 부피가 100 리터 이상인 생체반응기에서 생성된 생체거대분자 생성물의 분리 및/또는 정제를 가능하게 한다. 많은 실시양태에서, 1000 리터의 대규모 분리, 및 10,000 리터 이상의 대규모 분리가 가능하다.
본 발명에서 유용한 펌프는 여과기 카트리지를 통해 0.01 ㎝/분 초과, 바람직하게는 0.10 ㎝/분 초과, 더욱 바람직하게는 0.30 ㎝/분 초과의 플럭스 속도를 제공한다. 하나 초과의 생체거대분자 용질을 포함하는 하나 이상의 슬러리 및 용액 혼합물이 유동하는 펌프 및 이것과 연결된 가스켓 및 튜브/파이프는 바람직하게는 용액에 의해 비교적 화학적으로 영향받지 않는다. 바람직한 펌프는, 용액과 접촉하는 실제 펌프 성분이 스테인레스강 또는 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)으로 구성된 튜브연동식, 격막식, 기어식 및 원심력-추진식 펌프를 포함한다. 대부분의 유형의 고무 또는 플라스틱 튜브/파이프가 수성 매체 내에서 수행되는 충전 및 분리에 적합하지만, 유기 용매의 수성 혼합물이 사용되는 경우, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, PTFE, 스테인레스강 및 유리 튜브가 바람직하게 사용된다. 여과기 카트리지를 여과기 하우징 및 분리 시스템의 나머지 것들과 연결접속시키기에 바람직한 가스켓 물질은 PTFE 및 폴리프로필렌을 포함한다.
여과기 카트리지는 (i) 하우징 내에 함유된 본 발명의 복합 여과매체를 포함하는 여과기 카트리지, 0.01 ㎝/분 이상의 플럭스 속도를 전달할 수 있는 펌프 및 이것과 연결된 튜브를 포함하는 조립체를 제공하는 단계; (ii) 적당한 용매 중 입자의 슬러리를 제공하는 단계; (iii) 원하는 양의 고정상 입자가 적재될 때까지 슬러리를 재순환 모드로 여과기 카트리지를 통해 펌핑시키는 단계(여과기 카트리지 압력은 바람직하게는 약 0.15 MPa 미만, 더욱 바람직하게는 0.10 MPa 미만, 가장 바람직하게는 0.05 MPa 미만임)를 포함하는 "습식" 충전 기술에 의해 적재될 수 있다.
통상적인 "건식" 충전 기술과는 대조적으로, 액체 담체를 사용함으로써 여과층 상에 입자를 "습식" 충전하는 기술은, 후속적으로 용액 혼합물에 접근가능한 여과매체의 영역 내에 입자가 위치하는 것을 보장한다. 액체 담체의 유동은 입자의 궁극적인 위치에 영향을 줄 수 있지만, 입자는, 입자의 위치가 예비선택된 것이 아니라는 점에서, 여과층 상에 무작위적으로 위치한다. 전술된 공정으로 여과기 카트리지를 충전시키는 경우, 여과요소를 비교적 균일하게 부분 적재하기 위해서, 각각의 충전 동안에, 액체 내 입자의 농도가 상당히 묽은 것이 바람직하다. 입자를 여러 분취량으로 나누어(입자가 적합하게 조밀하고 수-습윤성이거나 예비-슬러리화된 경우 용매 없이), 각각의 분취량을 첨가하기 전후에 저장기 내용물이 시각적으로 등명해지게 하면서, 저장기에 첨가할 수 있다.
충전 작업의 플럭스 속도는 바람직하게는 0.01 ㎝/분 이상, 더욱 바람직하게는 0.10 ㎝/분 이상, 가장 바람직하게는 0.30 ㎝/분 이상이다. 분리상 동안의 양 및 시간과 관련하여, 원하는 생체거대분자를 효율적으로 분리하는 외에도, 특히 바람직한 복합 방사상 주름형 여과기 카트리지를 사용하는 입자 적재상 동안에는, 입자가 주름잡힌 여과요소의 주름들을 보다 잘 투과하여 보다 많은 여과요소에 접근하여 높은 적재율을 용이하게 달성하도록, 비교적 높은 플럭스 속도가 바람직하다. 고정상 입자들을 슬러리화하는데 사용되는 액체는 일반적으로 용액 혼합물의 용매이고, 일반적으로는 물, 바람직하게는 완충된 물이다. 소수성 상호작용 또는 역상 고정상 입자의 경우, 특히 용출 단계에서 유기 액체와 물의 혼합물을 사용할 필요가 있을 수 있다. 유용한 유기 액체는 50 중량％ 이하의 양의, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 아세토니트릴 및 N,N-디메틸포름아미드를 포함한다.
입자는, 여과기 카트리지 압력이 0.15 MPa 이하, 바람직하게는 0.10 MPa 이하, 더욱 바람직하게는 0.05 MPa 이하에 도달할 때까지, 저장기에 적재되고 궁극적으로는 여과요소의 상류 표면 상에 적재된다. 완전히 적재된 바람직한 복합 방사상 주름형 여과기 카트리지에 대한 현실적인 여과기 카트리지 압력 한계는 약 0.25 MPa이다. 일반적으로는 여과기 카트리지의 응용에 있어서, 여과기 카트리지 압력이 약 0.05 MPa를 초과할 때, 후속적으로 추가의 입자를 적재하면 여과기 카트리지 압력은 점점 더 증가한다. 그러나 특히 보다 낮은 권장된 여과기 카트리지 압력에서, 여과기 카트리지를 통과하는 용액의 플럭스 속도는 본 발명의 취지상 높고 바람직한 범위 내에 있게 된다. 이렇게 하여, 장치는 여전히, 후속적 분리 및 취급 작업 동안에 우연히 존재할만한 입자에 대처할 수 있다. 실제 작업을 위해 다소의 입자 적재용량을 남겨둠으로써, 여과기 막힘에 의한 순간 정지(shot down)가 방지되고, 여과기 카트리지 수명이 연장될 수 있다.
이제, 고정상 입자가 적재된 여과기 카트리지를, 이것을 통과하는 용액 혼합물로부터 생체거대분자를 분리시키는 분리 여과기 조립체로서 사용할 수 있게 된다. 분리 여과기 조립체 및 카트리지는 도 1 내지 도 5에 도시되어 있다.
입자를 적재하여 복합 여과매체를 제공한 후, 입구 및 출구 튜브 말단을 저장기로부터 떼어내서(또는 충전 저장기가 분리 저장기로서도 작용하는 경우에는 부착된 채로 둠) 생물학적 용액 혼합물을 함유하는 저장기에 부착한다. 생물학적 용액 혼합물은 하나 초과의 생체거대분자 용질을 포함할 수 있다. 원하는 생체거대분자는 발효 매체, 세포융해체, 및 체액, 예를 들면 혈액 및 혈액 성분, 복수액 및 뇨로부터 유도될 수 있다.
가장 짧은 기간 동안에 가장 많은 양의 정제된 생체거대분자, 즉 높은 처리량을 수득하는 것이 통상적으로 바람직하다. 높은 처리량은 종종 문헌에서 생산률(또는 생산속도) 또는 시간당 크로마토그래피 수지 1리터당 정제된 생성물의 양으로서 정량되어 있다. 상업적으로 입수가능한 단백질 A 수지의 전형적인 생산률은 문헌[Fahrner 등, Biotechnol.Appl.Biochem., 1999, 30, 121-128]에 13 내지 23 g/ℓ/hr인 것으로 보고되어 있다. 본 발명의 분리 시스템을 사용하여, 25 g/ℓ/hr 초과, 40 g/ℓ/hr 초과, 70 g/ℓ/hr 초과 및 100 g/ℓ/hr 초과의 포착 효율 및/또는 생산률을 달성할 수 있다. 용액 혼합물이 복합 여과매체를 통과하여(즉 플럭스 속도) 재순환되는 속도는 본 발명의 성능에 대한 중요한 척도인 것으로 결정되었다. 매우 중요한 인자 중 하나는, 본 발명의 분리 여과기 조립체는 주로 낮은 압력에서 작동되기 때문에 보다 많은 양의 용액 혼합물을 주어진 시간 내에 처리하는 것을 허용한다는 점이다. 본 발명의 분리 여과기 조립체의 높은 효율에 기여할 수 있는 다른 인자는 (1) 충전 칼럼에서 사용되는 보다 큰 입자들에 비해, 비교적 높은 표면적 및 감소된 확산 한계를 갖는 보다 작은 고정상 입자를 활용할 수 있는 능력; (2) 보다 높은 플럭스 속도에서 생체거대분자 용질과 고정상 입자의 보다 우수한 전단 혼합; 및 (3) 보다 높은 플럭스 속도에서 여과요소의 주름 또는 절첩부 내에 깊숙이 함유된 보다 많은 입자들에 대한 접근이다. 용액 혼합물 통과의 플럭스 속도는 바람직하게는 0.01 ㎝/분 이상이고, 더욱 바람직하게는 0.10 ㎝/분 이상이고, 가장 바람직하게는 0.30 ㎝/분 이상이다.
본 발명의 여과요소는 단백질, 탄수화물, 지질, 핵산 및 기타 생물학적 물질을 포함하는 다양한 생물학적 분리에서 유용성을 갖는다. 분리 및 정제된 거대분자는 유용한 치료용 및 진단용 약제이다.
본 발명의 목적 및 이점은 하기 실시예에서 추가로 예시되지만, 이러한 실시예에서 언급된 특정 물질 및 그것의 양 뿐만 아니라 기타 조건 및 세부사항이 본 발명을 부당하게 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 실시예는 단지 예시를 목적으로 할 뿐이지 첨부된 청구의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 실시예 및 명세서의 나머지 부분에서 언급된 모든 부,％, 비율 등은 달리 언급이 없는 한 중량 기준이다. 사용된 용매 및 기타 시약은 달리 언급이 없는 한 미국 위스콘신주 밀워키 소재의 시그마-알드리치 케미칼 캄파니(Sigma-Aldrich Chemical Company)로부터 입수되었다.
시험 방법
리소짐에 대한 양이온교환용량
0.8 × 4 센티미터 폴리프로필렌 일회용 크로마토그래피 칼럼(미국 캘리포니아주 헤르큘레스 소재의 바이오-라드 래보러토리즈(Bio-Rad Laboratories)의 폴리-프레프 칼럼(Poly-Prep Column))에 이온교환수지 1 ㎖를 충전하였다. 칼럼 베드를, pH 7.5에서 적재용 완충제인 10 mM MOPS(4-모르폴리노프로판술폰산)의 용액 10 ㎖로써 세척함으로써 평형화시켰다. 이어서 칼럼 베드에 MOPS 완충제 중 12 ㎎/㎖의 농도를 갖는 단백질 용액(달걀 난백 리소짐, 약 95％ 순도, 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co.)) 30 ㎖를 적재하였다. 모든 완충제 및 단백질 용액을 탈이온수에서 제조하였다. 임의의 미결합 리소짐을 MOPS 완충제 30 ㎖(10 ㎖ 분획 3개)로써 세척 제거하였다. 마지막으로, 결합된 단백질을 MOPS 완충제 중 1M NaCl 15 ㎖로써 용출시켰다.
휴렛-팩커드 다이오드 어레이 스펙트로포토메터 모델 8452A(Hewlett-Packard Diode Array Spectrophotometer, Model 8452A)를 사용하여 280 ㎚에서 UV 흡광도를 측정함으로써, 다양한 분획에서 회수된 단백질의 양을 결정하였다. 순수한 리소짐을 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. NaCl 용출물에서 회수된 단백질의 양은 지지체에 대한 평형 양이온교환용량과 동일하다고 보았다.
면역글로불린 G(IgG)에 대한 양이온교환용량
양이온교환 비드를 물과 혼합하고, 20분 동안 3000 상대원심력(rcf)에서 원심분리한 후, 총 부피가 충전된 비드 베드의 부피의 2배가 되도록 물의 양을 조절함으로써, 탈이온수 중 양이온교환 비드의 50％ v/v 슬러리를 제조하였다. 슬러리를 잘 혼합하여 비드를 현탁시킨 후, 슬러리 샘플 400 마이크로리터를 피펫을 사용하여 5 밀리리터 0.45 마이크로미터 셀룰로스 아세테이트 센트렉스 MF(Centrex MF) 원심식 미세여과기(미국 미네소타주 이간 소재의 VWR에서 입수가능한 슐라이허 & 슈엘(Schleicher & Schuell))에 첨가하였다. 이것을 3000 rcf에서 5분 동안 원심분리함으로써 물을 제거하고, 80 mM 염화나트륨을 함유하는, pH 4.5의 50 mM 아세트산나트륨 4 ㎖와 혼합하고, 3000 rcf에서 10분 동안 다시 원심분리하였다. 여과수를 폐기하였다. 이어서 동일한 아세테이트 완충제 중 인간 IgG의 샘플(약 7 ㎎/㎖) 4.5 ㎖를, 비드를 함유하는 여과기에 첨가하였다. 혼합물을 밤새 텀블링시킴으로써 혼합한 후, 3000 rcf에서 20분 동안 원심분리함으로써 상층액을 비드로부터 제거하였다.
여과수를 UV 분광법으로써 분석하고, 280 ㎚에서의 흡광도를 출발 IgG 용액의 것과 비교하고, 그 차이를 사용하여 비드의 IgG 용량을 계산하였다. 분석을 삼중으로(in triplicate) 수행하였고 평균을 내었다.
입자크기 측정법
호리바 LA-910(Horiba LA-910) 장치(미국 캘리포니아주 어빈 소재의 호리바 래보러토리 인스트루먼츠(Horiba Laboratory Instruments))를 사용하여 광산란시킴 으로써 입자크기를 측정하였다.
압력/유동 특성화
컴퓨터-제어된 시험 장비는 1 ㎝ × 10 ㎝ 유리 칼럼, 칼럼 말단 부속품, 펌프, 압력계 및 인산염-완충된 식염수(PBS)를 함유하는 저장기에 연결된 적당한 튜브로 이루어졌다. 측정될 입자를 칼럼에 충전시켰다. 펌프를 켬으로써, 전형적으로는 2 ㎖/min(약 150 ㎝/hr)에서 개시함으로써, 칼럼을 통한 유동을 개시하였다. 압력강하가 안정한지를 확인하기 위해 유동을 상기 속도로 유지하고(전형적으로는 5 내지 15 분), 이어서 유속을 2 또는 4 ㎖/min 증가분으로 증가시키고, 다시 칼럼을 가로지르는 압력강하를 모니터링하였다. 칼럼이 고장날 때까지 이러한 절차를 계속 수행하였다. 고장은 컴퓨터가 시스템을 자동적으로 순간 정지시키는 시점인, 압력이 170 psi를 초과하는 경우로서 정의되었다.
단백질 A 친화성에 의한 인간 IgG 포착
인간 IgG 포착에 대해 시험될 입자를 단백질 A와 함께 적재하고, 카트리지 여과기(팔 필링 머신 캡슐(Pall Filling Machine Capsule) 카트리지, 5 마이크로미터 기공 크기, 여과층 면적 300 ㎠, 또는 큐노 베타퓨어 캡슐(CUNO Betapure Capsule) 여과기 카트리지, 2 마이크로미터 기공 크기, 여과층 면적 900 ㎠) 상에 충전시키기 위해, 비드 슬러리를 상기 여과기를 통해 펌핑시킨 후 PBS 완충제를 완충제 교환을 위해 펌핑시켰다. 완충제를 카트리지 여과기 하우징으로부터 배출시킨 후, 인간 IgG 용액(pH 7.2의 10 mM PBS 중 1.0 ㎎/㎖, 총부피 1,500 ㎖)을 저장기에 적재하고, 여과기 카트리지 하우징에 펌핑시키고, 재순환을 위해 저장기로 복 귀시켰다. 유속은 400 ㎖/min이었고, 압력강하는 35 psi(0.24 MPa) 미만이었다. 280 ㎚의 파장에서의 UV 흡광도를 사용하여 IgG 농도를 온-라인으로 모니터링함으로써 결정된 IgG 포착 속도가 0에 가까워질 때까지, 용액을 4 내지 30 분 동안 재순환시켰다. 용액을 입구 튜브를 통해 여과기 하우징으로부터 배출시키고, 여과기를 세척하고 포착된 IgG를 용출시키고 완충제를 교환함으로써, 여과기 카트리지 내의 비드를 재생시켰다. 이어서 카트리지 여과기 내의 재생된 비드를 용액 내에 남아있는 IgG를 포착하는데 사용하였다. 이러한 사이클을 용액 내의 대부분(93 내지 99％)의 IgG를 포착하기 위해 5번 반복하였다. 각각의 사이클에서의 포착 성능 및 총 포착률을 기록하였다.
약어표
약어 또는 상표명 설명
MBA N,N'-메틸렌비스아크릴아미드
VDM 4,4-디메틸-2-비닐-1,3-옥사졸린-4-온(비닐디메틸아즐락톤)
AMPS 미국 오하이오주 위클리프 소재의 루브리졸 코포레이션(Lubrizol Corp.)에서 나트륨염의 50％ 수용액인 AMPS 2405 모노머(AMPS 2405 Monomer)로서 상업적으로 입수가능한 2-아크릴아미도-2-메틸프로판술폰산
TMEDA N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민
CM-세파덱스(Sephadex) C50 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences)에서 입수가능한 약한 양이온교환수지
PEG 400 평균분자량이 400인 폴리에틸렌글리콜
완충제 A 0.135 M MOPS[3-(N-모르폴리노)프로판술폰산] 중 0.018 M 황산나트륨, pH 7.55
완충제 B 0.1 M MOPS 중 0.4 M 트리스(트리스(히드록시메틸)아미노메탄), 1.27 M 황산나트륨, pH 7.5
PBS 140 mM NaCl 중 인산나트륨의 완충제 용액, pH 7.2
IgG 미국 텍사스주 커빌 소재의 이퀴테크-바이오 인코포레이티드(EQUITECH-BIO, Inc.)에서 입수가능한 동결건조된 인간 IgG
제조실시예 1
미국특허 제 5,403,902 호에 기술된 바와 같은 역상 현탁 중합을 사용하여, 중량비가 35:65인 AMPS/MBA 공중합체를 제조하였다. 중합체성 안정화제(0.28 그램), 톨루엔(132 ㎖) 및 헵탄(243 ㎖)을, 기계적 교반기(교반속도 450 rpm), 질소 입구, 온도계, 온도 조절기를 갖는 가열 맨틀 및 응축기가 장착된 플라스크에 첨가하였다. 중합체성 안정화제는 중량비가 91.8:8.2인 이소옥틸 아크릴레이트와 2-아크릴아미도이소부티르아미드의 공중합체(이것은 문헌[Rasmussen 등, Makromol.Chem.,Macromol.Symp., 54/55, 535-550(1992)]에 기술된 바와 같이 제조됨)였다. 플라스크 내 비-수성 용액을 35℃로 가열하면서 교반하고, 질소를 15분 동안 살포하였다.
MBA(9.10 그램), AMPS(50 중량％의 수용액 9.80 그램), 메탄올(50 ㎖) 및 탈이온수(45.1 ㎖)를 함유하는 수용액을 제조하였다. 이러한 제 2 용액을 교반하고 30 내지 35 ℃에서 가열하여 MBA를 용해시켰다. 과황산나트륨(0.5 그램)을 제 2 용액에 첨가하면서 추가로 교반하여 과황산염을 용해시켰다. 수용액을 비-수성 용액을 함유하는 반응 플라스크에 첨가하였다. 그 결과의 혼합물을 교반하고 질소를 5분 동안 살포하였다. TMEDA(0.5 ㎖)를 첨가하여 중합을 개시하였다. 반응 온도가 갑자기 42.5 ℃로 상승하였고, 이어서 천천히 진정되었다. 반응 혼합물을 TMEDA의 첨가 시점으로부터 총 2시간 30분 동안 교반하고, 소결된 유리 깔때기를 사용하여 여과하고, 아세톤(5 × 250 ㎖)으로써 세척하고, 실온에서 진공 중에서 건조시켜, 무색 입자 15.7 그램을 수득하였다.
제조실시예 2 내지 3
제조실시예 1에서 기술된 것과 동일한 역상 중합 절차를 수행하여, 중량비가 65:35인 AMPS/MBA 공중합체(제조실시예 2) 및 중량비가 40:60인 AMPS/MBA 공중합체(제조실시예 3)를 수득하였다.
실시예 1
제조실시예 2에 기술된 바와 같이 역상 현탁 중합을 사용하여, 중량비가 65:35인 AMPS/MBA 공중합체를 제조하였다. 리소짐에 대한 평형 양이온교환용량을 측정하였고 이것은 160 ㎎/㎖인 것으로 밝혀졌다. 현미경 검사를 통해, 이것이 직경이 약 10 내지 200 마이크로미터인 구형 입자임이 밝혀졌다. 압력/유동 특성을 측정해 본 결과, 칼럼은 가장 낮은 유속에서 과도하게 가압되었다. 이러한 입자의 샘플을 분급하여, 약 45 내지 110 마이크로미터의 크기 범위를 제공하였다. 이러한 분급된 샘플의 압력/유동 특성은, 2 ㎖/min(150 ㎝/hr)에서 20 psi(약 0.14 MPa)의 압력강하를 제공하였지만, 3 ㎖/min(약 230 ㎝/hr)에서 실패하였다(170 psi 초과 = 1.17 MPa 초과).
분급되지 않은 비드의 샘플을 하기 시스템에서 평가하였다:
여과기 카트리지: 팔 베르사포르(Pall Versapor) 카트리지, 3 마이크로미터 기공 크기, 1480 ㎠ 여과층 면적
비드: AMPS/MBA(65/35); 5㎖ 수화된 베드 부피
리소짐 적재 용액: 10 ㎖ MOPS 중 2 ㎎/㎖, pH = 7.5, 1000 ㎖
완충제: 10 mM MOPS, pH = 7.5
(하우징 및 튜브의) 시스템 부피: 450 ㎖
유속: 1120 ㎖/min, 5 psi 미만의 압력 강하
절차
충전시키고 배출시키고 부피를 3번 측정하고 그 결과들을 평균냄으로써, 시스템 부피를 결정하였다. 스톱워치 및 구배된 실린더를 사용하여, 특정 펌프 세팅에 대해 유속을 측정하였다(역시 3번 측정하여 평균을 냄). 이어서 완충제 50 ㎖를 사용하여 비드의 슬러리를 제조함으로써, 여과기 상에 비드를 충전시켰다.
이러한 슬러리를 2-분취량으로 나누어 일정량(약 1000 ㎖)의 완충제에 첨가하고, 여과기를 통해 펌핑시켜, 분취량의 첨가 전후에 완충제가 등명해지도록 하였다. 원래 용기의 2-분량의 헹굼물을 사용하여 잔여 비드를 적재하고, 헹굼물이 등명해진 후 추가로 15분 동안 완충제의 재순환을 허용하였다. 펌프를 끄고, 리소짐 용액으로 배관을 잇고 펌프를 켜서 재순환을 개시하였다. 용액을 90분 동안 재순환시키고 샘플을 주기적으로 채취하여 적재 용액 내에 남아있는 리소짐의 양(UV 흡광도)을 측정하였다. 그 결과가 표 1에 명시되어 있다.
비교실시예 1
중량비가 40:60인 AMPS/MBA 공중합체를 제조실시예 3에 기술된 바와 같은 역상 현탁 중합을 사용하여 제조하였다. 형성된 비드를 약 40 내지 110 마이크로미터의 크기 범위를 제공하도록 분급하였다. 리소짐에 대한 평형 용량은 113 ㎎/㎖인 것으로 측정되었다. 이러한 분급된 샘플의 압력/유동 특성은 10 ㎖/min(760 ㎝/hr)에서 50 psi(0.34 MPa)의 안정한 압력강하를 보이다가, 보다 높은 유속에서는 점점 더 압력강하가 증가해서 결국에는 1000 ㎝/hr 초과할 때 실패했다. 이러한 비드를 실시예 1에서 기술된 시스템에서 평가하였고, 그 결과가 표 1에 명시되어 있다.
시간(분) 실시예 1 비드 상 리소짐 (㎎/㎖) 비교실시예 1 비드 상 리소짐(㎎/㎖)
0 0 0
5 59.48 46.79
10 66.06 56.29
15 75.79 50.45
20 79.95 55.00
25 88.68 57.93
30 86.60 64.11
40 94.41 69.64
50 88.46 77.06
60 103.95 70.69
70 108.07 90.34
80 113.18 84.83
90 115.79 84.95
100 NM 86.06
NM = 측정되지 않음
비교실시예 2
AMPS(50％ 수용액 36.4g), MBA(9.8g), 탈이온수(31.8 ㎖) 및 이소프로판올(100 ㎖)로부터, 제조실시예 2에 기술된 바와 같이 역상 현탁 중합을 사용하여, 중량비가 65:35인 AMPS/MBA 공중합체를 제조하였다. 리소짐에 대한 평형 양이온교환용량은 25 ㎎/㎖인 것으로서 측정되었고, IgG에 대한 평형 양이온교환용량은 7 ㎎/㎖인 것으로 밝혀졌다.
실시예 2
비교실시예 2의 수성상과 동일한 배합비를 갖는 모노리쓰형 매체를 제조하였다. 유리 용기에서, MBA(0.993 g), 50 중량％의 AMPS 수용액(3.649 g), 탈이온수(2.88 ㎖) 및 이소프로판올(10 ㎖)을 혼합하고 약하게 가열하면서 교반하였다. 혼합물을 완전히 용해시킨 후, 이것을 폴리에틸렌 파우치(약 10 ㎝ × 7 ㎝ × 0.15 ㎜ 벽 두께)에 옮기고, 물(0.3 ㎖) 중 과황산나트륨(0.0512 g)의 용액을 TMEDA(0.05 ㎖)와 함께 첨가하였다. 파우치를 즉시 열-밀봉하고, 이어서 실온에서 밤새 회전진탕기(orbital shaker)에서 약하게 진탕하였다. 파우치를 절단하여 개봉하고, 중합체 덩어리를 여과깔때기로 옮기고, 여기서 이것을 물에 이어 아세톤으로 잘 세척하고, 진공 중에서 밤새 건조시켰다. 건조된 샘플을 사발에서 막자로써 가볍게 분쇄하였다. 입자크기는 매우 넓은 분포를 나타내었고, 입자크기는 1 마이크로미터 내지 700 마이크로미터의 범위였다.
실시예 1에 기술된 카트리지 시스템에서 평가시, 분쇄된 모노리쓰는 리소짐과 매우 신속히 결합하여, 15분 이내에 46 ㎎/㎖ 초과의 용량을 달성하였다. 비교실시예 2의 것과 비해 이러한 물질의 신속한 흡수 역학 및 증가된 용량은 모노리쓰형 매체의 개선된 물질 수송 및 다공성에 의해 설명될 수 있다.
실시예 3
중합 시간이 2시간 30분이 아닌 5시간이라는 것만 제외하고는 실시예 1에 기술된 것과 동일한 방법으로, 중량비가 65:35인 AMPS/MBA 공중합체를 제조하였다. 이러한 샘플을, 수력분급(elutriation)에 의해, 소형, 중형 및 대형의 세 가지 크기로 분급하였다. 중형 분획을 폐기하고, 소형 및 대형 분획의 평균입자크기를 측정하였더니, 각각 37.6 마이크로미터(소형 비드) 및 160.0 마이크로미터(대형 비드)였다. 이어서 이러한 두 가지 샘플을 실시예 1에서 기술된 카트리지 시스템에서 평가하였다. 리소짐 포착에 대한 결과가 표 2에 열거되어 있다.
시간(분) 소형 비드(㎎/㎖) 대형 비드(㎎/㎖)
0 0 0
2 109 87
4 131 111
6 145 118
8 153 125
10 158 132
15 168 139
20 176 153
25 178 159
30 180 168
40 186 172
50 188 186
60 189 192
70 NM 196
80 NM 204
90 NM 210
NM = 측정되지 않음
실시예 4
CM-세파덱스 C50은 소규모 단백질 정제에 유용한 이온교환수지이다. 제조사는 45 ㎝/hr의 최대 유속을 권장하는데, 이것은 이러한 수지가 대규모 칼럼 용도에 사용되기에는 너무 연질이라는 것을 보여준다. 샘플을 40℃에서 10 mM 인산나트륨 완충제와 밤새 혼합함으로써 샘플을 완충제에 수화시켰다. 침강된 수지 10 ㎖를 실시예 1에 기술된 분리 시스템에 적재하고, 토끼 IgG의 용액(10 mM 인산염 중 0.17 ㎎/㎖, pH 7.2)을 1134 ㎖/min의 유속에서 적재된 여과기 캡슐을 통해 재순환시킴으로써 IgG 흡착에 대해 평가하였다. 시간 경과에 따라 채취된 샘플을 UV 분석하였더니, 6분 이내에 3.9 ㎎/㎖의 수지가 흡착되었고, 25분 이내에 4.5 ㎎/㎖의 평형 흡착이 이루어지는 등 신속한 IgG 흡착이 관찰되었다. 제조사에 따르면, 유효 용량(포화 용량)은 7 ㎎/㎖라고 한다. 실험 동안에 유속의 변화 또는 압력의 증가는 관찰되지 않았다.
실시예 5
중량비가 95:5인 MBA/VDM 공중합체 비드를 제조실시예 1에 기술된 일반적 절차에 따라 제조하였다. 유기상은 헵탄(348 ㎖), 안정화제(0.13 g) 및 VDM(0.72 g)으로 이루어졌다. 수성상은 이소프로판올(90 ㎖), 물(55 ㎖), MBA(13.33 g), 과황산나트륨(0.55 g) 및 TMEDA(0.55 ㎖)로 이루어졌다. 이러한 비드(5A)를, 문헌[P.R.Johnson 등, J. Chromatogr.A, 1994, 667, 1-9]에 기술된 바와 같이 탈이온수에서 수화된 부피 및 미오글로빈 결합용량에 대해 평가하였다. 그 결과가 표 3에 명시되어 있다. 이소프로판올의 부피를 125 ㎖로 증가시키고 물의 부피를 75 ㎖로 증가시킨다는 것만 제외하고는 동일한 성분 및 양을 사용하여 제 2 MBA/VDM 공중합체를 제조하였다. 이러한 비드(5B)를 수화 부피 및 미오글리빈 결합용량에 대해 평가하였다. 그 결과가 표 3에 열거되어 있다.
비드 수화 부피(㎖/g) 미오글로빈 결합(㎎/g)
5A 9.6 466
5B 12.4 533
실시예 6 내지 8
톨루엔(188 ㎖)을 유기상에 첨가하고 물의 총부피를 60 ㎖로 증가시킨다는 것만 제외하고는 실시예 5A에 기술된 바와 같은 공정에 따라, 중량비가 95:5인 MBA/VDM의 공중합체 비드를 제조하였다. 실시예 6의 경우, 사용된 중합체성 안정화제는 중량비가 92.5:7.5인 이소옥틸 아크릴레이트와 아크릴산의 공중합체(0.27 g)였고, 교반 속도를 600 rpm으로 증가시켰고; 실시예 7의 경우, 사용된 중합체성 안정화제는 중량비가 90:10인 이소옥틸 아크릴레이트와 아크릴산의 공중합체였고, 아크릴산을 중화시키기 위해 수산화나트륨(0.1 M 용액 3.7 ㎖)을 수성상에 첨가하였고; 실시예 8의 경우, 중합체성 안정화제는 중량비가 95:5인 이소옥틸 아크릴레이트와 아크릴산의 공중합체(1.06g)였고, 아크릴산을 중화시키기 위해 수산화나트륨(1 M 용액 0.74 ㎖)을 수성상에 첨가하였고, 도데실황산나트륨(10 중량％의 수용액 3 ㎖)을 수성상에 첨가하였고, 교반 속도를 750 rpm으로 증가시켰다. 건조 후, 비드를 건식 분급하여, 32 마이크로미터 체를 통과하는 분획을 수득하였다.
단백질 A를 미국특허 제 5,907,016 호의 교시에 따라 실시예 6 내지 8에서 제조된 비드와 결합시켰다. 단백질 A 결합 절차: 반응 전, 모든 용액을 25℃에서 수조에서 평형화시켰다. 둥근바닥 플라스크에서 탈이온수 40 ㎖에 재조합 단백질 A(미국 매사추세츠주 왈탐 소재의 레플리겐 코포레이션(Repligen Corp.)) 797.2 ㎎을 용해시킴으로써 용액을 제조하였다. 이 용액에 완충제 A 112 ㎖를 첨가하였다. 오버헤드 교반기를 사용하여 혼합물을 교반하고, 건조한 비드 11.44 g을 첨가하였다. 교반을 15분 동안 계속한 후, 완충제 B 304 ㎖를 첨가하고, 교반을 1시간 동안 계속하였다. 소결된 유리 깔때기를 사용하여 비드를 여과하였다. 비드를 반응 플라스크로 복귀시키고, pH 9.5의 3.0 M 에탄올아민 560 ㎖를 첨가하고, 이 혼합물을 1시간 동안 교반시켰다. 이어서 비드를 여과하고, pH 7.5의 인산염-완충된 식염수(PBS) 265 ㎖로써 3번 세척하고, pH 10.5의 0.1 M 탄산나트륨 완충제 265 ㎖로써 6번 세척하고, PBS 200 ㎖로써 2번 세척하고, 2％ 아세트산 중 2 M 구아니딘 160 ㎖로써 3번 세척하고, PBS 200 ㎖로써 3번 세척하고, 탈이온수 265 ㎖로써 6번 세척하고, 사용 전까지 20％ 에탄올/탈이온수 160 ㎖에서 저장하였다.
추가로 분급한 후, 표 4에 명시된 크기를 갖는, 수화 비드 부피 1 ㎖ 당 약 6.5 내지 7.5 ㎎의 결합된 단백질 A를 함유하는 비드 샘플을 수득하였다. 단백질 A-적재된 비드를 전술된 방법을 사용하여 인간 IgG 포착에 대해 시험하였고, 그 결과를 표 5(실시예 6), 표 6(실시예 7) 및 표 7(실시예 8)에 나타내었다. 총 포착속도(또는 포착률)는 실시예 6의 경우 40 g/ℓ/hr, 실시예 7의 경우 72 g/ℓ/hr, 실시예 8의 경우 125 g/ℓ/hr였다. 비교하자면, 이러한 시스템 내 직경 60 마이크로미터의 단백질 A 입자를 사용하면, 표준 대규모 크로마토그래피 칼럼에서 달성되는 포착속도와 매우 유사한, 약 20 g/ℓ/hr의 포착속도를 달성한다.
실시예 평균 직경(마이크로미터) 변동계수(％)
6 36.9 41.7
7 18.1 38.5
8 10.3 27.9
실시예 6
사이클 시간(분) 포착된 IgG(㎎/㎖) 포착률(％)
사이클-1 10 23.8 28.0％
사이클-2 30 47.7 56.2％
사이클-3 60 66.9 78.8％
사이클-4 90 77 90.6％
사이클-5 120 79.1 93.1％
실시예 7
사이클 시간(분) 포착된 IgG(㎎/㎖) 포착률(％)
사이클-1 10 27.0 31.2％
사이클-2 22 50.6 58.6％
사이클-3 38 69.9 81.0％
사이클-4 54 81.6 94.4％
사이클-5 72 86.0 99.5％
실시예 8
사이클 시간(분) 포착된 IgG(㎎/㎖) 포착률(％)
사이클-1 5 29.5 34.2％
사이클-2 11 51.6 59.9％
사이클-3 21 71.1 82.5％
사이클-4 31 81.5 94.6％
사이클-5 41 85.4 99.1％
실시예 9
단량체 혼합물을 질소-퍼징된 밀봉 유리 바이알에서 중합시킴으로써, 실시예 2의 모노리쓰의 조성과 동일한 조성을 갖는 모노리쓰를 제조하였다. 바이알을 33 ℃에서 밤새 수조에 넣어 두었다. 바이알을 부수고, 모노리쓰 플러그를 물 및 아세톤으로써 세척하고, 사발에서 막자로써 가볍게 분쇄하고, 이어서 진공 중에서 건조시켰다. 이러한 파쇄된 입자의 탈이온수 중 슬러리를 제조하고, 바이오-라드 폴리-프레프 칼럼에 베드 깊이가 1 ㎖가 되도록 충전시켰다. 리소짐 절차를 IgG에 맞게 수정함으로써, IgG에 대한 평형 양이온교환용량을 측정하였고, 이것은 35 ㎎/㎖인 것으로 밝혀졌다.
이러한 파쇄된 입자의 슬러리를, 0.25 마이크로미터 프릿을 갖는 0.35 ㎖의 3 × 50 ㎜의 옴니피트(Omnifit) 칼럼에 충전시키고, 인간 IgG에 대한 동적결합용량을 AKTA 익스플로러(AKTA Explorer) 크로마토그래피 시스템(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))을 사용하여 측정하였다. IgG 적재용 완충제는 pH 4.5의, 50 mM 아세트산나트륨 및 80 mM 염화나트륨 중 IgG 3.5 ㎎/㎖였다. 10％ 돌파점(breakthrough)에서의 동적적재용량을 300 ㎝/hr 및 500 ㎝/hr에서 측정하였고, 이것들은 각각 20.8 ㎎/㎖ 및 15.3 ㎎/㎖인 것으로 밝혀졌다.
실시예 10
이소프로판올 1.5 ㎖ 대신에 PEG 400 1.5 ㎖를 사용한다는 것만 제외하고는, 실시예 9의 모노리쓰의 조성과 동일한 조성을 갖는 모노리쓰를 제조하였다. 그 절차 및 후처리 방법은 실시예 9의 것과 동일하였다. IgG에 대한 평형 양이온교환용량을 실시예 9에 기술된 바와 같이 측정하였고, 이것은 23 ㎎/㎖인 것으로 밝혀졌다.
실시예 11
이소프로판올 1.68 ㎖ 대신에 기공형성물질로서 1-옥탄올 1.68 ㎖를 사용한다는 것만 제외하고는, 실시예 9의 모노리쓰의 조성과 동일한 조성을 갖는 모노리쓰를 제조하였다. 그 절차 및 후처리 방법은 실시예 9의 것과 동일하였다. IgG에 대한 평형 양이온교환용량을 실시예 9에 기술된 바와 같이 측정하였고, 이것은 30 ㎎/㎖인 것으로 밝혀졌다.
실시예 12
단량체 혼합물 1 ㎖를 질소-퍼징된 바이오-라드 폴리-프레프 칼럼에서 실온에서 밤새 중합시킴으로써, 실시예 10의 모노리쓰의 조성과 동일한 조성을 갖는 모노리쓰를 제조하였다. 탈이온수(10 ㎖)를 모노리쓰 플러그의 최상부에 첨가하였지만, 칼럼을 통한 어떠한 유동도 일어나지 않았다. 약간의 질소 압력을 칼럼의 최상부에 가하였지만, 여전히 어떠한 유동도 일어나지 않았다. 프릿을 함유하는 칼럼의 저부를 절단하였지만, 여전히 어떠한 유동도 일어나지 않았다. 마지막으로, 모노리쓰를 실시예 9에 기술된 바와 같이 파쇄하고, 세척하고, 건조시켰다. IgG에 대한 평형 양이온교환용량을 실시예 9에 기술된 바와 같이 측정하였고, 이것은 31 ㎎/㎖인 것으로 밝혀졌다.
실시예 13 내지 15
5 중량％의 AMPS 단량체 대신에 동일한 중량의 n-부틸아크릴레이트를 사용하고(실시예 13), 10 중량％의 AMPS 단량체 대신에 동일한 중량의 n-부틸아크릴레이트를 사용하고(실시예 14), 15 중량％의 AMPS 단량체 대신에 동일한 중량의 n-부틸아크릴레이트를 사용한다(실시예 15)는 것만 제외하고는, 실시예 10의 모노리쓰의 조성과 동일한 조성을 갖는 모노리쓰를 제조하였다. 그 절차 및 후처리 방법은 실시예 9의 것과 동일하였다. IgG에 대한 평형 양이온교환용량을 실시예 9에 기술된 바와 같이 측정하였고, 이것은 24 ㎎/㎖(실시예 13), 16 ㎎/㎖(실시예 14) 및 5 ㎎/㎖(실시예 15)인 것으로 밝혀졌다.

Claims (23)

  1. 하나 이상의 다공성 섬유상 여과층, 및 평균직경이 50 마이크로미터 미만인 입자, 연질 중합체성 입자 및 파쇄된 모노리쓰형(monolithic) 중합체 입자의 군에서 선택된, 표적 분자와 결합할 수 있는 하나 이상의 고정상 입자의 층을 포함하는 여과요소를 포함하는 복합 여과매체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 다공성 섬유상 여과층이, 평균 공칭 기공 크기가 1 내지 50 마이크로미터인 직조(woven) 또는 부직조(non-woven) 다공성 물질인 복합 여과매체.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 고정상 입자가 흡착, 이온교환, 소수성 결합 및 친화성 결합에 의해 결합할 수 있는 입자의 군에서 선택된 것인 복합 여과매체.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 이온교환 입자가 음이온교환수지 및 양이온교환수지로 이루어진 군에서 선택된 것인 복합 여과매체.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피 고정상 입자가 표적 분자 친화성을 갖는 리간드를 포함하는 아가로스, 셀룰로스, 덱스트란 및 비닐 중합체를 포함하는 복합 여과매체.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 고정상 입자가 평균입자직경이 50 마이크로미터 미만인 유기 또는 무기 입자인 복합 여과매체.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 고정상 입자의 평균입자크기가 30 마이크로미터 미만인 복합 여과매체.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 입자의 크기의 변동계수가 30％를 초과하는 복합 여과매체.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 여과요소가 상류 표면 및 하류 표면을 포함하고, 상기 입자층이 상기 상류 표면 상에 배치된 복합 여과매체.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 여과요소의 상기 여과매체가 표면 여과매체인 복합 여과매체.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 여과요소의 상기 여과매체가 심층 여과매체인 복합 여과매체.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 파쇄된 모노리쓰형 입자의 크기분포가 0.1 내지 1000 마이크로미터인 복합 여과매체.
  13. 제 1 항에 있어서, 50 psi의 압력이 가해질 때 상기 연질 입자의 종횡비가 10％ 이상 변화하는 복합 여과매체.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 연질 입자의 평균 직경이 50 마이크로미터 미만인 복합 여과매체.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 연질 입자의 평균 직경이 30 마이크로미터 미만인 복합 여과매체.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 복합 여과매체를 포함하는 여과요소를 포함하는 여과기 카트리지.
  17. 제 16 항의 여과기 카트리지, 용질로서 하나 이상의 표적 생체거대분자를 포함하는 용액 혼합물을 함유하는 저장기, 및 상기 하나 이상의 생체거대분자가 고정상 입자에 결합하여 표적 분자:고정상 입자 생성물을 형성하도록 용액 혼합물을 여과기 카트리지를 통해 펌핑시키기 위한 펌프 및 이것과 연결된 튜브를 포함하는, 생체거대분자의 대규모 분리를 위한 분리 시스템.
  18. 제 17 항에 있어서, 24 시간 이내에 100 g 이상의 표적 생체거대분자를 정제할 수 있는 분리 시스템.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 여과기 카트리지가 전량여과식 여과기 카트리지(dead end filter catridge)인 분리 시스템.
  20. 제 17 항에 있어서, 상기 펌프 및 이것과 연결된 튜브가 폐쇄 루프 조립체를 형성하고, 상기 폐쇄 루프 조립체가 용액 혼합물의 재순환 펌핑을 제공하는 분리 시스템.
  21. 제 20 항에 있어서, 표적 분자가 유리되도록 생체거대분자:고정상 입자 생성물 결합 상호작용을 역전시킬 수 있는 용출 용액을 폐쇄 루프 조립체를 통해 펌핑시키는 수단을 추가로 포함하는 분리 시스템.
  22. (a) 표적 분자와 결합할 수 있는 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 복합 여과매체를 포함하는 여과기 카트리지, 하나 이상의 표적 분자를 용질로서 포함하는 용액 혼합물을 함유하는 저장기, 및 펌프 및 이것과 연결된 튜브를 함유하는 분리 시스템을 제공하는 단계; (b) 상기 하나 이상의 생체거대분자가 고정상 입자에 결합하여 표적 분자:고정상 입자 생성물을 형성하도록, 용액 혼합물을 여과기 카트리지를 통해 50 psi 이하의 압력에서 펌핑시키는 단계를 포함하는, 용액 혼합 물로부터 표적 분자를 분리하는 방법.
  23. 제 18 항에 있어서, 상기 표적 분자가 단백질, 탄수화물, 지질 및 핵산으로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
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