KR20070053815A - 백신 및 유전자요법 조성물 및 이들의 제조 및 사용방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개체에서 면역원에 대한 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 주조직적합성 복합체 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 핵산분자를 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 면역원 및 주조직적합성 복합체 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열은 개체에 의해서 흡수되었을 때 발현되어, 면역원에 대한 면역반응이 개체에서 유도된다. 본 발명은 또한, 세포, 조직 또는 기관이식을 수행하는 개체에서 비매칭된 공여체 세포, 조직 또는 기관의 거부반응을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열, 및 공여체 세포, 조직 또는 기관에 매칭된 주조직적합성 복합체 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 핵산분자를 개체의 신체상의 부위에 투여하는 단계를 포함한다. 주조직적합성 복합체 항원 및 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열들은 개체에서 흡수되었을 때 발현된다. 사멸시그날 또는 독소와의 상호작용으로 인한 T 세포 사멸은 비매칭된 공여체 세포, 조직 또는 기관의 거부반응의 감소를 유도한다. 본 발명은 또한 개체에서 우성면역반응을 감소시키는 방법 및 특이면역반응과 관련된 T 세포의 부차집단을 증량시키는 방법에 관한 것이다. 상기의 방법을 수행하는데 유용한 플라스미드 및 플라스미드를 포함하는 조성물도 본 발명에 기술되어 있다.

면역원, 면역반응, 주조직적합성 복합체 항원, 발현, 사멸시그날, 독소, 거부반응, 우성면역반응, T 세포

Description

백신 및 유전자요법 조성물 및 이들의 제조 및 사용방법 {Vaccines and Gene Therapy Compositions and Methods of Making and Using the Same}

도 1은 유동세포계산 (flow cytometry)에 의한 키메라 형성 (chimerization)의 측정에서 생성된 데이타를 나타낸 것이다. 키메라 마우스의 생성은 말초혈액 단핵세포 (PBMC) 상에서 이식후 3개월에 MHC 클래스 I 발현을 면역형광염색에 의해서 분석함으로써 입증되었다. β₂m^-/-→β₂m^+/+ 마우스의 PBMC는 MHC 클래스 I 분자의 유의적인 발현을 나타내지 못한 반면에, β₂m^+/+→β₂m^-/- 키메라 마우스의 PBMC는 MHC 클래스 I의 발현을 나타내었다.

도 2A 및 2B는 β₂m^+/+, β₂m^-/-, β₂m^+/+→β₂m^-/-, 및 β₂m^-/-→β₂m^+/+ 마우스에서 백시니아 바이러스 (Vaccinia virus; vMN462)-특이적 직접 (도 2A) 및 간접 (도 2B) CTL 반응을 나타낸 것이다. 직접 백시니아-특이적 CTL 반응은 주효세포의 시험관내 자극이 없이 백시니아 면역시킨지 7일 후에 분석하였다. 간접 백시니아-특이적 CTL 분석시험은 주효세포의 시험관내 자극이 있는 상태에서 백시니아 면역시킨지 4주 후에 수행하였다. 표적의 특이적 용해를 계산하기 위해서, 비-특이적 (비-감염된) 표적의 용해율을 특이적 (vMN462-감염된) 표적의 용해율로부터 공제하 였다. 이들 실험은 2회 반복하였으며, 동일한 결과를 얻었다.

도 3은 pCDNA3, pCEnv, pCEnv + pCD80, 또는 pCEnv + pCD86으로 면역시킨 β₂m^-/- 마우스, β₂m^+/+→β₂m^-/-, 및 β₂m^-/-→β₂m^+/+ 키메라에서 HIV-1 외피 (envelope)-특이적 CTL 반응을 나타낸 것이다 (그룹당 4마리의 마우스). HIV-1 Env-특이적 CTL 반응은 주효세포를 시험관내 자극시킨 후에 백시니아-감염된 표적에 대하여 분석하였다. 표적의 특이적 용해를 계산하기 위해서, 비-특이적 (WR 감염된) 표적의 용해율을 특이적 (vMN462-감염된) 표적의 용해율로부터 공제하였다. 비-특이적 용해의 최대레벨은 6.5%였다. 이들 실험은 2회 반복하였으며, 동일한 결과를 얻었다.

도 4는 pCDNA3, pCEnv, pCEnv + pCD80, 또는 pCEnv + pCD86으로 면역시킨 β₂m^-/-→β₂m^+/+ 키메라 마우스에서 직접 HIV-1 외피-특이적 CTL 반응을 입증하는 데이타를 나타낸 것이다. HIV-1 env-특이적 CTL 반응은 주효세포를 시험관내 자극시키지 않고 백시니아-감염된 표적에 대하여 분석하였다. 이들 실험에서 비-특이적 용해의 최대레벨은 5% 미만이었다.

도 5는 자극된 주효세포에 의한 사이토킨의 발현을 입증하는 데이타를 나타낸 것이다. CTL 분석시험을 위해서 자극된 주효세포로부터의 상등액을 6일째에 수집하고, IFN-γ 및 IL-4에 대한 ELISA 키트 (이들 키트는 둘다 Biosource International, Inc., Camarillo, CA로부터 공급)를 사용하여 사이토킨 프로필에 대해서 시험하였다. 이들 실험은 2회 반복하였으며, 동일한 결과를 얻었다.

도 6은 근육내에서 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포의 존재를 입증하는 데이타를 나타낸 것이다. pCEnv + pCD86으로 공동-면역시킨 후에 근육내의 침윤성 세포를 안티-CD4 또는 안티-CD8 항체로 더 면역시켰다. CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포를 염색된 슬라이드로부터 계수하였다.

본 발명은 개체에서 예방적 및(또는) 치료학적 면역반응을 유도하는 백신 및 유도 방법에 관한 것이다. 본 발명은 세포, 조직 및(또는) 기관 이식수술을 받는 환자를 치료하는 조성물 및 치료방법에 관한 것이다. 본 발명은 면역반응의 조절용 조성물 및 조절방법에 관한 것이다.

백신은 병원체 항원 또는 인간의 질병에 연관된 세포와 관련된 항원과 같은 표적항원에 대하여 개체를 면역시키는데 유용하다. 인간의 질병에 연관된 세포와 관련된 항원에는 암-관련 종양항원 및 자가면역질병에 연관된 세포와 관련된 항원이 포함된다.

이러한 백신을 디자인하는 경우에, 백신접종된 개체의 세포에서 표적항원을 생산하는 백신은 면역시스템의 세포성완 (cellular arm)을 유도하는데 효과적이라는 것을 인식하여야 한다. 특히, 생약독화 백신, 무독성 벡터를 사용하는 재조합 체 백신, 및 DNA 백신은 모두 면역시스템의 세포성완의 유도를 일으키는 백신접종된 개체의 세포에서 항원의 생산을 유도한다. 한편, 체액성 반응을 유도하는 단백질 및 사멸 또는 불활성화 백신 만을 함유하는 서브-유니트 백신은 우수한 세포성 면역반응을 유도하지 않는다.

세포성 면역반응은 종종 병원체 감염에 대한 방어작용을 제공하고, 병원체 감염, 암 또는 자가면역질병의 치료를 위한 효과적인 면역-매개된 치료법을 제공하는데 필요하다. 따라서, 백신접종된 개체의 세포에서 표적항원을 생산하는 것으로서 생약독화 백신, 무독성 벡터를 사용하는 재조합체 백신 및 DNA 백신과 같은 백신이 바람직하다.

몇가지 백신은 병원체 감염 또는 인간 질병에 대해서 개체를 예방적으로 또는 치료학적으로 면역시키는데 효과적인 것으로 보고되었지만, 개선된 백신이 아직도 필요하다. 증진된 면역반응을 생산하는 조성물 및 방법도 필요하다.

면역반응은 또한 이식환자에게서 나타나는 세포, 조직 및 기관의 거부반응 및 이식편대 숙주질환에서도 연관된다. 종종, 공여체 세포, 조직 및 기관은 수용체의 세포와는 다른 주조직접합성 컴플렉스 클래스 (major histocompatibility complex class) I (MHC I) 항원의 서브타입(들)을 갖는다. 수용체의 면역시스템은 MHC I 서브타입에 있어서의 차이점을 검출하고 공여체 세포, 조직 및 기관에 대하여 면역반응을 지시한다.

마찬가지로, 골수이식을 한 환자에게서도 MHC II 항원의 서브타입에 있어서의 차이점으로 인하여 MHC II 항원을 발현하는 공여체 세포의 거부반응이 일어날 수 있다.

이식거부반응의 중증도를 방지하거나 감소시킬 수 있는 조성물 및 방법이 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 개체에서 면역원에 대한 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 주조직적합성 복합체 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자를 개체의 신체상의 부위에서 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 핵산분자는 개체의 세포에 의해서 흡수된다. 여기에서 면역원 및 주조직적합성 복합체 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열이 발현되며, 면역원에 대한 면역반응이 개체에서 유도된다. 그 대신에 또는 동시에, 이 방법은 제 1 핵산분자 및 제 2 핵산분자를 개체의 신체상의 부위에서 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 제 1 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 2 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 주조직적합성 복합체 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 1 및 2 핵산분자들은 개체의 세포에 의해서 흡수되어 면역원 및 주조직적합성 복합체 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열들이 발현되며, 면역원에 대한 면역반응이 개체에서 유도된다. 몇가지 구체예에서, 핵산분 자 또는 분자들은 추가로 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다.

본 발명은 추가로, 조절요소에 작동가능하게 연결된 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열, 조절요소에 작동가능하게 연결된 주조직적합성 복합체 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열, 및 임의로, 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드, 및 이 플라스미드를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 조절요소에 작동가능하게 연결된 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 조절요소에 작동가능하게 연결된 주조직적합성 복합체 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드인 제 1 플라스미드, 및 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제 2 플라스미드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 조절요소에 작동가능하게 연결된 주조직적합성 복합체 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 제 1 플라스미드 및 제 2 플라스미드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 제 1 플라스미드는 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유하며, 제 2 플라스미드는 주조직적합성 복합체 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 이들 중의 어느 하나의 플라스미드는 임의로, B7.2를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 추가로 함유할 수 있다. 임의로, 조성물은 B7.2를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제 3 플라스미드를 함유할 수도 있다.

본 발명은 또한, 세포, 조직 또는 기관이식을 수행하는 개체에서 비매칭된 (unmatched) 공여체 세포, 조직 또는 기관의 거부반응을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 사멸시그날 (death signal) 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열, 및 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 주조직적합성 복합체 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자를 개체의 신체상의 부위에서 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 주조직적합성 복합체 항원은 공여체 세포, 조직 또는 기관에 매칭된다. 핵산분자는 개체의 세포에 의해서 흡수되어, 여기에서 주조직적합성 복합체 항원 및 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열들이 발현된다. T 세포의 T 세포 수용체는 세포에 의해서 발현된 주조직적합성 복합체 항원을 포함하는 컴플렉스를 형성한다. T 세포는 컴플렉스 형성에 이어서 사멸시그날 또는 독소와 상호작용함으로써 사멸한다. 이렇게하여 개체에서 비매칭된 공여체 세포, 조직 또는 기관의 거부반응이 감소된다. 그 대신에 또는 동시에, 이 방법은 제 1 핵산분자 및 제 2 핵산분자를 개체의 신체상의 부위에 투여하는 단계를 포함한다. 제 1 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 2 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 주조직적합성 복합체 클래스 I 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 주조직적합성 복합체 항원은 공여체 세포, 조직 또는 기관에 매칭된다. 제 1 및 2 핵산 분자들은 개체의 세포에 의해서 흡수되어, 여기에서 주조직적합성 복합체 항원 및 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열들이 발현된다. T 세포의 T 세포 수용체는 세포에 의해서 발현된 주조직적합성 복합체 항원을 함유하는 컴플렉스를 형성한다. T 세포는 컴플렉스 형성에 이어서 사멸시그날 또는 독소와 상호작용함으로써 사멸하며, 개체에서 비매칭된 공여체 세포, 조직 또는 기관의 거부반응이 감소된다. 몇가지 구체예에서, 핵산분자 또는 분자들은 추가로 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다.

본 발명은 추가로, 조절요소에 작동가능하게 연결된 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열, 조절요소에 작동가능하게 연결된 주조직적합성 복합체 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열, 및 임의로, 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드, 및 이 플라스미드를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 제 1 플라스미드 및 제 2 플라스미드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 제 1 플라스미드는 조절요소에 작동가능하게 연결된 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열, 및 조절요소에 작동가능하게 연결된 주조직적합성 복합체 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 2 플라스미드는 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다.

본 발명은 또한 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드에 관한 것이다.

본 발명은 추가로, 제 1 플라스미드 및 제 2 플라스미드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 제 1 플라스미드는 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유하며, 제 2 플라스미드는 주조직적합성 복합체 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다.

본 발명은 추가로, 개체에게서 우성 (dominant) 면역반응을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 우성면역반응과 관련된 T 세포의 부차집단 (subpopulation)과의 컴플렉스를 형성하는 주조직적합성 복합체 항원 서브타입을 확인하는 단계를 포함한다. 개체의 신체 상의 부위에서, 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 주조직적합성 복합체 항원 서브타입을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자를 개체에게 투여한다. 핵산분자는 개체의 세포에 의해서 흡수되어, 여기에서 주조직적합성 복합체 항원 서브타입을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열이 발현된다. T 세포의 T 세포 수용체는 세포에 의해서 발현된 주조직적합성 복합체 항원 서브타입을 포함하는 컴플렉스를 형성한다. T 세포는 컴플렉스 형성에 이어서 사멸시그날 또는 독소와 상호작용함으로써 사멸하며, 개체에서 우성면역반응이 감소된다. 그 대신에 또는 동시에, 제 1 핵산분자 및 제 2 핵산분자를 개체의 신체상의 부위에 투여한다. 제 1 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 제 2 핵산분자는 개체에서 의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 주조직적합성 복합체 항원 서브타입을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 1 및 2 핵산분자들은 개체의 세포에 의해서 흡수되어, 여기에서 주조직적합성 복합체 항원 서브타입을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열이 발현된다. T 세포의 T 세포 수용체는 세포에 의해서 발현된 주조직적합성 복합체 항원 서브타입을 포함하는 컴플렉스를 형성하고, T 세포는 컴플렉스 형성에 이어서 사멸시그날 또는 독소와 상호작용함으로써 사멸하며, 개체에게서 우성면역반응이 감소된다.

본 발명은 추가로, 특이면역반응과 관련된 T 세포의 부차집단을 증량시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 특이면역반응과 관련된 T 세포의 부차집단과의 컴플렉스를 형성하는 주조직적합성 복합체 항원 서브타입을 확인하는 단계를 포함한다. 개체에게는 개체의 신체 상의 부위에서, 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열, 및 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 주조직적합성 복합체 항원서브타입을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자를 투여한다. 핵산분자는 개체의 세포에 의해서 흡수되어, 여기에서 주조직적합성 복합체 항원 서브타입을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 B7.2를 코드화한 뉴클레오타이드 서열이 발현된다. T 세포의 T 세포 수용체는 세포에 의해서 발현된 주조직적합성 복합체 항원 서브타입을 포함하는 컴플렉스를 형성하며, T 세포는 컴플렉스 형성에 이어서 B7.2와 상호작용함으로써 증식한다. 특이면역반응과 관련된 T 세포의 부차집단이 증량된다. 그 대신에 또는 동시에, 제 1 핵산분자 및 제 2 핵산분자를 개체의 신체상의 부위에 투여한다. 제 1 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유하며, 제 2 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 주조직적합성 복합체 항원 서브타입을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 핵산분자들은 개체의 세포에 의해서 흡수되어, 여기에서 주조직적합성 복합체 항원 서브타입을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열이 발현된다. T 세포의 T 세포 수용체는 세포에 의해서 발현된 주조직적합성 복합체 항원 서브타입을 포함하는 컴플렉스를 형성하고, T 세포는 컴플렉스 형성에 이어서 B7.2와 상호작용함으로써 증식하여 특이면역반응과 관련된 T 세포의 부차집단이 증량된다.

바람직한 구체예의 설명

본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "유전자 구조물 (genetic construct)"은 단백질을 코드화하며 개체의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 폴리아데닐화 시그날 및 프로모터를 포함하는 조절요소에 작동가능하게 연결된 개시 및 종결 시그날을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "발현가능형 (expressible form)"은 단백질을 코드화한 코드화 서열에 작동가능하게 연결된 필요한 조절요소를 함유하여 개체의 세포내에 존재하는 경우에 코드화 서열이 발현될 수 있도록 한 유전자 구조 물을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "방어적 면역반응" 및 "예방적 면역반응"은 상호교환하여 사용되며, 미감염된 개체에서의 병원체 항원과 같이 개체가 아직 노출되지 않은 면역원, 또는 종양에 걸리지 않은 환자에게서의 종양 관련된 단백질과 같이 질병에 걸리지 않은 개체에게서 질병세포 관련된 단백질을 표적으로 하는 면역반응을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "치료학적 면역반응"은 감염된 개체에서의 병원체 항원과 같이 개체가 노출된 면역원, 또는 종양에 걸린 환자에게서의 종양 관련된 단백질과 같이 질병에 걸린 개체에게서 질병세포 관련된 단백질을 표적으로 하는 면역반응을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "예방적 유효량"은 감염인자의 경우에는 개체가 감염을 일으키는 것을 방지하는데 필요하고, 세포특이적 질병의 경우에는 개체가 세포특이적 질병에 걸리는 것을 방지하는데 필요한 양을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "치료학적 유효량"은 감염인자의 경우에는 증상을 감소시키거나 감염을 제거하기 위해서 감염된 개체에서 감염의 레벨을 저하시키는데 필요하고, 세포특이적 질병의 경우에는 증상을 감소시키고 개체를 치유시키기 위해서 세포특이적 질병이 있는 개체에서 세포특이적 질병세포의 수를 감소시키는데 필요한 양을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "세포특이적 질병"은 자가면역질병, 및 암과 같은 과증식성 세포를 특징적으로 나타내는 질병을 칭하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "면역원", "항원", "표적항원" 및 "표적단백질"은 상호교환하여 사용되며, 표적으로서 작용하여 그에 대해 면역반응이 유도되도록 하는 본 발명의 유전자 구조물에 의해 코드화된 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 포함하는 의미를 갖는다.

본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "면역원에 대한 면역반응을 유도하는"은 순수한 개체에서 면역반응의 유도 및 면역원에 대해 미리 노출된 개체에서의 면역반응의 유도 (여기에서는 면역원에 대한 면역반응이 증진된다)를 의미한다. 따라서, 예를들어 병원체 감염에 걸려 있는 개체는 병원체 항원에 대한 면역반응을 유도하는 본 발명의 방법에 의해서 치료할 수 있다. 치료학적 면역반응은 병원체에 대해 지시될 수 있는 감염된 개체에서 유도된다.

본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "발현에 필요한 조절요소"는 유전자 구조물의 코드화 서열이 발현가능형이 되도록하는데 필요한 조절요소를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "주조직적합성 복합체 항원 서브타입"은 MHC 클래스 I 항원 대립유전자 또는 MHC 클래스 II 항원 대립유전자의 단백질 생성물을 칭하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 것으로, 매치시키는 주조직적합성 항원 서브타입에 관하여 언급하는 경우에 용어 "매치 (match, matches)" 및 "매칭 (matching)"은 동일한 그룹 및 서브타입의 주조직적합성 복합체 항원을 칭하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 것으로, 공여체 세포, 조직 또는 기관의 주조직적합성 항원 서브타입을 언급하는 경우에 용어 "비매칭된"은 상이한 그룹 및 서브타입의 주조직적합성 복합체 항원을 칭하는 것을 의미한다. 비매칭된 공여체 세포, 조직 또는 기관은 수용체 개체와는 다른 주조직적합성 항원 서브타입을 발현한다. 비매칭된 공여체는 또한 동종이계 공여체라고도 불리운다.

본 명세서에서 사용된 것으로, "사멸시그날 또는 독소와의 T 세포 상호작용"은 개체의 세포에 의해서 발현된 사멸시그날 또는 독소와 T 세포와의 상호작용을 의미하며, 이렇게하여 T 세포의 사멸이 야기된다. 예를들어, fas/fas 수용체가 사용된 사멸시그날 시스템인 경우에 T 세포상에서 fas 사멸시그날 (fas-리간드-fas-1)과 fas 수용체와의 상호작용으로 T 세포의 사멸이 야기된다.

본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "우성면역반응"은 항원에 대해 다른 항원에서 지시된 면역반응보다 큰 세포성 및 체액성 성분을 포함한 면역반응을 칭하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "T 세포의 부차집단을 증량시키는"은 특이적 T 세포 클론의 증식을 칭하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "특이면역반응"은 특이적 에피토프 (epitope)에 대해 지시된 세포성 또는 체액성 면역반응을 칭하는 것을 의미한다. 특이면역반응은 T 세포의 MHC, 항원 및 T 세포수용체 (TCR) 중에서 컴플렉스의 형성을 통해서 T 세포에 대해 MHC에 의한 에피토프를 제시한 후에 항원의 특이적 에피토프에 대해서 유도된다. 컴플렉스 형성에 연관된 특이적 T 세포는 MHC/항원 컴플렉스와 특이적으로 상호작용하는 TCR을 발현시킨다.

주조직적합성 복합체 (MHC) 항원은 실제로 면역글로부린 슈퍼패밀리 (superfamily)의 구성원인 단백질 헤테로다이머 (heterodimer)의 패밀리이다. 이들 항원은 면역시스템에서 주로 항원제시제 (antigen presenter)로서 사용되는 세포성 단백질이다. MHC는 항원과의 컴플렉스를 형성하며, MHC/항원 컴플렉스는 MHC/항원 컴플렉스 (여기에서 항원은 특이적 에피토프를 갖는다)에 대해서 특이적인 T 세포 수용체에 대해 제시된다. 즉, T 세포 수용체는 특이적 에피토프를 인식할 뿐 아니라 특이적 MHC 내에 제시된 특이적 에피토프 만을 인식한다. MHC/항원 캄플렉스와 T 세포 수용체 사이의 상호작용은 항원에 대한 면역반응의 유도, 유지 및 기억에 필수적이다. MHC 항원은 그들의 구조 및 기능과 아울러 문헌 (Stites, D.P. et al., Basic and Clinical Immunology, Sixth Edition, 1987, Appleton and Lange, Norwalk, CT, 및 Roitt, I.M., et al., Immunology, 1985, C.V. Moseby Co. St. Louis MO, Toronto, Gower Medical Publishing, London UK, New York, NY; 이들은 모두 본 명세서에서 참고로 포함되어 있다)에 기술되어 있다.

MHC 단백질은 일반적으로 두개의 광범한 그룹, 즉 주조직적합성 복합체 클래스 I (MHC I) 항원 및 주조직적합성 복합체 클래스 II (MHC II) 항원으로 나뉜다. 두개의 클래스는 면역시스템 내에서 상이한 항원제시기능 (antigen presenting function)을 갖는다. 그러나, 이 두가지는 모두 고도로 다형성성인 유전자에 의해서 코드화되어 면역시스템에 의해서 검출하고자 하는 항원의 다양한 에피토프에 결합할 수 있는 여러가지 상이한 MHC 서브타입을 제공하는 다양한 대립유전자를 제공한다. MHC I 항원 및 MHC II 항원은 상이한 T 세포에 대한 항원을 나타낸다: MHC I 항원은 세포독성 T 세포에 대한 항원을 나타내며 MHC II 항원은 헬퍼 (helper) T 세포 및 억제제 T 세포에 대한 항원을 나타낸다. MHC 항원은 또한 인간백혈구항원 (human leukocyte antigens: HLA)으로도 불리운다. 클래스 I 및 II의 각각에는 다양한 대립유전자에 의해서 코드화된 몇가지 서브타입을 각각 포함하는 몇가지 서브그룹이 있다.

MHC I 항원은 HLA 서브그룹 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 항원을 말한다. 이들 세가지 서브그룹은 실질적으로 모든 인간세포에서 발견된다. 클래스 I 항원의 구조는 분자량이 44,000으로 다형성성 당단백을 포함하는 2-쇄 단백질 컴플렉스로 구성된다. 여기에는 HLA-A좌에 대한 적어도 23개의 별개의 대립유전자 (따라서, HLA-A의 적어도 23개의 서브타입), HLA-B좌에 대한 적어도 47개의 별개의 대립유전자 (HLA-B의 적어도 47개의 서브타입을 코드화), 및 HLA-C좌에 대한 적어도 8개의 별개의 대립유전자 (HLA-C의 적어도 8개의 서브타입을 코드화)가 있다. 개개 인간은 다양한 대립유전자의 상이한 그룹들을 발현한다. 즉, 개체들은 상이한 서브타입의 셋트를 발현한다. 따라서, 개개 인간은 서브타입 HLA-A, -B 및 -C의 어떠한 조합이 그들의 세포 상에 존재하는지를 측정하기 위해서 형을 검출할 수 있다. 클래스 I 항원의 HLA 형별 (typing)은 림프구 미소세포독성 분석시험으로 불리우는 방법이다. 간략하면, HLA-A, -B 및 -C 항원에 대한 다중 항혈청을 형별 트레이 (typing tray)의 마이크로웰에 배치시킨다. 각각의 마이크로웰에 1000 내지 2000개의 말초혈액 림프구를 가한다. 배양한 후에, 보체를 가하고 배양을 계속한다. 그후, 에오신과 같은 생체염색색소 (vital dye)를 가한다. 용해된 세포는 색소를 흡수하는 반면에 배제된 생세포는 염색되지 않고 유지된다는 사실을 근거로해서, 상 현미경 검사를 사용하여 사멸세포로부터 생세포를 구분해낸다. 그후, 반응패턴을 기초로하여 소정의 개체의 HLA-A, -B 및 -C 표현형을 지정한다.

MHC 클래스 II 항원은 HLA 서브타입 HLA-D, HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP를 말한다. 클래스 II 항원은 주로 마크로파지 세포, 단핵세포, T 림프구 및 B 림프구와 같은 면역적격성 세포의 표면에서 발견된다. DP 항원은 이들이 강력한 이차 증식성 반응을 야기시키고 CTLs에 대한 표적항원으로서 작용한다는 점에서 다른 클래스 II 항원으로부터 구별된다. 여기에는 적어도 19개의 HLA-D 대립유전자 (HLA-D의 적어도 19개의 서브타입을 코드화), 적어도 16개의 HLA-DR 대립유전자 (HLA-DR의 적어도 16개의 서브타입을 코드화), 적어도 3개의 HLA-DQ 대립유전자 (HLA-DQ의 적어도 3개의 서브타입을 코드화) 및 적어도 6개의 HLA-DP 대립유전자 (HLA-DP의 적어도 6개의 서브타입을 코드화)가 있다. HLA-DR 및 -DQ는 말초혈액 림프구 대신에 B 림프구의 정제된 집단을 사용하는 것을 제외하고는 HLA 클래스 I 항원의 형을 검출하는 방식과 유사한 방식으로 형을 검출할 수 있다. HLA-D 항원은 혼합된 림프구 반응을 이용하여 형을 검출할 수 있다. HLA-DP 항원은 일차 림프구 형별방법을 사용하여 형이 검출된다.

B7.2는 문헌 (Azuma, M. et al., 1993 Nature 366:76-79; 이것은 본 명세서에 참고로 포함되어 있다)에 최초로 기술되었다. 이 문헌의 도 2B는 B7.2 단백질의 뉴클레오타이드 및 예상되는 아미노산 서열을 개시하였다. 서열 정보는 또한 본 명세서에 참고로 포함된 진뱅크 (Genbank) 데이타베이스에서 U04343으로 이용할 수도 있다.

사멸영역 수용체에는 다음과 같은 것이 포함되나 이들로 제한되는 것은 아니며, 이들에 대한 문헌 및 진뱅크 서열은 본 명세서에 참고로 포함된다: Apo-1 (Oehm et al., J. Biol. Chem., 1992, 267(15), 10709-15; 수탁번호 X63717); Fas (Itoh et al., Cell, 1991, 66(2), 233-43; 수탁번호 M67454); TNFR-1 (Nophar et al., EMBO J., 1990, 9(10), 3269-78; 수탁번호 M67454); p55 (Loetscher et al., Cell, 1990, 61, 351-359; 수탁번호 M58286, M33480); WSL-1 (Kitson et al., Nature, 1996, 384(6607), 372-5; 수탁번호 Y09392); DR3 (Chinnaiyan et al., Science, 1996, 274(5829), 990-2; 수탁번호 U72763); TRAMP (Bodmer et al., Immunity, 1997, 6(1), 79-88; 수탁번호 U75381); Apo-3 (Marsters et al., Curr. Biol., 1996, 6(12), 1669-76; 수탁번호 U74611); AIR (Degli-Esposti et al., 직접기탁, 수탁번호 U78029); LARD (Screaton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94(9), 4615-19; 수탁번호 U94512); NGRF (Johnson et al., Cell, 1986, 47(4), 545-554; 수탁번호 M14764); DR4 (Pan et al., Science, 1997, 276(5309), 111-113; 수탁번호 U90875); DR5 (Sheridan et al., Science, 1997, 277(5327), 818-821; 수탁번호 AF012535); KILLER (Wu et al., Nature Genetics, 인쇄중); TRAIL-R2 (MacFarlane et al., J. Biol. Chem., 1997, 인쇄중; 수탁번호 AF020501); TRICK2 (Screaton et al., Curr. Biol., 1997, 인쇄중; 수탁번호 AF018657); DR6 (Pan et al., 미공개; 수탁번호 AF068868).

사멸시그날, 즉 사멸영역 수용체와 상호작용하는 단백질에는 다음과 같은 것이 포함되나 이들로 제한되는 것은 아니며, 이들에 대한 문헌 및 진뱅크 서열은 본 명세서에 참고로 포함된다: FADD (Chinnaiyan et al., Cell, 1995, 81(4), 505-12; 수탁번호 U24231); FAP-1 (Sato et al., Science, 1995, 268(5209), 411-15; 수탁번호 L34583); TRADD (Hsu et al., Cell, 1995, 81(4), 495-504: 수탁번호 L41690); RIP (Stanger et al., Cell, 1995, 81(4), 513-23; 수탁번호 U25994); 및 FLICE (Muzio et al., Cell, 1996, 85(6), 817-27; 수탁번호 U58143); RAIDD (Lennon et al., Genomics, 1996, 33(1), 151-2; 수탁번호 U79115). 사멸시그날은 또한 FAS-L (Alderson et al., J. Exp. Med., 1995, 181(1), 71-7; 수탁번호 U08137) 및 TNF과 같이 사멸영역 수용체에 결합하며 세포소멸을 개시시키는 리간드 (단, 이들로 제한되는 것은 아니며, 이들에 대한 문헌 및 진뱅크 서열은 본 명세서에 참고로 포함되어 있다), 및 FADD (Chinnaiyan et al., Cell, 1995, 81(4), 505-12; 수탁번호 U24231), MORT1 (Boldin et al., J. Biol. Chem., 1995, 270(14), 7795-8; 수탁번호 X84709), CRADD (Ahmad et al., Cancer Res., 1997, 57(4), 615-9; 수탁번호 U84388) 및 MyD88 (Bonnert et al., FEBS Lett., 1997, 402(1), 81-4; 수탁번호 U84408)과 같이 사멸영역 수용체와 상호작용하는 매개체 (mediator) (단, 이들로 제한되는 것은 아니며, 이들에 대한 문헌 및 진뱅크 서열은 본 명세서에 참고로 포함되어 있다)를 포함한다.

독소는 세포를 사멸시키는 단백질을 포함한다. 독소에는 곤충독 및 사독, 슈도모나스 내독소와 같은 세균 내독소, 단일쇄 독소를 포함하는 리신과 같은 이중쇄 리보좀 불활성화 단백질, 및 젤로닌이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다.

백신에 의해 코드화된 면역원에 대한 면역반응은 면역원 이외에도 백신이 추 가로 MHC 항원을 코드화한 뉴클레오타이드의 발현가능형을 갖추고 있는 경우에 증진된다는 것이 발견되었다. 이렇게 발현된 MHC 항원은 T 세포에 대한 면역원을 나타낼 수 있으며, 증진된 면역반응을 야기시킨다. 본 발명은 개체에서 면역원에 대한 면역반응을 유도하거나, 그렇지 않으면 증진시키는 방법을 제공한다. 몇가지 구체예에서, 이 방법은 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 MHC 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 둘다를 함유하는 핵산분자를 개체의 신체상의 부위에 투여하는 단계를 포함한다. 핵산분자는 개체의 세포에 의해서 흡수되어, 여기에서 면역원 및 MHC 각각을 코드화한 뉴클레오타이드 서열들이 발현된다. 생산된 MHC는 개체의 면역시스템의 T 세포에 대한 면역원의 에피토프를 나타내며, 면역원에 대한 증진된 면역반응이 개체에서 유도된다. 몇가지 구체예에서, 방법은 적어도 2개의 상이한 핵산분자를 개체의 신체상의 부위에서 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 제 1 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 2 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 MHC 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 1 및 2 핵산분자들은 둘다 개체의 세포에 의해서 흡수되어, 여기에서 면역원 및 MHC 항원 각각을 코드화한 뉴클레오타이드 서열들이 발현된다. 생산된 MHC는 개체의 면역시스템의 T 세포에 대한 면역원의 에피토프를 나타내며, 면역원에 대한 증진된 면역반응이 개체에서 유도된다.

일부의 구체예에서는, MHC I 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열이 개체에게 투여되는 핵산분자 내에 포함된다. 일부의 구체예에서, MHC I 항원은 개체에 의해서 발현된 MHC I 항원 대립유전자에 매칭한다. 상기 언급한 바와 같이, MHC 표현형에 대하여 개체를 형별하는 것은 통상적으로 수행할 수 있다. 개체에 의해서 발현된 MHC I 대립유전자의 주체성 (identity)이 확인되면, 개체에 의해서 발현된 서브타입을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 구조물은 개체에게 매칭된 MHC I가 투여되는 것을 보장하도록 제조되거나, 제조된 유전자 구조물로부터 선택될 수 있다.

일부의 구체예에서는 MHC II 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열이 개체에게 투여되는 핵산분자 내에 포함된다. 일부의 구체예에서, MHC II 항원은 개체에 의해서 발현된 MHC II 항원 대립유전자에 매칭한다. 상기 언급한 바와 같이, MHC 표현형에 대하여 개체를 형별하는 것은 통상적으로 수행할 수 있다. 개체에 의해서 발현된 MHC II 대립유전자의 주체성이 확인되면, 개체에 의해서 발현된 서브타입을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 구조물은 개체에게 매칭된 MHC II가 투여되는 것을 보장하도록 제조되거나, 제조된 유전자 구조물로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 한 관점은 MHC I 단백질 및 면역원을 코드화한 유전자 물질을 사용하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 관점은 MHC II 항원 및 면역원을 코드화한 유전자 물질을 사용하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 이 방법은 면역원적 표적에 대한 예방적 및 치료학적 면역반응을 유도하는 개선된 방법 에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 일부의 구체예는 발현에 필요한 조절서열에 작동가능하게 연결된 MHC I 항원 및(또는) MHC II 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 백신내에서의 발현에 필요한 조절서열에 작동가능하게 연결된 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 제공함으로써 개선된 백신을 제공한다. 조성물은 DNA 백신, 무독성 재조합체 벡터 백신, 및 생약독화 백신과 같은 백신일 수 있다.

또한, 백신에 의해 코드화된 면역원에 대한 면역반응은 면역원 이외에도 백신이 추가로 B7.2 단백질 및 MHC 항원 둘다를 코드화한 뉴클레오타이드 서열의 발현가능형을 갖추고 있는 경우에 증진된다는 것이 발견되었다. 이렇게하여 B7.2 단백질 및 MHC 항원이 표적항원을 발현하는 백신접종된 개체의 세포에서 공동-생산된다. 본 발명의 이러한 관점에 따라, 면역원, B7.2 단백질, MHC I 항원 및(또는) MHC II 항원 단백질을 코드화한 유전자 물질을 사용하는 조성물 및 방법이 제공된다. 이 방법은 면역원적 표적에 대한 예방적 및 치료학적 면역반응을 유도하는 개선된 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 일부의 구체예는 백신내에서의 발현에 필요한 조절서열에 작동가능하게 연결된 B7.2를 코드화한 뉴클레오타이드 서열, 발현에 필요한 조절서열에 작동가능하게 연결된 MHC I 항원 및(또는) MHC II 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열, 및 백신내에서의 발현에 필요한 조절서열에 작동가능하게 연결된 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 제공함으로써 개선된 백신을 제공한다. 조성물은 DNA 백신, 무독성 재조합체 벡터 백신, 및 생약독화 백신과 같은 백신일 수 있다.

본 발명의 몇가지 구체예에 따르면, 개체에게 투여된 유전자 물질은 면역원 을 코드화한 뉴클레오타이드 서열, MHC I 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열, 및 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자를 함유한다. 이러한 뉴클레오타이드 서열 각각은 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된다.

본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 개체에게 투여된 유전자 물질은 제 1 핵산분자 및 제 2 핵산분자를 함유한다. 제 1 핵산분자는 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 두가지 뉴클레오타이드 서열은 모두 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된다. 제 2 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 MHC I 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다.

본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 개체에게 투여된 유전자 물질은 제 1 핵산분자 및 제 2 핵산분자를 함유한다. 제 1 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 2 핵산분자는 MHC I 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 이들 두가지 뉴클레오타이드 서열은 모두 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된다.

본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 개체에게 투여된 유전자 물질은 제 1 핵산분자 및 제 2 핵산분자를 함유한다. 제 1 핵산분자는 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 MHC I 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 두가지 뉴클레오타이드 서열은 모두 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하 게 연결된다. 제 2 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다.

본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 개체에게 투여된 유전자 물질은 제 1 핵산분자, 제 2 핵산분자 및 제 3 핵산분자를 함유한다. 제 1 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 2 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 MHC I 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 3 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다.

본 발명의 몇가지 구체예에 따르면, 개체에게 투여된 유전자 물질은 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열, MHC II 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열, 및 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자를 함유한다. 이러한 뉴클레오타이드 서열 각각은 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된다.

본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 개체에게 투여된 유전자 물질은 제 1 핵산분자 및 제 2 핵산분자를 함유한다. 제 1 핵산분자는 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 두가지 뉴클레오타이드 서열은 모두 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된다. 제 2 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 MHC II 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다.

본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 개체에게 투여된 유전자 물질은 제 1 핵산분자 및 제 2 핵산분자를 함유한다. 제 1 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 2 핵산분자는 MHC II 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 두가지 뉴클레오타이드 서열은 모두 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된다.

본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 개체에게 투여된 유전자 물질은 제 1 핵산분자 및 제 2 핵산분자를 함유한다. 제 1 핵산분자는 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 MHC II 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 두가지 뉴클레오타이드 서열은 모두 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된다. 제 2 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다.

본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 개체에게 투여된 유전자 물질은 제 1 핵산분자, 제 2 핵산분자 및 제 3 핵산분자를 함유한다. 제 1 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 2 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 MHC II 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 3 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다.

유전자 물질은 개체의 세포에 의해서 발현되어 면역원적 표적으로서 작용하 며, 이에 대하여 면역반응이 야기된다. 생성된 면역반응은 광범한 기초를 두고 있는데, 체액성 면역반응 이외에도 세포성 면역반응의 두개의 완 모두가 야기된다. 본 발명의 방법은 예방적 및 치료학적 면역성을 부여하는데 유용하다. 따라서, 면역시키는 방법은 면역원에 대한 면역시킴으로써 예를들어 병원체 공격 또는 특이세포의 출현 또는 증식으로부터 개체를 보호하는 방법 및 병원체 감염, 과증식성 질병 또는 자가면역질병을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법 둘다를 포함한다.

표적단백질은 바람직하게는 암세포 또는 그에 대해서 면역시키는 것이 필요한 자가면역질병에 연관된 세포와 같은 병원체 또는 원치않는 세포-타입으로부터의 단백질과 적어도 하나의 에피토프를 공유하는 면역원성 단백질이다. 표적단백질에 대하여 지시된 면역반응은 표적단백질이 관련된 특이적 감염 또는 질병에 관하여 개체를 보호하고(거나) 치료한다.

본 발명은 표적단백질, 즉 병원체, 알러젠 (allergen) 또는 개체 자신의 "비정상 (abnormal)" 세포와 특이적으로 관련된 단백질에 대한 광범한 면역반응을 야기시키는데 유용하다. 본 발명은 병원성 인자 및 유기체에 대해서 개체를 면역시켜 병원체 단백질에 대한 면역반응이 병원체에 대한 보호적 면역성을 제공하도록 하는데 유용하다. 본 발명은 과증식성 세포와 특이적으로 관련된 표적단백질에 대하여 면역반응을 야기시킴으로써 암과 같은 과증식성 질병 및 질환을 구제하는데 유용하다. 본 발명은 자가면역질병에 연관된 세포와 특이적으로 관련된 표적단백질에 대하여 면역반응을 야기시킴으로써 자가면역질병 및 질환을 구제하는데 유용하다.

본 발명에 따라서 세포에 송달되는 핵산분자는 예방적 및(또는) 치료학적 면역제로서 작용하는 면역원에 대한 유전자 주형으로서 작용할 수 있다. 본 발명은 바이러스, 원핵생물, 및 단세포 병원성 유기체 및 다세포성 기생충과 같은 병원성 진핵성 유기체 등의 모든 병원체에 대하여 개체를 면역시키는데 사용될 수 있다. 본 발명은 특히 세포를 감염시키며 바이러스, 및 고노레아 (gonorrhea), 리스테리아 (listeria) 및 시겔라 (shigella)와 같은 원핵생물과 같이 피막이 형성되지 않은 병원체에 대하여 개체를 면역시키는데 유용하다. 또한, 본 발명은 생활환 (life cycle)에 세포내 병원체인 단계를 포함하는 원생동물 병원체에 대해 개체를 면역시키는데에도 유용하다. 본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "세포내 병원체"는 그의 생식주기 또는 생활환의 적어도 일부분에서는 숙주세포 내에 존재하고 그안에서 병원체 단백질을 생산하거나 생산하도록 유도하는 바이러스 또는 병원성 유기체를 칭하는 것을 의미한다. 표 2는 본 발명에 따르는 백신이 제조될 수 있는 바이러스 과 및 속 중의 몇가지에 대한 리스트를 제공한다. 표에 언급된 항원과 같은 병원체 항원 상에서 나타나는 에피토프와 동일하거나 실질적으로 유사한 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 펩타이드를 코드화한 DNA 서열을 포함하는 DNA 구조물이 백신에서 유용하다. 또한, 본 발명은 원핵성 및 진핵성 원생동물 병원체 및 표 3에 언급된 것과 같은 다세포성 기생충을 포함한 다른 병원체에 대해 개체를 면역시키는데에도 유용하다.

병원체 감염으로부터 보호하기 위한 유전자 백신을 생산하기 위해서는, 그에 대한 보호적 면역반응이 제공될 수 있는 면역원성 단백질을 코드화한 유전자 물질 이 유전자 구조물 내에 표적에 대한 코드화 서열로서 반드시 포함되어야 한다. 병원체가 본 발명이 특히 유용한 세포내적으로 감염되거나, 또는 세포외적으로 감염된 경우에 모든 병원체 항원이 보호적 반응을 야기시키는 것 같지는 않다. DNA 및 RNA가 둘다 비교적 작고 비교적 용이하게 생산될 수 있기 때문에, 본 발명은 다중 병원체 항원에 의한 백신접종을 가능하게 한다는 추가의 잇점을 제공한다. 유전자 백신에서 사용된 유전자 구조물은 다수의 병원체 항원을 코드화한 유전자 물질을 함유할 수 있다. 예를들어, 몇가지 바이러스 유전자가 단일 구조물내에 포함되어 다중 표적을 제공할 수 있다.

표 2 및 3에는 그들에 의한 감염으로부터 개체를 보호하기 위해서 유전자 백신이 제조될 수 있는 병원성 인자 및 유기체 중의 일부의 리스트가 포함되어 있다. 몇가지 바람직한 구체예에서, 병원체에 대해 개체를 면역시키는 방법은 HIV, HTLV 또는 HBV에 대해 지시되는 방법이다.

본 발명의 또 다른 관점은 과증식성 질병에서 특징적인 과증식성 세포에 대한 광범한 기초를 둔 보호적 면역반응을 부여하는 방법, 및 과증식성 질병을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "과증식성 질병"은 세포의 과증식을 특징적으로 나타내는 질병 및 질환을 칭하는 것을 의미한다. 과증식성 질병의 예에는 모든 형태의 암 및 건선이 포함된다.

면역원성 "과증식성 세포"-관련된 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 구조물을 개체의 세포내에 도입시키면 백신접종된 개체의 세포에서 이들 단백질의 생산이 일어난다. 본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "과증식 성-관련된 단백질"은 과증식성 질병과 관련된 단백질을 칭하는 것을 의미한다. 과증식성 질병에 대해 면역시키기 위해서 과증식성 질병과 관련된 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 구조물을 개체에게 투여한다.

과증식성-관련된 단백질이 효과적인 면역원성 표적이 되기 위해서, 이것은 정상세포에 비해서 과증식성 세포에서 독점적으로 또는 더 높은 레벨로 생산되는 단백질이어야 한다. 표적항원은 이러한 단백질, 그의 단편 및 이러한 단백질 상에서 발견되는 적어도 하나의 에피토프를 함유하는 펩타이드를 포함한다. 일부의 경우에, 과증식성-관련된 단백질은 단백질을 코드화한 유전자의 돌연변이의 생성물이다. 돌연변이된 유전자는 정상 단백질 상에 존재하지 않는 상이한 에피토프를 생성시키는 약간 상이한 아미노산 서열을 갖는 것을 제외하고는 정상 단백질과 거의 동일한 단백질을 코드화한다. 이러한 표적단백질에는 myb , myc , fyn과 같은 종양유전자 및 전위유전자 bcr / abl , ras, src, P53, neu , trk 및 EGRF에 의해서 코드화된 단백질인 것이 포함된다. 표적항원으로서의 종양유전자 생성물 이외에도, 항암치료 및 보호적 레지멘 (regimen)을 위한 표적단백질에는 B 세포 림프종에 의해서 생성된 항체의 가변부위, 및 일부의 구체예에서 자가면역질병에 대한 표적항원으로도 사용되는 T 세포 림프종의 T 세포 수용체의 가변부위가 포함된다. 모노클론성 항체 17-1A에 의해서 인식되는 단백질 및 엽산염 결합단백질을 포함하여 종양세포에서 더 높은 레벨로 존재하는 단백질과 같은 그밖의 다른 종양-관련된 단백질이 표적단백질로서 사용될 수 있다.

본 발명은 몇가지 암의 형태 중의 하나 또는 그 이상에 대하여 개체를 면역 시키는데 사용될 수 있지만, 본 발명은 특히 특정한 암이 발병할 소인이 있거나 암에 걸렸던 적이 있어서 재발하기 쉬운 개체를 예방적으로 면역시키는데 특히 유용하다. 유전학 및 기술 뿐 아니라 역학의 발전으로 개체에서 암이 발병할 확률의 측정 및 위험도 평가를 할 수 있게 되었다. 유전자 선별 및(또는) 가족의 건강력을 이용하여 특정한 개체가 여러가지 형태의 암 중에서 어느 하나의 암을 발병할 확률이 있는지를 예견할 수 있다.

마찬가지로, 이미 암이 발병하였고 암을 제거하는 치료를 받았거나 다른 식으로 완화되고 있는 개체가 특히 재발 및 재연 (recurrence)을 일으키기 쉽다. 치료 레지멘의 일부로서 이러한 개체는 재연을 구제하기 위해서 이들이 걸렸었던 것으로 진단되었던 암에 대해서 면역시킬 수 있다. 즉, 일단 개체가 어떠한 형태의 암에 걸렸었고 재발의 위험이 있는 것을 알면, 이들은 미래에 있을 수 있는 암의 발병을 구제하도록 그들의 면역시스템을 준비시키기 위해서 면역시킬 수 있다.

본 발명은 과증식성 질병을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, 유전자 구조물의 도입은 개체의 면역시스템이 표적단백질을 생산하는 과증식성 세포를 구제하도록 지시하고 촉진시키는 면역요법으로서 작용한다.

본 발명은 세포수용체 및 "자가 (self)"-지시된 항체를 생산하는 세포를 포함하여 자가면역성과 관련된 표적에 대하여 광범한 기초를 둔 보호적 면역반응을 부여함으로써 자가면역질병 및 질환을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 제공한다.

T 세포 매개된 자가면역질병에는 류마티스성 관절염 (RA), 다발성 경화증 (MS), 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome), 유육종증, 인슐린-의존성 당뇨병 (IDDM), 자가면역 갑상선염, 반응성 관절염, 강직성 척추염, 공피증, 다발성근염, 피부근염, 건선, 맥관염, 베게너 육아종증 (Wegener's granulomatosis), 크론병 (Crohn's disease) 및 궤양성 대장염이 포함된다. 이들 각각의 질병은 내인성 항원에 결합하여 자가면역질병과 관련된 염증성 다단계를 개시시키는 T 세포 수용체를 특징적으로 나타낸다. T 세포의 가변부위에 대한 백신접종은 CTLs를 포함한 면역반응을 야기시켜 이들 T 세포를 제거할 수 있다.

RA에서는 질병에 연관된 T 세포 수용체 (TCRs)의 몇가지 특이적 가변부위가 특정화되었다. 이들 TCRs에는 Vβ-3, Vβ-14, Vβ-17 및 Vα-17이 포함된다. 즉, 이들 단백질 중의 적어도 하나를 코드화한 DNA 구조물로 백신접종하여 RA에 연관된 T 세포를 표적으로하는 면역반응을 야기시킨다 [참조: Howell, M.D., et al., 1991 Proc. Natl . Acad . Sci . USA 88:10921-10925; Paliard, X., et al., 1991 Science 253:325-329; Williams, W.V., et al., 1992 J. Clin . Invest. 90:326-333; 이들은 각각 본 명세서에 참고로 포함되어 있다].

MS에서는 질병에 연관된 TCRs의 몇가지 특이적 가변부위가 특정화되었다. 이들 TCRs에는 Vβ-7 및 Vα-10이 포함된다. 즉, 이들 단백질 중의 적어도 하나를 코드화한 DNA 구조물로 백신접종하여 MS에 연관된 T 세포를 표적으로하는 면역반응을 야기시킨다 [참조: Wucherpfennig, K.W., et al., 1990 Science 248:1016-1019; Oksenberg, J.R., et al., 1990 Nature 345:344-346; 이들은 각각 본 명세서에 참고로 포함되어 있다].

공피증에서는 질병에 연관된 TCRs의 몇가지 특이적 가변부위가 특정화되었다. 이들 TCRs에는 Vβ-6, Vβ-8, Vβ-14 및 Vα-16, Vα-3C, Vα-7, Vα-14, Vα-15, Vα-16, Vα-28 및 Vα-12가 포함된다. 즉, 이들 단백질 중의 적어도 하나를 코드화한 DNA 구조물로 백신접종하여 공피증에 연관된 T 세포를 표적으로하는 면역반응을 야기시킨다.

T 세포 매개된 자가면역질병, 특히 그에 대한 TCR의 가변부위가 아직 특정화되어야 하는 질병을 앓고 있는 환자를 치료하기 위해서는 활액생검을 수행할 수 있다. 존재하는 T 세포의 샘플을 취하여 이들의 TCRs의 가변부위를 표준기술을 사용하여 확인하였다. 이 정보를 이용하여 유전자 백신을 제조할 수 있다.

B 세포 매개된 자가면역질병에는 루푸스 (SLE), 그레이브스병 (Grave's disease), 중증근무력증, 자가면역성 용혈성빈혈, 자가면역성 혈소판감소증, 천식, 한성글로부린혈증, 원발성 담관경화증 및 악성빈혈이 포함된다. 이들 각각의 질병은 내인성 항원에 결합하여 자가면역질병과 관련된 염증성 다단계를 개시시키는 항체를 특징적으로 나타낸다. 항체의 가변부위에 대한 백신접종은 CTLs를 포함한 면역반응을 야기시켜 항체를 생산하는 이들 B 세포를 제거할 수 있다.

B 세포 매개된 자가면역질병을 앓고 있는 환자를 치료하기 위해서는 자가면역활성에 연관된 항체의 가변부위가 반드시 확인되어야 한다. 조직생검을 수행하여 염증부위에 존재하는 항체의 샘플을 취할 수 있다. 이들 항체의 가변부위는 표준기술을 사용하여 확인할 수 있다. 이 정보를 이용하여 유전자 백신을 제조할 수 있다.

SLE의 경우에 하나의 항원은 DNA인 것으로 믿어진다. 즉, SLE에 대하여 면역시킨 환자에게서 그들의 혈청을 안티-DNA 항체에 대해 선별할 수 있으며, 혈청에 존재하는 이러한 안티-DNA 항체의 가변부위를 코드화한 DNA 구조물을 포함하는 백신을 제조할 수 있다.

TCRs와 항체 둘다의 가변부위 사이의 공통적인 구조적 특징은 잘 알려져 있다. 특정한 TCR 또는 항체를 코드화한 DNA 서열은 일반적으로 문헌 (Kabat, et al., 1987 Sequence of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda MD; 이것은 참고로 본 명세서에 포함되어 있다)에 기술된 방법과 같은 잘 알려진 방법에 따라 확인될 수 있다. 또한, 항체로부터 기능적 가변부위를 클로닝하는 일반적인 방법은 문헌 (Chaudhary, V.K., et al., 1990 Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87:1066, 이것은 참고로 본 명세서에 포함되어 있다)에서 찾을 수 있다.

본 발명은 면역억제되거나 면역약화된 개체에서 면역반응을 증진시키는데에 특히 유용하다. 이러한 환자는 특히 감염에 걸리기 쉬우며, 효과적인 면역반응을 제공하기가 어렵다. 본 발명은 또한, 암에 걸린 환자를 치료하는데 특히 유용하다. 일부의 이러한 환자에게서 암세포는 효과적으로 암-관련된 항원을 제시하지 못하며, 따라서 개체는 최적유효면역반응 보다 작은 면역반응을 제공한다.

몇가지 바람직한 구체예에서는, 조절요소에 작동가능하게 연결된 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 조절요소에 작동가능하게 연결된 MHC I 항원 및(또는) MHC II 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드가 제공 된다. 일부의 바람직한 구체예에서는, 제 1 플라스미드 및 제 2 플라스미드를 포함하는 조성물이 제공된다. 제 1 플라스미드는 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유하며, 제 2 플라스미드는 MHC I 항원 및(또는) MHC II 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 면역원은 병원체 항원, 과증식성 질병과 관련된 단백질, 또는 자가면역질병과 관련된 단백질이다. 일부의 구체예에서, 플라스미드는 임의로, 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 추가로 함유할 수 있다. 바람직한 구체예는 조절요소에 작동가능하게 연결된 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 조절요소에 작동가능하게 연결된 MHC I 항원 및(또는) MHC II 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드를 포함하는, 주사용 조성물을 포함한 약제학적 조성물을 포함한다. 일부의 구체예에서, 제 1 플라스미드는 조절요소에 작동가능하게 연결된 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 2 플라스미드는 조절요소에 작동가능하게 연결된 MHC I 항원 및(또는) MHC II 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 일부의 구체예에서, 제 1 플라스미드는 조절요소에 작동가능하게 연결된 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유하며, 제 2 플라스미드는 조절요소에 작동가능하게 연결된 MHC I 항원 및(또는) MHC II 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 일부의 구체예에서는 제 1 및 2 플라스미드가 제공된다. 제 1 플라스미드는 조절요소에 작동가능하게 연결된 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 조절요소에 작동가능하게 연결된 MHC I 항원 및(또는) MHC II 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유하며, 제 2 플라스미드는 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 어떤 구체예에서는, 제 1, 2 및 3 플라스미드가 제공된다. 제 1 플라스미드는 조절요소에 작동가능하게 연결된 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 2 플라스미드는 조절요소에 작동가능하게 연결된 MHC I 항원 및(또는) MHC II 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 3 플라스미드는 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다.

본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 공여체 서브타입 MHC I 단백질 및 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열의 발현가능형을 함유하는 조성물을 투여함으로써 비-MHC I 서브타입-매칭된 공여체 세포, 조직 및 기관에 대한 면역반응을 제거하거나 감소시킬 수 있다. 이 방법은 이식 환자에게 이식된 것과 같은 동계의 세포, 조직 및 기관의 거부반응에 연관된 면역세포를 제거하는 개선된 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 수용체에 관하여 동종인 공여체 MHC I 항원에 상응하는 MHC I 항원, 및 사멸시그날 또는 독소 둘다의 세포내 발현은 동종 공여체 MHC I 항원을 나타내는 세포, 조직 및 기관에 대한 면역반응을 감소시킨다. 이식 환자의 세포에서 동계 세포, 조직 및 기관의 MHC I 서브타입을 매칭시키는 서브타입의 MHC I 항원 및 독소 또는 사멸시그날의 공동-생산은 동계 세포, 조직 및 기관을 표적으로하는 T 세포의 제거를 야기시키고, 이렇게하여 동계 세포, 조직 및 기관에 대한 면역반응을 제거하는 것이 빌견되었다. 동종 MHC I 항원에 대한 면역반응에 연관된 T 세포는 사멸시그날 또는 독소와의 상호작용에 의해서 사멸한다. 필수적으로, 동종 MHC I 항원은 동종 MHC I 항원에 대해 지시된 면역반응에 연관된 세포를 제거함으로써 볼수 없게 된다. 이에 따라 이식된 세포, 조직 또는 기관에 대한 면역반응에 연관된 T 세포의 수가 감소함으로써 이식술의 거부반응이 감소한다.

본 발명에 따라 수용체인 개체와 공여체 둘다의 형이 검출된다. MHC I 대립유전자의 발현패턴의 비교는 공여체의 MHC I 항원이 공여체 물질의 거부반응을 야기시키는 면역반응에 대해 표적화되는 것을 시사한다. 동종 공여체 MHC I 항원에 대해 응답하는 T 세포의 제거는 거부반응을 감소시킨다. 바람직한 구체예에서, T 세포의 제거는 거부반응을 최소화하여 이식프로토콜을 진행시킨다. 다수의 동종 공여체 MHC I 항원을 표적으로하는 다수의 유전자 구조물이 제조될 수 있다.

골수 이식조직과 같이 MHC II를 발현하는 세포를 포함한 세포를 이식하는 경우에, 동종 공여체 MHC II 항원은 공여체 및 수용체의 형을 검출함으로써 확인될 수 있다. 동종 공여체 MHC II 항원을 코드화한 유전자 구조물을 사멸시그날 또는 독소와 함께 투여하여 동종 공여체 MHC II 항원에 대해 응답하는 T 세포를 제거할 수 있다.

따라서, 본 발명은 세포, 조직 또는 기관이식술을 수행하는 개체에게서 비매칭된 공여체 세포, 비매칭된 공여체 조직 또는 비매칭된 공여체 기관의 거부반응을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부의 구체예에서, 이 방법은 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 MHC 를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자를 개체에게 개체 신체의 부위에서 투여하는 단계를 포함한다. MHC는 공여체 세포, 공여체 조직 또는 공여체 기관에 매칭되며, 수용체에 대해 동종이다. 핵산분자는 개체의 세포에 의해서 흡수되어, 여기에서 MHC 항원 및 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열이 발현된다. T 세포는 동종 MHC 항원을 발현하는 세포와 컴플렉스를 형성한다. 이 세포는 또한 사멸시그날 또는 독소를 발현한다. T 세포는 동종 MHC 항원 및 사멸시그날 또는 독소를 발현하는 세포와의 컴플렉스 형성으로 인해서 사멸하며, 세포, 조직 또는 기관이식을 수행하는 개체에서 비매칭된 공여체 세포, 비매칭된 공여체 조직 또는 비매칭된 공여체 기관의 거부반응을 감소시킨다. 일부의 구체예에서는, 제 1 핵산분자 및 제 2 핵산분자를 개체 신체상의 부위에 투여한다. 제 1 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유하며, 제 2 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 동종 MHC 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다.

일부의 구체예에서는, 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 또한, 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 동종 MHC 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열과 함께 개체에게 투여한다. 일부의 구체예에서, 이 방법은 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열, 동종 MHC 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자를 개체의 신체상의 부위에 투여하는 단계를 포함한다. 각각의 뉴클레오타이드 서열은 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된다. 일부의 구체예에서, 방법은 제 1 핵산분자 및 제 2 핵산분자를 개체의 신체상의 부위에 투여하는 단계를 포함한다. 제 1 핵산분자는 각각 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결되어 있는, 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유하며, 제 2 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 동종 MHC 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 일부의 구체예에서, 방법은 제 1 핵산분자 및 제 2 핵산분자를 개체의 신체상의 부위에 투여하는 단계를 포함한다. 제 1 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유하며, 제 2 핵산분자는 각각 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결되어 있는, 동종 MHC 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 일부의 구체예에서, 방법은 제 1 핵산분자 및 제 2 핵산분자를 개체의 신체상의 부위에 투여하는 단계를 포함한다. 제 1 핵산분자는 각각 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결되어 있는, 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 동종 MHC 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유하며, 제 2 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단 백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 일부의 구체예에서, 방법은 제 1 핵산분자, 제 2 핵산분자 및 제 3 핵산분자를 개체의 신체상의 부위에 투여하는 단계를 포함한다. 제 1 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 2 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 MHC 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 3 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다.

본 발명은 조절요소에 작동가능하게 연결된 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 조절요소에 작동가능하게 연결된 MHC 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드를 제공한다. MHC 항원은 MHC I 항원 및(또는) MHC II 항원일 수 있다. 일부의 구체예에서, 플라스미드는 추가로 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 본 발명은 조절요소에 작동가능하게 연결된 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 조절요소에 작동가능하게 연결된 MHC 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드를 포함하는, 주사용 조성물을 포함한 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드를 제공한다.

일부의 구체예에서는 제 1 플라스미드 및 제 2 플라스미드를 포함하는 조성 물이 제공된다. 제 1 플라스미드는 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유하며, 제 2 플라스미드는 MHC 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. MHC 항원은 MHC I 항원 및(또는) MHC II 항원일 수 있다. 일부의 구체예에서, 제 1 플라스미드는 조절요소에 작동가능하게 연결된 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 2 플라스미드는 조절요소에 작동가능하게 연결된 MHC 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 일부의 구체예에서, 플라스미드는 조절요소에 작동가능하게 연결된 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유하며, 제 2 플라스미드는 조절요소에 작동가능하게 연결된 MHC 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 일부의 구체예에서 제 1 플라스미드는 조절요소에 작동가능하게 연결된 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 조절요소에 작동가능하게 연결된 MHC 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유하며, 제 2 플라스미드는 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 어떤 구체예에서는, 제 1 플라스미드, 제 2 플라스미드 및 제 3 플라스미드를 포함하는 조성물이 제공된다. 제 1 플라스미드는 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 2 플라스미드는 MHC 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. MHC 항원은 MHC I 항원 및(또는) MHC II 항원일 수 있다. 제 3 플라스미드는 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다.

본 발명의 또 다른 관점은 개체에서 우성면역반응을 감소시키기 위한 조성물 및 감소시키는 방법에 관한 것이다. 우성면역반응은 항체 및(또는) 특이항체에서 지시된 CTLs의 대부분을 특징적으로 나타낸다. 우성면역반응에서는 "우성표적항원"을 사용하여 형성하는 MHC/Ag/TCR 컴플렉스가 우성면역반응을 매개한다. 즉, MHC/우성항원 컴플렉스에 대해 특이적인 T 세포의 제거는 우성항원에서 지시된 면역반응을 감소시키고, 이렇게하여 비-우성항원에 대한 면역반응은 증가시킨다. 본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 우성항원과 결합하여 MHC/우성항원/TCR 컴플렉스를 형성하는 MHC의 서브타입이 확인된다. 그후, 개체에게 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열, 및 우성항원과 결합하여 MHC/우성항원/TCR 컴플렉스를 형성하는 MHC의 서브타입을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자를 개체의 신체상의 부위에 투여한다. 이들 두가지 뉴클레오타이드 서열은 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된다. 핵산분자는 개체의 세포에 의해 흡수되어, 여기에서 MHC를 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열이 발현된다. MHC/우성항원 컴플렉스와의 컴플렉스를 형성하는 T 세포의 부차집단의 T 세포는 세포와의 컴플렉스를 형성한다. 사멸시그날 또는 독소를 발현하는 세포와의 컴플렉스 형성으로 인해서 T 세포는 사멸한다. 개체에서 진행되는 우성면역반응은 감소된다. 본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 우성항원과 결합하여 MHC/우성항원/TCR 컴플렉스를 형성하는 MHC의 서브타입을 확인하고, 제 1 핵산분자 및 제 2 핵산분자를 개체의 신체상의 부위 에 투여한다. 제 1 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 2 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 MHC를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 2 핵산분자의 뉴클레오타이드 서열에 의해서 코드화된 MHC는 우성항원과 결합하여 MHC/우성항원/TCR 컴플렉스를 형성하는 서브타입으로서 확인된 MHC의 서브타입과 매칭된다. 제 1 및 2 핵산분자는 개체의 세포에 의해서 흡수되어, 사멸시그날 또는 독소 및 MHC를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 발현하며, MHC/우성항원 컴플렉스와의 컴플렉스를 형성하는 T 세포의 부차집단의 T 세포는 세포와의 컴플렉스를 형성한다. T 세포는 사멸시그날 또는 독소를 발현하는 세포와의 컴플렉스 형성으로 인해서 사멸한다. 진행되는 개체에서의 우성면역반응은 감소된다. 일부의 구체예에서는 MHC가 MHC I 항원이다. 일부의 구체예에서, MHC는 MHC II 항원이다. 일부의 구체예에서는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 개체에게 공동투여한다.

일부의 구체예에서, 방법은 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열, 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자를 개체의 신체상의 부위에 투여하는 단계를 포함한다. 이들 3가지 뉴클레오타이드 서열의 각각은 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된다. 뉴클레오타이드 서열에 의해 코드화된 MHC는 우성항원과 결합하여 MHC/우성항원/TCR 컴플렉스를 형성하는 서브타입으로서 확인된 MHC의 서브타입과 매칭된다. 핵산분자는 개체의 세포에 의해서 흡수되어, 여기에서 사멸시그날 또는 독소, MHC 및 B7.2를 코드화한 뉴클레오타이드 서열이 발현된다. MHC/우성항원 컴플렉스와의 컴플렉스를 형성하는 T 세포의 부차집단의 T 세포는 세포와의 컴플렉스를 형성한다. 사멸시그날 또는 독소를 발현하는 세포와의 컴플렉스 형성으로 인해서 T 세포는 사멸한다. 진행되는 개체에서의 우성면역반응이 감소된다.

일부의 구체예에 따르면, 방법은 제 1 핵산분자 및 제 2 핵산분자를 개체의 신체상의 부위에 투여하는 단계를 포함한다. 일부의 구체예에서, 제 1 핵산분자는 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유하며, 이들 각각의 뉴클레오타이드 서열은 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된다. 제 2 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 MHC 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 일부의 구체예에서, 제 1 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 2 핵산분자는 MHC 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유하며, 여기에서 각각의 뉴클레오타이드 서열은 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된다. 일부의 구체예에서, 제 1 핵산분자는 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 MHC 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유하며, 여기에서 각각의 뉴클레오타이드 서열은 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동 가능하게 연결된다. 제 2 핵산분자는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 이러한 각각의 구체예에서, 뉴클레오타이드 서열에 의해서 코드화된 MHC는 MHC I 또는 MHC II일 수 있다. MHC는 우성항원과 결합하여 MHC/우성항원/TCR 컴플렉스를 형성하는 서브타입으로서 확인된 MHC의 서브타입과 매칭된다. 제 1 및 2 핵산분자는 개체의 세포에 의해 흡수되어, 여기에서 사멸시그날 또는 독소, MHC 및 B7.2를 코드화한 뉴클레오타이드 서열이 발현된다. MHC/우성항원 컴플렉스와의 컴플렉스를 형성하는 T 세포의 부차집단의 T 세포는 세포와의 컴플렉스를 형성한다. T 세포는 사멸시그날 또는 독소를 발현하는 세포와의 컴플렉스 형성으로 인해서 사멸한다. 진행되는 개체에서의 우성면역반응이 감소된다.

일부의 구체예에 따르면, 방법은 제 1 핵산분자, 제 2 핵산분자 및 제 3 핵산분자를 개체의 신체상의 부위에 투여하는 단계를 포함한다. 제 1 핵산분자는 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 2 핵산분자는 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 3 핵산분자는 MHC 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 이들 각각의 뉴클레오타이드 서열은 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된다. 뉴클레오타이드 서열에 의해서 코드화된 MHC는 MHC I 또는 MHC II일 수 있다. MHC는 우성항원과 결합하여 MHC/우성항원/TCR 컴플렉스를 형성하는 서브타입으로서 확인된 MHC의 서브타입과 매칭된다. 제 1, 2 및 3 핵산분자는 개체의 세포에 의해 흡수되어, 여기에서 사멸시그날 또는 독소, MHC 및 B7.2를 코드화한 뉴클레오타이드 서열 이 발현된다. MHC/우성항원 컴플렉스와의 컴플렉스를 형성하는 T 세포의 부차집단의 T 세포는 세포와의 컴플렉스를 형성한다. T 세포는 사멸시그날 또는 독소를 발현하는 세포와의 컴플렉스 형성으로 인해서 사멸한다. 이렇게하여 진행되는 개체에서의 우성면역반응이 감소된다.

일부의 구체예에 따르면, 본 발명은 T 세포의 목적하는 부차집단을 증량시키기 위한 조성물 및 증량시키는 방법에 관한 것이다. 목적하는 T 세포의 부차집단은 바람직하게는, 그에 대한 증진된 면역반응이 필요한 항원을 함유하는 MHC/항원 컴플렉스와의 컴플렉스를 형성한다. 증량시키고자 하는 T 세포에 의해서 발현된 TCR을 포함한 MHC/Ag/TCR 컴플렉스를 형성하는 MHC 서브타입을 확인한다. 개체에게는 그들의 신체상의 부위에서 증량시키고자 하는 T 세포에 의해서 발현된 TCR을 포함한 MHC/Ag/TCR 컴플렉스를 형성하는 MHC 서브타입을 코드화한 뉴클레오타이드 서열, 및 B7.2를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자를 투여한다. 이들 두가지 뉴클레오타이드 서열은 모두 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된다. 핵산분자는 개체의 세포에 의해 흡수되어, 여기에서 MHC를 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 B7.2를 코드화한 뉴클레오타이드 서열이 발현된다. MHC/우성항원 컴플렉스와의 컴플렉스를 형성하는 T 세포의 부차집단의 T 세포는 세포와의 컴플렉스를 형성한다. B7.2를 발현하는 세포와의 컴플렉스 형성으로 인해서 B7.2에 대한 응답으로 T 세포는 증식한다. 본 발명의 다른 구체예에 따르면, 개체에게 그들의 신체상의 부위에서 제 1 핵산분자 및 제 2 핵산분자를 투여한다. 제 1 핵산분자는 증량시킬 T 세포에 의해서 발현된 TCR을 포함하는 MHC/Ag/TCR 컴플렉스를 형성하는 MHC의 서브타입을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제 2 핵산분자는 B7.2를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 두가지 뉴클레오타이드 서열 모두는 개체에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된다. 제 1 및 2 핵산분자는 개체의 세포에 의해서 흡수되어, 여기에서 MHC를 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 B7.2를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 발현한다. MHC/우성항원 컴플렉스와의 컴플렉스를 형성하는 T 세포의 부차집단의 T 세포는 세포와의 컴플렉스를 형성한다. T 세포는 B7.2를 발현하는 세포와의 컴플렉스 형성으로 인해서 B7.2에 대한 응답으로 증식한다. 일부의 구체예에서, MHC는 MHC I 항원이다. 일부의 구체예에서 MHC는 MHC II 항원이다.

다양한 프로토콜을 사용하여, 백신 및 치료제로서 사용하는 것을 포함하여 직접 DNA 투여에 의해서 세포에 단백질을 송달하는 조성물 및 방법이 보고되었다. 이러한 방법은 예는 미합중국특허 제 5,593,972호, 미합중국특허 제 5,739,118호, 미합중국특허 제 5,580,859호, 미합중국특허 제 5,589,466호, 미합중국특허 제 5,703,055호, 미합중국특허 제 5,622,712호, 미합중국특허 제 5,459,127호, 미합중국특허 제 5,676,954호, 미합중국특허 제 5,614,503호 및 PCT 출원 PCT/US95/12502호 (이들은 각각 본 명세서에 참고로 포함된다)에 기술되어 있다. 직접 DNA 투여에 의해서 세포에 단백질을 송달하는 조성물 및 방법은 또한 PCT/US90/01515, PCT/US93/02338, PCT/US93/048131 및 PCT/US94/00899 (이들은 각각 본 명세서에 참고로 포함된다)에도 기술되어 있다. 이들 특허출원에 기술된 송달 프로토콜이외에도 DNA를 송달하는 대체방법이 미합중국특허 제 4,945,050호 및 5,036,006호 (이들 은 각각 본 명세서에 참고로 포함된다)에 기술되어 있다. 핵산서열을 송달하는데 유용한 재조합체 아데노바이러스성 벡터의 예는 미합중국특허 제 5,756,283호 및 미합중국특허 제 5,707,618호 (이들은 각각 본 명세서에 참고로 포함된다)에 기술되어 있다. 핵산분자는 또한 미합중국특허 제 4,235,871호, 미합중국특허 제 4,241,046호 및 미합중국특허 제 4,394,448호 (이들은 각각 본 명세서에 참고로 포함된다)에 기술되어 있는 것과 같은 리포좀-매개된 DNA 전이를 사용하여 송달할 수도 있다.

본 발명의 일부의 방법에 따르면, 핵산분자는 근육내, 비내, 복강내, 피하, 피내 또는 국소로 구성된 그룹으로부터 선택된 투여경로에 의해서, 또는 질, 직장, 요도, 구강 및 설하로 구성된 그룹으로부터 선택된 점액성조직에 대한 관류 (lavage)에 의해서 개체의 신체상의 부위에 투여될 수 있다. 몇가지 바람직한 투여경로에는 피내, 피하, 복강내, 근육내 및 경구가 포함된다.

본 발명의 일부의 방법에 따르면, DNA는 플라스미드 DNA이다.

본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 프로모터는 시미안 바이러스 (Simian Virus) 40 (SV40), 마우스유선암 바이러스 (Mouse Mammary Tumor Virus; MMTV) 프로모터, HIV 장말단반복 (Long Terminal Repeat; LTR) 프로모터와 같은 인간면역결핍바이러스 (HIV), 몰로니 바이러스 (Moloney virus), ALV, CMV 즉시형 초기프로모터 (immediate early promoter)와 같은 사이토메갈로바이러스 (Cytomegalovirus; CMV), 엡스타인 바르 바이러스 (Epstein Barr Virus; EBV), 라우스육종 바이러스 (Rous Sarcoma Virus; RSV), 및 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 및 인간 메탈로티오네인과 같은 인간 유전자로부터 유래하는 프로모터로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 폴리아데닐화 시그날은 SV40 폴리아데닐화 시그날 및 소성장호르몬 폴리아데닐화 시그날로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 일부의 방법에 따르면, DNA 분자는 세포에 의한 DNA 분자의 흡수를 용이하게 하는 조성물로 투여된다. 일부의 구체예에서, 핵산분자는 공력제 (co-agent)의 투여와 함께 세포에 송달된다. 공력제의 예는 미합중국특허 제 5,593,972호, 미합중국특허 제 5,739,118호, 및 1994년 1월 26일자로 출원된 국제특허출원 PCT/US94/00899 (이들은 각각 본 명세서에 참고로 포함된다)에 기술되어 있다. 핵산분자와 함께 투여되는 공력제는 핵산분자와의 혼합물로서 투여될 수 있거나, 핵산분자의 투여와 동시에, 투여 전에 또는 투여 후에 별도로 투여될 수도 있다. 일부의 구체예에서, 공력제는 미합중국특허 제 5,703,055호에 기술되 것을 포함하나 이들로 제한되지는 않는 양이온성 지질일 수 있다. 그밖의 공력제의 예로는 α-인터페론, 감마-인터페론, 혈소판-유래 성장인자 (PDGF), TNF, 표피성장인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 및 IL-12, 및 섬유아세포 성장인자와 같은 성장인자, 사이토킨 및 림포킨, 면역-촉진성 컴플렉스 (ISCOMS)와 같은 계면활성제, 프로인트 불완전보조액, 모노포스포릴 지질 A (MPL)를 포함한 LPS 유사체, 콜레라 독소, 코브라 독소, 사포닌, 뮤라밀 펩타이드, 퀴논 유사체 및 스쿠알렌 및 스쿠알렌과 같은 소포체, 및 히알우론산이 포함된다. 일부의 구체예에서는 면역조절 단백질이 공력제로서 사용될 수도 있다. 세포에 의한 DNA 분자의 흡 수를 용이하게 하는 바람직한 조성물은 양이온성 지질, 리포좀 및 국소마취제로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 몇가지 바람직한 구체예에서, DNA 분자는 부피바카인과 함께 투여된다. 몇가지 구체예에서는, 다수의 공력제가 사용된다. 핵산분자와 함께 투여되는 공력제는 핵산분자와의 혼합물로서 투여될 수 있거나, 핵산분자의 투여와 동시에, 투여 전에 또는 투여 후에 별도로 투여될 수도 있다.

플라스미드-기본 유전자 전이프로토콜에서 MHC 코드화 서열, 및 면역원에 대한 코드화 서열 및(또는) 사멸시그날 또는 독소에 대한 코드화 시그날 및(또는) B7.2 코드화 서열의 발현가능형을 사용하는 것 이외에도, 본 발명은 약독화 생백신 및 항원을 코드화한 외래유전자를 송달하기 위해서 재조합체 벡터를 사용하는 백신을 사용하는 방법과 같은 다른 유전자 전이방법을 제공한다. 약독화 생백신 및 외래유전자를 송달하기 위해서 재조합체 벡터를 사용하는 백신의 예는 미합중국특허 제 4,722,848; 5,017,487; 5,077,044; 5,110,587; 5,112,749; 5,174,993; 5,223,424; 5,225,336; 5,240,703; 5,242,829; 5,294,441; 5,294,548; 5,310,668; 5,387,744; 5,389,368; 5,424,065; 5,451,499; 5,453,364; 5,462,734; 5,470,734; 및 5,482,713호 (이들은 각각 본 명세서에 참고로 포함된다)에 기술되어 있다. 본 발명에 따르는 유전자 구조물은 약독화 생백신 및 재조합체 백신에 통합되어 본 발명에 따르는 개선된 백신을 생산할 수 있다.

본 발명의 관점은 본 발명의 방법에 유용한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 약제학적 조성물은 미토콘드리아성 프로모터를 포함하는 개체의 세포에서의 발현에 필요한 조절요소에 작동가능하게 연결된 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자를 함유한다. 약제학적 조성물은 또한, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 함유한다. 용어 "약제학적"은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있으며 광범하게 이해되고 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "약제학적 조성물" 및 "주사용 약제학적 조성물"은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해 이해되는 그들의 통상적인 의미를 갖는 것을 의미한다. 약제학적 조성물은 무균성, 발열성물질, 미립상 물질 및 등장성 및 pH에 관한 특정 표준에 부합하는 것이 필요하다. 예를들어, 주사용 약제학적 제제는 무균상태이고 발열성물질을 함유하지 않는다.

본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 약 1 ng 내지 약 10,000 ㎍의 DNA를 함유한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 약 2000 ㎍, 3000 ㎍, 4000 ㎍ 또는 5000 ㎍의 DNA를 함유한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 약 1000 ㎍의 DNA를 함유한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물는 약 10 ng 내지 약 800 ㎍의 DNA를 함유한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물는 약 0.1 내지 약 500 ㎍의 DNA를 함유한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 약 1 내지 약 350 ㎍의 DNA를 함유한다. 몇가지 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 약 25 내지 약 250 ㎍의 DNA를 함유한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 약 100 ㎍의 DNA를 함유한다.

본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 사용하고자 하는 투여방식에 따라 제제화된다. 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 유전자 구조물을 함유하는 백신을 용이하게 제제화할 수 있다. 선택된 투여방식이 근육내 주사인 경우에는 등장성 제제가 바람직하게 사용된다. 일반적으로, 등장성을 위한 첨가제에는 염화나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 소르비톨 및 락토즈가 포함될 수 있다. 일부의 경우에, 포스페이트 완충된 식염수와 같은 등장성 용액이 바람직하다. 안정화제에는 젤라틴 및 알부민이 포함된다. 몇가지 구체예에서는, 혈관수축제가 제제에 첨가된다, 본 발명에 따르는 약제학적 제제는 무균상태이고 발열성물질을 함유하지 않게 제공된다.

바람직한 구체예에서, DNA는 근육내 주사에 의해서 투여된다. 잘 알려져 있고 시판품으로 이용할 수 있는 약제학적 화합물인 부피바카인을 유전자 구조물의 투여 전에, 동시에 또는 후에 투여한다. 부피바카인과 유전자 구조물은 동일한 조성물로 제제화될 수도 있다. 부피바카인은 조직에 투여하였을 때의 그의 다수의 특성 및 활성의 관점에서 특히 유용하다. 부피바카인은 화학적으로 및 약물학적으로 아미노아실 국소마취제와 관련이 있다. 이것은 메피바카인의 동족체이며, 리도카인과 관련이 있다. 부피바카인은 근육조직 전압이 나트륨 공격에 민감하도록 하며, 세포내의 이온농도에 영향을 미친다. 부피바카인의 약물학적 활성에 대한 상세한 설명은 문헌 (Ritchie, J.M. and N.M. Greene, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eds.: Gilman, A.G. et al., 8th Edition, Chapter 15: 3111; 이것은 본 명세서에 참고로 포함된다)에서 볼 수 있다. 부피바카인 및 부피바카인과 유사한 기능을 나타내는 화합물이 본 발명의 방법에서 바람직하다.

부피바카인-HCl은 화학적으로 2-피페리딘카복스아미드, 1-부틸-N-(2,6-디메 틸페닐)모노하이드로클로라이드, 모노하이드레이트로서 명명되고 있으며, 아스트라사 (Astra Pharmaceutical Products Inc., Westboro, Mass.) 및 사노피 윈스롭사 (Sanofi Winthrop Pharmaceuticals, New York, N.Y.)를 포함한 다수의 공급원으로부터 약제학적 용도로 상업적으로 광범하게 입수할 수 있다. 부피바카인은 상업적으로는 메틸파라벤의 존재 또는 부재하 및 에피네프린의 존재 또는 부재하에서 제제화된다. 이러한 제제중의 어떤 것이라도 사용될 수 있다. 이것은 본 발명에서 사용될 수 있는 0.25%, 0.5% 및 0.75%의 농도로 약제학적 용도로 상업적으로 이용할 수 있다. 필요에 따라, 목적하는 효과를 야기시키는 다른 농도로 제조될 수도 있다. 본 발명에 따르면, 약 250 ㎍ 내지 약 10 ㎎의 부피바카인이 투여된다. 일부의 구체예에서는 약 250 ㎍ 내지 약 7.5 ㎎이 투여된다. 일부의 구체예에서는 약 0.50 ㎎ 내지 약 5.0 ㎎이 투여된다. 몇가지 구체예에서는, 약 1.0 ㎎ 내지 약 3.0 ㎎이 투여된다. 어떤 구체예에서는 약 5.0 ㎎이 투여된다. 예를들어, 일부의 구체예에서는 등장성 약제학적 담체중의 약 50 ㎕ 내지 약 2 ㎖, 바람직하게는 50 ㎕ 내지 약 1500 ㎕, 더욱 바람직하게는 약 1 ㎖의 0.5% 부피바카인-HCl 및 0.1% 메틸파라벤을 백신을 투여하기 전, 투여와 동시에 또는 투여한 후에 백신과 동일한 부위에 투여한다. 유사하게, 일부의 구체예에서는 등장성 약제학적 담체중의 약 50 ㎕ 내지 약 2 ㎖, 바람직하게는 50 ㎕ 내지 약 1500 ㎕, 더욱 바람직하게는 약 1 ㎖의 0.5% 부피바카인-HCl을 백신을 투여하기 전, 투여와 동시에 또는 투여한 후에 백신과 동일한 부위에 투여한다. 부피바카인 및 그밖의 다른 유사하게 작용하는 화합물, 특히 국소마취제의 관련된 그룹의 화합물은 세포에 의한 유전자 구조물 의 목적하는 흡수촉진을 제공하는 농도로 투여될 수 있다.

본 발명의 일부의 구체예에서, 개체에게는 근육내 주사에 의해서 유전자 백신접종을 하기 전에 우선 부피바카인을 주사한다. 즉, 예를들어 백신접종을 하기 약 일주일 내지 10일 전 까지에 개체에게 우선 부피바카인을 주사한다. 일부의 구체예에서는, 백신접종을 하기에 앞서서 개체에게 유전자 구조물을 투여하기 약 1 내지 5일 전에 부피바카인을 주사한다. 일부의 구체예에서는, 백신접종을 하기에 앞서서 개체에게 유전자 구조물을 투여하기 약 24시간 전에 부피바카인을 주사한다. 또 다른 대체방법으로, 부피바카인은 백신접종과 동시에 또는 백신접종을 하기 잠시 전 또는 후에 주사할 수 있다.

따라서, 부피바카인과 유전자 구조물은 배합하여 혼합물로서 동시에 주사할 수도 있다. 일부의 구체예에서, 부피바카인은 유전자 구조물을 투여한 후에 투여한다. 예를들어, 유전자 구조물을 투여한지 약 일주일 내지 10일 후까지 개체에게 부피바카인을 주사한다. 일부의 구체예에서는 개체에게 백신접종한지 약 24시간 후에 부피바카인을 주사한다. 일부의 구체예에서는, 개체에게 백신접종한 지 약 1 내지 5일 후에 부피바카인을 주사한다. 일부의 구체예에서, 개체에게는 백신접종한 지 약 1주일 내지 10일 후까지에 부피바카인을 투여한다.

본 발명은 촉진제로서 국소마취제를 사용하여 수행할 수 있다. 부피바카인, 메피바카인, 리도카인, 프로카인, 카보카인 및 메틸부피바카인 이외에 유사하게 작용하는 다른 화합물들도 사용될 수 있다.

실시예

β ₂ m 녹아웃 키메라 마우스의 구성

4주령의 암컷 C57B1/6J (β₂m^+/+) 및 C57B1/6J-β₂m^{tm1 / Unc} (β₂m^-/-) 마우스를 잭슨 래보래토리 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)로부터 구입하였다. β₂m^+/+ 및 β₂m^-/- 둘다를 상호 (reciprocal) 골수이식을 위해서 사용하였다. 골수 키메라의 제조는 문헌 (Sobel et al., J. Exp. Med., 1991, 173: 1441; 이 문헌은 그대로 참고로 포함되었다)에 상세히 기술되어 있다. 간략하면, (-2) 및 (-1)일에 200 ㎍/㎖의 모노클론성 항체 PK136 (안티-NK1.1)를 IP 주사하여 수용체 마우스 (β₂m^+/+ 및 β₂m^-/- 둘다)에서 NK 세포를 고갈시켰다. 이러한 전처리는 C57B1/6J 마우스에서 방사선-저항성 NK 세포에 의한 C57B1/6J-β₂m^{tm1 / Unc} 마우스로부터 유래하는 골수세포의 거부반응을 방지한다. 상호 골수이식을 한 날에 수용체 마우스에게 3시간 간격을 두고 동일하게 둘로 나눈 용량으로 제공되는 총 1050 rad의 방서선을 치명적으로 조사하였다. 공여체 마우스는 희생시키고 경골과 대퇴골을 관류시킴으로써 골수를 별도로 수거하였다. 골수세포를 로우-톡스-M (Low-Tox-M) 토끼 보체 (Cederlane Labs)와 함께 배양 (37℃, 1시간)하고, 이어서 모노클론성 항체 안티-CD4 (172.4), 안티-CD8 (31 M) 및 안티-Thy1.2 (mmt 1)의 혼합물의 포화농도와 함께 배양 (4℃, 45분)하여 골수세포로부터 성숙한 T-세포를 고갈시켰다. 상호 골수 세포를 10⁷ 세포 (0.3 ㎖)로 IV 주사하여 수용체 마우스를 재구성하였다. 모든 동물들은 온도-조절되고 광-주기화된 설비에서 사육하였다.

마우스의 면역

HIV-1_MN 외피단백질을 코드화한 DNA 백신 구조물 (pCEnv)을 문헌 (Boyer et al., J. Med. Primatol., 1996, 25:342; Wang et al., AIDS, 1995, 9: S159, 이들은 그대로 참고로 포함되어 있다)에 기술된 바와 같이 제조하였다. CD80 및 CD86 발현카세트는 문헌 (Kim et al., Nat. Biotech., 1997, 15: 641, 이것은 그대로 참고로 포함되어 있다)에 기술된 바와 같이 제조하였다. 각각의 마우스에게 문헌 (Kim, et al., Nat. Biotech., 1997, 15:641 및 Kim et al., J. Immunol., 1997, 158: 816, 이들은 그대로 참고로 포함되어 있다)에 기술된 바와 같이, 포스페이트 완충된 식염수 (PBS) 내에서 제제화된 목적하는 DNA 구조물 및 0.25% 부피바카인-HCl (Sigma, St. Louis, MO)를 각각 50 ㎍ 씩, 3회 (2주 간격) 근육내 주사하였다.상술한 레지멘으로 투여된 pCEnv 50 ㎍은 마우스에서 온화하지만 양성인 면역반응을 유도하는 것으로 나타났다. 이 용량이 공자극성 유전자의 공동-송달에 의해서 증진된 면역반응을 나타내는 것으로 선택되었다. 동물에게는 또한 HIV-1 외피단백질을 발현하는 재조합체 백시니아 바이러스 (vMN462) (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)를 주사하였다. 마우스에게 vMN462 (마우스당 5×10⁶ 플라그-형성유니트 (PFU))를 정맥내로 주사하였다. 7일 후에 비장을 절제하여 직접 CTL 분석시험의 검출에 사용하였다. 마우스는 또한 동일용량의 vMN462로 면역 시킨지 4주 후에 간접 CTL로 분석하였다.

유동세포계산

키메라 마우스의 생성은 H-2D^b 분자의 α3 영역에 대한 모노클론성 항체를 사용하여 FACS 분석에 의해서 확인되었다. H-2D^b 분자의 α-3 영역을 인식하는 1 ㎍/㎖의 마우스 모노클론성 항체 28-14-8s (IgG2a 아이소타입 (isotype))(Dr. J. Frelinger, Chapel Hill, NC에 의해 제공)를 개개 마우스로부터 분리된 PBMC (10×10⁵)에 가하였다. 데이타는 셀퀘스트 (CELLQuest™) 데이타수집 및 소프트웨어 (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA)를 사용한 FACScan에 의해서 분석하였다.

근육세포 상에서의 면역조직화학적 분석시험

면역시킨 다리근육을 CD80, CD86 및 외피단백질의 생체내 발현에 관하여 면역조직화학적으로 검사하였다. 마우스의 사두근을 50 ㎎의 pCEnv + pCD80, pCEnv + pCD86, 또는 대조용 벡터로 접종하였다. 접종한지 7일 후에, 마우스를 희생시키고 사두근을 분리하였다. 그후, 신선한 근육조직을 O.C.T. 화합물 (Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA) 중에서 동결시켰다. 라이카 (Leica) 1800 저온조 (Leica Inc., Deerfield, IL)를 사용하여 4 미크론의 동결된 절편을 제조하였다. 절편을 프로브온 플러스 슬라이드 (ProbeOn Plus slides; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) 상에 배치시켰다. 슬라이드를 아세톤 중에 고정시키고 1.5% 염소혈청 (Vector Labs, Burlingame, CA)으로 차단시켰다. 공동-발현을 검출하기 위하 여 슬라이드를 28℃에서 12시간 동안, 1:5로 희석된 FITC-컨쥬게이트된 안티-CD80 또는 안티-CD86 항체 (PharMingen, San Diego, CA)와 함께 1:20으로 희석된 비오티닐화된-α-gp120 항체 (Immuno Diagnostics, Bedford MA)와 배양하였다. 그후, 슬라이드를 PBS 중에서 1:400의 비로 스트렙타비딘 텍사스레드 (Texas Red) (NEN Life Sciences, Boston MA)와 함께 실온에서 30분 동안 배양하였다. 근육 내에서 림프구의 존재를 검출하기 위해서 슬라이드를 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염료로 염색하였다. 슬라이드를 40× 대물렌즈 (Nikon Fluo 40× Ph3D2)를 사용하여 니콘 옵티포트 (Nikon OPTIPHOT) 형광현미경 (Nikon Inc., Tokyo, Japan)으로 검경하였다. 슬라이드 사진은 니콘 UFX-II 및 코닥 엑타크론 (Kodak Ektachrome) 160T 슬라이드 필름에 의해서 노출을 조절하여 니콘 카메라 FX35DX를 사용하여 수득하였다.

근육내에서 림프구의 침윤은 DNA를 주사한 동물로부터 유래한 동결된 근육절편을 제조하여 분석하였으며, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염료 (Vector Labs)로 염색하였다. 슬라이드는 또한 안티-CD4 또는 안티-CD8 항체 (PharMingen)로 염색하였다.

ELISA

0.1 M 카보네이트-바이카보네이트 완충액 (pH 9.5) 중에서 2 ㎍/㎖ 농도로 희석된 50 ㎕의 재조합체 gp120 (ImmunoDiagnostics, Inc., Bedford, MA)을 4℃에서 밤새 미량역가 웰 상에 흡착시켰다. 플레이트를 PBS-0.05% 트윈 (Tween)-20으로 세척하고 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS 중의 3% BSA로 37℃에서 1시간 동안 차 단시켰다. 마우스 항혈청을 0.05% 트윈-20으로 희석하고 37℃에서 1시간 동안 배양한 다음, HRP-컨쥬게이트된 염소 안티-마우스 IgG (Sigma, St. Louis, MO)와 배양하였다. 플레이트를 세척하고 3'3'5'5' TMB (Sigma) 완충용액으로 현색시켰다. 플레이트를 450 ㎚의 흡광도로 다이나테크 (Dynatech) MR5000 플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 항체 역가는 실험 웰의 흡광도가 평균 전면역값을 적어도 2의 표준편차 까지 초과하는 혈청의 최고희석도로 정의하였다.

세포독성 T 림프구 분석시험

5시간 ⁵¹Cr 방출 CTL 분석시험은 문헌 (Kim et al., Nat. Biotech., 1997, 15: 641 및 Kim et al., J. Immunol., 1997, 158; 816)에 기술된 바와 같이 수행하였다. 정상세포 및 백시니아 감염된 EL-4 세포 (H-2^b T 세포 림프종)를 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 그들의 능력에 대하여 FACS로 분석하였다. 예상한 바와 같이, EL-4 세포는 어떤 경우에도 MHC 클래스 II 분자를 발현하지 않았다. 주효인자 (effector)를 Con A (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA)의 부재하에 RPMI 1640 (Gibco-BRL, Grand Island, NY), 10% 태자송아지혈청 (Gibco-BRL) 및 10% RAT-T-STIM으로 구성된 CTL 배양배지로 ㎖당, 5×10⁶ 세포의 비율로 2일 동안 비특이적으로 촉진시켰다. 주효인자는 또한 vMN462로 감염된 EL-4 세포를 0.1% 글루타르알데히드로 고정시켜 추가로 4일 동안 특이적으로 촉진시켰다. 모든 CTL 실험을 위한 특이표적의 제조는 EL-4 세포를 vMN462로 감염시킴으로써 수행되었다. 백시니아 바이러스 및 DNA 면역실험을 위한 비특이적 대조군으로, 각각 비감염 EL-4 세 포 및 WR 백시니아 바이러스로 감염시킨 EL-4 세포 (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)를 사용하였다. 표준 크롬방출 분석시험은 표적세포를 100 μCi/㎖ Na₂ ⁵¹CrO₄로 2시간 동안 표지하고 37℃에서 5시간 동안 주효세포와 함께 배양하는데 사용함으로써 수행되었다. CTL 용해는 50:1 내지 12.5:1 범위의 주효인자:표적 (E:T) 비에서 측정하였다. 상등액을 수거하여 LKB 클리니감마 (CliniGamma) 감마-계수기 상에서 계수하였다. 특이용해율은 하기 수학식 1로부터 구하였다:

최대방출은 10% 트리톤 X-100 함유 매질중에서 표적세포의 용해에 의해서 결정하였다. '자발적 방출' 계수에 대한 값이 '최대방출'의 20%를 초과하는 경우에 분석시험은 유효한 것으로 간주되지 않았다. 표적의 특이용해를 계산하기 위해서는 특이적 (vMN462 감염된) 표적의 용해율로부터 비특이적 (WR 감염된) 표적의 용해율을 공제하였다. 직접 CTL 분석시험은 주효세포 (특이적도 비특이적도 아님)를 시험관내 촉진시키지 않는 것을 제외하고는 상술한 바와 같이 수행하였다.

결과

상호 β ₂ m 녹아웃 키메라 마우스에서 기능적 MHC 클래스 I 분자의 확인

β₂m의 발현은 감염성 병원체에 대한 보호적 세포독성 면역반응을 생성시키 는데 중요한 역할을 수행하는 MHC 클래스 I 분자를 세포-표면 발현시키는데 필요하다. 이들 분자는 CD8⁺ 세포독성 림프구에 대해 사이토졸에서 합성된 외래항원으로부터 유래하는 짧은 펩타이드 단편을 제시한다. 본 발명자들은 동일한 일배체형 (haplotype) (H-2^b)의 상호 골수키메라의 생성을 위해서 정상적인 C57B1/6J (β₂m^+/+) 동물과 함께 β₂m 녹아웃 유전자 (β₂m^-/-)에 대해 동형접합성인 C57B1/6J-B2m^tm/Unc마우스를 이용하였다.

β₂m^+/+ 및 β₂m^-/- 동물 모두를 상호 골수이식을 위해서 사용하였다. β₂m^-/- → β₂m^+/+ 마우스는 MHC 클래스 I 분자의 발현이 없는 골수 유래하는 APCs 및 MHC 클래스 I 분자 발현이 있는 근육세포를 갖는다. β₂m^+/+ →β₂m^-/- 키메라 마우스는 MHC 클래스 I-양성 골수 유래하는 APCs 및 MHC 클래스 I-음성 근육세포를 갖는다. 각각의 마우스에게는 포스페이트 완충식염수 (PBS) 중에서 제제화된 DNA 구조물 (pCEnv, pCD80 또는 pCD86) 및 0.25% 부피바카인-HCl 각각 50 ㎍ 씩을 3회 근육내 주사하였다 (2주 간격).

골수이식한 후에, 키메라 마우스의 생성은 H-2D^b 분자의 α3 영역에 대한 모노클론성 항체를 사용하여 FACS 분석에 의해서 확인되었다. 이들 동물의 키메라형성은 3개월에 완료되었다. 수득한 키메라 마우스는 근육세포 및 APCs의 표면 상에 서 MHC 클래스 I 분자의 상이한 발현을 나타내었다 (도 1). β₂m^-/- →β₂m^+/+ 마우스는 MHC 클래스 I 분자 발현이 없는 골수 유래한 APCs (공여체) 및 MHC 클래스 I 분자 발현이 있는 근육세포 (수용체)를 보유하였다. 반대로, β₂m^+/+ →β₂m^-/- 키메라 마우스는 MHC 클래스 I 양성 골수 유래하는 APCs 및 MHC 클래스 I-음성 근육세포를 보유하였다. 몇개의 보고서에서는 낮은 레벨 - 즉, FACS 감수성의 레벨 이하 -의 α-쇄는 실제로 β₂m^-/- 세포의 표면 상에서 발현될 수 있고, 이들 α-쇄는 다시 유리 β₂m을 결합시켜 동족성으로 CD8⁺ T-세포에 대해 외래펩타이드를 제시할 수 있다고 시사하였다. 한편, MHC 클래스 I⁺ 흉선상피세포를 갖지 않는 β₂m^+/+ →β₂m^-/- 키메라 마우스는 T 세포 분화중에 기능적 CD8⁺ CTLs를 생성할 수 없다. MHC 클래스 I⁺ 골수세포에 의한 이들 림프구의 양성 선택도 입증되었다. 실제로, β₂m^-/-→β₂m^+/+ 및 β₂m^+/+ →β₂m^-/- 키메라는 둘다 유의적인 수의 CD4 및 CD8 세포를 생성한 것으로 나타났다. 그러나, 항-바이러스성 CD8⁺ CTL 면역반응을 생성시키는 상호 키메라 마우스의 능력을 조사하도록 결정하였다. 정상적인 C57B1/6 (β₂m^+/+) 및 β₂m^-/- 녹아웃 마우스 및 β₂m^-/- →β₂m^+/+ 및 β₂m^+/+ →β₂m^-/- 키메라 마우스를 재조합체 백시니아 바이러스 (vMN462)로 면역시켰다. 이어서, 이들 동물에서 생성된 항-바이러스성 CD8⁺ CTL 면역반응을 분석하였다. 도 2에서 보는 바와 같이, C57B1/6 및 β₂m^+/+ →β₂m^-/- 마우스는 둘다 일차적 (직접적) 및 이차적 (간접적) CD8⁺ CTL 반응을 생성하였다. C57B1/6 마우스에서의 CTL 반응이 β₂m^+/+ →β₂m^-/- 키메라에서의 반응보다 더 강력하였으며, 이들 결과는 더 이전의 관찰결과와 일치하는 것이다. 반대로, 항-바이러스성 CD8⁺ CTL 반응은 β₂m^-/- 녹아웃 또는 β₂m^-/-→β₂m^+/+ 키메라 마우스에서 관찰되지 않았다. 따라서, 이들 결과는 정상 및 β₂m-녹아웃 마우스 사이의 키메라가 DNA 면역화에 따른 MHC 클래스 I 제한된 T-세포 반응에서 근육세포의 역할을 검사하기 위한 완전한 모델을 제공하는 것임을 입증하는 것이다.

근육세포 상에서 공자극성 분자와 바이러스성 단백질의 공동-발현

CD80 및 CD86 공자극성 분자에 대해 코드화된 플라스미드를 마우스에게 근육내 주사하여 유사한 형질감염 효율로 근육내에서 CD80 및 CD86 분자의 발현을 유도하였다. 본 발명자들은 또한, 두개의 발현구조물 (HIV-1 외피단백질을 코드화한 것 및 공자극성 분자를 코드화한 것)의 공동-송달이 동일한 세포에서 이들 단백질의 공동-발현을 야기시키는지 여부를 조사하였다. β₂m^+/+ 마우스는 HIV-1_MN 외피단 백질을 발현하는 DNA 백신 (pCEnv) 및 CD80 또는 CD86 유전자를 코드화한 플라스미드 (pCD80 또는 pCD86) 또는 대조용 플라스미드 (pCDNA3)로 공동-면역시켰다. 주사한 다리근육에서 CD80, CD86 및 외피단백질의 발현은 면역조직화학적으로 검사하였다. 동결된 근육절편은 DNA 주사한 동물로부터 제조하였으며, FITC-표지된 (녹색) 안티-CD80 또는 안티-CD86 항체 및 텍사스레드-표지된 (적색) 안티-gp120 항체로 염색하였다. pCEnv + pCD80으로 면역시킨 다리로부터의 슬라이드는 안티-CD80 또는 안티-CD80 및 안티-gp120 항체로 염색하였다. pCEnv + pCD86으로 면역시킨 다리로부터의 슬라이드는 안티-CD86 또는 안티-CD86 및 안티-gp120 항체로 염색하였다. pCDNA3 (대조용 벡터)으로 면역시킨 다리로부터의 슬라이드는 안티-CD80 및 안티-CD86 항체로, 또는 안티-CD80, 안티-CD86 및 안티-gp120 항체로 염색하였다. pCEnv + pCD80 또는 pCEnv + pCD86에 의한 공동-면역은 근육세포 내에서 이들 단백질의 공동-발현을 유도하였다. pCEnv + pCD80 및 pCEnv + pCD86을 주사한 각각의 마우스로부터 외피 및 CD80, 또는 외피 및 CD86 각각의 공동-발현 레벨은 유사하였다. 반대로, 대조군의 다리는 이들 단백질의 발현을 나타내지 않았다.

H-2D ^b 양성 비 - 조혈세포는 MHC 클래스 I 제한된 CTLs 의 전구체를 활성화시키도록 조작될 수 있다.

체액성 및 세포성 면역반응 둘다를 바이러스성 항원 및 공자극성 분자를 코드화한 플라스미드로 면역시킨 키메라 및 대조용 마우스에서 분석하였다. 면역시키기 전 및 후에 실험마우스로부터 수집한 혈청 내에서 체액성 면역반응을 분석하 였다. 이들 혈청 샘플은 ELISA에 의해서 외피단백질 (gp120)에 대한 반응성에 대하여 분석하였다. 표 1에서 보는 바와 같이, HIV-1 외피 특이적 체액성 반응은 키메라의 두가지 형태 모두에서 생성되었다. β₂m^-/- 마우스의 체액성 면역반응은 키메라 마우스의 반응과 유사하였다. 이들 결과는, 항원-특이적 체액성 면역반응이 플라스미드 DNA 면역시킨 후에 β₂m 녹아웃 마우스에서 생성될 수 있었으며, 이 모델시스템에서 단백질 면역에 따라 이미 보고된 결과 (Raulet, Advances in Immunology, 1993, 55:381-421, 이것은 그대로 참고로 포함되어 있다)와 일치한다는 것을 입증하는 것이다. 또한, 이들 결과는 정상적인 BALB/c 마우스에서 이전에 관찰된 것과 같이 (Kim et al., Nature Biot., 1997, 15:641-645, 이것은 그대로 참고로 포함되어 있다), pCD80 또는 pCD86과의 상호 키메라의 공동-면역이 pCEnv 면역에 의해 유도된 특이항체 종말점 역가에 대해 효과가 거의 없음을 시사하는 것이다.

pCD80 또는 pCD86에 의한 공동-면역으로 인한 HIV-1 외피-특이적 항체반응 (그룹당 4마리의 마우스)

키메라 마우스	면역화 그룹	면역후 3주	면역후 7주
β2m-/- → β2m+/+	pCEnv	1024	1024
β2m-/- → β2m+/+	pCEnv + pCD80	2048	512
β2m-/- → β2m+/+	pCEnv + pCD86	2048	1024
β2m+/+ → β2m-/-	pCEnv	1024	1024
β2m+/+ → β2m-/-	pCEnv + pCD80	1024	512
β2m+/+ → β2m-/-	pCEnv + pCD86	1024	512

마우스 혈청은 HIV-1 gp120 단백질을 사용하는 ELISA를 이용해서 외피-특이적 항체반응에 대하여 시험하였다. 계열희석도는 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024, 1:2048 및 1:4096이었다. ELISA에 대한 배경흡광도 레벨은 <0.015였다. 이들 실험은 2회 반복하였으며, 유사한 결과를 수득하였다.

상호 키메라 및 β₂m^-/- 동물에서 CTL 반응의 생성도 또한 평가되었다. CD80 유전자가 아닌 CD86에 의한 공동-면역이 MHC 정상동물에서 MHC-클래스 I 제한된 항-바이러스성 CTLs의 현저한 증진을 야기시킨다는 것은 더 이전에 입증되었다 (Kim et al., Nature Biot., 1997, 15:641-645, 이것은 그대로 참고로 포함되어 있다). MHC-II 클래스 분자를 발현하지 않는 표적으로 EL-4 T 림프종 세포를 사용하여 MHC 클래스 I-제한된 CD8⁺ CTL 반응을 분석하였다. 표적의 특이용해를 계산하기 위해서는 특이적 (vMN462 감염된) 표적의 용해율로부터 비특이적 (WR 감염된) 표적의 용해율을 공제하였다. 특이적 사멸의 배경레벨은 대조용 플라스미드, pCEnv, pCEnv + pCD80 또는 pCEnv + pCD86으로 면역시킨 β₂m^-/- 대조군 및 β₂m^+/+ →β₂m^-/- 키메라 마우스로부터 관찰되었다 (도 3). 그러나, pCEnv 또는 pCEnv + pCD80이 아니라 pCEnv + pCD86으로 공동-면역시킨 β₂m^-/- →β₂m^+/+ 마우스는 높은 레벨의 외피-특이적 CTL을 야기시켰다 (50:1의 E:T 비에서 37%). CTL 유도의 효능을 더 검사하기 위해서, β₂m^-/- →β₂m^+/+ 키메라 마우스에서 직접적인 비자극된 CTL 반응을 유도하는 능력을 분석하였다 (도 4). pCEnv로 면역시킨 마우스는 특이적 사멸을 유도하지 않았다. 반대로, 23%의 특이용해율은 pCEnv + pCD86 면역그룹으로부터 50:1의 E:T 비에서 관찰되었으며, 12.5:1의 E:T 비에서는 11%로 역가가 측정되었다. β₂m^-/- →β₂m^+/+ 마우스에서 골수 유래한 세포는 실질적인 항-바이러스성 CD8⁺ CTLs를 생성하지 못하기 때문에 (도 2), 이들 결과는 비-조혈세포 상에서 HIV 외피 및 CD86 분자의 공동-발현이 이들이 안티-HIV-1 특이적 CTL 반응을 유발하도록 할 수 있음을 시사하는 것이다. 또한, 면역학적으로 정상인 β₂m^+/+ →β₂m^-/- 키메라로부터 얻은 결과 (도 2)는 CTL 증량에 대한 CD86 분자의 증진효과는 작은 수의 APCs의 전환을 통해서는 관찰되지 않으며, 오히려 비-조혈세포 상에서 더 우세함을 시사한다.

면역세포에 의해서 방출된 다양한 사이토킨의 레벨은 면역반응의 방향 및 크기를 반영하는 것이다. IFN-γ 및 IL-4 사이토킨은 CD4⁺ 뿐만 아니라 CD8⁺ T 세포에 의해서도 생산된다. IFN-γ는 T 세포-매개된 세포독성 면역반응의 조절에 복잡하게 연관되는 반면에, IL-4는 B-세포 매개된 면역반응에서 우세한 역할을 한다. 따라서, 본 발명자들의 CTL 분석 이외에도 상등액을 CTL 분석시험을 위해서 시험관내에서 자극된 주효세포로부터 수집하고, 이들을 IFN-γ 및 IL-4의 방출에 대하여 시험하였다. 도 5에서 보는 바와 같이, IFN-γ 방출의 레벨은 도 3에 제시된 CTL 반응의 레벨에 상응하였다. 실제로, pCEnv + pCD86 (45 ng/㎖)로 면역시킨 β₂m^-/- →β₂m^+/+ 마우스로부터 방출된 INF-γ의 레벨은 다른 그룹에서의 레벨의 적어도 3배였다. 한편, 모든 그룹으로부터 방출된 IL-4의 레벨은 유사하였다. 따라서, IFN-γ 방출 데이타는 비-조혈세포 상에서의 CD86 발현이 MHC 클래스 I 발현과 관련하여 우선적으로 사이토킨 유도를 유발시킬 수 있었다는 것을 지지하며, 이것은 비-전문적 APCs에 의한 직접적인 TCR 공동-연결반응을 지지하는 것이다.

CD86 의 발현은 면역시킨 동물의 근육내로 림프구의 침윤을 유도하였다.

CD86으로 형질감염시킨 비-골수세포가 T 세포를 직접적으로 유도하는 능력을 더 분명하게 밝히기 위하여, 본 발명자들은 생체내에서 형질감염된 근육세포에 대한 T 세포 연결의 직접적인 증거를 조사하였다. 면역후 7일 째에 대조군 또는 pCEnv + pCD80 면역시킨 마우스의 근육에서 보다 pCEnv + pCD86으로 면역시킨 마우스의 근육내로 림프구가 훨씬 더 많이 침윤되는 것으로 관찰되었다. 다수의 침윤성 림프구가 항원 및 CD86 발현의 부위에서 관찰되었으며, 제시하는 근육세포를 공격하는 것으로 보인다. 슬라이드를 T 세포에 대하여 면역조직화학적으로 염색하였을 때, 침윤성 T 세포는 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포를 모두 포함하는 것으로 관찰되었다 (도 6). 면역시킨 근육에서 림프구 침윤은 1개월 이내에 깨끗하게 되는 것으로 관찰되었으며, 이것은 cDNA 발현에 이은 항원 발현의 기간과 상관관계가 있다. 동물들은 비-백신접종된 동물과 비교하여 이러한 침습의 명확한 표현형적 영향을 나타내지 않았다. 추후의 시점에서 근육절편의 검사로 림프구 침습이 없이 정상적인 근육 표현형이 입증되었다. 림프구 침윤의 초기단계 중에 조차도 마우스가 정상적으로 행동하였다는 것은 흥미로운 일이다. 이들 결과는 CD80 분자가 아닌 CD86 및 MHC 클래스 I과 함께 바이러스성 항원을 발현하도록 조작된 근육세포가 림프구를 효과적으로 유인하여 그들과 직접적으로 상호작용함을 시사하는 것이다. 이 데이타는 유인 그자체가 CD80의 기능은 아니라는 것을 명확하게 나타내는 것이다.

피코르나바이러스과 (Picornavirus Family)
속	리노바이러스 (Rhinoviruses): (의학적) 감기의 ~50% 증례의 원인임 엔테로바이러스 (Enteroviruses): (의학적) 폴리오바이러스, 콕사키바이러스, 에코바이러스, 및 간염 A 바이러스와 같은 인간의 엔테로바이러스가 포함됨. 아프토바이러스 (Apthoviruses): (수의학적) 이들은 구제역 바이러스이다.
표적항원	VP1, VP2, VP3, VP4, VPG
칼시바이러스과 (Calcivirus Family)
속	바이러스의 노르워크 그룹 (Norwalk Group): (의학적) 이들 바이러스는 유행성 위장염의 중요한 원인균이다.
토가바이러스과 (Togavirus Family)
속	알파바이러스 (Alphaviruses): (의학적 및 수의학적) 예로는 신드비스 바이러 스 (Sindbis virus), 로즈리버 (RossRiver) 바이러스 및 동부마 및 서부마 뇌염이 포함됨. 루비바이러스 (Rubivirus): (의학적) 루벨라 (Rubella) 바이러스
플라리비리두과 (Flariviridue Family)
	예: (의학적) 뎅그열, 황열, 일본뇌염, 세인트루이스 뇌염 및 진드기매개 뇌염 바이러스가 포함됨.
간염 C 바이러스
	(의학적) 이들 바이러스는 아직 과가 지정되지는 않았지만 토가바이러스나 플라비바이러스인 것으로 믿어진다. 가장 유사한 것은 토가바이러스과이다.
코로나바이러스과 (Coronavirus Family)
	(의학적 및 수의학) 전염성 기관지염 바이러스 (가금) 돼지전파성 위장계 바이러스 (돼지) 돼지 혈구응집성 뇌척수염 바이러스 (돼지) 고양이 전염성 복막염 바이러스 (고양이) 고양이 장내 코로나바이러스 (enteric coronavirus) (고양이) 개 코로나바이러스 (개) 인간 호흡기 코로나바이러스는 약 40 증례의 감기를 유발시킨다. EX, 224E, 0C43 주 - 코로나바이러스는 비-A, B 또는 C형 간염을 야기시킬 수 있다.
표적항원	E1 - 또한 M 또는 매트릭스 (matrix) 단백질이라고도 불린다. E2 - 또한 S 또는 스파이크 (Spike) 단백질이라고도 불린다. E3 - 또한 HE 또는 헤마글루티닌-엘테로즈 당단백질이라고도 불린다. (모든 코로나바이러스에 존재하지는 않음) N - 뉴클레오캅시드
라브도바이러스과 (Rhabdovirus Family)
속	베시큘로바이러스 (Vesiculovirus): 수포성 구내염바이러스 리사바이러스 (Lyssavirus): (의학적 및 수의학) 광견병
표적항원	G 단백질 N 단백질
필로비리두과 (Filoviridue Family)
	(의학적) 마르부르그 (Marburg) 및 에볼라 (Ebola) 바이러스와 같은 출혈열 바이러스

파라믹소바이러스과 (Paramyxovirus Family)
속	파라인플루엔자 (Parainfluenza) 바이러스 타입 1 파라인플루엔자 바이러스 타입 3 소 파라인플루엔자 바이러스 타입 3 루불라바이러스 (Rubulavirus): (의학적 및 수의학) 유행성이하선염 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 타입 2, 파라인플루엔자 바이러스 타입 4, 뉴켓슬병 (NewCastle disease) 바이러스 (닭에서 중요한 병원체) 모르빌리바이러스 (Morbillivirus): (의학적 및 수의학) 홍역, 개 디스템퍼 (canine distemper) 뉴몬바이러스 (Pneumonvirus): (의학적 및 수의학) 호흡기합포체 바이러스
오르토믹소바이러스과 (Orthomyxovirus Family)
	(의학적) 인플루엔자 바이러스
부니아바이러스과 (Bunyavirus Family)
속	부니아바이러스: (의학적) 캘리포니아 뇌염, 라크로스 (La Crosse) 플레보바이러스 (Phlebovirus): (의학적) 리프트계곡열 (Rift Valley Fever) 한타바이러스 (Hantavirus): 푸레말라 (Puremala)는 헤마하진 (hemahagin) 열바이러스이다. 나이로바이러스 (Nairovirus): (수의학) 나이로비양병 (Nairobi sheep disease) 또한, 다수의 비지정된 분가바이러스 (bungavirus)
아레나바이러스과 (Arenavirus Family)
	(의학적) LCM, 라사열 (Lassa fever) 바이러스
레오바이러스과 (Reovirus Family)
속	레오바이러스: 존재가능한 인간 병원체 로타바이러스 (Rotavirus): 소아에서 급성위장염 오르비바이러스 (Orbiviruses): (의학적 및 수의학) 컬티바이러스 (Cultivirus): 콜로라도진드기열 (Colorado Tick fever), 레봄보 (Lebombo) (인간) 말 뇌증, 청설병
레트로바이러스과 (Retrovirus Family)
아과	온코리비리날 (Oncorivirinal): (수의학) (의학적) 고양이 백혈병 바이러스, HTLV1 및 HTLVII 렌티비리날 (Lentivirinal): (의학적 및 수의학) HIV, 고양이 면역결핍증 바이러스, 말 전염성빈혈 스푸마비리날 (Spumavirinal)
파포바바이러스과 (Papovavirus Family)
아과	폴리오마바이러스 (Polyomaviruses): (의학적) BKU 및 JCU 바이러스
아과	파필로마바이러스 (Papillomavirus): (의학적) 암, 또는 유두종의 악성진행과 련된 다수의 바이러스 타입
아데노바이러스 (Adenovirus) (의학적)
	EX AD7, ARD., O.B. - 호흡기병을 야기시킴 - 275와 같은 일부의 아데노바이 러스는 장염을 야기시킨다.
파르보바이러스과 (Parvovirus Family) (수의학)
	고양이 파르보바이러스: 고양이 장염을 야기시킴 고양이 판로이코페니아바이러스 (panleucopeniavirus) 개 파르보바이러스 돼지 파르보바이러스

헤르페스바이러스과 (Herpesvirus Family)
아과	알파헤르페스비리두 (alphaherpesviridue)
속	심플렉스바이러스 (Simplexvirus) (의학적) HSVI, HSVII 바리셀로바이러스 (Varicellovirus): (의학적 - 수의학) 가성광견병 - 수두대상포진
아과	베타헤르페스비리두 (betaherpesviridue)
속	사이토메갈로바이러스 (Cytomegalovirus) (의학적) HCMV 뮤로메갈로바이러스 (Muromegalovirus)
아과	감마헤르페스비리두 (Gammaherpesviridue)
속	림포크립토바이러스 (Lymphocryptovirus) (의학적) EBV - (버키트 림프종 (Burkitts lympho)) 라디노바이러스 (Rhadinovirus)
폭스바이러스과 (Poxvirus Family)
아과	코르도폭스비리두 (Chordopoxviridue) (의학적 - 수의학)
속	오르토폭스바이러스 (Orthopoxvirus) 바리올라 (Variola) (천연두) 백시니아 (Vaccinia) (우두) 파라폭시바이러스 (Parapoxivirus) - 수의학 아우이폭스바이러스 (Auipoxvirus) - 수의학 카프리폭스바이러스 (Capripoxvirus) 레포리폭스바이러스 (Leporipoxvirus) 수이폭스바이러스 (Suipoxvirus)
아과	엔테모폭스비리두 (Entemopoxviridue)
헤파드나바이러스과 (Hepadnavirus Family)
	간염 B 바이러스
미분류	간염 델타 바이러스

세균성 병원체 병원성 그람-양성구균에는 뉴모코칼 (pneumococcal), 스타필로코칼 (staphyloco-ccal) 및 스트렙토코칼 (streptococcal)이 포함된다. 병원성 그람-음성구균에는 메닝고코칼 (meningococcal) 및 고노코칼 (gonococcal)이 포함된다. 병원성 장 그람-음성간균에는 엔테로박테리아세 (enterobacteriaceae), 슈도모나스 (pseudomonas), 아시네토박테리아 (acinetobacteria) 및 에이케넬라 (eikenella), 살모넬라 (salmonella), 시겔로시스 (shigellosis), 헤모필루스 (hemophilus), 모락셀라 (moraxella), 연성하감 (chancroid), 브루셀로시스 (brucellosis), 야토병 (tularemia), 예르시니아 (yersinia) (pasteurella), 스트렙토바실루스 모닐리포르미스 (streptobacillus moniliformis) 및 스피릴룸 (spirillum), 리스테리아 모노사이토게네스 (listeria monocytogenes), 에리시페로트릭스 루시오패시에 (erysipelothrix rhusiopathiae), 디프테리아 (diphtheria), 콜레라 (cholera), 탄저병 (anthrax), 도노바니아증 (donovanosis) (서혜부육아종), 및 바르토넬라증 (bartonellosis)가 포함된다. 병원성 혐기성 세균에는 파상풍, 보툴리즘 (botulism), 다른 클로스트리디아 (clostridia), 결핵, 나병, 및 그밖의 다른 마이코박테리아 (mycobacteria)가 포함된다. 병원성 스피로키타성 질병에는 매독, 트레포네마증 (treponematoses), 딸기종 (yaws), 열대백반성피부병 (pinta) 및 지방유행성매독 (endemic syphilis) 및 렙토스피라병이 포함된다. 더 고등의 병원체 세균 및 병원성 진균에 의해서 야기된 그밖의 다른 감염증에는 방선균증 (actinomycosis), 노카르디아증 (nocardiosis), 효모균증 (cryptococcosis), 분아진균증 (blastomycosis), 히스토플라즈마증 (histoplasmosis) 및 콕시디오이디즈증 (coccidiodomycosis),칸디다증 (candidiasis), 아스페르질러스증 (aspergillosis) 및 모균증 (mucormycosis), 스포로트리쿰증 (sporotrichosis), 파라콕시디오이드진균증 (para-coccidiodomycosis), 페트리엘리디오시스 (petriellidiosis), 토룰롭소시스증 (torulopsosis), 진균종 (mycetoma) 및 크로모마이코시스 (chromomycosis) 및 피부사상균증 (dermatophytosis)이 포함된다. 리케치아성 감염에는 리케치알 및 리케치아증이 포함된다, 마이코플라즈마 및 클라미디아 감염증의 예로는 마이코플라즈마 뉴모니아에 (mycoplasma pneumoniae), 림포그래뉼로마 베네레움 (lymphogranuloma venereum), 앵무병 (psittacosis) 및 주산기 클라미디아성 감염증이 포함된다.

병원성 진핵세포 병원성 원생동물 및 기생충 및 이에 의한 감염증에는 아메바증 (amebiasis), 말라리아, 레슈마니아증 (leishmaniasis), 트리파노소마증 (trypanosomiasis), 톡소플라즈마증 (toxoplasmosis), 뉴모시스티스 카리니 (pneumocystis carinii), 바베시아병 (babesiosis), 지알디아증 (giardiasis), 선모충증 (trichinosis), 사상충증 (filariasis), 주혈흡충증 (schistosomiasis), 선충 (nematodes), 흡충 (trematodes 또는 flukes), 및 조충 (cestode) (촌충) 감염이 포함된다.

본 발명은 개체에서 면역원에 대한 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 주조직적합성 복합체 항원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 핵산분자를 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.

Claims (1)

1. 조절요소에 작동가능하게 연결된 B7.2 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열 및 사멸시그날 또는 독소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드.

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