KR20070039981A - Ｒａｇｅ 융합 단백질 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본원에는 제2의 비-RAGE 폴리펩티드와 연결된 RAGE 폴리펩티드 서열을 포함하는 RAGE 융합 단백질이 기재되어 있다. 이러한 RAGE 융합 단백질은 RAGE 리간드 결합 부위를 포함하는 RAGE 폴리펩티드 도메인과, 면역글로불린 CH2 도메인에 직접적으로 연결된 도메인간 링커를 활용할 수 있다. 상기 융합 단백질은 RAGE 리간드에 대한 특이적인 고 친화도 결합을 제공할 수 있다. 또한, 본원에는 RAGE-매개된 병리 상태에 대한 치료제로서의 RAGE 융합 단백질의 용도가 기재되어 있다.
최종당화산물에 대한 수용체 (RAGE), RAGE 융합 단백질, 도메인간 링커

Description

ＲＡＧＥ 융합 단백질 및 이의 사용 방법 {RAGE Fusion Proteins and Methods of Use}
관련 출원에 대한 참조
본 출원은 2004년 8월 3일자로 출원된 미국 가특허출원 제60/598,555호로부터 35 USC 119(e) 하에 우선권을 청구한다. 미국 가특허출원 제60/598,555호의 기술 내용은 그 전문이 본원에 참조로 도입된다.
본 발명은 최종당화산물에 대한 수용체 (RAGE)의 조절에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질, 이러한 융합 단백질의 제조 방법, 및 RAGE에 의거한 장애를 치료하기 위한 상기 단백질의 용도에 관해 기술하고 있다.
단백질 또는 지질을 알도스 당과 함께 항온 배양하면, 단백질 상의 아미노기가 비효소적으로 당화 및 산화되어 아마도리 (Amadori) 부가물이 형성된다. 시간이 지남에 따라, 이러한 부가물은 기타 단백질과 함께 부가의 재배열, 탈수 및 가교 결합을 진행하여 최종당화산물 (AGE)로 공지된 복합체를 형성한다. AGE의 형성을 증진시키는 요인으로는 단백질 전환의 지연 [예를 들어, 아밀로이드증 (amyloidoses)에서와 같음], 리신 함량이 높은 거대 분자의 축적, 및 높은 혈당치 가 있다 (예를 들어, 당뇨병에서와 같음) [참고: Hori et al., J. Biol . Chem. 270: 25752-761, (1995)]. AGE는 당뇨병 및 정상적인 노화와 연관된 합병증을 포함한 각종 장애에 밀접한 영향을 끼쳐 왔다.
AGE는 단구, 대식 세포, 미소혈관계의 내피 세포, 평활근 세포, 혈관사이 세포, 및 신경원 상의 세포 표면 수용체에 대한 특이적이고도 포화 가능한 결합을 나타낸다. 최종당화산물에 대한 수용체 (RAGE)는 면역글로불린 초유전자 분자 집단의 한 구성원이다. RAGE의 세포외 (N-말단) 도메인에는 3가지 면역글로불린-유형 영역이 포함된다: 1개의 V (가변) 유형 도메인에 이어 2개의 C-유형 (불변) 도메인 [참고: Neeper et al., J. Biol. Chem., 267:14998-15004 (1992); Schmidt et al., Circ. (Suppl.) 96#194 (1997)]. 이러한 세포외 도메인 다음에는 단일 막관통 도메인과, 고도로 하전된 짧은 세포질내 꼬리 부분이 존재한다. N-말단의 세포외 도메인은 RAGE를 단백질 분해시키거나 또는 분자 생물학적 접근법에 의해 V 도메인과 C 도메인으로 구성된 가용성 RAGE (sRAGE)를 생성시켜 단리할 수 있다.
RAGE는 백혈구, 신경원, 미세신경교 세포 및 혈관 내피를 포함한 여러 세포 유형 상에서 발현된다 [참고: 예를 들어, Hori et al., J. Biol. Chem., 270:25752-761 (1995)]. RAGE 수준 상승이 노화 조직 [참고: Schleicher et al., J. Clin. Invest., 99 (3): 457-468 (1997)], 및 당뇨병성 망막, 혈관계 및 신장 [참고: Schmidt et al., Nature Med., 1:1002-1004 (1995)]에서 발견되기도 한다.
AGE 이외에도, 기타 화합물이 RAGE와 결합하고 이를 조절할 수 있다. RAGE는 기능적, 구조적으로 다양한 여러 가지 리간드, 예를 들어 아밀로이드 베타 (A β), 혈청 아밀로이드 A (SAA), 최종당화산물 (AGE), SlOO [칼그라눌린 (Calgranulin) 계열의 전-염증성 구성원], 카복시메틸 리신 (CML), 암포테린 및 CD11b/D18과 결합한다 [참고: Bucciarelli et al., Cell Mol. Life Sci., 59: 1117-128 (2002); Chavakis et al., Microbes Infect., 6:1219-1225 (2004); Kokkola et al., Scand. J. Immunol., 61:1-9 (2005); Schmidt et al., J. Clin. Invest., 108:949-955 (2001); Rocken et al., Am. J. Pathol, 162:1213-1220 (2003)].
AGE, SlOO/칼그라눌린, β-아밀로이드, CML (Nε-카복시메틸 리신) 및 암포테린 등의 리간드를 RAGE에 결합시키는 것이 각종 유전자의 발현을 변형시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이때, 이들 상호 작용은 신호 변환 기전, 예를 들어 p38 활성화, p21ras, MAP 키나제, Erkl-2 인산화, 및 염증성 신호전달의 전사적 매개인자인 NF-κB의 활성화를 개시시킬 수 있다 [참고: Yeh et al., Diabetes, 50:1495-1504 (2001)]. 예를 들어, 많은 세포 유형에서는 RAGE와 그의 리간드 간의 상호 작용으로 인해 산화적 스트레스가 발생할 수 있고, 이로 인해 자유 라디칼 민감성 전사 인자 NF-κB가 활성화되고, NF-κB 조절된 유전자, 예를 들어 사이토킨 IL-1β 및 TNF-α가 활성화된다. 더우기, RAGE 발현은 NF-κB를 통하여 상향 조절되고, 염증 또는 산화적 스트레스 부위에서 발현 증가를 나타낸다 [참고: Tanaka et al., J. Biol. Chem., 275:25781-25790 (2000)]. 따라서, 리간드 결합에 의해 개시된 양성 피드백 루프에 의해, 상행성이면서 종종 해로운 나선형이 더욱 자극될 수도 있다.
상이한 조직과 기관에서 RAGE를 활성화시키면, 수 많은 병리생리적 결과가 초래될 수 있다. RAGE는 다음을 포함한 각종 질환에 밀접한 영향을 끼쳐 왔다: 급성 및 만성 염증 [참고: Hofmann et al., Cell 97:889-901 (1999)], 당뇨병 말기 합병증 발병, 예를 들어 혈관 투과성 증가 [참고: Wautier et al., J. Clin. Invest., 97:238-243 (1995)], 신장애 [참고: Teillet et al., J. Am. Soc. Nephrol., 11:1488-1497 (2000)], 동맥경화증 [참고: Vlassara et al., The Finnish Medical Society DUODECIM, Ann. Med., 28:419-426 (1996)], 및 망막병증 [참고: Hammes et al., Diabetologia, 42:603-607 (1999)]. RAGE는 또한, 알츠하이머병 (Alzheimer's disease) [참고: Yan et al., Nature, 382:685-691 (1996)], 및 종양 침입 및 전이 [참고: Taguchi et al., Nature, 405:354-357 (2000)]에 밀접한 영향을 끼쳐 왔다.
RAGE가 광범위하게 발현되고 다양한 많은 질병 모델에서 뚜렷한 다면적 역할을 함에도 불구하고, RAGE는 정상적인 발생에 있어 필수적인 것으로 간주되지 않는다. 예를 들어, RAGE 녹아웃 (knockout) 마우스는 명백한 비정상적인 표현형을 지니고 있지 않은데, 이는 RAGE가 만성적으로 자극될 때 질병 병리에 있어 일정 역할을 할 수 있긴 하지만, RAGE를 억제하는 것이 불필요한 모든 급성 표현형에 기여하는 것으로 여겨지지는 않는다 [참고: Liliensiek et al., J. Clin. Invest., 113:1641-50 (2004)].
생리적 리간드가 RAGE와 결합하는 것을 길항시키는 것이, AGE 및 기타 RAGE 리간드의 과도한 농도로 인해 야기된 병리생리적 변화를 하향 조절할 수 있다. 내인성 리간드가 RAGE와 결합하는 것을 저하시킴으로써, RAGE-매개된 장애와 연관된 증상들을 경감시킬 수 있다. 가용성 RAGE (sRAGE)는 RAGE 리간드가 RAGE와 결합하는 것을 효과적으로 길항시킬 수 있다. 그러나, sRAGE는 생체 내에서 투여되는 경우에 반감기가 너무 짧아 한 가지 이상 장애에 대해 치료적으로 유용할 수가 없다. 따라서, AGE 및 기타 생리적 리간드가 RAGE 수용체와 결합하는 것을 길항시키는 화합물을 개발할 필요가 있는데, 이러한 화합물은 바람직한 약동학적 프로파일을 갖는다.
요약
본 발명의 양태는 RAGE 융합 단백질 및 이러한 단백질의 사용 방법을 포함한다. 본 발명은 각종 방식으로 예시될 수 있다. 본 발명의 양태는 제2의 비-RAGE 폴리펩티드와 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 포함할 수 있다. 한 양태에서는, 융합 다백질이 RAGE 리간드 결합 부위를 포함한다. 융합 단백질은 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 이러한 CH2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드와 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, RAGE 융합 단백질의 제조 방법을 포함한다. 한 양태에서는, 이러한 방법이 RAGE 폴리펩티드를 제2의 비-RAGE 폴리펩티드에 연결시키는 것을 포함한다. 한 양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 RAGE 리간드 결합 부위를 포함한다. 상기 방법은 RAGE 폴리펩티드를, 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 이러한 CH2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드에 직접적으로 연결시키는 것을 포함할 수 있다.
기타 양태에서, 본 발명은 특정 대상체에게서 RAGE-매개된 장애를 치료하기 위한 방법 및 조성물을 포함할 수 있다. 상기 방법은 본 발명의 융합 단백질을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 조성물은 제약상 허용 가능한 담체 중에 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정한 양태와 연관될 수 있는 각종 이점이 있다. 한 양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 특정 대상체에게 투여되는 경우에 대사적으로 안정적일 수 있다. 또한, 본 발명의 융합 단백질은 RAGE 리간드에 대한 고 친화도 결합을 나타낼 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 높은 나노몰 내지 낮은 마이크로몰 범위의 친화도로 RAGE 리간드와 결합한다. 생리적 RAGE 리간드와 고 친화도로 결합함으로써, 본 발명의 융합 단백질은 내인성 리간드가 RAGE와 결합하는 것을 억제시킴으로써, RAGE-매개된 질병을 개선시키기 위한 수단을 제공하는데 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 단백질은 단백질 또는 핵산 형태로 제공될 수 있다. 한 가지 예시 양태에서는, 융합 단백질을 전신 투여하여 혈관계에 유지되도록 하여, 부분적으로 RAGE에 의해 매개된 혈관성 질병을 잠재적으로 치료할 수 있다. 또 다른 예시 양태에서는, 융합 단백질을 국소 투여하여, RAGE 리간드가 해당 질병의 병리 상태에 기여하는 질병을 치료할 수 있다. 또 다른 한편, 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 구조물을 적당한 운반체, 예를 들어 바이러스 또는 있는 그대로의 (naked) DNA를 사용함으로써 특정 부위에 전달할 수 있는데, 여기서는 일시적인 국소 발현이 RAGE 리간드와 수용체 간의 상호 작용을 국소적으로 억제시킬 수 있다. 따라서, 투여는 일시적이거나 (예를 들어, 융합 단백질을 투여하는 경우와 같음) 또는 사실상 보다 영구적일 수 있다 (예를 들어, 융합 단백질을 재조합 DNA로서 투여하는 경우와 같음).
본 발명의 부가의 특징이 다음에 기술될 것이다. 본 발명이 다음의 청구의 범위, 상세한 설명 및 도면에 제시된 상세 내역으로 그 적용 분야가 제한되지 않는 다는 것을 인지해야 한다. 본 발명은 기타 양태들을 실시할 수 있고, 각종 방법으로 실시 또는 수행할 수 있다.
본 발명의 각종 특징, 국면 및 이점들은 다음 도면을 참고로 하여 보다 명백해질 것이다.
도 1은 본 발명의 대체 양태에 따르는 각종 RAGE 서열을 도시한 것이다: 패널 A, 서열 1, 인간 RAGE에 대한 아미노산 서열; 서열 2, 아미노산 1 내지 22의 신호 서열을 수반하지 않은 인간 RAGE에 대한 아미노산 서열; 패널 B, 서열 3, 아미노산 1 내지 23의 신호 서열을 수반하지 않은 인간 RAGE에 대한 아미노산 서열; 패널 C, 서열 4, 인간 sRAGE의 아미노산 서열; 서열 5, 아미노산 1 내지 22의 신호 서열을 수반하지 않은 인간 sRAGE에 대한 아미노산 서열, 및 서열 6, 아미노산 1 내지 23의 신호 서열을 수반하지 않은 인간 sRAGE에 대한 아미노산 서열; 패널 D, 서열 7, 인간 RAGE의 V-도메인을 포함하는 아미노산 서열; 서열 8, 인간 RAGE의 V- 도메인을 포함하는 또 다른 아미노산 서열; 서열 9, 인간 RAGE의 V-도메인의 N-말단 단편; 서열 10, 인간 RAGE의 V-도메인의 또 다른 N-말단 단편; 서열 11, 인간 RAGE의 아미노산 124 내지 221에 대한 아미노산 서열; 서열 12, 인간 RAGE의 아미노산 227 내지 317에 대한 아미노산 서열; 서열 13, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 123에 대한 아미노산 서열; 패널 E, 서열 14, 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 123에 대한 아미노산 서열; 서열 15, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 136에 대한 아미노산 서열; 서열 16, 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 136에 대한 아미노산 서열; 서열 17, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 226에 대한 아미노산 서열; 서열 18, 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 226에 대한 아미노산 서열; 패널 F, 서열 19, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 251에 대한 아미노산 서열; 서열 20, 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 251에 대한 아미노산 서열; 서열 21, RAGE 도메인간 링커; 서열 22, 제2의 RAGE 도메인간 링커; 서열 23, 제3의 RAGE 도메인간 링커; 서열 24, 제4의 RAGE 도메인간 링커; 패널 G, 서열 25, 인간 RAGE 아미노산 1 내지 118을 코딩하는 DNA; 서열 26, 인간 RAGE 아미노산 1 내지 123을 코딩하는 DNA; 및 서열 27, 인간 RAGE 아미노산 1 내지 136을 코딩하는 DNA; 패널 H, 서열 28, 인간 RAGE 아미노산 1 내지 230을 코딩하는 DNA; 및 서열 29, 인간 RAGE 아미노산 1 내지 251을 코딩하는 DNA; 패널 I, 서열 38, 인간 IgG의 CH2 및 CH3 도메인에 대한 부분 아미노산 서열; 서열 39, 인간 IgG의 인간 CH2 및 CH3 도메인의 일부를 코딩하는 DNA; 서열 40, 인간 IgG의 CH2 및 CH3 도메인에 대한 아미노산 서열; 패널 J, 서열 41, 인간 IgG의 인간 CH2 및 CH3 도메인을 코딩하는 DNA; 서열 42, 인간 IgG의 CH2 도메인에 대한 아미노산 서열; 서열 43, 인간 IgG의 CH3 도메인에 대한 아미노산 서열; 및 서열 44, 제5의 RAGE 도메인간 링커.
도 2는 본 발명의 양태에 따르는 RAGE 융합 단백질 (TTP-4000) 코딩 영역의 DNA 서열 (서열 30)을 도시한 것이다. 진하게 강조한 코딩 서열 1 내지 753은 RAGE N-말단 단백질 서열을 코딩하는 반면, 서열 754 내지 1386은 인간 IgG Fc (γl) 단백질 서열을 코딩한다.
도 3은 본 발명의 양태에 따르는 또 다른 RAGE 융합 단백질 (TTP-3000) 코딩 영역의 DNA 서열 (서열 31)을 도시한 것이다. 진하게 강조한 코딩 서열 1 내지 408은 RAGE N-말단 단백질 서열을 코딩하는 반면, 서열 409 내지 1041은 인간 IgG Fc (γl) 단백질 서열을 코딩한다.
도 4는 본 발명의 대체 양태에 따르는, 각각 4개 도메인 RAGE 융합 단백질을 코딩하는 아미노산 서열, 서열 32 (TTP-4000), 서열 33, 및 서열 34를 도시한 것이다. RAGE 서열이 진하게 강조되었다.
도 5는 본 발명의 대체 양태에 따르는, 각각 3개 도메인 RAGE 융합 단백질을 코딩하는 아미노산 서열, 서열 35 (TTP-3000), 서열 36, 및 서열 37을 도시한 것이다. RAGE 서열이 진하게 강조되었다.
도 6, 패널 A는 본 발명의 대체 양태에 따르는, 인간 RAGE 중의 단백질 도메인 및 인간 Ig 감마-1 Fc 중의 단백질 도메인과, TTP-3000을 제조하기 위해 사용된 절단점 (위치 136) 및 TTP-4000을 제조하기 위해 사용된 절단점 (위치 251)을 비교하여 도시한 것이고; 패널 B는 본 발명의 대체 양태에 따르는 TTP-3000 및 TTP-4000에 대한 도메인 구조를 도시한 것이다.
도 7은 본 발명의 특정 양태에 따르는, RAGE 리간드 아밀로이드-베타 (A-베타), SlOOb (SlOO), 및 암포테린 (Ampho)에 대한 sRAGE, 및 RAGE 융합 단백질 TTP-4000 (TT4) 및 TTP-3000 (TT3)의 시험관내 결합 검정 결과를 도시한 것이다.
도 8은 본 발명의 특정 양태에 따르는, 면역탐지 시약 만을 포함하는 음성 대조군 ("복합체 단독")과 비교한 바와 같은, 아밀로이드-베타에 대한 RAGE 융합 단백질 TTP-4000 (TT4) ("단백질")의 시험관내 결합 검정과, RAGE 길항제 ("RAGE 리간드")에 의한 상기 결합의 길항 작용을 도시한 것이다.
도 9는 본 발명의 특정 양태에 따르는, 면역탐지 시약 만을 포함하는 음성 대조군 ("복합체 단독")과 비교한 바와 같은, 아밀로이드-베타에 대한 RAGE 융합 단백질 TTP-3000 (TT3) ("단백질")의 시험관내 결합 검정과, RAGE 길항제 ("RAGE 리간드")에 의한 상기 결합의 길항 작용을 도시한 것이다.
도 10은 본 발명의 특정 양태에 따르는, RAGE 융합 단백질 TTP-3000 (TT3) 및 TTP-4000 (TT4), 및 sRAGE에 의한 TNF-α의 SlOOb-RAGE 유도된 생성 억제를 측정하는 세포에 의거한 검정 결과를 도시한 것이다.
도 11은 본 발명의 특정 양태에 따르는, RAGE 융합 단백질 TTP-4000에 대한 약동학적 프로파일을 도시한 것인데, 각 곡선은 동일한 실험 조건 하의 상이한 동물을 나타낸다.
도 12는 본 발명의 특정 양태에 따르는, 염증 반응의 측정치로서 RAGE 융합 단백질 TTP-4000에 의한 자극과 인간 IgG 자극으로 인한 THP-1로부터의 상대적 TNF-α 방출 수준을 도시한 것이다.
도 13은 본 발명의 대체 양태에 따르는, 당뇨병 동물에게서 재발 협착증을 저하시키기 위해 RAGE 융합 단백질 TTP-4000을 사용하는 것을 도시한 것인데, 패널 A는 TTP-4000 RAGE-융합 단백질이 음성 대조군 (IgG)과 비교해서 혈관 내막/중막 비를 저하시켰다는 것을 나타내고; 패널 B는 TTP-4000 RAGE-융합 단백질이 혈관성 평활근 세포 증식을 용량-반응성 방식으로 저하시켰다는 것을 나타낸다.
도 14는 본 발명의 대체 양태에 따르는, 알츠하이머병 (AD)에 걸린 동물에게서 아밀로이드 형성과 인지 기능장애를 저하시키기 위해 RAGE 융합 단백질 TTP-4000을 사용하는 것을 도시한 것인데, 패널 A는 TTP-4000 RAGE-융합 단백질이 뇌 중의 아밀로이드 부하량을 감소시켰다는 것을 나타내고; 패널 B는 TTP-4000 RAGE-융합 단백질이 인지 기능을 개선시켰다는 것을 나타낸다.
도 15는 본 발명의 특정 양태에 따르는, 공지된 각종 고정화 RAGE 리간드에 대한 TTP-4000을 이용한 경우의 포화-결합 곡선을 도시한 것이다.
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서의 목적상 본 명세서에서 사용된 성분의 양, 반응 조건 등을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 있어 용어 "약"으로써 변형될 수 있는 것으로 인지되어야 한다. 따라서 달리 지시되지 않는 한, 다음 명세서에 제시된 수치 파라미터는 본 발명에 의해 수득하고자 하는 목적 특성에 따라서 다양할 수 있는 근사치이다. 적어도, 그리고 본 출원의 청구의 범위에 대한 균등론의 적용을 제한하려는 의도에서가 아니라, 각 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 숫자의 수를 고려하고 통상적인 반올림법을 적용하여 해석되어야 한다.
본 발명의 넓은 범위를 제시하는 수치 범위와 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 구체적인 실시예에 제시된 수치는 가능한 한 정확하게 보고되어 있다. 그러나, 어떠한 수치도 각각의 시험 측정치에서 발견되는 표준 편차로 인해 불가피하게 발생되는 특정 오차를 본래 함유하고 있다. 더우기, 본원에 기재된 모든 범위는 그에 포함된 모든 아범위를 포괄하는 것으로 이해해야 한다. 예를 들어, "1 내지 10"으로 언급된 범위는 최소값 1과 최대값 10 사이의 모든 아범위, 즉 최소값 1 이상으로 시작하여 (예를 들어, 1 내지 6.1), 최대값 10 이하로 종결되는 (예를 들어, 5.5 내지 10) 모든 아범위를 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 부가적으로, "본 명세서에 포함되는" 것으로 지칭된 모든 참고자료는 그의 전체가 포함되는 것으로 간주되어야 한다.
추가로 본 명세서에 사용된 단수 형태에는 하나의 지시 대상물로 직접적이고도 명료하게 제한하지 않는 한은 복수 지시 대상물이 포함된다는 것을 인지해야 한다. 용어 "또는"은 명료하게 달리 언급하지 않는 한은, 용어 "및/또는"과 상호 교환적으로 사용된다.
또한, 용어 "일부" 및 "단편"은 폴리펩티드, 핵산 또는 기타 분자상 구조물의 일부를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 용어 "상단"은 분자가 단백질인 경우에는 제2 잔기에 대해 N-말단쪽인 잔기를 지칭하거나, 또는 분자가 핵산인 경우에는 제2 잔기에 대해 5'쪽인 잔기를 지칭한다. 또한 본원에 사용된 바와 같은 용어 "하단"은 분자가 단백질인 경우에는 제2 잔기에 대해 C-말단쪽인 잔기를 지칭하거나, 또는 분자가 핵산인 경우에는 제2 잔기에 대해 3'쪽인 잔기를 지칭한다.
달리 규정되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 당업자가 통상적으로 인식하고 있는 바와 동일한 의미를 갖는다. 실행자는 특히 당해 분야의 정의와 용어에 대해서 문헌 [Current Protocols In Molecular Biology (Ansubel)]에 따른다. 아미노산 잔기에 대한 약어는 20개의 통상적인 L-아미노산 중의 하나를 지칭하기 위해 당해 분야에서 사용되고 있는 표준 3-문자 및/또는 1-문자 부호이다.
"핵산"은 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)이다. 이 용어는 단일 가닥 핵산, 이중 가닥 핵산, 및 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 유사체로부터 만든 RNA 및 DNA를 포함하기 위해 사용된다.
용어 "벡터"는 제2 핵산 분자를 특정 세포에 수송하기 위해 사용될 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 한 양태에서는, 벡터가 이러한 벡터 내로 삽입된 DNA 서열을 복제시킬 수 있다. 이 벡터는 적어도 몇몇 숙주 세포에서 핵산 분자의 발현을 증강시키는 프로모터를 포함할 수 있다. 벡터는 자기 복제할 수 있거나 (염색체외) 숙주 세포 염색체 내로 통합될 수도 있다. 한 양태에서는, 벡터가 이러한 벡터 내로 삽입된 핵산 서열의 적어도 일부로부터 유래된 단백질을 생산할 수 있는 발현 벡터를 포함할 수 있다.
당해 분야에 공지된 바와 같이, 핵산 서열을 서로 혼성화시키기 위한 조건은 낮은 엄격성 조건 내지 높은 엄격성 조건으로서 기재될 수 있다. 일반적으로, 고도로 엄격한 혼성화 조건은 하이브리드를 고온 하에 저염 완충액 중에서 세척시키는 것을 지칭한다. 혼성화는 당해 분야에서 표준인 혼성화 용액, 예를 들어 65℃ 하의 0.5 M NaHPO4, 7% 나트륨 도데실 설페이트 (SDS)를 사용하고, 프로브의 길이에 따라서 실온 내지 68℃ 하에 0.25 M NaHPO4, 3.5% SDS 중에서의 세척에 이어 0.1 x SSC/0.1% SDS 중에서 세척하여 결합된 DNA를 여과시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, Ausubel, F.M. et al., Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed., Chapter 2, John Wiley & Sons, N.Y]. 예를 들어, 고도로 엄격한 세척은 14개 염기 올리고뉴클레오티드 프로브의 경우에는 37℃ 하에, 17개 염기 올리고뉴클레오티드 프로브의 경우에는 48℃ 하에, 20개 염기 올리고뉴클레오티드 프로브의 경우에는 55℃ 하에, 25개 염기 올리고뉴클레오티드 프로브의 경우에는 60℃ 하에, 또는 약 250개 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 프로브의 경우에는 65℃ 하에, 6x SSC/0.05% 나트륨 피로포스페이트 중에서 세척하는 것을 포함한다. 핵산 프로브는, 예를 들어 [γ-32P]ATP로 말단 표지시킴으로써 방사뉴클레오티드로 표지시킬 수 있거나, 또는 무작위 프라이머 표지화에 의해 [α-32P]dCTP 등의 방사성 표지된 뉴클레오티드를 혼입시킴으로써 표지시킬 수 있다. 또 다른 한편, 바이오티닐화 또는 플루오레세인 표지된 뉴클레오티드를 혼입시킴으로써 프로브를 표지시킬 수 있고, 스트렙타비딘 또는 항-플루오레세인 항체를 사용하여 프로브를 탐지할 수 있다.
본원에 사용된 "유기 소분자"는 1개 이상의 탄소 원자를 함유하고 분자량이 2,000 달톤 미만인 분자이다.
"폴리펩티드" 및 "단백질"은 부분 또는 전장의 단백질을 포함할 수 있는 단백질 분자를 기재하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "융합 단백질"은 2가지 이상의 단백질로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 융합 단백질은 별개의 단백질로부터 유래된 아미노산 부분들 간의 아미노산의 연결성 영역을 포함할 수도 있다.
본원에 사용된 "비-RAGE 폴리펩티드"는 RAGE 또는 그의 단편으로부터 유래되지 않은 모든 폴리펩티드이다. 이러한 비-RAGE 폴리펩티드에는 면역글로불린 펩티드, 이량체화 폴리펩티드, 안정화 폴리펩티드, 양친매성 펩티드, 또는 단백질을 표적화 또는 정제하기 위한 "태그"를 제공해 주는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 포함된다.
본원에 사용된 "면역글로불린 펩티드"는 면역글로불린 중쇄 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 한 양태에서는, 이러한 중쇄의 일부가 Fc 단편 또는 그의 일부일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 Fc 단편은 중쇄 힌지 (hinge) 폴리펩티드, 및 단량체 또는 이량체 형태의 면역글로불린 중쇄의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 또한, CH1 및 Fc 단편이 면역글로불린 폴리펩티드로서 사용될 수도 있다. 중쇄 (또는 그의 일부)는 다음 공지된 중쇄 이소형 중의 어느 한 가지로부터 유래될 수 있다: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε), 또는 IgA (α). 또한, 중쇄 (또는 그의 일부)는 다음 공지된 중쇄 아유형 중의 어느 한 가지로부터 유래될 수 있다: IgG1 (γ1), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgA1 (α1), IgA2 (α2), 또는 생물학적 활성을 변경시키는 이들 이소형 또는 아유형의 돌연변이물. 변경시킬 수 있는 생물학적 활성의 예에는, 예를 들어 힌지 영역을 변형시킴으로써, 몇몇 Fc 수용체와 결합할 수 있는 이소형의 능력을 저하시키는 것이 포함된다.
용어 "동일성" 또는 "동일률"은 두 아미노산 서열 간의 서열 동일성(률) 또는 두 핵산 서열 간의 서열 동일성(률)을 지칭한다. 동일률은 두 서열을 정렬시킴으로써 결정될 수 있고, 이는 비교된 서열들이 공유하고 있는 위치에서 동일한 잔기 (즉, 아미노산 또는 뉴클레오티드) 수를 지칭한다. 서열 정렬과 비교는 당해 분야에서 표준인 알고리즘을 사용하거나 [참고: Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch, 1970, J Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:2444], 또는 BLAST 및 FASTA로서 공개적으로 입수 가능한, 이들 알고리즘의 컴퓨터 버젼 [Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI]에 의해 수행할 수 있다. 또한, 서열 비교를 위해 ENTREZ [공급처: the National Institutes of Health, Bethesda MD]를 사용할 수도 있다. 한 양태에서, 두 서열의 동일률은 두 서열 간에 단일 아미노산 미스매치만이 존재하는 것 처럼 각 아미노산 갭을 칭량하도록 하는, 갭 중량 1을 수반하는 GCG를 사용하여 결정할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "보존된 잔기"는 동일한 구조 및/또는 기능을 지닌 복수 개의 단백질 중에서 동일한 아미노산을 지칭한다. 보존된 잔기 영역은 단백질 구조 또는 기능 면에서 중요할 수 있다. 따라서, 3차원적 단백질에서 확인된 바와 같은 연속되는 보존된 잔기는 단백질 구조 또는 기능에 중요할 수 있다. 보존된 잔기 또는 보존된 3차원 구조 영역을 밝혀내기 위해, 상이한 종으로부터의 동일하거나 유사한 단백질에 대한 서열을 비교하거나, 또는 동일한 종의 개개 서열을 비교할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "상동체"는 야생형 아미노산 서열과의 상동성을 지닌 폴리펩티드를 의미한다. 상동성 비교는 육안으로 수행할 수 있거나, 보다 통상적으로는 용이하게 입수 가능한 서열 비교용 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 이들 시판용 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열들 간의 상동률을 계산할 수 있다 [참고: 예를 들어, Wilbur, W. J. and Lipman, D. J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:726-730]. 예를 들어, 상동성 서열은 서로 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 폴리펩티드 또는 단백질 "도메인"은 독립적 단위를 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질에 수반되는 영역을 포함한다. 도메인은 구조, 서열 및/또는 생물학적 활성 측면에서 규정될 수 있다. 한 양태에서는, 폴리펩티드 도메인이 실질적으로 나머지 단백질과는 독립적인 방식으로 폴딩되는 특정 단백질 영역을 포함할 수 있다. 도메인은 도메인 데이터베이스, 예를 들어 PFAM, PRODOM, PROSITE, BLOCKS, PRINTS, SBASE, ISREC PROFILES, SAMRT, 및 PROCLASS 등을 사용하여 확인할 수 있다.
본원에 사용된 "면역글로불린 도메인"은 면역글로불린의 특정 도메인과 구조적으로 상동성이거나 동일한 아미노산 서열이다. 면역글로불린 도메인의 아미노산 서열 길이는 어떠한 길이일 수도 있다. 한 양태에서는, 면역글로불린 도메인이 250개 미만 아미노산일 수 있다. 특정 예시 양태에서는, 면역글로불린 도메인 길이가 약 80 내지 150개 아미노산일 수 있다. 예를 들어, IgG의 가변 영역, 및 CH1, CH2, 및 CH3 영역이 각 면역글로불린 도메인이다. 또 다른 예에서는, IgM의 가변 영역, 및 CH1, CH2, CH3 및 CH4 영역이 각 면역글로불린 도메인이다.
본원에 사용된 "RAGE 면역글로불린 도메인"은 면역글로불린의 특정 도메인과 구조적으로 상동성이거나 동일한, RAGE 단백질로부터의 아미노산 서열이다. 예를 들어, RAGE 면역글로불린 도메인은 RAGE V-도메인, RAGE Ig-유사 C2-유형 1 도메인 ("Cl 도메인"), 또는 RAGE Ig-유사 C2-유형 2 도메인 ("C2 도메인")을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "도메인간 링커"는 2개의 도메인을 함께 연결시켜 주는 폴리펩티드를 포함한다. Fc 힌지 영역이 IgG에서의 도메인간 링커의 한 예이다.
본원에 사용된 "직접적으로 연결"이란 연결되는 2개 군 간에 어떠한 원자도 개입하지 않은 2개의 상이한 군 (예: 핵산 서열, 폴리펩티드, 폴리펩티드 도메인) 간의 공유적 연결을 의미한다.
본원에 사용된 "리간드 결합 도메인"은 리간드 결합에 책임이 있는 단백질의 특정 도메인을 지칭한다. 용어 리간드 결합 도메인에는 리간드 결합 도메인의 상동체 또는 그의 일부가 포함된다. 이와 관련하여, 리간드 결합 도메인의 결합 특이성이 보존되는 한은, 해당 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성 또는 친수성 상의 유사성에 기초하여 리간드 결합 부위에서 계획적인 아미노산 치환이 이루어질 수 있다.
본원에 사용된 "리간드 결합 부위"는 리간드와 직접적으로 상호 작용하는 단백질 내의 잔기, 또는 리간드와 직접적으로 상호 작용하는 잔기에 아주 근접하게 리간드를 위치시키는 것에 관여하는 잔기를 포함한다. 이러한 리간드 결합 부위 내에서의 잔기들의 상호 작용은 해당 모델 또는 구조 내에서 리간드에 대한 상기 잔기의 공간적 근접성으로써 규정될 수 있다. 용어 리간드 결합 부위에는 리간드 결합 부위의 상동체 또는 그의 일부가 포함된다. 이와 관련하여, 리간드 결합 부위의 결합 특이성이 보존되는 한은, 해당 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성 또는 친수성 상의 유사성에 기초하여 리간드 결합 부위에서 계획적인 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 리간드 결합 부위는 특정 단백질 또는 폴리펩티드의 하나 이상의 리간드 결합 도메인에 존재할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "상호 작용"이란 특정 리간드 또는 화합물, 또는 그의 일부 또는 단편과, 관심있는 제2 분자의 일부 간의 근접한 상태를 지칭한다. 상호 작용은, 예를 들어 수소-결합, 반 데르 발스 (van der Waals) 상호 작용, 정전기 또는 소수성 상호 작용의 결과로서 비-공유적이거나, 또는 공유적일 수 있다.
본원에 사용된 "리간드"는 리간드 결합 부위와 상호 작용하는 분자 또는 화합물 또는 실재물 (그의 기질 또는 유사체 또는 일부 포함)을 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같은 용어 "리간드"는 관심있는 단백질과 결합하는 화합물을 지칭할 수 있다. 리간드는 작동제, 길항제 또는 조절제일 수 있다. 또한, 리간드는 생물학적 효과를 지니지 않을 수 있다. 또한, 리간드는 기타 리간드의 결합을 차단시킴으로써 생물학적 효과를 억제시킬 수도 있다. 리간드에는 소분자 억제제가 포함될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 소분자에는 펩티드, 펩티드-모방제, 유기 화합물 등이 포함될 수 있다. 리간드에는 폴리펩티드 및/또는 단백질이 포함될 수도 있다.
본원에 사용된 "조절 화합물"은 관심있는 분자의 생물학적 활성을 변화 또는 변경시키는 분자를 지칭한다. 조절 화합물은 관심있는 분자의 활성을 증가 또는 저하시킬 수 있거나, 또는 관심있는 분자의 물리적 또는 화학적 특징, 또는 기능적 또는 면역학적 특성을 변화시킬 수 있다. RAGE의 경우에는, 조절 화합물이 RAGE 또는 그의 일부의 활성을 증가 또는 저하시킬 수 있거나, 또는 RAGE 또는 그의 일부의 특징, 또는 기능적 또는 면역학적 특성을 변화시킬 수 있다. 조절 화합물에는 천연 및/또는 화학적으로 합성되거나 인공적인 펩티드, 변형된 펩티드 (예: 포스포펩티드), 항체, 탄수화물, 단당류, 올리고당류, 다당류, 당지질, 헤테로사이클릭 화합물, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 또는 그의 일부, 및 유기 또는 무기 소분자가 포함될 수 있다. 조절 화합물은 내인성 생리적 화합물일 수 있거나, 또는 천연 또는 합성 화합물일 수 있다. 또한, 조절 화합물이 유기 소분자일 수 있다. 용어 "조절 화합물"에는 또한, 화학적으로 변형된 리간드 또는 화합물이 포함되고, 이성체 및 라세미 형태도 포함된다.
"작동제"는 관련된 수용체에 대해 특이적인 약리학적 반응을 유발시키는 복합체를 형성하기 위해 이러한 수용체와 결합하는 화합물을 포함한다.
"길항제"는 실재적인 약리학적 반응을 유발시키지 않는 복합체를 형성하기 위해 특정 작동제 또는 수용체와 결합하고, 작동제에 의해 유도된 생물학적 반응을 억제시킬 수 있는 화합물을 포함한다.
따라서, RAGE 작동제는 RAGE와 결합할 수 있고 RAGE-매개된 세포성 과정을 자극할 수 있으며, RAGE 길항제는 RAGE 작동제에 의해 RAGE-매개된 과정이 자극되는 것을 억제시킬 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서는 RAGE 작동제에 의해 자극된 세포성 과정이 TNF-α 유전자 전사 활성화를 포함한다.
용어 "펩티드-모방제"는 분자들 간의 상호 작용에서 펩티드에 대한 치환물로서 제공되는 구조물을 지칭한다 [참고: Morgan et al., 1989, Ann. Reports Med. Chem., 24:243-252]. 펩티드-모방제에는 특정 펩티드, 작동제 또는 길항제의 아미노산 및/또는 펩티드 결합은 함유하거나 함유하지 않을 수 있지만, 이러한 펩티드, 작동제 또는 길항제의 구조적 및 기능적 특징을 보유하고 있는 합성 구조물이 포함될 수 있다. 펩티드-모방제에는 또한, 펩토이드, 올리고펩토이드 [참고: Simon et al., 1972, Proc. Natl. Acad, Sci., USA, 89:9367); 및 본 발명의 펩티드, 작동제 또는 길항제에 상응하는 아미노산의 가능한 모든 서열을 나타내는 고안된 길이의 펩티드를 함유하는 펩티드 라이브러리가 포함된다.
용어 "치료"란 특정 질병 또는 장애 증상을 개선시키는 것을 지칭하고, 이는 이러한 장애를 치유하거나, 장애 발병을 실질적으로 예방하거나, 또는 대상체의 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료"는 환자를 고통스럽게 하는 소정의 장애에 대한 전 스펙트럼의 치료를 지칭하는데, 이에는 해당 장애로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 특정 장애를 치유하거나, 또는 장애 발병을 예방하는 것이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "EC50"은 측정된 생물학적 효과의 50%를 가져다 주는 특정 작용제의 농도로서 규정된다. 예를 들어, 측정 가능한 생물학적 효과를 지닌 치료제의 EC50은 이러한 치료제가 생물학적 효과의 50%를 나티내는 값을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "IC50"은 측정된 효과의 50% 억제를 가져다 주는 특정 작용제의 농도로서 규정된다. 예를 들어, RAGE 결합 길항제의 IC50은 이러한 길항제가 RAGE의 리간드 결합 부위에 대한 리간드 결합을 50% 정도 저하시키는 값을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "유효량"은 목적하는 효과를 특정 대상체에게서 생성시키는데 유효한 작용제의 양을 의미한다. 용어 "치료 유효량"은 특정 동물 또는 인간에게서 추구하고자 하는 치료적 반응을 유발시킬 약물 또는 약제의 양을 의미한다. 유효량을 포함하는 실제적 용량은 투여 방식, 대상체의 크기와 건강 상태, 치료하고자 하는 장애 등에 따라서 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약상 허용가능한 담체"는 인간 또는 동물 대상체에게 사용하기 적합한 화합물 및 조성물, 예를 들어 RAGE-매개된 장애 또는 질병을 치료하기 위해 투여되는 치료적 조성물을 지칭할 수 있다.
용어 "제약 조성물"은 통상적인 비독성 담체, 희석제, 아주반트, 비히클 등을 함유하는 단위 투여 제형으로 포유류 숙주에게, 예를 들어 경구, 비경구, 국소, 흡입 분무, 비내 또는 직장 투여할 수 있는 조성물을 의미하기 위해 본원에 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "비경구"에는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 뇌조내 (intracisternal) 주사, 또는 주입 기술이 포함된다.
RAGE 융합 단백질
본 발명의 양태는 RAGE 융합 단백질, 이러한 융합 단백질의 제조 방법, 및 상기 융합 단백질의 사용 방법을 포함한다. 본 발명은 각종 방식으로 실시될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 양태는 제2의 비-RAGE 폴리펩티드와 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 한 양태에서는, 이러한 융합 단백질이 RAGE 리간드 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 리간드 결합 부위가 융합 단백질의 가장 N-말단 도메인을 포함한다. RAGE 리간드 결합 부위는 RAGE의 V 도메인, 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, RAGE 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 서열 10 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함한다.
특정 양태에서, RAGE 폴리펩티드는 면역글로불린 도메인 또는 면역글로불린 도메인의 일부 (예: 그의 단편)을 포함하는 폴리펩티드와 연결될 수 있다. 한 양태에서는, 면역글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 인간 IgG의 CH2 도메인 또는 CH3 도메인 중의 하나 이상의 적어도 일부를 포함한다.
RAGE 단백질 또는 폴리펩티드는 전장의 인간 RAGE 단백질 (예: 서열 1), 또는 인간 RAGE의 단편을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 RAGE 폴리펩티드의 단편은 길이가 5개 이상 아미노산이고, 길이가 30개 초과 아미노산일 수 있지만, 완전한 아미노산 서열 보다는 작다. 대체 양태에서, RAGE 폴리펩티드는 인간 RAGE 또는 그의 단편과 70%, 80%, 85% 또는 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 한 양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 인간 RAGE 또는 그의 단편을 포함할 수 있는데, 제1 잔기로서 메티오닌이 아닌 글리신을 수반한다 [참고: 예를 들어, Neeper et al, (1992)]. 또한, 인간 RAGE가 신호 서열이 제거된 전장의 RAGE (예를 들어, 서열 2 또는 서열 3) (도 1A 및 1B) 또는 이러한 아미노산 서열의 일부를 포함할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 또한, sRAGE (예: 서열 4), sRAGE와 90% 동일한 폴리펩티드, 또는 sRAGE의 단편을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 sRAGE는 막관통 영역 또는 세포질 꼬리 부분을 포함하지 않는 RAGE 단백질이다 [참고: Park et al., Nature Med., 4:1025-1031 (1998)]. 예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 인간 sRAGE 또는 그의 단편을 포함할 수 있는데, 제1 잔기로서 메티오닌이 아닌 글리신을 수반한다 [참고: 예를 들어, Neeper et al, (1992)]. 또한, RAGE 폴리펩티드는 신호 서열이 제거된 인간 sRAGE (예를 들어, 서열 5 또는 서열 6) (도 1C) 또는 이러한 아미노산 서열의 일부를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, RAGE 단백질은 RAGE V 도메인 (예: 서열 7 또는 서열 8; 도 1D)을 포함할 수 있다 [참고: Neeper et al., (1992); Schmidt et al. (1997)]. 또한, RAGE V 도메인 또는 그의 단편과 90% 동일한 서열을 사용할 수도 있다.
또한, RAGE 단백질은 RAGE V 도메인의 단편 (예: 서열 9 또는 서열 10, 도 1D)을 포함할 수 있다. 한 양태에서는, RAGE 단백질이 리간드 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 이러한 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 서열 10 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서는, RAGE 단편이 합성 펩티드이다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질에 사용된 RAGE 폴리펩티드는 전장의 RAGE의 단편을 포함할 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, RAGE는 3가지 면역글로불린-유사 폴리펩티드 도메인, 즉 V 도메인과, 도메인간 링커에 의해 각각 서로 연결된 Cl 및 C2 도메인을 포함한다. 전장의 RAGE는 또한, 막관통 폴리펩티드 및 C2 도메인의 세포질 꼬리 하단 (C-말단)을 포함하고, C2 도메인에 연결된다.
특정 양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 어떠한 신호 서열 잔기로 포함하지 않는다. RAGE의 신호 서열은 전장의 RAGE의 잔기 1 내지 22 또는 잔기 1 내지 23을 포함할 수 있다.
예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 V 도메인에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 116 (서열 7) 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 116 (서열 8) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또한, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 C1 도메인에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 124 내지 221 (서열 11) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 RAGE의 C2 도메인에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 227 내지 317 (서열 12) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또한, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 V 도메인 및 하단 도메인간 링커에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 123 (서열 13) 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 123 (서열 14) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또한, RAGE 폴리펩티드는 V 도메인, C1 도메인 및 이들 두 도메인을 연결해 주는 도메인간 링커에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 226 (서열 17) 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 226 (서열 18) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또한, RAGE 폴리펩티드는 sRAGE (즉, V, C1 및 C2 도메인, 및 도메인간 링커를 코딩함)에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 339 (서열 5) 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 339 (서열 6) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이들 서열 각각의 단편을 사용할 수도 있다.
융합 단백질에는 RAGE 또는 그의 단편으로부터 유래되지 않은 몇 가지 유형의 펩티드가 포함될 수 있다. 융합 단백질의 제2 폴리펩티드는 면역글로불린으로부터 유래된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 한 양태에서는, 면역글로불린 폴리펩티드가 면역글로불린 중쇄 또는 그의 일부 (즉, 단편)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 단편은 면역글로불린의 Fc 단편으로부터 유래된 폴리펩티드를 포함할 수 있는데, 이러한 Fc 단편은 중쇄 힌지 폴리펩티드, 및 단량체로서의 면역글로불린 중쇄의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 중쇄 (또는 그의 일부)는 다음 공지된 중쇄 이소형 중의 어느 한 가지로부터 유래될 수 있다: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε), 또는 IgA (α). 또한, 중쇄 (또는 그의 일부)는 다음 공지된 중쇄 아유형 중의 어느 한 가지로부터 유래될 수 있다: IgG1 (γ1), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgA1 (α1), IgA2 (α2), 또는 생물학적 활성을 변경시키는 이들 이소형 또는 아유형의 돌연변이물. 제2 폴리펩티드는 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인, 또는 이들 도메인 중의 어느 하나, 또는 둘 다의 일부를 포함할 수 있다. 예시 양태로서, 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드는 서열 38 또는 서열 40을 포함할 수 있다.
면역글로불린 쇄의 Fc 부분은 생체 내에서 프로염증성일 수 있다. 따라서, 한 양태에서는, 본 발명의 RAGE 융합 단백질이 면역글로불린으로부터 유래된 도메인간 힌지 폴리펩티드가 아니라, RAGE로부터 유래된 도메인간 링커를 포함한다.
따라서, 한 양태에서는, 상기 융합 단백질이 면역글로불린의 CH2 도메인, 또는 면역글로불린의 CH2 도메인의 단편 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드와 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 한 양태에서는, CH2 도메인 또는 그의 단편이 서열 42를 포함한다. 한 양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 리간드 결합 부위를 포함할 수 있다. 이러한 RAGE 리간드 결합 부위는 RAGE의 V 도메인, 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, RAGE 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 서열 10 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질에 사용된 RAGE 폴리펩티드는 RAGE 면역글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 부가적으로 또는 또 다른 한편, RAGE의 단편은 도메인간 링커를 포함할 수 있다. 또한, RAGE 폴리펩티드는 상단 (즉, N-말단에 더 가까움) 또는 하단 (즉, C-말단에 더 가까움) 도메인간 링커에 연결된 RAGE 면역글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 2개 이상의 RAGE 면역글로불린 도메인 (이들 각각은 서로 도메인간 링커에 의해 연결된다)을 포함할 수 있다. RAGE 폴리펩티드는 서로 1개 이상의 도메인간 링커에 의해 연결되고 N-말단 RAGE 면역글로불린 도메인 및/또는 C-말단 면역글로불린 도메인에 부착된 말단 도메인간 링커를 갖는 여러 개의 (다중) RAGE 면역글로불린 도메인을 추가로 포함할 수 있다. RAGE 면역글로불린 도메인과 도메인간 링커의 부가의 조합 역시 본 발명의 범위 내에 속한다.
한 양태에서, RAGE 폴리펩티드는 RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고, RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, RAGE 면역글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 포함한다. 면역글로불린의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인, 또는 이들 도메인 중의 어느 하나, 또는 둘 다의 일부를 포함할 수 있다. 예시 양태로서, 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드는 서열 38 또는 서열 40을 포함할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 융합 단백질은 RAGE로부터의 단일 또는 다중 도메인을 포함할 수 있다. 또한, RAGE 폴리펩티드 도메인에 연결된 도메인간 링커를 포함하는 RAGE 폴리펩티드는 전장 RAGE 단백질의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 V 도메인 및 하단 도메인간 링커에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 136 (서열 15) 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 136 (서열 16) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또한, RAGE 폴리펩티드는 V 도메인, C1 도메인, 이들 두 도메인을 연결시켜 주는 도메인간 링커, 및 C1의 제2의 도메인간 링커 하단에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 251 (서열 19) 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 251 (서열 20) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 한 양태에서는, 융합 단백질이 RAGE 단백질로부터 유래된 2개의 면역글로불린 도메인과, 인간 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 2개의 면역글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 융합 단백질은 제1 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제1 RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 면역글로불린 도메인의 N-말단 아미노산이 제1 도메인간 링커의 C-말단 아미노산에 연결되며, 제2 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제2 RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 CH2 면역글로불린 도메인의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, 제2 RAGE 면역글로불린 도메인 및 제2 RAGE 도메인간 링커에 연결된 제1 RAGE 면역글로불린 도메인 및 제1 RAGE 도메인간 링커를 포함할 수 있다. 한 양태에서는, 4개 도메인 RAGE 융합 단백질이 서열 32를 포함할 수 있다. 대체 양태에서는, 4개 도메인 RAGE 융합 단백질이 서열 33 또는 서열 34를 포함한다.
또 다른 한편, 3개 도메인 융합 단백질은 RAGE로부터 유래된 1개의 면역글로불린 도메인과, 인간 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 2개의 면역글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 RAGE 도메인간 링커를 통하여 CH2 면역글로불린 도메인 또는 CH2 면역글로불린 도메인의 일부의 N-말단 아미노산에 연결된 단일 RAGE 면역글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 한 양태에서는, 3개 도메인 RAGE 융합 단백질이 서열 35를 포함할 수 있다. 대체 양태에서는, 3개 도메인 RAGE 융합 단백질이 서열 36 또는 서열 37을 포함할 수 있다.
RAGE 도메인간 링커 단편은 본래 RAGE 면역글로불린 도메인의 하단이므로, RAGE 면역글로불린 도메인에 연결되는 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE V 도메인에 대해서는, 도메인간 링커가 이러한 V 도메인으로부터 본래 하단인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 상기 링커가 전장의 RAGE의 아미노산 117 내지 123에 상응하는 서열 21을 포함할 수 있다. 또한, 상기 링커는 천연 RAGE 서열의 부가 부분을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열 21의 상단 및 하단에 여러 개의 아미노산 (예를 들어, 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산)을 포함하는 도메인간 링커를 사용할 수도 있다. 따라서, 한 양태에서는 도메인간 링커가 전장의 RAGE의 아미노산 117 내지 136을 포함하는 서열 23을 포함한다. 또한, 상기 링커의 어느 한 말단으로부터, 예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산을 결실시킨 서열 21의 단편을 사용할 수 있다. 대체 양태에서는, 상기 링커가 서열 21 또는 서열 23과 70%, 80% 또는 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다.
RAGE Cl 도메인의 경우에는, 상기 링커가 본래 C1 도메인의 하단인 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 상기 링커가 전장의 RAGE의 아미노산 222 내지 251에 상응하는 서열 22를 포함할 수 있다. 또한, 상기 링커는 천연 RAGE 서열의 부가 부분을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열 22의 상단 및 하단에 여러 개의 아미노산 (예를 들어, 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산)을 포함하는 링커를 사용할 수도 있다. 또한, 상기 링커의 어느 한 말단으로부터, 예를 들어 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산을 결실시킨 서열 22의 단편을 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서는 RAGE 도메인간 링커가 아미노산 222 내지 226에 상응하는 서열 24를 포함할 수 있다. 또한, 도메인간 링커는 RAGE 아미노산 318 내지 342에 상응하는 서열 44를 포함할 수 있다.
RAGE 융합 단백질의 생성 방법
본 발명은 또한, RAGE 융합 단백질의 제조 방법을 포함한다. 따라서 한 양태에서는, 본 발명이 제2의 비-RAGE 폴리펩티드에 RAGE 폴리펩티드를 공유결합으로 연결시키는 단계 (여기서, RAGE 폴리펩티드는 RAGE 리간드 결합 부위를 포함한다)를 포함하여, RAGE 융합 단백질을 제조하는 방법을 포함한다. 에를 들어, 연결된 RAGE 폴리펩티드와 제2의 비-RAGE 폴리펩티드는 재조합 DNA 구조물에 의해 코딩될 수 있다. 상기 방법은 이러한 DNA 구조물을 발현 벡터 내로 혼입시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 이러한 발현 벡터를 숙주 세포 내로 삽입하는 단계를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 양태는 제2의 비-RAGE 폴리펩티드에 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 한 양태에서는, 이러한 융합 단백질이 RAGE 리간드 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 리간드 결합 부위가 융합 단백질의 가장 N-말단 도메인을 포함한다. RAGE 리간드 결합 부위는 RAGE의 V 도메인, 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, RAGE 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 서열 10 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함한다.
특정 양태에서, RAGE 폴리펩티드는 면역글로불린 도메인 또는 면역글로불린 도메인의 일부 (예: 그의 단편)을 포함하는 폴리펩티드와 연결될 수 있다. 한 양태에서는, 면역글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 인간 IgG의 CH2 도메인 또는 CH3 도메인 중의 하나 이상의 적어도 일부를 포함한다.
융합 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 공학적으로 처리할 수 있다. 예를 들어 한 양태에서는, 본 발명이 제2의 비-RAGE 폴리펩티드와 연결된 RAGE 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 RAGE 리간드 결합 부위를 포함할 수 있다.
RAGE 단백질 또는 폴리펩티드는 전장의 인간 RAGE (예: 서열 1), 또는 인간 RAGE의 단편을 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 어떠한 신호 서열 잔기도 포함하지 않는다. RAGE의 신호 서열은 전장의 RAGE (서열 1)의 잔기 1 내지 22 또는 잔기 1 내지 23을 포함할 수 있다. 대체 양태에서, RAGE 폴리펩티드는 인간 RAGE 또는 그의 단편과 70%, 80% 또는 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 한 양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 인간 RAGE 또는 그의 단편을 포함할 수 있는데, 제1 잔기로서 메티오닌이 아닌 글리신을 수반한다 [참고: 예를 들어, Neeper et al, (1992)]. 또한, 인간 RAGE는 신호 서열이 제거된 전장의 RAGE (예를 들어, 서열 2 또는 서열 3) (도 1A 및 1B) 또는 이러한 아미노산 서열의 일부를 포함할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은 또한, sRAGE (예: 서열 4), sRAGE와 90% 동일한 폴리펩티드, 또는 sRAGE의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 인간 sRAGE 또는 그의 단편을 포함할 수 있는데, 제1 잔기로서 메티오닌이 아닌 글리신을 수반한다 [참고: 예를 들어, Neeper et al, (1992)]. 또한, 인간 RAGE는 신호 서열이 제거된 인간 sRAGE (예를 들어, 서열 5 또는 서열 6) (도 1C) 또는 이러한 아미노산 서열의 일부를 포함할 수 있다. 기타 양태에서, RAGE 단백질은 V 도메인 (예: 서열 7 또는 서열 8; 도 1D)을 포함할 수 있다. 또한, V 도메인 또는 그의 단편과 90% 동일한 서열을 사용할 수도 있다. 또한, RAGE 단백질은 V 도메인의 일부를 포함하는 RAGE의 단편 (예: 서열 9 또는 서열 10, 도 1D)을 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 서열 10 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서는, RAGE 단편이 합성 펩티드이다.
특정 양태에서는, 핵산 서열이 인간 RAGE의 아미노산 1 내지 118 또는 그의 단편을 코딩하기 위한 서열 25를 포함한다. 예를 들어, 서열 25의 뉴클레오티드 1 내지 348을 포함하는 서열을 사용하여 인간 RAGE의 아미노산 1 내지 116을 코딩할 수 있다. 또한, 핵산은 인간 RAGE의 아미노산 1 내지 123을 코딩하기 위한 서열 26을 포함할 수 있다. 또한, 핵산은 인간 RAGE의 아미노산 1 내지 136을 코딩하기 위한 서열 27을 포함할 수 있다. 또한, 핵산은 인간 RAGE의 아미노산 1 내지 230을 코딩하기 위한 서열 28을 포함할 수 있다. 또한, 핵산은 인간 RAGE의 아미노산 1 내지 251을 코딩하기 위한 서열 29를 포함할 수 있다. 또한, 이들 핵산 서열의 단편을 사용하여 RAGE 폴리펩티드 단편을 코딩할 수 있다.
융합 단백질에는 RAGE 또는 그의 단편으로부터 유래되지 않은 몇 가지 유형의 펩티드가 포함될 수 있다. 융합 단백질의 제2 폴리펩티드는 면역글로불린으로부터 유래된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 중쇄 (또는 그의 일부)는 다음 공지된 중쇄 이소형 중의 어느 한 가지로부터 유래될 수 있다: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε), 또는 IgA (α). 또한, 중쇄 (또는 그의 일부)는 다음 공지된 중쇄 아유형 중의 어느 한 가지로부터 유래될 수 있다: IgG1 (γ1), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgA1 (α1), IgA2 (α2), 또는 생물학적 활성을 변경시키는 이들 이소형 또는 아유형의 돌연변이물. 제2 폴리펩티드는 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인, 또는 이들 도메인 중의 어느 하나, 또는 둘 다의 일부를 포함할 수 있다. 예시 양태로서, 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드는 서열 38 또는 서열 40을 포함할 수 있다. 면역글로불린 펩티드는 서열 39 또는 서열 41의 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
면역글로불린 쇄의 Fc 부분은 생체 내에서 프로염증성일 수 있다. 따라서, 본 발명의 RAGE 융합 단백질은 면역글로불린으로부터 유래된 도메인간 힌지 폴리펩티드가 아니라, RAGE로부터 유래된 도메인간 링커를 포함할 수 있다. 예를 들어 한 양태에서는, 융합 단백질이 재조합 DNA 구조물에 의해 코딩될 수 있다. 또한, 이러한 방법은 상기 DNA 구조물을 발현 벡터 내로 혼입시키는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 이러한 발현 벡터를 숙주 세포 내로 형질감염시키는 단계를 포함할 수 있다.
따라서 한 양태에서, 본 발명은 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 면역글로불린의 CH2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드에 RAGE 폴리펩티드를 공유결합으로 연결시키는 단계를 포함하여, RAGE 융합 단백질을 제조하는 방법을 포함한다. 한 양태에서는, 융합 단백질이 RAGE 리간드 결합 부위를 포함할 수 있다. 이러한 RAGE 리간드 결합 부위는 RAGE의 V 도메인, 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, RAGE 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 서열 10 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함한다.
예를 들어 한 양태에서, 본 발명은 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드에 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 한 양태에서는, 상기 CH2 도메인 또는 그의 단편이 서열 42를 포함한다. 제2의 폴리펩티드는 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 예시 양태로서, 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 서열 38 또는 서열 40을 포함할 수 있다. 면역글로불린 펩티드는 서열 39 또는 서열 41의 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
한 양태에서, RAGE 폴리펩티드는 RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고, RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, RAGE 면역글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 포함할 수 있다. 면역글로불린의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인, 또는 이들 도메인 중의 어느 하나, 또는 둘 다의 일부를 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예시 양태로서, 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드는 서열 38 또는 서열 40을 포함할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 RAGE로부터의 단일 또는 다중 도메인을 포함할 수 있다. 또한, RAGE 면역글로불린 도메인에 연결된 도메인간 링커를 포함하는 RAGE 폴리펩티드는 전장 RAGE 단백질의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어 한 양태에서는, 융합 단백질이 RAGE 단백질로부터 유래된 2개의 면역글로불린 도메인과, 인간 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 2개의 면역글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 융합 단백질은 제1 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제1 RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 면역글로불린 도메인의 N-말단 아미노산이 제1 도메인간 링커의 C-말단 아미노산에 연결되며, 제2 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제2 RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 CH2 면역글로불린 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, 제2 RAGE 면역글로불린 도메인 및 제2 RAGE 도메인간 링커에 연결된 제1 RAGE 면역글로불린 도메인 및 제1 RAGE 도메인간 링커를 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 V 도메인, C1 도메인, 이들 두 도메인을 연결시켜 주는 도메인간 링커, 및 C1의 제2의 도메인간 링커 하단에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 251 (서열 19) 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 251 (서열 20) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 한 양태에서는, 서열 30 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 구조물이 4개 도메인 RAGE 융합 단백질을 코딩할 수 있다.
또 다른 한편, 3개 도메인 융합 단백질은 RAGE로부터 유래된 1개의 면역글로불린 도메인과, 인간 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 2개의 면역글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 RAGE 도메인간 링커를 통하여 CH2 면역글로불린 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 연결된 단일 RAGE 면역글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 V 도메인 및 하단 도메인간 링커에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 136 (서열 15) 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 136 (서열 16) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 한 양태에서는, 서열 31 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 구조물이 3개 도메인 RAGE 융합 단백질을 코딩할 수 있다.
RAGE 도메인간 링커 단편은 본래 RAGE 면역글로불린 도메인의 하단이므로, RAGE 면역글로불린 도메인에 연결되는 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE V 도메인에 대해서는, 도메인간 링커가 이러한 V 도메인으로부터 본래 하단인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 상기 링커가 전장의 RAGE의 아미노산 117 내지 123에 상응하는 서열 21을 포함할 수 있다. 또한, 상기 링커는 천연 RAGE 서열의 부가 부분을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열 21의 상단 및 하단에 여러 개의 아미노산 (예를 들어, 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산)을 포함하는 도메인간 링커를 사용할 수도 있다. 따라서, 한 양태에서는 도메인간 링커가 전장의 RAGE의 아미노산 117 내지 136을 포함하는 서열 23을 포함한다. 또한, 상기 링커의 어느 한 말단으로부터, 예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산을 결실시킨 서열 21의 단편을 사용할 수 있다. 대체 양태에서는, 상기 링커가 서열 21 또는 서열 23과 70%, 80% 또는 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다.
RAGE Cl 도메인의 경우에는, 상기 링커가 본래 C1 도메인의 하단인 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 상기 링커가 전장의 RAGE의 아미노산 222 내지 251에 상응하는 서열 22를 포함할 수 있다. 또한, 상기 링커는 천연 RAGE 서열의 부가 부분을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열 22의 상단 및 하단에 여러 개의 아미노산 (예를 들어, 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산)을 포함하는 링커를 사용할 수도 있다. 또한, 상기 링커의 어느 한 말단으로부터, 예를 들어 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산을 결실시킨 서열 22의 단편을 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서는 RAGE 도메인간 링커가 아미노산 222 내지 226에 상응하는 서열 24를 포함할 수 있다. 또한, 도메인간 링커는 RAGE 아미노산 318 내지 342에 상응하는 서열 44를 포함할 수 있다.
상기 방법은 DNA 구조물을 발현 벡터 내로 혼입시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 따라서 특정 양태에서, 본 발명은 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 면역글로불린의 CH2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드에 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 발현 벡터를 포함한다. 특정 양태에서는, RAGE 폴리펩티드가, RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고, RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, RAGE 면역글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 갖는 본원에 기재된 바와 같은 구조물을 포함한다. 예를 들어, 세포를 형질감염시키기 위해 사용된 발현 벡터는 핵산 서열인 서열 30 또는 그의 단편, 또는 서열 31 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.
상기 방법은 특정 세포를 본 발명의 발현 벡터로 형질감염시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 따라서 특정 양태에서, 본 발명은 상기 세포가 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 면역글로불린의 CH2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드에 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 발현하도록, 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 발현하는 발현 벡터를 이용하여 형질감염시킨 세포를 포함한다. 특정 양태에서는, RAGE 폴리펩티드가, RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고, RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, RAGE 면역글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 갖는 본원에 기재된 바와 같은 구조물을 포함한다. 예를 들어, 상기 발현 벡터는 핵산 서열인 서열 30 또는 그의 단편, 또는 서열 31 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상이한 길이의 인간 RAGE의 5' cDNA 서열을 인간 IgGl Fc (γ1)의 3' cDNA 서열과 융합시킴으로써 RAGE-IgG Fc 융합 단백질을 발현하는 플라스미드를 구축할 수 있다. 표준 재조합 기술을 사용하여 발현 카세트 서열을 발현 벡터, 예를 들어 pcDNA3.1 발현 벡터 (공급처: Invitrogen, CA) 내로 삽입할 수 있다.
또한, 상기 방법은 발현 벡터를 숙주 세포 내로 형질감염시키는 것을 포함할 수 있다. 한 양태에서는, 재조합체를 중국산 햄스터 난소 세포 내로 형질감염시키고, 발현을 최적화시킬 수 있다. 대체 양태에서는, 상기 세포가 0.1 내지 20 그램/리터, 또는 0.5 내지 10 그램/리터, 또는 1 내지 2 그램/리터로 생성될 수 있다.
당해 분야에 공지된 바와 같이, 이러한 핵산 구조물은, 예를 들어 관심있는 돌연변이를 포함하는 프라이머를 사용하여 핵산 주형을 PCR 증폭시킴으로써 돌연변이에 의해 변형시킬 수 있다. 이러한 방식으로, RAGE 리간드에 대한 다양한 친화도를 나타내는 폴리펩티드를 고안할 수 있다. 한 양태에서는, 이와 같이 돌연변이시킨 서열이 출발 DNA와 90% 이상 동일할 수 있다. 따라서, 변이체는 엄격한 조건 하에 (즉, 1몰 염 중의 DNA 이중체의 융점 (TM) 보다 약 20 내지 27℃ 아래 온도 등가 조건) 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
발현 벡터를 적당한 숙주 내로 형질감염시킴으로써 코딩 서열을 발현시킬 수 잇다. 예를 들어, 재조합 벡터가 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포 내로 안정적으로 형질감염될 수 있고, 융합 단백질을 발현하는 세포를 선별하여 클로닝하였다. 특정 양태에서, 재조합 구조물을 발현하는 세포를 대상으로 하여, 항생제 G418을 적용함으로써 플라스미드-코딩된 네오마이신 내성에 대해 선별한다. 개개 클론을 선별할 수 있고, 세포 상등액을 웨스턴 블롯 (Western Blot) 분석함으로써 탐지된 바와 같이 고 수준의 재조합 단백질을 발현하는 클론을 확장시킬 수 있으며, 단백질 A 칼럼을 사용하여 친화 크로마토그래피함으로써 유전자 생성물을 정제하였다.
본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산의 샘플 양태가 도 2 내지 5에 도시되어 있다. 예를 들어, 상기 언급된 바와 같이, 재조합 DNA 구조물에 의해 생성된 융합 단백질은 제2의 비-RAGE 폴리펩티드에 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 융합 단백질은 RAGE 단백질로부터 유래된 2개의 도메인과, 면역글로불린으로부터 유래된 2개의 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 구조를 갖는 융합 단백질 TTP-4000 (TT4)을 코딩하는 핵산 구조물의 한 예가 도 2에 도시되어 있다 (서열 30). 도 2에 도시된 바와 같이, 진하게 강조한 코딩 서열 1 내지 753은 RAGE N-말단 단백질 서열을 코딩하는 반면, 서열 754 내지 1386은 IgG Fc 단백질 서열을 코딩한다.
서열 30, 또는 이와 90% 동일한 서열로부터 유래된 경우, 융합 단백질은 서열 32의 4개 도메인 아미노산 서열, 또는 신호 서열을 제거시킨 폴리펩티드 (예: 서열 33 또는 서열 34)를 포함할 수 있다 (도 4). 도 4에서는, RAGE 아미노산 서열이 진하게 강조되었다. 면역글로불린 서열은 IgG의 CH2 및 CH3 면역글로불린 도메인이다. 도 6B에 도시된 바와 같이, 전장의 TTP-4000 RAGE 융합 단백질의 첫 번째 251개 아미노산은 RAGE 폴리펩티드 서열로서, 아미노산 1 내지 22/23을 포함하는 신호 서열, 아미노산 23/24 내지 116을 포함하는 V 면역글로불린 도메인 (리간드 결합 부위 포함), 아미노산 117 내지 123을 포함하는 도메인간 링커, 아미노산 124 내지 221을 포함하는 제2 면역글로불린 도메인 (C1), 및 아미노산 222 내지 251을 포함하는 하단 도메인간 링커를 함유한다.
특정 양태에서는, 융합 단백질이 제2 RAGE 면역글로불린 도메인을 반드시 포함할 수는 없다. 예를 들어, 융합 단백질은 RAGE로부터 유래된 1개의 면역글로불린 도메인과, 인간 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 2개의 면역글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 구조물의 한 예가 도 3에 도시되어 있다 (서열 31). 도 3에 도시된 바와 같이, 진하게 강조한 뉴클레오티드 1 내지 408의 코딩 서열은 RAGE N-말단 단백질 서열을 코딩하는 반면, 서열 409 내지 1041은 인간 IgG1 Fc (γ1) 단백질 서열을 코딩한다.
서열 31, 또는 이와 90% 동일한 서열로부터 유래된 경우, 융합 단백질은 서열 35의 3개 도메인 아미노산 서열, 또는 신호 서열을 제거시킨 폴리펩티드 (예: 서열 36 또는 서열 37)를 포함한다 (도 5). 도 5에서는, RAGE 아미노산 서열이 진하게 강조되었다. 도 6B에 도시된 바와 같이, 전장의 TTP-3000 RAGE 융합 단백질의 첫 번째 136개 아미노산은 RAGE 폴리펩티드 서열로서, 아미노산 1 내지 22/23을 포함하는 신호 서열, 아미노산 23/24 내지 116을 포함하는 V 면역글로불린 도메인 (리간드 결합 부위 포함) 및 아미노산 117 내지 136을 포함하는 도메인간 링커를 함유한다. 서열 137 내지 346에는 IgG의 CH2 및 CH3 면역글로불린 도메인이 포함된다.
본 발명의 융합 단백질은 제2의 폴리펩티드를 포함하지 않는 RAGE 폴리펩티드에 비해 개선된 생체내 안정성을 나타낼 수 있다. 이러한 융합 단백질을 추가로 변형시켜 안정성, 효능, 효력 및 생체내 이용 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 해독 후 프로세싱 또는 화학적 변형에 의해 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 L-, D-, 또는 천연이 아닌 아미노산, 알파-이치환된 아미노산, 또는 N-알킬 아미노산을 포함하도록 합성적으로 제조할 수 있다. 부가적으로, 단백질을 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 포스파티딜이노시톨 등의 지질 부착, 디설파이드 결합 형성 등에 의해 변형시킬 수 있다. 더우기, 폴리에틸렌 글리콜을 부가하여 본 발명의 융합 단백질의 생물학적 안정성을 증가시킬 수 있다.
RAGE 융합 단백질에 RAGE 길항제의 결합
본 발명의 융합 단백질은 수 많은 적용 분야를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질은 RAGE 리간드, 예를 들어 RAGE 작동제, 길항제 또는 조절제를 확인하기 위한 결합 검정에 사용할 수 있다.
예를 들어 한 양태에서, 본 발명은 (a) 제2의 비-RAGE 폴리펩티드에 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공하는 단계 (여기서, RAGE 폴리펩티드는 리간드 결합 부위를 포함한다); (b) RAGE에 대한 공지된 결합 친화도를 갖는 리간드 및 관심있는 화합물과 상기 융합 단백질을 혼합하는 단계; 및 (c) 상기 관심있는 화합물의 존재 하에 RAGE 융합 단백질에 대한 공지된 RAGE 리간드의 결합을 측정하는 단계를 포함하여, RAGE 조절제를 탐지하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서는, 리간드 결합 부위가 융합 단백질의 가장 N-말단 도메인을 포함한다.
RAGE 융합 단백질은 또한, RAGE 조절제를 탐지하기 위한 키트를 제공할 수도 있다. 예를 들어 한 양태에서는, 본 발명의 키트가 (a) 양성 대조군으로서, RAGE에 대한 공지된 결합 친화도를 지닌 화합물; (b) 제2의 비-RAGE 폴리펩티드와 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 RAGE 융합 단백질 (여기서, RAGE 폴리펩티드는 RAGE 리간드 결합 부위를 포함한다); 및 (c) 사용에 관한 지시사항을 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 리간드 결합 부위가 융합 단백질의 가장 N-말단 도메인을 포함한다.
RAGE 단백질 또는 폴리펩티드는 전장의 인간 RAGE (예: 서열 1), 또는 인간 RAGE의 단편을 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 어떠한 신호 서열 잔기도 포함하지 않는다. RAGE의 신호 서열은 전장의 RAGE (서열 1)의 잔기 1 내지 22 또는 잔기 1 내지 23을 포함할 수 있다. 대체 양태에서, RAGE 폴리펩티드는 인간 RAGE 또는 그의 단편과 70%, 80% 또는 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 한 양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 인간 RAGE 또는 그의 단편을 포함할 수 있는데, 제1 잔기로서 메티오닌이 아닌 글리신을 수반한다 [참고: 예를 들어, Neeper et al, (1992)]. 또한, 인간 RAGE는 신호 서열이 제거된 전장의 RAGE (예를 들어, 서열 2 또는 서열 3) (도 1A 및 1B) 또는 이러한 아미노산 서열의 일부를 포함할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은 또한, sRAGE (예: 서열 4), sRAGE와 90% 동일한 폴리펩티드, 또는 sRAGE의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 인간 sRAGE 또는 그의 단편을 포함할 수 있는데, 제1 잔기로서 메티오닌이 아닌 글리신을 수반한다 [참고: 예를 들어, Neeper et al, (1992)]. 또한, 인간 RAGE는 신호 서열이 제거된 인간 sRAGE (예를 들어, 서열 5 또는 서열 6) (도 1C) 또는 이러한 아미노산 서열의 일부를 포함할 수 있다. 기타 양태에서, RAGE 단백질은 V 도메인 (예: 서열 7 또는 서열 8; 도 1D)을 포함할 수 있다. 또한, V 도메인 또는 그의 단편과 90% 동일한 서열을 사용할 수도 있다. 또한, RAGE 단백질은 V 도메인의 일부를 포함하는 RAGE의 단편 (예: 서열 9 또는 서열 10, 도 1D)을 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 서열 10 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서는, RAGE 단편이 합성 펩티드이다.
융합 단백질에는 RAGE 또는 그의 단편으로부터 유래되지 않은 몇 가지 유형의 펩티드가 포함될 수 있다. 융합 단백질의 제2 폴리펩티드는 면역글로불린으로부터 유래된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 중쇄 (또는 그의 일부)는 다음 공지된 중쇄 이소형 중의 어느 한 가지로부터 유래될 수 있다: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε), 또는 IgA (α). 또한, 중쇄 (또는 그의 일부)는 다음 공지된 중쇄 아유형 중의 어느 한 가지로부터 유래될 수 있다: IgG1 (γ1), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgA1 (α1), IgA2 (α2), 또는 생물학적 활성을 변경시키는 이들 이소형 또는 아유형의 돌연변이물. 제2 폴리펩티드는 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인, 또는 이들 도메인 중의 어느 하나, 또는 둘 다의 일부를 포함할 수 있다. 예시 양태로서, 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드는 서열 38 또는 서열 40을 포함할 수 있다. 면역글로불린 펩티드는 서열 39 또는 서열 41의 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
면역글로불린 쇄의 Fc 부분은 생체 내에서 프로염증성일 수 있다. 따라서, 본 발명의 RAGE 융합 단백질은 면역글로불린 쇄가 아닌 RAGE로부터 유래된 Fc 서열을 포함할 수 있다. 한 양태에서, 융합 단백질은 CH2 면역글로불린 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드와 연결된 RAGE 면역글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 한 양태에서, RAGE 폴리펩티드는, RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고, RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, RAGE 면역글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 포함할 수 있다. 면역글로불린의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인, 또는 이들 도메인 중의 어느 하나, 또는 둘 다의 일부를 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예시 양태로서, 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드는 서열 38 또는 서열 40을 포함할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 RAGE로부터의 단일 또는 다중 도메인을 포함할 수 있다. 또한, RAGE 면역글로불린 도메인에 연결된 도메인간 링커를 포함하는 RAGE 폴리펩티드는 전장 RAGE 단백질의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어 한 양태에서는, 융합 단백질이 RAGE 단백질로부터 유래된 2개의 면역글로불린 도메인과, 인간 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 2개의 면역글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 융합 단백질은 제1 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제1 RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 면역글로불린 도메인의 N-말단 아미노산이 제1 도메인간 링커의 C-말단 아미노산에 연결되며, 제2 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제2 RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 CH2 면역글로불린 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, 제2 RAGE 면역글로불린 도메인 및 제2 RAGE 도메인간 링커에 연결된 제1 RAGE 면역글로불린 도메인 및 제1 도메인간 링커를 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 V 도메인, C1 도메인, 이들 두 도메인을 연결시켜 주는 도메인간 링커, 및 C1의 제2 도메인간 링커 하단에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 251 (서열 19) 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 251 (서열 20) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 한 양태에서는, 서열 30 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 구조물이 4개 도메인 RAGE 융합 단백질을 코딩할 수 있다.
또 다른 한편, 3개 도메인 융합 단백질은 RAGE로부터 유래된 1개의 면역글로불린 도메인과, 인간 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 2개의 면역글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 RAGE 도메인간 링커를 통하여 CH2 면역글로불린 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 연결된 단일 RAGE 면역글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 V 도메인 및 하단 도메인간 링커에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 136 (서열 15) 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 136 (서열 16) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 한 양태에서는, 서열 31 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 구조물이 3개 도메인 RAGE 융합 단백질을 코딩할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, RAGE 도메인간 링커 단편은 본래 RAGE 면역글로불린 도메인의 하단이므로, RAGE 면역글로불린 도메인에 연결되는 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE V 도메인에 대해서는, 도메인간 링커가 이러한 V 도메인으로부터 본래 하단인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 상기 링커가 전장의 RAGE의 아미노산 117 내지 123에 상응하는 서열 21을 포함할 수 있다. 또한, 상기 링커는 천연 RAGE 서열의 부가 부분을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열 21의 상단 및 하단에 여러 개의 아미노산 (예를 들어, 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산)을 포함하는 도메인간 링커를 사용할 수도 있다. 따라서, 한 양태에서는 도메인간 링커가 전장의 RAGE의 아미노산 117 내지 136을 포함하는 서열 23을 포함한다. 또한, 상기 링커의 어느 한 말단으로부터, 예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산을 결실시킨 서열 21의 단편을 사용할 수 있다. 대체 양태에서는, 상기 링커가 서열 21 또는 서열 23과 70%, 80% 또는 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다.
RAGE Cl 도메인의 경우에는, 상기 링커가 본래 C1 도메인의 하단인 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 상기 링커가 전장의 RAGE의 아미노산 222 내지 251에 상응하는 서열 22를 포함할 수 있다. 또한, 상기 링커는 천연 RAGE 서열의 부가 부분을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열 22의 상단 및 하단에 여러 개의 아미노산 (예를 들어, 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산)을 포함하는 링커를 사용할 수도 있다. 또한, 상기 링커의 어느 한 말단으로부터, 예를 들어 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산을 결실시킨 서열 22의 단편을 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서는 RAGE 도메인간 링커가 아미노산 222 내지 226에 상응하는 서열 24를 포함할 수 있다. 또한, 도메인간 링커는 RAGE 아미노산 318 내지 342에 상응하는 서열 44를 포함할 수 있다.
예를 들어, RAGE 융합 단백질은 효능있는 RAGE 리간드를 확인하기 위한 결합 검정에 사용할 수 있다. 이러한 결합 검정의 한 가지 예시 양태에서는, 공지된 RAGE 리간드를 웰당 약 5 마이크로그램의 농도로 [각 웰은 총 약 100 마이크로리터 (㎕) 용적을 함유한다] 고형 기판 [예: 맥시소르브 (Maxisorb) 판] 상으로 피복시킬 수 있다. 상기 판을 4℃ 하에 밤새 항온 배양하여 상기 리간드가 흡착되게 할 수 있다. 또 다른 한편, 보다 고온 (예: 실온) 하에 보다 단기간 항온 배양을 사용할 수도 있다. 리간드가 상기 기판에 결합할 수 있는 시간이 경과한 후, 검정 웰을 흡인시키고, 차단용 완충액 (예를 들어, 50 mM 이미다졸 완충제 중의 1% BSA, pH 7.2)을 가하여 비-특이적 결합을 차단시킬 수 있다. 예를 들어, 차단용 완충액을 상기 판에 실온 하에 1시간 동안 가할 수 있다. 이어서, 상기 판을 흡인 및/또는 세척 완충액으로 세척할 수 있다. 한 양태에서는, 20 mM 이미디졸, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈 (Tween)-20, 5 mM CaCl2 및 5 mM MgCl2, pH 7.2를 포함하는 완충액을 세척 완충액으로서 사용할 수 있다. 그 다음, 융합 단백질을 증가 희석률로 상기 검정 웰에 가할 수 있다. 이어서, RAGE 융합 단백질을 상기 검정 웰에서 고정화 리간드와 함께 항온 배양하여, 결합이 평형을 획득할 수 있도록 한다. 한 양태에서는, RAGE 융합 단백질을 37℃ 하에 약 1시간 동안 고정화 리간드와 함께 항온 배양한다. 대체 양태에서는, 보다 저온 하에 보다 길게 항온 배양할 수도 있다. 융합 단백질과 고정화 리간드를 항온 배양한 후, 상기 판을 세척하여 결합되지 않은 모든 융합 단백질을 제거할 수 있다. 고정화 리간드에 결합된 융합 단백질을 각종 방식으로 탐지할 수 있다. 한 양태에서는, ELISA를 이용하여 탐지한다. 따라서, 한 양태에서는 모노클로날 마우스 항-인간 IgGl, 바이오티닐화 염소 항-마우스 IgG, 및 아비딘 연결된 알칼리성 포스파타제를 함유하는 면역탐지 복합체를, 상기 검정 웰에서 고정화된 융합 단백질에 가할 수 있다. 이러한 면역탐지 복합체가 고정화 융합 단백질과 결합할 수 있도록 하여, 융합 단백질과 면역탐지 복합체 간의 결합이 평형을 획득하도록 한다. 예를 들어, 상기 복합체를 실온 하에 1시간 동안 융합 단백질과 결합될 수 있도록 한다. 이때, 검정 웰을 세척 완충액으로 세척함으로써, 결합되지 않은 모든 복합체를 제거할 수 있다. 결합된 복합체는 알칼리성 포스파타제 기질인 파라-니트로페닐포스페이트 (PNPP)를 가한 다음, 405 nm 에서의 흡광도 증가치로서 PNPP가 파라-니트로페놀 (PNP)로 전환되는 양을 측정함으로써 탐지할 수 있다.
특정 양태에서는, RAGE 리간드가 RAGE 융합 단백질과 나노몰 (nM) 또는 마이크로몰 (μM) 친화도로 결합한다. RAGE 리간드가 본 발명의 RAGE 융합 단백질과 결합하는 것을 예시하는 실험이 도 7에 도시되어 있다. 초기 농도가 각각 1.082 mg/ml 및 370 ㎍/ml인 TTP-3000 (TT3) 및 TTP-4000 (TT4)의 용액을 준비하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, 각종 희석률에서 융합 단백질 TTP-3000 및 TTP-4000은 고정화 RAGE 리간드 아밀로이드-베타 (A베타) [아밀로이드 베타 (1-40); 공급처: Biosource], SlOOb (SlOO), 및 암포테린 (Ampho)과 결합하여, 흡광도 증가를 가져다 줄 수 있다. 리간드의 부재 하에서는 (즉, BSA로만 피복시킴) 흡광도 증가가 전혀 없었다.
본 발명의 결합 검정을 사용하여 RAGE에 대한 리간드 결합을 정량화할 수 있다. 대체 양태에서는, RAGE 리간드가 본 발명의 융합 단백질과 0.1 내지 1000 나노몰 (nM), 1 내지 500 nM, 또는 10 내지 80 nM 범위의 결합 친화도로 결합할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질을 또한 사용하여, RAGE와 결합할 수 있는 능력을 지닌 화합물을 확인 (동정)할 수 있다. 도 8 및 9에 각각 도시된 바와 같이, RAGE 리간드를 대상으로 하여, TTP-4000 (TT4) 또는 TTP-3000 (TT3) 융합 단백질에 대한 결합을 놓고 고정화 아밀로이드 베타와 경쟁할 수 있는 능력에 대해 검정할 수 있다. 따라서, 10 μM의 최종 검정 농도 (FAC) 하의 RAGE 리간드는 초기 TTP-4000 용액 (도 8) 또는 TTP-3000 (도 9)의 1:3, 1:10, 1:30, 및 1:100 농도에서 아밀로이드-베타에 대한 RAGE 융합 단백질의 결합을 전위시킬 수 있는 것으로 관찰될 수 있다.
세포성 효과기의 조절
본 발명의 융합 단백질의 양태들을 사용하여 RAGE에 의해 매개된 생물학적 반응을 조절할 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현에 있어서의 RAGE-유도된 증가를 조절하도록 융합 단백질을 고안할 수 있다. 따라서 특정 양태에서는, 본 발명의 융합 단백질을 사용하여 생물학적 효소의 기능을 조절할 수 있다. 예를 들어, RAGE와 그의 리간드 간의 상호 작용은 산화적 스트레스와, NF-κB, 및 NF-κB 조절된 유전자, 예를 들어 사이토킨 IL-lβ, TNF-α 등의 활성화를 유발시킬 수 있다. 또한, 몇 가지 기타 조절성 경로, 예를 들어 p21ras, MAP 키나제, ERKl, 및 ERK2가 관여하는 경로가 RAGE에 대한 AGE 및 기타 리간드의 결합에 의해 활성화되는 것으로 밝혀졌다.
세포성 효과기 TNF-α의 발현을 조절하기 위해 본 발명의 융합 단백질을 사용하는 것이 도 10에 도시되어 있다. THP-1 골수성 세포를, 10% FBS가 보충된 RPMI-1640 배지에서 배앙하고, RAGE를 SlOOb로 자극함으로써 TNF-α를 분비하도록 유도시킬 수 있다. 이러한 자극이 RAGE 융합 단백질의 존재 하에 일어나게 되면, RAGE에 대한 SlOOb 결합으로 인한 TNF-α 유도가 억제될 수 있다. 따라서, 도 10에 도시된 바와 같이, 10 ㎍ TTP-3000 (TT3) 또는 TTP-4000 (TT4) RAGE 융합 단백질을 부가하면, SlOOb에 의한 TNF-α 유도가 약 50% 내지 75% 정도 저하된다. 융합 단백질 TTP-4000은 SlOOb에 의한 TNF-α 유도를 차단시키는데 있어서 적어도 sRAGE 만큼 유효할 수 있다 (도 10). TTP-4000 및 TTP-3000의 RAGE 서열에 대한 억제 특이성은, IgG 단독을 SlOOb 자극된 세포에 부가한 실험에 의해 밝혀졌다. IgG와 SlOOb를 본 검정에 부가한 결과, SlOOb 단독과 동일한 수준의 TNF-α가 나타났다.
RAGE 융합 단백질의 생리적 특징
sRAGE가 RAGE-매개된 질병을 조절하는데 있어서 치료적 이득을 지닐 수 있긴 하지만, 인간 sRAGE는 혈장 내에서의 반감기가 비교적 짧기 때문에 그 자체 만으로 치료제로서 사용하기에는 한계가 있을 수 있다. 예를 들어, 설치류 sRAGE는 정상 및 당뇨병 랫트에서 대략 20시간의 반감기를 갖는 반면, 인간 sRAGE는 면역반응성 sRAGE 잔류에 의해 평가한 경우에 2시간 미만의 반감기를 갖고 있었다 [참고: Renard et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 290:1458-1466 (1999)].
sRAGE와 유사한 결합 특징을 지니고 있긴 하지만, 보다 안정한 약동학적 프로파일을 지닌 RAGE 치료제를 생성시키기 위해, 하나 이상의 인간 면역글로불린 도메인에 연결된 RAGE 리간드 결합 부위를 포함하는 RAGE 융합 단백질을 사용할 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 면역글로불린 도메인에는 면역글로불린 중쇄의 Fc 부분이 포함될 수 있다.
이러한 면역글로불린 Fc 부분은 융합 단백질에 몇 가지 특징을 제공해줄 수 있다. 예를 들어, Fc 융합 단백질은 이러한 융합 단백질의 혈청 반감기를 종종 수 시간에서부터 수 일까지 증가시킬 수 있다. 약동학적 안정성 상의 증가는 일반적으로, Fc 단편의 CH2 영역과 CH3 영역 간의 링커와 FcRn 수용체 간의 상호 작용에 따른 결과이다 [참고: Wines et al., J. Immunol., 164:5313-5318 (2000)].
면역글로불린 Fc 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이 안정성 증가 이점을 제공해줄 수 있긴 하지만, 면역글로불린 융합 단백질은 숙주 내로 도입되는 경우에 염증성 반응을 유발시킬 수 있다. 이러한 염증성 반응은 대부분이, 융합 단백질의 면역글로불린의 Fc 부분에 기인될 수 있다. 프로염증성 반응은 제거시킬 필요가 있는 병든 세포 유형 (예: 암 세포, 및/또는 자가면역 질환을 유발시키는 림프구 집단) 상에서 표적이 발현되는 경우에 바람직한 특징일 수 있다. 프로염증성 반응은 표적이 수용성 단백질인 경우에는 분명치 않은 특징일 수 있는데, 이는 대부분의 수용성 단백질이 면역글로불린을 활성화시키지 못하기 때문이다. 그러나, 프로염증성 반응은 파괴로 인해 바람직하지 못한 부작용이 유발될 수도 있는 세포 유형 상에 표적이 발현되는 경우에는, 부정적인 특징이 될 수도 있다. 또한, 프로염증성 반응은 특정 조직 표적에 대한 융합 단백질 결합 부위에 염증성 케스케이드가 수립되는 경우에도 부정적인 특징이 될 수 있는데, 이는 많은 염증 매개인자가 주변 조직에 해로울 수 있고/있거나 전신 효과를 유발시킬 수 있기 때문이다.
면역글로불린 Fc 단편 상의 주요 프로염증성 부위는 CH1과 CH2 사이의 힌지 영역 상에 체류한다. 이러한 힌지 영역은 각종 백혈구 상의 FcRl-3와 상호 작용하고 이들 세포가 표적을 공격하도록 촉발시킨다 [참고: Wines et al., J. Immunol., 164:5313-5318 (2000)].
RAGE-매개된 질병에 대한 치료제로서, RAGE 융합 단백질은 염증성 반응 발생을 요구하지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명의 RAGE 융합 단백질에 관한 양태는 면역글로불린 도메인(들)에 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 (여기서는, 면역글로불린으로부터의 Fc 힌지 영역이 제거되고 RAGE 폴리펩티드로 대체된다)을 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 염증 세포 상에서 RAGE 융합 단백질과 Fc 수용체 간의 상호 작용을 최소화할 수 있다. 그러나, 융합 단백질의 각종 면역글로불린 도메인들 간의 적절한 적층과 기타 3차원적 구조적 상호 작용을 유지시키는 것이 중요할 수 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질에 관한 양태는 면역글로불린 중쇄의 정상적인 힌지 영역 대신, RAGE의 V 도메인과 C1 도메인을 격리시키는, 생물학적으로 불활성이지만 구조적으로 유사한 RAGE 도메인간 링커, 또는 RAGE의 C1 도메인과 C2 도메인을 격리시키는 링커로 치환할 수 있다. 따라서, 융합 단백질의 RAGE 폴리펩티드는 RAGE 면역글로불린 도메인/링커 단편을 형성하기 위해 RAGE 면역글로불린 도메인의 하단에 본래 발견되는 도메인간 링커 서열을 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, RAGE 또는 면역글로불린에 의해 기여된 면역글로불린 도메인들 간의 3차원적 상호 작용을 유지시킬 수 있다.
특정 양태에서는, 본 발명의 RAGE 융합 단백질이 sRAGE와 비교해서 약동학적 안정성 상의 상당한 증가를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 도 11은 RAGE 융합 단백질 TTP-4000이 일단 그의 리간드를 포화시키면, 300 시간 초과의 반감기를 보유할 수 있다는 것을 나타낸다. 이는 인간 혈장에서의 sRAGE의 반감기가 단지 수 시간에 불과한 것과는 대조적일 수 있다.
따라서, 특정 양태에서는 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하여, 허용 가능하지 않은 양의 염증을 발생시키지 않으면서 RAGE-매개된 질병을 치료하기 위한 수단으로서 RAGE에 대한 생리적 리간드의 결합을 길항시킬 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은 IgG와 비교해서 프로염증성 반응 발생을 상당히 저하시킬 수 있다. 예를 들어, 도 12에 도시된 바와 같이 RAGE 융합 단백질 TTP-4000은 인간 IgG 자극에 의한 TNF-α 방출이 탐지되는 조건 하에서도 세포로부터 TNF-α 방출을 자극하지 않는다.
RAGE 융합 단백질을 이용한 질병 치료
본 발명은 또한, 인간 대상체에게서 RAGE-매개된 장애를 치료하는 방법을 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 상기 방법이 제2의 비-RAGE 폴리펩티드와 연결된 RAGE 리간드 결합 부위를 포함하는 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 특정 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 한 양태에서는, 이러한 융합 단백질이 RAGE 리간드 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 리간드 결합 부위가 융합 단백질의 가장 N-말단 도메인을 포함한다. 이러한 RAGE 리간드 결합 부위는 RAGE의 V 도메인, 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, RAGE 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 서열 10 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함한다.
특정 양태에서, RAGE 폴리펩티드는 면역글로불린 도메인 또는 면역글로불린 도메인의 일부 (예: 그의 단편)을 포함하는 폴리펩티드와 연결될 수 있다. 한 양태에서는, 면역글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 인간 IgG의 CH2 도메인 또는 CH3 도메인 중의 하나 이상의 적어도 일부를 포함한다.
RAGE 단백질 또는 폴리펩티드는 전장의 인간 RAGE (예: 서열 1), 또는 인간 RAGE의 단편을 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 어떠한 신호 서열 잔기도 포함하지 않는다. RAGE의 신호 서열은 전장의 RAGE (서열 1)의 잔기 1 내지 22 또는 잔기 1 내지 23을 포함할 수 있다. 대체 양태에서, RAGE 폴리펩티드는 인간 RAGE 또는 그의 단편과 70%, 80% 또는 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 한 양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 인간 RAGE 또는 그의 단편을 포함할 수 있는데, 제1 잔기로서 메티오닌이 아닌 글리신을 수반한다 [참고: 예를 들어, Neeper et al, (1992)]. 또한, 인간 RAGE는 신호 서열이 제거된 전장의 RAGE (예를 들어, 서열 2 또는 서열 3) (도 1A 및 1B) 또는 이러한 아미노산 서열의 일부를 포함할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은 또한, sRAGE (예: 서열 4), sRAGE와 90% 동일한 폴리펩티드, 또는 sRAGE의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 인간 sRAGE 또는 그의 단편을 포함할 수 있는데, 제1 잔기로서 메티오닌이 아닌 글리신을 수반한다 [참고: 예를 들어, Neeper et al, (1992)]. 또한, 인간 RAGE는 신호 서열이 제거된 sRAGE (예를 들어, 서열 5 또는 서열 6) (도 1C) 또는 이러한 아미노산 서열의 일부를 포함할 수 있다. 기타 양태에서, RAGE 단백질은 V 도메인 (예: 서열 7 또는 서열 8; 도 1D)을 포함할 수 있다. 또한, V 도메인 또는 그의 단편과 90% 동일한 서열을 사용할 수도 있다. 또한, RAGE 단백질은 V 도메인의 일부를 포함하는 RAGE의 단편 (예: 서열 9 또는 서열 10, 도 1D)을 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 서열 10 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서는, RAGE 단편이 합성 펩티드이다.
융합 단백질에는 RAGE 또는 그의 단편으로부터 유래되지 않은 몇 가지 유형의 펩티드가 포함될 수 있다. 융합 단백질의 제2 폴리펩티드는 면역글로불린으로부터 유래된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 중쇄 (또는 그의 일부)는 다음 공지된 중쇄 이소형 중의 어느 한 가지로부터 유래될 수 있다: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε), 또는 IgA (α). 또한, 중쇄 (또는 그의 일부)는 다음 공지된 중쇄 아유형 중의 어느 한 가지로부터 유래될 수 있다: IgG1 (γ1), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgA1 (α1), IgA2 (α2), 또는 생물학적 활성을 변경시키는 이들 이소형 또는 아유형의 돌연변이물. 제2 폴리펩티드는 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인, 또는 이들 도메인 중의 어느 하나, 또는 둘 다의 일부를 포함할 수 있다. 예시 양태로서, 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드는 서열 38 또는 서열 40을 포함할 수 있다. 면역글로불린 펩티드는 서열 39 또는 서열 41의 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 V 도메인에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 116 (서열 7) 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 116 (서열 8) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또한, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 C1 도메인에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 124 내지 221 (서열 11) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 RAGE의 C2 도메인에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 227 내지 317 (서열 12) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또한, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 V 도메인 및 하단 도메인간 링커에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 123 (서열 13) 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 123 (서열 14) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또한, RAGE 폴리펩티드는 V 도메인, C1 도메인 및 이들 두 도메인을 연결시켜 주는 도메인간 링커에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 226 (서열 17) 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 226 (서열 18) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또한, RAGE 폴리펩티드는 sRAGE (즉, V, C1 및 C2 도메인, 및 도메인간 링커를 코딩함)에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 339 (서열 5) 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 339 (서열 6) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또한 이들 서열 각각의 단편을 사용할 수도 있다.
면역글로불린 쇄의 Fc 부분은 생체 내에서 프로염증성일 수 있다. 따라서, 한 양태에서 본 발명의 RAGE 융합 단백질은 면역글로불린로부터 유래된 도메인간 힌지 폴리펩티드가 아니라, RAGE로부터 유래된 도메인간 링커를 포함한다.
따라서, 한 양태에서는, 상기 융합 단백질이 면역글로불린의 CH2 도메인, 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드와 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 한 양태에서는, CH2 도메인 또는 그의 단편이 서열 42를 포함한다.
한 양태에서, RAGE 폴리펩티드는, RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고, RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, RAGE 면역글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 포함한다. 면역글로불린의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 예시 양태로서, 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 서열 38 또는 서열 40을 포함할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 RAGE로부터의 단일 또는 다중 도메인을 포함할 수 있다. 또한, RAGE 면역글로불린 도메인에 연결된 도메인간 링커를 포함하는 RAGE 폴리펩티드는 전장 RAGE 단백질의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어 한 양태에서는, 융합 단백질이 RAGE 단백질로부터 유래된 2개의 면역글로불린 도메인과, 인간 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 2개의 면역글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 융합 단백질은 제1 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제1 RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 면역글로불린 도메인의 N-말단 아미노산이 제1 도메인간 링커의 C-말단 아미노산에 연결되며, 제2 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제2 RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 CH2 면역글로불린 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, 제2 RAGE 면역글로불린 도메인 및 제2 RAGE 도메인간 링커에 연결된 제1 RAGE 면역글로불린 도메인 및 제1 RAGE 도메인간 링커를 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 V 도메인, C1 도메인, 이들 두 도메인을 연결시켜 주는 도메인간 링커, 및 C1의 제2 도메인간 링커 하단에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 251 (서열 19) 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 251 (서열 20) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 한 양태에서는, 서열 30 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 구조물이 4개 도메인 RAGE 융합 단백질을 코딩할 수 있다.
또 다른 한편, 3개 도메인 융합 단백질은 RAGE로부터 유래된 1개의 면역글로불린 도메인과, 인간 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 2개의 면역글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 RAGE 도메인간 링커를 통하여 CH2 면역글로불린 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 연결된 단일 RAGE 면역글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 V 도메인 및 하단 도메인간 링커에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 136 (서열 15) 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 136 (서열 16) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 한 양태에서는, 서열 31 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 구조물이 3개 도메인 RAGE 융합 단백질을 코딩할 수 있다.
RAGE 도메인간 링커 단편은 본래 RAGE 면역글로불린 도메인의 하단이므로, RAGE 면역글로불린 도메인에 연결되는 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE V 도메인에 대해서는, 도메인간 링커가 본래 이러한 V 도메인으로부터 하단인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 상기 링커가 전장의 RAGE의 아미노산 117 내지 123에 상응하는 서열 21을 포함할 수 있다. 또한, 상기 링커는 천연 RAGE 서열의 부가 부분을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열 21의 상단 및 하단에 여러 개의 아미노산 (예를 들어, 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산)을 포함하는 도메인간 링커를 사용할 수도 있다. 따라서, 한 양태에서는 도메인간 링커가 전장의 RAGE의 아미노산 117 내지 136을 포함하는 서열 23을 포함한다. 또한, 상기 링커의 어느 한 말단으로부터, 예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산을 결실시킨 서열 21의 단편을 사용할 수 있다. 대체 양태에서는, 상기 링커가 서열 21 또는 서열 23과 70%, 80% 또는 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다.
RAGE Cl 도메인의 경우에는, 상기 링커가 C1 도메인의 본래 하단인 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 상기 링커가 전장의 RAGE의 아미노산 222 내지 251에 상응하는 서열 22를 포함할 수 있다. 또한, 상기 링커는 천연 RAGE 서열의 부가 부분을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열 22의 상단 및 하단에 여러 개의 아미노산 (예를 들어, 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산)을 포함하는 링커를 사용할 수도 있다. 또한, 상기 링커의 어느 한 말단으로부터, 예를 들어 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산을 결실시킨 서열 22의 단편을 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서는 RAGE 도메인간 링커가 아미노산 222 내지 226에 상응하는 서열 24를 포함할 수 있다. 또한, 도메인간 링커는 RAGE 아미노산 318 내지 342에 상응하는 서열 44를 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 각종 경로로 투여할 수 있다. 본 발명의 RAGE 융합 단백질의 투여는 복강내 (IP) 주사를 이용할 수 있다. 또 다른 한편, RAGE 융합 단백질은 경구, 비내 또는 에어로솔로서 투여할 수 있다. 또 다른 양태에서는, 정맥내 (IV) 투여한다. RAGE 융합 단백질은 피하 주사할 수도 있다. 또 다른 양태에서는, 융합 단백질을 동맥내 투여한다. 또 다른 양태에서는, 설하 투여한다. 또한, 투여는 서방출 캡슐을 이용할 수도 있다. 또 다른 양태에서는, 좌제 등에 의해서 경직장 투여할 수 있다. 예를 들어, 자가 투여가 요망되는 경우에 만성 질환을 치료하는데 있어서는 피하 투여가 유용할 수 있다.
각종 동물 모델을 사용하여, RAGE를 조절하는 치료제로서의 화합물의 용도를 검증하였다. 이들 모델의 예는 다음과 같다:
a) sRAGE는 RAGE를 통한 내피, 평활근 및 대식 세포 활성화를 억제함으로써 당뇨병 랫트와 정상 랫트 모두에서 동맥 손상에 따른 재발 협착증 랫트 모델에서 신생내막 형성을 억제하였다 [참고: Zhou et al., Circulation 107:2238-2243 (2003)];
b) sRAGE 또는 항-RAGE 항체를 사용하여 RAGE/리간드 상호 작용을 억제시키면, 전신성 아밀로이드증 마우스 모델에서 아밀로이드 반점 형성이 저하되었다 [참고: Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000)]. 아밀로이드 반점 저하에 수반하여, 치료받은 동물에게서 NF-κB의 활성화가 저하될 뿐만 아니라 염증성 사이토킨, 인터루킨-6 (IL-6) 및 대식 세포 집락 자극 인자 (M-CSF)가 감소되었다.
c) RAGE 트랜스제닉 (transgenic) 마우스 (RAGE 과발현자 및 RAGE 우세 음성 발현자)는 AD 마우스 모델에서 인지력 결핍과 반점 형성을 나타낸다 [참고: Arancio et al., EMBO J., 23:4096-4105 (2004)];
d) 당뇨병 랫트를 sRAGE로 처리하면, 혈관 투과성이 저하되었다 [참고: Bonnardel-Phu et al., Diabetes, 48:2052-2058 (1999)];
e) sRAGE로 처리하면, 당뇨병성 아포지단백질 E-기능없는 (null) 마우스에서 아테롬성 경화증 병변이 감소되었고, db/db 마우스에서 당뇨병성 신장애의 기능적 및 형태학적 지표가 방지되었다 [참고: Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003)];
f) sRAGE는 콜라겐-유도된 관절염 마우스 모델 [참고: Hofmann et al., Genes Immunol., 3: 123-135 (2002)], 실험적 알레르기성 뇌척수염 마우스 모델 [참고: Yan et al., Nat. Med. 9:28-293 (2003)] 및 염증성 장 질환 마우스 모델 [참고: Hofmann et al., Cell, 97:889-901 (1999)]에서 중증의 염증을 약화시켰다.
따라서, 특정 양태에서는 본 발명의 융합 단백질을 사용하여 당뇨병 증상 및/또는 RAGE에 의해 매개된 당뇨병으로부터 비롯된 합병증을 치료할 수 있다. 대체 양태에서, 당뇨병 증상 또는 당뇨병 말기 합병증에는 당뇨병성 신장애, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 족부 궤양, 당뇨병의 심혈관 합병증, 또는 당뇨병성 신경병증이 포함될 수 있다.
RAGE는 그의 발현이 당뇨병 병리 상태와 연관이 있는 분자에 대한 수용체로서 최초로 확인 (동정)되었기 때문에, RAGE 그 자체가 당뇨병 합병증의 병리생리 학에 있어 필수적이다. RAGE와 그의 리간드(들) 간의 상호 작용을 생체 내에서 억제시키는 것이, 당뇨병 합병증과 염증이 있는 다중 모델에서 치료적인 것으로 밝혀졌다 [참고: Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003)]. 예를 들어, 항-RAGE 항체를 이용하여 2개월간 치료하면, 당뇨병성 마우스에서 신장 기능이 정상화되었고 비정상적인 신장 조직병리 상태가 저하되었다 [참고: Flyvbjerg et al., Diabetes 53:166-172 (2004)]. 더구나, RAGE 리간드와 결합하고 RAGE/리간드 상호 작용을 억제하는 가용성 형태의 RAGE (sRAGE)를 이용하여 치료하면, 당뇨병성 아포지단백질 E-기능없는 마우스에서 아테롬성 경화증 병변이 저하되었고 db/db 마우스에서 당뇨병성 신장애의 기능적 및 형태학적 병리 상태가 약화되었다 [참고: Bucciarelli et al., Circulation 106:2827-2835 (2002)].
또한, 궁극적으로 최종당화산물 (AGE)을 형성시켜 주는 거대 분자의 비효소적 당산화 반응이 염증 부위에서, 신부전증에서, 고혈당증 및 전신성 또는 국소 산화제 스트레스와 연관된 기타 질환의 존재 하에서 증강되는 것으로 밝혀졌다 [참고: Dyer et al., J. Clin. Invest., 91:2463-2469 (1993); Reddy et al., Biochem., 34:10872-10878 (1995); Dyer et al., J. Biol. Chem., 266:11654-11660 (1991); Degenhardt et al., Cell Mol. Biol., 44:1139-1145 (1998)]. AGE가 혈관계에 축적되는 것은, 투석과 관계된 아밀로이드증 환자에게서 발견된 AGE-β2-마이크로글로불린으로 구성된 관절 아밀로이드에서와 같이 병소적으로 일어날 수 있거나 [참고: Miyata et al., J. Clin. Invest., 92:1243-1252 (1993); Miyata et al., J. Clin. Invest., 98:1088-1094 (1996)], 또는 당뇨병 환자의 혈관계 및 조직에 의해 예시된 바와 같이 전신적으로 일어날 수 있다 [참고: Schmidt et al., Nature Med., 1:1002-1004 (1995)]. AGE가 당뇨병 환자에게서 시간 경과에 따라 점진적으로 축적된다는 것은, 내인성 청소 (제거) 기전이 AGE 침착 부위에서 효과적으로 기능할 수 없다는 것을 제안하고 있다. 이와 같이 축적된 AGE는 수 많은 기전에 의해 세포성 특징을 변경시킬 수 있는 능력을 지니고 있다. RAGE가 수용체의 리간드가 축적되는 환경 하에서, 정상 조직과 혈관계에서는 저 수준으로 발현되긴 하지만, RAGE는 상향 조절되는 것으로 밝혀졌다 [참고: Li et al., J. Biol Chem., 272:16498-16506 (1997); Li et al., J. Biol. Chem., 273:30870-30878 (1998); Tanaka et al., J. Biol. Chem., 275:25781-25790 (2000)]. RAGE 발현은 당뇨병성 혈관계에서 침윤성 단핵 포식세포, 내피 및 평활근 세포에서 증가된다. 또한, 세포 배양물에서의 연구 결과, AGE-RAGE 상호 작용이 혈관성 생체 항상성에 있어 중요한 세포성 특성 상의 변화를 유발시키는 것으로 입증되었다.
당뇨병과 관계된 병리 상태를 치료하는데 있어 RAGE 융합 단백질을 사용하는 것이 도 13에 예시되어 있다. RAGE 융합 단백질 TTP-4000는, 혈관 손상에 따른 내막 팽창과 평활근 증식을 측정함으로써, 당뇨병성 재발 협착증 랫트 모델에서 평가하였다. 도 13에 예시된 바와 같이, TTP-4000을 이용한 치료는 당뇨병 관련 재발 협착증에서 혈관 내막/중막 (LM) 비 (도 13A; 표 1)를 용량-반응성 방식으로 상당히 감소시킬 수 있다. 또한, TTP-4000를 이용한 치료는 재발 협착증-관련 혈관성 평활근 세포 증식을 용량-반응성 방식으로 상당히 저하시킬 수 있다.
Figure 112007017848201-PCT00001
*P <0.05
** 고 용량과 저 용량 모두에 대해, 동물 1마리당 3 mg의 부하 용량을 사용하였다.
기타 양태에서는, 본 발명의 융합 단백질을 사용하여 아밀로이드증과 알츠하이머병을 치료 또는 역전시킬 수도 있다. RAGE는 아밀로이드 베타 (Aβ) 뿐만 아니라 SAA 및 아밀린을 포함한 기타 아밀로이드생성성 단백질에 대한 수용체이다 [참고: Yan et al., Nature, 382:685-691 (1996); Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:5296-5301 (1997); Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000); Sousa et al., Lab Invest., 80:1101-1110 (2000)]. 또한, AGE, SlOOb 및 Aβ 단백질을 포함한 RAGE 리간드는 남성에게서의 노인성 반점 주변 조직에서 발견된다 [참고: Luth et al., Cereb. Cortex 15:211-220 (2005); Petzold et al., Neurosci. Lett., 336:167-170 (2003); Sasaki et al., Brain Res., 12:256-262 (2001); Yan et al., Restor. Neurol Neruosci., 12:167-173 (1998)]. RAGE는 소단위체 (아밀로이드-β 펩티드, 아밀린, 혈청 아밀로이드 A, 프리온-유래 펩티드)의 조성에 상관없이 β-시트 섬유상 물질과 결합하는 것으로 밝혀졌다 [참고: Yan et al., Nature, 382:685-691 (1996); Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000)]. 또한, 아밀로이드 침착으로 인해 RAGE의 발현이 증강되는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 알츠하이머병 (AD) 환자의 뇌에서는 RAGE 발현이 신경원과 신경교에서 증가된다 [참고: Yan et al., Nature 382:685-691 (1996)]. RAGE 리간드의 발현과 동시에, RAGE는 AD 환자의 해마 내의 미세신경 세포와 성상 세포에서 상향 조절되지만, AD가 없는 개개인에게서는 상향 조절되지 않는다 [참고: Lue et al., Exp. Neurol., 171:29-45 (2001)]. 이러한 발견들은 RAGE를 발현하는 세포가 노인성 반점 근처에서 RAGE/RAGE 리간드 상호 작용을 통하여 활성화된다는 것을 제안하고 있다. 또한, 시험관 내에서 Aβ에 의해 매개된 미세신경교 세포의 활성화는, RAGE의 리간드-결합성 도메인에 대항하여 유도된 항체를 사용하여 차단시킬 수 있다 [참고: Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:5296-5301 (1997)]. 또한, RAGE는 피브릴 어셈블리에 대한 초점 (병소점)으로서 제공될 수 있는 것으로 입증되었다 [참고: Deane et al., Nat. Med. 9:907-913 (2003)].
또한, sRAGE 또는 항-RAGE 항체를 사용하여 RAGE/리간드 상호 작용을 생체내 억제시키면, 전신성 아밀로이드증 마우스 모델에서 아밀로이드 반점 형성이 저하되었다 [참고: Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000)]. 신경원에서 스웨덴인 및 런던인 돌연변이를 수반한 인간 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) (돌연변이체 hAPP)와 인간 RAGE를 과발현하는 이중 트랜스제닉 마우스에게서, 그들의 단일 돌연변이체 hAPP 트랜스제닉 대응물 보다 더 일찍 신경병리학적 비정상과 학습력 결함이 발생한다. 이와는 달리, 동일한 돌연변이체 hAPP 배경 상에서 우세 음성 형태의 RAGE를 발현하는 신경원으로 인해 Aβ 신호 전달 능력이 저하된 이중 트랜스제닉 마우스에게서는, 그들의 단일 APP 트랜스제닉 대응물과 비교해서 신경병리학적 이상과 학습 이상의 발병이 더 느리게 나타났다 [참고: Arancio et al., EMBO J., 23:4096-4105 (2004)].
또한, RAGE-아밀로이드 상호 작용을 억제하면, 세포성 RAGE와 세포 스트레스 마커의 발현이 저하되고 (NF-κB 활성화도 저하됨), 아밀로이드 침착이 감소되는 것으로 밝혀졌는데 [참고: Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000)], 이는 RAGE-아밀로이드 상호 작용이 아밀로이드 축적에서 뿐만 아니라 아밀로이드가 풍부한 환경 하에서 (심지어 초기 단계에서도) 세포성 특성의 교란 (섭동)에 있어 일정 역할을 한다는 것을 제안하고 있다.
따라서, 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하여 아밀로이드증을 치료할 수 있고, 알츠하이머병 (AD)과 연관된 인지 기능장애와 아밀로이드 반점을 저하시킬 수도 있다. 상기 언급된 바와 같이, sRAGE는 AD 동물 모델에서 뇌에서의 아밀로이드 반점 형성과 후속 염증성 마커 증가 둘 다를 저하시키는 것으로 밝혀졌다. 도 14A 및 14B는 AD가 있고, TTP-4000 또는 마우스 sRAGE를 이용하여 3개월간 처치한 마우스는, 비히클 또는 인간 IgG 음성 대조군 (IgG1)을 투여한 동물 보다 더 적은 수의 아밀로이드 베타 (Aβ) 반점과 덜한 인지 기능장애를 나타내었다는 것을 도시하고 있다. sRAGE와 마찬가지로, TTP-4000 또한 AD와 연관된 염증성 사이토킨 IL-1 및 TNF-α를 저하시킬 수 있다 (데이터는 제시되지 않음).
또한, 본 발명의 융합 단백질을 사용하여 아테롬성 경화증 및 기타 심혈관 질환을 치료할 수 있다. 따라서, 허혈성 심장 질환은 당뇨병 환자에게서 특히 잘 발병하는 것으로 밝혀졌다 [참고: Robertson, et al., Lab Invest., 18:538-551 (1968); Kannel et al., J. Am. Med. Assoc., 241:2035-2038 (1979); Kannel et al., Diab. Care, 2:120-126 (1979)]. 또한, 연구 결과, 아테롬성 경화증은 당뇨병을 앓고 있지 않은 환자에서 보다도 당뇨병 환자에게서 보다 더 광범위하게 나타나고 진행이 가속화되는 것으로 밝혀졌다 [참고: 예를 들어, Waller et al., Am. J. Med., 69:498-506 (1980); Crall et al., Am. J. Med. 64:221-230 (1978); Hamby et al., Chest, 2:251-257 (1976); and Pyorala et al., Diab. Metab. Rev., 3:463-524 (1978)]. 당뇨병 환자에게서 아테롬성 경화증이 가속화되는 이유에는 여러 가지가 있긴 하지만, AGE 감소가 반점 형성을 저하시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
예를 들어, 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 또한 사용하여 발작 (뇌졸중)을 치료할 수 있다. 질병과 관련된 발작 동물 모델에서 TTP-4000를 sRAGE와 비교한 경우에는, TTP-4000가 경색 용적을 상당히 더 많이 감소시켜 주는 것으로 밝혀졌다. 이러한 모델에서는, 마우스의 중앙 경동맥을 결찰한 다음, 재관류하여 경색을 형성시킨다. 발작을 치료 또는 예방하는 RAGE 융합 단백질의 효능을 평가하기 위해, 재관류하기 직전에 마우스를 sRAGE 또는 TTP-4000, 또는 대조군 면역글로불린으로 처치하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, TTP-4000은 상기 동물에게서 경색 면적을 제한한다는 점에서 sRAGE 보다 더 효능이 있었는데, 이는 TTP-4000가 그의 혈장 내에서의 반감기가 더 우수하기 때문에 sRAGE 보다 더 큰 보호를 유지할 수 있었다는 것을 제안하고 있다.
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*p<0.001에 대해 유의적임; **식염수와 비교함.
또 다른 양태에서는, 본 발명의 융합 단백질을 사용하여 암을 치료할 수 있다. 한 양태에서는, 본 발명의 융합 단백질을 사용하여 치료되는 암이 RAGE를 발현하는 암 세포를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 이용하여 치료할 수 있는 암에는 몇몇 폐암, 몇몇 신경교종, 몇몇 유두종 등이 포함된다. 암포테린은 RAGE와 상호 작용하는 것으로 밝혀진, 고 이동성 군 I 비-히스톤 염색체성 DNA 결합성 단백질이다 [참고: Rauvala et al., J. Biol. Chem., 262: 16625-16635 (1987); Parkikinen et al., J. Biol Chem. 268:19726-19738 (1993)]. 암포테린은 (세포 이동성에 기여하는 것으로 공지되기도 한) 섬유소용해 시스템에서 프로테아제 복합체 어셈블리에 대한 표면으로서 제공될 뿐만 아니라 신경돌기 증식을 증진시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, RAGE를 차단시키는 국소 종양 성장 억제 효과가 원발성 종양 모델 (C6 신경교종), 루이스 (Lewis) 폐 전이 모델 [참고: Taguchi et al., Nature 405:354-360 (2000)], 및 v-Ha-ras 트랜스유전자 (transgene)를 발현하는 마우스에서 자발적으로 발생한 유두종 [참고: Leder et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9178-9182 (1990)]에서 관찰되었다.
또 다른 양태에서는, 본 발명의 융합 단백질을 사용하여 염증을 치료할 수 있다. 예를 들어, 대체 양태에서는, 본 발명의 융합 단백질을 사용하여 자가면역과 연관된 염증, 염증성 장 질환과 연관된 염증, 류마티스성 관절염과 연관된 염증, 건선과 연관된 염증, 다발성 경화증과 연관된 염증, 저산소증과 연관된 염증, 발작 (뇌졸중)과 연관된 염증, 심장 마비와 연관된 염증, 출혈성 쇼크와 연관된 염증, 패혈증과 연관된 염증, 기관 (장기) 이식과 연관된 염증, 또는 상처 치유 부전과 연관된 염증을 치료한다.
예를 들어, 혈전용해 치료 후, 과립구와 같은 염증 세포가 허혈성 조직 내로 침윤되어 산소 라디칼을 생성시키는데, 이는 저산소증에 의해 사멸되는 세포 보다 더 많은 세포를 파괴시킬 수 있다. 항체 또는 기타 단백질 길항제를 사용하여 상기 조직을 침윤시킬 수 있는 호중구에 대해 책임이 있는 호중구 상의 수용체를 억제시키는 것이 상기 반응을 완화시키는 것으로 밝혀졌다. RAGE는 이러한 호중구 수용체에 대한 리간드이기 때문에, RAGE의 단편을 함유하는 융합 단백질이 미끼로서 작용할 수 있고, 호중구가 재관류된 부위로 트래픽킹되지 못하도록 함으로써 추가의 조직 파괴를 예방할 수 있다. 염증을 예방하는데 있어서의 RAGE의 역할은, sRAGE가 당뇨병 랫트와 정상적인 랫트 둘 다에서 동맥 손상에 따른 재발 협착증 랫트 모델에서, 아마도 RAGE를 통한 내피, 평활근 세포 증식과 대식 세포 활성화를 억제함으로써 신생내막 팽창을 억제하였다는 것을 보여주는 연구 결과에 의해 표시될 수 있다 [참고: Zhou et al., Circulation, 107:2238-2243 (2003)]. 또한, sRAGE는 지연형 과민증, 실험적 자가면역성 뇌염 및 염증성 장 질환을 포함한 염증 모델을 억제하였다 [참고: Hofman et al., Cell, 97:889-901 (1999)].
또한, 특정 양태에서는 본 발명의 융합 단백질을 사용하여 자가면역에 의거한 장애를 치료할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질을 사용하여 신부전증을 치료할 수 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질을 사용하여 전신성 루푸스 신염 또는 염증성 루푸스 신염을 치료할 수 있다. 예를 들어, SlOO/칼그라눌린은 결합 펩티드에 의해 연결된 2개의 EF-핸드 (hand) 영역을 특징으로 하는, 밀접하게 관련된 칼슘-결합성 폴리펩티드 계열을 포함하는 것으로 밝혀졌다 [참고: Schafer et al., TIBS, 21:134-140 (1996); Zimmer et al., Brain Res. Bull., 37:417-429 (1995); Rammes et al., J. Biol. Chem., 272:9496-9502 (1997); Lugering et al., Eur. J. Clin. Invest., 25:659-664 (1995)]. 이들에 신호 펩티드가 결여되긴 하지만, SlOO/칼그라눌린은 낭성 섬유증 및 류마티스성 관절염에서와 같이, 특히 만성 면역/염증 반응 부위에서 세포외 공간에 접근하는 것으로 오랫 동안 공지되어 왔다. RAGE는 SlOO/칼그라눌린 계열의 수 많은 구성원들에 대한 수용체이므로, 림프구 및 단핵 포식세포와 같은 세포에 대한 그들의 프로염증성 효과를 매개한다. 또한, 지연형 과민증 반응, IL-10 기능없는 마우스에서의 결장염, 콜라겐-유도된 관절염, 및 실험적 자가면역성 뇌염 모델에 대한 연구 결과는, RAGE-리간드 상호 작용 (SlOO/칼그라눌린과의 상호 작용인 것으로 추정됨)이 상기 염증성 케스케이드에 있어 근위적 역할을 한다는 것을 제안한다.
따라서, 각종의 선택된 양태에서 본 발명은 특정 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 융합 단백질을 투여함으로써, 이러한 대상체에게서 AGE와 RAGE의 상호 작용을 억제하는 방법을 제공할 수 있다. 본 발명의 RAGE 융합 단백질을 사용하여 치료받는 대상체는 동물일 수 있다. 특정 양태에서는, 이러한 대상체가 인간이다. 이 대상체는 AGE-관련 질환, 예를 들어 당뇨병, 당뇨병 합병증, 예를 들어 신장애, 신경병증, 망막병증, 족부 궤양, 아밀로이드증, 또는 신부전증, 및 염증으로 고통받을 수 있다. 또한, 대상체는 알츠하이머병에 걸린 개개인일 수 있다. 대체 양태에서는, 대상체가 암 환자일 수 있다. 기타 양태에서는, 대상체가 전신성 홍반성 루푸스 또는 염증성 루푸스 신염으로 고통받을 수 있다. 기타 질환이 RAGE에 의해 매개될 수 있으므로, 본 발명의 융합 단백질을 사용하여 치료할 수 있다. 따라서, 본 발명의 부가의 대체 양태에서는, 융합 단백질을 사용하여 인간 또는 동물 대상체에게서 크론병 (Crohn's disease), 관절염, 혈관염, 신장애, 망막병증 및 신경병증을 치료할 수 있다.
치료 유효량은 특정 대상체에게서 RAGE와 AGE 또는 내인성 RAGE 리간드의 기타 유형과의 상호 작용을 예방할 수 있는 양을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 양은 치료받는 대상체에 따라서 다양할 것이다. 화합물 투여는 매시간, 매일, 매주, 매월, 매년, 또는 단일 사건으로서 이루어질 수 있다. 각종의 대체 양태에서는, 융합 단백질의 유효량 범위가 약 1 ng/체중 kg 내지 약 100 mg/체중 kg, 또는 약 10 ㎍/체중 kg 내지 약 50 mg/체중 kg, 또는 약 100 ㎍/체중 kg 내지 약 10 mg/체중 kg일 수 있다. 실제 유효량은 당해 분야에서 표준인 방법을 사용하여 용량/반응 검정에 의해 확립할 수 있다 [참고: Johnson et al., Diabetes. 42: 1179, (1993)]. 따라서, 당해 분야에 공지된 바와 같이 유효량은 해당 화합물의 생체내 이용 효율, 생체 활성, 및 생분해성에 좌우될 수 있다.
조성물
본 발명은 제약상 허용 가능한 담체와 혼합된 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 조성물을 포함할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 제2의 비-RAGE 폴리펩티드와 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 한 양태에서는, 이러한 융합 단백질이 RAGE 리간드 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 리간드 결합 부위가 융합 단백질의 가장 N-말단 도메인을 포함한다. 이러한 RAGE 리간드 결합 부위는 RAGE의 V 도메인, 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, RAGE 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 서열 10 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함한다.
특정 양태에서, RAGE 폴리펩티드는 면역글로불린 도메인 또는 면역글로불린 도메인의 일부 (예: 그의 단편)을 포함하는 폴리펩티드와 연결될 수 있다. 한 양태에서는, 면역글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 인간 IgG의 CH2 도메인 또는 CH3 도메인 중의 하나 이상의 적어도 일부를 포함한다.
RAGE 단백질 또는 폴리펩티드는 전장의 인간 RAGE (예: 서열 1), 또는 인간 RAGE의 단편을 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 어떠한 신호 서열 잔기도 포함하지 않는다. RAGE의 신호 서열은 전장의 RAGE (서열 1)의 잔기 1 내지 22 또는 잔기 1 내지 23을 포함할 수 있다. 대체 양태에서, RAGE 폴리펩티드는 인간 RAGE 또는 그의 단편과 70%, 80% 또는 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 한 양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 인간 RAGE 또는 그의 단편을 포함할 수 있는데, 제1 잔기로서 메티오닌이 아닌 글리신을 수반한다 [참고: 예를 들어, Neeper et al, (1992)]. 또한, 인간 RAGE는 신호 서열이 제거된 전장의 RAGE (예를 들어, 서열 2 또는 서열 3) (도 1A 및 1B) 또는 이러한 아미노산 서열의 일부를 포함할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은 또한, sRAGE (예: 서열 4), sRAGE와 90% 동일한 폴리펩티드, 또는 sRAGE의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 인간 RAGE 또는 그의 단편을 포함할 수 있는데, 제1 잔기로서 메티오닌이 아닌 글리신을 수반한다 [참고: 예를 들어, Neeper et al, (1992)]. 또한, 인간 RAGE는 신호 서열이 제거된 인간 sRAGE (예를 들어, 서열 5 또는 서열 6) (도 1C) 또는 이러한 아미노산 서열의 일부를 포함할 수 있다. 기타 양태에서, RAGE 단백질은 V 도메인 (예: 서열 7 또는 서열 8; 도 1D)을 포함할 수 있다. 또한, V 도메인 또는 그의 단편과 90% 동일한 서열을 사용할 수도 있다. 또한, RAGE 단백질은 V 도메인의 일부를 포함하는 RAGE의 단편 (예: 서열 9 또는 서열 10, 도 1D)을 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 서열 10 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서는, RAGE 단편이 합성 펩티드이다.
예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 V 도메인에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 116 (서열 7) 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 116 (서열 8) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또한, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 C1 도메인에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 124 내지 221 (서열 11) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서는, RAGE 폴리펩티드가 RAGE의 C2 도메인에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 227 내지 317 (서열 12) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또한, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 V 도메인 및 하단 도메인간 링커에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 123 (서열 13) 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 123 (서열 14) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또한, RAGE 폴리펩티드는 V 도메인, C1 도메인 및 이들 두 도메인을 연결시켜 주는 도메인간 링커에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 226 (서열 17) 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 226 (서열 18) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또한, RAGE 폴리펩티드는 sRAGE (즉, V, C1 및 C2 도메인, 및 도메인간 링커를 코딩함)에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 339 (서열 5) 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 339 (서열 6) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 또한 이들 서열 각각의 단편을 사용할 수도 있다.
융합 단백질에는 RAGE 또는 그의 단편으로부터 유래되지 않은 몇 가지 유형의 펩티드가 포함될 수 있다. 융합 단백질의 제2 폴리펩티드는 면역글로불린으로부터 유래된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 중쇄 (또는 그의 일부)는 다음 공지된 중쇄 이소형 중의 어느 한 가지로부터 유래될 수 있다: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε), 또는 IgA (α). 또한, 중쇄 (또는 그의 일부)는 다음 공지된 중쇄 아유형 중의 어느 한 가지로부터 유래될 수 있다: IgG1 (γ1), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgA1 (α1), IgA2 (α2), 또는 생물학적 활성을 변경시키는 이들 이소형 또는 아유형의 돌연변이물. 제2 폴리펩티드는 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인, 또는 이들 도메인 중의 어느 하나, 또는 둘 다의 일부를 포함할 수 있다. 예시 양태로서, 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드는 서열 38 또는 서열 40을 포함할 수 있다. 면역글로불린 펩티드는 서열 39 또는 서열 41의 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
면역글로불린 쇄의 Fc 부분은 생체 내에서 프로염증성일 수 있다. 따라서, 한 양태에서 본 발명의 RAGE 융합 단백질은 면역글로불린로부터 유래된 도메인간 힌지 폴리펩티드가 아니라, RAGE로부터 유래된 도메인간 링커를 포함한다.
따라서, 한 양태에서는, 상기 융합 단백질이 면역글로불린의 CH2 도메인, 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드와 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 한 양태에서는, CH2 도메인 또는 그의 단편이 서열 42를 포함한다.
한 양태에서, RAGE 폴리펩티드는, RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고, RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, RAGE 면역글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 포함한다. 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드는 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 예시 양태로서, 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 서열 38 또는 서열 40을 포함할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 RAGE로부터의 단일 또는 다중 도메인을 포함할 수 있다. 또한, RAGE 면역글로불린 도메인에 연결된 도메인간 링커를 포함하는 RAGE 폴리펩티드는 전장 RAGE 단백질의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어 한 양태에서는, 융합 단백질이 RAGE 단백질로부터 유래된 2개의 면역글로불린 도메인과, 인간 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 2개의 면역글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 융합 단백질은 제1 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제1 RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 면역글로불린 도메인의 N-말단 아미노산이 제1 도메인간 링커의 C-말단 아미노산에 연결되며, 제2 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제2 RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 CH2 면역글로불린 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, 제2 RAGE 면역글로불린 도메인 및 제2 RAGE 도메인간 링커에 연결된 제1 RAGE 면역글로불린 도메인 및 제1 RAGE 도메인간 링커를 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 V 도메인, C1 도메인, 이들 두 도메인을 연결시켜 주는 도메인간 링커, 및 C1의 제2 도메인간 링커 하단에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 251 (서열 19) 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 251 (서열 20) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 한 양태에서는, 서열 30 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 구조물이 4개 도메인 RAGE 융합 단백질을 코딩할 수 있다.
또 다른 한편, 3개 도메인 융합 단백질은 RAGE로부터 유래된 1개의 면역글로불린 도메인과, 인간 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 2개의 면역글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 RAGE 도메인간 링커를 통하여 CH2 면역글로불린 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 연결된 단일 RAGE 면역글로불린 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE 폴리펩티드는 RAGE의 V 도메인 및 하단 도메인간 링커에 상응하는, 인간 RAGE의 아미노산 23 내지 136 (서열 15) 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 인간 RAGE의 아미노산 24 내지 136 (서열 16) 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 한 양태에서는, 서열 31 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 구조물이 3개 도메인 RAGE 융합 단백질을 코딩할 수 있다.
RAGE 도메인간 링커 단편은 본래 RAGE 면역글로불린 도메인의 하단이므로, RAGE 면역글로불린 도메인에 연결되는 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, RAGE V 도메인에 대해서는, 도메인간 링커가 본래 이러한 V 도메인으로부터 하단인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 상기 링커가 전장의 RAGE의 아미노산 117 내지 123에 상응하는 서열 21을 포함할 수 있다. 또한, 상기 링커는 천연 RAGE 서열의 부가 부분을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열 21의 상단 및 하단에 여러 개의 아미노산 (예를 들어, 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산)을 포함하는 도메인간 링커를 사용할 수도 있다. 따라서, 한 양태에서는 도메인간 링커가 전장의 RAGE의 아미노산 117 내지 136을 포함하는 서열 23을 포함한다. 또한, 상기 링커의 어느 한 말단으로부터, 예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산을 결실시킨 서열 21의 단편을 사용할 수 있다. 대체 양태에서는, 상기 링커가 서열 21 또는 서열 23과 70%, 80% 또는 90% 동일한 서열을 포함할 수 있다.
RAGE Cl 도메인의 경우에는, 상기 링커가 C1 도메인의 본래 하단인 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 특정 양태에서는, 상기 링커가 전장의 RAGE의 아미노산 222 내지 251에 상응하는 서열 22를 포함할 수 있다. 또한, 상기 링커는 천연 RAGE 서열의 부가 부분을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열 22의 상단 및 하단에 여러 개의 아미노산 (예를 들어, 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산)을 포함하는 링커를 사용할 수도 있다. 또한, 상기 링커의 어느 한 말단으로부터, 예를 들어 1 내지 3개, 1 내지 5개 또는 1 내지 10개, 또는 1 내지 15개 아미노산을 결실시킨 서열 22의 단편을 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서는 RAGE 도메인간 링커가 아미노산 222 내지 226에 상응하는 서열 24를 포함할 수 있다. 또한, 도메인간 링커는 RAGE 아미노산 318 내지 342에 상응하는 서열 44를 포함할 수 있다.
제약상 허용 가능한 담체에는 당해 분야에 공지된 모든 표준 제약상 허용된 담체가 포함될 수 있다. 이러한 담체에는 희석제가 포함될 수 있다. 한 양태에서는, 제약 담체가 액상일 수 있고, 융합 단백질 또는 핵산 구조물이 용액 형태일 수 있다. 또 다른 양태에서는, 제약상 허용 가능한 담체가 분말, 동결건조된 분말 또는 정제 형태의 고형물일 수 있다. 또한, 제약 담체는 겔, 좌제 또는 크림일 수 있다. 대체 양태에서, 담체는 리포솜, 미소캡슐, 중합체 피막 형성된 세포, 또는 바이러스를 포함할 수 있다. 따라서, 용어 제약상 허용 가능한 담체에는 모든 표준 제약상 허용된 담체, 예를 들어 물, 알코올, 인산염 완충 식염수, 당 (예: 슈크로스 또는 만니톨), 오일 또는 에멀션, 예를 들어 오일/수 에멀션 또는 트리글리세라이드 에멀션, 각종 유형의 습윤제, 정제, 제피정 및 캅셀제가 포괄되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 RAGE 융합 단백질은 각종 경로로 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명의 RAGE 융합 단백질의 투여는 복강내 (IP) 주사를 이용할 수 있다. 또 다른 한편, RAGE 융합 단백질은 경구, 비내 또는 에어로솔로서 투여할 수 있다. 또 다른 양태에서는, 정맥내 (IV) 투여한다. RAGE 융합 단백질은 피하 주사할 수도 있다. 또 다른 양태에서는, 융합 단백질을 동맥내 투여한다. 또 다른 양태에서는, 설하 투여한다. 또한, 투여는 서방출 캡슐을 이용할 수도 있다. 또 다른 양태에서는, 좌제 등에 의해서 경직장 투여할 수 있다. 예를 들어, 자가 투여가 요망되는 경우에 만성 질환을 치료하는데 있어서는 피하 투여가 유용할 수 있다.
제약 조성물은 비경구적으로 허용 가능한 비독성 용매 또는 비히클 중의 무균성 주사용 용액제 형태일 수 있다. 이용될 수 있는 허용 가능한 비히클 및 용매로는 특히, 물, 링거액, 3-부탄디올, 등장성 염화나트륨 용액, 또는 수성 완충제, 예를 들어 생리적으로 허용 가능한 시트레이트, 아세테이트, 글리신, 히스티딘, 인산염, 트리스 또는 석시네이트 완충제가 있다. 주사용 용액제는 화학적으로 분해되지 못하게하고 응집체 형성을 방지시키는 안정화제를 함유할 수 있다. 안정화제에는 항산화제, 예를 들어 부틸화 히드록시 아니솔 (BHA), 및 부틸화 히드록시 톨루엔 (BHT), 완충제 (시트레이트, 글리신, 히스티딘) 또는 계면활성제 (폴리솔베이트 80, 폴옥사머)가 포함될 수 있다. 상기 용제는 항미생물성 방부제, 예를 들어 벤질 알코올 및 파라벤을 함유할 수도 있다. 상기 용제는 응집을 저하시키기 위한 계면활성제, 예를 들어 폴리솔베이트 80, 폴옥사머, 또는 당해 분야에 공지된 기타 계면활성제를 함유할 수도 있다. 상기 용제는 해당 조성물의 삼투압이 인체 혈액과 유사하도록 조절시키기 위한 기타 첨가제, 예를 들어 당(들)을 함유할 수도 있다.
제약 조성물은 희석제를 이용한 재구성시 주사용의 무균성 동결건조된 산제 형태일 수 있다. 희석제는 주사용 수, 주사용 제균수, 또는 무균성 식염수일 수 있다. 동결건조된 산제는 본 발명의 융합 단백질을 건조 형태로 생성시키기 위해 이러한 단백질의 용액을 동결 건조시킴으로써 생성시킬 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 동결건조된 단백질은 일반적으로, 단백질의 액상 용액 보다도 저장 수명이 더 길고 안정성이 증가되었다. 동결건조된 산제 (케이크)는 pH를 조절하기 위한 완충제, 예를 들어 생리적으로 허용 가능한 시트레이트, 아세테이트, 글리신, 히스티딘, 인산염, 트리스 또는 석시네이트 완충제를 함유할 수도 있다. 동결건조된 산제는 그의 물리적 및 화학적 안정성을 유지시키기 위한 리오프로텍턴트 (lyoprotectant)를 함유할 수도 있다. 통상적으로 사용되고 있는 리오프로텍턴트는 비-환원성 당 및 이당류, 예를 들어 슈크로스, 만니톨 또는 트레할로스이다. 동결건조된 산제는 화학적으로 분해되지 못하게하고 응집체 형성을 방지시키는 안정화제를 함유할 수 있다. 안정화제에는 항산화제 (BHA, BHT), 완충제 (시트레이트, 글리신, 히스티딘) 또는 계면활성제 (폴리솔베이트 80, 폴옥사머)가 포함될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 동결건조된 산제는 항미생물성 방부제, 예를 들어 벤질 알코올 및 파라벤을 함유할 수도 있다. 동결건조된 산제는 응집을 저하시키기 위한 계면활성제, 예를 들어 폴리솔베이트 80, 폴옥사머 등을 함유할 수도 있다. 동결건조된 산제는 이러한 산제 재구성시 삼투압이 인체 혈액과 유사하도록 조절시키기 위한 첨가제 (예를 들어, 당 또는 식염수)를 함유할 수도 있다. 동결건조된 산제는 벌크제, 예를 들어 당 및 이당류를 함유할 수도 있다.
주사용 제약 조성물은 유지성 현탁제 형태일 수도 있다. 이러한 현탁제는 상기 언급된 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지된 방법에 따라서 제형화할 수 있다. 또한, 무균의 고정유를 용매 또는 현탁 매질로서 편리하게 이용한다. 이를 위해, 합성 모노- 또는 디글리세라이드를 사용하는 모든 블렌드 고정유를 이용할 수도 있다. 또한, 활성 성분을 식물성 오일, 예를 들어 아라키스유, 올리브유, 참깨유 또는 코코넛 오일, 또는 광유, 예를 들어 액상 파라핀에 현탁시킴으로써 오일상 현탁액을 제형화할 수 있다. 예를 들어, 올레산과 같은 지방산이 주사제 제조에 이용된다. 오일상 현탁제는 증점제, 예를 들어 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알코올을 함유할 수 있다. 이들 조성물은 항산화제 (예: 아스코르브산)을 부가함으로써 보존시킬 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 수중유 에멀션 또는 수성 현탁제 형태일 수도 있다. 오일 상은 식물성 오일, 예를 들어 올리브유 또는 아라키스유, 또는 광유, 예를 들어 액상 파라핀, 또는 그의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제는 천연 발생적 검, 예를 들어 아카시아 검 또는 트라가칸드 검, 천연 발생적 포스파티드, 예를 들어 대두, 레시틴, 및 지방산과 헥시톨 무수물로부터 유래된 에스테르 또는 부분 에스테르, 예를 들어 솔비탄 모노올레에이트, 및 상기 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드와의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 솔비탄일 수 있다.
수성 현탁제는 활성 화합물을 부형제와 혼합하여 함유할 수도 있다. 이러한 부형제에는 현탁제, 예를 들어 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 나트륨 알지네이트, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸드 검 및 아카시아 검; 분산제 또는 습윤제, 예를 들어 천연 발생적 포스파티드, 예를 들어 레시틴, 또는 알킬렌 옥사이드와 지방산과의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알코올과의 축합 생성물, 예를 들어 헵타데카에틸렌옥시세탄올, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨로부터 유래된 부분 에스테르와의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 솔비톨 모노올레에이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르와의 축합 생성물, 예를 들어 폴리에틸렌 솔비톨 모노올레에이트가 포함될 수 있다.
물을 부가함으로써 수성 현탁제를 제조하는데 적합한 분산성 분말 및 과립은 활성 화합물을 분산제, 현탁제, 및 하나 이상의 방부제와 혼합하여 제공할 수 있다. 적합한 방부제, 분산제, 및 현탁제가 상기 언급되어 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 화합물을 직장 투여하기 위한 좌제 형태일 수도 있다. 이들 조성물은 약물을, 통상적인 온도 하에서는 고형이지만 직장 온도에서 액상이므로 직장 내에서 용융되어 해당 약물을 방출시키는 적합한 비-자극성 부형제와 혼합함으로써 제조할 수 있다. 이러한 물질에는, 예를 들어 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.
국소 투여하기 위해서는, 본 발명의 화합물을 함유하는 크림, 연고, 젤리, 용제 또는 현탁제를 사용할 수 있다. 국소 적용제에는 구강 세척제 및 가글이 포함될 수도 있다. 적합한 방부제, 항산화제, 예를 들어 BHA 및 BHT, 분산제, 계면활성제 또는 완충제를 사용할 수 있다.
본 발명의 화합물은 리포솜 전달 시스템 형태, 예를 들어 소형 단층 소포, 대형 단층 소포, 및 다층 소포 형태로 투여할 수도 있다. 리포솜은 각종 인지질, 예를 들어 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린으로부터 형성될 수 있다.
특정 양태에서는, 본 발명의 화합물을 변형시켜 대사적 효소에 의한 순환으로부터의 제거를 추가로 지연시킬 수 있다. 한 양태에서는, 수용성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), PEG와 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리프롤린, 카복시메틸 셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올 등을 공유적으로 부착시킴으로써 상기 화합물을 변형시킬 수 있다. 이러한 변형은 수용액 중에서의 화합물의 용해도를 증가시킬 수도 있다. PEG 등의 중합체를 하나 이상의 반응성 아미노 잔기, 설프히드릴 잔기 또는 카복실 잔기에 공유적으로 부착시킬 수 있다. 수 많은 활성화 형태의 PEG가 보고되었는데, 이에는 카복실산 또는 카보네이트 유도체의 활성 에스테르, 특히 아미노기와의 반응의 경우에는 이탈기가 N-히드록시석신이미드, p-니트로페놀, 이미다졸 또는 1-히드록시-2-니트로벤젠-3-설폰이고, 설프히드릴기와의 반응의 경우에는 이탈기가 멀티모드 또는 할로 아세틸 유도체이며, 탄수화물기와의 반응의 경우에는 이탈기가 아미노 히드라진 또는 히드라지드 유도체인 것이 포함된다.
본 발명의 융합 단백질과 함께 사용될 수 있는 단백질 제형의 부가의 제조 방법이 미국 특허 제6,267,958호 및 제5,567,677호에 기재되어 있다.
본 발명의 추가 국면에서는, 본 발명의 RAGE 조절제를 보조 치료적 처치 또는 기타 공지된 치료제와의 병용 치료적 처치에 활용한다. 다음은 본 발명의 RAGE 융합 단백질 조절제와 병용해서 활용될 수 있는 부가의 치료제 및 보조제 (아주반트)를 비-제한적으로 열거한 것이다:
항암제의 약리학적 분류:
1. 알킬화제: 시클로포스파미드, 니트로소우레아, 카르보플라틴, 시스플라틴, 프로카르바진
2. 항생제: 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신
3. 항대사제: 메토트렉세이트, 시타라빈, 플루오로우라실
4. 식물 알카로이드: 빈블라스틴, 빈크리스틴, 에토포시드, 파클리탁셀
5. 호르몬: 타목시펜, 옥트레오티드 아세테이트, 피나스테라이드, 플루타미드
6. 생체 반응 조절물질: 인터페론, 인터루킨
류마티스성 관절염 치료제에 대한 약리학적 분류:
1. 진통제: 아스피린
2. NSAIDs (비스테로이드계 소염 약물): 이부프로펜, 나프록센, 디클로페낙
3. DMARDs (질병 완화 항류마티스약): 메토트렉세이트, 금 제제, 히드록시클로로퀸, 설파살라진
4. 생체 반응 조절물질, DMARDs: 에타네르셉트, 인플릭시마브 글루코코르티코이드
당뇨병 치료제에 대한 약리학적 분류:
1. 설포닐우레아: 톨부타미드, 톨라자미드, 글리부리드, 글리피지드
2. 비구아니드: 메트포르민
3. 다양한 경구제: 아카르보스, 트로글리타존
4. 인슐린
알츠하이머병 치료제에 대한 약리학적 분류:
1. 콜린에스테라제 억제제: 타크린, 도네페질
2. 항정신병제: 할로페리돌, 티오리다진
3. 항우울제: 데시프라민, 플루옥세틴, 트라조돈, 파록세틴
4. 항경련제: 카르바마제핀, 발프로산.
한 양태에서, 본 발명은 치료가 필요한 대상체에게 치료 유효량의 RAGE 융합 단백질을, 알킬화제, 항대사제, 식물 알카로이드, 항생제, 호르몬, 생체 반응 조절물질, 진통제, NSAIDs, DMARDs, 글루코코르티코이드, 설포닐우레아, 비구아니드, 인슐린, 콜린에스테라제 억제제, 항정신병제, 항우울제 및 항경련제로 이루어진 군 중에서 선택된 치료제와 병용해서 투여하는 것을 포함하여, RAGE 매개된 질병을 치료하는 방법을 제공할 수 있다. 추가 양태에서, 본 발명은 알킬화제, 항대사제, 식물 알카로이드, 항생제, 호르몬, 생체 반응 조절물질, 진통제, NSAIDs, DMARDs, 글루코코르티코이드, 설포닐우레아, 비구아니드, 인슐린, 콜린에스테라제 억제제, 항정신병제, 항우울제 및 항경련제로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 치료제를 추가로 포함하는, 상기 언급된 바와 같은 본 발명의 제약 조성물을 제공한다.
본 발명에 포괄되는 본 발명의 특징과 이점이 다음 실시예에 추가로 예시되 어 있다.
실시예 1: RAGE-IgG Fc 융합 단백질의 생성
RAGE-IgG Fc 융합 단백질을 발현하는 두 플라스미드를 구축하였다. 인간 RAGE로부터의 상이한 길이의 5' cDNA 서열을 인간 IgG Fc (γ1)으로부터의 동일한 3' cDNA 서열과 연결시킴으로써 양 플라스미드를 구축하였다. 이어서, 이들 발현 서열 (즉, 연결 생성물)을 pcDNA3.1 발현 벡터 (공급처: Invitrogen, CA)에 삽입하였다. 상기 융합 단백질 코딩 영역을 코딩하는 핵산 서열이 도 2 및 3에 도시되었다. TTP-4000 융합 단백질의 경우, 진하게 강조한 핵산 서열 1 내지 753은 RAGE N-말단 단백질 서열을 코딩하는 반면, 핵산 서열 754 내지 1386은 IgG Fc 단백질 서열을 코딩하였다 (도 2). TTP-3000의 경우, 진하게 강조한 핵산 서열 1 내지 408은 RAGE N-말단 단백질 서열을 코딩하는 반면, 핵산 서열 409 내지 1041은 IgG Fc 단백질 서열을 코딩하였다 (도 3).
RAGE 융합 단백질을 생성시키기 위해, 서열 30 또는 서열 31의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 CHO 세포 내로 안정적으로 형질감염시켰다. 양성 형질전환체를 대상으로 하여, 플라스미드에 의해 부여된 네오마이신 내성에 대해 선별하고, 이를 클로닝하였다. 상등액을 웨스턴 블롯 분석함으로써 탐지된 바와 같이 고 수준으로 생산하는 클론을 확장시킬 수 있으며, 단백질 A 칼럼을 사용하여 친화 크로마토그래피함으로써 유전자 생성물을 정제하였다. 세포가 재조합 TTP-4000을 약 1.3 그램/리터 수준으로 생성시키도록 발현을 최적화하였다.
두 융합 단백질을 코딩하는 발현된 폴리펩티드가 도 4 내지 6에 예시되었다. TTP-4000의 4개 도메인 구조의 경우, 첫 번째 251개 아미노산 (도 4에 진하게 도시됨)은 신호 서열 (1 내지 22/23), V 면역글로불린 (및 리간드 결합) 도메인 (23/24 내지 116), 제2 도메인간 링커 (117 내지 123), 제2 면역글로불린 도메인 (CH1) (124 내지 221), 및 인간 RAGE 단백질의 제2 링커 (222 내지 251)를 함유하였다 (도 4, 6B).
TTP-3000의 3개 도메인 구조의 경우, 첫 번째 136개 아미노산 (진하게 도시됨)은 신호 서열 (1 내지 22/23), V 면역글로불린 (및 리간드 결합) 도메인 (23/24 내지 116), 및 인간 RAGE 단백질의 도메인간 링커 서열 (117 내지 136)를 함유하였다 (도 5, 6B). 또한, TT3의 경우에는, 서열 137 내지 346에 IgG의 CH2 및 CH3 면역글로불린 도메인이 포함되었다.
실시예 2: RAGE-IgGl 융합 단백질의 활성을 시험하는 방법
A. 시험관내 리간드 결합:
공지된 RAGE 리간드를 웰당 5 마이크로그램의 농도로 맥시소르프 판 표면 상으로 피복시켰다. 판을 4℃ 하에 밤새 항온 배양하였다. 리간드 항온 배양 후, 판을 흡인시키고, 50 mM 이미다졸 완충제 (pH 7.2) 중의 1% BSA의 차단 완충액을 실온 하에 1시간 동안 상기 판에 가하였다. 이어서, 상기 판을 흡인시키고/시키거나 세척 완충액 (20 mM 이미디졸, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈-20, 5 mM CaCl2 및 5 mM MgCl2, pH 7.2)으로 세척하였다. 초기 농도가 1.082 mg/ml인 TTP-3000 (TT3)의 용액과 초기 농도가 370 ㎍/ml인 TTP-4000 (TT4)의 용액을 준비하였다. 융합 단백질 을 증가 희석률의 초기 샘플에 가하였다. RAGE 융합 단백질을 37℃ 하에 1시간 동안 고정화 리간드와 함께 항온 배양한 다음, 판을 세척하고, 융합 단백질의 결합을 알아보기 위해 검정하였다. 결합성은 21 ng/100 ㎕의 최종 검정 농도 (FAC)가 되도록 1:11,000으로 희석시킨 모노클로날 마우스 항-인간 IgG1, 500 ng/㎕의 FAC가 되도록 1:500으로 희석시킨 바이오티닐화 염소 항-마우스 IgG, 및 아비딘-연결된 알칼리성 포스파타제를 함유하는 면역탐지 복합체를 부가함으로써 탐지하였다. 이 복합체를 실온에서 1시간 동안 고정화 융합 단백질과 함께 항온 배양한 후, 판을 세척하고, 알킬리성 포스파타제 기질 파라-니트로페닐포스페이트 (PNPP)를 가하였다. 고정화 융합 단백질에 대한 상기 복합체의 결합성은, PNPP가 파라-니트로페놀 (PNP)로 전환되는 양을 측정함으로써 (이는 405 nm 하에 분광광도계로 측정하였다) 정량화하였다.
도 7에 예시된 바와 같이, 융합 단백질 TTP-4000 (TT4) 및 TTP-3000 (TT3)은 공지된 RAGE 리간드 아밀로이드-베타 (A베타), S100b (S100), 및 암포테린 (Ampho)과 특이적으로 상호 작용하였다. 리간드의 부재 하에서는, 즉 BSA 피복재 단독 (BSA 또는 BSA + 세척액) 하에서는, 면역탐지 복합체의 비-특이적 결합에 기인한 수준 전반에 걸쳐 흡광도 증가를 전혀 나타내지 않았다. 아밀로이드 베타를 표지된 리간드로서 사용하는 경우에는, 검정하기 전에 아밀로이드 베타를 예비-항온 배양하는 것이 필요할 수도 있다. 예비-항온 배양은 아밀로이드 베타가 주름진 시트 형태로 자가-응집할 수 있게 해주는데, 이는 아밀로이드 베타가 주름진 시트 형태로 RAGE와 우선적으로 결합할 수 있기 때문이다.
RAGE 융합 단백질 TTP-4000 및 TTP-3000과 RAGE 리간드 간에 특이적 상호 작용이 존재한다는 명백한 부가의 증거는, 특정 RAGE 리간드가 융합 단백질에 대한 결합을 놓고 공지된 RAGE 리간드와 효과적으로 경쟁할 수 있다는 것을 나타낸 연구에서 예시되었다. 이들 연구에서는, 아밀로이드-베타 (A-베타)를 맥시소르브 판 상에 고정화시키고, 융합 단백질을 상기 언급된 바와 같이 부가하였다. 또한, RAGE 리간드를 융합 단백질과 동시에 몇몇 웰에 가하였다.
TTP-4000이 123 ㎍/ml으로 존재하는 경우에는 (1:3 희석률, 도 8), RAGE 리간드가 TTP-4000 (TT4)의 결합을 약 25% 내지 30% 정도 차단시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. TTP-4000의 초기 용액을 10 또는 30 인자로 희석시킨 경우에는 (1:10 또는 1:30), 고정화 리간드에 대한 융합 단백질의 결합이 RAGE 리간드에 의해 완전히 억제되었다. 유사하게, TTP-3000이 360 ㎍/ml으로 존재하는 경우에는 (1:3 희석률, 도 9), RAGE 리간드가 TTP-3000 (TT3)의 결합을 약 50% 정도 차단시켰다. TTP-3000의 초기 용액을 10 인자로 희석시킨 경우에는 (1:10), 고정화 리간드에 대한 융합 단백질의 결합이 RAGE 리간드에 의해 완전히 억제되었다. 따라서, RAGE 리간드에 대한 RAGE 융합 단백질의 결합 특이성은 용량 의존적이었다. 또한, 도 8 및 9에 도시된 바와 같이, 융합 단백질의 부재 하에서는, 즉 면역탐지 복합체 만을 사용해서는 ("복합체 단독") 본질적으로 결합이 전혀 탐지되지 않았다.
B. 세포 기초 검정에서 RAGE 융합 단백질의 효과
기존의 연구 결과는, 골수성 THP-1 세포가 RAGE 리간드에 반응하여 TNF-α를 분비할 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 검정에서는, THP-1 세포를 ATCC에 의해 제공된 프로토콜을 사용하여 10% FBS가 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 융합 단백질 TTP-3000 (TT3) 또는 TTP-4000 (TT4) (10 ㎍), sRAGE (10 ㎍), 및 인간 IgG (10 ㎍) (즉, 음성 대조군으로서)의 부재 및 존재 하에 RAGE를 0.1 mg/ml S100b로 자극함으로써 TNF-α를 분비하도록 상기 세포를 유도시켰다. THP-1 세포에 의해 분비된 TNF-α의 양은, TNF-α에 대한 시판용 ELISA 키트 (공급처: (R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 상기 단백질을 세포 배양물에 부가한지 24시간 후에 측정하였다. 도 10의 결과는 융합 단백질이 이들 세포에서 S100b/RAGE-유도된 TNF-α 생성을 억제하였다는 것을 입증해준다. 도 10에 도시된 바와 같이, 10 ㎍ TTP-3000 또는 TTP-4000 RAGE 융합 단백질을 부가하면, SlOOb (0.1 mg/ml FAC)에 의한 TNF-α 유도가 각각 약 45% 내지 70% 정도 저하되었다. 융합 단백질 TTP-4000은 SlOOb에 의한 TNF-α 유도를 차단시키는데 있어서 적어도 sRAGE 만큼 유효할 수 있다 (도 10). TTP-4000 및 TTP-3000의 RAGE 서열에 대한 억제 특이성은, IgG 단독을 SlOOb 자극된 세포에 부가한 실험에 의해 밝혀졌다. IgG와 SlOOb를 본 검정에 부가한 결과, SlOOb 단독과 동일한 수준의 TNF-α가 나타났다. 융합 단백질의 RAGE 서열에 대한 TTP-4000 및 TTP-3000에 의한 TNF-α 유도 억제 특이성은, IgG 단독을 SlOOb 자극된 세포에 부가한 실험에 의해 밝혀졌다. IgG, 즉 RAGE 서열을 수반하지 않은 인간 IgG (10 ㎍/웰로 부가된 시그마 인간 IgG)와 SlOOb를 본 검정에 부가한 결과, SlOOb 단독과 동일한 수준의 TNF-α가 나타났다는 것을 알 수 있다.
실시예 3: TTP-4000의 약동학적 프로파일
TTP-4000이 인간 sRAGE와 비교해서 탁월한 약동학적 프로파일을 지니고 있는지를 결정하기 위해, 랫트 및 비-인간 영장류에게 TTP-4000 (5 mg/kg)을 정맥내 (IV) 주사한 다음, TTP-4000가 존재하는지를 알아보기 위해 혈장을 평가하였다. 이들 실험에서는, 타고난 본래의 2마리 수컷 원숭이의 말초 정맥에 단일 정맥내 거환 용량의 TTP-4000 (5 mg/ml/kg)을 투여한 다음, 대략 1.0 밀리리터 (mL) 식염수 세정액을 투여하였다. 혈액 샘플 (대략 1.0 mL)을, 투여하기 전 (즉, TTP-4000을 주사하기 이전), 또는 리튬 헤파린을 함유하는 튜브 내로 투여한지 0.083, 0.25, 0.5, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 240, 288, 및 336시간 후에 수집하였다. 수집 후, 상기 튜브를 냉동 (2 내지 8℃) 하에 15분 동안 1500 xg로 원심분리시킬 때까지 습윤 얼음 위에 놓아두었다 (최대 30분). 이어서, 수거된 각 혈장 샘플을, 실시예 6에 기재된 바와 같이 주사 후 각종 시점에서 ELISA를 사용하여 RAGE 폴리펩티드에 대해 검정할 때까지 동결 (-70℃±10℃) 저장하였다.
도 11에 도시된 역학적 프로파일은, 2마리 동물에서 알파 상의 꽤 가파른 기울기로써 입증된 바와 같이 TTP-4000이 일단 그의 리간드를 포화시키면, 이는 300시간 초과의 말단 반감기를 보유한다는 것을 나타내었다. 이러한 반감기는 인간 sRAGE의 혈장 중에서의 반감기 (일반적으로 약 2시간) 보다 상당히 더 크고, 급성 및 반-만성 적응증에 대해 1회 주사 투여할 수 있는 기회를 제공해준다. 도 11에서는, 각 곡선이 동일한 실험 조건 하의 상이한 동물을 나타낸다.
실시예 4: TTP-4000 Fc 활성화
인간 IgG와 비교해서 RAGE 융합 단백질 TTP-4000에 의한 Fc 수용체의 활성화 를 측정하기 위한 실험을 수행하였다. Fc 수용체 활성화는 이러한 Fc 수용체를 발현하는 THP-1 세포로부터의 TNF-α 분비를 측정함으로써 측정하였다. 이들 실험에서는, 96 웰 판을 10 ㎍/웰 TTP-4000 또는 인간 IgG로 피복시켰다. Fc 자극으로 인해, TNF-α가 분비되었다. TNF-α의 양은 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 측정하였다.
따라서, 본 검정에서는 골수성 세포주 THP-1 (ATTC #TIB-202)를 ATCC 지시에 따라서 10% 태아 소 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지에서 유지시켰다. 전형적으로, 웰을 10 ㎍/웰의 열 응집된 (63℃에서 30분 동안) TTP-4000 또는 인간 IgGl으로 예비피복시킴으로써 Fc 수용체 자극을 통하여 TNF-알파를 분비하도록, 웰당 40,000 내지 80,000개 세포를 유도시켰다. THP-1 세포에 의해 분비된 TNF-알파의 양은 시판용 TNF ELISA 키트 (공급처: R&D Systems, Minneapolis, MN #DTAOOC)를 지시사항에 따라서 사용하여 처리시킨 웰에서 24시간 세포 배양물로부터 수집한 상등액 중에서 측정하였다.
그 결과가 도 12에 도시되었는데, 이로부터 TTP-4000는 웰당 2 ng 미만의 TNF를 생성시켰고, IgG는 웰당 40 ng 초과를 생성시켰다는 것을 알 수 있다.
실시예 5: TTP-4000의 생체내 활성
TTP-4000의 활성을 몇 가지 인간 질병 생체내 모델에서 sRAGE와 비교하였다.
A. 재발 협착증 동물 모델에서의 TTP-4000
RAGE 융합 단백질 TTP-4000는, 혈관 손상 21일 후 내막 팽창과 평활근 증식을 측정함으로써, 당뇨병성 재발 협착증 랫트 모델에서 평가하였다. 이들 실험에 서는, 좌측 경동맥의 발룬 손상을, 표준 과정을 사용하여 주커 (Zucker) 당뇨병성 랫트와 비당뇨병성 랫트에서 수행하였다. IgG, TTP-4000 또는 인산염 완충 식염수 (PBS)의 부하 용량 (랫트 1마리당 3 mg)을 손상시키기 하루 전에 복강내 (IP) 투여하였다. 손상시킨지 7일 후까지는 유지 용량을 격일로 투여하였다 (즉, 손상시킨 후 1일, 3일, 5일 및 7일 째에 투여함). 이러한 유지 용량은 한 무리에 대해서는 동물당 1 mg 정도로 높거나, 또는 또 다른 제2 무리에 대해서는 0.3 mg 정도로 낮다. 혈관성 평활근 세포 (VSMC) 증식을 측정하기 위해, 손상시킨 후 4일 및 21일 째에 동물을 희생시켰다.
세포 증식을 측정하기 위해, 4일째 동물에게 안락사시키기 18, 12 및 2시간 전에 브로모데옥시우리딘 (BrDdU) 50 mg/kg을 복강내 주사하였다. 희생시킨 후, 전체 좌측 및 우측 경동맥을 수거하였다. 표본을 포매시키기 전 적어도 24시간 동안 히스토초이스 (Histochoice)에 저장하였다. 마우스 항-BrdU 모노클로날 항체를 사용하여, VSMC 증식에 관한 평가를 수행하였다. 형광 표지된 염소 항-마우스 이차 항체를 적용하였다. 이러한 치료 섭생 내용을 전혀 알지 못하는 2명의 관찰자가 박편당 BrdU-양성 핵 수를 계수하였다.
나머지 랫트는 형태계측적 분석을 위해 21일 째에 희생시켰다. 형태계측적 분석은 일련의 박편들, 반 기에손 (Van Gieson) 염색에 의해 염색시킨 (5 mm 간격은 둔) 경동맥들 상에서 컴퓨터 디지털 현미경 면적측정 소프트웨어 (Image-Pro Plus)를 사용하여, 연구군에 대한 내용을 전혀 알지 못하는 관찰자가 수행하였다. 모든 데이터는 평균±SD로서 표현하였다. SPSS 소프트웨어를 사용하여 통계적 분 석을 수행하였다. 쌍을 이루지 않은 t 시험을 사용하여 연속되는 변수를 비교하였다. P ≤ 0.05 값이 통계상 유의적인 것으로 간주되었다.
도 13A 및 13B에 도시된 바와 같이, TTP-4000 처치는 혈관 내막/중막 비와 혈관성 평활근 세포 증식을 용량-반응성 방식으로 저하시켰다. 도 13B에서는, y-축이 BrdU 증식성 세포 수를 나타낸다.
B. AD 동물 모델에서의 TTP4000
TTP-4000이 AD 마우스 모델에서 아밀로이드 형성과 인식 기능장애에 영향을 미칠 수 있었는지를 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 이 실험은 PDGF-B 연쇄 프로모터의 제어 하에 인간 스웨덴인 돌연변이체 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 활용하였다. 시간이 지남에 따라, 이들 마우스는 고 수준의 RAGE 리간드 아밀로이드 베타 (Aβ)를 생성하였다. 기존에는, sRAGE로 3개월 동안 처치하면, 뇌에서의 아밀로이드 반점 형성과, 이와 관련하여 이러한 모델에서의 염증성 마커 증가가 저하되는 것으로 밝혀졌다.
본 실험에 사용된 APP 마우스 (수컷)는 인간 APP 유전자 (스웨덴인 및 런던인 돌연변이를 수반함)를 혈소판-유래된 성장 인자 B (PDGF-B) 연쇄 유전자 프로모터의 제어 하에 마우스 난자 내로 미세주사함으로써 고안하였다. 이 마우스는 C57BL/6 배경 상에서 생성되었고, 다음 업체 (Molecular Therapeutics Inc.)에 의해 개발되었다. 동물에게 사료를 임의로 공급하고, 형제 자매 교배함으로써 유지시켰다. 이러한 구조물로부터 발생한 마우스에게서, 생후 6개월 째부터 아밀로이드 침착물이 발생하였다. 동물을 6개월 동안 노화시킨 다음 90일 동안 유지시키 고, 아밀로이드 정량화를 위해 희생시켰다.
APP 트랜스제닉 마우스에게 비히클 또는 TTP4000을 생후 6개월부터 시작하여 90일 동안 격일 투여하였다 (복강내). 실험이 끝날 무렵, 동물을 희생시키고 뇌에 존재하는 Aβ 반점 (즉, 반점 수)을 검사하였다. 생후 6개월 대조군 APP군은 아밀로이드 침착물의 기준선을 결정하기 위해 사용하였다. 또한, 연구가 끝날 무렵, 상기 동물을 대상으로 하여 행위적 [모리스 수 미로(Morris water maze)] 분석을 수행하였다. 이에 참여한 연구 조사자들은 연구 화합물에 관한 내용을 전혀 알지 못하였다. 샘플을 마우스 1마리당 격일로 0.25 ml 투여하였다. 또한, 마우스 한 무리에게는 인간 sRAGE를 1일 200 ㎍ 투여하였다.
1. 아밀로이드 베타 침착
조직학적으로 조사하기 위해, 해당 동물에게 나트륨 펜토바르비탈 (50 mg/kg)을 복강내 주사 (IP)하여 이를 마취시켰다. 이 동물에게 4℃ 인산염 완충 식염수 (PBS)에 이어, 4% 파라포름알데히드를 경심장적으로 관류시켰다. 뇌를 꺼내어 4% 파라포름알데히드에 밤새 놓아두었다. 이 뇌를 파라핀으로 처리하고 포매시켰다. 뇌내의 일련의 30-㎛ 두께 박편 10개를 수득하였다. 이들 박편에 일차 항체 (Aβ 펩티드 항체)를 4℃ 하에 밤새 적용하여 상기 트랜스제닉 동물 뇌에서의 아밀로이드 침착물을 탐지하였다 [참고: Guo et al., J. Neurosci., 22:5900-5909 (2002)]. 박편을 트리스 완충 식염수 (TBS)에서 세척하고, 이차 항체를 가한 다음, 실온에서 1시간 동안 항온 배양하였다. 세척한 후, 박편을 벡터 ABC 엘라이트 키트 (공급처: Vector Laboratories)에서 지시된 바와 같이 항온 배양하고 디아미 노벤조산 (DAB)으로 염색하였다. 반응을 물에서 중단시키고, 크실렌으로 처리한 후에 커버 슬립으로 덮었다. 순간 포착 프레임 그래버 카드가 장착된 파워 매캔토시 컴퓨터, 올림푸스 (Olympus) 현미경 위에 설치된 히타치 (Hitachi) CCD 카메라 및 카메라 스탠드로 구성된, 컴퓨터를 이용한 영상 분석 시스템을 사용하여, 각 박편 내의 아밀로이드 면적을 결정하였다. NIH 영상 분석용 소프트웨어 v. 1.55를 사용하였다. 영상을 포착하고 10개 박편 전반에 걸친 아밀로이드 총 면적을 결정하였다. 처리 상태를 전혀 알지 못하는 단독 조작원이 모든 측정 과정을 수행하였다. 박편의 아밀로이드 용적을 합하고, 이를 총 박편 수로 나눔으로써 아밀로이드 용적을 계산하였다.
정량적으로 분석하기 위해, 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)을 사용하여 APP 트랜스제닉 마우스 (공급처: Biosource International, Camarillo, CA) 뇌내의 인간 총 Aβ, Aβ총 및 Aβ1-42 수준을 측정하였다. Aβ총 및 Aβ1-42는 구아니딘 히드로클로라이드에 의해 마우스 뇌로부터 추출하고, 제조업자가 기재한 바와 같이 정량화하였다. 이러한 검정으로, 뇌로부터 총 Aβ 펩티드 (가용성 및 응집형)를 추출할 수 있었다.
2. 인식 기능
모리스 수 미로 시험을 다음과 같이 수행하였다: 실험이 끝날 무렵 모든 마우스를 대상으로 하여 모리스 수 미로 시험으로 1회 시험하였다. 마우스를 1.2 m의 개방된 수 미로에서 훈련시켰다. 풀을 물로 30 cm 깊이가 되도록 채운 다음 25 ℃로 유지시켰다. 탈출용 플랫폼 (10 평방 cm)을 수 표면 1 cm 아래에 놓아두었다. 이와 같이 시도하는 동안, 상기 플랫폼을 풀로부터 제거하였다. 이러한 자극을 가하는 시험은 흰색 커튼이 쳐진 풀에서 수행하여 미로 외의 어떠한 (행동을 유발하는) 자극도 감추었다. 모든 동물을 대상으로 하여 비-공간적 사전 훈련 (NSP)을 3일 연속해서 진행시켰다. 이러한 시도는 동물에게 플랫폼을 찾을 수 있는 기억력이 남아있는지를 결정하기 위한 최종 행위 시험을 하기 위한 것이다. 이러한 시도는 기록하지 않았는데, 단지 훈련하기 위한 것일 뿐이다. 훈련 및 학습 연구의 경우에는, 커튼을 치우고 별도의 미로 자극을 가하였다 (이로써, 수영 장애가 있는 동물을 확인할 수 있었다). 1일 째에는, 마우스를 감춰진 플랫폼 상에 20초 동안 놓아 두고 (시도 1), 시도 2 내지 3 동물의 경우에는 행동 자극시킨 플랫폼 또는 감춰진 플랫폼으로부터 10 cm 떨어진 거리에서 물에 풀어 놓고 (시도 4), 플랫폼까지 수영하도록 하였다. 시도 이틀 째에는, 감춰진 플랫폼을 풀 중앙이나 각 4분원 중앙 사이에 무작위로 이동시켰다. 동물을 벽 쪽을 향하도록 무작위로 풀에 풀어 놓았는데, 플랫폼에 도달하는데 60초가 소요되도록 하였다 (3번 시도). 세번째 시도에서는, 동물이 3번 시도하게 하였는데, 2번은 감춰진 플랫폼을 이용하였고, 1번은 행동을 자극하는 플랫폼을 이용하였다. NSP한지 2일 후에, 동물을 대상으로 하여 최종 행위 시도 (모리스 수 미로 시험)를 수행하였다. 이들 시도 (동물당 3번)를 위해, 플랫폼을 풀의 1개 4분원 중앙에 놓아두고, 동물을 벽 쪽을 향하도록 무작위로 풀에 풀어 놓았다. 동물이 플랫폼을 발견하거나 수영하는데 60초 (이는 플랫폼을 발견하는데 소요되는 잠복 기간이다)가 소요되도록 하였다. 모든 동물은 투약한지 4 내지 6시간 내에 시험하였고, 동물을 무작위로 선별하여 시험군에 관한 내용을 전혀 알지 못하는 조작원이 시험하였다.
그 결과를 평균±표준 편차 (SD)로서 표현하였다. 아밀로이드 및 행위적 연구에 있어서의 유의적 차이는 t-시험을 이용하여 분석하였다. 6개월생 APP 대조군과 TTP-4000 처리 동물 간을 비교하였을 뿐만 아니라 9개월생 APP 비히클 처리군과 TTP-4000 처리 동물 간도 비교하였다. 0.05 미만 차이가 유의적인 것으로 간주되었다. 아밀로이드 및 행위 상의 변화율 (%)은 각 군의 데이터를 종합하고, 이를 상기 비교 수치로 나눔으로써 결정하였다 (즉, 1, 복강내/6개월생 대조군 = % 변화).
도 14A 및 14B는 TTP-4000 또는 마우스 sRAGE를 이용하여 3개월간 처치한 마우스는 비히클 및 음성 대조군 인간 IgGl (IgGl)로 처치한 동물 보다도 Aβ 반점 수가 더 적었고 인식 기능 장애가 덜하였다는 것을 나타낸다. 이러한 데이터는 TTP-4000이 트랜스제닉 마우스 모델에서 AD 병리 상태를 저하시키는데 유효하다는 것을 나타낸다. 또한, sRAGE과 마찬가지로 TTP-4000 역시, 염증성 사이토킨 IL-1 및 TNF-α를 감소시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다 (데이터는 제시되지 않음).
C. 발작 (뇌졸중) 동물 모델에서 TTP-4000의 효능
TTP-4000을 또한, 특정 질병과 관련된 발작 동물 모델에서 sRAGE와 비교하였다. 이러한 모델에서는, 마우스의 중간 경동맥을 1시간 동안 결찰시킨 다음, 23시간 동안 재관류하였는데, 이때 마우스를 희생시키고 뇌 경색 면적을 평가하였다. 재관류시키기 직전에 마우스를 sRAGE 또는 TTP-4000 또는 대조군 면역글로불린으로 처치하였다.
이들 실험에서는, 수컷 C57BL/6에게 마우스 1마리당 비히클 250 ㎕ 또는 TTP 시험 제품 (마우스 1마리당 TTP-3000, TTP-4000 250 ㎕)을 주사하였다. 허혈증이 발생한지 1시간 후에 마우스에게 복강내 주사하였다. 마우스를 대상으로 하여 1시간 동안 뇌 허혈증을 발생시킨 다음 24시간 재관류하였다. 허혈증을 유도시키기 위해, 각 마우스를 마취시키고, 외부적으로 가온시킴으로써 체온을 36 내지 37℃로 유지시켰다. 경부 (목) 중심선을 절개하여 좌측 경동맥 (CCA)을 노출시켰다. 내부 경동맥 (ICA) 기점 주변에 미세수술용 클립을 놓아두었다. ECA의 원위 말단을 실크로 결찰시키고 가로로 절개하였다. 6-0 실크로 ECA 스텀프 (stump) 주변을 느슨하게 묶었다. 불을 이용하여 끝을 처리시킨 나일론 봉합사를 ECA 스텀프 내로 조심스럽게 삽입하였다. 6-0 실크 루프를 상기 스텀프 주변에 단단히 고정시키고, 나일론 봉합사가 전방 뇌동맥에 잔류할 때까지 이 봉합사를 내부 경동맥 (ICA) 내로 나아가게 함으로써, 이와 같이 전달되는 전방 뇌동맥과 중간 뇌동맥을 폐쇄시켰다. 나일론 봉합사를 1시간 동안 원 위치에 놓아둔 후, 동물을 다시 마취시키고, 직장 온도를 기록한 다음, 봉합사를 꺼내고 절개 부위를 닫았다.
해당 동물에게 나트륨 펜토바르비톨 (50 mg/kg)을 복강내 주사함으로써 마취시킨 다음 뇌를 꺼냄으로써, 경색 용적을 결정하였다. 이어서, 뇌를 절단하여, 경색된 영역 내의 2-mm 박편 4개를 수득하고, 이를 2% 트리페닐테트라졸륨 클로라이드 (TTC)에 30분 동안 놓아 두었다. 그 후, 상기 박편을 4% 파라포름알데히드에 밤새 놓아두었다. 순간 포착 프레임 그래버 카드가 장착된 파워 매캔토시 컴퓨터 및 카메라 스탠드 위에 설치된 히타치 CCD 카메라로 구성된, 컴퓨터를 이용한 영상 분석 시스템을 사용하여, 각 박편 내의 경색 면적을 결정하였다. NIH 영상 분석용 소프트웨어 v. 1.55를 사용하였다. 영상을 포착하고 박편 전반에 걸친 경색 총 면적을 결정하였다. 처리 상태를 전혀 알지 못하는 단독 조작원이 모든 측정 과정을 수행하였다. 박편의 경색 용적을 합하여 총 경색 용적을 계산하였다. 그 결과를 평균±표준 편차 (SD)로서 표현하였다. 경색 용적 데이터에 있어서의 유의적 차이는 t-시험을 이용하여 분석하였다.
표 2의 데이터로써 예시된 바와 같이, TTP-4000은 상기 동물에게서 경색 면적을 제한한다는 점에서 sRAGE 보다 더 효능이 있었는데, 이는 TTP-4000가 그의 혈장 내에서의 반감기가 더 우수하기 때문에 이들 마우스에서 sRAGE 보다 더 큰 보호를 유지할 수 있었다는 것을 제안하고 있다.
실시예 6; ELISA 에 의한 RAGE 융합 단백질의 검출
초기에는, 1X PBS pH 7.3 중의 10 ㎍/ml 농도의 RAGE 특이적 모노클로날 항체 1HBlOl 50 ㎍을 밤새 항온 배양함으로써 판 상에 피복시켰다. 사용하기 직전에, 판을 300 ㎕의 1X 이미다졸-트윈 세척 완충액으로 3회 세척한 다음, 1% BSA로 차단시켰다. 공지된 TTP-4000 희석률의 샘플 (희석됨) 및 표준 희석물을 100 ㎕ 최종 용적으로 가하였다. 샘플을 실온에서 1시간 동안 항온 배양하였다. 항온 배양 후, 상기 판을 3회 세척하였다. 1% BSA를 수반한 1X PBS 중의 염소 항-인간 IgGl 1 (Sigma A3312) AP 접합체를 가하고, 실온에서 1시간 동안 항온 배양하였다. 판을 3회 세척하였다. 파라니트로페닐포스페이트를 사용하여 색상을 밝혀내었다.
실시예 7: RAGE 융합 단백질에 결합하는 RAGE 리간드의 정량
도 15는 공지된 각종 고정화 RAGE 리간드에 대한 TTP-4000을 이용한 경우의 포화-결합 곡선을 도시한 것이다. 상기 리간드를 미세역가 판 상에 고정화시키고, 0에서부터 360 nM까지 증가 농도의 융합 단백질의 존재 하에 항온 배양하였다. 융합 키메라의 IgG 부분에 대해 특이적인 알칼리성 포스파타제와 접합시킨 폴리클로날 항체를 사용하여, 융합 단백질-리간드 상호 작용을 탐지하였다. 그래프파드 프리즘 (Graphpad Prizm) 소프트웨어를 사용하여 상대적 Kds를 계산하였는데, 이는 당해 분야의 문헌에 확립된 RAGE-RAGE 리간드 값과 부합되었다. HMGlB = 암포테린, CML = 카복시메틸 리신, A 베타 = 아밀로이드 베타 1-40.
전술된 내용은 본 발명의 요지를 단지 예시하는 것으로 간주해야 한다. 당업자는 수 많은 변형과 변화를 용이하게 인지할 것이기 때문에, 본 발명이 본원에 제시되고 기재된 바로 그 양태들로만 제한되지 않으며, 첨부된 청구의 범위 내에 속하는 적합한 모든 변형물과 등가물 역시 본 발명의 개념 내인 것으로 간주된다.
SEQUENCE LISTING <110> TransTech Pharma, Inc. <120> RAGE Fusion Proteins and Methods of Use <130> 41305-318492 <150> US 60/598,555 <151> 2004-08-03 <160> 44 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 404 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu 1 5 10 15 Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu 20 25 30 Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg 35 40 45 Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu 50 55 60 Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro 65 70 75 80 Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile 85 90 95 Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn 100 105 110 Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp 115 120 125 Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys 130 135 140 Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp 145 150 155 160 Gly Lys Pro 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Homo sapiens <400> 27 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60 gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120 gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180 tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240 aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300 gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360 cctgggaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggt 408 <210> 28 <211> 690 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gcgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60 gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120 gcccccaaga aaccacccca gcggctggaa tggaaactga acacaggccg gacagaagct 180 tggaaggtcc tgtctcccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 240 aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 300 gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 360 cctgggaagc cagaaattgt 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Ile Ala Val 245 250 255 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 260 265 270 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 275 280 285 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 290 295 300 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 305 310 315 320 Ser Pro Gly Lys <210> 37 <211> 323 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 37 Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys 1 5 10 15 Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr 20 25 30 Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro 50 55 60 Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn 65 70 75 80 Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln 85 90 95 Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala 100 105 110 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 115 120 125 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 130 135 140 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 145 150 155 160 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 165 170 175 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 180 185 190 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 195 200 205 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 210 215 220 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 225 230 235 240 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 245 250 255 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 260 265 270 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 275 280 285 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 290 295 300 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 305 310 315 320 Pro Gly Lys <210> 38 <211> 210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 1 5 10 15 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 20 25 30 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 35 40 45 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 50 55 60 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 65 70 75 80 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 85 90 95 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 100 105 110 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 115 120 125 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 130 135 140 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 145 150 155 160 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 165 170 175 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 180 185 190 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 195 200 205 Gly Lys 210 <210> 39 <211> 633 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 60 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 120 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 180 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 240 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 300 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 360 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 420 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 480 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 540 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 600 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 633 <210> 40 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 1 5 10 15 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 100 105 110 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 115 120 125 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 130 135 140 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 145 150 155 160 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 165 170 175 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 180 185 190 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 41 <211> 663 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 60 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 120 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 180 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 240 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 300 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 360 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 420 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 480 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 540 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 600 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 660 tga 663 <210> 42 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 1 5 10 15 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 100 105 110 Lys <210> 43 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 44 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Ile Ser Ile Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Leu Gly Thr Leu Ala 20 25

Claims (78)

  1. 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 면역글로불린의 CH2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드와 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, RAGE 폴리펩티드가, RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고, RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, RAGE 면역글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 포함하는 것인 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, RAGE 폴리펩티드가 리간드 결합 부위를 포함하는 것인 융합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, RAGE 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 서열 10 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  5. 제2항에 있어서, RAGE 면역글로불린 도메인에 연결된 도메인간 링커를 포함하는 RAGE 폴리펩티드가 전장 RAGE 단백질의 단편을 포함하는 것인 융합 단백질.
  6. 제5항에 있어서,
    제1 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제1 RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고,
    제2 RAGE 면역글로불린 도메인의 N-말단 아미노산이 제1 도메인간 링커의 C-말단 아미노산에 연결되며,
    제2 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제2 RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고,
    제2 RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 CH2 면역글로불린 도메인 또는 면역글로불린의 CH2 도메인의 일부의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록,
    제2 RAGE 면역글로불린 도메인 및 제2 RAGE 도메인간 링커에 연결된 제1 RAGE 면역글로불린 도메인 및 제1 RAGE 도메인간 링커를 추가로 포함하는 융합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 서열 33 또는 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
  8. 제6항에 있어서, 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
  9. 제6항에 있어서, 면역글로불린 CH2 도메인 또는 그의 일부와 직접적으로 연결된 RAGE 도메인간 링커가 서열 22 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 서열 24 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  10. 제5항에 있어서, RAGE 도메인간 링커를 통하여 CH2 면역글로불린 도메인 또는 면역글로불린의 CH2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 연결된 단일 RAGE 면역글로불린 도메인을 포함하는 융합 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 서열 36 또는 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
  12. 제10항에 있어서, 서열 35의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
  13. 제10항에 있어서, 면역글로불린 CH2와 직접적으로 연결된 RAGE 링커가 서열 21 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 서열 23 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  14. 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 면역글로불린의 CH2 도메인의 일부를 포함 하는 폴리펩티드와 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 서열.
  15. 제14항에 있어서,
    RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고,
    RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록,
    RAGE 폴리펩티드가 RAGE 면역글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 포함하는 것인 단리된 핵산 서열.
  16. 제15항에 있어서, 서열 30 또는 그의 단편, 또는 서열 31 또는 그의 단편을 포함하는 핵산.
  17. 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 면역글로불린의 CH2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드와 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 발현 벡터.
  18. 제17항에 있어서,
    RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고,
    RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록,
    RAGE 폴리펩티드가 RAGE 면역글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 포함하는 것인 발현 벡터.
  19. 제17항에 있어서, 서열 30 또는 그의 단편, 또는 서열 31 또는 그의 단편의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  20. 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 면역글로불린의 CH2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드와 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 발현하도록, 제17항의 발현 벡터로 형질감염된 세포.
  21. RAGE 융합 단백질이 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 면역글로불린의 CH2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드와 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는, 치료 유효량의 RAGE 융합 단백질을 제약 담체 중에 포함하는 조성물.
  22. 제21항에 있어서,
    RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고,
    RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록,
    RAGE 폴리펩티드가 RAGE 면역글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 포함하는 것인 조성물.
  23. 제21항에 있어서, RAGE 폴리펩티드가 리간드 결합 부위를 포함하는 것인 조성물.
  24. 제23항에 있어서, RAGE 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 서열 10 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함하는 것인 조성물.
  25. 제22항에 있어서, RAGE 면역글로불린 도메인에 연결된 도메인간 링커를 포함하는 RAGE 폴리펩티드가 전장 RAGE 단백질의 단편을 포함하는 것인 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    제1 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제1 RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고,
    제2 RAGE 면역글로불린 도메인의 N-말단 아미노산이 제1 도메인간 링커의 C-말단 아미노산에 연결되며, 제2 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제2 RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고,
    제2 RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 CH2 면역글로불린 도메인 또는 면역글로불린의 CH2 도메인의 일부의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록,
    RAGE 폴리펩티드가 제2 RAGE 면역글로불린 도메인 및 제2 RAGE 도메인간 링커에 연결된 제1 RAGE 면역글로불린 도메인 및 제1 RAGE 도메인간 링커를 포함하는 것인 조성물.
  27. 제26항에 있어서, RAGE 융합 단백질이 서열 33 또는 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  28. 제25항에 있어서, 융합 단백질이, RAGE 도메인간 링커를 통하여 CH2 면역글로불린 도메인 또는 면역글로불린의 CH2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 연결된 단일 RAGE 면역글로불린 도메인을 포함하는 것인 조성물.
  29. 제28항에 있어서, RAGE 융합 단백질이 서열 36 또는 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  30. 제21항에 있어서, RAGE 융합 단백질이 주사용 용액제로서 제형화되는 조성물.
  31. 제21항에 있어서, RAGE 융합 단백질이 무균의 동결건조된 산제로서 제형화되는 조성물.
  32. 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 면역글로불린의 CH2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드에 RAGE 폴리펩티드를 공유결합으로 연결시키는 단계를 포함하는, RAGE 융합 단백질의 제조 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고,
    RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록,
    RAGE 폴리펩티드가 RAGE 면역글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 포함하는 것인 방법.
  34. 제32항에 있어서, RAGE 폴리펩티드가 리간드 결합 부위를 포함하는 것인 방 법.
  35. 제34항에 있어서, RAGE 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 서열 10 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함하는 것인 방법.
  36. 제33항에 있어서, RAGE 면역글로불린 도메인에 연결된 도메인간 링커를 포함하는 RAGE 폴리펩티드가 전장 RAGE 단백질의 단편을 포함하는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    제1 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제1 RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고,
    제2 RAGE 면역글로불린 도메인의 N-말단 아미노산이 제1 도메인간 링커의 C-말단 아미노산에 연결되며,
    제2 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제2 RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고,
    제2 RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 CH2 면역글로불린 도메인 또는 면역글로불린의 CH2 도메인의 일부의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록,
    RAGE 폴리펩티드가 제2 RAGE 면역글로불린 도메인 및 제2 RAGE 도메인간 링커에 연결된 제1 RAGE 면역글로불린 도메인 및 제1 RAGE 도메인간 링커를 포함하는 것인 방법.
  38. 제36항에 있어서, RAGE 폴리펩티드가, RAGE 도메인간 링커를 통하여 CH2 면역글로불린 도메인 또는 면역글로불린의 CH2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 연결된 단일 RAGE 면역글로불린 도메인을 포함하는 것인 방법.
  39. 제32항에 있어서, 융합 단백질이 재조합 DNA 구조물에 의해 코딩되는 방법.
  40. 제32항에 있어서, DNA 구조물을 발현 벡터 내로 혼입시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 발현 벡터를 숙주 세포 내로 형질감염시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  42. 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 면역글로불린의 CH2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드와 직접적으로 연결된 RAGE 폴리펩티드를 포함하는 RAGE 융합 단백질을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 RAGE-매개 질환을 치료하는 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산이 도메인간 링커의 N-말단 아미노산에 연결되고,
    RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 면역글로불린의 CH2 도메인 또는 그의 일부를 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록,
    RAGE 폴리펩티드가 RAGE 면역글로불린 도메인에 연결된 RAGE 도메인간 링커를 포함하는 것인 방법.
  44. 제42항에 있어서, RAGE 리간드 결합 부위가 서열 9 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 서열 10 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함하는 것인 방법.
  45. 제43항에 있어서, RAGE 면역글로불린 도메인에 연결된 도메인간 링커를 포함하는 RAGE 폴리펩티드가 전장 RAGE 단백질의 단편을 포함하는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 제1 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제1 RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연결되고, 제2 RAGE 면역글로불린 도메인의 N-말단 아미노산이 제1 도메인간 링커의 C-말단 아미노산에 연결되며, 제2 도메인간 링커의 N-말단 아미노산이 제2 RAGE 면역글로불린 도메인의 C-말단 아미노산에 연 결되고, 제2 RAGE 도메인간 링커의 C-말단 아미노산이 CH2 면역글로불린 도메인 또는 면역글로불린의 CH2 도메인의 일부의 N-말단 아미노산에 직접적으로 연결되도록, 제2 RAGE 면역글로불린 도메인 및 제2 RAGE 도메인간 링커에 연결된 제1 RAGE 면역글로불린 도메인 및 제1 RAGE 도메인간 링커를 추가로 포함하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, RAGE 융합 단백질이 서열 33 또는 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  48. 제46항에 있어서, RAGE 융합 단백질이 서열 35의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  49. 제46항에 있어서, 면역글로불린 CH2 도메인 또는 그의 일부와 직접적으로 연결된 RAGE 도메인간 링커가 서열 22 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 서열 24 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함하는 것인 방법.
  50. 제45항에 있어서, RAGE 도메인간 링커를 통하여 CH2 면역글로불린 도메인 또는 면역글로불린의 CH2 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드의 N-말단 아미노산에 연결된 단일 RAGE 면역글로불린 도메인을 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, RAGE 융합 단백질이 서열 36 또는 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  52. 제50항에 있어서, RAGE 융합 단백질이 서열 35의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  53. 제50항에 있어서, 면역글로불린 CH2 또는 그의 일부와 직접적으로 연결된 RAGE 도메인간 링커가 서열 21 또는 이와 90% 동일한 서열, 또는 서열 23 또는 이와 90% 동일한 서열을 포함하는 것인 방법.
  54. 제42항에 있어서, RAGE 융합 단백질을 대상체에게 정맥내 투여하는 것을 포함하는 방법.
  55. 제42항에 있어서, RAGE 융합 단백질을 대상체에게 복강내 투여하는 것을 포함하는 방법.
  56. 제42항에 있어서, RAGE 융합 단백질을 대상체에게 피하 투여하는 것을 포함하는 방법.
  57. 제42항에 있어서, 융합 단백질이 당뇨병 증상 또는 당뇨병 말기 합병증 증상을 치료하기 위해 사용되는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 당뇨병 증상 또는 당뇨병 말기 합병증 증상이 당뇨병성 신장애를 포함하는 방법.
  59. 제57항에 있어서, 당뇨병 증상 또는 당뇨병 말기 합병증 증상이 당뇨병성 망막병증을 포함하는 방법.
  60. 제57항에 있어서, 당뇨병 증상 또는 당뇨병 말기 합병증 증상이 당뇨병성 족부 궤양을 포함하는 방법.
  61. 제57항에 있어서, 당뇨병 증상 또는 당뇨병 말기 합병증 증상이 심혈관 합병증을 포함하는 방법.
  62. 제57항에 있어서, 당뇨병 증상 또는 당뇨병 말기 합병증 증상이 당뇨병성 신경병증을 포함하는 방법.
  63. 제42항에 있어서, 융합 단백질이 아밀로이드증 (amyloidosis)을 치료하기 위 해 사용되는 방법.
  64. 제42항에 있어서, 융합 단백질이 알츠하이머병 (Alzheimer's disease)을 치료하기 위해 사용되는 방법.
  65. 제42항에 있어서, 융합 단백질이 암을 치료하기 위해 사용되는 방법.
  66. 제42항에 있어서, 융합 단백질이 자가면역증과 연관된 염증을 치료하기 위해 사용되는 방법.
  67. 제42항에 있어서, 융합 단백질이 염증성 장 질환과 연관된 염증을 치료하기 위해 사용되는 방법.
  68. 제42항에 있어서, 융합 단백질이 류마티스성 관절염과 연관된 염증을 치료하기 위해 사용되는 방법.
  69. 제42항에 있어서, 융합 단백질이 건선과 연관된 염증을 치료하기 위해 사용되는 방법.
  70. 제42항에 있어서, 융합 단백질이 다발성 경화증과 연관된 염증을 치료하기 위해 사용되는 방법.
  71. 제42항에 있어서, 융합 단백질이 저산소증과 연관된 염증을 치료하기 위해 사용되는 방법.
  72. 제42항에 있어서, 융합 단백질이 뇌졸중과 연관된 염증을 치료하기 위해 사용되는 방법.
  73. 제42항에 있어서, 융합 단백질이 심장 마비와 연관된 염증을 치료하기 위해 사용되는 방법.
  74. 제42항에 있어서, 융합 단백질이 출혈성 쇼크와 연관된 염증을 치료하기 위해 사용되는 방법.
  75. 제42항에 있어서, 융합 단백질이 패혈증과 연관된 염증을 치료하기 위해 사용되는 방법.
  76. 제42항에 있어서, 융합 단백질이 장기 이식과 연관된 염증을 치료하기 위해 사용되는 방법.
  77. 제42항에 있어서, 융합 단백질이 상처 치유 부전과 연관된 염증을 치료하기 위해 사용되는 방법.
  78. 제42항에 있어서, 융합 단백질이 신부전을 치료하기 위해 사용되는 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130059461A (ko) * 2007-06-14 2013-06-05 갈락티카 파마슈티칼스, 인크. Ｒａｇｅ 융합 단백질
WO2015023165A1 (ko) * 2013-08-16 2015-02-19 가톨릭대학교 산학협력단 염증조절복합체 및 ｓｔａｔ３ 신호분자 차단을 통한 면역조절능 최적화된 안정화 중간엽줄기세포

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6465422B1 (en) * 1998-04-17 2002-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for inhibiting tumor invasion or spreading in a subject
US6303321B1 (en) 1999-02-11 2001-10-16 North Shore-Long Island Jewish Research Institute Methods for diagnosing sepsis
US7304034B2 (en) 2001-05-15 2007-12-04 The Feinstein Institute For Medical Research Use of HMGB fragments as anti-inflammatory agents
US7696169B2 (en) * 2003-06-06 2010-04-13 The Feinstein Institute For Medical Research Inhibitors of the interaction between HMGB polypeptides and toll-like receptor 2 as anti-inflammatory agents
EP1668035A2 (en) * 2003-09-11 2006-06-14 Critical Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies against hmgb1
BRPI0514052A (pt) 2004-08-03 2008-05-27 Transtech Pharma Inc proteìnas de fusão rage e métodos de utilização
AU2005271449A1 (en) * 2004-08-03 2006-02-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York RAGE fusion proteins and methods of use
US20070087406A1 (en) * 2005-05-04 2007-04-19 Pei Jin Isoforms of receptor for advanced glycation end products (RAGE) and methods of identifying and using same
AU2006330807A1 (en) * 2005-11-28 2007-07-05 Medimmune, Llc Antagonists of HMBG1 and/or rage and methods of use thereof
US7957931B2 (en) * 2005-12-23 2011-06-07 Gcoder Systems Ab Positioning pattern
KR20080105066A (ko) * 2006-02-09 2008-12-03 트랜스테크 파르마, 인크. Ｒａｇｅ 융합 단백질 및 이의 사용 방법
KR20090008459A (ko) * 2006-05-05 2009-01-21 트랜스테크 파르마, 인크. Ｒａｇｅ 융합 단백질, 제제 및 이의 사용 방법
CN107011431B (zh) 2007-01-30 2020-11-06 埃皮瓦克斯公司 调节性t细胞表位、组合物及其用途
WO2008100470A2 (en) * 2007-02-15 2008-08-21 Transtech Pharma, Inc. Rage - immunoglobulin fusion proteins
US20100254983A1 (en) * 2007-06-07 2010-10-07 Ann Marie Schmidt Uses of rage antagonists for treating obesity and related diseases
US20120047586A9 (en) * 2007-10-24 2012-02-23 Otsuka Chemical Co., Ltd Polypeptide having enhanced effector function
NL2001552C2 (nl) * 2008-05-06 2009-05-07 Transtech Pharma Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001555C2 (nl) * 2008-05-06 2009-05-07 Transtech Pharma Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001553C2 (nl) * 2008-05-06 2009-05-07 Transtech Pharma Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001557C2 (nl) * 2008-05-06 2009-05-07 Transtech Pharma Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001554C2 (nl) * 2008-05-06 2009-05-07 Transtech Pharma Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001556C2 (nl) * 2008-05-06 2009-05-07 Transtech Pharma Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001551C2 (nl) * 2008-05-06 2009-05-07 Transtech Pharma Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001558C2 (nl) * 2008-05-06 2009-05-07 Transtech Pharma Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
CN104987416A (zh) 2008-05-23 2015-10-21 Siwa有限公司 促进再生的方法、组合物及设备
US9034341B2 (en) 2009-04-20 2015-05-19 Transtech Pharma, Llc Control of RAGE fusion protein glycosylation and RAGE fusion protein compositions
US10080799B2 (en) 2010-02-12 2018-09-25 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Methods and compositions related to glycoprotein-immunoglobulin fusions
WO2011102845A1 (en) * 2010-02-18 2011-08-25 Transtech Pharma, Inc. Rage fusion protein compositions and methods of use
EP3511017A1 (en) 2010-09-27 2019-07-17 Siwa Corporation Selective removal of age-modified cells for treatment of atherosclerosis
US8721571B2 (en) 2010-11-22 2014-05-13 Siwa Corporation Selective removal of cells having accumulated agents
CA2839622A1 (en) 2011-06-28 2013-01-03 Inhibrx Llc Wap domain fusion polypeptides and methods of use thereof
US10400029B2 (en) 2011-06-28 2019-09-03 Inhibrx, Lp Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
SG10201601621PA (en) 2011-06-28 2016-04-28 Inhibrx Llc Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
JP2015533483A (ja) * 2012-09-07 2015-11-26 サノフイ メタボリックシンドロームを治療するための融合タンパク質
EP3194439B1 (en) 2014-09-19 2022-01-19 Siwa Corporation Anti-age antibodies for treating inflammation and auto-immune disorders
US10358502B2 (en) 2014-12-18 2019-07-23 Siwa Corporation Product and method for treating sarcopenia
US9993535B2 (en) 2014-12-18 2018-06-12 Siwa Corporation Method and composition for treating sarcopenia
WO2017143073A1 (en) 2016-02-19 2017-08-24 Siwa Corporation Method and composition for treating cancer, killing metastatic cancer cells and preventing cancer metastasis using antibody to advanced glycation end products (age)
CN109311975A (zh) 2016-04-15 2019-02-05 Siwa有限公司 用于治疗神经退行性紊乱的抗age抗体
US20190263918A1 (en) * 2016-06-08 2019-08-29 Shanghai Jiao Tong University School Of Medicine Sequence of antibody heavy chain constant region for enhancing agonistic antibody activity
WO2017222535A1 (en) 2016-06-23 2017-12-28 Siwa Corporation Vaccines for use in treating various diseases and disorders
US10961321B1 (en) 2017-01-06 2021-03-30 Siwa Corporation Methods and compositions for treating pain associated with inflammation
US10925937B1 (en) 2017-01-06 2021-02-23 Siwa Corporation Vaccines for use in treating juvenile disorders associated with inflammation
US10995151B1 (en) 2017-01-06 2021-05-04 Siwa Corporation Methods and compositions for treating disease-related cachexia
US10858449B1 (en) 2017-01-06 2020-12-08 Siwa Corporation Methods and compositions for treating osteoarthritis
US10457717B2 (en) 2017-02-17 2019-10-29 Denali Therapeutics Inc. Engineered polypeptides
US10143187B2 (en) 2017-02-17 2018-12-04 Denali Therapeutics Inc. Transferrin receptor transgenic models
CA3053381A1 (en) * 2017-02-17 2018-08-23 Denali Therapeutics Inc. Engineered polypeptides
JP2020516648A (ja) 2017-04-13 2020-06-11 シワ コーポレーション ヒト化モノクローナル終末糖化産物抗体
US11518801B1 (en) 2017-12-22 2022-12-06 Siwa Corporation Methods and compositions for treating diabetes and diabetic complications
US10913784B2 (en) 2018-09-14 2021-02-09 BioAge Labs, Inc. RAGE fusion proteins with improved stability and ligand binding affinity and uses thereof

Family Cites Families (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4867973A (en) 1984-08-31 1989-09-19 Cytogen Corporation Antibody-therapeutic agent conjugates
US6018026A (en) 1988-01-22 2000-01-25 Zymogenetics, Inc. Biologically active dimerized and multimerized polypeptide fusions
US5567584A (en) 1988-01-22 1996-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF
NZ235148A (en) 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
SE9201073D0 (sv) 1992-04-03 1992-04-03 Kabi Pharmacia Ab Protein formulation
DK0672141T3 (da) 1992-10-23 2003-06-10 Immunex Corp Fremgangsmåder til fremstilling af opløselige, oligomere proteiner
US5891341A (en) 1995-04-05 1999-04-06 The Picower Institute For Medical Research Compositions and devices for partitioning advanced glycosylation endproducts, and methods of their use
CA2210684C (en) 1995-01-18 2008-01-15 Alteon Inc. Use of thiazolium compounds for preventing and reversing the formation of advanced glycosylation endproducts
FI119756B (fi) 1995-01-18 2009-03-13 Alteon Inc Tiatsoliumyhdisteiden käyttö pitkälle edenneen glykosylaation lopputuotteiden muodostumisen estossa ja suunnan muutoksessa
US5656261A (en) 1995-01-18 1997-08-12 The Picower Institute For Medical Research Preventing and reversing advanced glycosylation endproducts
US5747035A (en) 1995-04-14 1998-05-05 Genentech, Inc. Polypeptides with increased half-life for use in treating disorders involving the LFA-1 receptor
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
WO1997026913A1 (en) 1996-01-26 1997-07-31 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York A POLYPEPTIDE FROM LUNG EXTRACT WHICH BINDS AMYLOID-β PEPTIDE
AU2696097A (en) 1996-04-16 1997-11-07 Schering Aktiengesellschaft Advanced glycosylation end-product receptor peptides and uses therefor
US5864018A (en) 1996-04-16 1999-01-26 Schering Aktiengesellschaft Antibodies to advanced glycosylation end-product receptor polypeptides and uses therefor
US6555651B2 (en) 1997-10-09 2003-04-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Ligand binding site of rage and uses thereof
US7258857B2 (en) 1996-11-22 2007-08-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Rage-related methods for treating inflammation
US6790443B2 (en) * 1996-11-22 2004-09-14 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for treating symptoms of diabetes
US7081241B1 (en) 1998-10-06 2006-07-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Extracellular rage binding protein (EN-RAGE) and uses thereof
EP1007048A4 (en) 1997-03-11 2004-09-22 Gen Hospital Corp IDENTIFICATION OF AGENTS USEFUL IN THE TREATMENT OF ALZHEIMER'S DISEASE
US6165476A (en) 1997-07-10 2000-12-26 Beth Israel Deaconess Medical Center Fusion proteins with an immunoglobulin hinge region linker
US7101838B2 (en) 1997-08-05 2006-09-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method to prevent accelerated atherosclerosis using (sRAGE) soluble receptor for advanced glycation endproducts
ZA988461B (en) 1997-09-18 1999-03-30 Idec Pharma Corp Synergistic composition and methods for treating neoplastic or cancerous growths and for restoring or boosting hematopoiesis
US6380165B1 (en) 1997-09-19 2002-04-30 The Picower Institute For Medical Research Immunological advanced glycation endproduct crosslink
US6761888B1 (en) 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US6323218B1 (en) 1998-03-11 2001-11-27 The General Hospital Corporation Agents for use in the treatment of Alzheimer's disease
US6465422B1 (en) 1998-04-17 2002-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for inhibiting tumor invasion or spreading in a subject
WO2000018970A1 (fr) 1998-09-29 2000-04-06 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Procede de commande de liberation de granules
US6753150B2 (en) 1998-10-05 2004-06-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for determining whether a compound is capable of inhibiting the interaction of a peptide with rage
CA2346217A1 (en) 1998-10-06 2000-04-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Extracellular novel rage binding protein (en-rage) and uses thereof
US6197294B1 (en) * 1998-10-26 2001-03-06 Neurotech S.A. Cell surface molecule-induced macrophage activation
US6787566B2 (en) 1999-04-05 2004-09-07 City Of Hope Breakers of advanced glycation endproducts
US6589944B1 (en) 1999-04-05 2003-07-08 City Of Hope Breakers of advanced glycation endproducts
US6605642B2 (en) 1999-04-05 2003-08-12 City Of Hope Inhibitors of formation of advanced glycation endproducts (AGES)
US6939545B2 (en) 1999-04-28 2005-09-06 Genetics Institute, Llc Composition and method for treating inflammatory disorders
US6835200B2 (en) 1999-06-22 2004-12-28 Ndo Surgical. Inc. Method and devices for tissue reconfiguration
FR2797402B1 (fr) 1999-07-15 2004-03-12 Biomerieux Stelhys Utilisation d'un polypeptide pour detecter, prevenir ou traiter un etat pathologique associe a une maladie degenerative, neurologique ou autoimmune
JP2003507013A (ja) 1999-08-13 2003-02-25 ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク βシートフィブリルのＲＡＧＥへの結合を阻害する方法及びその結果
WO2001018060A1 (fr) 1999-09-08 2001-03-15 Toray Industries, Inc. Materiaux de circulation extracorporelle, adsorbants de facteurs de complication diabetique, reservoirs servant a eliminer des facteurs de complication diabetique et procede d'elimination de facteurs de complication diabetique
US20050170382A1 (en) 1999-10-06 2005-08-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York. RAGE-related compositions
EP1287162A2 (en) 1999-10-21 2003-03-05 Case Western Reserve University Gene expression profiling of inflammatory bowel disease
CA2382165A1 (en) 1999-12-08 2001-06-14 Genset S.A. Full-length human cdnas encoding potentially secreted proteins
US6727353B2 (en) * 2000-04-14 2004-04-27 Icagen, Inc. Nucleic acid encoding Kv10.1, a voltage-gated potassium channel from human brain
CN1205480C (zh) 2000-04-14 2005-06-08 尼亚戴恩公司 蛋白质高级糖化终产物(蛋白质－age)形成的调节物的鉴定方法
WO2001079849A2 (en) 2000-04-17 2001-10-25 Trans Tech Pharma Protein expression system arrays and use in biological screening
EP1358348A2 (en) 2000-05-09 2003-11-05 Genetics Institute, LLC Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of psoriasis
US6613801B2 (en) 2000-05-30 2003-09-02 Transtech Pharma, Inc. Method for the synthesis of compounds of formula I and their uses thereof
US6908741B1 (en) 2000-05-30 2005-06-21 Transtech Pharma, Inc. Methods to identify compounds that modulate RAGE
AU2001283138A1 (en) * 2000-08-07 2002-02-18 Amberwave Systems Corporation Gate technology for strained surface channel and strained buried channel mosfet devices
US6825164B1 (en) 2000-08-14 2004-11-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method to increase cerebral blood flow in amyloid angiopathy
US6563015B1 (en) 2000-08-14 2003-05-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Transgenic mice over-expressing receptor for advanced glycation endproduct (RAGE) and mutant APP in brain and uses thereof
PL366009A1 (en) 2000-10-02 2005-01-24 Reddy Us Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of inflammatory diseases
AU2002213192A1 (en) 2000-10-13 2002-04-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York A method for inhibiting new tissue growth in blood vessels in a patient subjected to blood vessel injury
US20050244849A1 (en) 2000-12-15 2005-11-03 Genetics Institute, Llc Screening assays for rheumatoid arthritis
EP1368648A2 (en) 2000-12-29 2003-12-10 Reddy US Therapeutics, Inc. Detection of compounds that modulate inflammatory responses
US6946277B2 (en) 2001-01-31 2005-09-20 Council Of Scientific And Industrial Research Method for enhancing cellobiase activity of termitomyces clypeatus using a glycosylation inhibitor
KR20040074587A (ko) 2001-02-19 2004-08-25 메르크 파텐트 게엠베하 감소된 면역원성을 갖는 인공 단백질
DE10109466B4 (de) 2001-02-28 2008-01-10 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren und Mittel zur Modifikation humaner Angiogenese
JP3837494B2 (ja) 2001-03-19 2006-10-25 国立大学法人金沢大学 可溶型ｒａｇｅタンパク質
DE60204669T2 (de) * 2001-03-22 2006-05-04 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw. Verfahren und vorrichtung zur gel-freien qualitativen proteomanalyse und deren verwendungen
US7304034B2 (en) 2001-05-15 2007-12-04 The Feinstein Institute For Medical Research Use of HMGB fragments as anti-inflammatory agents
AU2004236174B2 (en) 2001-10-10 2011-06-02 Novo Nordisk A/S Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
JP2006506442A (ja) 2002-07-09 2006-02-23 ポイント セラピューティクス， インコーポレイテッド ボロプロリン化合物併用療法
EP1575513A4 (en) * 2002-08-16 2007-04-04 Wyeth Corp COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING RAGE-ASSOCIATED DISEASES
US7261893B2 (en) 2002-10-22 2007-08-28 Wyeth Neutralizing antibodies against GDF-8 and uses therefor
US20060241284A1 (en) 2002-12-13 2006-10-26 Juha Kuja-Panula Transmembrane protein amigo and uses thereof
WO2004100890A2 (en) 2003-05-09 2004-11-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Rage g82s-related methods and compositions for treating inflammatory disorders
MXPA05012350A (es) 2003-05-20 2006-05-25 Transtech Pharma Inc Antagonistas rage como agentes para la amiloidosis inversa y enfermedades asociadas con la misma.
WO2005021710A2 (en) 2003-06-02 2005-03-10 University Of Miami Chimeric molecules and methods of use
US8198020B2 (en) 2003-08-22 2012-06-12 Potentia Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing phagocytosis or phagocyte activity
ZA200601810B (en) 2003-09-05 2008-05-28 Univ Columbia Rage-related methods and compositions for treating glomerular injury
US20070167360A1 (en) 2003-10-31 2007-07-19 Yan Shi D Methods for treating multiple sclerosis
WO2005049852A2 (en) 2003-11-17 2005-06-02 University Of Florida Methods and compositions for inducing apoptosis
WO2005051995A2 (en) 2003-11-19 2005-06-09 Curagen Corporation Novel advanced glycosylation end product-specific receptor-like protein and nucleic acids encoding same
GB0330079D0 (en) 2003-12-20 2004-02-04 Bioinvent Int Ab Vaccine
CN100342017C (zh) 2004-05-10 2007-10-10 中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所 基因重组趋化抗原疫苗
ES2306195T3 (es) 2004-07-02 2008-11-01 Creabilis Therapeutics S.P.A. Agentes terapeuticos para el tratamiento de patologias relacionas con hmgb1.
US20060012414A1 (en) * 2004-07-15 2006-01-19 Texas Instruments Incorporated Circuit and method for generating a polyphase clock signal and system incorporating the same
WO2006012373A2 (en) 2004-07-20 2006-02-02 Critical Therapeutics, Inc. Combination therapies of hmgb and complement inhibitors against inflammation
WO2006012415A2 (en) 2004-07-20 2006-02-02 Critical Therapeutics, Inc. Rage protein derivatives
BRPI0514052A (pt) 2004-08-03 2008-05-27 Transtech Pharma Inc proteìnas de fusão rage e métodos de utilização
AU2005271449A1 (en) 2004-08-03 2006-02-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York RAGE fusion proteins and methods of use
CA2581505A1 (en) 2004-09-27 2006-04-06 Centocor, Inc. Srage mimetibody, compositions, methods and uses
US20070087406A1 (en) 2005-05-04 2007-04-19 Pei Jin Isoforms of receptor for advanced glycation end products (RAGE) and methods of identifying and using same
US20080207499A1 (en) 2005-06-29 2008-08-28 Gaetano Barile Rage-related methods for treating and preventing diabetic retinopathy
KR20080105066A (ko) 2006-02-09 2008-12-03 트랜스테크 파르마, 인크. Ｒａｇｅ 융합 단백질 및 이의 사용 방법
KR20090008459A (ko) 2006-05-05 2009-01-21 트랜스테크 파르마, 인크. Ｒａｇｅ 융합 단백질, 제제 및 이의 사용 방법
US8192951B2 (en) 2006-11-03 2012-06-05 Wyeth Llc Glycolysis-inhibiting substances in cell culture
WO2008100470A2 (en) 2007-02-15 2008-08-21 Transtech Pharma, Inc. Rage - immunoglobulin fusion proteins
AU2008265983B2 (en) 2007-06-14 2013-06-20 Galactica Pharmaceuticals, Inc. RAGE fusion proteins

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130059461A (ko) * 2007-06-14 2013-06-05 갈락티카 파마슈티칼스, 인크. Ｒａｇｅ 융합 단백질
WO2015023165A1 (ko) * 2013-08-16 2015-02-19 가톨릭대학교 산학협력단 염증조절복합체 및 ｓｔａｔ３ 신호분자 차단을 통한 면역조절능 최적화된 안정화 중간엽줄기세포

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