CN100342017C

CN100342017C - 基因重组趋化抗原疫苗

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Publication number: CN100342017C
Application number: CNB2004100379103A
Authority: CN
Inventors: 张叔人; 林晨; 孙文欣; 覃汉军; 周春霞; 梁萧; 王冬梅; 马文波; 张雪燕; 付明
Original assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Current assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Priority date: 2004-05-10
Filing date: 2004-05-10
Publication date: 2007-10-10
Anticipated expiration: 2024-05-10
Also published as: EP1748075A4; WO2005108584A1; CA2566299C; PL1748075T3; JP4838238B2; EP1748075B1; EP1748075A1; AU2005240691B2; JP2007535949A; ATE462792T1; RU2006142760A; EP1748075A8; CN1696293A; CA2566299A1; AU2005240691A1; US20090209729A1; DE602005020272D1; HK1102076A1; US8133873B2; RU2396348C2

Abstract

本发明涉及一种重组基因序列，该序列包括人SLC基因，抗原基因和IgG1的Fc片段基因，其中在抗原基因上游连接SLC基因；在抗原基因下游连接IgG1的Fc片段基因。本发明还涉及该重组基因序列在制备基因疫苗和其编码的融合蛋白的多肽疫苗中的应用。

Description

基因重组趋化抗原疫苗

技术领域

本发明涉及一种新的重组基因序列及其表达的融合蛋白，和由该基因制成的疫苗；并通过置换其中的抗原基因形成不同的基因疫苗，或其表达产物作为融合多肽疫苗。

背景技术

人次级淋巴组织趋化性细胞因子(secondary lymphoid tissue chemokine，SLC)自发现以来逐渐受到重视。SLC调节细胞因子的分泌，改变肿瘤微环境的免疫抑制状态，促进Th1的发展，有利于抗肿瘤免疫；SLC具有较强的趋化淋巴细胞和树突状细胞(DC)作用。瘤内注射可诱导肿瘤局部和宿主的抗肿瘤免疫应答；SLC还可调节抑制肿瘤的血管生成；因此，SLC在肿瘤免疫治疗中具有广泛的应用前景。然而，单独使用SLC蛋白或转基因的方法用于抗肿瘤免疫效果不理想。Si-YiChen等人将IgG的Fc片段基因与肿瘤抗原基因重组于逆转录病毒载体上转染DC，免疫小鼠可获得较好的抗肿瘤免疫效应。其原理是DC分泌表达的融合体再被DC通过Fc受体(FcR)捕捉，并通过MHC II类分子递呈给T辅助细胞(Th)以及通过MHC I类分子交叉递呈给细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，进而全面引发抗肿瘤的体液免疫和细胞免疫。Serre K等人报道DC通过FcR介导的内吞比通过胞饮捕获抗原强10,000倍。但是，DC的分离、扩增、转基因等增加了疫苗制备的复杂性，并且只能是因人制备，质量控制较难，不能产业化生产。

发明内容

为了克服现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种新的重组基因序列。

本发明的另一目的在于提供由该重组基因序列表达的融合蛋白；

本发明的再一目的在于提供经过本发明基因序列表达融合蛋白的基因疫苗及其表达的多肽疫苗。

本发明的目的还在于提供一种基因重组肿瘤趋化抗原基因疫苗及其表达的多肽疫苗。

为了完成本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

本发明涉及一种重组基因序列，该序列包括人SLC基因，抗原基因和IgG1的Fc片段基因，其中在抗原基因上游连接SLC基因；在抗原基因下游连接IgG1的Fc片段基因。所述的抗原基因包括：Her2/neu、P53、PSA、PAP、PSM、MAGE1、MAGE2、MAGE3、BAGE、GAGE1、GAGE2、CAG3、RAGE、NY-ESO-1、Tyrosinase、CEA、Igidiotype、gp100、melan A、gp75、TRP-1、TRP-2、CDK4、CASP-8、ras、bcr/abl、MUC-1、以及HCV、HIV病毒和其他致病微生物等相关蛋白基因。在本发明的SLC基因和抗原基因之间具有EcoRI酶切位点和3个甘氨酸，而在抗原基因和IgG1的Fc片段基因之间具有EcoRV酶切位点和5个甘氨酸。

本发明还涉及本发明的重组基因序列在制备基因疫苗中的应用。即一种基因疫苗，其含有本发明所述的基因序列，特别是序列1或者序列12以及其相应的蛋白序列序列2和序列13。

换言之，本发明涉及一种重组基因序列，该序列包括人SLC基因，抗原基因和IgG1的Fc片段基因，(参见图13)在抗原基因上游连接SLC基因，并引入EcoRI酶切位点和3个甘氨酸；在抗原基因下游连接IgG1的Fc片段基因，并引入EcoRV酶切位点和5个甘氨酸。

本发明通过上述的基因中的酶切位点更换不同抗原基因，能够形成各种趋化抗原融合基因。

本发明还具体涉及一种重组基因，该基因具有序列1的核苷酸序列。序列1所述的核苷酸序列是一种人工拼接的SLC-Her2/P53-Fc的基因序列，其中

SLC基因是位于第1～402的核苷酸的位置；而Her2拼接基因是位于418～711个核苷酸的位置；其中重组基因位置418～444为Her2/neu读码框架的1105～1131；重组基因位置445～546为Her2/neu读码框架的244～345(第250位“G”突变为“C”)，重组基因位置547～711为Her2/neu读码框架1333～1497。P53部分基因是位于第712～1113个的位置为p53读码框架475～876。IgG Fc基因(带内含子)是位于第1147～2057个核苷酸的位置，其中内含子位于1189～1309以及1640～1739的位置。第1147～1189个核苷酸的位置是C-region hinge，第1310～1639个核苷酸的位置是CH2，而第1740～2057核苷酸的位置是CH3。Her2/P53上游连接处引入三个甘氨酸和EcoRI酶切位点序列，下游引入五个甘氨酸和EcoRV酶切位点序列。本发明在抗原基因上、下游连接处设有3～5个甘氨酸基因，使表达的上下游因子能正常发挥生物学功能，其产生的效果是防止重组抗原对其空间结构产生干扰。

本发明还具体涉及一种由序列1的核苷酸序列表达的序列2的氨基酸序列，其中序列1，即人工拼接的SLC-Her2/P53-Fc的基因对应的氨基酸序列(612aa、mat589aa)是SLC位于第1～134个氨基酸的位置，甘氨酸x3位于第135～137个氨基酸的位置，而Her2部分多肽位于140～237。其中融合蛋白第140～148为Her2/neu第369～377位的氨基酸；融合蛋白第149～182个氨基酸的位置为Her2/neu第82～115位氨基酸，其中84位“V”突变为“L”)；融合蛋白第183～237个氨基酸的位置为Her2/neu第445～499位氨基酸，P53部分多肽序列位于第238～371(相当于P53的159～292位氨基酸)个氨基酸的位置，而甘氨酸x5位于第374～378个氨基酸的位置；IgG Fc位于第383～612个氨基酸的位置，其中第383～396个氨基酸的位置是C-region hinge，第397～506个氨基酸的位置是CH2，第507～612个氨基酸的位置是CH3。

本发明还具体涉及另一种编码***癌疫苗的重组基因，该基因具有序列12的核苷酸序列。序列12所述的核苷酸序列是一种人工拼接的SLC-PSM-mPAP-PSA-Fc(简称SLC-3P-Fc)的基因序列，其中PSM(人***特异性膜抗原)、mPAP(小鼠***酸性磷酸酶)、PSA(人***特异性抗原)均为部分序列。SLC基因是位于融合基因第1～402的核苷酸的位置；PSM部分基因是位于融合基因第418～603个核苷酸的位置，为PSM读码框架的1987～2172；mPAP基因位于融合基因第604～759为mPAP读码框架的328～484；PSA基因是位于融合基因第760～981为PSA读码框架的151～372；IgG Fc基因(带内含子)是位于第1003～1925个核苷酸的位置。IgG Fc基因是位于第1003～1925个核苷酸的位置；其中内含子位于1057～1177；1508～1607的位置。3P上游连接处引入三个甘氨酸和EcoRI酶切位点序列，下游引入五个甘氨酸和EcoRV酶切位点序列。

本发明还具体涉及由序列12的核苷酸序列表达的序列13的氨基酸序列，即人工拼接的SLC-3P-Fc的基因对应的氨基酸序列(568aa)。SLC位于融合蛋白第1～134个氨基酸的位置，甘氨酸x3位于第135～137个氨基酸的位置，PSM部分多肽位于融合蛋白140～201。mPAP部分多肽位于融合蛋白第202～253；PSA部分多肽位于融合蛋白第254～327个氨基酸的位置；甘氨酸x5位于第374～378个氨基酸的位置；IgG1-Fc位于融合蛋白第335～568个氨基酸的位置。

本发明还涉及含有本发明重组基因序列，包括序列1在制备疫苗中的用途。

由此可见，本发明的趋化抗原策略是：将抗原的上游与趋化因子SLC重组，下游与IgG的Fc重组。此融合的三联基因直接导入健康或肿瘤组织进行分泌表达，通过Fc铰链区形成两联体。该重组蛋白在体内通过SLC的趋化作用，主动吸引DC和T细胞。DC通过胞饮，尤其通过Fc受体和SLC受体CCR7高效捕获融合蛋白，同时将抗原带入胞内；经过加工处理后通过MHC-II类分子递呈或通过MHC-I类分子交叉递呈给Th和CTL，最终全面诱发特异性抗肿瘤细胞免疫和体液免疫反应。此外，Fc段与DC的Fc受体结合可活化DC。而SLC除了可主动趋化DC和T淋巴细胞，还可促进IL-12、IFN-γ、干扰素诱导蛋白(IP-10)等因子分泌，促进Th1的发展，并可下调TGF-β和VEGF的产生，有利于抗肿瘤免疫。所以这种组合具有较好协同作用，产生较强的抗肿瘤免疫效应(见图1)。

在本发明中，非限定性地采用了不同的重组基因，进行对照研究发现这种重组的趋化抗原无论是质粒基因还是制备成融合蛋白均可产业化生产，使用中省去了DC的制备，但在体内对DC具有高效的靶向性。此外，在重组基因序列中抗原基因的两端引入酶切位点，可更换不同的抗原，形成针对各种肿瘤或非瘤的趋化抗原疫苗。重组基因x即用***癌相关抗原置换SLC-HP-Fc中的HP抗原形成新的趋化抗原疫苗。

该重组基因可构建于各种真核表达载体中，采用质粒直接体内或瘤内注射，也可采用基因枪，电脉冲等方法增强导入率和表达效率；也可构建重组病毒，如：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒、疱疹病毒等，作为疫苗直接体内注射。还可以将表达质粒导入CHO等真核细胞，体外培养，进行分泌表达。通过融合蛋白的Fc段采用亲和层析等方法可简单而高效地提取纯化融合蛋白，并作为蛋白疫苗。

附图说明

图1、是本发明趋化抗原基因疫苗作用机制示意图。

图2、构建的表达质粒示意图，其中HP：Her2/neu-p53拼接基因sig：SLC分泌肽基因。

图3、是本发明SLC-Her2/neu-Fc基因重组示意图。

图4、是采用Western Blot检测pSLC-HP-Fc基因疫苗转导细胞的胞内和分泌表达的重组蛋白转染细胞检测，其中A：pSLC-HP-Fc转染细胞裂解物；B：转染细胞培养上清；C：pcDNA转染细胞培养上清。

图5、是预防接种肿瘤趋化抗原核酸疫苗(pSLC-HP-Fc)体内抑瘤效应。

图6、是预防接种肿瘤趋化抗原核酸疫苗(pSLC-HP-Fc)荷瘤鼠的生存期。

图7、是肿瘤趋化抗原核酸疫苗治(pSLC-HP-Fc)疗肿瘤的体内抑瘤效应。

图8、是肿瘤趋化抗原核酸疫苗(pSLC-HP-Fc)***的生存期。

图9、是肿瘤趋化抗原核酸疫苗(pSLC-HP-Fc)免疫后CTL活性。

图10、是动物经免疫后，2周和4周时血清中特异性的抗HP抗体的抗体应检测结果。小鼠血清以1∶100稀释，ELISA法检测。

图11、是pSLC-HP-Fc疫苗体外诱导抗Her2/neu、p53人特异性CTL。

图12、是pSLC-3P-Fc表达质粒构建示意图

图13、是pSLC-3P-Fc核酸疫苗***的体内抑瘤效应。

图14、是pSLC-3P-Fc核酸疫苗***的生存期。

图15、是本发明重组基因表达融合基因的特征结构。

具体实施方式

以下将结合附图详细描述本发明的具体实施方案，涉及的实施例仅仅是说明之目的，而非用于限定本发明的保护范围。

实施例一人SLC基因的克隆

从肿瘤患者***中提取mRNA。采用本领域技术人员公知的方法，将SLC上游引物5’-c ggtaccacagacatggctcagtcac-3’引入Kpn1酶切位点；下游引物5’-t gaattctcctcctcctggccctttagg-3’引入编码三个甘氨酸的序列和EcoR1酶切位点，RT-PCR获取SLC基因，纯化SLC基因***pUCmT测序载体(pUC-SLC)，测序结果，与预计序列完全一致(带下划线部分)。

本发明采用四色荧光末端终止法测序，依据SANGER的双脱氧链终止法。所用测序仪器是ABI公司的377测序仪测序结果：参见序列3，其中序列中36到464位置是本发明的克隆序列。

实施例二Her-2/neu基因的获取和拼接

首先用PCR方法分别调取Her-2/neu基因的两段序列，第一段：上游引物5’-a gaattcaagatctttgggagcctggcatttctgggctacctgctcatcgctca c-3’，引入EcoRI酶切位点；下游引物5’-gatgcccagcccttgcagggccagggcatagttgtc-3’；以neu基因的胞外区质粒为模板，扩增其氨基酸序列的第82-115位对应的基因，其中第103位的V被L取代。第二段：上游引物5’-ctgcaagggctgggcatc-3’；下游引物5’-t ccatggcccggttggcagtgtggag-3’，引入NcoI酶切位点，扩增其氨基酸序列的第445-499位对应的基因。

回收以上两段PCR产物，放于同一PCR体系中经过一次PCR后可拼接为模板，再加入第一段的上游引物与第二段的下游引物进行PCR，扩增出294bp大小的融合基因，***pUCmT载体(pUC-Her2P)，测序结果与预计序列完全一致(带下划线部分)。

测序结果：参见序列4，其中121到465位置是本发明的克隆序列。

实施例三p53部分基因克隆

以全长p53质粒为模板，上游引物5’-acc atg gcc atc tac aag cag tca cag cac atgac-3’，含有一个NcoI酶切位点；下游引物5’-tga tat ctt tct tgc gga gat tct ctt c-3’，引入EcoRV酶切位点。扩增p53的402bp片段，编码p53氨基酸序列的第156-289位，***pUCmT载体(pUC-p53P)，测序结果与预计序列完全一致(带下划线部分)。

测序结果：参见序列5，其中39到445位置是本发明的克隆序列。

实施例四Her2/neu与p53片段的拼接

参见图3，将pUC-Her2P用EcoRI，NcoI酶切的小片段，pUC-p53P用NcoI，EcoRV酶切的小片段，与pcDNA3z用EcoR1和EcoRV酶切的大片段进行连接所获质粒pcDNA-Her2/p53，简称为pcDNA-HP(HP：即为Her2/neu与p53片段拼接基因)。人工拼接的Her2/neu-p53片段基因富含多种HLA-I类分子结合肽基因和少量HLA-II类分子结合肽基因。

实施例五PcDNA-Fc构建

首先人工合成多酶切点置换pcDNA3.1的多酶切点(所获质粒称为pcDNAf)构建过程：人工合成两条寡核苷酸

上游

5’-GCTAGCGAAGCTTTGGTACCGTAGGATCCACGAATTCAGTCCA GGATAT CGGCGGTGG-3’

下游

5’GGTTTAAACGTTAACCCCGGGCCCTCGAGCTCTAGAGCCT CCTCCACCGC CGATATC-3’

3’末端有15个碱基互补。按1∶1混合后，加入Taq DNA聚合酶和dNTP在45℃条件下复性，延伸，纯化后***pUCmT载体测序，测序结果与原设计一致，下划线为人工合成的多酶切点。其形成的酶切位点为“NheI-HindIII-Kpn1-BamH1-EcoR1-EcoRV- Glysine×5-XbaI-Xho1-Apa1-Sma1-Hpa1-Pme1”。其中EcoRV和XbaI之间***编码五个甘氨酸的基因序列(GGCGGTGGAGGAGGC)。将克隆的质粒经NheI、Pme1酶切后取约100bp小片段与经NheI、Pme1酶切的pcDNA3.1大片段连接后形成新载体，并称为pcDNAf。

人工合成多酶切点测序结果：参见序列6，其中3到100位置是本发明的克隆序列。

PcDNA-Fc构建过程

将含有IgG1的Fc片段基因的质粒用XbaI、ApaI内切酶切取Fc基因片段，***同样酶切的pcDNAf载体上，称为PcDNA-Fc，测序证实为IgG1的Fc基因片段。

Fc段基因序列测定：

应用Fc段基因上游引物5’-gaattcggagttaacgagcccaaatcttg-3’和下游引物5’-gggccctcatttacccggagac-3’，含IgG1 Fc基因的质粒为模板PCR扩增的约900bp的片段***pUCmT载体测序，结果为IgG1的铰链区、CH2和CH3区基因(即Fc段基因，见下滑线部分)。测序结果：(为双向测序后拼接的序列)参见序列7，其中78到991位置是本发明的克隆序列。

实施例六SLC-Her2/neu-Fc基因的拼接

参见图3，pcDNA-HP用Kpn1、EcoR1酶切的大片段和pUC-SLC用Kpn1、EcoR1酶切的小片段进行连接(pcDNA-SLC-HP)→再用Kpn1、EcoRV酶切的小片段与pcDNA-Fc用Kpn1和EcoRV酶切的大片段连接为pcDNA-SLC-HP-Fc(简称pSLC-HP-Fc。

构建的对照组质粒示意图见图2。

实施例七Western Blot检测基因疫苗转导细胞的胞内和分泌表达的重组蛋白

重组质粒pSLC-HP-Fc用脂质体方法转染B16-F10细胞，并用G418筛选出抗G418阳性转染克隆，收集培养上清(收集前用无血清1640培养24小时，收集后进行浓缩)，Western Blot法分析融合蛋白的表达。一抗采用兔抗人p53多克隆抗体，二抗是HRP标记的山羊抗兔抗体，用ECL-Plus chemiluminescent detection kit检测(Amersham Pharmacia Biotech.)。最后压片，放射自显影于X光片上。结果显示：pSLC-HP-Fc转染的B16-F10细胞培养上清和细胞裂解液，可测出融合蛋白的表达，分子量与预计大小完全一致(参见图4)。经证明得到的融合蛋白为序列2的氨基酸。

实施例八人PSM(***特异性膜抗原)基因克隆

从人***癌细胞LNCaP提取总RNA，上游引物为5’-ACTCGAGATGAAGACATACAGTGTATC-3’，下游引物为5’-TGATATCTTAGGCTACTTCACTCAAAG-3’行RT-PCR，电泳、切取hPSM 390bp条带，经玻璃奶法纯化回收目的片段，并与pUCm-T载体连接成pUCm-hPSM，挑取阳性克隆测序，测序结果正确。详见序列8，所获基因相当于人PSM读码框架的1864～2253。该序列中229到618的位置是本发明克隆序列。

实施例九人PSA(***特异性抗原)基因克隆

从人***癌细胞LNCaP提取总RNA，上游引物为5’-TCTCGAGGGCGGTGTTCTGGTGCA-3’，下游引物为 5’-AGATATCATGTCCAGCGTCCAGCAC-3’行RT-PCR，琼脂糖电泳、切取约600bp条带经玻璃奶法纯化回收目的片段，并与pUCm-T载体连接成pUCm-PSA，挑取阳性克隆测序，测序结果正确。详见序列9，所获基因相当于人PSA读码框架的151～609。该序列中45到503的位置是本发明克隆序列。

实施例十小鼠PAP(***特异性抗原，mPAP)基因克隆

从小鼠***组织中提取总RNA，以5’-TCTAGATGAGAGCTGTTCCTC

TG-3’作上游引物，5’-GGGCCCTTAATTCCGTCCTTGGTG-3’作下游引物进行RT-PCR，电泳、切取mPAP 1146bp条带，经玻璃奶法纯化回收目的片段，并与pUCm-T载体连接成pUCm-mPAP，挑取阳性克隆测序，测序结果见序列10。该序列中48到1193的位置是本发明克隆序列。

实施例十一PSM、mPAP和PSA部分基因的拼接(3P)

以5’-AGAATTCATGATGAATGATCAACTCATG-3’(为hPSM读码框架的1987-2007，并引入EcoRI酶切位点)为上游引物、5’- AGCACTCATCAAAGT CCTGGCCTTGGAAGGG TCCAC-3’(下滑线部分为mPAP读码框架的328-345，其余部分为hPSM读码框架的2155-2172) 为下游引物、pUCm-hPSM为模板行PCR，电泳后切取hPSM目的条带用玻璃奶纯化回收备用；以5’-AGGACTTTGATGAGTGCTATG-3’(为mPAP读码框架的328～348)为上游引物、5’-AGGGCAGTCTCTGAAAGGCAG-3’(为mPAP读码框架的463～483)为下游引物、pUCm-hPMP为模板行PCR，电泳、切取hPMP目的条带用玻璃奶纯化回收备用；以S2- CCTTTCAGAGACTGCCCTGGCGGTGTTCTGGTGCAC-3’(下滑线部分为mPAP读码框架的466～483，其余为hPSA读码框架的151～168)为上游引物、5’-AGATATCGAGCAGCATGAGGTCGT-3’G为下游引物、pUCm-hPSA为模板行PCR，电泳、切取hPSA目的条带用玻璃奶纯化回收备用。

分别以hPSM为模板5’-AGAATTCATGATGAATGATCAACTCATG-3’(同前)为引物、PAP为模板5’-AGGGCAGTCTCTGAAAGGCAG-3’(同前)为引物在25μl体系进行10个循环单向PCR。然后，将两者产物合并在50μl体系中进行18个循环的PCR，电泳，切取hPSM-mPAP 352bp目的条带用玻璃奶纯化回收备用。

以mPAP为模板5’-AGGACTTTGATGAGTGCTATG(为mPAP读码框架的328-348)为引物，hPSA为模板5’-AGATATCGAGCAGCATGAGGTCGTG-3’(为PSA读码框架的355-372)为引物在25μl体系进行10个循环单向PCR；再将两者产物合并在50μl体系中进行18个循环的PCR；电泳、切取mPAP-hPSA 378bp目的条带用玻璃奶纯化回收备用。

分别以hPSM-mPAP为模板5’-AGAATTCATGATGAATGATCAACTCA TG-3’为引物、mPAP-hPSA为模板5’-AGATATCGAGCAGCATGA GGTCGTG-3’为引物在25μl体系进行10个循环单向PCR；再将两者产物合并在50μl体系中进行18个循环的PCR；电泳、切取hPSM-mPAP-hPSA 564bp目的条带用玻璃奶纯化回收并与pUCm-TV连接，挑取阳性克隆双向测序，测序结果正确。详见序列11，为双向测序拼接结果。该序列中54到629的位置是本发明克隆序列。

实施例十二SLC-3P-Fc趋化抗原基因重组

将序列测定后的3P基因(3P：PSM-PAP-PSA部分拼接基因，564bp，编码188个氨基酸)正确的质粒用EcoRI和EcoRV切取3P基因小片段，与同样酶切的pSLC-HP-Fc的大片段载体连接，形成pSLC-3P-Fc(见图12)。SLC-3P-Fc基因重组序列见序列12，其对应的氨基酸序列见序列13。

实验例一趋化小室检测融合蛋白趋化免疫细胞的活性人SLC的体外趋化活性：

A.将质粒pcDNA3z-SLC-HP-Fc及其对照质粒转染B16-F10黑色素瘤细胞，48小时后收集细胞培养上清(未转染的细胞培养上清作为阴性对照)，PEG20000浓缩待用。

B.抽取健康人外周血5ml，稀释后用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，生理盐水洗两遍，无血清1640培养液重悬细胞，台盼蓝记数，调细胞浓度为1×10⁶/ml，待用。

C.趋化小室准备：趋化小室购自Neuro Probe，在下层小室中加入27μl的细胞上清浓缩液，每个设三复孔。孔上覆以5μm孔径多聚碳酸酯膜，装好上层小室，在各小室中加入50μl浓度为1×10⁶/ml的人外周血单个核细胞悬液，然后，将小室置于37℃，5％CO₂孵箱中作用4小时。

D.取下膜，用细胞刮子仔细刮下上层小室面的细胞，经固定，染色，于显微镜下计数迁移至膜下层的细胞数，计算趋化指数(CI＝实验孔5个高倍视野的细胞数/对照孔5个高倍视野的细胞数)。阴性对照组CI值为1。高倍视野为200×

表1.融合蛋白的体外趋化活性测定

组别	趋化细胞数	趋化指数CI	P值
组别	趋化细胞数	趋化指数CI	P值	阴性对照空载体psig-HPpSLC-HP-FcpSLC	34±10.444.6±11.968.6±9.5157.4±19.2156.6±20.3	11.312.024.634.61	＞0.05^＜0.05^＜0.01^＜0.05^＜0.01^＜0.05^**

^*与阴性对照相比。^**与psig-HP相比。

【结果】：pSLC-HP-Fc转导细胞的无血清培养上清具有明显的趋化活性，表明该质粒的导入不仅表达且有活性。其水平与单纯pSLC转导细胞产生的趋化活性一致，说明融合蛋白对SLC活性无影响。

实验例二人趋化抗原核酸疫苗在小鼠体内抗肿瘤的免疫效应

基因导入方法采用将质粒(裸基因)挂载到金粉颗粒上，并附着在塑料管内壁上切割成适宜大小，作为基因***备用。每发子弹约含有1μg DNA。详细方法见BioRad公司说明书。实验中设有对照组：空载体，pSLC-Fc、含有SLC前导肽的HP表达质粒psig-HP、pSLC-HP和psig-HP-Fc。

实验例三预防肿瘤免疫实验

pSLC-HP-Fc及其对照组于肿瘤接种前14和7天基因枪腹部分别免疫动物二次。第0天小鼠腋下接种B16F10-HP瘤细胞 (B16F10黑色素瘤细胞转入HP基因，并经过G418加压筛选)5×10⁴/0.2ml/只，以后每周两到三次测量肿瘤大小，按公式：长(cm)×宽(cm²)计算肿瘤大小。

【结果】：pSLC-HP-Fc三联疫苗仅免疫两次即显示了显著的抑瘤效果(参见图5、6)，平均生存期明显延长，与任何一种两联疫苗相比都有显著差异(P＜0.05)。说明SLC和Fc有协同免疫增强效果。

实验例四***免疫实验

第0天动物腋下接种5×10⁴/0.2ml/只的B16F10-HP瘤细胞，第6，12，18天基因枪免疫三次，以后每周两到三次测量肿瘤大小，计算方法同上。

【结果】：参见图7、8，三联pSLC-HP-Fc疫苗的抑瘤效果最为显著，并且在第28天，pSLC-HP-Fc组与两联psig-HP-Fc组相比也有显著差异(P＜0.05)；平均生存期也显著延长。B16(pSLC-HP-Fc)组的小鼠接种的为野生型B16，经过三次SLC-HP-Fc免疫后，无抑瘤效果，说明该疫苗诱导的是针对HP抗原的特异性免疫反应。

实验例五肿瘤趋化抗原核酸疫苗诱导的CTL活性

荷瘤鼠经三次基因枪免疫2周后，处死动物，取脾细胞做CTL细胞毒性活性测定，采用Promega公司LDH检测试剂盒，将脾细胞与靶细胞B16F10-HP以不同效靶比(40∶1，20∶1，10∶1)进行细胞毒测定。

【结果】：经趋化抗原核酸疫苗免疫后的淋巴细胞对B16F10-HP产生显著的杀伤作用(参见图9)。在E∶T比值为40∶1和20∶1时，三联与两联疫苗相比仍有显著差异(P＜0.05)。说明三联疫苗可以诱导更强的CTL活性。

实验例六免疫后血清中抗体滴度的检测

动物经基因枪免疫(pSLC-HP-Fc)后，在2周和4周时取血清检测抗体反应(ELISA法)。重组p53蛋白包被酶标板过夜，20％牛血清封闭，依次加入一抗(不同稀释度的小鼠血清)，二抗(羊抗小鼠IgG/辣根酶标记)，中间洗涤，OPD(邻苯二胺)显色，490nm测OD值。P53单克隆抗体作为阳性对照，正常小鼠血清作为阴性对照。

【结果】：SLC-HP-Fc疫苗免疫小鼠抗p53抗体效价最高，显著优于两联疫苗(参见图10)。

实验例七pSLC-HP-Fc疫苗体外诱导抗Her2/neu、p53人特异性CTL

取HLA-A2⁺健康人血，淋巴细胞分离液密度梯度分离单个核细胞(MNC)。部分细胞用脂质体法将pSLC-HP-Fc质粒导入，再与未处理的MNC按1∶1混合培养，37℃，5％CO₂条件下培养。第6天计数活细胞用培养液重新混悬，按不同效应细胞：靶细胞比例加入96孔培养板与不同靶细胞混合培养。细胞毒测定采用LDH法(Promega试剂盒)。

【结果】：导入pSLC-HP-Fc质粒的MNC，自身混合淋巴细胞培养后，诱导的CTL特异性杀伤Her2/neu高表达或p53堆积的肿瘤细胞，并且受MHC限制(图11)。即只对HLA-A2⁺的并且Her2/neu高表达或p53堆积的肿瘤细胞产生显著的杀伤效应。说明趋化抗原基因疫苗可诱导人肿瘤抗原特异性CTL。

实验例八***癌pSLC-3P-Fc趋化抗原基因疫苗小鼠体内抗肿瘤效应

5×10⁴B16-3P肿瘤细胞(pcDNA-3P表达质粒转染的B16细胞，G418筛选)，接种C57BL/6小鼠侧腹壁(每组八只小鼠)、肿瘤接种后第3天、第8天、第13天基因枪免疫三次，设了空载体、pSLC-Fc、psig-3P(3P基因前端含有SLC分泌肽基因的表达质粒)为对照组。观察肿瘤大小和小鼠的生存期。

【结果】：参见图13、14，三联趋化抗原基因疫苗(pSLC-3P-Fc)组肿瘤生长明显受到抑制(与各种对照组相比P＜0.05)，并显著地延长了生存期(P＜0.05)，说明该趋化抗原疫苗结构中间更换抗原基因即可产生针对不同靶抗原的疫苗。

序列表

<110>中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所

<120>基因重组趋化抗原疫苗

<130>CGCNC41111

<160>13

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2060

<212>DNA

<213>人

<400>1

atggctcagt cactggctct gagcctcctt atcctggttc tggcctttgg catccccagg 60

acccaaggca gtgatggagg ggctcaggac tgttgcctca agtacagcca aaggaagatt 120

cccgccaagg ttgtccgcag ctaccggaag caggaaccaa gcttaggctg ctccatccca 180

gctatcctgt tcttgccccg caagcgctct caggcagagc tatgtgcaga cccaaaggag 240

ctctgggtgc agcagctgat gcagcatctg gacaagacac catccccaca gaaaccagcc 300

cagggctgca ggaaggacag gggggcctcc aagactggca agaaaggaaa gggctccaaa 360

ggctgcaaga ggactgagcg gtcacagacc cctaaagggc caggaggagg agaattcaag 420

atctttggga gcctggcatt tctgggctac ctgctcatcg ctcacaacca agtgaggcag 480

gtcccactgc agaggctgcg gattgtgcga ggcacccagc tctttgagga caactatgcc 540

ctggccctgc aagggctggg catcagctgg ctggggctgc gctcactgag ggaactgggc 600

agtggactgg ccctcatcca ccataacacc cacctctgct tcgtgcacac ggtgccctgg 660

gaccagctct ttcggaaccc gcaccaagct ctgctccaca ctgccaaccg ggccatggcc 720

atctacaagc agtcacagca catgacggag gttgtgaggc gctgccccca ccatgagcgc 780

tgctcagata gcgatggtct ggcccctcct cagcatctta tccgagtgga aggaaatttg 840

cgtgtggagt atttggatga cagaaacact tttcgacata gtgtggtggt gccctatgag 900

ccgcctgagg ttggctctga ctgtaccacc atccactaca actacatgtg taacagttcc 960

tgcatgggcg gcatgaaccg gaggcccatc ctcaccatca tcacactgga agactccagt 1020

ggtaatctac tgggacggaa cagctttgag gtgcgtgttt gtgcctgtcc tgggagagac 1080

cggcgCacag aggaagagaa tctccgcaag aaagatatcg gcggtggagg aggctctaga 1140

gtcgacgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc aggtaagcca 1200

gcccaggcct cgccctccag ctcaaggcgg gacaggtgcc ctagagtagc ctgcatccag 1260

ggacaggccc cagccgggtg ctgacacgtc cacctccatc tcttcctcag cacctgaact 1320

cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc 1380

ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa 1440

gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga 1500

gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct 1560

gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa 1620

aaccatctcc aaagccaaag gtgggacccg tggggtgcga gggccacatg gacagaggcc 1680

ggctcggccc accctctgcc ctgagagtga ccgctgtacc aacctctgtc cctacagggc 1740

agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc 1800

aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg 1860

agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg 1920

gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg 1980

tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct 2040

ccctgtctcc gggtaaatga 2060

<210>2

<211>612

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Ala Gln Ser Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Ala Phe

1 5 10 15

Gly Ile Pro Arg Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys

20 25 30

Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr

35 40 45

Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe

50 55 60

Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu

65 70 75 80

Leu Trp Val Gln Gln Leu Met Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro

85 90 95

Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr

100 105 110

Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser

115 120 125

Gln Thr Pro Lys Gly Pro Gly Gly Gly Glu Phe Lys Ile Phe Gly Ser

130 135 140

Leu Ala Phe Leu Gly Tyr Leu Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln

145 150 155 160

Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu

165 170 175

Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly

180 185 190

Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His

195 200 205

Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe

210 215 220

Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Ala Met Ala

225 230 235 240

Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro

245 250 255

His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His

260 265 270

Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg

275 280 285

Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val

290 295 300

Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser

305 310 315 320

Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu

325 330 335

Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg

340 345 350

Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu

355 360 365

Arg Lys Lys Asp Ile Gly Gly Gly Gly Gly Ser Arg Val Asp Glu Pro

370 375 380

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Ala Pro Glu Leu

385 390 395 400

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

405 410 415

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

420 425 430

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

435 440 445

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

450 455 460

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

465 470 475 480

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

485 490 495

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gln Pro Arg Glu Pro Gln

500 505 510

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

515 520 525

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

530 535 540

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

545 550 555 560

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

565 570 575

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

580 585 590

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

595 600 605

Ser Pro Gly Lys

610

<210>3

<211>512

<212>DNA

<213>人

<400>3

atatcccatg ggcggccgcc tgcagaccag gtctcggtac cacagacatg gctcagtcac 60

tggctctgag cctccttatc ctggttctgg cctttggcat ccccaggacc caaggcagtg 120

atggaggggc tcaggactgt tgcctcaagt acagccaaag gaagattccc gccaaggttg 180

tccgcagcta ccggaagcag gaaccaagct taggctgctc catcccagct atcctgttct 240

tgccccgcaa gcgctctcag gcagagctat gtgcagaccc aaaggagctc tgggtgcagc 300

agctgatgca gcatctggac aagacaccat ccccacagaa accagcccag ggctgcagga 360

aggacagggg ggcctccaag actggcaaga aaggaaaggg ctccaaaggc tgcaagagga 420

ctgagcggtc acagacccct aaagggccag gaggaggaga attcaaagac tggagatctg 480

gatccctcga gtctagagtc gacctgcagg ca 512

<210>4

<211>498

<212>DNA

<213>人

<400>4

gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg 60

ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac 120

gaattcgagc tcggtacccg gggatcctct agagattaga attcaagatc tttgggagcc 180

tggcatttct gggctacctg ctcatcgctc acaaccaagt gaggcaggtc ccactgcaga 240

ggctgcggat tgtgcgaggc acccagctct ttgaggacaa ctatgccctg gctctgcaag 300

ggctgggcat cagctggctg gggctgcgct cactgaggga actgggcagt ggactggccc 360

tcatccacca taacacccac ctctgcttcg tgcacacggt gccctgggac cagctctttc 420

ggaacccgca ccaagctctg ctccacactg ccaaccgggc catggaaatc gtcgacctgc 480

aggcatgcaa gcttggca 498

<210>5

<211>721

<212>DNA

<213>人

<400>5

gccagtgcca agcttgcatg cctgcaggtc gacgattacc atggccatct acaagcagtc 60

acagcacatg acggaggttg tgaggcgctg cccccaccat gagcgctgct cagatagcga 120

tggtctggcc cctcctcagc atcttatccg agtggaagga aatttgcgtg tggagtattt 180

ggatgacaga aacacttttc gacatagtgt ggtggtgccc tatgagccgc ctgaggttgg 240

ctctgactgt accaccatcc actacaacta catgtgtaac agttcctgca tgggcggcat 300

gaaccggagg cccatcctca ccatcatcac actggaagac tccagtggta atctactggg 360

acggaacagc tttgaggtgc gtgtttgtgc ctgtcctggg agagaccggc gcacagagga 420

agagaatctc cgcaagaaag atatcaaatc tctagaggat ccccgggtac cgagctcgaa 480

ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca 540

caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact 600

cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg 660

cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct 720

t 721

<210>6

<211>335

<212>DNA

<213>人

<400>6

tggctagcga agctttggta ccgtaggatc cacgaattca gtccaggata tcggcggtgg 60

aggaggctct agagctcgag ggcccggggt taacgtttaa acccgctgat cagcctcgac 120

tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 180

ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 240

gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg 300

ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgg 335

<210>7

<211>1077

<212>DNA

<213>人

<400>7

tatgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac tctagactcg agggatccag atctccagtc 60

ttgaattcgg agttaacgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc 120

caggtaagcc agcccaggcc tcgccctcca gctcaaggcg ggacaggtgc cctagagtag 180

cctgcatcca gggacaggcc ccagccgggt gctgacacgt ccacctccat ctcttcctca 240

gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 300

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 360

cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 420

ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 480

caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 540

cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa ggtgggaccc gtggggtgcg agggccacat 600

ggacagaggc cggctcggcc caccctctgc cctgagagtg accgctgtac caacctctgt 660

ccctacaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct 720

gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc 780

cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct 840

ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca 900

gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca 960

gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg agggcccaga cctggtctgc aggcggccgc 1020

ccatgggata tcatcgatca tatgtcgccc tatagtgagt cgtattacgg taccgag 1077

<210>8

<211>651

<212>DNA

<213>人

<400>8

tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat 60

taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc 120

ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagct tgcatgcctg 180

caggtcgact ctagactcga gggatccaga tctccagtct tactcgagat gaagacatac 240

agtgtatcat ttgattcact tttttctgca gtaaagaatt ttacagaaat tgcttccaag 300

ttcagtgaga gactccagga ctttgacaaa agcaacccaa tagtattaag aatgatgaat 360

gatcaactca tgtttctgga aagagcattt attgatccat tagggttacc agacaggcct 420

ttttataggc atgtcatcta tgctccaagc agccacaaca agtatgcagg ggagtcattc 480

ccaggaattt atgatgctct gtttgatatt gaaagcaaag tggacccttc caaggcctgg 540

ggagaagtga agagacagat ttatgttgca gccttcacag tgcaggcagc tgcagagact 600

ttgagtgaag tagcctaaga tatcaagacc tgatctgcag gcggccgccc a 651

<210>9

<211>643

<212>DNA

<213>人

<400>9

atgatatccc atgggcggcc gcctgcagac caggtcttct cgagggcggt gttctggtgc 60

acccccagtg ggtcctcaca gctgcccact gcatcaggaa caaaagcgtg atcttgctgg 120

gtcggcacag cctgtttcat cctgaagaca caggccaggt atttcaggtc agccacagct 180

tcccacaccc gctctacgat atgagcctcc tgaagaatcg attcctcagg ccaggtgatg 240

actccagcca cgacctcatg ctgctccgcc tgtcagagcc tgccgagctc acggatgctg 300

tgaaggtcat ggacctgccc acccaggagc cagcactggg gaccacctgc tacgcctcag 360

gctggggcag cattgaacca gaggagttct tgaccccaaa gaaacttcag tgtgtggacc 420

tccatgttat ttccaatgac gtgtgtgcgc aagttcaccc tcagaaggtg accaagttca 480

tgctgtgtgc tggacgctgg acatgatatc taagactgga gatctggatc cctcgagtct 540

agagtcgacc tgcaggcatg caagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg 600

aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgaacc cgg 643

<210>10

<211>1257

<212>DNA

<213>小鼠

<400>10

gatcgatgat atcccatggg cggccgcctg cagaccaggt cttctagatg agagctgttc 60

ctctgcccct gagcccgaca gcaagcctca gccttggctt cttgctcctg ctttctctct 120

gcctggaccc aggccaagcc aaggagttga agtttgtgac attggtgttt cgacatggag 180

accgaggtcc catcgagacc tttcctaccg accccattac ggaatcctcg tggccacaag 240

gatttggcca actcacccag tggggcatgg aacagcacta cgaacttgga agttatataa 300

ggaaaagata cggaagattc ttgaacgaca cctataagca tgatcagatt tatatccgga 360

gcacagatgt ggacaggact ttgatgagtg ctatgacaaa ccttgcagcc ctgtttcctc 420

cagaggggat cagcatctgg aatcctagac tgctctggca gcccatccca gtgcacaccg 480

tgtctctctc tgaggatcgg ttgctgtacc tgcctttcag agactgccct cgttttgaag 540

aactcaagag tgagacttta gaatctgagg aattcttgaa gaggcttcat ccatataaaa 600

gcttcctgga caccttgtcg tcgctgtcgg gattcgatga ccaggatctt tttggaatct 660

ggagtaaagt ttatgaccct ttattctgcg agagtgttca caatttcacc ttgccctcct 720

gggccaccga ggacgccatg attaagttga gagagctatc agaattatct ctgctatcac 780

tttatggaat tcacaagcag aaagagaaat ctcgactcca agggggcgtc ctggtcaatg 840

aaatcctcaa gaatatgaag cttgcaactc agccacagaa gtataaaaag ctggtcatgt 900

attccgcaca cgacactacc gtgagtggcc tgcagatggc gctagatgtt tataatggag 960

ttctgcctcc ctacgcttct tgccacatga tggaattgta ccatgataag ggggggcact 1020

ttgtggagat gtactatcgg aatgagaccc agaacgagcc ctacccactc acgctgccag 1080

gctgcaccca cagctgccct ctggagaagt ttgcggagct actggacccg gtgatctccc 1140

aggactgggc cacggagtgt atggccacaa gcagccacca aggacggaat taagggccca 1200

agactggaga tctggatccc tcgagtctag agtcgacctg caggcatgca agcttgg 1257

<210>11

<211>652

<212>DNA

<213>人和小鼠

<400>11

cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagactc gagggatcca gatctccagt ctagaattca 60

tgatgaatga tcaactcatg tttctggaaa gagcatttat tgatccatta gggttaccag 120

acaggccttt ttataggcat gtcatctatg ctccaagcag ccacaacaag tatgcagggg 180

agtcattccc aggaatttat gatgctctgt ttgatattga aagcaaagtg gacccttcca 240

aggccaggac tttgatgagt gctatgacaa accttgcagc cctgtttcct ccagagggga 300

tcagcatctg gaatcctaga ctgctctggc agcccatccc agtgcacacc gtgtctctct 360

ctgaggatcg gttgctgtac ctgcctttca gagactgccc tggcggtgtt ctggtgcacc 420

cccagtgggt cctcacagct gcccactgca tcaggaacaa aagcgtgatc ttgctgggtc 480

ggcacagcct gtttcatcct gaagacacag gccaggtatt tcaggtcagc cacagcttcc 540

cacacccgct ctacgatatg agcctcctga agaatcgatt cctcaggcca ggtgatgact 600

ccagccacga cctcatgctg ctcgatatct aaacctggtc tgcaggcggc cg 652

<210>12

<211>1928

<212>DNA

<213>人和小鼠

<400>12

atggctcagt cactggctct gagcctcctt atcctggttc tggcctttgg catccccagg 60

acccaaggca gtgatggagg ggctcaggac tgttgcctca agtacagcca aaggaagatt 120

cccgccaagg ttgtccgcag ctaccggaag caggaaccaa gcttaggctg ctccatccca 180

gctatcctgt tcttgccccg caagcgctct caggcagagc tatgtgcaga cccaaaggag 240

ctctgggtgc agcagctgat gcagcatctg gacaagacac catccccaca gaaaccagcc 300

cagggctgca ggaaggacag gggggcctcc aagactggca agaaaggaaa gggctccaaa 360

ggctgcaaga ggactgagcg gtcacagacc cctaaagggc caggaggagg agaattcatg 420

atgaatgatc aactcatgtt tctggaaaga gcatttattg atccattagg gttaccagac 480

aggccttttt ataggcatgt catctatgct ccaagcagcc acaacaagta tgcaggggag 540

tcattcccag gaatttatga tgctctgttt gatattgaaa gcaaagtgga cccttccaag 600

gccaggactt tgatgagtgc tatgacaaac cttgcagccc tgtttcctcc agaggggatc 660

agcatctgga atcctagact gctctggcag cccatcccag tgcacaccgt gtctctctct 720

gaggatcggt tgctgtacct gcctttcaga gactgccctg gcggtgttct ggtgcacccc 780

cagtgggtcc tcacagctgc ccactgcatc aggaacaaaa gcgtgatctt gctgggtcgg 840

cacagcctgt ttcatcctga agacacaggc caggtatttc aggtcagcca cagcttccca 900

cacccgctct acgatatgag cctcctgaag aatcgattcc tcaggccagg tgatgactcc 960

agccacgacc tcatgctgct cgatatcggc ggtggaggag gctctagagt cgacgagccc 1020

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag gtaagccagc ccaggcctcg 1080

ccctccagct caaggcggga caggtgccct agagtagcct gcatccaggg acaggcccca 1140

gccgggtgct gacacgtcca cctccatctc ttcctcagca cctgaactcc tggggggacc 1200

gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga 1260

ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta 1320

cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag 1380

cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga 1440

gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa 1500

agccaaaggt gggacccgtg gggtgcgagg gccacatgga cagaggccgg ctcggcccac 1560

cctctgccct gagagtgacc gctgtaccaa cctctgtccc tacagggcag ccccgagaac 1620

cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga 1680

cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc 1740

agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc 1800

tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct 1860

ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg 1920

gtaaatga 1928

<210>13

<211>568

<212>PRT

<213>人和小鼠

<400>13

Met Ala Gln Ser Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Ala Phe

1 5 10 15

Gly Ile Pro Arg Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys

20 25 30

Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr

35 40 45

Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe

50 55 60

Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu

65 70 75 80

Leu Trp Val Gln Gln Leu Met Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro

85 90 95

Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr

100 105 110

Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser

115 120 125

Gln Thr Pro Lys Gly Pro Gly Gly Gly Glu Phe Met Met Asn Asp Gln

130 135 140

Leu Met Phe Leu Glu Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp

145 150 155 160

Arg Pro Phe Tyr Arg His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Gly Glu Ser Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile

180 185 190

Glu Ser Lys Val Asp Pro Ser Lys Ala Arg Thr Leu Met Ser Ala Met

195 200 205

Thr Asn Leu Ala Ala Leu Phe Pro Pro Glu Gly Ile Ser Ile Trp Asn

210 215 220

Pro Arg Leu Leu Trp Gln Pro Ile Pro Val His Thr Val Ser Leu Ser

225 230 235 240

Glu Asp Arg Leu Leu Tyr Leu Pro Phe Arg Asp Cys Pro Gly Gly Val

245 250 255

Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Arg Asn

260 265 270

Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Phe His Pro Glu Asp

275 280 285

Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr

290 295 300

Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg Pro Gly Asp Asp Ser

305 310 315 320

Ser His Asp Leu Met Leu Leu Asp Ile Gly Gly Gly Gly Gly Ser Arg

325 330 335

Val Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

340 345 350

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

355 360 365

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

370 375 380

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

385 390 395 400

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

405 410 415

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

420 425 430

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gln Pro

450 455 460

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

465 470 475 480

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

485 490 495

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

500 505 510

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

515 520 525

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

530 535 540

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

545 550 555 560

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

565

Claims

1.一种重组基因序列，该序列包括人SLC基因，抗原基因和IgG1的Fc片段基因，其中在抗原基因上游连接SLC基因；在抗原基因下游连接IgG1的Fc片段基因。

2.根据权利要求1所述的重组基因序列，其中所述的抗原基因包括：Her2/neu、P53、PSA、PAP、PSM、MAGE1、MAGE2、MAGE3、BAGE、GAGE1、GAGE2、CAG3、RAGE、NY-ESO-1、Tyrosinase、CEA、Ig idiotype、gp100、melan A、gp75、TRP-1、TRP-2、CDK4、CASP-8、ras、bcr/abl、MUC-1、HCV、HIV病毒和致病微生物相关蛋白基因的一个或多个。

3.根据权利要求1或2所述的重组基因序列，其中在SLC基因和抗原基因之间具有EcoRI酶切位点和3个甘氨酸，而在抗原基因和IgG1的Fc片段基因之间具有EcoRV酶切位点和5个甘氨酸。

4.根据权利要求1所述的重组基因序列，其特征在于该序列是序列1。

5.根据权利要求1所述的重组基因序列，其特征在于该序列是序列12。

6.根据权利要求1所述的重组基因序列表达的氨基酸序列。

7.一种由权利要求4所述的序列1表达的氨基酸序列，其特征在于该序列是序列2。

8.一种由权利要求5所述的序列12表达的氨基酸序列，其特征在于该序列是序列13。

9.一种基因疫苗，其特征在于含有如权利要求1所述的重组基因序列。

10.如权利要求9所述的基因疫苗，其特征在于所述的基因序列是序列1或者序列12。

11.一种多肽疫苗，其特征在于含有由权利要求1所述的重组基因序列表达的氨基酸序列。

12.如权利要求11所述的多肽疫苗，其特征在于所述的氨基酸序列是序列2或序列13。