CN1168822C - 不动杆菌及采用该菌种拆分制备手性环戊烯酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种不动杆菌CGMCC0789及采用该菌种拆分制备手性环戊烯酮的方法。本发明的方法包括以含有酯酶活性的微生物细胞或者由其分离的酯酶为催化剂，以外消旋醇酮的脂肪酸酯为原料进行转化反应，得到(R)-醇酮和(S)-醇酮脂肪酸酯的混合物。然后对其进行磺酰化和碱水解，再从水解产物中收集最终的产物(S)-醇酮单一对映体。本发明工艺过程比较简单，反应条件比较温和；所用菌种(含胞内酯酶)的催化活性和立体选择性较高，所获得的(S)-醇酮光学纯度可达90%以上。该方法具有简单实用、成本低廉的优点，可望在工业生产上推广应用。

Description

不动杆菌及采用该菌种拆分制备手性环戊烯酮的方法

技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及一种不动杆菌以及采用该微生物催化拆分制备手性化合物对映异构体的方法，特别涉及拆分制备环戊烯酮型手性醇对映体的方法。

背景技术

环戊烯酮型手性醇类化合物是生产拟除虫菊酯杀虫剂的重要中间体，本发明所涉及的环戊烯酮型醇类化合物的基本骨架为：4-羟基-3-甲基-环戊-2-烯-1-酮，主要包括两个品种，化学结构式如下：

其中：式(I)为2-烯丙基-3-甲基-4-羟基环戊-2-烯-1-酮，以下简称烯丙醇酮；式(II)为2-炔丙基-3-甲基-4-羟基环戊-2-烯-1-酮，以下简称炔丙醇酮；二者可总称“醇酮”。根据立体化学构型的不同，每一种醇酮又可分为R-和S-两种对映异构体。

除虫菊酯及拟除虫菊酯是一类多功能的家用或农用杀虫剂。天然的除虫菊酯来源于菊花的花蕊，它在阳光和空气中极不稳定；现在所用的杀虫剂一般为人工合成的拟除虫菊酯，有很多品种，如丙炔菊酯、丙烯菊酯、甲基丙炔菊酯、甲氰菊酯、氯菊酯、溴氰菊酯、氟氯氰菊酯等。(S)-烯丙醇酮是制备丙烯菊酯(allethrin)杀虫剂的重要中间体，丙烯菊酯(allethrin)杀虫剂的全名为(R，S)-3-烯丙基-2-甲基-4-氧代环戊-2-烯基(R，S)-顺，反-2，2-二甲基-3-(2-甲基-1-丙烯基)环丙烷羧酸酯。另一种中间体菊酸有几何及光学异构体，共有四个立体异构体。据报道，法国罗素—优克福公司在1967年将(1R，3R)-反式菊酸与(S，R)-烯丙醇酮反应得到生物烯丙醇酮(bioallethrin)。70年代法国罗素—优克福公司又以(1R，3R)-反式菊酸与含(S)-体为主要成份的烯丙醇酮反应得到了E_s-生物菊酯(esbiothrin)。该酯中的烯丙醇酮组分S与R异构体之比72∶21。1972年Rauch等研制了(1R，3R)-反式菊酸与S-烯丙醇酮反应得到S-生物丙烯菊酯(S-bioallethrin)。在合成菊酯时所用S-烯丙醇酮的比例越高，产品的相对效力就越高。因此，开发S-烯丙醇酮可大大提高产品的杀虫活性，降低用药量。关于S-烯丙醇酮的合成，归纳起来主要有以下几种方法：

(1)不对称合成法：此法以双萘酚化锂铝作还原剂，以环烯(1，3)二酮为原料，直接合成单一构型的烯丙醇酮，此法所得产品光学纯度高，但所用还原剂制备很难，故难以大规模生产。

(2)化学拆分法：此法以(1R，4R，5S)-4-羟基-6，6-二甲基-3-氧杂双环(3，1，0)环己烷-2-酮为拆分剂，与外消旋的烯丙醇酮形成醚对映体，再经分离，分别水解后制得R和S构型的烯丙醇酮。此法合成路线复杂，总收率低，不易制得，因而产品的生产成本很高。

(3)酶促拆分法：由于不对称合成法及化学拆分法的不完善性，使得人们开始考虑使用酶催化法拆分烯丙醇酮的外消旋体。美国专利USPatent No.4571436(1986)报道了日本住友公司从商品酶中筛选得到一种烯丙醇酮醋酸酯水解酶，该酶优先水解(R)-烯丙醇酮醋酸酯，其ee_S及ee_P均高于90％。但是该商品酶制剂价格相对较高，反应后不易回收重复使用，且由于酶的乳化作用，使得萃取分离过程比较困难，并造成产品的损失，从而使生产的成本显著增加，在一定程度上影响了其工业化应用的可行性。用微生物整体细胞(其中酶处于细胞内部，在某种程度上相当于天然的固定化酶)直接水解(R)-醇酮脂肪酸酯的方法，省去了酶纯化的复杂步骤，大大降低了生产成本，是一种新的水解(R)-醇酮脂肪酸酯的方法。如《上海化工》第24卷第10期第7-8页的综述中所披露的技术路线，但该菌种还存在反应转化率偏低和光学纯度不高的缺陷。

发明内容

本发明需要解决的技术问题之一是公开一株产酯酶的不动杆菌；

本发明需要解决的技术问题之二是公开采用所述菌种进行催化拆分制备手性环戊烯酮的方法，以克服现有技术存在的商品酶制剂价格较高、或所用菌种活性和选择性较低的缺陷。

本发明的构思是这样的：

(1)自然界的微生物种类是非常丰富、多种多样的。既然自然界存在着(R)和(S)两种构型的手性酯，那末根据进化论的观点可以推断，自然界中必定也存在着对(R)和(S)两种底物具有较高专一性的酯酶。因此，发明人认为只要设计一定的方法，巧妙地筛选分离得到高度专一性的酯酶产生菌，那末通过高度对映选择性的酯水解等过程，就可获得高度光学纯的单一对映体(S)-醇酮或(R)-醇酮。

(2)微生物及其酶催化的对映体拆分过程，实质上是以两种对映体底物的竞争性反应的速度快慢不同为前提的所谓“动力学拆分”过程，有关的定量分析及模拟曲线在文献J.Am.Chem.Soc.1982，104：7294中已有详细记载。根据这一理论模型可以得到如下启示：当目标对映体为反应生成的产物(醇)时，首先要选择对映选择率(E值)尽可能高的细胞或酶；其次，在细胞或酶的选择率不是特别高(如E＜50)的情况下，应当控制适当的反应时间，使残留底物(酯)和生成的产物(醇)的对映体过量值ee_S及ee_P均达到较高值，即ee_S及ee_P相等，这样方可获得光学纯度较高的最终产物。

据此，发明人首先从土壤中筛选出产酯酶的菌株，利用此菌株所产的酯酶对烯丙醇酮脂肪酸酯进行对映选择性水解，获得光学纯度较高的R-醇酮；然后用对甲基苯磺酰氯将其磺酰化，再通过化学水解以及磺酸酯水解过程中伴随的构型翻转，即可将R-醇酮磺酸酯转化为S-醇酮。与此同时，原来酶促水解反应中残留的S-醇酮脂肪酸酯经过化学水解后，则保持原有的立体构型，直接转化为S-醇酮。

使用的微生物：

用于对(R，S)-醇酮脂肪酸酯进行对映选择性水解的微生物是一种属于不动杆菌属的菌种，不动杆菌(Acinetobacter sp.)YQ231即为具有这种能力的菌种，以下简称YQ231，该菌种已于2002年8月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为：CGMCC0789。

该菌种是通过如下的方法筛选获得的：

取1g新鲜土样，加到50ml筛选培养基中(含0.2％(NH₄)₂SO₄，0.2％K₂HPO₄，0.05％NaCl和0.05％MgSO₄·7H₂O)，另加入少量烯丙醇酮醋酸酯(0.1％)，进行富集培养；富集后取少许培养液，稀释涂平板(培养基组成同上)培养，再挑取单菌落在摇管中用丰富培养基(例如：葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％)培养24h后，加入烯丙醇酮醋酸酯(1％)，转化24h后，用等体积的乙酸乙酯萃取出产物醇和残留的酯，使用手性气相色谱柱进行分析(柱160℃，进样器及检测器温度均为280℃)，计算底物的转化率和产物的对映体过量值(ee_P)。最后从370株侯选菌株中选出一株专一性水解(R)-烯丙醇酮醋酸酯的微生物：不动杆菌YQ231。

YQ231菌种具有如下的性质：

(1)形态特征：革兰氏染色阴性，杆状或球状(稳定生长期为球形)，成对及多个排列成链状，大小为1.0-1.5×1.5-2.5μm，无芽孢，无鞭毛；

(2)培养特征：YQ231菌株在30℃平板上培养12h可形成小的菌落，36h后形成粘稠、湿润的白色菌落，边缘光滑，中间下陷。在培养物中有少量丝状体，好氧；

(3)生理生化特征：菌株YQ231的生理生化试验结果见表1。

     表1：YQ231菌株的生理生化试验结果

特性                  Properties               结果Results

过氧化氢酶            Catalase                 +

V.P试验               V.P test                 -

M.R试验               M.R test                 -

葡萄糖产酸            Acid from glucose        +

果糖产酸              Acid from fructose       +

乳糖发酵          lactose fermentation              -

淀粉水解          Hydrolysis of starch              -

明胶水解          Hydrolysis of gelatin             +

果胶水解          Hydrolysis of pectin              -

柠檬酸盐利用      Utilization of citrate            +

乙醇氧化          Alcohol oxidate                   -

氧化酶            Oxidizing enzyme                  -

脲酶              Urease                            -

产生吲哚          Production of indole              -

产生H₂S          Production of H₂S                +

硝酸盐还原        Nitrate reduction                 -

油脂水解          Fat hydrolysis                    +

蔗糖利用          Utilization of sucrose            -

葡萄糖利用        Utilization of glucose            -

甘露醇利用        Utilization of mannitol           -

乳糖利用          Utilization of lactose            -

半乳糖利用        Utilization of galactose          +

肌醇利用          Utilization of creatol            -

果糖利用          Utilization of fructose           -

山梨醇利用        Utilization of sorbitol           -

根据菌株YQ231的形态特征、培养特征及生理生化特征，该菌株与《伯杰细菌鉴定手册》(第八版，山东大学出版社1988年12月)中不动杆菌属(Acinetobacter sp.)的分类特征最相符，所以判定菌株YQ231为不动杆菌，定名为：不动杆菌(Acinetobacter sp.)YQ231。

本发明的方法包括如下步骤：

(1)将含有酯酶活性的微生物细胞或者由其分离的酯酶为催化剂，以外消旋醇酮的脂肪酸酯为原料，在20-50℃，pH＝5-10，最好25-40℃和pH＝6-8.5条件下进行转化反应，至一定转化率，一般40-50％，最好45-50％时停止反应，反应时间一般为2-48h。然后用乙酸乙酯萃取水解生成的(R)-醇酮和反应残余的(S)-醇酮脂肪酸酯，加无水硫酸钠干燥后蒸发去除有机溶剂，得到(R)-醇酮和(S)-醇酮脂肪酸酯的混合物。

所说的微生物，是指以外消旋的烯丙醇酮醋酸酯为唯一碳源分离筛选到的能够专一性水解(R)-醇酮脂肪酸酯的酯酶产生菌，例如不动杆菌Acinetobacter sp.YQ231。

所说的外消旋醇酮脂肪酸酯包括烯丙醇酮脂肪酸酯或炔丙醇酮脂肪酸酯；所说的酯是指由烯丙醇酮或炔丙醇酮与短链(C₁-C₈)脂肪酸构成的酯，尤其是乙酸酯和丁酸酯。

所说的催化剂，是指以所述及的微生物，如不动杆菌Acinetobacter sp.YQ231为种子，利用发酵工程、酶工程和基因工程技术制备的具有上述酯酶水解活力的生物材料，包括发酵液、活细胞、休止细胞，冻干细胞、固定化细胞、细胞破碎液及提取物、不同纯度的酶制剂和各种形式的固定化酶，也包括含有上述酯酶基因的各种“克隆”及其表达的蛋白质产物。

由于底物酯在水中很难溶解，分散不好而影响酶的作用效率，因此反应时最好向反应***中添加适量的助溶剂，如乙醇、丙酮、二甲亚砜等，或者加入乳化剂如吐温-80、曲拉通、壬基酚聚氧乙烯醚等；其浓度范围可在0.1-5％之内，最好在0.5-1.5％(w/v)。

按照本发明，可优选采用经过培养获得的YQ231的细胞为催化剂，加入量为5～20g(湿重)/L，并以pH为6～8.5的磷酸钾为缓冲液。

(2)产物的处理：采用现有技术，如美国专利US Patent No.4571436(1986)公开的方法，对所获得的含有(R)-醇酮和(S)-醇酮脂肪酸酯的混合物进行磺酰化和水解，然后从水解产物中收集最终的产物(S)-醇酮单一对映体。该方法简述如下：在含有(R)-醇酮和(S)-醇酮脂肪酸酯的混合物中加入丙酮和三乙基氨，然后滴加对甲基苯磺酰氯/丙酮溶液，搅拌反应，将反应混合物倒入稀盐酸溶液中，然后从反应产物中收集(R)-醇酮磺酸酯和(S)-醇酮脂肪酸酯的混合物；稀盐酸溶液的浓度为0.5～2wt％。

然后加入碳酸钙和水加热回流，反应物冷却后倒入碳酸氢钠水溶液中，再用乙酸乙酯萃取、无水硫酸镁干燥，蒸发浓缩去除溶剂即得到最终的产物(S)-醇酮单一对映体。

所述及的菌种的培养包括以下步骤：

(1)菌种的准备：将不动杆菌YQ231在灭过菌(121℃，20-40min)的丰富培养基(例如：葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％，琼脂1.5％)平板上划线，于25～30℃静置培养约2天后挑取单菌落，作为种子进行斜面培养(培养条件同上)，约2天后保存于4℃冰箱中备用。

(2)细胞的培养：挑取上述斜面培养的种子，接种到装有20mL液体培养基(组成同上，但不加琼脂)的100mL小摇瓶中，在适当温度(20～50℃，最好25～40℃)和转速(例如60～300r/min，一般100～200r/min)的摇床上培养12～18h后，按适当比例(比如5％)接种于含有100mL生长培养基的500mL大摇瓶中，在摇床上(30℃，150r/min)培养24～30h后取出，在4℃、8000r/min离心除去上清液，所得细胞用生理盐水(0.85％NaCl)洗涤一次，置于4℃冰箱中贮存备用。上述培养所得的细胞也可不经离心分离，即直接向含有细胞的发酵液中加入适量的底物酯和乳化剂进行水解拆分反应。

本发明的方法，工艺过程比较简单，反应条件比较温和；所用菌种(含胞内酯酶)的催化活性和立体选择性较高，所获得的(S)-醇酮光学纯度可达90％ee以上。该方法具有简单实用、成本低廉的优点，可望在工业生产上推广应用。

具体实施方式

                       实施例1

在一容积1L的大摇瓶中装入150mL生长培养基(含蔗糖1％，吐温-80 0.15％，黄豆饼粉2％，硫铵0.2％，K₂HPO₄ 0.2％，NaCl 0.1％，MgSO₄0.02％，pH8.0)，灭菌后按6％的接种量接入YQ231种子培养液，在温度为30℃、140r/min的摇床上培养24h。

取100mL上述培养液，离心收集菌体，用生理盐水洗涤后，悬浮于100mL巴比妥钠-盐酸缓冲液中(100mM，pH8.5)，加入1.5g壬基酚聚氧乙烯醚，再加入浓度为5wt％的烯丙醇酮醋酸酯，于30℃和160r/min的摇床上保温反应，生成(R)-烯丙醇酮，结果为：当反应进行到2小时，转化率即高于30％，继续反应至14小时，反应接近终点(50％)，此时，ee_S及ee_P达到80％，对映选择率(E值)接近40。

                       实施例2

取实施例1中的发酵液50mL，离心收集菌体，用生理盐水洗涤后，悬浮于100mL巴比妥钠-盐酸缓冲液中(100mM，pH8.5)，加入1.5g壬基酚聚氧乙烯醚，再加入2.0g烯丙醇酮醋酸酯，于30℃和160r/min的摇床上保温反应，结果为：反应进行到24小时，烯丙醇酮醋酸酯转化反应基本结束，此时，ee_S及ee_P达到90％，E值接近50。

                        实施例3

在5-L发酵罐中装入3L生长培养基(含蔗糖1％，吐温-80 0.15％，黄豆饼粉2％，硫铵0.2％，K₂HPO₄ 0.2％，NaCl 0.1％，MgSO₄ 0.02％，pH8.0)，灭菌后按5％的接种量接入YQ231种子培养液，在温度为30℃、搅拌转速为500r/min和通气速率为1.0vvm的条件下发酵，至24h放罐时菌浓为3g/L(干重)，酶活为900U/L。

取上述发酵液50mL，用0.1M、pH8.0的磷酸钾缓冲液稀释至100mL，直接加入2g烯丙醇酮醋酸酯和1.5g壬基酚聚氧乙烯醚，于30℃磁力搅拌3h，停止反应并用乙酸乙酯萃取，蒸去溶剂后得到对映体纯度均超过94％的(R)-烯丙醇酮和(S)-烯丙醇酮醋酸酯；再加入3g丙酮，在温度为-15-0℃条件下加入0.65g三乙胺，然后在同样温度下滴加对甲基苯磺酰氯(0.62g)/丙酮(2g)溶液，大约10分钟内滴完后，继续搅拌反应1.5小时，将反应混合物倒入30ml稀盐酸溶液(1％)中，然后用二氯甲烷萃取、无水硫酸钠干燥，蒸发浓缩得到(R)-醇酮磺酸酯和(S)-醇酮醋酸酯的混合物。然后加入0.1g碳酸钙和10mL水加热回流2小时，反应物冷却后倒入5％碳酸氢钠水溶液中，再用乙酸乙酯萃取、无水硫酸镁干燥，蒸发浓缩去除溶剂即得到最终的产物(S)-烯丙醇酮，光学纯度为91.0％，收率为85.0％。

                       实施例4

取实施例3中所述的发酵液100mL，离心收集细胞并重新悬浮于25mL Tris-HCl缓冲液中(20mmol/L，pH7.5)，加入75mL含2％(w/v)海藻酸钠的Tris-HCl缓冲液(20mmol/L，pH7.5)，分散均匀后用注射器滴加到0.1mol/L的CaCl₂溶液中，待形成球状颗粒后，置于新鲜CaCl₂溶液中浸泡30分钟使颗粒充分硬化。然后收集固定化细胞颗粒，重新悬浮于100ml Tris-HCl缓冲液中(50mmol/L，pH8.0)，加入2g烯丙醇酮醋酸酯和1.5g壬基酚聚氧乙烯醚，于30℃摇床上振荡反应5h，停止反应后用乙酸乙酯萃取，蒸去溶剂后得到对映体纯度超过93％的(R)-烯丙醇酮和(S)-烯丙醇酮醋酸酯。然后按上述实施例3中的后处理步骤对(R)-醇酮进行磺酰化以及对二种混合的酯进行加热水解，结果获得光学纯度为90.5％的(S)-烯丙醇酮，收率为86％。第一批反应结束后，过滤收集固定化细胞，并用Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH8.0)洗涤后，投入新鲜反应液继续反应，然后按同样的步骤进行产品的转化和分离提取。如此重复5批后，酶的活力无显著损失，所得(S)-醇酮的光学纯度也都保持在90％以上，平均收率为85％。

根据本发明公开的技术方案和实施例，有关的工程技术人员可以方便地将本发明所说的微生物菌种及其培养与转化工艺，举一反三地用于其它类型的酯(如：烯丙醇酮丁酸酯和炔丙醇酮醋酸酯)的对映体拆分。

Claims (11)

1.一种不动杆菌CGMCC0789。

2.一种拆分制备手性环戊烯酮的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)以权利要求1所述的不动杆菌CGMCC0789为催化剂，以外消旋醇酮的脂肪酸酯为原料进行转化反应，然收集(R)-醇酮和(S)-醇酮脂肪酸酯的混合物；

(2)采用常规的方法对所获得的含有(R)-醇酮和(S)-醇酮脂肪酸酯的混合物进行水解，然后从水解产物中收集最终的产物(S)-醇酮单一对映体。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于外消旋醇酮脂肪酸酯包括烯丙醇酮脂肪酸酯或炔丙醇酮脂肪酸酯。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所说的酯为由烯丙醇酮或炔丙醇酮与短链C₁-C₈脂肪酸构成的酯。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所说的酯是乙酸酯和丁酸酯。

6.根据权利要求2～5任一项所述的方法，其特征在于转化反应在20-50℃，pH＝5-10条件下进行转化反应，反应时间为2-48h。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于转化反应在25-40℃和pH＝6-8.5条件下进行。

8.根据权利要求2～5任一项所述的方法，其特征在于反应时向反应***中添加适量的助溶剂。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于助溶剂包括乙醇、丙酮、二甲亚砜或乳化剂。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于助溶剂浓度为0.1-5％，w/v。

11.根据权利要求2～5任一项所述的方法，其特征在于所说的催化剂为经过培养的不动杆菌CGMCC0789，加入量为5～20g，湿重/L，并以pH为6～8.5的磷酸钾为缓冲液。