CN101326283B - 新型脂肪酶 - Google Patents

新型脂肪酶 Download PDF

Info

Publication number
CN101326283B
CN101326283B CN2006800460085A CN200680046008A CN101326283B CN 101326283 B CN101326283 B CN 101326283B CN 2006800460085 A CN2006800460085 A CN 2006800460085A CN 200680046008 A CN200680046008 A CN 200680046008A CN 101326283 B CN101326283 B CN 101326283B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
protein
lipase
polynucleotide
sequence number
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2006800460085A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101326283A (zh
Inventor
中尾正宏
金森正树
深见治一
笠井宏朗
落合美佐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suntory Holdings Ltd
Original Assignee
Suntory Holdings Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suntory Holdings Ltd filed Critical Suntory Holdings Ltd
Publication of CN101326283A publication Critical patent/CN101326283A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101326283B publication Critical patent/CN101326283B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供Tetrasphaera属菌产生的、分子量约为32kDa的新型脂肪酶、编码该酶的基因。此脂肪酶可将中链脂肪酸作为底物识别。本发明还提供编码属于Tetrasphaera属的菌产生的、可将中链脂肪酸及长链脂肪酸作为底物识别、分子量约为40kDa的新型脂肪酶、编码该酶的多核苷酸。本发明还进一步提供Tetrasphaera属NITE P-154菌株。本发明的脂肪酶可作为固定化酶使用，在消化药、芳香剂制造、临床检验试剂、洗涤剂用酶、油脂制造、农药·医药品的光学活性中间体制造等领域中有利用价值。

Description

新型脂肪酶
技术领域
本发明涉及新型脂肪酶。本脂肪酶由Tetrasphaera属的新株的菌体产生。本脂肪酶可将中链脂肪酸及/或长链脂肪酸作为底物识别。本脂肪酶可通过阴离子交换树脂、疏水性树脂吸附固定，可作为固定化酶使用。本脂肪酶在消化药、芳香剂制造、临床检验试剂、洗涤剂用酶、油脂制造、农药·医药品的光学活性中间体制造等领域中有利用价值。 
背景技术
已证明脂肪酶是在各种酯的合成和分解、酯交换、外消旋体的光学拆分时优异的生物催化剂，实际上已在消化药、芳香剂制造、临床检验试剂、洗涤剂用酶、油脂制造、农药·医药品的光学活性中间体制造上使用。 
脂肪酶中众所周知的是动物的胰脂肪酶，而工业上经常使用的是主要来自微生物的脂肪酶。这些脂肪酶的大多数的基因已被克隆，氨基酸序列也已知(Candida rugosa：非专利文献1。Rhizopus delemar：非专利文献2。Bacillussubtilis：非专利文献3。Staphylococcus aureus：非专利文献4。Pseudomonasaeruginosa：非专利文献5)。 
丝状菌、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Stapylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)等产生的脂肪酶已在工业上使用。这些脂肪酶基本上以高级脂肪酸(碳数为16以上的脂肪酸)作为底物，以短链脂肪酸(碳数6以下)作为底物的是酯酶。可充分识别中链脂肪酸，不仅显示水解活性，还显示酯化活性的脂肪酶还不为人所知。 
中链脂肪酸结合的甘油三酯不仅被胰脂肪酶水解，还被胃脂肪酶水解，在甘油三酯的消化·吸收上也显示优势(非专利文献6)。且中链脂肪酸被吸收后，在小肠的肠道细胞中很少再合成甘油三酯，而是从门静脉运送到肝脏，作为能 量燃烧。另一方面，高级脂肪酸在肠道细胞中再合成，由淋巴吸收运送到肝脏，有时作为脂肪积累。即，高级脂肪酸有体内积累性，中链脂肪酸无积累性。这样，通过中链脂肪酸甘油三酯和通常的食用油脂之间的酯交换来制造有益于健康的油脂。 
非专利文献1 Kawaguchi et al.，Nature，341，164-166(1989) 
非专利文献2 Haas et al.，Gene，109，107-113(1991) 
非专利文献3 Dartois et al.，B.B.A.，1131，253-260(1992) 
非专利文献4 Lee et al.，J.Bacteriol.，164，288-293(1985) 
非专利文献5 Wohlfarth et al.，J.General Microbiology，138，1325-1335，(1992) 
非专利文献6 I.Ikeda，Y.Tomari，M.Sugano，S.Watanabe，andJ.Nagata：Lipids，26，369-373(1991) 
发明内容
但是，至今为止在工业上用脂肪酶还未制造出非甘油三酯的中链脂肪酸酯。因中链脂肪酸无脂肪积累性，所以，用中链脂肪酸酯化的食品材料成为不易产生肥胖等问题的材料。 
本发明者对脂肪酶进行了锐意研究，且从Tetrasphaera属新株的菌体培养上清中分离·精制出分子量约为32kDa及约为40kDa的新型脂肪酶，且进一步发现这些脂肪酶是以中链脂肪酸作为底物充分识别的新型物质，从而完成了本发明。 
I.新型脂肪酶
本发明提供如下多核苷酸，其是编码属于Tetrasphaera属(优选与Tetrasphaera属NITE P-154菌株属于同种，更优选为Tetrasphaera属NITEP-154菌株)的菌产生的、分子量约为32kDa的脂肪酶的多核苷酸或其同源物，即含有下述(A1)、(B1)、(C1)、(D1)、(E1)、(F1)或(G1)的多核苷酸： 
(A1)多核苷酸，其由序列号：10中记载的碱基序列的全部或至少包含25～ 801位的碱基序列的部分组成； 
(B1)多核苷酸，其与(A1)中记载的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(C1)多核苷酸，其由(A1)中记载的多核苷酸的碱基序列中1个或多个碱基发生取代、缺失、***及/或附加的碱基序列组成，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(D1)多核苷酸，其与(A1)中记载的多核苷酸的碱基序列有至少80％以上的同一性，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(E1)多核苷酸，其编码由序列号：11中记载的氨基酸序列组成的蛋白质； 
(F1)多核苷酸，其编码由序列号：11中记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、***及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(G1)多核苷酸，其编码由与序列号：11中记载的氨基酸序列有至少80％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质。 
序列号：10表示编码Tetrasphaera属NITE P-154菌株产生的分子量约为32kDa的脂肪酶的多核苷酸的碱基序列，序列号：11表示同一脂肪酶的氨基酸序列。且序列号：15表示含有编码同一脂肪酶的多核苷酸的基因组DNA的碱基序列，序列号：16表示包含序列号：11的上游序列的氨基酸序列。 
本说明书中，序列号：10中“25～801位的碱基序列”，除特殊情况外，可与序列号：15中“388～1164位的碱基序列”互换，本说明书中，“序列号：11的氨基酸序列”，除特殊情况外，可与“序列号：16的48～306位的氨基酸序列”互换。本发明中，由序列号：10中记载的至少包含25～801位的碱基序列的部分组成的多核苷酸，可用由序列号：15的碱基序列中至少包含388～1164位的碱基序列的部分组成的多核苷酸(例如，由序列号：15的碱基序列的247～1167位的碱基序列组成的部分组成的多核苷酸)代替；且由序列号：11中记载的氨基酸序列组成的蛋白质(或编码该蛋白质的多核苷酸)，可用序列号：16的氨基酸序列的全部或一部分组成的蛋白质(优选32～306位的氨基酸序列，更优 选48～306位的氨基酸序列组成的蛋白质)所组成的蛋白质(或编码该蛋白质的多核苷酸)代替。此种情况也包含在本发明的范围内。序列号：16的第1～47位的氨基酸序列可认为是前原序列。推测第1～31位作为分泌信号即前序列起作用，第32～47位是在分泌后，大概是通过其它蛋白质的作用被切断的原序列。因此，为作为脂肪酶起作用，必须的成熟蛋白质应是第48位以后的序列，在大肠杆菌等异种表达***中使同一脂肪酶表达时，除去前原序列使其表达更为适合。 
编码本发明的分子量约为32kDa的脂肪酶的多核苷酸或其同源物的优选例如下： 
·多核苷酸，其是下述(A1’)、(B1’)、(C1’)、(D1’)、(E1’)、(F1’)或(G1’)，： 
(A1’)多核苷酸，其是序列号：10中记载的碱基序列的全部或25～801位的碱基序列组成的部分； 
(B1’)多核苷酸，其与(A1’)中记载的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(C1’)多核苷酸，其由(A1’)中记载的多核苷酸的碱基序列中1个或多个碱基发生取代、缺失、***及/或附加的碱基序列组成，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(D1’)多核苷酸，其与(A1’)中记载的多核苷酸的碱基序列有至少80％以上的同一性，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(E1’)多核苷酸，其编码由序列号：11中记载的氨基酸序列组成的蛋白质； 
(F1’)多核苷酸，其编码由序列号：11中记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、***及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(G1’)多核苷酸，其编码由与序列号：11中记载的氨基酸序列有至少80％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质。 
·多核苷酸，其含有下述(A2)、(B2)、(C2)、(D2)、(E2)、(F2)或(G2)： 
(A2)多核苷酸，其由序列号：15中记载的碱基序列的全部或至少包含247～ 1167位的碱基序列或388～1164位的碱基序列的部分组成； 
(B2)多核苷酸，其与(A2)中记载的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(C2)多核苷酸，其由(A2)中记载的多核苷酸的碱基序列中1个或多个碱基发生取代、缺失、***及/或附加的碱基序列组成，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(D2)多核苷酸，其与(A2)中记载的多核苷酸的碱基序列有至少80％以上的同一性，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(E2)多核苷酸，其编码由序列号：16中记载的氨基酸序列的全部或至少包含48～306位的氨基酸序列的部分组成的蛋白质； 
(F2)多核苷酸，其编码由(E2)中记载的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、***及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(G2)多核苷酸，其编码由与(E2)中记载的蛋白质的氨基酸序列有至少80％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质。 
·多核苷酸，其是下述(A2’)、(B2’)、(C2’)、(D2’)、(E2’)、(F2’)或(G2’)： 
(A2’)多核苷酸，其是序列号：15中记载的碱基序列的全部或247～1167位的碱基序列或388～1164位的碱基序列组成的部分。 
(B2’)多核苷酸，其与(A2’)中记载的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(C2’)多核苷酸，其由(A2’)中记载的多核苷酸的碱基序列中1个或多个碱基发生取代、缺失、***及/或附加的碱基序列组成，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(D2’)多核苷酸，其与(A2’)中记载的多核苷酸的碱基序列有至少80％以上的同一性，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(E2’)多核苷酸，其编码序列号：16中记载的氨基酸序列的全部或至少包含48～306位的氨基酸序列的部分组成的蛋白质； 
(F2’)多核苷酸，其编码由(E2’)中记载的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、***及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(G2’)多核苷酸，其编码由与(E2’)中记载的蛋白质的氨基酸序列有至少80％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质。 
本发明还提供如下多核苷酸，其是编码属于Tetrasphaera属(优选与Tetrasphaera属NITE P-154菌株属于同种，更优选Tetrasphaera属NITEP-154菌株)的菌产生的、分子量约为40kDa的脂肪酶的基因或其同源物，即含有下述(H2)、(I2)、(J2)、(K2)、(L2)、(M2)或(N2)的多核苷酸： 
(H2)多核苷酸，其由序列号：28中记载的碱基序列的全部或至少包含414～1688位的碱基序列或498～1685位的碱基序列的部分组成； 
(I2)多核苷酸，其与(H2)中记载的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(J2)多核苷酸，其由(H2)中记载的多核苷酸的碱基序列中1个或多个碱基发生取代、缺失、***及/或附加的碱基序列组成，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(K2)多核苷酸，其与(H2)中记载的多核苷酸的碱基序列有至少80％以上的同一性，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(L2)多核苷酸，其编码由序列号：29中记载的氨基酸序列的全部或至少包含29～424位的氨基酸序列的部分组成的蛋白质； 
(M2)多核苷酸，其编码由(L2)中记载的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、***及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(N2)多核苷酸，其编码由与(L2)中记载的蛋白质的氨基酸序列有至少80％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质。 
序列号：28表示编码Tetrasphaera属NITE P-154菌株产生的分子量约为40kDa的脂肪酶的基因的碱基序列，序列号：29表示同一脂肪酶的氨基酸序列。 
编码本发明的分子量约为40kDa的脂肪酶的多核苷酸或其同源物的优选例如下： 
·多核苷酸，其是下述(H2’)、(I2’)、(J2’)、(K2’)、(L2’)、(M2’)或(N2’)： 
(H2’)多核苷酸，其是由序列号：28中记载的碱基序列的全部或414～1688位的碱基序列或498～1685位的碱基序列组成的部分； 
(I2’)多核苷酸，其与(H2’)中记载的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(J2’)多核苷酸，其由(H2’)中记载的多核苷酸的碱基序列中1个或多个碱基发生取代、缺失、***及/或附加的碱基序列组成，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(K2’)多核苷酸，其与(H2’)中记载的多核苷酸的碱基序列有至少80％以上的同一性，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(L2’)多核苷酸，其编码的是序列号：29中记载的氨基酸序列的全部或29～424位的氨基酸序列组成的部分的蛋白质； 
(M2’)多核苷酸，其编码由(L2’)中记载的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、***及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质； 
(N2’)多核苷酸，其编码由与(L2’)中记载的蛋白质的氨基酸序列有至少80％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质。 
本说明书所述的“脂肪酶”，除特殊情况外，指水解甘油酯，使脂肪酸游离的酶。本说明书中，称某种蛋白质“具有脂肪酶活性”时(或称为“脂肪酶”时)，除特殊情况外，该蛋白质(或脂肪酶)至少具有水解甘油和脂肪酸形成的酯的活性，优选具有水解与中链脂肪酸形成的酯及/或与长链脂肪酸形成的酯的活性，更优选具有与中链脂肪酸形成的酯及与长链脂肪酸形成的酯的活性。具有脂肪酶活性的蛋白质(或脂肪酶)优选具有催化脂肪酸的转移反应(酯化反应或酯交换反应)的活性，优选具有催化中链脂肪酸的转移反应的活性。 
某种蛋白质是否具有水解甘油与中链脂肪酸或长链脂肪酸形成的酯的活 性，例如，可通过供给测定如本说明书实施例中所述的4-甲基伞形酮辛酯(MU-C8)或4-甲基伞形酮基油酸酯(MU-C18)的分解活性的试验来进行评价。且某种蛋白质是否具有催化中链脂肪酸的转移反应的活性，例如，可通过供给如本说明书实施例中所述的3-苯基-1-丙醇或1-苯基-2-丙醇与三辛酸甘油酯(MCT)的酯化反应实验来进行评价。 
本说明书中，除特殊情况外，某种蛋白质(或脂肪酶)具有水解某种脂肪酸的酯的活性时或具有催化某种脂肪酸的转移反应的活性时，也将其脂肪酸称为“可作为底物识别”。 
证实了本发明的属于Tetrasphaera属(优选与Tetrasphaera属NITEP-154菌株属于同种，更优选Tetrasphaera属NITE P-154菌株)的菌产生的、分子量约为32kDa的蛋白质及分子量约为40kDa的蛋白质，至少具有4-甲基伞形酮辛酯(MU-C8)的分解活性，后者进一步具有4-甲基伞形酮基油酸酯(MU-C18)的分解活性，且可由三辛酸甘油酯及3-苯基-1-丙醇或1-苯基-2-丙醇分别生成正辛酸酯(参照实施例1)。因此，两者均可具有脂肪酶活性，更加详细地说，可以说前者具有水解与中链脂肪酸形成的酯的活性(可将中链脂肪酸作为底物识别)，后者具有水解与中链脂肪酸及长链脂肪酸形成的酯的活性(可将中链脂肪酸及长链脂肪酸作为底物识别)，且具有催化中链脂肪酸的转移反应(特别是酯化反应)的活性。 
本说明书中的“中链脂肪酸”，除特殊情况外，指碳数为7～15的饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸。中链脂肪酸中包含正辛酸、癸酸及十二烷酸。 
本说明书中的“长链脂肪酸”，除特殊情况外，指碳数为16以上的饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸。长链脂肪酸中包含棕榈酸、硬脂酸、棕榈烯酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸及γ-亚麻酸。 
本说明书中涉及甘油和脂肪酸，为“酯”时，除特殊情况外，不只是三酰甘油，还可以是二酰甘油或单酰甘油(有时也将后二者合起来称为部分酰基甘油。 
本发明中所述的“严谨条件”，除特殊情况外，指6M尿素、0.4％SDS、 0.5×SSC的条件或与其同等的杂交条件，且根据需要，本发明中也可适用严谨性更高的条件，例如6M尿素、0.4％SDS、0.1×SSC或与其同等的杂交条件。在各种条件中，温度可约为40℃以上，如需要严谨性更高的条件时，例如可约为50℃，进一步可约为65℃。 
且本发明中，进行“1个或多个碱基发生取代、缺失、***及/或附加的碱基序列”时的取代等的核苷酸的个数，只要其碱基序列组成的多核苷酸编码的蛋白质具有所需功能，无特别限定，可以是1～9个或1～4个的程度，如是编码同一或性质相似的氨基酸序列的取代等，也可有更多个数的取代等。且本发明中，进行“1个或多个氨基酸发生取代、缺失、***及/或附加的氨基酸序列”时被取代等的氨基酸的个数，只要具有该氨基酸序列的蛋白质具有所需功能，无特别限定，可为1～9个或1～4个的程度，如是对性质相似的氨基酸取代等，也可有更多个数的取代等。用于制备与此种碱基序列或氨基酸序列有关的多核苷酸的方法，为本领域技术人员所周知。 
对于碱基序列，高的同一性是指至少50％以上、优选70％以上、更优选80％以上、进一步优选90％以上、最优选95％以上的序列同一性。 
对于氨基酸序列，高的同一性是指至少50％以上、优选70％以上、更优选80％以上、进一步优选90％以上、最优选95％以上的序列同一性。序列号：11中记载的氨基酸序列与公知脂肪酶的氨基酸序列之间的同一性，如实施例的表4所示。此外，序列号：28中记载的氨基酸序列与公知序列之间的同一性，如实施例8所述。 
对于多核苷酸序列或氨基酸序列同一性的检索·分析，可根据本领域技术人员周知的算法或程序(例如，BLASTN、BLASTP、BLASTX、ClustalW)进行。使用程序时的参数，只要是本领域技术人员均可适当设定，也可使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方法，为本领域技术人员所周知。 
本说明书中表示蛋白质或脂肪酶的分子量时，除特殊情况外，为使用SDS-PAGE确定的值(参照实施例1、图2)。 
本发明的多核苷酸，可从天然物中使用杂交技术、聚合酶链式反应(PCR) 技术等获得。 
具体地说，从属于Tetrasphaera属(优选与Tetrasphaera属NITE P-154菌株属于同种，更优选Tetrasphaera属NITE P-154菌株)的菌中，通过常法[例如，DNeasy Tissue Kit(QIAGEN)]制备基因组DNA(gDNA)，或从同一菌体中通过常法[例如，RNeasy Plant isolation Kit(QIAGEN)]制备全RNA，且以全RNA为模板，通过常法[例如，SuperScript II Reverse Transcriptase(Invitrogen)]进行逆转录反应(1st strand cDNA合成)来制备。 
为获得目的多核苷酸，以32kDa脂肪酶蛋白质的N-末端序列为基础，设计5’端的引物。进一步以与上述N末端氨基酸残基显示同一性的来自比较近缘的链霉菌属(Streptomyces)菌等的推测蛋白质的保守序列为基础，设计3’端的引物。将lip32基因片段以#375株cDNA为模板，通过使用上述引物组(PrimerSet)的简并PCR进行扩增，确定部分碱基序列。进一步用适合的限制酶酶切后，以环化#375株gDNA为模板，通过使用了在同序列上外向设计的引物的反向PCR，获得旁侧区域的碱基序列信息。这样，确定了共计约900bp的lip32区域gDNA的碱基序列。 
本发明的多核苷酸中包含DNA，DNA中包含基因组DNA、cDNA及化学合成DNA。DNA可以是单链DNA及双链DNA。 
本发明的多核苷酸的优选例为来自Tetrasphaera属的多核苷酸。 
本发明还提供包含本发明的多核苷酸的重组载体、通过其重组载体转化的转化体(例如转化大肠杆菌、转化酵母、转化昆虫细胞)。本发明还进一步提供包括使用本发明的多核苷酸转化宿主(例如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞)的工序(例如，通过本发明的重组载体转化的工序)的转化方法。 
***本发明的多核苷酸的载体，只要可使在宿主内的***物表达无特别限制，载体通常具有启动子序列、终止子序列、用于通过外界刺激诱导性地使***物表达的序列、通过用于***靶基因的限制酶识别的序列、及编码用于选择转化体的标记的序列。重组载体的制备、通过重组载体的转化方法，可适用本领域技术人员周知的方法。 
本发明还提供如下蛋白质，其为属于Tetrasphaera属(优选与Tetrasphaera属NITE P-154菌株属于同种，更优选Tetrasphaera属NITEP-154菌株)的菌产生的分子量约为32kDa的脂肪酶或其同源物，即含有下述(e1)、(f1)或(g1)的蛋白质： 
(e1)蛋白质，其由序列号：11中记载的氨基酸序列组成； 
(f1)蛋白质，其由序列号：11中记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、***及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性； 
(g1)蛋白质，其由与序列号：11中记载的氨基酸序列有至少80％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性。 
本发明的分子量约为32kDa的脂肪酶或其同源物的优选例为下述蛋白质： 
·蛋白质，其是下述(e1’)、(f1’)或(g1’)： 
(e1’)蛋白质，其由序列号：11中记载的氨基酸序列组成； 
(f1’)蛋白质，其由序列号：11中记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、***及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性； 
(g1’)蛋白质，其由与序列号：11中记载的氨基酸序列有至少80％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性。 
·蛋白质，其含有下述(e2)、(f2)或(g2)： 
(e2)蛋白质，其由序列号：16中记载的氨基酸序列的全部或至少包含48～306位的氨基酸序列的部分组成； 
(f2)蛋白质，其由(e2)中记载的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、***及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性； 
(g2)蛋白质，其由与(e2)中记载的蛋白质的氨基酸序列有至少80％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性。 
·蛋白质，其为下述(e2’)、(f2’)或(g2’)： 
(e2’)蛋白质，其为序列号：16中记载的氨基酸序列的全部或48～306位的氨基酸序列组成的部分； 
(f2’)蛋白质，其由(e2’)中记载的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸 发生取代、缺失、***及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性； 
(g2’)蛋白质，其由与(e2’)中记载的蛋白质的氨基酸序列有至少80％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性。 
此分子量约为32kDa的脂肪酶可将中链脂肪酸作为底物识别，如实施例11中所示的条件中，最适温度约为40℃，最适pH值为7.0左右。 
本发明还提供如下蛋白质，其为属于Tetrasphaera属(优选与Tetrasphaera属NITE P-154菌株属于同种，更优选Tetrasphaera属NITEP-154菌株)的菌产生的分子量约为40kDa的脂肪酶或其同源物，即含有下述(l1)、(m1)或(n1)的蛋白质。 
(l1)蛋白质，其由序列号：35中记载的氨基酸序列组成； 
(m1)蛋白质，其由序列号：35中记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、***及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性； 
(n1)蛋白质，其由与序列号：35中记载的氨基酸序列有至少80％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性。 
序列号：35及图16中，表示Tetrasphaera属NITE P-154菌株产生的分子量约为40kDa的脂肪酶的、成熟蛋白质的氨基酸序列。 
本发明的分子量约为40kDa的脂肪酶或其同源物的优选例，如下述蛋白质： 
·蛋白质，其是上述(l1)、(m1)或(n1)。 
·蛋白质，其含有下述(l2)、(m2)或(n2)： 
(l2)蛋白质，其由序列号：29中记载的氨基酸序列的全部或至少包含29～424位的氨基酸序列的部分组成； 
(m2)蛋白质，其由(l2)中记载的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、***及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性； 
(n2)蛋白质，其由与(l2)中记载的蛋白质的氨基酸序列有至少80％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性。 
·蛋白质，其是下述(l2’)、(m2’)或(n2’)， 
(l2’)蛋白质，其由序列号：29中记载的氨基酸序列的全部或29～424位的 氨基酸序列组成的部分组成； 
(m2’)蛋白质，其由(l2’)中记载的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、***及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性； 
(n2’)蛋白质，其由与(l2’)中记载的蛋白质的氨基酸序列有至少80％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性。 
此分子量约为40kDa的脂肪酶可将中链脂肪酸及长链脂肪酸作为底物识别，实施例11所示条件中，最适温度约为45～50℃，最适pH值为7.0左右。 
上述蛋白质或脂肪酶，可从将属于Tetrasphaera属(优选与Tetrasphaera属NITE P-154菌株属于同种，更优选Tetrasphaera属NITE P-154菌株)的菌用市售培养基[例如，使用Marine broth 2216(Difco公司制)。Marine broth是液体培养基，其特征在于约含有2％食盐]培养后获得的培养上清中分离·精制。 
具体如下所示。首先接种菌液，使菌液相对于培养基为0.1～5％，10～40℃下培养2日～10日。使用经含有氯化钙及氯化镁的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液平衡后的疏水性凝胶(例如φ-Sepharose)0.01～1份，将培养上清用于柱色谱法。用上述缓冲液液洗涤后，通过用含有1％非离子表面活性剂[例如，曲拉通X-100(TritonX-100)]的上述缓冲液液洗脱，可获得具有脂肪酶活性的组分。将本脂肪酶组分用10份上述缓冲液液稀释后，吸附于0.001～1份阴离子交换凝胶(例如，Q-Sepharose)上，用含有0.1％的两性表面活性剂(例如，3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸内盐(CHAPS)；3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate(CHAPS))的上述缓冲液洗涤后，用氯化钠水溶液的浓度梯度洗脱，获得脂肪酶活性组分。将本脂肪酶组分使用阴离子交换柱(例如HiTrapQ)进行高效液相色谱法(HPLC)，通过氯化钠水溶液进行浓度梯度洗脱，获得可确认出具有脂肪酶活性且分子量约为32kDa或约为40kDa的蛋白质的存在的组分。更具体的方法，可参照本说明书的实施例1。 
上述的蛋白质或脂肪酶，可通过用***了本发明的多核苷酸的重组载体转化的转化体(例如，转化大肠杆菌)，获得重组蛋白质。 
具体如下所示。首先，用于大肠杆菌表达***的基因的碱基序列，通过使用适合的引物组(Primer Set)的PCR进行扩增，克隆后，通过测序确认碱基序列。克隆后的DNA片段，通过适合的限制酶酶切提取后，整合进蛋白质的大肠杆菌表达用载体中，使用此载体转化到大肠杆菌中，使蛋白质表达。破碎表达靶基因的大肠杆菌，将上清用色谱柱精制，获得约32kDa或约40kDa的目标蛋白质。更具体的方法可参照本说明书的实施例3或8。 
本发明还可提供如下脂肪酶，其为属于Tetrasphaera属(优选与Tetrasphaera属NITE P-154菌株属于同种，更优选Tetrasphaera属NITEP-154菌株)的菌产生的、可将中链脂肪酸及长链脂肪酸作为底物识别的、分子量约为40kDa的脂肪酶、或可通过包含下述工序的制造方法分离的分子量约为40kDa的脂肪酶。 
将属于Tetrasphaera属的菌的培养上清液加入到疏水性树脂色谱柱，将疏水性树脂吸附物用含有1％非离子表面活性剂的缓冲液洗脱； 
将洗脱物加入到阴离子交换树脂中，将阴离子交换树脂吸附物用0.5M NaCl溶液洗脱； 
将洗脱物透析后加入到阴离子交换柱，用NaCl梯度溶剂洗脱。 
该制造方法更详细地说包括下述1)～3)的工序： 
1)将属于Tetrasphaera属(优选与Tetrasphaera属NITE P-154菌株属于同种，更优选Tetrasphaera属NITE P-154菌株)的菌的培养上清液加入到疏水性树脂色谱柱，根据需要，将疏水性树脂吸附物用含有0.5％非离子表面活性剂[例如，曲拉通X-100(TritonX-100)]的缓冲液等洗涤后，用含有1％曲拉通X-100(TritonX-100)的缓冲液洗脱， 
2)将洗脱物加入到阴离子交换树脂中，根据需要，将阴离子交换树脂吸附物用含有0.1％两性表面活性剂(例如，3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸内盐(CHAPS)；3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate(CHAPS))的缓冲液等洗涤后，用0.5M NaCl溶液洗脱， 
3)将洗脱物透析后加入到阴离子交换柱，用NaCl梯度溶剂洗脱。例如， 将洗脱物透析后加入到1ml容量的阴离子交换柱，用0～0.75M NaCl梯度溶剂洗脱，毎0.5ml收集一次洗脱物。 
上述40kDa的脂肪酶，按照与已叙述的32kDa的脂肪酶相同的方法，可从将属于Tetrasphaera属(优选与Tetrasphaera属NITE P-154菌株属于同种，更优选Tetrasphaera属NITE P-154菌株)的菌用市售培养基培养后获得的培养上清中分离·精制(参照实施例1)。 
上述40kDa的脂肪酶的优选例，其氨基酸序列为序列号：3及/或序列号：14中记载的氨基酸序列，更特定地说，为具有序列号：3及序列号：14中记载的氨基酸序列的氨基酸序列。 
通过使用本发明及由本说明书提供的信息，例如，通过使用上述40kDa的脂肪酶的全部或一部分、序列号：3或序列号：14中记载的氨基酸序列、或属于Tetrasphaera属的(优选与Tetrasphaera属NITE P-154菌株属于同种，更优选Tetrasphaera属NITE P-154菌株)菌、从该菌中获得的基因组DNA，另外适当的话还可通过适用本说明书中公开的针对32kDa脂肪酶的各种方法，获得编码40kDa脂肪酶的多核苷酸的序列信息及编码40kDa脂肪酶的多核苷酸。更具体地说，将从属于Tetrasphaera属(优选与Tetrasphaera属NITE P-154菌株属于同种，更优选Tetrasphaera属NITE P-154菌株)的菌中获得的基因组DNA用适合的限制酶完全酶切，与对应限制酶的接头(Cassette)连接，制备模板DNA。另一方面，利用由40kDa的脂肪酶的一部分获得的氨基酸序列信息(例如，为N末端氨基酸序列的序列号：3，为内部氨基酸序列的序列号：14)，设计适合的引物。使用此引物和接头引物(Cassette Primer)进行PCR，获得40kD脂肪酶基因的周边基因组DNA序列。从所得到的碱基序列等中可推测出编码40kDa脂肪酶的基因的ORF。在推测ORF的扩增、克隆、碱基序列的确认、经编码的蛋白质功能的确认中，可适用本说明书中记载的、与32kDa的脂肪酶以相同目的使用的方法。 
即本发明还以使用序列号：3或序列号：14中记载的氨基酸序列、上述40kDa的脂肪酶的全部或一部分(即脂肪酶自身或其片段)、或属于Tetrasphaera属 (优选与Tetrasphaera属NITE P-154菌株属于同种，更优选Tetrasphaera属NITE P-154菌株)的菌为特征，提供编码该脂肪酶的多核苷酸碱基序列信息的生产方法。 
II.Tetrasphaera属NITE P-154菌株
本发明还提供可产生本发明的脂肪酶的Tetrasphaera属NITE P-154菌株。 
Tetrasphaera属NITE P-154菌株，从株式会社海洋生物技术研究所拥有的新型海洋性微生物文库中，使用含有中链脂肪酸油脂(MCT)的琼脂板，通过是否形成抑菌圈来筛选。 
[Tetrasphaera属NITE P-154菌株的菌学性质] 
Tetrasphaera sp.NITE P-154株(本说明书中有时表示为“#375”。)在形态上为球菌(0.86×0.86μm)，无运动性。生理学上为革兰氏阳性，生育温度范围为15～45℃，作为碳源可使用D-果糖、D-葡萄糖、D-甘露糖醇、棉子糖及蔗糖，不能使用L-***糖、肌醇、L-鼠李糖及D-木糖。化学分类上异戊二烯醌是MK-8(H4)，DNA的碱基组成为70.5％。 
表1 
a.形态特性 
1)细胞的形状及大小：球菌、0.86×0.86μm 
2)有无运动性：无 
b.培养特性 
1)ISP培养基No.2平板培养：形成圆形、半球状、全缘、有光泽的白色菌落 
2)ISP培养基No.4平板培养：形成圆形、半球状、全缘、有光泽的白色菌落 
3)ISP培养基No.5平板培养：生育不良，但形成白色菌落 
4)ISP培养基No.6平板培养：形成圆形、半球状、全缘、有光泽带有黄色的白色菌落 
5)ISP培养基No.7平板培养：生育不良，但形成白色菌落 
6)Marine Agar琼脂平板培养：形成圆形、半球状、全缘、有光泽的白色菌落 
c.生理学特性 
1)革兰氏染色：阳性 
2)生育温度范围：15-45度 
3)碱性磷酸酶活性：阴性 
4)酯酶(C4)活性：阳性 
5)酯酶脂肪酶(C8)活性：阳性 
6)脂肪酶(C4)活性：阳性 
7)亮氨酸 芳香基酰胺酶活性：阳性 
8)缬氨酸 芳香基酰胺酶活性：阳性 
9)胱氨酸 芳香基酰胺酶活性：阴性 
10)胰蛋白酶活性：阴性 
11)糜蛋白酶活性：阴性 
12)酸性磷酸酶活性：阳性 
13)萘酚-AS-BI-磷酸水解酶活性：阳性 
14)α-半乳糖苷酶活性：阴性 
15)β-半乳糖苷酶活性：阳性 
16)β-葡糖醛酸苷酶活性：阴性 
17)α-葡萄糖苷酶活性：阳性 
18)β-葡萄糖苷酶活性：阳性 
19)N-乙酰-β-葡萄糖胺酶活性：阴性 
20)α-甘露糖苷酶活性：阴性 
21)α-岩藻糖苷酶活性：阴性 
22)碳源的利用性 
L-***糖：- 
D-果糖：+ 
D-葡萄糖：+ 
肌醇：- 
D-甘露醇：+ 
L-鼠李糖：- 
棉子糖：+ 
蔗糖：+ 
D-木塘：- 
使用BiOLOG SFP2酶标板。 
d.化学分类学特性 
1)异戊二烯醌：MK-8(H4) 
2)DNA的碱基組成：70.5％ 
用marine broth 2216(Difco公司制)培养Tetrasphaera属NITE P-154菌株时，将本发明的脂肪酶分泌到菌体外。 
本发明还提供如下菌株或其突变体，其为与Tetrasphaera属NITE P-154菌株具有同样菌学性质的菌株或其突变体、及具有由与Tetrasphaera属NITEP-154菌株的16S rRNA基因(序列号：1)有高度同一性(例如，具有高于98％的同一性、优选98.5％同一，进一步优选99％同一，进一步优选99.5％同一)的碱基序列组成的16S rRNA基因的菌株或其突变体。且根据本发明者的研究，与公知的菌最接近的是98％。 
本发明的菌株及其突变体的菌株，可用于本发明的蛋白质及脂肪酶的制造。 
本发明还提供由序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸。 
附图说明
图1表示Tetrasphaera sp.NITE P-154(#375)的16S rRNA基因的碱基序列。 
图2表示HPLC分离后各组分的SDS-PAGE的照片。MW表示分子量标记，21～35表示组分#21～35泳动的泳道。 
图3表示链霉菌属(Streptomyces)菌推测分泌蛋白质与来自龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)的GDSL-脂肪酶的比对结果。#375株产生的32kDa蛋白质的N-末端15个氨基酸残基与比较近缘的链霉菌属(Streptomyces)菌的推测分泌蛋白质显示出高度同一性，此链霉菌属(Streptomyces)菌推测分泌蛋白质，与包括来自龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)的GDSL-脂肪酶在内的一些脂肪酶等的氨基酸序列有同一性。 
图4表示与推测的编码32kDa蛋白质的基因(lip32基因)碱基序列对应的氨基酸序列。lip32基因至少由777bp构成，编码由259个氨基酸残基组成的蛋白质。 
图5表示LIP32蛋白质表达载体(pET22b：：lip32Nc)的构成。 
图6表示色谱柱精制后LIP32蛋白质的SDS-PAGE照片。M表示标记，2表示组分#2、3表示组分#3泳动的泳道。 
图7表示色谱柱精制后LIP32蛋白质通过Bradford法得到的结果。 
图8表示包含编码LIP32的基因的基因组DNA的碱基序列和LIP32的氨基酸序列。网线部表示与精制LIP32的N末端氨基酸序列一致的序列。 
图9表示LIP32的推测前序列及原序列、和pETLIP32-F、pETLIP32-M、pETLIP32-S载体。 
图10表示包含编码LIP40的基因的基因组DNA的碱基序列和LIP40的氨基酸序列。下线部表示分泌信号序列，网线部表示与精制LIP40的部分氨基酸序列一致的序列。双重下线部为脂肪酶的保守区域。 
图11表示LIP40蛋白质表达载体(pETLIP40HP)的构成。 
图12表示LIP32PH及LIP40HP的最适温度。 
图13表示LIP32PH及LIP40HP的最适pH值。 
图14表示使用固定化的LIP40HP或对照(pET22b)进行向虾青素的脂肪酸转移反应时反应液的HPLC分析图。 
图15表示使用LIP40HP或对照(pET22b)进行向儿茶素的脂肪酸转移反应时反应液的HPLC分析图。 
图16表示LIP40成熟蛋白质的氨基酸序列。 
具体实施方式
本发明的32kDa或40kDa的脂肪酶，可固定在适合的载体上，作为固定化酶使用。 
载体中，以同样目的使用的以往的树脂，可将例如碱性树脂[例如，MARATHON WBA陶氏化学公司(Dow Chemical Company)、三菱化学的SA系列、WA系列或FP系列的树脂及ORGANO公司Amber Light的IRA系列]、疏水性树脂[例如，FPHA(Diaion、三菱化学公司制)、三菱化学的HP系列、ORGANO公司的AmberLight XAD7等作为载体使用。 
向载体的固定化方法也可适用以同样目的使用的以往技术。例如，相对于1份上述的树脂载体，加入10份#375的培养上清，可直接进行减压干燥，也可使其吸附后，除去上清后干燥。 
经固定的脂肪酶在工业上很有利用价值。即将固定化酶充填入色谱柱，在其色谱柱中可进行原料流通的连续反应。此外也可容易地从反应液中除去固定化酶，还可进行再利用。 
本发明的脂肪酶或固定化脂肪酶，可在中链脂肪酸及/或长链脂肪酸的转移反应中、及中链脂肪酸酯及/或长链脂肪酸酯的制造中使用。酯中包含虾青素等的类胡萝卜素(由胡萝卜素类和叶黄素类组成。)与脂肪酸形成的酯、及儿茶素等的多酚与脂肪酸形成的酯。 
本说明书中的“转移反应”，除特殊情况外，为酯化反应或酯交换反应。 
转移反应用于制造各种脂肪酸酯。例如在甘油三酯间的酯交换、固醇酯的制造、脂肪酸甲酯制造等的工业化实施中，如使用以往的脂肪酶一样，此种情况下也可使用本发明的脂肪酶。可通过本发明的脂肪酶制造的酯中，作为特别有用的例子，可列举固醇酯(例如，β-谷甾醇辛酸酯)、虾青素辛酸酯、儿茶素辛酸酯等。 
本发明还提供由本发明首次提供的与序列号：1、序列号：3、序列号：14、序列号：10、序列号：11、序列号：15、序列号：16、序列号：28及序列号：29有关的序列信息及其一部分、以及其利用方法。 
实施例 
以下通过实施例，进一步具体说明本发明。但本发明不限于下述实施例。 
[实施例1]从#375株培养上清中的脂肪酶蛋白质的分离·精制和N末端15个残基的序列确定： 
在Marine broth 2216(Difco公司制)液体培养基中接种1％#375株，25℃下振荡培养4日。对于培养上清液200ml，吸附于用缓冲液A：50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH8.0)/2mM CaCl2/2mM MgCl2平衡的疏水树脂：PhenylSepharose CL4B(Amersham Biosciences公司制)2ml上，用于柱色谱法。用缓冲液A洗涤后，用10ml含有0.5％曲拉通X-100(TritonX-100)的缓冲液A洗涤除去脂肪酶蛋白质以外的物质。其次，通过用10ml含有1％曲拉通X-100(TritonX-100)的缓冲液A洗脱，获得脂肪酶活性组分。 
在本脂肪酶组分(10ml)中添加10倍量的缓冲液A稀释后，吸附于阴离子交换树脂：Q-Sepharose(Amersham Biosciences公司制)0.4ml上，用含有0.1％CHAPS的缓冲液A充分洗涤，从表面活性剂曲拉通X-100(TritonX-100)置换为CHAPS后，用0.5M进一步用1M NaCl进行分步洗脱。将证实了脂肪酶活性的0.5M NaCl洗脱组分(2ml)用含有0.1％CHAPS的缓冲液A充分透析后，使用阴离子交换柱：HiTrapQ(Amersham Biosciences公司制)1ml，通过HPLC进行0→0.75M NaCl梯度洗脱。毎0.5ml收集一次组分，分别进行脂肪酶活性、及通过SDS-PAGE的条带的检测。表2表示脂肪酶活性及转移活性，图2表示SDS-PAGE结果。 
脂肪酶活性，按照实施例3中详细叙述的使用MU-C8的方法，使用底物MU-C8或MU-C18测定。单位用Unit[1 Unit(1MU)是1L样品在1min内水解1μmol的MU而游离的活性]表示。 
转移活性如下测定。在3-苯基-1-丙醇(10μl)或1-苯基-2-丙醇(10μl)和三辛酸甘油酯(150μl)的混合液中添加酶溶液(100μl)，45℃下剧烈搅拌3日使其反应。离心分离反应液，回收上层50μl，加入乙腈50μl，取10μl用HPLC分析。分析条件为色谱柱使用Develosil C30-UG-5(4.6×150mm)(Nomurachemical，Aichi，Japan)，移动层使用90％乙腈0.08％TFA，流速为1ml/分，温度为室温。用各种辛酸酯的生成率表示。 
表2 
                    表2.脂肪酶活性
    Q Fr22   Q Fr23   Q Fr24   Q Fr25   Q Fr26   Q Fr27   Q Fr28   Q Fr29   Q Fr30   Q Fr31   Q Fr32   Q Fr33   Q Fr34   Q Fr35   Q Fr36
  C8   48.50   64.75   49.24   33.62   16.49   9.95   6.07   3.94   2.97   2.47   7.78   33.97   13.94   2.69   2.17
 C18   10.67   13.46   10.58   7.58   4.73   2.88   1.70   1.24   0.90   0.76   0.74   0.69   0.57   0.46   0.43
 3P1   15.15   22.31   20.89   13.47   5.85   3.09   2.44   2.62   +   +   +   +   +   +   +
 1P2   6.24   8.28   8.57   3.97   +   +   +   +   +   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00
对于2种脂肪酶(32kDa、40kDa)，通过蛋白质序列分析仪，确定N末端开始15个残基的氨基酸序列。其结果如表3及序列表(序列号：2、序列号：3)所示。 
表3 
       表3.各脂肪酶的N末端氨基酸序列
        1          5       10       15 
Lip32k  G D A P A Y E R Y V A L G D s 
Lip40k  G P D S V P G T A G A T T V T 
进一步对于分子量40kDa的脂肪酶，从SDS-PAGE中切出条带，用胰蛋白酶酶切，通过反相HPLC进行片段肽的分离。确定了任意峰值的肽的N末端开始12个残基的氨基酸序列LSTNVGPTHLGG(序列号：14)。 
[实施例2]32kDa的脂肪酶基因的克隆： 
[由#375的DNA及RNA的制备] 
从本菌中制备基因组DNA(gDNA)时使用DNeasy Tissue Kit(QIAGEN)，制备全RNA时使用RNeasy Plant isolation Kit(QIAGEN)，根据各试剂盒的使用说明进行。以全RNA为模板的逆转录反应(lst strand cDNA合成)使用SuperScript II Reverse Transcriptase(Invitrogen)，根据使用说明进行。 
与PCR产物的载体的连接时使用TOPO TA-cloning Kit(Invitrogen)，根据规定方法转化到大肠杆菌中。克隆的DNA片段的碱基序列，使用在克隆载体MCS的外侧设计的引物(M13 primer M4，RV等)、在已知序列上设计的引物，通过引物步查法确定。测序样品使用ABI PRISM BigDye Terminator v3.1(AppliedBiosystems)，根据使用说明制备。序列分析仪使用ABI PRISM 3100-AvantGenetic Analyser(Applied Biosystems)，数据分析软件使用Vector-NTI 9.0(InforMax)。 
[lip32基因的获得] 
为获得预想的编码#375株的32kDa蛋白质的基因(以下为lip32基因)，将该蛋白质的N-末端15个氨基酸残基的序列(GDAPAYERYVALGDS)对照基因库(genebank)的氨基酸序列数据库进行blastp检索的结果，显示出与#375株比较近缘的链霉菌属(Streptomyces)菌的推测分泌蛋白质(登录号No.CAC42140)有高度同一性。此链霉菌属(Streptomyces)菌的推测分泌蛋白质与一些脂肪酶等的氨基酸序列具有同一性。其中，通过与来自龟裂链霉菌(Streptomycesrimosus)的GDSL-脂肪酶(登录号No.AAK84028)的ClustalW的比对结果如图3所示。这些蛋白质的保守序列中，以用下线部表示的2个序列VALGDSYS(序列号：4)和IGGNDS(序列号：5)为基础，设计正义链的简并引物375-dg-F3(5’-TGGCCCTCGGCGACTCSTAC-’3)(序列号：6)和反义链简并引物375-dg-R3(5’- CGTCGTTGCCNCCGATG-3’)(序列号：7)。以#375株cDNA为模板，通过引物375-dg-F3和引物375-dg-R3，使用ExTaq(TAKARA BIO)，通过98℃ 2分钟、(98℃20秒、55℃ 30秒、72℃ 1分钟)x35循环、72℃ 5分钟的PCR扩增DNA。确定所得到的DNA片段的碱基序列，获得序列号：10的第73位～第290位的部分碱基序列。其次，在所得到的序列上设计外向引物375-IPC32-F1(5’-CGGCGCGGACACGACGGACATGACG-3’)(序列号：8)和375-IPC32-R1(5’-GGTAGCAGCCGCCCGCGATGTCGAG-3’)(序列号：9)。将#375株gDNA用限制酶PstI或NotI酶切后，以自我连接环化的产物为模板，通过引物375-IPC32-F1和引物375-IPC32-R1，使用LATaq(TAKARA BIO)，利用98℃ 20秒、68℃ 15分钟(+10秒/循环)x35循环的PCR(反向PCR)扩增旁侧序列。克隆所得到的DNA片段，确定其一部分的碱基序列。和上述获得的部分碱基序列加在一起，确定了共计约900bp的lip32区域gDNA的碱基序列。从用实施例1确定的N-末端氨基酸序列(序列号2)中，推测LIP32蛋白质的氨基酸序列。本菌的lip32基因区域的DNA序列及推测氨基酸序列如图4及序列表(序列号：10、序列号：11)所示。用实施例1确定的N-末端氨基酸序列(序列号：2)与图4的N-末端氨基酸序列一致。从以上结果可知，LIP32成熟蛋白质是由259氨基酸残基组成的蛋白质。 
且对于推测出的LIP32蛋白质，通过ClustalW进行与已知脂肪酶蛋白质氨基酸序列的同一性分析。各蛋白质的氨基酸序列的同一性如表4所示。 
表4 
表4.LIP32的比对分析 
Figure DEST_PATH_G42161462150138000D000031
[实施例3]32kDa脂肪酶基因向大肠杆菌的导入和脂肪酶活性： 
[通过大肠杆菌表达***的LIP32蛋白质(LIP32PH)的制备] 
大肠杆菌表达***中使用的#375株的lip32基因ORF的cDNA序列，通过使用了引物lip32-Nc-F(5’-CCATGGGCGACGCACCGGCATACGAACGC-3’)(序列号： 甘油(glycerol)，25mM Tris-HCl，pH 8.0)、1.0ml的清洗缓冲液(Wash-2buffer)(500mM NaCl，40mM咪唑(imidazole)，20mM β-ME，10％(v/v)甘油(glycerol)，25mM Tris-HCl，pH 8.0)，洗涤色谱柱。LIP32蛋白质用5ml的洗脱缓冲液(Elution buffer)(500mM NaCl，250mM咪唑(imidazole)，20mM β-ME，10％(v/v)甘油(glycerol)，25mM Tris-HCl，pH 8.0)从色谱柱中洗脱，每500μl收集一次洗脱液。各收集组分中所含有的蛋白质的纯度和浓度，通过SDS-PAGE(图6)和Bradford法(图7)确认。SDS-PAGE的结果，在组分#2～3中，清楚地确认出推测为LIP32蛋白质的约30kDa的条带。进一步，对于各组分，将MU-C8作为底物测定脂肪酶活性(与下述脂肪酶活性测定相同)。其结果，证实组分#3有强的同样活性。因此，在以后的研究中，决定将组分#3作为LIP32蛋白质的酶溶液(约530ng/μl)使用。 
[LIP32蛋白质(LIP32PH)的脂肪酶活性] 
LIP32蛋白质的脂肪酶活性，通过制备混合20μl稀释的大肠杆菌培养液(悬浮液)和180μl底物溶液[0.1mM MU-C8，50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)，1％DMF]的反应溶液(200μl)，37℃下用微孔板式荧光酶标仪(SPECTRAmaxGEMINI XS)(Molecular Devices)测定20min内荧光强度的变化来求出。1Unit(1MU)是1L样品在1min内水解1μmol的MU而游离的活性。 
使用表达诱导LIP32蛋白质的大肠杆菌悬浮液，测定脂肪酶活性的结果，LIP32显示出高的脂肪酶活性(MU-C8分解活性)(表5)。 
表5 
表5.LIP32表达大肠杆菌悬浮液的脂肪酶活性 
OF：来自皱落假丝酵母(Candida rugosa)的脂肪酶 
[实施例4]#375株的培养上清在阴离子交换树脂上的固定和转移活性： 
在强阴离子交换树脂(MARATHON WBA、陶氏化学公司(Dow ChemicalCompany)制)500mg中加入#375培养液5ml，室温下减压干燥，得到固定化酶。在3-苯基-1-丙醇(25μl)和三辛酸甘油酯(375μl)的混合液中加入固定化酶50mg，进一步添加水(20μl)，40℃下搅拌3日。反应液用HPLC分析，3-苯基-1-丙醇的辛酸酯的生成率为75％。 
[实施例5]#375株的培养上清在疏水性树脂上的固定和转移活性： 
使用FPHA(Diaion、三菱化学公司制)500mg，得到了与实施例4相同的固定化酶。使用此固定化酶50mg，进行与实施例4相同的反应。此时酯的生成率为47％。 
[实施例6]lip32基因全长序列的确定： 
将#375株gDNA用限制酶PstI或NotI酶切后，以通过自我连接而环化的产物为模板，通过引物375-IPC32-F1和引物375-IPC32-R1，使用LATaq(TAKARA BIO)，用98℃ 20秒、68℃ 15分钟(+10秒/循环)x35循环的PCR(反向PCR)扩增旁侧序列。克隆所得到的DNA片段，确定其一部分的碱基序列，与上述获得的碱基序列(序列号：10)连接，获得含有编码LIP32的ORF的基因组DNA序列(序列号：15、图8)及推测氨基酸序列(序列号：16、图8)。 
[实施例7]有关LIP32蛋白质的推测前序列及原序列的探讨： 
分别合成编码LIP32蛋白质的全长氨基酸序列的LIP32-F的扩增用引物LIP32-Full-Nde-F(5’-CATATGAGCTCGTCACGTCGTACCGTCCGCACC-3’)(序列号：17)和LIP32stop-Xho-Rv(5’-CTCGAGTCAGGTGAGCTCGTCGATGAGCAGGTC-3’)(序列号：18)，编码除前序列以外的氨基酸序列的LIP32-M扩增用引物LIP32-Mid-Nco-F(5’-CCATGGCGACCGAGCGGGCGTCGGCGCCCACG-3’)(序列号：19)和LIP32stop-Xho-Rv，编码除前-原序列以外的氨基酸序列的LIP32-S扩增用引物LIP32-sht-Nco-F(5’-CCATGGGCGACGCACCGGCATACGAACGCTAT-3’)(序列号：20)和LIP32stop-Xho-Rv。将以#375株gDNA为模板、通过使用各个引物组(Primer Set)的PCR扩增的DNA片段，克隆到pCR4Blunt-TOPO载体 (invitrogen公司制)中，确认碱基序列。将用限制酶NdeI和XhoI(LIP32-F)或NcoI和XhoI(LIP32-M，-S)切出的各lip32基因片段，整合进大肠杆菌表达用载体pET22b(+)(Novagen)的同一限制酶识别位点，分别作为pETLIP32-F、pETLIP32-M、pETLIP32-S载体(图9)。 
将各大肠杆菌在LB培养基中振荡培养到OD600约为0.6后，添加IPTG使其最终浓度为1mM。进一步通过3小时的振荡培养表达诱导LIP32蛋白质。上述大肠杆菌悬浮液的各脂肪酶活性如下测定。 
即制备混和20μl稀释过的大肠杆菌悬浮液和180μl的底物溶液[0.1mMMU-C8，50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)，1％DMF]的反应溶液(200μl)，37℃下用微孔板式荧光酶标仪(SPECTRAmax GEMINI XS)(Molecular Devices)测定20min内荧光强度的变化。1Unit(1MU)是1L样品在1min内通过水解1μmol的MU而游离的活性。分析结果如下表所示。 
表6 
各LIP32表达大肠杆菌悬浮液的脂肪酶活性 
Figure DEST_PATH_G42161462150138000D000061
此结果表明，为使LIP32蛋白质的活性表达，需切断推测前序列及原序列。 
[实施例8]lip40基因的克隆： 
对于分子量40kDa的脂肪酶，从SDS-PAGE中切出条带，通过胰蛋白酶酶切后，通过反相HPLC进行片段肽的分离。从任意峰值的肽中，加上上述得到的氨基酸序列(序列号：3、序列号：14)中，获得以下的氨基酸部分序列。 
GPDSVPGTAGATTVT(N末端)(序列号：3)…参照实施例1 
LSTNVGPTHLGG          (序列号：14)…参照实施例1 
APWFGLGAR             (序列号：21) 
QLAESVTEYE            (序列号：22) 
GYAVAFTDYQ            (序列号：23) 
氨基酸部分序列中，作为相对于序列号：23的正义链和相对于序列号：14的3～12的反义链的简并引物，分别合成了的引物LIP40-9(GGNTAYGCNGTNGCNTTYACNGAYTAYCA)(序列号：24)和引物LIP40-5(CCNCCNARRTGNGTNGGNCCNACRTTNGT)(序列号：25)的寡聚DNA。 
以100ng #375的基因组DNA为模板，LA Taq with GC buffer(TAKARA BIO)使用GC buffer II，分别使引物LIP40-9和引物LIP40-5的最终浓度为10mM，添加LA Taq 0.2unit使总量为20μl，进行94℃ 1分钟、(94℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃ 2分钟)的40循环、72℃ 5分钟的PCR。将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析时，因确认出约0.7kb的DNA片段，所以从凝胶切出，通过GFX试剂盒(Amersham)精制，用TOPO-TA克隆试剂盒(invitrogen)克隆。为确定经克隆化的DNA的碱基序列，获得部分碱基序列(序列号：28的932～1571)。其次，为克隆lip40基因的全长，进行反向PCR(inverse PCR)。将#375基因组DNA用限制酶NotI完全酶切后，进行自我连接。以其为模板，使用引物LIP40-13(gacgcggttcatgtaggtgtgcgtcc)(序列号：26)和LIP40-14(gtgcgccaagggcgccaacgtccgcc)(序列号：27)，用LA Taq with GC buffer(TAKARA BIO)进行PCR。 
所得到的7kb的DNA片段用TOPO-TAcloning Kit(invitrogen)克隆，确定了两端开始的碱基序列。将得到的碱基序列与上述得到的碱基序列连接，得到序列号：28的碱基序列。ORF分析，从LIP40的部分氨基酸序列等中，认为LIP40由414bp～1688bp的ORF编码。该ORF编码由424氨基酸残基组成的蛋白质(序列号：29、LIP40氨基酸序列)。因精制蛋白质的N末端氨基酸序列(序列号：3)与序列号：29(LIP40氨基酸序列)的第29位开始的序列一致，所以认为序列号：29的第1～第28位的肽是分泌信号(图10)。 Unit(1MU)是1L样品在1min内通过水解1μmol的MU而游离的活性。 
LIP40氨基酸序列显示出与来自Janibacter sp.HTCC2649的假定蛋白(hypothetical protein)(gi_84498087)有72.9％的同一性(identity)。 
[实施例9]40kDa脂肪酶基因向大肠杆菌中的导入和脂肪酶活性： 
[通过大肠杆菌表达***的LIP40蛋白质的制备] 
以#375的基因组DNA为模板，使用引物L40EcoRI-F1(GAATTCGGGACCGGACTCCGTGCCCGGCAC)(序列号：30)或引物L40NdeI-F3(CATATGACGTCAGCACTGCTCCGACGAGCCCTCGC)(序列号：31)、和引物L40HindIII-R1(AAGCTTCTAGACGGCCCAGCAGTTGCTGAG)(序列号：32)，用LA Taq with GC buffer进行PCR反应。将扩增后约1.2kbp的DNA片段使用TOPO-TA cloning Kit克隆确认碱基序列，获得质粒pCR-375LIP40P和质粒pCR-375LIP40S。将质粒pCR-375LIP40P用EcoRI和HindIII酶切，质粒pCR-375LIP40S用NdeI和HindIII酶切，与将大肠杆菌表达用载体pET22b(+)(Novagen)用EcoRI和HindIII或NdeI和HindIII酶切后的产物使用ligation high(东洋纺)连接，获得质粒pET375L40P和pET375LP40S。 
将用LIP40蛋白质表达载体(质粒pET375L40P和pET375L40S)转化的E.coli的单菌落在含有100μg/ml氨苄青霉素(ampicillin)的LB培养基2ml上接种，进行预培养(＞150rpm，12hr，37℃)。将预培养菌液在含有100μg/ml氨苄青霉素(ampicillin)的加富培养基(Enriched medium)[2％胰蛋白胨(trypton)，1％酵母膏(yeast extract)，0.5％NaCl，0.2％(v/v)甘油(glycerol)，50mM KH2PO4，pH 7.2)50ml中接种，振荡培养(150rpm，25℃)]。菌液达到OD600＝0.6时，添加异丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)(IPTG)，使最终浓度为1.0mM，诱导LIP40蛋白质的表达，再进行振荡培养(150rpm，～4hr，25℃)。 
[LIP40的脂肪酶活性] 
脂肪酶活性，通过制备混和20μl稀释的大肠杆菌培养液(悬浮液)和180μl底物溶液[0.1mM MU-C8或MU-C18，50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)，1％DMF]的反应溶液(200μl)，用微孔板式荧光酶标仪(SPECTRAmax GEMINI XS)(Molecular Devices)测定37℃下20min内的荧光强度的变化来求出。1 Unit(1MU)是1L样品在1min内通过水解1μmol的MU而游离的活性。 
结果如下表所示。 
表7 
大肠杆菌培养液的脂肪酶活性 
Figure DEST_PATH_G42161462150138000D000081
转移活性如下测定。在3-苯基-1-丙醇(10μl)或1-苯基-2-丙醇(10μl)和三辛酸甘油酯(150μl)的混合液中添加大肠杆菌培养液(100μl)，45℃下剧烈搅拌3日使其反应。离心分离反应液，回收上层50μl，加入乙腈50μl，取10μl用HPLC分析。分析条件，色谱柱使用Develosil C30-UG-5(4.6x150mm)(Nomurachemical，Aichi，Japan)，流动相为90％乙腈0.8％TFA，流速1ml/分钟，温度为室温，用各个辛酸酯的生成率表示。 
结果如下表所示。 
表8 
大肠杆菌培养液的转移活性 
Figure DEST_PATH_G42161462150138000D000082
[实施例10]通过大肠杆菌表达***的LIP40蛋白质(LIP40HP)的制备： 
在#375株的LIP40蛋白质中附加6His-tag，为使在大肠杆菌中表达，如下构建载体。以MBI375株的基因组DNA为模板，使用引物375L40 EcoRI-His-F(5’-GAATTCGCACCACCACCACCACCACGGACCGGACTCCGTGCCCGGCAC-3’)(序列：33)和375L40HindIII-R1(5’-AAGCTTCTAGACGGCCCAGCAGTTGCTGAG-3’)(序列号：34)通过PCR扩增后，克隆到pCR2.1TOPO载体上。确认碱基序列后，通过限制酶的EcoRI和HindIII酶切，提取的Lip40基因片段整合进大肠杆菌表达用载体pET22b(+)(Novagen)的同一限制酶识别位点，将其作为pETLIP40HP载体(图11)。将用pETLIP40HP载体转化的E. coli strain BL21(DE3)用于蛋白质表达。 
大肠杆菌中的LIP40HP蛋白质的表达，除IPTG诱导后培养时间变为12小时以外，与LIP32蛋白质用同样的方法进行。LIP40HP蛋白质的精制，用在N-末端融合的6-His-tag的亲和纯化进行。其方法除对实施例3加以若干变更以外，按照与LIP32蛋白质同样的方法进行。变更为(1)将裂解缓冲液(Lysis buffer)、平衡缓冲液(Equilibration buffer)、清洗缓冲液(Wash-1 bufer)变更为共通的缓冲液[500mM NaCl，5mM咪唑(imidazole)，2mM CaCl2，2mM MgCl2，25mM Tris-HCl，pH8.0]，和(2)将洗脱缓冲液(Elution buffer)变更为500mMNaCl，250mM咪唑(imidazole)，2mM CaCl2，2mM MgCl2，25mM Tris-HCl，pH 8.0的2处。 
[实施例11]LIP32PH及LIP40HP的特性： 
[LIP32PH，LIP40HP的最适温度] 
通过混合从大肠杆菌中精制、稀释的酶溶液20μl和预先在测定温度(10，20，25，30，35，40，45，50，60℃)下保温的180μl底物溶液(0.1mM MU-C8，1％DMF，50mM Tris-HCl，pH 7.0)开始反应。活性通过经时测定各种测定温度下的反应中MU荧光的强度变化来求出。 
活性测定的结果，LIP32PH(用实施例3获得)的最适温度为40℃，LIP40HP的最适温度为45℃-50℃(图12)。 
[LIP32PH，LIP40HP的最适pH值] 
通过混合从大肠杆菌中精制、稀释的酶溶液20μl和预先在37℃下保温的180μl底物溶液(0.1mM MU-C8，1％DMF，50mM各种pH值的缓冲液)开始反应。活性通过经时测定37℃下20分钟内的反应中MU荧光的强度来求出。各pH值 的缓冲液，使用50mM乙酸钠-乙酸缓冲液(Sodium acetate-acetic acid)(pH 4.0-6.0)、50mM MES-NaOH(pH 5.5-7.0)及50mM Tris-HCl(pH 6.5-9.0)。 
活性测定的结果，LIP32PH，LIP40HP的最适pH值均在pH值7.0左右(图13)。 
[实施例12]通过LIP40HP固定化酶向虾青素的脂肪酸转移反应： 
通过LIP40HP，从三辛酸甘油酯(MCT)向虾青素的脂肪酸转移反应中使用LIP40HP的固定化酶。LIP40HP固定化酶(WBA-LIP40HP)的制备，是在强阴离子交换树脂[MARATHON WBA、陶氏化学公司(Dow Chemical Company)制]50mg中加入IP40HP(约3.65ng/μl)500μl，搅拌2小时(1000rpm，10℃)后，室温下减压干燥来进行。 
转移反应，通过在1.25mg的虾青素(和光纯药)和MCT(125μl)的混合液中依次添加WBA-LIP40HP(50mg)和H2O(6.25μl)，在45℃下静置3日来进行。反应液中加入100μl的丙酮，搅拌、离心分离后回收上层100μl，取20μl用HPLC分析。分析条件，色谱柱：Develosil C30-UG-5(野村化学株式会公司制、4.6×150mm)，流动相：75-100％丙酮、1-15分梯度洗脱，流速1.0ml/min，分析温度：室温，检测波长：480nm。转移活性，以保留时间16.4分钟为指标的虾青素的酯的生成率求出。分析结果，虾青素的辛酸酯的生成率为2.25％(图14)。且作为对照，使用了同样制备的WBA-pET22b的反应中，未发现虾青素的辛酸酯的生成(图14)。 
[实施例13]通过LIP40HP向儿茶素的脂肪酸转移反应 
通过LIP40，从三辛酸甘油酯(MCT)向儿茶素的脂肪酸转移反应，通过在100μl的儿茶素溶液(0.01mg/μl)和150μl MCT的混合液中加入50μlLIP40HP酶溶液(1.0μg/μl)，45℃下搅拌2日来进行。离心分离反应液，回收油层，加入等量的乙腈，取10μl用HPLC分析。分析条件，色谱柱：DevelosilC30-UG-5(野村化学株式会公司制、4.6×150mm)，流动相：(A)0.1％TFA，(B)90％乙腈、0.08％TFA，梯度条件5％B液→100％B液/5分钟，流速1.0ml/min，分析温度：室温，检测波长：280nm。转移活性，以保留时间8.4分钟为指标的儿茶素的酯的生成率求出。分析结果，儿茶素的辛酸酯的生成率为38.70％(图15)。 且作为对照，使用了同样制备的pET22b的反应中，未发现儿茶素的辛酸酯的生成(图15)。 
Figure IYZ000004216146300011
Figure IYZ000004216146300021
Figure IYZ000004216146300031
Figure IYZ000004216146300041
Figure IYZ000004216146300051
Figure IYZ000004216146300061
Figure IYZ000004216146300071
Figure IYZ000004216146300081
Figure IYZ000004216146300091
Figure IYZ000004216146300101
Figure IYZ000004216146300111
Figure IYZ000004216146300121
Figure IYZ000004216146300131
Figure IYZ000004216146300151
Figure IYZ000004216146300171
Figure IYZ000004216146300181
Figure IYZ000004216146300191
Figure IYZ000004216146300201
Figure IYZ000004216146300211
Figure IYZ000004216146300221
Figure IYZ000004216146300241
Figure IYZ000004216146300251
Figure IYZ000004216146300261
Figure IYZ000004216146300271
Figure IYZ000004216146300281
Figure IYZ000004216146300291
Figure IYZ000004216146300321
Figure IYZ000004216146300331
Figure IYZ000004216146300341
Figure IYZ000004216146300351
Figure IYZ000004216146300361
Figure IYZ000004216146300371
Figure IYZ000004216146300381
Figure IYZ000004216146300391
Figure IYZ000004216146300401

Claims (11)

1.下述(A1)或(E1)所述的多核苷酸：
(A1)多核苷酸，其由序列号：10中记载的碱基序列的全部或25～801位的碱基序列组成；
(E1)多核苷酸，其编码序列号：11中记载的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.下述(A2)或(E2)所述的多核苷酸：
(A2)多核苷酸，其由序列号：15中记载的碱基序列的全部或247～1167位的碱基序列或388～1164位的碱基序列组成；
(E2)多核苷酸，其编码由序列号：16中记载的氨基酸序列的全部或48～306位的氨基酸序列组成的蛋白质。
3.权利要求1或2所述的多核苷酸，其来自Tetrasphaera属。
4.载体，其包含权利要求1～3中任一项所述的多核苷酸。
5.转化体，其由权利要求4中所述的载体转化。
6.蛋白质，其由序列号：11中记载的氨基酸序列组成。
7.蛋白质，其由序列号：16中记载的氨基酸序列的全部或48～306位的氨基酸序列组成。
8.权利要求6或7所述的蛋白质，其被固定于树脂上。
9.中链脂肪酸的转移方法，其特征在于，使用权利要求6～8中任一项所述的蛋白质。
10.中链脂肪酸酯的制造方法，其特征在于，使用权利要求6～8中任一项所述的蛋白质。
11.权利要求10中所述的制造方法，其是多酚与中链脂肪酸形成的酯、或类胡萝卜素与中链脂肪酸形成的酯的制造方法。
CN2006800460085A 2005-12-09 2006-12-08 新型脂肪酶 Expired - Fee Related CN101326283B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005356936 2005-12-09
JP356936/2005 2005-12-09
PCT/JP2006/324598 WO2007066779A1 (ja) 2005-12-09 2006-12-08 新規リパーゼ

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011103625792A Division CN102382848B (zh) 2005-12-09 2006-12-08 新型脂肪酶

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101326283A CN101326283A (zh) 2008-12-17
CN101326283B true CN101326283B (zh) 2013-07-10

Family

ID=38122925

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011103625792A Expired - Fee Related CN102382848B (zh) 2005-12-09 2006-12-08 新型脂肪酶
CN2006800460085A Expired - Fee Related CN101326283B (zh) 2005-12-09 2006-12-08 新型脂肪酶

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011103625792A Expired - Fee Related CN102382848B (zh) 2005-12-09 2006-12-08 新型脂肪酶

Country Status (10)

Country Link
US (2) US7893232B2 (zh)
EP (2) EP2020441B1 (zh)
JP (2) JP5306593B2 (zh)
KR (2) KR101337769B1 (zh)
CN (2) CN102382848B (zh)
AT (1) ATE510918T1 (zh)
AU (1) AU2006323695B2 (zh)
CA (2) CA2633847C (zh)
DK (2) DK1964917T3 (zh)
WO (1) WO2007066779A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010065455A2 (en) * 2008-12-01 2010-06-10 Danisco Us Inc. Enzymes with lipase activity
JP6363326B2 (ja) * 2013-03-11 2018-07-25 株式会社コーセー 酵母・細菌共通培養方法およびこれに用いる酵母・細菌共通培養培地
WO2014140167A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Dsm Ip Assets B.V. Cell wall deconstruction enzymes of malbranchea cinnamomea and uses thereof
WO2014140165A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Dsm Ip Assets B.V. Cell wall deconstruction enzymes of paecilomyces byssochlamydoides and uses thereof
CN105349506A (zh) * 2015-11-18 2016-02-24 中国科学院南海海洋研究所 一种脂肪酶lipaseb5及其编码基因和应用
CN116064471B (zh) * 2022-09-30 2024-05-31 中国海洋大学 脂肪酶OUC-Lipase17及其在制备游离虾青素中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001016303A2 (de) * 1999-08-27 2001-03-08 Bayer Aktiengesellschaft Nucleinsäuren, die für enzymaktivitäten der spinosyn-biosynthese codieren
JP2002159290A (ja) * 2000-11-27 2002-06-04 Hiroshima Industrial Technology Organization 新規リパーゼおよびその製造方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3079276B2 (ja) * 1988-02-28 2000-08-21 天野製薬株式会社 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
JP3032390B2 (ja) * 1991-11-08 2000-04-17 ダイセル化学工業株式会社 シュードモナス エスピー ｓ１０−０７１株及び該微生物の生産するリパーゼ
DK1748074T3 (da) 2003-01-17 2012-03-05 Danisco Fremgangsmåde til in situ-fremstilling af en emulgator i en fødevare

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001016303A2 (de) * 1999-08-27 2001-03-08 Bayer Aktiengesellschaft Nucleinsäuren, die für enzymaktivitäten der spinosyn-biosynthese codieren
JP2002159290A (ja) * 2000-11-27 2002-06-04 Hiroshima Industrial Technology Organization 新規リパーゼおよびその製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JP特开平5304949A 1993.11.19

Also Published As

Publication number Publication date
DK2020441T3 (da) 2011-07-25
CA2633847C (en) 2015-03-31
CN102382848A (zh) 2012-03-21
US20110217768A1 (en) 2011-09-08
JP2007181456A (ja) 2007-07-19
EP2020441B1 (en) 2011-05-25
KR20130028797A (ko) 2013-03-19
CN102382848B (zh) 2013-07-31
CN101326283A (zh) 2008-12-17
KR101337769B1 (ko) 2013-12-06
ATE510918T1 (de) 2011-06-15
CA2633847A1 (en) 2007-06-14
EP2020441A1 (en) 2009-02-04
WO2007066779A9 (ja) 2008-10-23
AU2006323695B2 (en) 2012-03-29
EP1964917B1 (en) 2013-02-20
US20100075380A1 (en) 2010-03-25
DK1964917T3 (da) 2013-05-13
KR20080085017A (ko) 2008-09-22
US8207320B2 (en) 2012-06-26
JP2012165749A (ja) 2012-09-06
CA2800283C (en) 2015-04-07
CA2800283A1 (en) 2007-06-14
WO2007066779A1 (ja) 2007-06-14
JP5635554B2 (ja) 2014-12-03
US7893232B2 (en) 2011-02-22
EP1964917A4 (en) 2009-06-24
JP5306593B2 (ja) 2013-10-02
KR101302283B1 (ko) 2013-09-06
AU2006323695A1 (en) 2007-06-14
EP1964917A1 (en) 2008-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Singh et al. Overview of fungal lipase: a review
Soliman et al. Molecular cloning and characterization of thermostable esterase and lipase from Geobacillus thermoleovorans YN isolated from desert soil in Egypt
Hasan et al. Industrial applications of microbial lipases
CN101326283B (zh) 新型脂肪酶
CN106191004A (zh) 一种米曲霉脂肪酶、编码基因、载体、工程菌及其应用
Saengsanga et al. Molecular and enzymatic characterization of alkaline lipase from Bacillus amyloliquefaciens E1PA isolated from lipid-rich food waste
KR100803093B1 (ko) 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 및 이를 이용한광학순도 에폭사이드의 제조방법
Chiş et al. Molecular cloning and characterization of a thermostable esterase/lipase produced by a novel Anoxybacillus flavithermus strain
Ma et al. In vivo functional expression of an extracellular Ca 2+-independent Bacillus pumilus lipase in Bacillus subtilis WB800N
CN103952385A (zh) 一种来源于海洋放线菌的热稳定脂肪酶及其应用
WANG et al. Cloning and sequence analysis of a novel cold-adapted lipase gene from strain lip35 (Pseudomonas sp.)
Bhardwaj et al. Influence of culture conditions on the production of extracellular esterase from Bacillus licheniformis and its characterization
Kudanga et al. Esterases and putative lipases from tropical isolates of Aureobasidium pullulans
WO2007043777A1 (en) Enantioselective epoxide hydlrolase and method for preparing an enantiopure epoxide using the same
KR101734935B1 (ko) 메타게놈 라이브러리로부터 유래한 신규 지질분해효소 및 그의 생산 방법
JP2017060424A (ja) リパーゼ、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、リパーゼの製造法、グリセロ脂質を加水分解する方法及びグリセロ脂質の加水分解物を製造する方法
KR101715817B1 (ko) 메타게놈 라이브러리로부터 유래한 신규 지질분해효소 및 그의 생산 방법
Booncharoen Genome, physicochemical properties and esterase gene cloning of novel lentibacillus and halobacillus species
Borkar LIPASE: ITS CHARACTERIZATION, PRODUCTION AND IMMOBILIZATION ON MODIFIED ORGANIC SUPPORT
KR100575211B1 (ko) Ｍ37 리파제, 이를 생산하는 포토박테리움속 ｍ37 균주 및상기 효소의 대량 생산방법
Yuan et al. Screening and characterization of a thermostable lipase from marine Streptomyces sp. strain
KR20110118002A (ko) 고온성 에스터라제 및 그 용도

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: SUNTORY HOLDINGS CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: SUNTORY LTD.

Effective date: 20090619

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20090619

Address after: Osaka Japan

Applicant after: Suntory Holdings Limited

Address before: Osaka Japan

Applicant before: Suntory Ltd.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20130710

Termination date: 20171208