발명의 개시
본 발명의 목적은, 심혈관 및 뇌혈관 질환의 치료를 위한, 약용 식물의 생물활성 부분 및 그의 조제물을 포함하는 보다 효과적이며 사용하기 용이한 조성물을 제공하는 것으로, 이는 병용 투여를 위한 임상적인 요건을 만족시킬 수 없는 약용 식물의 생물학적 활성을 가지는 단일 부분을 기본으로 하는 중국 전통의 특허 약재의 결점을 극복할 수 있으며, 단순한 약물 혼합과 관련된 잠재적인 부작용을 피할 수 있다.
본 발명은 아래에 개괄된 바와 같이 이행될 수 있다:
본 발명의 약학적 조성물은 단삼(Salviae Miltiorrhizae Radix) 추출물, 삼칠(Notoginseng Radix) 추출물, 황기(Astragali Radix) 추출물 및 용뇌 또는 강진향(Dalbergiae odoriferae lignum)의 오일을 포함한다.
본 발명의 바람직한 예로, 본 발명의 조성물은 5.0% - 70.0%의 단삼 추출물, 10.0% - 85.0%의 삼칠 추출물, 5.0% - 70.0%의 황기 추출물 및 1.0% - 15.0%의 용뇌 또는 강진향 오일을 포함한다.
본 발명의 더 바람직한 예로, 본 발명의 조성물은 15.0% - 50.0%의 단삼 추출물, 25.0% - 65.0%의 삼칠 추출물, 15.0% - 50.0%의 황기 추출물, 및 2.0% - 12.0%의 용뇌 또는 강진향 오일을 포함한다.
본 발명의 보다 더 바람직한 예로, 본 발명의 조성물은 20.0% - 30.0%의 단삼 추출물, 30.0% - 55.0%의 삼칠 추출물, 20.0% - 30.0%의 황기 추출물, 및 4.0% - 10.0%의 용뇌 또는 강진향 오일을 포함한다.
본 발명의 보다 더 바람직한 예로, 본 발명의 조성물은 23%의 단삼 추출물, 45.0%의 삼칠 추출물, 23%의 황기 추출물, 및 9%의 용뇌 또는 강진향 오일을 포함한다.
본 발명에 따른 조성물의 보다 더 바람직한 예로, 상기 단삼 추출물은 45% - 70%의 살비아놀산 B, 2% - 10%의 살비아놀산 E, 4% - 20%의 로즈마린산, 1% - 10%의 리토스페름산(lithospermic acid) 및 70% 이상의 살비놀산류를 포함한다.
본 발명에 따른 조성물의 보다 더 바람직한 예로, 상기 삼칠 추출물은 2% - 10%의 노토진세노사이드 R1, 2% - 6%의 진세노사이드 Re, 15% - 40%의 진세노사이드 Rg1, 15% - 40%의 진세노사이드 Rb1, 5% - 12%의 진세노사이드 Rd, 및 70% 이상, 바람직하기로는 80% 이상의 삼칠 사포닌류이다.
본 발명의 조성물에 대한 보다 더 바람직한 예로, 상기 황기 추출물은 5% - 15%의 아스트라갈로사이드(astragaloside) I 및 70% 이상의 황기 사포닌류를 포함한다.
본 발명의 조성물에 대한 보다 더 바람직한 예로, 상기 단삼 추출물은 80% 이상의 살비놀산류를 포함하며, 상기 삼칠 추출물은 80% 이상의 삼칠 사포닌류를 포함하며, 상기 황기 추출물은 80% 이상의 황기 사포닌류를 포함한다.
본 발명의 조성물에 대한 보다 더 바람직한 예로, 본 발명의 조성물은 주사제, 정제, 서방성 정제, 드롭 환제, 과립제, 주사용 분말제, 캡슐제 및 미세과립제이다.
보다 더 바람직한 예로, 본 발명의 조성물은 주사제 또는 주사용 분말제이다.
본 발명의 조성물은 심혈관 질환 및 뇌혈관 질환의 치료에 사용된다.
전술한 약학적 조성물의 단삼 추출물은, 종래 기술에 따라 제조할 수 있으며, 예컨대 중국 특허 출원 CN1352985A, CN1247855A, CN1242364A, CN1384090A, CN1459448A 및 Guo Ying et al., The Journal of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, 2001, 24(4): 6에 게시된 방법에 따라 제조할 수 있다. 또한 상기 방법에 적절한 수정이 가미된 유사 방법으로 수득할 수 있다.
본 발명의 단삼 추출물은 45% - 70%의 살비아놀산 B, 2% - 10%의 살비아놀산 E, 4% - 20%의 로즈마린산, 1% - 10%의 리토스페름산, 및 70% 이상의, 바람직하기로는 80% 이상의 살비놀산류를 포함한다. 단삼 추출물의 제조 방법과는 별도로, 본원에서 기재된 "단삼 추출물"이라는 표현은 추출물의 함량이 나열된 범위에 포함되는 것을 의미하며, 이를 위해, 성분들의 함량 요건을 충족시키기 위해 조 추출물은 농축과 같이 추가적으로 정제될 수 있다. 상기 성분 및 이의 함량은 각각 다음과 같이 특정화되고 결정될 수 있다:
1. 단삼 추출물내 살비아놀산 B, 살비아놀산 E, 로즈마린산, 및 리토스페름산의 함량 결정(HPLC)
a. 크로마토그래피 조건
필터: 옥타데실실릴-실리카 겔; 이동상: 아세토니트릴-물-인산(23.5: 76.5: 0.02); 검출 파장: 288 nm.
이론 단수(Theoretic plates)는 5000 보다 낮지 않으며, 살비아놀산 B 피크를 토대로 계산한다.
b. 대조군 용액의 준비
0.2 mg/ml의 살비아놀산 B 대조군 용액은, 대조군 샘플을 이동상과 혼합하여 준비하였으며, 이와 동일하게 0.02 mg/ml 살비아놀산 E 대조군 용액, 0.05 mg/ml의 로즈마린산 대조군 용액, 및 0.01 mg/ml의 리토스페름산 대조군 용액을 준비한다.
c. 샘플 용액의 준비
35 mg의 단삼 추출물을 25 ml의 측정용 병에서 정확하게 칭량한다. 상기 병에 이동상을 첨가하여 샘플을 용해시킨다. 얻어지는 용액은 교반하면서 이동상을 가하여 25 ml로 더욱 희석한다. 샘플 용액 5 ml을 25 ml 측정용 병에 넣고, 상기 병에 이동상을 가하여 25 ml로 만든 다음 얻어지는 용액을 교반하여 잘 혼합한다.
d. 분석 과정
각 대조군 용액 및 샘플 용액으로부터 10 ㎕을 취하여 각각 액체 크로마토그래피로 분석한다.
2. 상기 단삼 추출물내 살비놀산류 분석(분광광도계)
a. 대조군 용액의 준비
20 ㎕/ml의 살비아놀산 B 용액은 샘플을 아세토니트릴-물-인산(23.5: 76.5: 0.02) 혼합물과 혼합하여 준비한다.
b. 샘플 용액의 준비
25 mg의 단삼 추출물을 50 ml의 측정용 병에서 정확하게 칭량한다. 상기병에 아세토니트릴-물-인산(23.5: 76.5: 0.02) 혼합물을 첨가한다. 얻어지는 용액은 교반하면서 상기 용액을 가하여 25 ml로 희석시킨다. 샘플 용액 2 ml을 50 ml의 측정용 병에 넣는다. 상기 혼합물을 첨가하여 25 ml로 만들고 얻어지는 용액은 교반하여 완전히 혼합한다.
c. 분석 과정
블랭크로 아세토니트릴-물-인산(23.5: 76.5: 0.02) 혼합물을 취하고, 분광광도계(China Pharmacopoeia, edition 1995, volume 1, appendix VA)에서 288 nm 파장하에 대조군 용액 및 샘플 용액의 흡광도를 각각 측정한다. 계산은 아래 식으로 실시한다:
살비놀산류(%) = f(A-B) + B
상기에서, f는 0.626이고, 보정 계수; A는 살비아놀산 B에 대한 분광광도계로 분석한 살비놀산류의 함량이며, B는 HPLC로 분석한 살비아놀산 B의 함량이다.
3. 상기 단삼 추출물의 HPLC 핑거프린트 스펙트럼
분석 방법에서, 상기 (1)의 살비아놀산 B 및 E, 로즈마린산, 리토스페름산의 분석과 관련된 내용을 참조한다. 기록 시간은 60분이다.
모든 공통된 핑거프린트 피크들에서, 비교적 크고 안정적인 피크 부위를 나타내는 공통된 피크인 살비아놀산 B를 대조 피트로서 선택한다. 상대적 체류 시간 및 상대적인 피크 면적은, 대조 피크의 체류 시간 및 피크 면적에 대해 계산한다. 상기 단삼 추출물의 핑거프린트에서 5-7개의 공통 피크가 나타나며, 일반적으로는 6개의 공통 피크가 있다. 상기 6개의 공통 피크의 상대적인 체류 시간은 0.55 - 0.65 (살비아놀산 E 피크), 0.66 - 0.70 (로즈마린산 피크), 0.71 - 0.79 (리토스페름산 피크), 1 (살비아놀산 B 피크), 1.03 - 1.12, 1.21 - 1.30 순이다. 모든 공통 피크들중, 대조 피크인 살비아놀산 B 피크만이 20 % 보다 높은 총 피크 면적에 대한 단일 피크 면적 비를 가진다. 살비아놀산 B의 피크 면적은 총 피크 면적의 57% - 87%이며, 상대적인 피크 면적은 1이다. 상대적인 체류 시간이 0.66 - 0.70인 로즈마린산 공통 피크의 면적은 총 피크 면적의 3% - 18%이며, 상대적인 피크 면적은 0.03 - 0.25이다. 비공통 피크의 총 피크 면적은 총 피크 면적의 10% 미만이다.
상기 약학적 조성물의 삼칠 추출물은 종래 기술에 따라, 예컨대 중국 특허 ZL1095363C, 중국 특허 출원 CN1352985A, Qian Tianxiang et al., Foreign Medical Sciences, Plant Medicine Section, 1997, 12(4)), Tang Diguang, The journal of Chinese Traditional Patent Medicine, 1990, 12(8): 5, The Standard of Public Health Ministry of China WS3-B-3590-2001 (z)에 개시된 방법에 따라 제조할 수 있다. 또한 상기 방법에 적절한 수정이 가미된 유사 방법으로 수득할 수 있다. 또한 삼칠 추출물은, 예컨대 95% (UV로 측정) 삼칠 사포닌류 (Rb1 > 30%, Rg1 > 20%, R1 > 15%, HPLC로 측정)를 포함하는 추출물 형태로, 상업적으로 구입가능하다.
본 발명의 삼칠 추출물은 2% - 10%의 노토진세노사이드 R1, 2% - 6%의 진세노사이드 Re, 15% - 40%의 진세노사이드 Rg1, 15% - 40%의 진세노사이드 Rb1, 5% - 12%의 진세노사이드 Rd, 및 70% 이상의, 바람직하기로는 80% 이상의 삼칠 사포닌류를 포함한다. 삼칠 추출물의 제조 방법과는 무관하게, 본원에 기재된 "삼칠 추출물"이라는 표현은 추출물의 함량이 나열된 범위에 포함되는 것을 의미하며, 이를 위해, 성분들의 함량 요건을 충족시키기 위해 조 추출물은 농축과 같이 추가적으로 정제될 수 있다. 상기 성분 및 이의 함량은 각각 다음과 같이 특정화되고 결정될 수 있다:
1. 삼칠 추출물내 진세노사이드 Re, 진세노사이드 Rd, 노토진세노사이드R1, 진세노사이드 Rg1, 및 진세노사이드 Rb1의 함량 결정(HPLC)
a. 크로마토그래피 조건 및 시스템 적합성 평가
필터: 옥타데실실릴-실리카 겔; 컬럼 온도: 40 ℃; 유속: 0.7 ml/min; 검출 파장: 203 nm; 이동상의 농도 구배는 다음과 같다:
시간 |
물 |
아세토니트릴 |
0 |
70 |
30 |
10 |
70 |
30 |
30 |
10 |
90 |
b. 대조군 용액의 준비:
0.2 mg/ml의 진세노사이드 Re 대조군 용액은, 대조군 샘플을 메탄올과 혼합하여 준비하였으며, 이와 동일하게 0.4 mg/ml의 진세노사이드 Rd 대조군 용액, 0.2 mg/ml의 진세노사이드 R1 대조군 용액, 0.4 mg/ml의 노토진세노사이드 Rg1 대조군 용액 및 0.4/ml의 진세노사이드 Rb1 대조군 용액을 각각 준비하였다.
c. 샘플 용액의 준비:
20 mg의 삼칠 추출물을 50 ml의 측정용 병에서 정확하게 칭량한다. 상기 병에 이동상을 첨가하여 샘플을 용해시킨다. 얻어지는 용액은 교반하면서 이동상을 가하여 50 ml로 더욱 희석한다.
d. 분석 과정
각 표준 용액 및 샘플 용액 10 ㎕을 취하여 각각 HPLC 시스템에 주입하여 분석한다. 본 발명의 삼칠 추출물의 HPLC 스펙트럼을 구한다.
(1) 상기 삼칠 추출물내 삼칠 사포닌류의 분석(분광광도계)
(2) 삼칠 추출물의 HPLC 핑거프린트 스펙트럼
분석 방법은 전술한 HPLC에 의한 진세노사이드 Re, 진세노사이드 Rd, 진세노사이드 R1, 노토진세노사이드 Rg1 및 진세노사이드 Rb1 분석을 개시한 내용을 참조한다. 기록 시간은 30분이다.
모든 공통 핑거프린트 피크들 중, 비교적 크고 안정된 피크 면적을 나타내는 진세노사이드 Rg1 피크를 대조 피크로 선택한다. 상대적 체류 시간 및 상대적인 피크 면적은 대조 피크의 체류 시간 및 피크 면적에 대해 계산한다. 삼칠 추출물의 핑거프린트 스펙트럼에서는, 9 - 12개의 공통 피크가 나타나며, 전형적으로 11개의 공통 피크가 있다. 11개의 공통 피크의 상대적인 체류 시간은 0.77 - 0.85 (노토진세노사이드 R1 피크), 0.87 - 0.97 (진세노사이드 Re 피크), 1 (진세노사이드 Rg1 피크, 즉 대조 피크), 2.58 - 2.67, 0.68 - 2.76, 2.77 - 2.81, 2.82 - 2.91 (진세노사이드 Rb1 피크), 2.95 - 3.03, 3.05 - 3.13, 3.15 - 3.22 (진세노사이드 Rd 피크), 3.24 - 3.91의 순이다. 모든 공통 피크들 중, 진세노사이드 Rg1 피크와 진세노사이드 Rb1 피크만 20% 보다 높은 총 피크 면적에 대한 단일 피크 면적 비를 가진다. 대조 피크인 진세노사이드 Rg1 피크는 총 피크 면적의 20% - 35%이며, 상대적인 피크 면적은 1이다. 진세노사이드 Rb1 피크는 총 피크 면적의 30% - 50%이고, 상대적인 피크 면적은 0.85-2.50이다. 노토진세노사이드 R1의 피크는 총 피크 면적의 2% - 8%이고, 상대적인 피크 면적은 0.06 - 0.40이다. 진세노사이드 Rd 피크는 총 피크의 5% - 14%이고, 상대적인 피크 면적은 0.14 - 0.70이다. 비공통 피크의 총 피크 면적은 총 피크 면적의 10% 미만이다.
전술한 약학적 조성물의 황기 추출물은 종래 방법, 예컨대 중국 특허 CN1096269C, Yu Hao et al., West China Journal of Pharmaceutical Sciences, 1993, 8(3):163, Teng Xinglong et al., Heilongjiang Medical Journal, 2002, 15(5): 340, Wang Zhijie et al., Journal of Zhejiang College of Traditional Chinese Medicine, 2001, 25(5): 43에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다. 또한, 적절한 수정이 가미된 유사한 방법으로 수득할 수 있다. 또한, 황기 추출물은 예컨대, 80% - 98% (UV로 측정)의 황기 추출물을 포함하는 추출물 형태로서, 상업적으로 구입가능하다.
본 발명의 황기 추출물은 5% - 15%의 아스트라갈로사이드 I 및 70% 초과의 황기 사포닌류 또는 바람직하기로는 80% 초과의 황기 사포닌류를 포함한다. 황기 추출물의 제조방법과는 무관하게, 본원에 기재된 "황기 추출물"이라는 표현은 추출물의 함량이 나열된 범위에 포함되는 것을 의미하며, 이를 위해, 성분들의 함량 요건을 충족시키기 위해 조 추출물은 농축과 같이 추가적으로 정제될 수 있다.
전술한 조성물에 사용된 용뇌는 천연적으로 형성되거나 합성된 것일 수 있다.
전술한 조성물에 사용된 강진향 오일은 강진향의 증류에 의해 수득할 수 있다.
본 발명의 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 보강제를 조합하여 여러가지 투여 형태로 제형화할 수 있다. 상기 보강제로는, 전분, 덱스트리, 락토스, 미세결정 셀룰로스(아비셀, avicel), 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스(HPMC), 폴리에틸렌 글리콜, 마그네슘 스테아레이트, 마이크로 실리콘 겔, 자일리톨, 락티톨, 글루코스, 글리신, D-만니톨 등이 있으나, 그에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 주사제, 정제, 서방성 정제, 드롭 환제, 과립제, 주사용 분말제, 캡슐제, 미세과립제 등의 형태를 취할 수 있다. 정제, 드롭 환제, 주사용 분말제 및 캡슐제가 바람직하다. 본 발명의 조성물이 주사제 또는 주사용 분말로 제형화되는 경우, 살비놀산류, 삼칠 사포닌류 및 황기 사포닌류의 총 함량은 80% 이상이 바람직하다.
본 발명의 조성물의 재료는 쉽게 입수가능하며, 따라서 본 발명에 따른 조성물의 상업적 생산이 용이하다. 본 발명은 원하는 여러가지 형태로 제형화할 수 있으며, 임상적 적용을 위해 보다 간편하고, 효율적이며 고품질로 조절된 현대 중국 전통의 특허 약재를 제공한다.
본 발명은 철(III) 클로라이드 헥사하이드레이트를 중간 대뇌동맥에 국소 적용에 의해 초래된 국소 대뇌 허혈 모델을 이용하고, 신경학적 증상과 뇌 경색 부위를 결정함으로써, 본 발명의 조성물: 살비놀산류 + 삼칠 사포닌류 + 브로네올 또는 강진향 오일; 살비놀산류 + 삼칠 사포닌류; 살비놀산류 및 삼칠 사포닌류의 항-대뇌 허혈 효과를 비교한다. 그 결과, 본 발명의 조성물이 항-대뇌 허혈에 현저한 효과가 있는 것으로 나타난다. 이의 치료 효과는 단일 살비놀산류 또는 삼칠 사포닌류의 효과에 비해 매우 유의할만한 수준이며, 살비놀산류 + 삼칠 사포닌류와 살비놀산류 + 삼칠 사포닌류 + 용뇌 또는 강진향 오일에 비해 매우 유의한 수준이다. 이러한 결과는 본 발명의 약학적 조성물, 즉 단삼 추출물 + 삼칠 추출물+ 황기 추출물 + 용뇌, 또는 단삼 추출물 + 삼칠 추출물+ 황기 추출물 + 강진향 오일이 유의적인 상승 효과를 가짐을 의미한다.
본 발명의 설명에서, 별도로 언급되지 않는한 모든 백분율은 중량 백분율이다.
실시예 1
단삼 추출물:
단삼 추출물은 중국 특허 출원 CN1459448A에 개시된 방법에 따라 준비하였다. 즉, 5 kg의 단삼을 조분말로 분쇄하고, 어느정도 끓는 조건하에서 100℃의 탈이온수로 3회 추출하였다. 첫번째 추출시, 27.5 kg의 물을 가하여 1시간 가온하고; 두번째 및 세번째 추출시, 15 kg의 물을 가하여 0.5시간동안 가온하였다. 추출물의 산도를 10% HCl로 pH2로 조정한 다음 여과하였다. 여과물은 폴리아미드 수지 컬럼(건조 수지의 양은 조 추출물의 2/3임)에 주입하였다. 컬럼에 컬럼의 5배 부피의 탈이온수를 흘려준 다음 컬럼의 5 부피배의 0.1% NaHCO3 용액을 흘려주었다. 용출물을 수집하였다. 10% HCl로 pH2로 조정한 다음, 용출물을 D101 마크로다공성 흡착 수지에 주입하였다. 수지에서 중성의 용출물이 용리될때까지 탈이온수를 흘려주었다. 이후 컬럼에 95% 에탄올을 흘려주어 용출되는 컬러 밴드를 수집하였다. 수집한 용액은 건조될때까지 감압하에 농축하였다. 건조 물질은 물에 용해하여, 밤동안 냉장고에 보관하였다. 이를 0.3 ㎛의 혼합성 셀룰로스 미세기공 필터 필름에 통과시켜, 살비놀산류의 추출물을 수득하였다. 이를 2% NaOH 용액으로 pH 6.0으로 조정하였고, 즉각 동결건조하여 단삼 추출물의 동결 건조 분말 221 g을 수득하였다. 수율은 조물질인 단삼에 4.4%이다.
수득된 단삼 추출물은 살비아놀산 A, 살비아놀산 B, 살비아놀산 C, 살비아놀산 D, 살비아놀산 E, 살비아놀산 G, 밀티온온(miltionone) I, 로즈마린산, 리토스 페름산, 단센수(danshensu) 등을 포함하고 있었다. 상기 살비아놀산 B는 53.73%였고, 살비아놀산 E는 3.7%였고, 로즈마린산은 5.2%였고, 리토스페름산은 1.7%이며, 살비놀산류는 83.94%이었다. 단삼 추출물의 HPLC 핑거프린트 스펙트럼에서는 6개의 공통 피크가 나타났다(평균 10개의 배치). 이들 6개의 공통 피크의 평균 상대 체류 시간은, 차례대로 0.60 (살비아놀산 E 피크), 0.68 (로즈마린산 피크), 0.73 (리토스페름산 피크), 1(살비아놀산 B 피크), 1.08, 1.26이었다. 공통 피크들중, 대조 피크인 살비아놀산 B 피크만이 총 피브 면적에 대한 단일 피크 면적 비가 20% 보다 높았다. 살비아놀산 B의 피크는 총 피크 면적의 72% (평균)이었고, 이의 상대적인 피크 면적은 1이었다. 로즈마린산의 피크는 총 피크 면적의 10% (평균)이었고, 이의 상대적인 피크 면적은 0.14 (평균)이었다. 총 비공통 피크 면적은 총 피크 면적의 10% 이하였다. 단삼 추출물의 HPLC 핑거프리트 스펙트럼은 도 1에 나타낸다.
삼칠 추출물:
상업적으로 구입가능한 삼칠 사포닌류를 더욱 정제하여 적합한 삼칠 추출물로 제조하였다. 제조된 추출물은 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rd, 진세노사이드 Re, 진세노사이드 Rg1, 진세노사이드 Rg2, 진세노사이드 Rg3, 진세노사이드 Rh1, 진세노사이드 Rh2, 파낙시트리올(panaxytriol), 노토진세노사이드 R1, 노토진세노사이드 R2, 노토진세노사이드 R3, 20-글루코-진세노사이드 Rf를 포함하고 있었다. 이들중, 진세노사이드 Re는 3.9%이고, 진세노사이드 Rg1은 34.3%, 진세노사이드 Rb1은 31.0%, 진세노사이드 Rd는 8.8%, 노토진세노사이드 R1은 6.8%, 그리고 삼 칠 사포닌류는 94%였다. 삼칠 추출물의 HPLC 핑거프린트 스펙트럼(평균 10개의 배치)에서 11개의 공통 피크가 나타났다. 이들 11개의 공통 피크의 평균적인 상대 체류 시간은, 0.82 (노토진세노사이드 R1 피크), 0.94 (진세노사이드 Re 피크), 1 (진세노사이드 Rg1 피크, 대조 피크), 2.63, 2.74, 2.79, 2.85 (진세노사이드 Rb1 피크), 2.99, 3.08, 3.18 (진세노사이드 Rd 피크), 그리고 3.28 순이었다. 모든 공통 피크들 중, 진세노사이드 Rg1의 피크와 진세노사이드 Rb1의 피크만이, 총 피크 면적에 대한 단일 피크 면적 비가 20% 보다 높았다. 진세노사이드 Rg1의 피크(즉, 대조 피크)는 총 피크 면적의 28% (평균)이고, 이의 상대적인 피크 면적은 1이었다. 진세노사이드 Rb1의 피크는 총 피크 면적의 39% (평균)이고, 이의 상대적인 피크 면적은 1.36 (평균)이었다. 노토진세노사이드 R1의 피크는 총 피크 면적의 6% (평균)이고, 이의 상대적인 피크 면적은 0.20 (평균)이었다. 진세노사이드 Rd의 피크 면적은 총 피크의 10%(평균)이고, 이의 상대적인 피크 면적은 0.37(평균)이었다. 총 비공통 피크 면적은 총 피크 면적의 10% 미만이었다. 삼칠의 HPLC 핑거프린트 스펙트럼은 도 2에 나타낸다.
황기 추출물:
상업적으로 구입가능한 황기 추출물은 더욱 정제하였다. 얻어지는 추출물은 아세틸아스트라갈로사이드, 아스트라갈로사이드 I, 아스트라갈로사이드 II, 아스트라갈로사이드 III, 아스트라갈로사이드 IV, 이소아스트라갈로사이드 I, 이소아스트라갈로사이드 II, 아스트라멤브레닌(astramembrannin) II, 사이클로아스트라게놀(cycloastragenol), 소야사포닌(soyasaponin) I, 루페오드(lupeod), β-시토스테롤 (sitosterol), 다우코스테린(daucosterin)을 함유하고 있었다. 여기서, 아스트라갈로사이드 I은 9.5%이었고, 황기 추출물의 함량은 88.9%였다.
상기에서 수득한 단삼 추출물 75 mg, 삼칠 추출물 150 mg, 황기 추출물 75 mg과 용뇌 30 mg을 충분히 혼합하였다. 이후 상기 혼합물을 동결건조하여 본 발명의 조성물로 수득하였다.
실시예 2
실시예 1에서 수득한 단삼 추출물 100 mg, 삼칠 추출물 200 mg, 황기 추출물 75 mg과 강진향 오일 30 mg을 폴리에틸렌 글리콜 6000 400 mg과 혼합하고 섞이게 하여 혼합물로 수득하였다. 상기 혼합물을 냉각시켜 본 발명의 조성물을 수득하였다.
실시예 3
실시예 1에서 수득한 단삼 추출물 96 mg, 삼칠 추출물 136 mg, 황기 추출물 70 mg과 용뇌 28 mg을 충분히 혼합하였다. 이후 상기 혼합물을 동결건조하여 본 발명의 조성물로 수득하였다.
실시예 4
실시예 1에서 수득한 단삼 추출물 70 mg, 삼칠 추출물 150 mg, 황기 추출물 90 mg과 용뇌 20 mg을 충분히 혼합하였다. 이후 상기 혼합물을 동결건조하여 본 발명의 조성물로 수득하였다.
실시예 5
실시예 1에서 수득한 단삼 추출물 165 mg, 삼칠 추출물 80 mg, 황기 추출물 60 mg과 용뇌 25 mg을 충분히 혼합하였다. 이후 상기 혼합물을 동결건조하여 본 발명의 조성물로 수득하였다.
실시예 6
실시예 1에서 수득한 단삼 추출물 75 mg, 삼칠 추출물 135 mg, 황기 추출물 82 mg과 용뇌 38 mg을 충분히 혼합하였다. 이후 상기 혼합물을 동결건조하여 본 발명의 조성물로 수득하였다.
실시예 7
실시예 1에서 수득한 단삼 추출물 230 mg, 삼칠 추출물 75 mg, 황기 추출물 17 mg과 용뇌 8 mg을 충분히 혼합하였다. 이후 상기 혼합물을 동결건조하여 본 발명의 조성물로 수득하였다.
실시예 8
실시예 1에서 수득한 단삼 추출물 17 mg, 삼칠 추출물 70 mg, 황기 추출물 230 mg과 용뇌 13 mg을 충분히 혼합하였다. 이후 상기 혼합물을 동결건조하여 본 발명의 조성물로 수득하였다.
실시예 9
실시예 1에서 수득한 단삼 추출물 55 mg, 삼칠 추출물 160 mg, 황기 추출물 63 mg과 용뇌 48 mg을 충분히 혼합하였다. 이후 상기 혼합물을 동결건조하여 본 발명의 조성물로 수득하였다.
실시예 10
실시예 1에서 수득한 단삼 추출물 96 mg, 삼칠 추출물 136 mg, 황기 추출물 70 mg과 강진향 오일 28 mg을 400 mg의 폴리에틸렌 글리콜-6000과 충분히 혼합하여 융화하였다. 이후 상기 혼합물을 냉각시켜 본 발명의 조성물로 수득하였다.
실시예 11
실시예 1에서 수득한 단삼 추출물 70 mg, 삼칠 추출물 150 mg, 황기 추출물 90 mg과 강진향 오일 20 mg을 400 mg의 폴리에틸렌 글리콜-6000과 충분히 혼합하여 융화하였다. 이후 상기 혼합물을 냉각시켜 본 발명의 조성물로 수득하였다.
실시예 12
실시예 1에서 수득한 단삼 추출물 165 mg, 삼칠 추출물 80 mg, 황기 추출물 60 mg과 강진향 오일 25 mg을 400 mg의 폴리에틸렌 글리콜-6000과 충분히 혼합하여 융화하였다. 이후 상기 혼합물을 냉각시켜 본 발명의 조성물로 수득하였다.
실시예 13
실시예 1에서 수득한 단삼 추출물 75 mg, 삼칠 추출물 135 mg, 황기 추출물 82 mg과 강진향 오일 38 mg을 400 mg의 폴리에틸렌 글리콜-6000과 충분히 혼합하여 융화하였다. 이후 상기 혼합물을 냉각시켜 본 발명의 조성물로 수득하였다.
실시예 14
실시예 1에서 수득한 단삼 추출물 230 mg, 삼칠 추출물 75 mg, 황기 추출물 17 mg과 강진향 오일 8 mg을 400 mg의 폴리에틸렌 글리콜-6000과 충분히 혼합하여 융화하였다. 이후 상기 혼합물을 냉각시켜 본 발명의 조성물로 수득하였다.
실시예 15
실시예 1에서 수득한 단삼 추출물 17 mg, 삼칠 추출물 70 mg, 황기 추출물 230 mg과 강진향 오일 13 mg을 400 mg의 폴리에틸렌 글리콜-6000과 충분히 혼합하여 융화하였다. 이후 상기 혼합물을 냉각시켜 본 발명의 조성물로 수득하였다.
실시예 16
실시예 1에서 수득한 단삼 추출물 55 mg, 삼칠 추출물 160 mg, 황기 추출물 63 mg과 강진향 오일 48 mg을 400 mg의 폴리에틸렌 글리콜-6000과 충분히 혼합하여 융화하였다. 이후 상기 혼합물을 냉각시켜 본 발명의 조성물로 수득하였다.
실시예 17
실시예 1에서 수득한 단삼 추출물 75 g, 삼칠 추출물 135 g, 황기 추출물 96 g과, 용뇌 25 g, 만니톨 90 g, 식용(edite) 칼슘 디소듐 15 g 및 증류수 15 ml을 충분히 혼합하였다. 이후 상기 혼합물은 동결 건조하여 1000개의 분주물로 분할하였다.
실시예 18
단삼 추출물(중국 특허 출원 CN1352985A, 실시예 1) 67 g, 삼칠 추출물(실시예 1) 180 g, 황기 추출물(실시예 1) 67 g 및 용뇌 16 g을 미세결정형 셀룰로스 40 g과 충분히 혼합하였다. 여기에 3% 포비돈-에탄올 용액을 가하여 혼합물을 부드럽게 하였다. 상기 혼합물은 18# 체를 통과시켜 과립형으로 제조한 다음 60℃에서 30 - 45 분간 건조하였다. 수득된 과립을 다듬은 다음 탈크 4 g을 첨가하여 잘 혼합하였다. 제조된 과립은 캡슐에 충진하였다.
실시예 19
단삼 추출물(수 추출 및 알콜 침전법으로 제조함, Guo Ying et al, The Journal of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, 2001, 24(4): 6) 50 g, 삼칠 추출물(Qian Tian Xiang et al. Foreign Medical Sciences ,Plant Medicine Section, 1997, 12(4)) 210 g, 황기 추출물(실시예 1) 50 g 및 용뇌 20 g을 각각 소량의 생리식염수에 녹였다. 적량의 트윈 80을 첨가하였다. 각 혼합물을 곱게 갈고 생리식염수를 첨가한 후 탈색시켰다. 상기 용액이 맑고 투명해질때까지 감압하에 여과하였다. 여과물은 생리식염수가 있는 용기에 수집하였다. 상기 용기를 밀봉하고 끓는 물을 이용하여 멸균하였다. 3종의 맑은 용액을 이후 혼합하고 산도를 pH 5로 조정하였다. 적량의 생리식염수를 가하였다. 여과 과정을 반복하여 맑고 투명한 용액을 수득하였다. 이로써, 바람직한 주사제를 제조하였다.
실시예 20
단삼 추출물(중국 특허 출원 CN1384090A, 실시예 1) 60 g. 삼칠 추출물(Tang Di Guang, The journal of Chinese Traditional Patent Medicine, 1990, 12(8): 5) 80 g, 황기 추출물(실시예 1) 165 g 및 용뇌 25 g을 미세결정형 셀룰로스 40 g과 충분히 혼합하였다. 여기에 3% 포비돈-에탄올 용액을 가하여 혼합물을 부드럽게 하였다. 상기 혼합물은 18# 체를 통과시킨 다음 60℃에서 30 - 45분간 건조시켜 과립을 수득하고, 여기에 탈크 4 g을 가하여 잘 혼합하였다. 제조된 과립은 정제로 압축하였다.
실시예 21
단삼 추출물(중국 특허 출원 CN1384090A, 실시예 1) 90 g, 삼칠 추출물(실시 예 1) 150 g, 황기 추출물(실시예 1) 82 g 및 용뇌 8 g을 미세결정형 셀룰로스 40 g과 충분히 혼합하였다. 여기에 3% 포비돈-에탄올 용액을 가하여 혼합물을 부드럽게 하였다. 상기 혼합물은 18# 체를 통과시켜 과립을 제조한 다음 60℃에서 30 - 45분간 건조시켰다. 이로써 제조된 과립을 정련한 다음 탈크 4 g을 첨가하여 잘 혼합하였다.
실시예 22
단삼 추출물(중국 특허 출원 CN1384090A, 실시예 1) 85 g, 삼칠 추출물(실시예 1) 135 g, 황기 추출물(Teng Xing Long et al, Hei Long Jiang Medical Journal, 2002, 15(5): 340) 80 g 및 용뇌 30 g을 700 g의 폴리에틸렌 글리콜 6000과 잘 혼합하여 융화시켰다. 이후 저온의 파라핀 용액에 점적하고, 환을 선별한 다음 저온의 파라핀 용액을 제거하였다.
실시예 23
단삼 추출물(중국 특허 출원 CN1384090A, 실시예 1) 17 g, 삼칠 추출물(실시예 1) 280 g, 황기 추출물(실시예 1, 추출: Yu Hao et al., West China Journal of Pharmaceutical Sciences, 1993, 8(3):163); ㅈ정제: Teng Xing Long et al., Hei Long Jiang Medical Journal, 2002, 15(5): 340) 17 g 및 용뇌 16 g을 700 g의 폴리에틸렌 글리콜 6000과 잘 혼합하여 융화시켰다. 이후 저온의 파라핀 용액에 점적하고, 환을 선별한 다음 저온의 파라핀 용액을 제거하였다.
실시예 24
단삼 추출물(중국 특허 출원 CN1352985A, 실시예 1) 67 g, 삼칠 추출물(실시 예 1) 180 g, 황기 추출물(실시예 1) 67 g 및 강진향 오일 16 g을 미세결정형 셀룰로스 40 g과 충분히 혼합하였다. 여기에 3% 포비돈-에탄올 용액을 가하여 혼합물을 부드럽게 하였다. 상기 혼합물은 18# 체를 통과시켜 과립을 제조하고 이를 60℃에서 30 - 45분간 건조시켰다. 정련한 다음 탈크 4 g을 첨가하여 잘 혼합하였다. 제조된 과립은 캡슐에 충전하였다.
실시예 25
단삼 추출물(중국 특허 출원 CN1384090A, 실시예 1) 60 g, 삼칠 추출물(Tang Di Guang, The journal of Chinese Traditional Patent Medicine, 1990, 12(8): 5) 80 g, 황기 추출물(실시예 1) 165 g 및 강진향 오일 25 g을 미세결정형 셀룰로스 40 g과 충분히 혼합하였다. 여기에 3% 포비돈-에탄올 용액을 가하여 혼합물을 부드럽게 하였다. 상기 혼합물은 18# 체를 통과시켜 과립을 제조한 후 이를 60℃에서 30 - 45분간 건조시켰다. 정련한 다음 탈크 4 g을 첨가하여 잘 혼합하였다. 제조된 과립은 정제로 압축하였다.
실시예 26
단삼 추출물(중국 특허 출원 CN1384090A, 실시예 1) 90 g, 삼칠 추출물(실시예 1) 150 g, 황기 추출물(실시예 1) 82 g 및 강진향 오일 8 g을 미세결정형 셀룰로스 40 g과 충분히 혼합하였다. 여기에 3% 포비돈-에탄올 용액을 가하여 혼합물을 부드럽게 하였다. 상기 혼합물은 18# 체를 통과시켜 과립을 만든 후 이를 60℃에서 30 - 45분간 건조시켰다. 정련한 다음 탈크 4 g을 첨가하여 잘 혼합하였다. 제조된 과립은 정련 및 포장하였다.
실시예 27
단삼 추출물(중국 특허 출원 CN1384090A, 실시예 1) 85 g, 삼칠 추출물(실시예 1) 135 g, 황기 추출물(Teng Xing Long et al, Hei Long Jiang Medical Journal, 2002, 15(5): 340) 80 g 및 강진향 오일 30 g을 700 g의 폴리에틸렌 글리콜 6000과 잘 혼합하여 융화시켰다. 이후 저온의 파라핀 용액에 점적하고, 환을 선별한 다음 저온의 파라핀 용액을 제거하였다.
실시예 28
단삼 추출물(중국 특허 출원 CN1384090A, 실시예 1) 17 g, 삼칠 추출물(실시예 1) 280 g, 황기 추출물(실시예 1, 추출: Yu Hao et al., West China Journal of Pharmaceutical Sciences, 1993, 8(3):163); 정제: Teng Xing Long et al., Hei Long Jiang Medical Journal, 2002, 15(5): 340) 17 g 및 강진향 오일 16 g을 700 g의 폴리에틸렌 글리콜 6000과 잘 혼합하여 융화시켰다. 이후 저온의 파라핀 용액에 점적하고, 환을 선별한 다음 저온의 파라핀 용액을 제거하였다.
실험예 1 - 랫에서의 국소 대뇌 허혈에 대한 본 발명의 약학적 조성물의 효과
1. 재료
a. 동물: 품질 관리 인증 번호(Quality Control Certificate number) SCXK(Beijing) 2002-0003의, 180-200 g의 웅성 SD(Sprague-Dawley) 랫은 베이징 웨이통 리후아 실험동물 기술주식회사(Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Limited.)에서 제공받았다.
b. 시험 약물 및 화학물질:
시험 약물: 실시예 1 및 실시예 2에서 제조한 조성물; 실시예 1의 단삼 추출물; 실시예 1의 삼칠 추출물; 실시예 1의 황기 추출물; 강진향 오일 및 용뇌. 원밍 제약회사(Qunming Pharmaceutical Co., Limited, lot No 20020922.03)의 수에사이통(XUESAITONG, 상표)을 구입하였다.
화학물질: 2,3,5-트리페닐테트라졸리움 클로라이드(TTC)로, 연노란빛을 띄는 분말로, 베이징 마쉬 파인 화학주식회사(Beijing Mashi Fine Chemical Co., Limited, lot number 011102)의 제품.
c. 실험 장치: 윤안 광학기기사(Yunnan Optical Instrument Factory)의 XTT 입체 현미경(stereoscopic microscope); 일본 시마즈사(Japan Shimadzu Corporation)의 Model AEG-220 전자 분석 스케일; 상하이 치의학기기사(Shanghai Dental Medical Instrument Factory)의 307-6 데스크탑 치아 기기 카트; 하르빈 동밍 의학기기사( Harbin Dongming Medical Instrument Factory)의 HZQ-C 공기 조 진동장치(Air Bath Vibrator).
2. 방법 및 결과
a. 그룹 및 시험 산물의 투여: 동물들을 임의적으로 체중에 따라 분류하였다. 모든 그룹의 동물에게는 수술 후 30분에 연구용 시험산물을 설하 동맥으로 투여하였다. 또한 수술 후 2시간 및 23시간 경과하였을때 연구용 시험 산물을 복막내 주사하였다. 모든 산물은 적정 농도로 생리식염수에 희석하였다. 주사는 체중 100 g 당 0.4 ml로 하였다.
b. 중간 대뇌 동맥 색전증 모델: 10% 클로랄 하이드레이트 용액을 복막내 투여하여 (350 mg/kg) 랫을 마취시킨 다음 우측으로 누운 자세로 두었다. 좌측 눈의 바깥쪽과 좌측 외이도 사이 중앙 지점에 1.5 cm의 곡선으로 절개하였다. 측두근을 절개하여 측두골을 노출시키고, 입체 현미경으로 관절의 구강쪽 말단에서 단지 1 mm 떨어진 광대뼈와 인부측두골(squamosal temporal bone)의 관절 위치에서 2.5 mm의 골강조 영상(bone window)을 개봉하였다. 조직 파편을 제거하고 중간 뇌동맥(후기 다발과 하대뇌정맥 사이에 위치)을 노출시켰다. 혈관을 둘러싼 부위를 보호하기 위해 작은 플라스틱 필름 조각을 장착하였다. 여기 중간 대뇌 동맥 구획 위에 50%의 염화제3철 10 ㎕에 젖신 작은 정량 필터 종이 조각을 두고, 30분 후에 상기 필터 종이를 제거하고 생리식염수로 국소 조직을 세정한 다음, 층의 상처를 봉합하였다. 랫은 다시 사육장으로 돌려보내어 정상적인 생활 환경에서 회복시켰다. 실온은 24 ℃로 조절하였다.
c. 신경학적 증상의 수치 기준
수술 24시간 후 행동 평가를 실시하였다. 수치 기준은 다음과 같다: (1) 꼬리로 랫을 들어올렸을때 앞다리의 굽힘 현상을 관찰한다; 양쪽 앞다리를 앞으로 대칭적으로 뻗는 경우 0점, 수술한 반대쪽 앞다리에서 어깨 굽힘, 팔꿈치 굽힘 및/또는 어깨의 안쪽 돌림이 있는 경우 1점. (2) 랫을 편평한 면에 두고 양 어깨를 반대쪽으로 밀어서 저항력을 체크한다. 저항력이 양쪽이 동일하고 강한 경우 0점이고, 수술한 반대쪽의 저항력이 감소된 경우는 1점이다. (3) 랫의 앞다리를 금속 메쉬 위에 두어, 근육 장력을 관찰한다. 양 측의 근육 장력이 동일하고 강한경우 0점이고, 수술한 반대쪽 앞다리의 근육 장력이 감소된 경우 1점이다. (4) 랫을 꼬리로 들어올린 후 수술한 반대쪽으로 랫이 연속 회전하는 경우 1점으로 기록한다. 이러한 수치 기준에서, 총 수치는 4점이다. 수치가 높을 수록 행동 장애가 심한 것이다.
d. 뇌 경색 범위 결정
행동 평가를 한 다음 랫의 목을 베었다. 뇌를 수거하였다. 후각망울, 소뇌, 하위 뇌간은 폐기하고, 나머지 뇌는 시상으로(sagittally) 5 조각 절단하였다. 상기 5개의 절편을 TTC 염색액(각 5 ml의 염색액은 4% TTC 1.5 ml, 1M K2HPO4 0.1 ml을 함유하고 있으며, 잔량으로 증류수가 첨가된 것임)에 침지하여 37 ℃ 암실에 30분간 방치한 다음, 상기 뇌 절편을 10% 포름알데하이드 용액으로 이동시켜 암실에서 24시간 두었다. 염색으로, 비허혈성 부위는 장미빛으로 되고, 허혈성 부위는 하얗게 된다. 뇌 절편의 백색 조직을 조심스럽게 절개하여 중량을 측정하였다. 전체 뇌에서의 경색 부위의 중량 백분율 및 손상된 뇌 부분에서의 경색 부위의 중량 백분율을 뇌 경색 범위로 간주하였다.
e. 결과:
표 1.
랫의
신경학적 증상에 대한 본 발명의 약학적 조성물 및 추출물의 효과(MCAO)(
)
Groups |
투여량(mg/kg 체중) |
동물 수 |
6시간 후 신경학적 증상의 수치 |
24시간 후 신경학적 증상의 수치 |
실시예 1의 약학적 조성물 (단삼 추출물+삼칠 추출물 + 황기 추출물 + 용뇌) |
5+10+5+2 |
10 |
1.22 ± 0.41**##&&@ |
1.07 ± 0.59**## &&@ |
실시예 2의 약학적 조성물 (단삼 추출물+삼칠 추출물 + 황기 추출물 + 강진향 오일) |
5+10+5+2 |
10 |
1.32 ± 0.45**##&&@ |
1.13 ± 0.56**##&&@ |
살비놀산류+ 삼칠 사포닌류 + 용뇌 |
6+12+2 |
10 |
1.68 ± 0.43**##& |
1.61 ± 0.63**##& |
살비놀산류+ 삼칠 사포닌류 |
6.7+13.3 |
10 |
2.14 ± 0.60**# |
2.14 ± 0.59** # |
살비놀산류 |
20 |
10 |
2.95 ± 0.67* |
2.57 ± 0.42* |
삼칠 사포닌류 |
20 |
10 |
2.65 ± 0.32* |
2.52 ± 0.51* |
수에사이통(XUESAITONG) |
20 |
10 |
2.65 ± 0.37* |
2.56 ± 0.54* |
대조군 |
|
10 |
3.22 ± 0.42 |
3.04 ± 0.53 |
참조: 대조군과 비교시 *P<0.05, **P<0.01; 살비놀산류 그룹 또는 삼칠 사포닌류 그룹와 비교시 #P<0.05, ## P<0.01; 살비놀산류 + 삼칠 사포닌류 그룹과 비교시 &P<0.05, &&P<0.01; 살비놀산류 + 삼칠 사포닌류 + 용뇌 그룹과 비교시 @P<0.05.
MCAO - 중간 대뇌 동맥 폐색
표 2.
랫의
뇌 경색 부분에 대한 본 발명의 약학적 조성물 및 추출물의 효과(MCAO) (
)
그룹 |
투여량(mg/kg 체중) |
동물 수 |
뇌 경색/전체 뇌(%) |
뇌경색/손상된 뇌 부분(%) |
실시예 1의 약학적 조성물 (단삼 추출물+삼칠 추출물 + 황기 추출물 + 용뇌) |
5+10+5+2 |
10 |
1.28 ± 0.74**##&&@ |
2.57 ± 1.41**##&&@ |
실시예 1의 약학적 조성물 (단삼 추출물+삼칠 추출물 + 황기 추출물 + 강진향 오일) |
5+10+5+2 |
10 |
1.34 ± 0.69**##&&@ |
2.61 ± 1.50**##&&@ |
살비놀산류+ 삼칠 사포닌류 + 용뇌 |
6+12+2 |
10 |
1.66 ± 0.69**##& |
3.37 ± 1.30**##& |
살비놀산류+ 삼칠 사포닌류 |
6.7+13.3 |
10 |
2.32 ± 0.84**# |
4.61 ± 1.80**# |
살비놀산류 |
20 |
10 |
3.21 ± 0.86* |
6.41 ± 1.76* |
삼칠 사포닌류 |
20 |
10 |
3.02 ± 1.21* |
5.99 ± 2.33* |
수에사이통(XUESAITONG) |
20 |
10 |
2.99 ± 1.11* |
5.98 ± 2.23* |
대조군 |
|
10 |
4.33 ± 0.81 |
8.69 ± 1.59 |
참조: 대조군과 비교시 *P<0.05, **P<0.01; 살비놀산류 그룹 또는 삼칠 사포닌류 그룹과 비교시 #P<0.05, ## P<0.01; 살비놀산류 + 삼칠 사포닌류 그룹과 비교시 &P<0.05, &&P<0.01; 살비놀산류 + 삼칠 사포닌류 + 용뇌 그룹과 비교시 @P<0.05.
표 1 및 표 2의 결과는, 모든 시험 약물이 항-뇌 허혈증에 유의한 효과를 가짐을 나타낸다. 모든 약물들중, 실시예 1의 조성물(단삼 추출물, 삼칠 추출물, 황기 추출물 및 용뇌) 및 실시예 2의 조성물(단삼 추출물, 삼칠 추출물, 황기 추출물 및 강진향 오일)은 현저한 치료학적 효과를 달성한다. 살비놀산류나 삼칠 사포닌류만을 투여하였을때는 수에사이통(상표, 양성 대조 약물)의 투여시와 유사한 효과가 있었다. 살비놀산류 + 삼칠 사포닌류 + 용뇌의 병용 투여하였을때의 치료 효과 는, 살비놀산류 + 삼칠 사포닌류 또는 살비놀산류 단독, 삼칠 사포닌류 단독 또는 수에사이통(상표) 단독 투여에 비해 치료 효과가 더 우수하였으나, 실시예 1 및 2의 약학적 조성물에 비해서 치료 효과가 낮았다.
심근경색증의 실험 쥐 모델을 이용한 체외관류 방법에 의해, 본 발명에서는 본 발명의 약학적 조성물, 살비놀산류 + 삼칠 사포닌류 + 용뇌 또는 강진향 오일, 살비놀산류 + 삼칠 사포닌류, 살비놀산류 및 삼칠 사포닌류의 항-심근경색증 효과를 비교하였다. 그 결과, 본 발명의 약학적 조성물이 유의한 항-심근경색 효과가 있는 것으로 확인되었다. 이의 치료 효과는 살비놀산류 또는 삼칠 사포닌류만을 적용한 경우에 비해 우수하며, 살비놀산류 + 삼칠 사포닌류을 투여한 경우에 비해 더 강력하였으며, 살비놀산류 + 삼칠 사포닌류 + 용뇌 또는 강진향 오일에 비해 우수하였다. 이러한 결과들은, 본 발명의 약학적 조성물, 즉 단삼 추출물 + 삼칠 추출물 + 황기 추출물 + 용뇌, 또는 단삼 추출물 + 삼칠 추출물 + 황기 추출물 + 강진향 오일이, 강력한 상승 작용을 함을 나타내는 것이다.
실험예 2 - 본 발명의 조성물의 항-심근 허혈증 효과 연구
1. 250.8 + 24.6 g의 70마리의 Wistar 웅성 랫을 체중에 따라 7그룹으로 임의로 나누었다: 대조군인 생리식염수 그룹, 수에사이통 그룹, 살비놀산류 그룹, 삼칠 사포닌류 그룹, 살비놀산류 + 삼칠 사포닌류 그룹, 실시예 1의 약학적 조성물 그룹 및 실시예 2의 약학적 조성물 그룹. 모든 시험 약물들은 적정 농도로 생리식염수에 희석하였고, 시험 약물은 꼬리의 정맥 주사를 통해 4 ml/kg으로 투여하였다.
2. 방법
a. 심근 경색증의 실험 랫 모델: 펜토바르비탈 소듐(45 mg/kg)을 복막내 주사하여 랫을 마취시키고, 바로누운 자세로 고정시켜 기관 튜브를 삽입한 다음, 흉골좌측을 따라 세로 2 cm로 절개하였다. 흉강을 열고, 흉골에 근접한 연골 부위의 3번째 및 4번째 늑골을 절개하고, 인공 호흡기(환기량 2ml/100g, 50 회/분)로 호흡을 유지시켰다. 심장막을 열어 심장을 노출시킨 다음 하향성 심장 관상 동맥 밑으로 선을 넣어, 표준 II 심전도유도를 기록하였다. 10분간 안정화시킨 다음, 상기 하향성 심장 관상 동맥을 결착하고 흉강을 닫았다. 주사기를 이용하여 후두로 분비되는 물질을 제거하여, 랫이 자가 호흡하도록 하였다. 관상 동맥 결착 15분 후, 시험 약물을 정맥을 통해 주입하였다. 관상 동맥 결착 4시간 후 심장을 꺼내어, 선을 삽입한 부분의 아래 심장 부위를 적출하여 5 절편으로 자른 다음 니트로블루 테트라졸리움(NBT)으로 염색하였다. 심실 전 부위과 전체 심장에서의 심근경색 부위의 백분율을 계산하여 통계학적으로 분석하였다(t-test).
b. 적출 관류(Langendorff) 심장 실험: "약물 실험법"(edited by Shuyun Xu etc., People Health Press, third edition, January 2002)을 참조한다.
3. 결과
a. 랫에서의 심근경색 부위에 대한 효과는 표 3을 참조한다.
표 3.
랫에서의
심근경색 부위에 대한 본 발명의 약학적 조성물의 효과(MCAO) (
)
그룹 |
투여량(mg/kg 체중) |
동물 수 |
경색 부위/ 심실 부위 (%) |
경색 부위/ 심장 전체 (%) |
실시예 1의 약학적 조성물 (단삼 추출물+삼칠 추출물 + 황기 추출물 + 용뇌) |
5+10+5+2 |
10 |
12.53 + 4.57**## &&@ |
10.96 + 3.35**## &&@ |
실시예 2의 약학적 조성물 (단삼 추출물+삼칠 추출물 + 황기 추출물 + 강진향 오일) |
5+10+5+2 |
10 |
12.62 + 4.49**## &&@ |
11.01 + 3.42**## &&@ |
살비놀산류+삼칠 사포닌류 + 용뇌 |
6+12+2 |
10 |
16.72 + 6.43**## & |
13.15 + 4.16**## & |
살비놀산류+ 삼칠 사포닌류 |
6.7+13.3 |
10 |
20.51 + 6.58**# |
14.03 + 5.18**# |
살비놀산류 |
20 |
10 |
24.08 + 8.56* |
18.11 + 4.49* |
삼칠 사포닌류 |
20 |
10 |
25.97 + 4.65* |
21.03 + 3.82* |
수에사이통 |
20 |
10 |
25.02 + 5.72* |
19.64 + 4.71* |
대조군 |
|
10 |
33.67 + 7.85 |
26.48 + 5.11 |
참조: 대조군과 비교시 *P<0.05, **P<0.01; 살비놀산류 그룹 또는 삼칠 사포닌류 그룹과 비교시 #P<0.05, ## P<0.01; 살비놀산류 + 삼칠 사포닌류 그룹과 비교시 &P<0.05, &&P<0.01; 살비놀산류 + 삼칠 사포닌류 + 용뇌 그룹과 비교시 @P<0.05.
b. 적출한 기니피그 심장의 관상 동맥내 유량 및 심장박동수에 대한 영향은 표 4를 참조한다.
표 4. 적출한 기니피그 심장의 관상 동맥내 유량 및 심장박동수에 대한 본 발명의 약학적 조성물의 영향 (
)
그룹 |
투여량)mg/kg 체중) |
동물 수 |
관상 동맥의 유량 증가치(ml/min) |
심장 박동수의 감소치 (beat/min) |
실시예 1의 약학적 조성물 (단삼 추출물+삼칠 추출물 + 황기 추출물 + 용뇌) |
5+10+5+2 |
10 |
16.67 + 1.74 **&&# |
40 + 14**&&# |
실시예 2의 약학적 조성물 (단삼 추출물+삼칠 추출물 + 황기 추출물 + 강진향 오일) |
5+10+5+2 |
10 |
16.76 + 1.68 **&&# |
41 + 15**&&# |
살비놀산류+ 삼칠 사포닌류+ 용뇌 |
6+12+2 |
10 |
14.85 + 1.76 **& |
32 + 12**& |
살비놀산류+ 삼칠 사포닌류 |
6.7+13.3 |
10 |
11.34 + 2.24 * |
21 + 9* |
살비놀산류 |
20 |
10 |
7.91 + 1.36 |
9 + 4 |
삼칠 사포닌류 |
20 |
10 |
8.88 + 1.51 |
10 + 5 |
수에사이통 |
20 |
10 |
8.82 + 1.11 |
10 + 4 |
참조: 대조군과 비교시 *P<0.05, **P<0.01; 살비놀산류 그룹 또는 삼칠 사포닌류 그룹, 또는 수에사이통과 비교시 ; 살비놀산류 + 삼칠 사포닌류 그룹과 비교시 &P<0.05, &&P<0.01; 살비놀산류 + 삼칠 사포닌류 + 용뇌 그룹과 비교시 #P<0.05.
표 3 및 4의 결과는, 모든 시험 약물이 유의적인 항-심근 허혈증 효과를 가짐을 의미한다. 모든 약물들중, 실시예 1의 조성물(단삼 추출물, 삼칠 추출물, 황기 추출물 및 용뇌)과 실시예 2의 조성물 (단삼 추출물, 삼칠 추출물, 황기 추출물 및 강진향 오일)이 가장 최상의 치료 효과를 나타내었다. 살비놀산류 또는 삼칠 사포닌류만을 투여한 그룹에서는 수에사이통(양성 대조 약물) 투여한 그룹과 유사한 효과를 가진다. 살비놀산류 + 삼칠 사포닌류 + 용뇌의 병용 투여시 살비놀산류 + 삼칠 사포닌류 투여나, 살비놀산류 단독 투여, 삼칠 사포닌류 단독 투여 또는 수에사이통 단독 투여하였을때 비해 치료 효과가 우수하였으나, 실시예 1의 약학적 조성물 및 실시예 2의 약학적 조성물에 비해선 효과가 좋지 못하였다.