KR20060118547A - 금속 이온-매개된 형광 수퍼켄칭 검정, 키트 및 시약 - Google Patents

금속 이온-매개된 형광 수퍼켄칭 검정, 키트 및 시약 Download PDF

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프루케 리닌슬란트
스리람 쿠마라사미
스튜어트 쿠숀
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큐티엘 바이오시스템즈 엘엘씨
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Abstract

본 발명에는 금속 이온과 포스페이트 리간드의 특이적인 결합 및 형광성 중합체 수퍼켄칭을 이용하는, 키나제, 포스파타제 및 프로테아제 효소 활성용 시약 및 검정법이 기재되어 있다. 이들 검정법은 펩티드 및 단백질 기질은 사용하는 키나제, 포스파타제 및 프로테아제 효소 활성을 측정하기 위한 일반적인 플랫폼을 제공한다. DNA 혼성화를 기초로 하는 시약 및 검정법 및 아프타머, 항체 및 다른 리간드를 사용하는 단백질용 시약 및 검정법도 기재되어 있다.
금속 이온 결합, 형광성 중합체, 수퍼켄칭, 바이오티닐화된 폴리펩티드

Description

금속 이온-매개된 형광 수퍼켄칭 검정, 키트 및 시약 {METAL ION MEDIATED FLUORESCENCE SUPERQUENCHING ASSAYS, KITS AND REAGENTS}
본 출원은 미국 특허 가출원 제60/528,792호(2003년 12월 12일 출원); 미국 특허 가출원 제60/550,733호(2004년 3월 8일 출원); 및 미국 특허 가출원 제60/604,813호(2004년 8월 27일 출원)를 우선권으로 주장한다. 상기 언급된 출원들은 각각 그 전문이 그 거명을 통해 본원에 참고로 포함된다.
본 출원은 일반적으로 생물학적 분자의 검출을 위한 시약, 키트 및 검정법, 특히 금속 이온 결합과 형광성 중합체 수퍼켄칭을 조합한 생물학적 분자의 검출을 위한 시약, 키트 및 검정법에 관한 것이다.
효소-연결된 면역흡착 검정법(즉, ELISA)은 광범위한 단백질, 항체, 세포, 바이러스 등의 존재 및 생물학적 활성을 확인하기 위해 가장 널리 사용되고 수용되는 기술이다. ELISA는 분석물질 생체분자가 먼저 표면에 부착된 항체에 결합하는 다단계 "샌드위치 검정법(sandwich assay)"이다. 2차 항체가 이어서 생체분자에 결합한다. 일부의 경우에, 2차 항체는 촉매 효소에 부착되고, 이 효소가 후속적으로 증폭 반응을 "전개(develop)"시킨다. 다른 경우에는, 이 2차 항체가 바이오티 닐화되어 제3의 단백질(예를 들어, 아비딘 또는 스트렙타비딘)에 결합된다. 이 단백질은 증폭된 발색 변화를 위한 화학적 캐스케이드를 생성하는 효소에 부착되거나, 또는 형광성 태깅을 위해 형광단에 부착된다.
이러한 광범위한 사용에도 불구하고, ELISA에 대한 다수의 불리함이 있다. 예를 들면, 다단계 절차가 시약 및 현상 시간에 대해 모두 정확한 조절을 요구하기 때문에, 시간 소모적이고 "가양성(false positive)"이 되기 쉽다. 또한, 비특이적으로 흡착된 시약을 제거하기 위해 주의 깊은 세척이 요구된다.
형광 공명 에너지 전달(즉, FRET) 기술은 중합효소 연쇄 반응(PCR)-기초의 유전자 서열분석 및 면역검정법 모두에 응용되어 왔다. FRET는 분석물질 생체분자의 동종 결합을 이용하여 소멸(OFF) 상태에서 켄칭되는 염료의 형광을 활성화시킨다. FRET 기술의 전형적 예에서, 형광성 염료는 항체(F-Ab)에 연결되고, 이 이조체(diad)가 켄쳐(quencher)에 연결된 항원(Ag-Q)에 결합된다. 결합된 복합체(F-Ab: Ag-Q)는 에너지 전달에 의해 켄칭된다(즉, 비-형광성 켄칭). Q(Ag)에 결합하지 않은 동일한 분석물질 항원의 존재하에, Ag-Q 이조체는 상대 농도([Ag-Q]/[Ag])에 의해 측정된 평형 결합 확률에 의해 측정된 바와 같이 정량적으로 치환된다. 이로 인해, FRET 기술은 항원이 이미 잘 특성화되어 있는 정량적 검정법으로만 제한되며, Q에 항원을 연결시키는 화학적 작용이 각각의 새로운 경우에 대해서 연구되어야만 한다.
다른 FRET 기질 및 검정법이 미국 특허 제6,291,201호 뿐만 아니라, 문헌 [Anne. et al., "High Throughput Fluorogenic Assay for Determination of Botulinum Type B Neurotoxin Protease Activity", Analytical Biochemistry, 291, 253-261(2001)]; [Curnmings , et al., A Peptide Based Fluorescence Resonance Energy Transfer Assay for Bacillus Anthracis Lethal Factor Protease", Proc. Natl. Acad. Scie. 99, 6603-6606(2002)]; [Mock, et al.,"Progress in Rapid Screening of Bacillus Anthracis Lethal Activity Factor", Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 6527-6529(2002)]; [Sportsman et al., Assay Drug Dev. Technol., 2004, 2, 205]; 및 [Rodems et al., Assay Drug Dev. Technol., 2002, 1, 9]에 개시되어 있다.
분자내에서 켄칭된 형광성 기질을 사용하는 다른 검정법은 문헌 [Zhong . et al., Development of an Internally Quenched Fluorescent Substrate for Escherichia Coli Leader Peptidase", Analytical Biochemistry 255, 66-73(1998)]; [Rosse , et al.,"Rapid Identification of Substrates for Novel Proteases Using a Combinatorial Peptide Library", J. Comb. Chem., 2, 461-466(2000)]; 및 [Thompson, et al., "A BODIPY Fluorescent Microplate Assay for Measuring Activity of Calpains and Other Proteases", Analytical Biochemistry, 279, 170-178(2000)]에 개시되어 있다.
형광 편광의 변화를 측정하여 분석물질의 양을 정량하기 위해 사용하는 검정법이 또한 개발되었다. 예를 들어, 문헌 [Levine , et al., "Measurement of Specific Protease Activity Utilizing Fluorescence Polarization", Analytical Biochemistry 247, 83-88(1997)]을 참조한다. 또한, 문헌 [Schade . et al., "BODIPY-α-Casein, a pH-Independent Protein Substrate for Protease Assays Using Fluorescence Polarization", Analytical Biochemistry 243, 1-7(1996)]을 참조한다.
그러나, 생물학적 관련 분자, 예컨대 효소 및 핵산을 고감도로 신속하고 정확하게 검출 및 정량하는 것에 대한 요구가 여전히 존재하고 있는 실정이다.
요약
제1 실시양태에 따라, 하나 이상의 포스페이트기를 포함하는 바이오티닐화된 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드의 포스페이트기와 결합된 금속 양이온을 포함하는 복합체를 제공한다.
제2 실시양태에 따라, 샘플 중 키나제 또는 포스파타제 효소 분석물질의 존재 및(또는) 양의 검출 방법을 제공한다. 이 실시양태에 따른 방법은
a) 키나제 효소 분석물질의 경우에는 분석물질에 의해 인산화될 수 있는 하나 이상의 기를 포함하는 바이오티닐화된 폴리펩티드와 샘플을 인큐베이션하거나, 또는 포스파타제 효소 분석물질의 경우에는 분석물질에 의해 탈인산화될 수 있는 하나 이상의 기를 포함하는 바이오티닐화된 폴리펩티드와 샘플을 인큐베이션하는 것;
b) 금속 양이온을 샘플에 첨가하는 것(여기서, 상기 금속 양이온이 켄쳐이거나, 또는 그렇지 않은 경우에는 샘플에 금속 양이온과 결합할 수 있는 켄쳐를 첨가하는 것을 더 포함시킴);
c) 켄쳐가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄쳐가 상기 형광물질의 수퍼켄 칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 바이오틴 결합 단백질과 결합된 형광물질을 샘플에 첨가하는 것; 및
d) 형광을 검출하는 것
을 포함하며, 여기서 검출된 형광은 샘플 중 분석물질의 존재 및(또는) 양을 나타내낸다.
제3 실시양태에 따라, 키나제 또는 포스파타제 효소 활성 억제제로서의 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다. 이 실시양태에 따른 방법은
a) 샘플 중에서, 키나제 효소 분석의 경우에는 분석물질에 의해 인산화될 수 있는 하나 이상의 기를 포함하는 바이오티닐화된 폴리펩티드를 키나제 효소 활성 억제제인 화합물의 존재하에 키나제 효소와 인큐베이션하고, 포스파타제 효소 분석의 경우에는 분석물질에 의해 탈인산화될 수 있는 하나 이상의 기를 포함하는 바이오티닐화된 폴리펩티드를 포스파타제 효소 활성 억제제인 화합물의 존재하에 포스파타제 효소와 인큐베이션하는 것;
b) 금속 양이온을 샘플에 첨가하는 것(여기서, 상기 금속 양이온이 켄쳐이거나, 또는 그렇지 않은 경우에는 샘플에 금속 양이온과 결합할 수 있는 켄쳐를 첨가하는 것을 더 포함시킴);
c) 켄쳐가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄쳐가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 바이오틴 결합 단백질과 결합된 형광물질을 샘플에 첨가하는 것; 및
d) 상기 화합물의 존재하에 샘플로부터 형광을 검출하는 것
을 포함하며, 여기서 상기 화합물의 존재하에 검출된 형광의 양은 키나제 또는 포스파타제 효소 활성에 대한 상기 화합물의 억제 효과를 나타낸다.
제4 실시양태에 따라,
인산화될 수 있거나 탈인산화될 될 수 있는 기를 하나 이상 포함하는 폴리펩티드; 및
상기 폴리펩티드에 접합된 켄칭 잔기
를 포함하는 생체접합체(bioconjugate)를 제공한다. 켄칭 잔기는 로다민 또는 유사한 스펙트럼 특징을 갖는 또다른 염료일 수 있다.
제5 실시양태에 따라, 상기 생체접합체는 하나 이상의 포스페이트기 및 절단 부위를 더 포함할 수 있으며, 여기서 절단 부위의 반대쪽에 상기 켄칭 잔기 및 포스페이트기가 존재한다. 바람직하게는, 켄칭 잔기가 접합된 절단 부위쪽에 포스페이트기가 존재하지 않는다.
제6 실시양태에 따라,
a) 상기한 절단 부위와 하나 이상의 포스페이트기를 포함하는 생체접합체와 샘플을 인큐베이션하는 것(여기서, 프로테아제 효소가 상기 절단 부위에서 폴리펩티드를 절단함);
b) 켄칭 잔기가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄칭 잔기가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 하나 이상의 음이온기를 더 포함하는 형광물질(여기서, 하나 이상의 금속 양이온이 형광물질의 음이온기와 결합되어 있음)을 샘플에 첨가하는 것; 및
c) 샘플로부터 형광을 검출하는 것
을 포함하며, 이 때 검출된 형광은 샘플 중의 프로테아제 효소의 존재 및(또는) 양을 나타내는 것인, 샘플 중 프로테아제 효소의 존재 및(또는) 양의 검출 방법을 제공한다.
제7 실시양태에 따라,
상기 기재된 생체접합체를 포함하는 제1 성분; 및
생체접합체의 켄칭 잔기가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄칭 잔기가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하는 형광물질(여기서, 상기 형광물질은 하나 이상의 음이온기를 더 포함하고, 하나 이상의 금속 양이온이 형광물질의 음이온기와 결합되어 있음)을 포함하는 제2 성분
을 포함하는, 샘플 중 키나제 또는 포스파타제 효소 분석물질의 존재 및(또는) 양의 검출용 키트를 제공한다.
제8 실시양태에 따라,
a) 샘플을 상기 기재된 생체접합체와 인큐베이션하는 것(여기서, 상기 생체접합체의 폴리펩티드는 효소 분석물질에 의해 인산화 또는 탈인산화될 수 있는 기를 포함함);
b) 켄칭 잔기가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄칭 잔기가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 하나 이상의 음이온기를 더 포함하는 형광물질(여기서, 하나 이상의 금속 양이온이 형광물질의 음이온기와 결합되어 있음)을 샘플에 첨가하는 것; 및
c) 샘플로부터 형광을 검출하는 것
을 포함하며, 이 때 검출된 형광은 샘플 중 효소 분석물질의 존재 및(또는) 양을 나타내는 것인, 샘플 중 효소 분석물질의 존재 및(또는) 양의 검출 방법을 제공한다.
제9 실시양태에 따라,
켄쳐를 포함하는 제1 성분; 및
바이오티닐화된 폴리펩티드(상기 폴리펩티드는 분석물질에 의해 변형될 수 있고, 분석물질에 의해 변형된 폴리펩티드는 켄쳐와 결합함)를 포함하는 제2 성분
을 포함하는, 샘플 중의 분석물질 존재 검출용 키트를 제공한다.
제10 실시양태에 따라,
a) 시클릭 AMP 또는 시클릭 GMP에 접합된 켄쳐를 포함하는 생체접합체와 샘플을 인큐베이션하는 것;
b) 켄쳐가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄쳐가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 하나 이상의 음이온기를 더 포함하는 형광물질(여기서, 하나 이상의 금속 양이온이 형광물질의 음이온기와 결합되ㅇ어 있음)을 샘플에 첨가하는 것; 및
c) 샘플로부터 형광을 검출하는 것
을 포함하며, 이 때 검출된 형광의 양은 샘플 중 포스포디에스테라제 효소의 존재 및(또는) 양을 나타내는 것인, 샘플 중 포스포디에스테라제 효소의 존재 및(또는) 양의 검출 방법을 제공한다.
제11 실시양태에 따라,
a) 폴리펩티드 기질, 및 인산화될 수 있는 하나 이상의 기를 포함하는 켄쳐로 표지된 폴리펩티드를 키나제 효소를 포함하는 샘플과 인큐베이션하는 것;
b) 켄쳐가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄쳐가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 하나 이상의 음이온기를 더 포함하는 형광물질(여기서, 하나 이상의 금속 양이온이 형광물질의 음이온기와 결합되ㅇ어 있음)을 샘플에 첨가하는 것; 및
c) 샘플로부터 형광을 검출하는 것
을 포함하며, 이 때 폴리펩티드 기질의 인산화는 형광을 증가시키고, 검출된 형광의 양은 폴리펩티드 기질의 키나제 효소 활성의 존재 및(또는) 양을 나타내는 것인, 폴리펩티드 기질의 키나제 효소 활성의 검출 방법을 제공한다.
제12 실시양태에 따라,
a) 폴리뉴클레오티드의 제1 말단 영역에 폴리펩티드에 접합된 켄쳐를 포함하고 폴리뉴클레오티드의 제2 말단 영역에 포스페이트기를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 샘플을 인큐베이션하는 것(여기서, 상기 폴리뉴클레오티드의 제1 및 제2 말단 영역 중 적어도 일부분은 함께 혼성화되어 헤어핀 구조를 형성하고, 상기 말단 영역 간의 폴리뉴클레오티드의 중심 영역은 핵산 분석물질에 혼성화되어 헤어핀 구조를 파괴하고 폴리뉴클레오티드의 켄쳐와 포스페이트기를 분리할 수 있는 핵산 서열을 포함함);
b) 켄쳐가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄쳐가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 하나 이상의 음이온기를 더 포함하는 형광물질(여기서, 하나 이상의 금속 양이온이 형광물질의 음이온기와 결합되어 있음)을 샘플에 첨가하는 것; 및
c) 샘플로부터 형광을 검출하는 것
을 포함하며, 이 때 검출된 형광은 샘플 중 핵산 분석물질의 존재 및(또는) 양을 나타내는 것인, 샘플 중 핵산 분석물질의 존재 및(또는) 양의 검출 방법을 제공한다.
제13 실시양태에 따라,
a) 샘플 중의 핵산을 켄쳐로 표지하는 것;
b) 폴리뉴클레오티드의 제1 말단 영역에 포스페이트기를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 샘플을 인큐베이션하는 것(여기서, 상기 폴리뉴클레오티드는 핵산 분석물질에 혼성화될 수 있는 핵산 서열을 포함함);
c) 켄쳐가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄쳐가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 하나 이상의 음이온기를 더 포함하는 형광물질(여기서, 하나 이상의 금속 양이온이 형광물질의 음이온기와 결합되어 있음)을 샘플에 첨가하는 것; 및
d) 샘플로부터 형광을 검출하는 것
을 포함하며, 이 때 상기 폴리뉴클레오티드에 대한 핵산 분석물질의 혼성화가 형광을 감소시키고, 감소된 형광은 샘플 중 핵산 분석물질의 존재 및(또는) 양을 나타 내는 것인, 샘플 중 핵산 분석물질의 존재 및(또는) 양의 검출 방법을 제공한다.
제14 실시양태에 따라,
a) 말단 영역에 포스페이트기를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 말단 영역에 제2 접합되어 있는 켄쳐를 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드와 샘플을 인큐베이션하는 것(여기서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 및 핵산 분석물질은 제1 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 수 있음);
b) 켄쳐가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄쳐가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 하나 이상의 음이온기를 더 포함하는 형광물질(여기서, 하나 이상의 금속 양이온이 형광물질의 음이온기와 결합되어 있음)을 샘플에 첨가하는 것; 및
c) 샘플로부터 형광을 검출하는 것
을 포함하며, 이 때 상기 제1 폴리뉴클레오티드에 대한 핵산 분석물질의 혼성화가 형광을 증가시키고, 검출된 형광의 양은 샘플 중 핵산 분석물질의 존재 및(또는) 양을 나타내는 것인, 샘플 중 핵산 분석물질의 존재 및(또는) 양의 검출 방법을 제공한다.
제15 실시양태에 따라,
a) 말단 영역에 포스페이트기를 포함하며 폴리펩티드 분석물질에 결합할 수 있는 핵산 아프타머(aptamer), 및 켄쳐를 포함하며 핵산 아프타머에 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오티드와 샘플을 인큐베이션하는 것;
b) 켄쳐가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄쳐가 상기 형광물질의 수퍼켄 칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 하나 이상의 음이온기를 더 포함하는 형광물질(여기서, 하나 이상의 금속 양이온이 형광물질의 음이온기와 결합되어 있음)을 샘플에 첨가하는 것; 및
c) 샘플로부터 형광을 검출하는 것
을 포함하며, 이 때 상기 핵산 아프타머에 대한 폴리펩티드 분석물질의 결합이 형광을 증가시키고, 검출된 형광의 양은 샘플 중 폴리펩티드 분석물질의 존재 및(또는) 양을 나타내는 것인, 샘플 중 폴리펩티드 분석물질의 존재 및(또는) 양의 검출 방법을 제공한다.
제16 실시양태에 따라,
하나 이상의 아미노산 잔기가 인산화되거나 탈인산화될 수 있는, 바이오틴 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 및
켄칭 잔기에 접합되어 있는 바이오틴 결합 단백질
을 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드의 바이오틴 잔기는 단백질-단백질 상호작용을 통해 바이오틴 결합 단백질과 결합되어 있고, 켄칭 잔기는 형광물질과 결합되는 경우에 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있는 것인 복합체를 제공한다.
제17 실시양태에 따라,
a) 샘플을 상기 기재된 복합체와 인큐베이션하는 것(여기서 폴리펩티드는, 키나제 효소 분석물질의 경우에는 분석물질에 의해 인산화될 수 있는 하나 이상의 기를 포함하고, 포스파타제 효소 분석물질의 경우에는 분석물질에 의해 탈인산화될 수 있는 하나 이상의 기를 포함함);
b) 켄쳐가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄쳐가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 하나 이상의 음이온기를 더 포함하는 형광물질(여기서, 하나 이상의 금속 양이온이 형광물질의 음이온기와 결합되어 있음)을 샘플에 첨가하는 것; 및
c) 샘플로부터 형광을 검출하는 것
을 포함하며, 이 때 검출된 형광의 양은 샘플 중 분석물질의 존재 및(또는) 양을 나타내는 것인, 샘플 중 키나제 또는 포스파타제 효소 분석물질의 존재 및(또는) 양의 검출 방법을 제공한다.
제18 실시양태에 따라,
a) 키나제 효소 분석물질 검정의 경우에는 분석물질에 의해 인산화될 수 있는 하나 이상의 기를 포함하는 바이오티닐화된 폴리펩티드와 샘플을 인큐베이션하거나, 또는 포스파타제 효소 분석물질 검정의 경우에는 분석물질에 의해 탈인산화될 수 있는 하나 이상의 기를 포함하는 바이오티닐화된 폴리펩티드와 샘플을 인큐베이션하는 것;
b) 켄칭 잔기에 접합된 바이오틴 결합 단백질을 인큐베이션된 샘플에 첨가하는 것;
c) 켄칭 잔기가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄칭 잔기가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 하나 이상의 음이온기를 더 포함하는 형광물질(여기서, 하나 이상의 금속 양이온이 형광물질의 음이온기와 결합되어 있음)을 샘플에 첨가하는 것; 및
d) 샘플로부터 형광을 검출하는 것
을 포함하며, 이 때 검출된 형광은 샘플 중 분석물질의 존재 및(또는) 양을 나타내는 것인, 샘플 중 키나제 또는 포스파타제 효소 분석물질의 존재 및(또는) 양의 검출 방법을 제공한다.
도 1A 및 도 1B는 금속 이온-매개된 형광 수퍼켄칭 검정에 사용될 수 있는 중합체의 화학 구조를 보여준다.
도 2는 금속 이온-매개된 형광 수퍼켄칭을 기초로 하는, 효소-매개된 인산화 또는 탈인산화에 대한 활성 검정의 모식도이다.
도 3은 로다민으로 표지된 인산화된 펩티드에 의한 갈륨 센서의 켄칭에 관한 스턴-볼머(Stern-Volmer) 플롯이다.
도 4A 및 도 4B는 단백질 키나제 A(PKA)에 대한 종말점 및 역학 검정을 보여주는 그래프이다.
도 5는 억제제 존재하에서의 단백질 키나제 A(PKA) 검정 반응을 보여주는 그래프이다.
도 6은 단백질 티로신 포스파타제 1B(PTB-1B) 포스파타제 검정에서의 EC50 및 검출 한계를 입증하는 그래프이다.
도 7은 단백질 티로신 포스파타제 1B(PTB-1B) 활성의 억제를 보여주는 그래프이다.
도 8은 금속 이온-매개된 형광 수퍼켄칭을 기초로 하는 프로테아제 검정의 모식도이다.
도 9는 단백질 및 펩티드 기질을 사용하고 금속 이온-매개된 수퍼켄칭을 기초로 하는 차단 키나제 검정의 모식도이다.
도 10은 형광 발현(turn-on) 차단 키나제 검정을 보여주는 그래프이며, 여기서는 PKCα를 예로서 사용하였다.
도 11은 금속 이온-매개된 수퍼켄칭을 이용한 포스포디에스테라제 검정의 모식도이다.
도 12는 트립신 활성을 실시간 포맷 또는 역학 검정 포맷으로 모니터링한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 13은 한 실시양태에 따라 인산화된 폴리펩티드를 검출하는 방법을 예시한다.
도 14는 한 실시양태에 따라 바이오티닐화된 펩티드 기질(BT)을 사용한 검정에서 상대 형광을 단백질 키나제 A(PKA) 농도에 대한 함수로서 보여주는 그래프이다.
도 15는 인산화된 히스톤 및 인산화되지 않은 히스톤에 대한 상대 형광 반응을 보여주는 차트이다.
도 16은 추가의 실시양태에 따라 바이오티닐화된 펩티드 기질(BT)을 사용한 검정에서 상대 형광을 단백질 티로신포스파타제-1B(PTP-1B) 농도의 함수로서 보여주는 그래프이다.
도 17은 켄쳐-테터 접합체(QT)가 금속 이온 및 형광성 중합체 앙상블과 결합되어 형광성 중합체의 수퍼켄칭이 증폭되는 검정을 예시한다.
도 18은 금속 이온-매개된 수퍼켄칭 검정에 대한 포스포-펩티드 보정자(calibrator) 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 19는 금속 이온-매개된 수퍼켄칭 검정으로부터 얻은 단백질 키나제-A 농도 곡선을 보여준다.
도 20은 키나제 반응에서 제2 단계에 첨가된 스트렙타비딘 켄쳐 분자의 결합을 통한 금속 이온-매개된 형광 수퍼켄칭을 기초로 하는 키나제 효소 활성 센서에 대한 모식도이다.
도 21A 및 도 21B는 바이오티닐화된 기질 및 켄쳐(즉, 로다민)로 표지된 기질을 사용한 2-단계 접근법을 이용하여 PKA에 대한 종말점을 검정하는 방법을 비교한 그래프로, 도 21A은 RFU를 PKA 농도의 함수로서 보여주고 도 21B는 인산화율(％)을 PKA 농도의 함수로서 보여준다.
도 22는 3가지 상이한 효소(즉, PTP-1B, PKCα 및 PKA)와 각각 반응하는 일곱가지(7) 상이한 바이오티닐화된 펩티드 기질을 사용한 스크리닝 결과를 예시하는 막대 차트이다.
바이오센싱에 대한 켄쳐-테터-리간드(QTL) 접근법은, 전자 전달 및 에너지 전달 켄쳐에 의한 형광성 고분자전해질의 수퍼켄칭의 이점을 이용한다. QTL 검정 플랫폼(platform)은, 접합된 중합체의 광 수거력 및 이들의 고도로 변화된 여기 상태를 이용하여 매우 소량의 전자 전달 종과 에너지 전달 종의 존재에 대한 반응에서의 형광 신호 증폭을 조정한다. 이러한 새로운 기술은 신호 조정 현상을 항원-수용체, 기질-효소 및 올리고뉴클레오티드-올리고뉴클레오티드 결합 상호작용과 관련지어서 단백질, 소분자, 펩티드, 프로테아제 및 올리고뉴클레오티드를 고도로 민감하게 검출하는데 적용되어 왔다 [1-9].
한 접근법에서, 형광성 중합체 P는 용액 중에서 또는 고체 지지체 상에서 바이오틴-바이오틴 결합 단백질 상호작용을 통해 바이오틴 결합 단백질과 공존하면서 켄쳐-테터-바이오틴(QTB) 생체접합체와 결합 복합체를 형성한다. QTB 생체접합체는 반응성 테터를 통해 바이오틴에 연결된 켄쳐 Q를 포함하며, 이 바이오틴은 중합체 P와 공존하는 바이오틴 결합 단백질에 강력하게 결합한다. QTB 생체접합체와 표적 분석물질의 반응은 중합체 형광을 쉽게 검출할 수 있는 방식으로 변형시킨다.
본원에 기재한 바와 같이, 용액 중의 개별 분자로서 또는 지지체 상의 조립체로서의 형광성 고분자전해질이 금속 이온과 복합체를 형성하는 자가-조직화 능력을 이용하여 QTL 생체접합체를 형광성 중합체와 결합시키는 별법의 방법이 개발되어 왔다. 따라서, 복합체를 형성한 금속 이온은 QTL 생체접합체에 혼입된 배위기(예를 들어 포스페이트기)와 선택적으로 결합할 수 있어서, 예를 들어 단백질, 소분자, 펩티드, 프로테아제, 키나제, 포스파타제 및 올리고뉴클레오티드의 선택적 검출을 위한 기초를 제공한다 [10-11].
수용자 분자(즉, 켄쳐)가 공여자 분자의 효율을 켄칭할 수 있는 효율은, 이들 2개의 물질이 분리되어 있는 거리에 따라 달라진다. 검정법을 고안하는데 있어서, 분자들의 테터링(수용자와 공여자가 가까워지도록 함)은 공유 결합 및 바이오틴-아비딘 상호작용과 같은 통상의 전략으로 수행될 수 있다. 공유 결합은 켄쳐가 수용자 상에 직접 위치하도록 하여 이들을 한 분자로 만들기 때문에 공명 에너지 전달을 위한 우수한 접근법이다. 따라서, 켄쳐와 수용자 사이의 거리는 단일 결합 길이 정도로 적을 수 있다. 한편, 어떠한 분자라도 대부분 바이오틴에 공유 결합으로 연결될 수 있기 때문에 바이오틴과 바이오틴 결합 단백질(BBP), 예를 들어 아비딘 사이의 상호작용은 광범위한 이용성을 제공한다. 그러나, 바이오틴 결합 단백질은 일반적으로 60 kDa 보다 커서, 수용자와 공여자가 바이오틴-BBP 상호작용에 의해 가까워져도 수용자와 공여자 사이의 거리는 유의하게 먼 것일 수 있다.
바이오틴-BBP 상호작용에 대한 일반적인 대체안으로서, 본 발명자들은 수퍼켄칭 검정에서 수용자와 공여자를 공존시키기 위해서 금속 이온과 포스페이트의 상호작용을 이용할 것을 제안한 바 있다. 바이오틴-BBP 상호작용의 경우처럼, 이 전략은 많은 분자들이 인산화될 수 있다는 점에서 일반적으로 적용될 수 있다. 또한, 이 전략은 테터의 말단과 말단 거리(즉, 금속 이온과 포스페이트 사이의 배위 거리)가 유의하게 더 짧기 때문에 바이오틴-아비딘 상호작용에 비해 일반적으로 더 개선된 것이다. 포스페이트기 등과 같은 리간드에 대한 금속 이온의 친화도는 바이오틴-BBP 상호작용에서의 경우에 비해 유의하게 더 낮다(Ka = 105-7 vs. 1013-15).
한 실시양태에 따라, 금속 이온과 복합체를 형성한 형광성 고분자전해질을 용액 중의 개별 분자로서 포함하거나 또는 지지체 상의 조립체로서 포함하는 신규 센서가 제공된다. 센서의 금속 이온은 QTL 생체접합체에 혼입된 리간드(예를 들어, 포스페이트기)와 선택적으로 추가 결합될 수 있고, 종말점 및 역학 방식 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 방식으로 상기 기재한 것과 동일한 분자(예를 들어, 단백질, 소분자, 펩티드, 프로테아제, 키나제, 포스파타제 및 올리고뉴클레오티드)를 선택적으로 검출할 수 있는 기초를 제공한다. 하기에 전개하겠지만, 몇몇 검정에 있어서는 배위기-금속 이온 결합이 바이오틴-바이오틴 결합 단백질의 결합에 대한 대안을 제공한다. 다른 예에서, 배위기는 QTL의 켄쳐 부분에 부착되거나 그로부터 제거되어 센서 형광의 켄칭 또는 복구(또는 이들 모두)를 제공한다.
본원에 기재한 여러가지 실시양태는 형광성 중합체-QTL 수퍼켄칭 및 금속 이온과 포스페이트 리간드의 특이적 결합을 이용하여, 키나제, 포스파타제 및 프로테아제 활성에 대한 개선된 검정법을 제공한다. 형광성 중합체의 금속 이온-매개된 수퍼켄칭은 펩티드 및 단백질 기질을 사용한 키나제, 포스파타제 및 프로테아제 효소 활성의 측정에 일반적인 플랫폼을 제공할 뿐만이 아니라 DNA 혼성화를 기초로 하는 검정, 및 아프타머, 항체 및 다른 리간드를 사용한 단백질 검정을 수행하기 위한 보다 일반적인 접근법을 제공한다.
폴리(페닐렌에티닐렌)(PPE) 족의 접합된 중합체는 방향족 고리상에 수반된 다양한 관능기를 갖도록 제조될 수 있다. 펜던트(pendant) 음이온기를 갖도록 합성된 중합체를 도 1A 및 도 1B에 나타내었다. 도 1A는 술포 폴리 p-페닐렌에티닐렌(PPE-Di-COOH) 접합된 중합체의 분자 구조를 보여준다. 도 1B는 술포 폴리 p-페닐렌에티닐렌(PPE) 접합된 중합체의 분자 구조를 보여준다. 이들 중합체 모두가 물 중에서 양이온성 미소구와 결합되어 안정한 중합체 코팅물을 형성할 수 있다. 상기 중합체-코팅된 미소구는 강력한 형광을 발한다. 중합체-코팅된 미소구상의 전체 전하는 중합체 하중(loading)의 정도를 변화시키고 중합체 구조를 변화시키켜 조정할 수 있다.
형광성 중합체로 코팅된 미소구는 금속 양이온과 결합될 수 있으며 금속 양이온의 하중은 미소구상의 중합체 하중 수준에 따라 달라질 수 있음이 밝혀졌다. Fe3 + 및 Cu2 + 등과 같은 특정 금속 이온은 중합체 형광을 켄칭할 수 있지만, Ga3+과 같은 것들은 그렇지 못하다. 몇몇 실시양태에서, Ga3 +는 금속 이온의 부재하에서는 켄칭이 거의 일어나지 않거나 전혀 일어나지 않는 조건하에서 미소구에 결합된 중합체 형광의 수퍼켄칭을 매개하는데 사용된다
예를 들어, 염료를 함유하는 인산화된 펩티드인 로다민-LRRA(pS)LG(서열 1)(여기서의 pS는 인산화된 세린을 지칭함)는 중합체를 위한 양호한 에너지 전달 켄쳐로 기능해야 하지만, 이 펩티드는 중합체-코팅된 미소구의 형광을 거의 켄칭하지 못하거나 전혀 켄칭하지 못하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 상기한 중합체-코팅된 미소구에 Ga3 +를 첨가하여 이 미소구를 "하전"시키고 이 현탁액에 동일한 펩티드를 첨가하면 중합체 형광이 켄칭된다. 반대로, 인산화된 잔기만을 함유하거나 켄쳐 염료만을 함유하는 펩티드, 예를 들어 로다민-LRRASLG(서열 2)로 표시되는 펩티드는 동일한 조건하에서 중합체 형광에 거의 영향을 주지 않는다. 인산화된 생체분자와 금속 이온으로 하전된 중합체와의 특이적 결합은 하기하는 수많은 검정법의 기초가 될 수 있다.
도 2는 금속 이온-매개된 수퍼켄칭을 기초로 하는 센서를 모식적으로 보여주며, 이것은 키나제 또는 포스파타제 활성 검정에 이용될 수 있다. 도 2는 표적 효소에 의한 로다민 펩티드 기질의 인산화 또는 탈인산화가 QTL 센서의 첨가로 검출될 수 있는 방법을 보여준다. 펩티드 생성물은 로다민 켄쳐로 표지되고 포스페이트와 Ga3 + 금속 이온과의 특이적 결합을 통해 중합체 표면으로 이동된다. 이로 인한 중합체 형광의 켄칭은 폴리펩티드 기질의 인산화 또는 탈인산화와 동시에 일어난다. 이러한 유형의 검정법은 펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물 및 뉴클레오티드 또는 소분자 등이 있으나 이에 제한되지 않는 생물학적 기질의 인산화 또는 탈인산화를 조정하는 효소에 대하여 이용될 수 있다.
키나제 / 포스파타제 검정
단백질의 인산화 및 탈인산화는 세포의 대사, 성장, 분화 및 세포 증식의 조절을 매개한다. 효소 기능의 이상은 암 및 염증 등과 같은 질환을 야기할 수 있다. 500종이 넘는 키나제 및 포스파타제가 세포 활성의 조절에 관여한다고 여겨지고 있고, 이들 중 많은 것들이 약물 요법의 표적이다.
단백질 키나제 A(PKA)는 cAMP 의존성 단백질 키나제이며, 호르몬 및 신경전달물질 등과 같이 cAMP를 상승시키는 많은 1차 전달자의 이펙터로 기능한다. PKA의 편재된 분포 및 이것의 유연성있는 기질 인식성으로 인해, PKA는 림프구 세포 증식 및 면역 반응의 억제, 감각 신경 전달 및 해마에서의 장기적인 기능저하의 조정 등과 같이 살아있는 세포의 여러 과정에서 중추적 역할을 담당한다. 단백질 티로신포스파타제-1B(PTP-1B)는 최근에 인슐린 신호전달 경로의 음성 조절자인 것으로 밝혀져서, PTP-1B에 대한 억제제가 제II형 당뇨병의 치료에 유익할 수 있음을 시사한다.
키나제의 90％는 세린 잔기를 인산화하고 10％는 트레오닌 잔기를 인산화하며 0.1％는 티로신 잔기를 인산화한다. 항-포스포티로신 항체의 개발은 가능해졌지만, 포스포세린 및 포스포트레오닌 잔기에 대한 항체는 친화도가 낮고 종종 오직 1종의 키나제에 대해서만 특이적이다. 일반적으로, 비-항체-기초의 고처리량 스크리닝(HTS) 검정은 시간 분할 형광(TRF, Time-Resolved Fluorescence), 형광 편광 검정(FP, Fluorescence Polarization assay) 또는 형광 공명 에너지 전달(FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer) 등과 같은 방법을 기초로 한다. 이들 검정에는 특별한 장치가 요구되고(되거나) 효소 활성의 함수로서의 형광 강도 변화가 낮다.
본 발명자들은 상기한 바와 같이 수퍼켄칭을 이용하여 형광 신호를 증폭시키면 효소 활성 측정시의 민감도가 증대된다는 것을 알아냈다. 센서 플랫폼은 도 1A에 나타낸 폴리(페닐렌에티닐렌)(PPE) 유도체 등과 같은 변형된 음이온성 고분자전해질 형광물질을 포함할 수 있다. PPE 형광물질은 양으로 하전된 미소구 상에서 흡착을 통해 고정될 수 있다. 이 중합체는 높은 효율로 광발광을 발하고, 프로테아제 활성의 검출에 이용되어 왔다 [9]. 이 플랫폼에서, 반응성 펩티드 서열은 N-말단 켄쳐와 C-말단 바이오틴이 측접(flanking)된 상태로 사용되었다. 펩티드는 바이오틴 결합 단백질과 공존하는 PPE-코팅된 미소구에 결합하고, 이에 따라 PPE 형광의 거의 전부가 켄칭된다. 효소-매개된 펩티드 절단은 효소 활성과 선형 관계에 있는 형광 켄칭의 반전을 초래한다. 에너지 수용자 염료 하나가 켄쳐 하나 당 대략 49개의 반복 단위로부터의 광발광을 켄칭할 수 있다는 것이 입증된 바 있다 [9].
형광성 중합체 수퍼켄칭은 도 2에 예시된 바와 같은 키나제/포스파타제 효소 활성의 생물검출에 이용될 수 있다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 다가 금속 이온은 용액 중의 음이온-접합된 중합체와 강력하게 결합되어, 중합체 형광의 변형 및(또는) 켄칭을 초래할 수 있다. 중합체-미소구 앙상블상의 전체 전하를 조정할 수 있기 때문에, 이들 앙상블은 금속 이온이 중합체 형광을 강력하게 켄칭하지는 않지만 특이적 리간드와 복합체를 형성하는 능력은 보유하면서 중합체와 결합되는 플랫폼을 제공할 수 있다. 상기 접근법은, 금속 이온이 낮은 pH에서 포스페이트 산소와의 배위를 통해 인산화된 화합물을 특이적으로 포획할 수 있는 고정된 금속 이온 친화도 크로마토그래피(IMAC)에서 사용되는 것과 유사하다. 예를 들어 문헌 [Morgan et al., Assay Drug Dev. Technol., 2004, 2, 171]을 참조한다.
본원에 기재한 바와 같이, 갈륨은 중합체 형광방출을 켄칭하지 않으면서 형광물질(도 1A 및 도 1B에 나타낸 바와 같은 음이온-접합된 중합체 및 복수개의 형광성 종을 포함하는 기타 형광물질 등이 있으나 이에 제한되지 않음)와 결합될 수 있다. 갈륨은 단량체성 Ga3 + 또는 다량체 앙상블, 예를 들어 폴리옥소 종으로 존재할 수 있다. 형광물질과 결합된 갈륨은 인산화된 펩티드와도 결합할 수 있어서, 펩티드가 로다민과 같은 염료를 함유하는 경우에는 금속 이온-매개된 중합체 수퍼켄칭이 일어난다. 형광물질은 미소구와 같은 고체 지지체의 표면에 결합될 수 있다. 도 2에 예시된 바와 같이, 이 접근법은 민감하고 선택적인 키나제/포스파타제 검정을 위한 기초를 제공한다.
형광 켄칭(소멸(turn-off)) 키나제 검정의 경우에, 중합체 형광의 켄칭은 효소 활성과 선형 관계에 있다. 하기 예에서 기재하는 바와 같이, 이 검정은 생리학적 pH에 가까운 pH에서 수행할 수 있으며, 실시간 또는 종말점 검정의 고안시에 융통성을 허용한다. 이 검정에서는 즉각적인 "혼합 및 판독"이 일어나고, 세척 단계 또는 복잡한 샘플 제조가 필요없다.
하기 실시예 1은 단백질 키나제 A(PKA) 및 단백질 티로신 포스파타제 1B(PTB-1B) 효소 활성에 대한 강력한 검정법을 보여준다. 통상적으로, 이 검정은 10 내지 20％의 기질 전환율에서 0.9 초과의 Z' 값을 제공한다. 하기에 나타낸 예에서, 키나제 검정에서는 효소 활성의 함수로서의 형광 신호가 감쇠되지만, 포스파타제 검정에서는 효소 활성의 증가에 따라 신호가 증대된다. 서열 1과 같은 펩티드의 경우에는 켄쳐가 중합체 형광을 켄칭함으로써 민감한 형광을 나타낼 수 있기 때문에, 상기 검정은 동일한 샘플에서 모니터링하는 파장에 따라 신호 증대 또는 신호 감소를 나타낼 수 있다. 따라서, 비율적(ratiometric) 측정이 이루어질 수 있다. 또한, 검출은 펩티드의 켄쳐에서 형광 편광을 모니터링하여 수행될 수 있다. 금속 이온-매개된 수퍼켄칭을 기초로 하는 단백질 키나제, 포스파타제 및 프로테아제 검정을 위해서는 종말점 및 역학 검정 모두를 수행할 수 있다.
실시예 1 - 단백질 키나제 A( PKA ) 및 티로신 포스파타제 활성 1B( PTP -1B)에 대한 검정
하기하는 펩티드를 효소 기질 및 포스포-펩티드 보정자로 사용하였다.
- PKA 활성 검출용: 로다민-LRRASLG (서열 2)
- 보정자 펩티드: 로다민-LRRA(pS)LG (서열 1)
(이들 펩티드는 아나스펙(Anaspec)으로 합성하였음).
- 포스파타제 활성 검출용:로다민-KVEKIGEGT(pY)GVVYK(서열 3)
- 보정자 펩티드: 로다민-KVEKIGEGTYGVVYK (서열 4)
(이들 펩티드는 아메리칸 펩티드 컴파니(American Peptide Company)가 합성하였음).
재조합 PKA는 프로메가(Promega)에서 구입하였다. 효소 PTP-1B와 억제제 RK682는 바이오몰(Biomol)에서 구입하였다. PKA에 대한 스타우로스포린(Staurosporine) 억제제는 시그마(Sigma)에서 구입하였다. 폴리스티렌 아민 관능화된 비드는 인터페이셜 다이나믹스(Interfacial Dynamics)에서 구입하였다.
센서 비드의 성능은, 검출기 완충액 중의 센서 15 ㎕에 검정 완충액 중의 1 μM 펩티드 용액(로다민-포스포-펩티드 또는 로다민-비-포스포-펩티드) 15 ㎕를 첨가하여 측정하였다. 스펙트라맥스 제미니 XS 플레이트(SpectraMax Gemini XS plate) 판독기(모레큘라 디바이시즈, 인크.(Molecular Devices, Inc.) 제품)를 웰 스캔 방식으로 이용하고 475 nm 컷오프(cutoff) 필터를 통한 450 nm에서의 여기 및 490 nm에서의 방출을 이용하여 혼합물의 형광을 측정하였다.
도 1A에 나타낸 구조의 중합체는 2가 또는 3가 금속 이온이 도 1A 및 도 1B에 나타낸 것과 같은 용액 중의 음이온성 중합체와 강력하게 결합될 수 있다는 발견을 기초로 하여, 키나제/포스파타제 검정용 센서로서 선택된 것이다. 340 μM 농도의 GaCl3을 PPE-Di-COOH로 코팅된 미소구를 포함하는 용액에 첨가하였을 때에는 형광방출의 켄칭이 전혀 관찰되지 않았다. GaCl3의 농도를 더 높였을 때에는 형광 방출의 켄칭이 관찰되었다. 그러나, 최적 농도의 Ga3 +가 사용된 경우에는, 로다민으로 표지된 포스포-펩티드가 중합체 형광을 강력하게 켄칭하는 것으로 밝혀졌지만, 인산화되지 않은 로다민으로 표지된 펩티드가 사용된 경우에는 형광 변경이 거의 관찰되지 않았다.
도 3은 로다민으로 표지된 PTP-1B 포스포-펩티드 기질에 대하여 얻은 스턴-볼머 플롯을 보여준다. 스턴-볼머 상수(KSV)는 정량적인 켄칭 측정치를 제공하며, 여기서의 F0는 켄쳐 부재하의 형광 강도이고 F는 켄쳐 존재하의 형광 강도이다. 여기서 측정된 KSV는 비교적 높다(즉, 2×107 M-1). 50％ 켄칭은(PRU/Q)50 = 50를 제공하여, 수퍼켄칭의 발생을 입증하였다.
상기에 나타낸 바와 같이, 켄쳐로 표지된 기질을 이용한 검정법이 개발되었다. 펩티드는 기질 인산화 후에 포스페이트기를 통해 센서와 결합되어 형광을 켄칭한다. 금속 이온 배위기는 포스페이트에 특이적으로 결합하기 때문에, 인산화된 세린, 트레오닌 또는 티로신 잔기가 검출될 수 있다.
세린 및 티로신 효소, 즉 단백질 키나제 A(PKA), 및 단백질 티로신 포스파타제 1-B(PTP-1B)에 대한, 형광성 수퍼켄칭을 기초로 하는 검정법을 하기에 기재한다.
도 4A는 중합체 켄칭의 증가가 효소 농도와 상관관계가 있는 PKA 효소 활성의 종말점 측정을 보여준다. 매우 낮은 pH를 요구하는 Fe3 + 배위 검정과는 달리, 이 플랫폼은 생리학적 pH에 가까운 pH에서 기능적이어서, 연구가들은 실시간 검정 또는 종말점 검정 수행시 선택에 융통성을 갖게 된다. 검출기 혼합물을 효소 반응 혼합물의 일부로 포함하는 실시간 검정에서는 50％ 기질 인산화에 필요한 효소 농도가 도 4B에 나타낸 종말점 검정보다 대략 10배 더 높다.
상기 검정의 민감도를 PKA 활성의 공지된 억제제인 스타우로스포린을 사용하여 시험하였다. 이 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 6.5 μM ATP 및 200 mU PKA를 사용한 반응에서 1 μM 기질을 사용하여 얻은 IC50은 59 mU이었고, 이것은 이전에 공표된 값(18.4 mU)과 일치하는 것이다.
상기 포맷을, PKA에 대해 사용된 것과는 길이 및 서열 조성이 상이한 펩티드 기질에 대해서 단백질 티로신 포스파타제 1B(PTP-1B)의 활성을 검출하기 위해 시험하였다. 도 6은 PTP-1B를 사용하여 125 nM 기질에 대해 종말점 검정으로 측정하거나 실시간 측정한 효소 농도 곡선의 EC50 및 LOD 결과를 보여준다. 공지된 억제제인 RK-682를 사용한 억제제 곡선은 26.4 nM이라는 우수한 IC50을 산출하였다.
이 검정으로 제공될 수 있는 통계적 파라미터는, 알려진 양의 포스포-펩티드 보정자 펩티드를 8회 반복 평가하여 결정되었다(도 6). 상기 데이타는 우수한 것으로서, 기질 전환율이 5 내지 10％밖에 안되어도 이 검정은 각각 0.8 및 0.9의 Z' 인자로 측정하는데 적합하다는 것을 보여준다.
이러한 PKA 검정의 성능을 시판되는 FRET 검정, ATP 소모 검정 및 IMAC-기초의 검정과 비교하였다. 가능한 한 동일한 펩티드를 사용하여, 모든 검정을 효소 농도 곡선에서 최적의 성능을 발휘하도록 수행하였다. IMAC-기초의 검정은 효소 농도 곡선에서 최저의 민감도를 제공한다(1 ng vs. 20 pg). 원리상으로는 QTL 라이트스피드(Lightspeed; 상표명) 검정에 가장 근접한 이 검정에서는 센서:검출기의 비율이 1:1이었고, 이것은 본 발명에서의 포맷인 1:50 비율과 대비되는 것이었다. 이들 결과는 수퍼켄칭을 사용할 때 민감도가 증대됨을 명백하게 입증하는 것이다.
Akt-1 및 PKCα에 대한 기질을 사용하는 추가의 검정법이 개발되었다. 이러한 여러 기질을 사용할 때, 형광 켄칭은 기질 길이 또는 펩티드 서열 함량과는 유의한 관련이 없는 것으로 관찰되었다. 이와 관련하여, 금속 이온-매개된 수퍼켄칭 검정은 일반형(generic)이라고 여겨질 수 있으며, 켄칭이 공여자와 수용자 사이의 거리에 고도로 의존적인 FRET 펩티드에 비해 중요한 이점을 제공한다.
프로테아제 검정
프로테아제 효소는 그의 기질에 존재하는 아미드 결합을 절단한다. 절단 부위의 어느 한쪽에 켄쳐 및 포스페이트기를 함유하는 펩티드 또는 단백질 기질 및 금속 이온-형광성 중합체 앙상블을 사용함으로써, 프로테아제 효소 활성을 검출하는데 고도로 민감한 검정법을 개발할 수 있다.
프로테아제 검정의 한 실시양태를 도 8에 예시하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 무손상 기질이 센서와 결합하면 켄쳐 염료의 근접성으로 인해서 센서 형광은 켄칭된다. 이 효소에 의해서 기질이 단편으로 절단되면 켄쳐가 포스페이트기로부터 분리되어 켄쳐와 중합체가 분리된다. 이러한 분리는 효소 활성의 존재하에서 중합체 형광의 켄칭 감소를 초래한다(즉, 센서로부터의 신호가 증대됨).
프로테아제 활성은 동종 또는 이종 포맷으로 실시간 모니터링되거나 또는 종말점에서 모니터링될 수 있다. 동종 실시간 검정에서, 기질은 중합체-미소구 앙상블의 표면상에 놓일 수 있다. 동종 종말점 검정에서, 기질 및 효소는 용액 중에서 반응할 수 있으며, 명시된 인큐베이션 기간의 종료시에는 상기 샘플에 센서를 첨가하여 반응을 중단시킬 수 있다. 형광성 염료가 켄쳐로 사용되는 경우에는 프로테아제 활성을 비율적으로 모니터링할 수 있다. 이종 종말점 포맷에서는, 절단 부위의 동일한 쪽에 포스페이트기와 켄쳐를 함유하는 바이오티닐화된 기질이 사용될 수 있다. 절단된 후의 펩티드 종은 바이오틴 종의 결합에 의해 분리되고, 켄쳐로 표지된 부분은 이동하여 형광물질을 켄칭할 수 있다.
실시예 2 - 금속 이온- 매개된 형광 수퍼켄칭을 기초로 하는 프로테아제 검정
이 검정에서 트립신에 대한 펩티드 기질은 로다민-LRRApSLG(서열 1)였다.
트립신은 2개의 아르기닌에서 펩티드를 절단한다. 본 실시예에서 수행된 검정에서는 하기하는 파라미터를 사용하였다:
- 미소구-형광물질-갈륨 앙상블(QTL 센서),
- 3 μM 최종 Rh-LRRApSLG(서열1),
- 1 U/㎕ 트립신,
- 40×106개 미소구(MS)/15 ㎕,
- λex 430,
- λem 490, 및
- λco 475 nm.
상기 검정을 1시간 동안 대략 22℃에서 384-웰 화이트 플레이트에서 수행하였다. 이 검정의 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
금속 이온- 매개된 형광 수퍼켄칭을 기초로 하는 프로테아제 검정의 결과
QTL 센서 단독 효소 대조군 없음 샘플 88842 7771 42138
신호 증가 신호/배경(background) Z' 신호/노이즈 34367 5.42 0.68 9.69
도 12는 트립신 활성을 "실시간"(즉, 역학) 검정 포맷으로 모니터링한 결과를 보여주는 그래프이다. 도 12에서 알 수 있는 바와 같이, 트립신 활성은 시간 의존적으로 증가한다. 이에 상응하여, 형광 신호도 시간에 따라 증대한다.
표지되지 않은 펩티드 및 단백질을 사용한 차단 검정
앞서 기재하고 도 2에 나타낸 검정법의 기초는, "일반형의" 인산화된 염료로 표지된 펩티드나, 또는 염료 및 포스페이트에 결합하는 금속 이온(예를 들어 갈륨)을 둘다 함유하는 다른 기질은 인산화된 추가의 기질이 없어도 형광성 중합체 및 금속 이온을 함유하는 중합체 비드를 켄칭하지만, 펩티드 또는 단백질 기질이 인산화된 경우에는 "차단"되는 차단 검정으로 변형될 수 있다.
상기 검정의 원리를 도 9에 나타내었고, 이것은 금속 이온-매개된 수퍼켄칭을 기초로 하는 차단 키나제 검정을 모식적으로 예시한다. 가장 편리하게는, 상기 검정은 효소와 분석물질의 혼합물을 인큐베이션하여 반응시킨 후에 여기에 센서를 첨가하여 수행된다. 도 9에서 입증되는 바와 같이, 인산화된 임의의 분석물질은 중합체 형광을 켄칭하지 않으면서 센서와 결합된다. "일반형의" 인산화된 염료로 표지된 펩티드를 첨가하면 중합체 형광이 켄칭되지만, 이것은 "차단"된 미소구상의 "유리" 포스페이트 결합 부위의 정도에 따라 제한된다. 상기 검정은 형광 "발현" 검정으로서 기능하고, 검정 진행에 있어서 기질의 사전 유도체화를 실시할 필요가 없다는 추가의 이점을 제공한다. 도 10은 마이엘린 염기성 단백질(MBP, Myelin Basic Protein)를 사용하여 PKCα에 대한 차단 검정("형광 발현")을 실시한 실험 데이타를 보여준다.
천연 단백질 기질에 대한 키나제 활성의 검출은, 펩티드 기질을 사용한 경우와 비교할 때 하기하는 바와 같은 여러가지 이점이 있다:
● 518종의 공지된 인간 키나제(또는 2500종의 이소형(isoform)) 중에서, 펩티드 기질은 대략 50종의 키나제에 대해서만 수립되어 있지만, 표적 단백질은 대부분의 경우에서 확인되어 있다. 몇몇 효소는 효과적인 기질 인식, 결합 및 인산화를 위해 표적의 비-연속 아미노산을 필요로 하는 경우가 있어서, 이 경우에는 관련 아미노산이 확인되어 있다 하더라도 인공 펩티드 서열을 이용할 수 없다.
● 천연 표적 단백질의 인산화는 펩티드 기질의 인산화보다 훨씬 더 효율적이라고 예측된다. 이것은 비용(펩티드 기질의 비용)면에 있어서도 중요하지만, 또한 HTS에서의 억제제 확인을 보다 정확하게 만들기도 한다.
● 천연 표적 단백질의 인산화는 인공 기질의 인산화보다 더 특이적이다. 세포 내 키나제 활성을 분석하려는 이후의 시도는 펩티드 기질의 교차 인식으로 인해 저해되겠지만 단백질 기질을 대상으로 수행되어야 한다.
● 단백질의 인산화를 검출할 수 있는 현행의 비-방사성 및 비-항체 기재의 검정은 2차 효소인 루시퍼라제에 의한 ATP 소모를 기초로 한다. 이러한 검정에서는 2차 효소인 루시퍼라제가 억제되기 때문에 억제제 스크리닝시에 가음성(false negative) 결과가 초래되는 경향이 있다. FP 검정에서 신호를 얻기 위해서는 분자의 움직임에 커다란 변화가 요구되기 때문에 작은 분자량의 단백질만이 검출될 수 있다.
실시예 3
키나제 PKCα에 의한 마이엘린 염기성 단백질(MBP)의 인산화를 표준 반응으로 수행하고, 실시예 2에서 상기한 바와 같이 QTL 센서를 첨가하였다. 인산화된 MBP는 금속 배위 이온과의 특이적 포스페이트 결합을 통해 QTL 센서에 결합하고, 염료로 표지된 포스포-펩티드(추적자)의 결합은 농도 의존적 방식으로 억제된다. 생성되는 형광은 mbp의 인산화 정도와 상관관계가 있다.
이 원리는 하기하는 예에서 입증된다. 연속 희석된 키나제 PKCα 효소를 사용하여, 1 ㎍ mbp의 농축물을 1시간 동안 실온에서 화이트 384-웰 옵티플레이트(Optiplate)에서 인산화시켰다. 인큐베이션 후, 50×106개의 QTL 센서 비드를 대략 22℃에서 10분 동안 첨가한 후에 1 μM 염료로 표지된 펩티드 추적자를 첨가하였다. 플레이트를 30분 동안 대략 22℃에서 인큐베이션하고, 제미니 XS 플레이트 판독기(모레큘라 디바이시즈, 인크. 제품)에서 475 nm 컷오프(cutoff) 필터를 통한 450 nm에서의 여기 및 490 nm에서의 방출을 이용하여 형광 신호를 모니터링하였다. 형광 "발현"은 도 9에 모식적으로 나타내었다.
금속 이온- 매개된 형광 수퍼켄칭에 의한 포스포디에스테라제 효소 활성의 모니터링
3',5'-시클릭 뉴클레오티드 포스포디에스테라제(PDE)는 시클릭 아데노신 모노포스페이트(cAMP) 및(또는) 시클릭 구아노신 모노포스페이트(cGMP)의 3' 결합을 특이적으로 절단하여 상응하는 5'-뉴클레오티드를 생성하는 메탈로포스포히드롤라제 족을 포함한다. cAMP 및 cGMP에 대한 선택성이 다른 11개 족의 PDE가 포유동물 조직에서 확인된 바 있다.
PDE는 세포의 cAMP 및(또는) cGMP 수준에 대한 필수 조정자이다. 시클릭-AMP 또는 cGMP는 중요한 세포내 과정과 관련이 있는 세포내 신호 도입에서 중대한 역할을 수행하는 세포내 2차 전달자이다. PDE는 각종 질환의 치료용 약물 발견을 표적으로 해 왔다. 예를 들어, PDE5의 선택적 억제제인 실데나필(Sidenafil)은 약물로서 시판되고 있다(즉, 비아그라(Viagra)(등록상표), 화이자, 인크.(Pfizer, Inc.)의 등록상표명). 여러가지 PDE4 억제제가 천식 등과 같은 질환 치료용 소염 약물로서 임상 시험 중에 있다.
상기한 바와 같이, QTL 센서는 키나제 및 포스파타제 검정에서 입증된 바와 같이 포스페이트기에 대하여 높은 결합 친화도를 나타낸다. PDE 검정은 염료로 표지된 cAMP 또는 cGMP를 기질로서 사용하여 포스포디에스테라제의 활성을 검정한다. 로다민, 아조 또는 플루오레세인 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 염료가 PDE에 대한 cAMP 또는 cGMP의 반응성을 억제하지 않으면서 cAMP 또는 cGMP에 커플링될 수 있다. cAMP 또는 cGMP는 포스포디에스테르로서 존재하기 때문에 갈륨-중합체 표면에 강력하게 결합하지 않으며, 초기에는 중합체 형광의 켄칭이 거의 일어나지 않는다. PDE에 의해 가수분해가 촉매되는 동안에, 이들 기질상의 포스포디에스테르는 포스페이트기로 전환된다. 이어서, 염료가 갈륨-포스페이트 특이적 상호작용을 통해 미소구 표면의 근방으로 이동되어 중합체 형광을 켄칭시킨다. 도 11은 포스포디에스테라제 검정을 도시한 모식도이다.
핵산 검정
금속-포스페이트 매개된 결합을 이용하여 DNA 및 RNA 검출을 위한 수퍼켄칭 검정을 수행할 수 있다. 핵산 종과 용액 중에 존재하거나 고체 지지체 상에 고정되어 있을 수 있는 표적 핵산 종과의 혼성화를 기초로 하는 수많은 여러가지 접근법이 이용될 수 있다. 제1 접근법은 말단 중 하나가 인산화된 올리고뉴클레오티드를 이용한다. 포스페이트는 DNA 가닥 및 접합된 형광성 중합체가 금속-포스페이트로 매개되어 공존할 수 있게 한다. 포스페이트기가 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 부착된다면, 3'-말단에 켄쳐를 보유하는 상보적 표적은 이 인산화된 가닥에 혼성화될 수 있다. 상기 말단은 기능적 시스템을 보유하면서 반전될 수도 있다. 이와 같이 혼성화된 형태에서는 켄쳐가 접합된 중합체 쪽으로 배향되어 수퍼켄칭을 용이하게 한다. 따라서, 켄쳐로 표지된 표적의 존재하에서는 중합체의 형광이 켄칭된다. 이러한 시스템은 표지되지 않은 DNA 가닥과 표지된 DNA 가닥이 그들의 인산화된 상보적 가닥과의 결합에 대하여 경쟁하도록 하기 때문에, 표지되지 않은 DNA에 대한 검정법으로 쉽게 고안될 수 있다.
제2 접근법은 모레큘라 비콘(molecular beacon)에 의해 사용된 접근법과 유사한 전략을 따른다. 말단 중 하나에는 포스페이트를 보유하고 다른 쪽 말단에는 켄쳐를 보유하는 헤어핀 올리고뉴클레오티드가 고안될 수 있는데, 여기서 올리고뉴클레오티드의 말단 영역들은 서로에게 상보적이어서 혼성화된 스템(stem)을 형성하는 반면, 올리고뉴클레오티드의 중심 영역은 표적 올리고뉴클레오티드에 상보적이고 표적이 존재하지 않는 경우에는 단일 가닥 루프를 형성한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는, 포스페이트 및 켄쳐가 스템 혼성화를 통해 매우 근접해지는 "헤어핀" 구조를 형성한다. 인산화된 헤어핀 올리고뉴클레오티드가 포스페이트와 금속 사이의 상호작용을 통해 금속-중합체 복합체와 결합하면, 켄쳐가 중합체 쪽으로 배향되어 켄칭이 유도된다. 포스페이트/켄쳐 관능화된 올리고뉴클레오티드가 헤어핀의 루프 영역에 결합하는 표적과 혼성화된다면, 이 루프 영역은 스템 영역의 2차 구조를 파괴하는 단단한 막대형이 될 것이다. 이것은 수용자와 공여자의 쌍이 서로 떨어지도록 하여 중합체의 켄칭을 감소시키게 된다.
또한, DNA 아프타머의 결합 특성을 이용하는 다수의 경로를 통해 단백질 및 다른 표적에 대한 직접적인 검정을 수행할 수도 있다. 인산화된 DNA 아프타머는 금속-코팅된 접합된 중합체 표면의 표면에 결합될 수 있다. 표적 분자(단백질 크기 이하의 소분자 크기)의 존재시, 올리고뉴클레오티드의 아프타머 형태는 안정화되어야 한다(더 낮은 △G). 선택된 표적의 부재시, 아프타머 가닥은 약한 자가-구조를 보유할 수 있다. 켄쳐로 표지된 상보적 올리고뉴클레오티드가 아프타머의 자가-구조를 통과할 수 있다면, 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에서, 아프타머의 표적이 존재하지 않는 경우, 상보적 올리고뉴클레오티드-켄쳐가 아프타머에 혼성화될 수 있다. 이 하이브리드는 상기 기술한 형태의 것(즉, 5'-말단의 포스페이트 및 3'-말단의 켄쳐; 또는 그 반대)일 수 있으며, 따라서 켄쳐를 배향하여 접합된 중합체를 켄칭할 수 있다. 아프타머의 표적의 존재시, 아프타머 자가-구조는 안정화될 것이며, 올리고뉴클레오티드 켄쳐는 아프타머에 혼성화될 수 없을 것이다. 따라서, 아프타머의 표적의 존재시, 중합체는 형광을 발생시킬 것이며, 아프타머의 표적의 부재시, 형광은 켄칭될 것이다.
일반적인 포스페이트 변형 또는 소모
임의의 수단을 통해 켄쳐에 테터링된 포스페이트를 함유하는 임의의 시스템에서, 화학적 수단을 통해 포스페이트를 변형시키는 것은 포스페이트를 또다른 관능기로 전환시킴으로써 금속-중합체 복합체에 대한 포스페이트-금속 매개된 결합을 방지할 수 있다. 유사하게, 포스페이트와 다른 구성원들과의 결합은 동일한 포스페이트와 금속 중합체 복합체의 결합을 방지할 수 있다. 이들 경우, 켄쳐는 접합된 중합체와 공존하지 않을 것이며, 형광이 나타날 것이다. 일반적인 예로서, 임의의 수단을 통해 켄쳐에 테터링된 포스페이트를 함유하는 복합체 A는 금속 중합체 복합체를 켄칭할 수 있다. 복합체 A에 대한 친화도를 보유하며, 또한 복합체 A에 함유된 포스페이트를 화학적으로 변형시키거나 또는 상기 포스페이트와 결합하는 구성원을 함유하는 분자 B와 함께 존재하는 경우, 복합체 A는 금속 중합체 복합체와 결합하여 그를 켄칭할 수 없을 것이다.
바이오틴 - 테터( BT) 접합체를 사용하는 검정, 시약 및 키트
한 실시양태에 따라, 표적 분석의 검정을 수행하기 위한 키트가 제공된다. 이 키트는 두 가지 별도의 성분으로서 켄쳐(Q) 및 바이오틴-테터 접합체(BT)를 포함한다. BT 접합체의 테터(T)는, 예를 들어 단백질 또는 폴리펩티드 기질을 포함할 수 있다. 이 실시양태에 따라, 테터는 켄쳐와 결합하는 능력이 있으며, 표적 분석물질과 상호작용하여 그에 의해 변형됨으로써 변형된 테터(T')를 형성한다. 테터의 변형 후, BT 접합체와 표적 분석물질의 상호작용에 이어서 변형된 BT 접합체(BT')와 켄쳐(Q)가 결합된 결과로서 QT'B 생체접합체가 형성된다. 상기 키트는 형광물질 성분(P)을 포함할 수도 있다. 형광물질 성분은, 켄쳐가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄쳐가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있는 방식으로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함한다. 형광물질은 형광성 중합체일 수 있다. 형광물질은 고체 지지체, 예를 들어 미소구, 비드 또는 나노입자와 결합될 수 있다. 또한, 고체 지지체는 바이오틴 결합 단백질을 포함할 수 있으며, 그 결과 QT'B 복합체 상의 바이오틴 잔기와 고체 지지체 상의 바이오틴 결합 단백질이 상호작용하여 형광을 켄칭한다.
상기 기술된 바와 같이, BT 접합체의 테터를 표적 분석물질에 대한 결합 또는 반응에 의해 인식 및 변형시켜 BT' 접합체를 형성시킬 수 있다. 테터의 변형은 변형된 BT 접합체(BT')가 켄쳐(Q)와 결합할 수 있게 하여 QT'B 복합체를 형성한다. 이러한 반응 순서에 이어서 중합체 형광의 변경을 수행할 수 있다. 특히, 형광에서의 변화를 이용하여 샘플 중 표적 분석물질의 존재 및(또는) 양을 나타낼 수 있다. 게다가, BT 접합체와 효소 또는 다른 표적 분석물질과의 특이적인 결합 또는 반응의 부재시, P의 형광은 BT 접합체에 대한 결합에 의해 영향을 받지 않는다. 따라서, 샘플 중 표적 분석물질의 존재 및(또는) 양을 결정하기 위해 상기 정의된 바와 같이 켄쳐(Q) 및 바이오틴-테터 접합체(BT)를 사용하는 방법이 또한 제공된다.
한 실시양태에 따라, BT 접합체의 테터(T)와 표적 분석물질의 상호작용은 테터 상의 켄쳐-결합 성분을 제거할 수 있다. 이 실시양태에서, 분석물질과 상호작용하여 변형된 접합체(BT')를 형성시킨 결과로서, BT 접합체가 켄쳐(Q)와 결합하는 능력이 제거된다. 또한, 이 반응 순서는 중합체 형광의 조절을 통해 정량적으로 수행될 수 있다. 어떤 실시양태에서, BT와 표적 분석물질의 반응은 촉매적 반응이어서 중합체 형광의 증폭된 조절을 초래할 수 있다.
추가의 실시양태에 따라, 중합체 수퍼켄칭은 금속 이온에 의해 매개될 수 있다. 이 실시양태에 따라, QT 접합체(여기서, Q는 전자 또는 에너지 전달 켄쳐이며, T는 반응성 테터임)는 표적 분석물질과 반응하여 테터 상의 관능기를 도입, 변형 또는 제거할 수 있다. 관능기는 형광성 중합체에 결합되거나 또는 상기 중합체와(예를 들어, 고체 지지체의 표면 상에서) 공존하는 금속 이온과 결합할 수 있는 관능기일 수 있다. 따라서, 변형된 QT 접합체(QT')는 형광성 중합체 및 금속 이온을 포함하는 앙상블과 결합할 수 있다. 결론적으로, 테터의 변형은 중합체 형광을 변화시킨다. 이 방법은 표적 분석물질로서 키나제, 포스파타제 및 다른 효소에 대한 고도로 민감한 검정에서 이용될 수 있다.
번역후 변형 반응의 생물검출을 위한 변형가능한 테터 -기초의 QTB 접근법
이 접근법은 표적 분석물질과의 상호작용시 변형되어 BT' 접합체를 형성하는 합성 바이오티닐화된 펩티드 기질 또는 테터(이하, "BT 접합체"라 함)를 이용한다. 한 실시양태에서, BT 접합체는 비-형광성 켄쳐(Q)와 복합체를 형성할 수 없지만, 변형된 접합체(BT')는 켄쳐에 쉽게 결합한다. 이러한 유형의 상호작용은 형광 "소멸" 검정으로 나타나는데, 중합체 형광은 기질 전환 증가에 따라 감소한다.
다른 실시양태에서, BT 접합체는 다크(dark) 켄쳐와 쉽게 결합할 수 있다. 그러나, BT 접합체는 표적 분석물질과 상호작용하여 변형된 접합체(BT')를 형성한 다음에는 결합 능력을 상실하게 된다. 이러한 유형의 상호작용은 형광 "발현" 검정으로 나타난다.
추가의 실시양태에서, 상기 실시양태들에서의 켄쳐는 형광성 잔기일 수도 있다. 형광성 잔기를 켄쳐로 사용하여 민감한 형광 방출을 제공할 수 있다. 이들 모든 실시양태에서, QTB 생체접합체는 중합체-수용체 앙상블과 복합체를 형성하여 수퍼켄칭 과정에 의해 중합체 형광을 효율적으로 조절할 수 있다.
번역후 변형 상호작용에 대한 검정에서 사용되는 켄쳐 잔기는, 기질 상에서 변형되는 관능기에 대한 결합 특성과, 근방에 존재하는 경우에 접합된 중합체 형광이 증폭되는 수퍼켄칭 특성을 겸비한다. 한 실시양태에서, 켄쳐는 전이 금속 또는 유기금속 종, 예를 들어 철(III) 이미노디아세트산(IDA) 유형 킬레이트일 수 있는데, 제2철은 전자 전달에 의해 형광성 중합체를 수퍼켄칭할 수 있으며, 포스포펩티드에 강력하게 결합할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 켄쳐는 두 가지 상이한 잔기, 즉 켄쳐와 변형된 관능기의 결합을 촉진하는 잔기 및 에너지 전달에 의해 중합체 켄칭을 유발하는 또다른 잔기로 구성될 수 있다.
센서는 고체 지지체 상에서 또는 용액 중에서 바이오틴 결합 단백질과 공존하는 접합된 형광성 중합체를 포함할 수 있다. 중합체는 하전된 중합체, 중성 중합체, 또는 비-접합된 백본(backbone) 상에서 또는 비드 또는 나노입자와 같은 고체 지지체의 반대로 하전된 표면 상에서 조합된 형광성 염료로 이루어진 "가상(virtual)" 중합체일 수 있다.
키나제 및 포스파타제 효소의 생물검출 및 생물검정을 위한 변형가능한 테터 -기초의( QT'B ) 접근법
샘플 중 키나제 또는 포스파타제 효소 활성의 검출 및 정량화를 위해 QT'B 포맷을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이 검정은 표적 키나제, 예를 들어 PKA 및 포스파타제, 예를 들어 PTP-1B에 의해 바이오티닐화된 펩티드 기질의 인산화 또는 탈인산화를 각각 모니터링하는데 사용될 수 있다. QT'B 포맷을 사용하여 키나제 또는 포스파타제 활성을 감지하는 것은 도 13에 도시되어 있다.
QTL 센서는 도 13에 나타낸 바와 같이 고체 지지체(예를 들어, 미소구)의 표면 상에 코팅되어 있거나 또는 용액 중에서 복합체로서 존재하는 바이오틴 결합 단백질과 공존하는 고도로 형광성인 접합된 고분자전해질을 포함할 수 있다. 표적 키나제에 의해 특이적으로 인산화되거나(예를 들어, PKA) 또는 표적 포스파타제에 의해 탈인산화되는(예를 들어, PTP-1B) 것으로 알려진 바이오티닐화된 펩티드 또는 단백질 기질을 소정의 시간 동안 적절한 효소와 함께 인큐베이션할 수 있다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 인산화되지 않은 BT 접합체를 샘플에 첨가하고 샘플과 함께 인큐베이션하여 키나제 효소 활성을 모니터링할 수 있다. 접합체와 샘플을 인큐베이션한 후, 중합체 센서 및 켄쳐를 샘플에 첨가하여 중합체 형광을 켄칭할 수 있다. 형광의 감소는 효소 활성의 선형 함수이다.
도 14는 QT'B 검정을 이용한 단백질 키나제 A(PKA) 활성 측정을 보여주는 그래프이다. 도 14에서, 형광(RFU)은 PKA 농도(mU/웰)의 함수로서 플롯팅되어 있다. 도 14로부터 알 수 있는 바와 같이, PKA의 농도 증가는 형광 감소를 초래한다.
도 15는 전체 단백질 기질, 히스톤 1을 사용한 단백질 키나제 C 활성 검출을 예시하는 차트이다. 도 15로부터 알 수 있는 바와 같이, 중합체 형광은 인산화된 히스톤 기질(1)에 비해 인산화되지 않은 히스톤 기질(2)에서 더 낮은 수준으로 관찰된다.
또한, 도 13에 나타낸 바와 같이, 샘플을 인산화된 BT 접합체와 함께 인큐베이션하여 샘플 중 포스파타제 효소 활성을 모니터링할 수 있다. 인큐베이션된 샘플에 중합체 센서 및 켄쳐를 첨가하면 중합체 형광을 PTP-1B 활성의 함수로서 증가시킬 수 있다.
도 16은 QT'B 검정을 이용한 단백질 티로신포스파타제-1B(PTP-1B) 활성 검출을 예시하는 그래프이다. 도 16에서, 형광(RFU)은 PTP-1B 농도(mU/웰)의 함수로서 플롯팅되어 있다. 도 16으로부터 알 수 있는 바와 같이, PTP-1B의 농도 증가는 형광 증가를 초래한다.
PKA 키나제 활성의 검출을 위해, 켐프티드(Kemptide) 펩티드 기질을 사용할 수 있다. 이 기질은 N-말단에서 바이오틴 및 PKA에 의해 인산화될 수 있는 세린을 함유한다.
PTP-1B 포스파타제 활성의 검출을 위해, N-말단 바이오틴을 갖는 인산화된 기질을 사용할 수 있다. 이 기질은 PTP-1B와의 상호작용시 탈인산화를 수행할 수 있다.
켄칭이 공여자와 수용자 사이의 등몰량 반응인 FRET(형광 공명 에너지 전달) 검정과는 달리, 상기 기술된 QTL 키나제 및 포스파타제 검정은 잘 확립된 포스페이트-금속 복합체 상호작용과, 전자 및 에너지 전달 켄쳐에 의한 접합된 중합체 수퍼켄칭의 현상을 조합한 기능적으로 우수한 플랫폼을 이용함으로써 형광 신호의 증폭 및 효소 활성 측정의 민감도 증대를 초래한다.
금속 이온- 매개된 중합체 수퍼켄칭을 기초로 하는 생물검정
음이온성 접합된 중합체가 금속 양이온 및 유기 양이온과 강력하게 결합하며, 흔히 중합체 형광을 동시에 켄칭한다는 것은 본원 발명 이전에 밝혀진 사실이다 [1,4]. 이러한 결합은 쿨롱 및 소수성 상호작용의 결과로서 일어난다. 또한, 종래의 연구에서는 중합체와 카운터이온 사이의 결합이 중합체와 하전된 지지체, 예를 들어 폴리스티렌 미소구, 실리카 또는 점토, 또는 또다른 하전된 중합체의 예비 결합에 의해 조절 또는 조정될 수 있다는 사실이 밝혀졌다. [4-6]
음이온성 중합체는, 그의 예를 도 1A에 나타낸 바와 같이, 중합체 형광을 거의 변형시키지 않는 과정에서 금속 이온과 결합할 수 있다. 이러한 접근법의 예로서, 도 1A에 나타낸 구조를 갖는 중합체를 먼저 양이온성 폴리스티렌 미소구 상에 코팅하고, 이어서 Ga3 +로 처리하였다. 이 과정은 도 17에 예시되어 있다. 도 17로부터 알 수 있는 바와 같이, Ga3 +는 중합체와 결합하지만, 그의 형광을 켄칭하지 않는다. 고체 지지체(예를 들어, 비드), 중합체 및 금속 이온(예, Ga3 +)으로 구성된 앙상블은, 금속 이온이 유기 포스페이트와 결합하는 기존에 입증된 능력을 이용하는 신규 센서 플랫폼을 제공한다.
금속 이온 친화도 크로마토그래피(IMAC)는 인산화된 종의 정제에 있어서 통상적인 기술이다. 금속 이온, 예를 들어 Fe(III), Ga(III), Al(III), Zr(IV), Sc(III) 및 Lu(III)(강한 루이스산)은, 공유 결합된 철(III) 이미노디아세트산(IDA) 또는 니트릴로트리아세트산(NTA) 또는 다른 리간드와의 결합을 통해 수지 비드, 예를 들어 아가로스, 세파로스 등의 표면 상에 고정될 수 있다. 즉, 결합된 금속 이온은 인산화된 종, 예를 들어 단백질 또는 펩티드에 결합할 수 있다. 단백질의 단리에 있어서 IMAC의 적용에 더하여, 포스페이트 금속 복합체의 형성에 이어서 인산화시에 형광-표지된 기질의 형광 편광에서의 변화를 모니터링함으로써 단백질 키나제 효소에 대한 포맷을 감지하는 것으로서 IMAC 관련 기술을 이용할 수 있다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 고체 지지체에 결합된 Ga3 +는 키나제 효소에 의해 생성된 인산화된(또는 포스파타제 효소에 의해 탈인산화된) 기질과 복합체를 이루는 능력을 보유한다. 따라서, 고체 지지체에 결합된 Ga3 +를 사용하여 QTL 검정에 대한 기초를 제공할 수 있다. 도시된 예에서, 금속 이온(예를 들어, Ga3 +)과의 결합에 의해 중합체 근방으로 이동했을 때 에너지 또는 전자 전달 켄칭에 의해 형광성 중합체의 형광을 감소시킬 수 있는 켄쳐로 기질을 관능화시켰다.
예시적인 감지 포맷은 도 1A에 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 음이온성 고분자전해질(이하, "PPE"라 함), 0.55 ㎛ 양이온성 폴리스티렌 미소구, 염화갈륨, 및 로다민으로 표지된 인산화된 펩티드를 이용한다. 이러한 감지 포맷은 도 17에 모식적으로 예시되어 있다.
먼저, 음이온성 PPE 중합체를 수중에 침전시켜 고체 지지체(즉, 0.55 ㎛ 양이온성 폴리스티렌 미소구) 상에 고정시켰다. 이어서, 중합체 코팅된 미소구를 pH 5.5의 수용액 중 염화갈륨으로 처리하였다. 이어서, 잉여량의 Ga3 +를 세척하여 제거하였다.
효소 인산화 반응(예를 들어, 키나제), 프로테아제 절단 반응, 또는 단일 DNA/RNA 서열로부터 생성되거나 또는 경쟁 반응을 통해 생성된 염료 표지된 인산화된 물질은 갈륨 중합체 센서와 결합하여 중합체로부터의 형광을 조절할 수 있다.
도 18은 펩티드 기질 내 인산화 정도의 함수로서 갈륨 중합체 센서의 형광을 나타낸다. 도 18에서, 상대 형광은 인산화 정도(％ 포스포펩티드)의 함수로서 플롯팅되어 있다.
도 19는 갈륨 중합체 센서의 존재시 기질의 효소-매개된 인산화가 일어나는 샘플 중에서 단백질 키나제 A 효소의 수준에 대한 실제적 역학 검정을 입증한다. 도 19에서, 상대 형광은 단백질 키나제 A(PKA) 농도(mU/Rx)의 함수로서 플롯팅되어 있다.
형광 변화는 다양한 포맷으로 모니터링할 수 있다. 일반적인 검정으로 역학 및 종말점 검정 둘 모두를 이용하여 다양한 기질에 대한 효소-매개된 반응을 모니터링할 수 있다.
약물 발견을 위한 억제제 스크리닝에 대한 QT'B 감지 접근법의 적용
키나제 및 포스파타제 효소 활성에 대한 검정에서 전자 또는 에너지 전달 켄쳐의 존재하에 수퍼켄칭을 나타내는 접합된 중합체의 용도를 변화시킴으로써 약리학적으로 관련된 효소 및 다른 생체분자의 효과를 완화시키는 약물의 거대 화합물 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 효소 활성이 공지된 억제제의 첨가는 효소와 기질의 반응을 방해할 것이며, 따라서 억제제의 부재하에 달리 나타나는 신호 반응을 조절할 것이다. 주어진 농도의 억제제에 대해 관찰된 신호 변경 정도는 억제제 강도의 측정치이다.
QT'B-기초의 검정을 다양한 웰 밀도의 미량역가 플레이트에서 수행하여 약물 발견 과정을 촉진시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 화합물 라이브러리를 키나제 또는 포스파타제 검정으로 스크리닝하여 각각 인산화 또는 탈인산화 반응을 억제하는 것을 찾아낼 수 있다.
바이오티닐화된 테터( BT), 및 켄쳐와 바이오틴 결합 단백질의 접합체를 이용하는 검정, 시약 및 키트
상기 기술한 바와 같이, 용액 중의 개별 분자로서 또는 지지체 상의 조립체로서 형광성 고분자전해질의 자가-조직화 능력을 이용하여 금속 이온과 복합체를 이루는, 형광성 중합체와 결합된 QTL 생체접합체가 개발되었다. 이와 같이 복합체를 이룬 금속 이온은 켄쳐(Q)를 포함하는 생체접합체 상에서 배위기(예를 들어, 포스페이트기)에 대해 선택적으로 결합할 수 있으며, 따라서 단백질, 소분자, 펩티드, 프로테아제 및 올리고뉴클레오티드의 선택적인 검출을 위한 기초를 제공한다 [10-11].
상기 기재된 접근법은 켄쳐로 표지되는 생체접합체를 이용한다. 그러나, 생체접합체는 2-단계 과정으로 조합될 수도 있는데, 바이오티닐화된 기질은 제1 단계에서 효소적으로 반응하며, 켄쳐에 커플링된 바이오틴 결합 단백질 분자(예를 들어, 스트렙타비딘)를 함유하는 검출용 분자가 제2 단계에서 첨가된다. 센서의 첨가시, 포스페이트와 금속 이온의 결합이 일어나며, 켄칭은 결합된 바이오틴 결합 단백질/켄쳐 접합체에 의해 매개된다.
이러한 "스냅 온(snap-on)" 접근법은 바이오티닐화된 기질을 스트렙타비딘 켄쳐와 미리 결합시키고 조합된 생체접합체를 효소와 직접 반응시킴으로써 1-단계 검정으로 이용할 수도 있다. 그러나, 이러한 1-단계 스냅 온 검정 접근법의 사용은 검정 속도 및(또는) 민감도를 저하시킬 수 있다.
금속 이온- 매개된 수퍼켄칭
폴리(페닐렌에티닐렌)(PPE) 족에서의 접합된 중합체는 방향족 고리에 부가된 다양한 관능기로 제조될 수 있다. 사용된 펜던트 음이온기 중에는 술포 폴리 p-페닐렌에티닐렌(PPE-Di-COOH) 접합된 중합체의 분자 구조를 나타내는 도 1A에 모식적으로 나타낸 것들이 있다. 이들 중합체는 물 중에서 양이온성 미소구와 결합하여 안정한 중합체 코팅물을 형성할 수 있다. 코팅된 미소구는 강력한 형광을 발한다. 중합체-코팅된 미소구 상의 전체 전하는 중합체 하중의 정도를 변화시키고 중합체의 구조를 변화시켜 조정할 수 있다.
중합체로 코팅된 미소구는 금속 양이온과 결합될 수 있으며 금속 양이온의 하중은 미소구에 대한 중합체의 하중 수준에 따라 달라질 수 있음이 밝혀졌다. 여러 금속 이온, 예를 들어 Fe3 + 및 Cu2 +는 중합체 형광을 켄칭할 수 있지만, 다른 것들, 예를 들어 Ga3 +는 그렇지 못하다. 켄칭되지 않은 금속 이온은, 금속 이온의 부재하에 켄칭이 거의 일어나지 않거나 전혀 일어나지 않는 조건하에서 미소구에 결합된 중합체 형광의 수퍼켄칭을 매개한다. Ga3 +의 첨가에 의해 중합체-코팅된 미소구를 "하전시킨" 후, 인산화된 펩티드를 현탁액에 첨가하면 중합체 형광이 현저하게 켄칭된다. 펩티드 상의 포스페이트와 Ga3 +의 결합은 켄쳐를 중합체의 근방으로 이동시켜 형광 켄칭을 매개하는 것으로 밝혀졌다.
금속 이온 하전된 중합체를 사용한 인산화된 생체분자의 중합체 켄칭은 하기 기재된 2-단계 과정으로 달성될 수 있다. 도 20은 효소적으로 반응된 바이오티닐화된 기질에 켄쳐를 연속적으로 첨가함으로써 달성된 금속 이온-매개된 수퍼켄칭, 및 키나제 검정에 대한 예를 모식적으로 나타낸다. 도 20은 QTL 센서에 이어 스트렙타비딘-켄쳐의 첨가에 의해 검출된 표적 효소에 의한 바이오틴 펩티드 기질의 인산화 또는 탈인산화를 예시하는 모식도이다. Ga3 + 금속 이온에 대한 특이적인 포스페이트 결합에 의해 펩티드 생성물이 중합체의 표면에 이르게 한다. 중합체 형광의 생성된 켄칭은 인산화 또는 탈인산화를 수반한다.
금속 이온- 매개된 수퍼켄칭을 기초로 하는 생물검정 - 키나제 / 포스파타제 검정
단백질의 인산화 및 탈인산화는 세포의 대사, 성장, 분화 및 세포 증식의 조절을 매개한다. 효소 기능의 이상은 암 및 염증과 같은 질병을 일으킬 수 있다. 500 종이 넘는 키나제 및 포스파타제가 세포의 활성의 조절에 관여하나고 여겨지고 있으며, 이들은 약물 요법에 대한 가능한 표적이다.
수퍼켄칭을 이용해서 형광 신호를 증폭시켜 효소 활성 측정시 증대된 민감도를 나타내는 검정이 문헌에 기재되어 있다 [10-11]. 이들 검정에서 사용된 센서 플랫폼은 양으로 하전된 미소구 상의 흡착에 의해 고정된 변형된 음이온성 고분자전해질 유도체를 포함한다. 예시적인 변형된 음이온성 고분자전해질은 도 1A에 나타낸 폴리(페닐렌에티닐렌)(PPE)의 유도체이다. 형광성 중합체 수퍼켄칭을 변화시켜 도 20에 나타낸 바와 같이 키나제/포스파타제 활성을 검출한다. 2가 또는 3가의 금속 이온은 용액 중의 음이온성 접합된 중합체와 강력하게 결합할 수 있어서, 중합체 형광의 변형 및(또는) 켄칭을 초래한다. 중합체-미소구 앙상블 상의 전체 전하는 조정될 수 있기 때문에, 금속 이온이 중합체 형광을 강력하게 켄칭하지 않고서 중합체와 결합하되 특이적인 리간드와 복합체를 이루는 능력을 보유하는 플랫폼을 제공하는 앙상블을 구성하였다. 예를 들면, PPE-결합된 Ga3 +는 인산화된 펩티드와 결합할 수도 있으며, 그 결과로 펩티드가 로다민과 같은 염료를 함유하는 경우에 금속 이온-매개된 중합체 수퍼켄칭이 일어나는 것으로 밝혀졌다. 본원에서, 본 발명자들은 바이오티닐화된 펩티드 기질의 검출을 위한 플랫폼의 적용을 기재하고 있다.
예를 들어, 섬광 근접(SPA) 또는 스트렙타비딘 막 지지체(SAM)를 사용하는 경우, 결합되지 않은 방사성 ATP 또는 결합되지 않은 항-포스포 항체를 반응 혼합물로부터 분리하기 위한 세척 단계가 필요하다. 전환된 기질을 보유하기 위해, 바이오티닐화된 펩티드가 사용되었으며, 다양한 매트릭스 상의 스트렙타비딘 또는 다른 바이오틴 결합 단백질을 통해 고정되었다. 이하 기재된 바와 같이, 금속 이온-매개된 수퍼켄칭을 이용하여 개별 기질 또는 바이오틴-펩티드 라이브러리에 대한 키나제의 활성을 스크리닝할 수 있다. 이러한 접근법에 의해 연구자들은,
1) 효소 돌연변이체의 기질 특이성을 시험하고;
2) 인산화 패턴을 비교함으로써 제품 효소의 효소 순도를 평가하고;
3) 키나제에 대한 형광 "발현" 검정을 제공하는 증대된 방출에 대하여 모니터링하고;
4) 이로써, 라이브러리에서 가시적인 자가-형광성 화합물의 스크리닝을 개선시킬 목적으로, 검출을 레드로 변경하는 적절한 염료-켄쳐를 사용하여 증대된 방출을 이용한다.
예로서, 스트렙타비딘-커플링된 플루오레세인 켄쳐는 효소적으로 반응된 바이오티닐화된 펩티드 기질에 첨가될 수 있다. 이러한 접근법은 도 20에 예시된 바와 같은 민감한 및 선택적인키나제/포스파타제 검정에 대한 기초를 제공한다. 검정은 순간적인 "혼합 및 판독" 검정이며, 세척 단계 또는 복합체 샘플 제조를 필요로 하지 않는다.
샘플 중 효소와 바이오티닐화된 펩티드 기질의 인큐베이션 후, 켄쳐 및 바이오틴 결합 단백질(예, 스트렙타비딘)의 접합체를 첨가하고, 인큐베이션된 샘플과(예를 들어, 실온에서 15분 동안) 결합되도록 한다.
하기 실시예 4는 1-단계 및 2-단계 접근법의 필적하는 성능 및 단백질 키나제 A(PKA)의 강력한 검정을 예시한다. 실시예 4에서, 키나제 검정은 형광 "소멸" 검정으로서 기능한다. 켄쳐는 중합체 형광의 켄칭의 결과로서 민감한 형광을 나타낼 수 있기 때문에, 검정은 모니터링된 파장에 따라 발현 또는 소멸을 사용할 수 있다. 추가로, 중합체 및 켄쳐의 형광을 동시에 모니터링하는 것은 민감한 비율적 검정을 제공한다.
실시예 4 - 단백질 키나제 A( PKA ) 활성에 대한 검정
효소 기질 및 포스포-펩티드 보정자로서 사용된 펩티드는 하기 기재되어 있다.
- PKA 활성 검출용(1-단계 방식):
로다민-LRRASLG (서열 2)
- 보정자 펩티드:
로다민-LRRA(pS)LG (서열 1)
(이들은 아나스펙으로 합성하였음)
- PKA 활성 검출용(2-단계 방식):
바이오틴-LRRASLG (서열 5), 및
바이오틴-LRRA(pS)LG (서열 6)
(이들은 아나스펙으에서 구입하였음). 재조합 PKA는 프로메가에서 구입하였다. 스트렙타비딘-커플링된 플루오레세인은 몰레큘라 프로브즈(Molecular Probes)에서 구입하였다. 폴리스티렌 관능화된 비드는 인터페이셜 다이나믹스에서 구입하였다.
2-단계 접근법에 대한 1-단계 접근법의 성능은 1 μM 펩티드(로다민-펩티드 또는 바이오틴-펩티드)를 CRT에서 60분 동안 검정 완충액 중에서 반응시켜 측정하였다. 2-단계 과정의 경우, 스트렙타비딘-플루오레세인 5 ㎕를 첨가하고, CRT에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 검출기 완충액 중 센서 15 ㎕를 첨가하였다. 스펙트라맥스 제미니 XS 플레이트 판독기(몰레큘라 디바이시즈, 인크. 제품)를 웰 스캔 방식으로 사용하고 475 nm 컷오프(cutoff) 필터를 통한 450 nm에서의 여기 및 490 nm에서의 방출을 이용하여 혼합물을 형광을 측정하였다.
도 21A 및 21B에 나타낸 바와 같이, N-말단 켄쳐를 갖는 합성 기질을 사용하거나 또는 스트렙타비딘-플루오레세인 접합체가 첨가된 바이오티닐화된 기질을 사용하여 검정을 수행한다. 기질의 인산화시, 펩티드는 포스페이트기를 통해 센서에 결합되어 형광을 켄칭한다.
도 21A 및 21B는 로다민으로 표지된 기질 또는 바이오티닐화된 기질을 사용한 2-단계 접근법을 이용하여 PKA에 대한 효소 농도 곡선을 보여주는 그래프이다. 검정에서 생성된 RFU는 도 21A에 나타나 있으며, 표준 곡선으로부터의 역-계산(backcalculation)을 따른 인산화율(％)은 도 21B에 나타나 있다. 도 21A 및 21B에서, 1 μM 농도의 기질을 화이트 384-웰 옵티플레이트에서 연속 희석된 키나제 PKA 효소를 사용하여 실온에서 1시간 동안 인산화시켰다. 인큐베이션한 후, 5 pmol 스트렙타비딘-로다민 접합체를 첨가하고, 대략 22 ℃에서 15분 동안 인큐베이션한 후에 대략 100×106개의 QTL 센서 비드를 첨가하고, 대략 22 ℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 대략 22 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였으며, 제미니 XS 플레이트 판독기(몰레큘라 디바이시즈, 인크.)에서 475 nm 컷오프(cutoff) 필터를 통한 450 nm에서의 여기 및 490 nm에서의 방출을 이용하여 형광 신호를 모니터링하였다.
실시예 5 - PKA , PKC α 또는 PTP - IB 에 대한 기질을 스크리닝하기 위한 검정
기질 스크리닝을 위해, 1 μM 바이오틴-펩티드를 대략 22 ℃에서 60분 동안 검정 완충액 중에서 반응시켰다. 대조군 반응은 효소를 함유하지 않았다. 이어서, 스트렙타비딘-플루오레세인 접합체 5 ㎕를 첨가하고, 대략 22 ℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 검출기 완충액 중 센서 15 ㎕를 첨가하였다. 스펙트라맥스 제미니 XS 플레이트 판독기(몰레큘라 디바이시즈, 인크.)를 웰 스캔 방식으로 이용하고 475 nm 컷오프(cutoff) 필터를 통한 450 nm에서의 여기 및 490 nm에서의 방출을 이용하여 혼합물의 형광을 측정하였다.
도 22는 효소 PTP-1B, PKCα 및 PKA로 키나제 또는 포스파타제에 대한 일곱가지 상이한 바이오티닐화된 기질을 스크리닝하는 것을 예시하는 막대 차트이다. 반응을 효소의 존재 또는 부재하에 수행하였으며, RFU에서의 차이를 컴퓨터로 계산하여 플롯팅하였다. 도 22로부터 알 수 있는 바와 같이, 형광의 인산화 의존성 켄칭은 적절한 기질을 함유하는 반응에서만 검출되며, 비특이적 기질을 함유하는 반응에서는 검출되지 않았다.
한 실시양태에 따라, 스턴-볼머 켄칭 상수에 의해 측정된 증폭된 수퍼켄칭의 켄칭 민감도는 500 이상이다. 추가의 실시양태에 따라, 스턴-볼머 켄칭 상수에 의해 측정된 증폭된 수퍼켄칭의 켄칭 민감도는 1000, 2000, 5000, 10,000, 100,000 또는 1×106 이상이다.
예시적인 형광물질은 형광성 중합체를 포함한다. 예시적인 형광성 중합체는 발광성의 접합된 물질, 예를 들어, 폴리(페닐렌 비닐렌), 예를 들어 폴리(p-페닐렌 비닐렌)(PPV), 폴리티오펜, 폴리페닐렌, 폴리디아세틸렌, 폴리아세틸렌, 폴리(p-나프탈렌 비닐렌), 폴리(2,5-피리딜 비닐렌) 및 그의 유도체, 예를 들어 폴리(2,5-메톡시 프로필옥시술포네이트 페닐렌 비닐렌)(MPS-PPV) 및 폴리(2,5-메톡시 부틸옥시술포네이트 페닐렌 비닐렌)(MBS-PPV) 등을 포함한다. 수용해성을 위해, 유도체는 하나 이상의 펜던트 이온성 기, 예를 들어 술포네이트 및 메틸 암모늄을 포함할 수 있다. 예시적인 펜던트 기로는 이하의 것들을 들 수 있다:
-O-(CH2)n-OSO3 -(M+)
(식 중, n은 정수, 예를 들어 3 또는 4이고, M+는 양이온, 예를 들어 Na+ 또는 Li+임);
-(CH2)n-OSO3 -(M+)
(식 중, n은 정수, 예를 들어 3 또는 4이고, M+는 양이온, 예를 들어 Na+ 또는 Li+임);
-O-(CH2)n-N+(CH3)3(X-)
(식 중, n은 정수, 예를 들어 3 또는 4이고, X-는 음이온, 예를 들어 Cl-임); 및
-(CH2)n-N+(CH3)3(X-)
(식 중, n은 정수, 예를 들어 3 또는 4이고, X-는 음이온, 예를 들어 Cl-임).
상기 명세서는 본 출원의 원리를 교시하고, 실시예는 예시 목적으로 제공되며, 당업자라면 이러한 개시내용을 읽어보고 이 개시내용의 진정한 범위를 벗어나지 않고서 본 발명의 형태 및 세부사항을 다양하게 변형시킬 수 있다는 것을 알 것이다.
인용 문헌
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기타 문헌
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Rininsland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2004, 101, 15295.

Claims (98)

  1. 하나 이상의 포스페이트기를 포함하는 바이오티닐화된 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드의 포스페이트기와 결합된 금속 양이온을 포함하는 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 금속 양이온이 Ga3 +인 복합체.
  3. 제1항에 있어서, 하나 이상의 음이온기, 및 켄쳐(quencher)가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄쳐가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 바이오틴 결합 단백질과 결합된 형광물질을 더 포함하며, 여기서 상기 형광물질의 음이온기가 금속 양이온과 결합되어 있는 복합체.
  4. 제3항에 있어서, 형광물질이 형광성 중합체인 복합체.
  5. 제3항에 있어서, 형광물질이 폴리(p-페닐렌-에티닐렌) 중합체인 복합체.
  6. 제3항에 있어서, 형광물질이 고체 지지체의 표면에 결합되어 있는 복합체.
  7. 제6항에 있어서, 고체 지지체가 미소구인 복합체.
  8. 제6항에 있어서, 고체 지지체가 양으로 하전된 표면을 포함하며, 형광물질의 음이온기가 상기 양으로 하전된 표면에 결합되어 있는 복합체.
  9. 제3항에 있어서, 형광물질과 결합되는 경우에 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있는 켄쳐를 더 포함하며, 여기서 상기 켄쳐가 폴리펩티드의 포스페이트기와 결합되어 있는 복합체.
  10. 제9항에 있어서, 켄쳐가 유기금속 화합물인 복합체.
  11. 제10항에 있어서, 켄쳐가 철(III) 이미노디아세트산 킬레이트인 복합체.
  12. 제3항에 있어서, 형광물질 및 바이오틴 결합 단백질이 고체 지지체의 표면에 결합되어 있는 복합체.
  13. a) 키나제 효소 분석물질의 경우에는 분석물질에 의해 인산화될 수 있는 하나 이상의 기를 포함하는 바이오티닐화된 폴리펩티드와 샘플을 인큐베이션하거나, 또는 포스파타제 효소 분석물질의 경우에는 분석물질에 의해 탈인산화될 수 있는 하나 이상의 기를 포함하는 바이오티닐화된 폴리펩티드와 샘플을 인큐베이션하는 것;
    b) 금속 양이온을 샘플에 첨가하는 것(여기서, 상기 금속 양이온이 켄쳐이거나, 또는 그렇지 않은 경우에는 샘플에 금속 양이온과 결합할 수 있는 켄쳐를 첨가하는 것을 더 포함시킴);
    c) 켄쳐가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄쳐가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 바이오틴 결합 단백질과 결합된 형광물질을 샘플에 첨가하는 것; 및
    d) 형광을 검출하는 것
    을 포함하며, 여기서 검출된 형광은 샘플 중 분석물질의 존재 및(또는) 양을 나타내는 것인, 샘플 중 키나제 또는 포스파타제 효소 분석물질의 존재 및(또는) 양의 검출 방법.
  14. 제13항에 있어서, 켄쳐가 인산화된 폴리펩티드와 결합되는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 폴리펩티드가 분석물질에 의해 인산화될 수 있는 기를 포함하며, 이 때 인산화될 수 있는 기의 인산화가 형광을 감소시키는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 폴리펩티드가 분석물질에 의해 탈인산화될 수 있는 기를 포함하며, 이 때 상기 기의 탈인산화가 형광을 증가시키는 것인 방법.
  17. 제13항에 있어서, 금속 양이온이 Ga3 +인 방법.
  18. 제13항에 있어서, 형광물질이 형광성 중합체인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 형광물질이 폴리(p-페닐렌-에티닐렌) 중합체인 방법.
  20. 제13항에 있어서, 형광물질이 고체 지지체의 표면에 결합되는 것인 방법.
  21. 제13항에 있어서, 형광물질 및 바이오틴 결합 단백질이 고체 지지체의 표면에 결합되는 것인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 고체 지지체가 미소구인 방법.
  23. 제20항에 있어서, 고체 지지체가 양으로 하전된 표면을 포함하고 형광물질이 하나 이상의 음이온기를 포함하며, 여기서 상기 형광물질의 음이온기가 양으로 하전된 표면에 결합되는 것인 방법.
  24. 제13항에 있어서, 켄쳐가 유기금속 화합물인 방법.
  25. 제14항에 있어서, 켄쳐가 철(III) 이미노디아세트산 킬레이트인 방법.
  26. 제13항에 있어서, 형광물질, 켄쳐 및 금속 양이온이 인큐베이션 후 및 형광 검출 전에 샘플에 첨가되는 것인 방법.
  27. 제13항에 있어서, 형광물질, 켄쳐 및 금속 양이온이 인큐베이션하기 전 또는 인큐베이션하는 동안 샘플에 첨가되고, 형광을 검출하는 것이 인큐베이션하는 동안의 형광 검출을 포함하는 것인 방법.
  28. a) 샘플 중에서, 키나제 효소 분석의 경우에는 분석물질에 의해 인산화될 수 있는 하나 이상의 기를 포함하는 바이오티닐화된 폴리펩티드를 키나제 효소 활성 억제제인 화합물의 존재하에 키나제 효소와 인큐베이션하고, 포스파타제 효소 분석의 경우에는 분석물질에 의해 탈인산화될 수 있는 하나 이상의 기를 포함하는 바이오티닐화된 폴리펩티드를 포스파타제 효소 활성 억제제인 화합물의 존재하에 포스파타제 효소와 인큐베이션하는 것;
    b) 금속 양이온을 샘플에 첨가하는 것(여기서, 상기 금속 양이온이 켄쳐이거나, 또는 그렇지 않은 경우에는 샘플에 금속 양이온과 결합할 수 있는 켄쳐를 첨가하는 것을 더 포함시킴);
    c) 켄쳐가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄쳐가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 바이 오틴 결합 단백질과 결합된 형광물질을 샘플에 첨가하는 것; 및
    d) 상기 화합물의 존재하에 샘플로부터 형광을 검출하는 것
    을 포함하며, 여기서 상기 화합물의 존재하에 검출된 형광의 양은 키나제 또는 포스파타제 효소 활성에 대한 상기 화합물의 억제 효과를 나타내는 것인, 키나제 또는 포스파타제 효소 활성 억제제로서의 화합물의 스크리닝 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    a) 제2 화합물의 존재하에 제2 샘플에서 바이오티닐화된 폴리펩티드를 키나제 또는 포스파타제 효소와 인큐베이션하는 것;
    b) 제2 샘플에 형광물질, 켄쳐 및 금속 양이온을 첨가하는 것; 및
    c) 제2 화합물의 존재하에 제2 샘플로부터 형광을 검출하는 것
    을 더 포함하며, 이 때 상기 제2 샘플로부터 검출된 형광의 양이 키나제 또는 포스파타제 효소 활성에 대한 제2 화합물의 억제 효과를 나타내는 것인 방법.
  30. 제28항에 있어서,
    a) 상기 화합물이 없는 제2 샘플 중에서, 바이오티닐화된 폴리펩티드를 키나제 또는 포스파타제 효소와 인큐베이션하는 것;
    b) 제2 샘플에 형광물질, 켄쳐 및 금속 양이온을 첨가하는 것; 및
    c) 상기 화합물의 부재하에 제2 샘플로부터 형광을 검출하는 것
    을 더 포함하며, 여기서 상기 화합물의 부재하에 상기 제2 샘플로부터 검출된 형광 의 양이 기준선 형광인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 화합물의 부재하에 검출된 기준선 형광에 대해 상기 화합물의 존재하에 검출된 형광을 비교하는 것을 더 포함하며, 여기서 화합물의 존재하에 검출된 형광과 기준선 형광과의 차이가 키나제 또는 포스파타제 효소 활성에 대한 상기 화합물의 억제 효과를 나타내는 것인 방법.
  32. 인산화될 수 있거나 탈인산화될 될 수 있는 기를 하나 이상 포함하는 폴리펩티드; 및
    상기 폴리펩티드에 접합된 켄칭 잔기
    를 포함하며, 여기서 상기 켄칭 잔기가 형광성 중합체와 결합되는 경우에 형광성 중합체의 수퍼 켄칭을 증폭시킬 수 있는 것인 생체접합체(bioconjugate).
  33. 제32항에 있어서, 켄칭 잔기가 로다민인 생체접합체.
  34. 제32항에 있어서, 폴리펩티드가 하나 이상의 포스페이트기를 포함하는 것인 생체접합체.
  35. 제34항에 있어서, 폴리펩티드가 절단 부위를 더 포함하고, 켄칭 잔기 및 포스페이트기가 절단 부위의 반대쪽에 존재하며, 켄칭 잔기가 접합된 절단 부위쪽에 포스페이트기가 존재하지 않는 것인 생체접합체.
  36. 제34항에 있어서, 폴리펩티드가 절단 부위를 더 포함하고, 켄칭 잔기 및 포스페이트기가 절단 부위와 동일한 쪽에 존재하며, 켄칭 잔기가 접합된 반대쪽의 절단 부위쪽에 포스페이트기가 존재하지 않는 것인 생체접합체.
  37. a) 제35항에 기재된 생체접합체와 샘플을 인큐베이션하는 것(여기서, 프로테아제 효소가 절단 부위에서 폴리펩티드를 절단함);
    b) 켄칭 잔기가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄칭 잔기가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 하나 이상의 음이온기를 더 포함하는 형광물질(여기서, 하나 이상의 금속 양이온이 형광물질의 음이온기와 결합되어 있음)을 샘플에 첨가하는 것; 및
    c) 샘플로부터 형광을 검출하는 것
    을 포함하며, 이 때 검출된 형광은 샘플 중의 프로테아제 효소의 존재 및(또는) 양을 나타내는 것인, 샘플 중 프로테아제 효소의 존재 및(또는) 양의 검출 방법.
  38. 제32항에 기재된 생체접합체를 포함하는 제1 성분; 및
    생체접합체의 켄칭 잔기가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄칭 잔기가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하는 형광물질(여기서, 상기 형광물질은 하나 이상의 음이온기를 더 포함하고, 하나 이상의 금속 양이온이 형광물질의 음이온기와 결합되어 있음)을 포함하는 제2 성분
    을 포함하는, 샘플 중 키나제 또는 포스파타제 효소 분석물질의 존재 및(또는) 양의 검출용 키트.
  39. 제38항에 있어서, 형광물질이 형광성 중합체인 키트.
  40. 제38항에 있어서, 형광물질이 폴리(p-페닐렌-에티닐렌) 중합체인 키트.
  41. 제38항에 있어서, 형광물질이 고체 지지체의 표면에 결합되어 있는 키트.
  42. 제41항에 있어서, 고체 지지체가 미소구인 키트.
  43. 제41항에 있어서, 고체 지지체가 양으로 하전된 표면을 포함하고, 형광물질의 하나 이상의 음이온기가 상기 양으로 하전된 표면에 결합되어 있는 키트.
  44. 제38항에 있어서, 켄칭 잔기가 로다민인 키트.
  45. a) 샘플을 제32항에 기재된 생체접합체와 인큐베이션하는 것(여기서, 상기 생체접합체의 폴리펩티드는 효소 분석물질에 의해 인산화 또는 탈인산화될 수 있는 기를 포함함);
    b) 켄칭 잔기가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄칭 잔기가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 하나 이상의 음이온기를 더 포함하는 형광물질(여기서, 하나 이상의 금속 양이온이 형광물질의 음이온기와 결합되어 있음)을 샘플에 첨가하는 것; 및
    c) 샘플로부터 형광을 검출하는 것
    을 포함하며, 이 때 검출된 형광은 샘플 중 효소 분석물질의 존재 및(또는) 양을 나타내는 것인, 샘플 중 효소 분석물질의 존재 및(또는) 양의 검출 방법.
  46. 제45항에 있어서, 폴리펩티드가 분석물질에 의해 인산화될 수 있는 기를 포함하며, 이 때 폴리펩티드의 인산화될 수 있는 기의 인산화가 형광을 감소시키는 것인 방법.
  47. 제45항에 있어서, 폴리펩티드가 분석물질에 의해 탈인산화될 수 있는 기를 포함하며, 이 때 폴리펩티드의 탈인산화될 수 있는 기의 탈인산화가 형광을 증가시키는 것인 방법.
  48. 제45항에 있어서, 금속 양이온이 Ga3 +인 방법.
  49. 제45항에 있어서, 형광물질이 형광성 중합체인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 형광물질이 음이온기를 포함하는 폴리(p-페닐렌-에티닐렌)인 방법.
  51. 제45항에 있어서, 형광물질이 고체 지지체의 표면에 결합된 것인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 고체 지지체가 미소구인 방법.
  53. 제51항에 있어서, 고체 지지체가 양으로 하전된 표면을 포함하고, 형광성 중합체의 음이온기가 상기 양으로 하전된 표면에 결합된 것인 방법.
  54. 제45항에 있어서, 형광물질이 인큐베이션 후 및 형광 검출 전에 샘플에 첨가되는 것인 방법.
  55. 제45항에 있어서, 형광물질이 인큐베이션하기 전 또는 인큐베이션하는 동안 샘플에 첨가되고, 형광을 검출하는 것이 인큐베이션하는 동안의 형광 검출을 포함하는 것인 방법.
  56. 켄쳐를 포함하는 제1 성분; 및
    바이오티닐화된 폴리펩티드(여기서, 상기 폴리펩티드는 분석물질에 의해 변형될 수 있고, 분석물질에 의해 변형된 폴리펩티드는 켄쳐와 결합함)를 포함하는 제2 성분
    을 포함하는, 샘플 중의 분석물질 존재 검출용 키트.
  57. 제56항에 있어서, 켄쳐가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄쳐가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하는 형광물질을 더 포함하는 키트.
  58. 제57항에 있어서, 형광물질이 형광성 중합체인 키트.
  59. 제57항에 있어서, 형광성 중합체가 폴리(p-페닐렌-에티닐렌) 중합체인 키트.
  60. 제57항에 있어서, 형광물질이 고체 지지체의 표면에 결합되어 있는 키트.
  61. 제60항에 있어서, 고체 지지체가 미소구인 키트.
  62. 제56항에 있어서, 분석물질이 효소인 키트.
  63. 제62항에 있어서, 효소가 키나제 또는 포스파타제 효소인 키트.
  64. 제62항에 있어서, 효소가 폴리펩티드 기질을 인산화시킬 수 있고, 인산화된 펩티드 기질이 켄쳐와 결합하는 것인 키트.
  65. 제56항에 있어서, 켄쳐가 유기금속 화합물인 키트.
  66. 제56항에 있어서, 켄쳐가 철(III) 이미노디아세트산 킬레이트인 키트.
  67. a) 시클릭 AMP 또는 시클릭 GMP에 접합된 켄쳐를 포함하는 생체접합체와 샘플을 인큐베이션하는 것;
    b) 켄쳐가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄쳐가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 하나 이상의 음이온기를 더 포함하는 형광물질(여기서, 하나 이상의 금속 양이온이 형광물질의 음이온기와 결합되어 있음)을 샘플에 첨가하는 것; 및
    c) 샘플로부터 형광을 검출하는 것
    을 포함하며, 이 때 검출된 형광의 양은 샘플 중 포스포디에스테라제 효소의 존재 및(또는) 양을 나타내는 것인, 샘플 중 포스포디에스테라제 효소의 존재 및(또는) 양의 검출 방법.
  68. 제67항에 있어서, 형광물질 및 금속 양이온이 인큐베이션 후 및 형광 검출 전에 샘플에 첨가되는 것인 방법.
  69. 제67항에 있어서, 형광물질 및 금속 양이온이 인큐베이션하기 전 또는 인큐베이션하는 동안에 샘플에 첨가되고, 형광을 검출하는 것이 인큐베이션하는 동안의 형광 검출을 포함하는 것인 방법.
  70. a) 폴리펩티드 기질, 및 인산화될 수 있는 하나 이상의 기를 포함하는 켄쳐로 표지된 폴리펩티드를 키나제 효소를 포함하는 샘플과 인큐베이션하는 것;
    b) 켄쳐가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄쳐가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 하나 이상의 음이온기를 더 포함하는 형광물질(여기서, 하나 이상의 금속 양이온이 형광물질의 음이온기와 결합되어 있음)을 샘플에 첨가하는 것; 및
    c) 샘플로부터 형광을 검출하는 것
    을 포함하며, 이 때 폴리펩티드 기질의 인산화는 형광을 증가시키고, 검출된 형광의 양은 폴리펩티드 기질의 키나제 효소 활성의 존재 및(또는) 양을 나타내는 것인, 폴리펩티드 기질의 키나제 효소 활성의 검출 방법.
  71. 제70항에 있어서, 폴리펩티드 기질이 천연 단백질인 방법.
  72. 제70항에 있어서, 형광물질 및 금속 양이온이 인큐베이션 후 및 형광 검출 전에 샘플에 첨가되는 것인 방법.
  73. 제70항에 있어서, 형광물질 및 금속 양이온이 인큐베이션하기 전 또는 인큐베이션하는 동안 샘플에 첨가되고, 형광을 검출하는 것이 인큐베이션하는 동안의 형광 검출을 포함하는 것인 방법.
  74. a) 폴리뉴클레오티드의 제1 말단 영역에 폴리펩티드에 접합된 켄쳐를 포함하고 폴리뉴클레오티드의 제2 말단 영역에 포스페이트기를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 샘플을 인큐베이션하는 것(여기서, 상기 폴리뉴클레오티드의 제1 및 제2 말단 영역 중 적어도 일부분은 함께 혼성화되어 헤어핀 구조를 형성하고, 상기 말단 영역 간의 폴리뉴클레오티드의 중심 영역은 핵산 분석물질에 혼성화되어 헤어핀 구조를 파괴하고 폴리뉴클레오티드의 켄쳐와 포스페이트기를 분리할 수 있는 핵산 서열을 포함함);
    b) 켄쳐가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄쳐가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 하나 이상의 음이온기를 더 포함하는 형광물질(여기서, 하나 이상의 금속 양이온이 형광물질의 음이온기와 결합되어 있음)을 샘플에 첨가하는 것; 및
    c) 샘플로부터 형광을 검출하는 것
    을 포함하며, 이 때 검출된 형광은 샘플 중 핵산 분석물질의 존재 및(또는) 양을 나타내는 것인, 샘플 중 핵산 분석물질의 존재 및(또는) 양의 검출 방법.
  75. a) 샘플 중의 핵산을 켄쳐로 표지하는 것;
    b) 폴리뉴클레오티드의 제1 말단 영역에 포스페이트기를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 샘플을 인큐베이션하는 것(여기서, 상기 폴리뉴클레오티드는 핵산 분석물질에 혼성화될 수 있는 핵산 서열을 포함함);
    c) 켄쳐가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄쳐가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 하나 이상의 음이온기를 더 포함하는 형광물질(여기서, 하나 이상의 금속 양이온이 형광물질의 음이온기와 결합되어 있음)을 샘플에 첨가하는 것; 및
    d) 샘플로부터 형광을 검출하는 것
    을 포함하며, 이 때 상기 폴리뉴클레오티드에 대한 핵산 분석물질의 혼성화가 형광을 감소시키고, 감소된 형광은 샘플 중 핵산 분석물질의 존재 및(또는) 양을 나타내는 것인, 샘플 중 핵산 분석물질의 존재 및(또는) 양의 검출 방법.
  76. a) 말단 영역에 포스페이트기를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 말단 영역에 접합되어 있는 켄쳐를 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드와 샘플을 인큐베이션하는 것(여기서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 및 핵산 분석물질은 제1 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 수 있음);
    b) 켄쳐가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄쳐가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 하나 이상의 음이온기를 더 포함하는 형광물질(여기서, 하나 이상의 금속 양이온이 형광물질의 음이온기와 결합되어 있음)을 샘플에 첨가하는 것; 및
    c) 샘플로부터 형광을 검출하는 것
    을 포함하며, 이 때 상기 제1 폴리뉴클레오티드에 대한 핵산 분석물질의 혼성화가 형광을 증가시키고, 검출된 형광의 양은 샘플 중 핵산 분석물질의 존재 및(또는) 양을 나타내는 것인, 샘플 중 핵산 분석물질의 존재 및(또는) 양의 검출 방법.
  77. 제76항에 있어서, 포스페이트기가 제1 폴리뉴클레오티드의 3'-말단 영역에 존재하고 켄쳐가 제2 폴리뉴클레오티드의 5'-말단 영역에 존재하거나, 또는 포스페이트기가 제1 폴리뉴클레오티드의 5'-말단 영역에 존재하고 켄쳐가 제2 폴리뉴클레오티드의 3'-말단 영역에 존재하는 것인 방법.
  78. a) 말단 영역에 포스페이트기를 포함하며 폴리펩티드 분석물질에 결합할 수 있는 핵산 아프타머(aptamer), 및 켄쳐를 포함하며 핵산 아프타머에 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오티드와 샘플을 인큐베이션하는 것;
    b) 켄쳐가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄쳐가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 하나 이상의 음이온기를 더 포함하는 형광물질(여기서, 하나 이상의 금속 양이온이 형광물질의 음이온기와 결합되어 있음)을 샘플에 첨가하는 것; 및
    c) 샘플로부터 형광을 검출하는 것
    을 포함하며, 이 때 상기 핵산 아프타머에 대한 폴리펩티드 분석물질의 결합이 형광을 증가시키고, 검출된 형광의 양은 샘플 중 폴리펩티드 분석물질의 존재 및(또는) 양을 나타내는 것인, 샘플 중 폴리펩티드 분석물질의 존재 및(또는) 양의 검출 방법.
  79. 제78항에 있어서, 포스페이트기가 핵산 아프타머의 3'-말단 영역에 존재하고 켄쳐가 폴리뉴클레오티드의 5'-말단 영역에 존재하거나, 또는 포스페이트기가 핵산 아프타머의 5'-말단 영역에 존재하고 켄쳐가 폴리뉴클레오티드의 3'-말단 영역에 존재하는 것인 방법.
  80. 제78항에 있어서, 폴리펩티드 분석물질이 천연 단백질인 방법.
  81. 하나 이상의 아미노산 잔기가 인산화되거나 탈인산화될 수 있는, 바이오틴 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 및
    켄칭 잔기에 접합되어 있는 바이오틴 결합 단백질
    을 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드의 바이오틴 잔기는 단백질-단백질 상호작용을 통해 바이오틴 결합 단백질과 결합되어 있고, 켄칭 잔기는 형광물질과 결합되는 경우에 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있는 것인 복합체.
  82. 제81항에 있어서, 폴리펩티드가 하나 이상의 포스페이트기를 포함하는 것인 복합체.
  83. 제82항에 있어서, 폴리펩티드의 포스페이트기와 결합되어 있는 금속 양이온을 더 포함하는 복합체.
  84. 제83항에 있어서, 금속 양이온이 Ga3 +인 복합체.
  85. 제83항에 있어서, 켄쳐가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄쳐가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종, 및 하나 이상의 음이온기를 포함하는 형광물질을 더 포함하며, 여기서 형광물질의 음이온기가 금속 양이온과 결합되어 있는 복합체.
  86. 제85항에 있어서, 형광물질이 형광성 중합체인 복합체.
  87. 제85항에 있어서, 형광물질이 폴리(p-페닐렌-에티닐렌) 중합체인 복합체.
  88. 제85항에 있어서, 형광물질이 고체 지지체의 표면에 결합되어 있는 복합체.
  89. 제88항에 있어서, 고체 지지체가 미소구인 복합체.
  90. 제88항에 있어서, 고체 지지체가 양으로 하전된 표면을 포함하고, 형광물질의 음이온기가 상기 양으로 하전된 표면에 결합되어 있는 복합체.
  91. 제81항에 있어서, 바이오틴 결합 단백질이 스트렙타비딘인 복합체.
  92. 제81항에 있어서, 켄칭 잔기가 플루오레세인인 복합체.
  93. a) 샘플을 제81항에 기재된 복합체와 인큐베이션하는 것(여기서 폴리펩티드는, 키나제 효소 분석물질의 경우에는 분석물질에 의해 인산화될 수 있는 하나 이상의 기를 포함하고, 포스파타제 효소 분석물질의 경우에는 분석물질에 의해 탈인산화될 수 있는 하나 이상의 기를 포함함);
    b) 켄쳐가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄쳐가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 하나 이상의 음이온기를 더 포함하는 형광물질(여기서, 하나 이상의 금속 양이온이 형광물질의 음이온기와 결합되어 있음)을 샘플에 첨가하는 것; 및
    c) 샘플로부터 형광을 검출하는 것
    을 포함하며, 이 때 검출된 형광의 양은 샘플 중 분석물질의 존재 및(또는) 양을 나타내는 것인, 샘플 중 키나제 또는 포스파타제 효소 분석물질의 존재 및(또는) 양의 검출 방법.
  94. 제93항에 있어서, 형광물질 및 금속 양이온이 인큐베이션 후 및 형광 검출 전에 샘플에 첨가되는 것인 방법.
  95. 제93항에 있어서, 형광물질 및 금속 양이온이 인큐베이션하기 전 또는 인큐베이션하는 동안 샘플에 첨가되고, 형광을 검출하는 것이 인큐베이션하는 동안의 형광 검출을 포함하는 것인 방법.
  96. a) 키나제 효소 분석물질 검정의 경우에는 분석물질에 의해 인산화될 수 있는 하나 이상의 기를 포함하는 바이오티닐화된 폴리펩티드와 샘플을 인큐베이션하거나, 또는 포스파타제 효소 분석물질 검정의 경우에는 분석물질에 의해 탈인산화될 수 있는 하나 이상의 기를 포함하는 바이오티닐화된 폴리펩티드와 샘플을 인큐베이션하는 것;
    b) 켄칭 잔기에 접합된 바이오틴 결합 단백질을 인큐베이션된 샘플에 첨가하는 것;
    c) 켄칭 잔기가 형광물질과 결합되는 경우에 상기 켄칭 잔기가 상기 형광물질의 수퍼켄칭을 증폭시킬 수 있도록 서로 결합되어 있는 복수개의 형광성 종을 포함하며 하나 이상의 음이온기를 더 포함하는 형광물질(여기서, 하나 이상의 금속 양이온이 형광물질의 음이온기와 결합되어 있음)을 샘플에 첨가하는 것; 및
    d) 샘플로부터 형광을 검출하는 것
    을 포함하며, 이 때 검출된 형광은 샘플 중 분석물질의 존재 및(또는) 양을 나타내는 것인, 샘플 중 키나제 또는 포스파타제 효소 분석물질의 존재 및(또는) 양의 검출 방법.
  97. 제96항에 있어서, 형광물질 및 금속 양이온이 인큐베이션 후 및 형광 검출 전에 샘플에 첨가되는 것인 방법.
  98. 제96항에 있어서, 형광물질 및 금속 양이온이 인큐베이션하기 전 또는 인큐베이션하는 동안 샘플에 첨가되고, 형광을 검출하는 것이 인큐베이션하는 동안의 형광 검출을 포함하는 것인 방법.
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