KR20070099519A - 3가 금속 매개 균질 발광 근접 분석 - Google Patents

3가 금속 매개 균질 발광 근접 분석 Download PDF

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Abstract

(1) 높은 분석 신호 대 배경 비율(S/B) 및 범위(S-B)를 나타내고; (2) 균질이며; (3) 비방사성이고; (4) 인-특이적 항체를 필요로 하지 않는 시험관내 단백질 키나제 분석 기술은 예를 들어 적합한 링커, 예를 들면 니트릴로트리아세트산(NTA; 카르복시메틸-리신이라고도함), 이미노디아세트산(IDA), 또는 적합하게 치환된 N-함유 헤테로사이클, 예를 들면 트리아조헤테로사이클, 예를 들면 트리아조사이클로노나네오노난, 예를 들면 1-프로필아미노-4-아세타토-1,4,7-트리아자사이클로노난을 통하여 3가 금속 이온(예를 들면, Ga3 +, Fe3 +, Al3 +, In3 +, Ru3 +, Sc3 +, Y3 +)을 증폭된 발광 근접 분석 수용체 또는 공여체 비드의 표면에 복합체를 이루는 단계를 포함한다. 단백질(또는 구성부분) 또는 다른 키나제 기질은 증폭된 발광 근접 분석 수용체 또는 공여체 비드의 다른 것의 표면에 결합되고, 인산화되면, 3가 금속 이온과 복합체를 이룬 수용체 비드와 근접하게 되어 발광 신호를 발생시킨다. 키나제 억제제의 존재는 인산화를 억제하여 따라서 신호 발생을 억제하며, 이 방식으로 검출가능하다. 본원에 설명된 발명은 단백질(또는 구성부분), 또는 다른 생물학적 거대분자(예를 들어, 모노, 디, 또는 트리뉴클레오티드, 고리형 뉴클레오티드 또는 인산 치환된 이노시톨) 상의 인산기의 존재 또는 부재를 인식하기 때문에, 어떤 인산화 또는 탈인산화 반응 효소에도 넓게 적용가능하고, 지질 키나제, 포스파테제, 포스포디에스테라제 및 다른 것들을 포함한 단백질 키나제 및 다른 효소 부류에 대 한 높은 범용성 및 적응성 분석을 제공한다.
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3가 금속 이온, 키나제 분석, 공여체, 수용체, 인산화, 발광.

Description

3가 금속 매개 균질 발광 근접 분석{TRIVALENT METAL MEDIATED HOMOGENEOUS LUMINESCENT PROXIMITY ASSAY}
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2004년 9월 17일 출원된, TRIVALENT METAL MEDIATED HOMOGENEOUS LUMINESCENT PROXIMITY ASSAY 명칭의 미국 가특허출원 제60/610,799호의 우선권을 주장하며, 이것의 개시는 모든 목적을 위해서 전부 본원에 참고문헌으로 포함된다.
본 발명은 생물학적 분석, 특히 키나제 분석을 수행하기 위한 물질 및 방법에 관한 것이다.
다양한 세포내 단백질 및 지질 기질의 인산화는 많은 세포 과정(예를 들어, 성장, 증식, 아포프토시스, 분화 및 세포 주기 진행)에서 중심 역할을 한다. 다른 키나제 및 지질을 포함한 세포 효소의 인산화에 관여하는 효소인 키나제는 잠재적 치료적 개입에 대한 주 표적으로 확인되었다. 키나제는 티로신(즉, 인산화는 티로신 아미노산 잔기에서 발생한다) 또는 세린/트레오닌(즉, 인산화는 세린 또는 트레오닌 아미노산 잔기에서 발생한다)으로 크게 분류된다. 지금까지 확인된 약 518 사람 키나제 중에, 약 85%는 티로신 키나제로 분류된 잔여물을 가진 세린/트레오닌(S/T) 키나제이다. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T. & Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science 298, 1912-34 (2002).
잠재적 키나제 억제성 화합물의 존재에서 키나제 활성의 고속처리 결정을 가능케 하는 많은 시험관내 분석이 설명되었다. 임의의 HTS 분석과 함께, 현재의 고속처리스크린(HTS) 키나제 분석의 관심사는 검출 시약의 비용 및 분석을 검증하고 최적화하기 위한 시간 비용을 포함한다. 이를 위하여, 방사성 폐기물의 처분이 매우 비싸기 때문에, 비-방사성 분석이 매우 바람직하다. 또한, 균질 분석(즉,세척 단계를 필요로 하지 않는 분석)은 스크린 허상의 가능한 공급원의 동시 감소와 함께 더 적은 실험 단계를 필요로 하고, HTS를 더 받을 수 있어서 통상적으로 더 높은 분석 처리율 및 장치 획득 및 유지와 연관된 더 낮은 선불금 및 계속된 자본비용을 제공한다.
이들 요건을 충족시키는 현재 사용가능한 한 시험관내 키나제 분석 기술은 Perkin Elmer LAS, Inc의 AlphaScreenTM(증폭된 발광 근접 균질 분석)이다. AlphaScreenTM은 콘쥬게이션된 공여체와 수용체 비드(직경 약 250 nm) 간 생체분자의 상호작용에 의존한다. Ullman, E. F. et al. Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence. Proc Natl Acad Sci USA 91, 5426-30 (1994). AlphaScreenTM 키나제 분석의 경우, 비오틴화된 펩티드 또는 단백질 기질이 공여체 비드에 결합되고, 인산화되면, 인(phospho)-특이적 항체(전형적으로 인-티로신 특이적)와 콘쥬게이트된 수용체 비 드에 근접하게 이끌린다. Warner, G., Illy, C, Pedro, L., Roby, P. & Bosse, R. AlphaScreenTM kinase HTS platforms. Curr. Med. Chem. 11, 721-730 (2004). 서로 200 nm 내인 공여체와 수용체 비드는 520 nm와 620 nm 사이에 방출된 빛으로 발광 신호 판독을 방출한다. AlphaScreenTM 키나제 분석은 일반적으로 10 이상의 배경(S/B) 비율로 신호를 보내며(Warner, G., Illy, C, Pedro, L., Roby, P. & Bosse, R. Alphascreen kinase HTS platforms. Curr. Med. Chem. 11, 721-730 (2004)), 큰 단백질 기질과 함께 사용될 수 있다. 그러나, 고 품질 항-포스포티로신 항체는 검출에 인-특이적 항체에 의존하는 분석 기술에 대하여 사용가능하고, 일반 항-포스포세린 또는 항-포스포트레오닌 항체는 통상적으로 범용성 신호를 생산하기에 충분히 높은 질이 아니다. 결과적으로, 분석 최적화 및 검증에 필요한 시간을 증가시키고, 분석의 전체 비용을 증가시키는 인-서열 특이적 항체가 필요하다. 인-특이적 항체의 사용은 특정 S/T 키나제 또는 다른 효소 부류의 스크리닝시 AlphaScreenTM의 사용을 배제하는데, 이 때문에 고 친화성 또는 특이성의 항체가 사용가능하지 않다.
현재 사용가능한 다른 시험관내 균질, 비-방사성 키나제 분석 기술은 Molecular Devices Corporation의 MAPTM (인산에 대한 고정된 금속 친화성)이다. EVIAPTM은 이들의 표면에 복합체를 이룬 3가 금속 이온을 가진 나노입자를 이용한다. Sportsman, J. R., Daijo, J. & Gaudet, E. A. Fluorescence polarization assays in signal transduction discovery. Comb. Chem. High Throughput Screen 6, 195-200 (2003). 3가 전이금속(예를 들어, Ga3 +, Fe3 +, Al3 +, In3 +, Ru3 +, Sc3 +, Y3 +)은 고 친화성 및 특이성을 가진 인산기와 결합할 수 있다고 잠시 동안 알려졌다. Osterberg, R. Metal and hydrogen-ion binding properties of O-phosphoserine. Nature 179, 476-477 (1957); Muszynska, G., Andersson, L. & Porath, J. Selective adsorption of phosphoproteins on gel-immobilized ferric chelate. Biochemistry 25, 6850-3 (1986); 및 Posewitz, M. C. & Tempst, P. Immobilized gallium (ET) affinity chromatography of phosphopeptides. Anal Chem. 71, 2883-2892 (1999). IMAPTM 나노입자가 인산화한 후 결합될 때, IMAPTM는 형광-표지된 펩티드 기질의 증가된 형광편광에 의존한다. 이 시스템은 인-항체와 다르게 주변 아미노산(들)과 관계없이 펩티드 기질 중의 자유 인산기와 결합할 수 있는 이점을 가진다. 그러나, 형광편광은 분자 이동의 변화를 측정하기 때문에, 생물학적 시스템에서 최대 신호 범위(S-B)는 통상적으로 약 350 mP에 한정된다. 이것은 생물학적 분석에서 약 8의 이론적 최대 신호 대 배경 비율(S/B)을 부여하지만, 그러나, 실제적으로 S/B는 종종 2 또는 그 미만이다(예를 들어, J. Biomolecular Screening 8(6): 694-700 (2003) 참조). 더욱이, 기질이 단백질 또는 큰 단백질 단편인 상황에는, 큰 분자의 내부 편광이 높기 때문에(즉, B, 배경이 현저히 증가한다) S/B가 너무 작아서 사용할 수 없다. 낮은 신호 대 배경을 가진 분석은 오류 양성을 발생시킬 가능성이 더 있으며, 이는 HTS 프로그램의 전반적 범용성 및 재현성에 현저히 영향 을 미칠 수 있다. Walters, W. P. & Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat. Rev. DrugDis. 2, 259-266 (2003).
따라서, 잠재적 키나제 억제성 화합물의 존재에서 키나제 활성의 신뢰할만한 고속처리 결정을 촉진시키는 시험관내 분석 기술이 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 (1) 높은 분석 신호 대 배경 비율(S/B) 및 범위(S-B)를 나타내고; (2) 균질이며; (3) 비-방사성이고; (4) 인-특이적 항체를 필요로 하지 않는 시험관내 키나제 분석 기술을 제공함으로써 이들 이슈들을 다룬다. 본원에 설명된 발명은 단백질(또는 구성부분, 예를 들어 폴리펩티드 또는 펩티드) 또는 다른 생물학적 거대분자(예를 들어, 모노, 디, 또는 트리뉴클레오티드, 고리형 뉴클레오티드 또는 인산 치환된 이노시톨)의 존재 또는 부재를 인식하기 때문에, 어떤 인산화 또는 탈인산화 반응 효소에도 넓게 적용가능하며 단백질 키나제 및 지질 키나제, 포스파타제, 포스포디에스테라제 등을 포함한 다른 효소 부류에 대한 높은 범용성 및 적응성 분석 포맷을 제공한다.
어떤 경우에, 상기 분석은 증폭된 형광 근접 분석 공여체 및 수용체 비드를 키나제 및 키나제 억제성 후보 화합물과 조합시키는 단계를 포함한다. 비드, 일반적으로 공여체 비드 중 하나는 그것의 표면에 키나제, 예를 들면 단백질, 지질 또는 핵산(또는 그것의 구성부분, 예를 들면 단백질, 펩티드)에 의하여 인산화할 수 있는 생체분자를 결합시켰다. 다른 비드, 일반적으로 수용체 비드는 예를 들면 적합한 링커, 예를 들어 니트릴로트리아세트산(IDA), 또는 적합하게 치환된 N-함유 헤테로사이클, 예를 들면 트리아조헤테로사이클, 예를 들면 트리아조사이클로노나네오노난, 예를 들면 1-프로필아미노-4-아세타토-1,4,7-트리아자사이클로노난을 통하여 그것의 표면에 복합체를 이룬 3가 금속 이온을 가진다. 화학발광 신호는 공여체와 수용체 입자가 밀접하게 근접해 있을 때 발생하는데, 이는 키나제가 생체분자를 인산화시키고 3가 금속 이온이 인산기에 결합할 때 발생한다. 키나제 억제성 화합물 후보가 키나제 억제성 화합물인 경우, 후보 억제성 화합물이 결핍된 대조군 조성물로부터 방출된 화학발광에 비해서 분석 조성물에 의하여 방출된 화학발광은 키나제가 억제된 범위만큼 감소 또는 제거된다. 이것은 키나제 억제의 표시 또는 측정, 또는 둘 다를 제공한다.
이러한 분석을 수행하는 데 사용될 수 있는 조성물 및 키트가 또한 제공된다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 단백질 또는 구성 부분(폴리펩티드 또는 펩티드를 포함한) 키나제 분석과 관련하여 처음으로 본원에 설명되고, 어떤 인산화 또는 탈인산화 반응 효소에도 넓게 적용가능하다. 본 발명의 조성물 및 과정은 지질 키나제, 포스파타제 및 포스포디에스테라제를 포함한 다른 유형의 효소의 분석에 대안적으로 사용될 수 있다.
PI3K와 같은 지질 키나제의 경우, 인산화 반응은 PI-4,5-P2를 PI-3,4,5-P로 만든다. 또한 PI(포스파티딜이노시톨) 그 자체가 기질로 사용될 수 있다. PI 또는 PIP2가 인산화되면, 비드는 증가된 화학발광 신호를 나타낸다.
포스파타제 및 포스포디에스테르의 경우, 상기 분석은 포스파타제 또는 포스포디에스테라제가 인산기를 제거하기 때문에 키나제 분석의 반대로 작동하는데, 예를 들면 억제제가 대조군에 비해서 높은 화학발광을 발생한다.
이들 및 다른 양태 그리고 본 발명의 이점은 하기에 상세히 설명된다.
도 1은 본 발명에 따라서 3가 금속 매개된 균질 형광 근접 키나제 분석을 수행하기에 적합한 조성물의 성분을 도시한다.
도 2 및 도 3은 실시예 1에서 시험한 각 조건에 대한 발광 수를 나타낸 플롯이다.
도 4 내지 7은 실시예 2에서 시험된 각 조건에 대한 발광 수를 나타낸 플롯이다.
발명의 상세한 설명
이제 본 발명의 특정 구체예에 대하여 상세히 언급할 것이다. 특정 구체예의 실시예는 첨부된 도면에 설명된다. 본 발명은 이들 특정 구체예와 함께 설명될 것이지만, 본 발명을 이러한 특정 구체예에 한정하려는 의도는 아니다. 그와 반대로, 첨부된 청구범위에 의하여 한정된 본 발명의 사상과 범주 내에 포함될 수 있는 대안, 변형 및 균등한 것을 포괄하려는 의도이다. 하기 설명에서, 많은 구체적 상세내용은 본 발명의 세밀한 이해를 돕기 위해서 제공된다. 이들 특정 상세한 설명의 일부 또는 전부가 없어도 본 발명을 수행할 수 있다. 다른 예에서, 주지된 과정 실시는 불필요하게 본 발명을 불분명하게 하지 않도록 하기 위하여 상세히 설명되지 는 않았다.
발명의 소개
본 발명은 (1) 높은 분석 신호 대 배경 비율(S/B) 및 범위(S-B)를 나타내고; (2) 균질이며; (3) 비-방사성이고; (4) 인-특이적 항체를 필요로 하지 않는 시험관내 키나제 분석 기술을 제공하였다. 본원에 설명된 발명은 단백질(또는 그것의 구성부분, 예를 들면 폴리펩티드 또는 펩티드) 또는 다른 생물학적 거대분자(예를 들면, 모노, 디, 또는 트리뉴클레오티드, 고리형 뉴클레오티드 또는 인 치환된 이노시톨)의 존재 또는 부재를 인식하기 때문에, 어떤 인산화 또는 탈인산화 반응 효소에도 널리 적용가능하며 단백질 키나제 및 지질 키나제, 포스파타제, 포스포디에스테라제 등을 포함한 다른 효소 부류에 대한 높은 범용성 및 적응성 분석 포맷을 제공한다.
한 구체예에서, 상기 분석은 증폭된 발광 근접 분석 공여체 및 수용체 비드를 키나제 및 키나제 억제성 화합물 후보와 결합시키는 단계를 포함한다. 비드 중 하나, 일반적으로 공여체 비드는 그것의 표면에 키나제에 의하여 인산화시킬 수 있는 생체분자, 예를 들어 단백질, 지질 또는 핵산(또는 그것의 구성부분, 예를 들어, 단백질, 펩티드)을 결합시켰다. 다른 비드, 일반적으로 수용체 비드는 예를 들면 적합한 링커, 예를 들어 니트릴로트리아세트산(NTA; 카르복시메틸-리신이라고도 함), 이미노디아세트산(IDA), 또는 적합하게 치환된 N-함유 헤테로사이클, 예를 들면 트리아조헤테로사이클, 예를 들면 트리아조사이클로노나네오노난, 예를 들면 1-프로필아미노-4-아세타토-1,4,7-트리아자사이클로노난을 통하여 그것의 표면에 복 합체를 이룬 3가 금속 이온(예를 들어, Ga3 +, Fe3 +, Al3 +, In3 +, Ru3 +, Sc3 +, Y3 +)을 가진다. 본 발명에 따라서 이 키나제 분석 및 다른 분석에서의 비드의 표면 성분은 뒤바뀔 수 있는 것으로 이해되어야 하는데, 예를 들어 3가 금속 이온은 공여체 비드 상에 있을 수 있고 키나제 기질(인산화/탈인산화를 위한 생체분자)은 수용체 비드 상에 있을 수 있다.
화학발광 신호는 공여체와 수용체 입자가 밀접하게 근접해 있을 때 발생하는데, 이는 키나제가 생체분자를 인산화시키고 3가 금속 이온이 인산기에 결합할 때 발생한다. 본 발명의 목적상, 화학발광은 어떤 형광 또는 인광 광자의 방출을 포함한, 화합물과 활성 산소를 포함한 반응성 화학종의 화학반응으로부터 직접 또는 간접적으로 발생한 빛의 방출을 말한다. 키나제 억제성 화합물 후보가 실질적으로 키나제 억제성 화합물인 경우, 후보 억제성 화합물이 결핍된 대조군 조성물로부터 방출된 화학발광에 비해서 분석 조성물에 의하여 방출된 화학발광은 키나제가 억제된 범위만큼 감소 또는 억제된다. 이것은 키나제 억제의 표시 또는 측정, 또는 둘 다를 제공한다.
이러한 분석을 사용하는 데 사용될 수 있는 조성물 및 키트가 또한 제공된다.
본 발명은 지금 한 구체예와 관련하여, 키나제 분석, 주로 단백질 키나제 분석과 관련하여 설명될 것이다.
3가 금속 매개된 균질 발광 근접 키나제 분석
Fe3 +를 포함한 3가 전이 금속 이온은 고 친화성 및 특이성을 가진 인산기와 결합할 수 있고, 그 사실은 키나제 분석, 특히 전술한 IMAPTM 기술에 이점으로 사용되었다고 잠시 동안 알려졌다. 그러나, IMAPTM 이외에 키나제 분석에서의 3가 금속 이온의 사용은 알려지지 않았다. 공여체 비드에서의 활성 산소 발생 및 수용체 비드로의 증식은 전술된 바와 같이 존재하는 증식된 발광 근접 균질 분석 기술의 작동에 대한 열쇠이며, 단일상태 이온 켄처(quencher)의 존재는 최신기술에 의하면 금기시되어 있다. 전술한 AlphaScreenTM 분석 기술의 공급업체는 Fe3 +를 포함한 어떤 전이 금속 이온이 유력한 활성 산소 켄처인 것으로 확인되었다는 것을 명백하게 기록하고, AlphaScreenTM 제품과 함께 제공된 문헌에 그것들의 사용을 피해야 한다는 것을 강하게 추천한다. A Practical Guide to Working with AlphaScreenTM, 22 페이지, PerkinElmer, Inc. (2003), 이 문헌은 모든 목적을 위하여 전부 본원에 포함된다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 전술한 현재의 증폭된 발광 근접 균질 분석 기술에 사용된 인-특이적 항체를 3가 금속 이온으로 대체하는 것이 향상된 분석을 제공한다는 것을 예기치 않게 발견하였다.
도 1은 본 발명에 따라서 3가 금속 매개된 균질 발광 근접 키나제 분석을 수행하기에 적합한 조성물(100)의 성분을 도시한다. 근접 분석은 콘쥬게이트된 공여체(102)와 수용체(104) 입자 간의 생체분자 상호작용을 이용함으로써 수행된다. 바 람직한 구체예에서, 입자는 문헌(Ullman, E. F. et al. Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence)에 설명된 것과 같은 폴리머 비드이다. Proc Natl Acad Sd USA 91, 5426-30 (1994), 및 미국 특허 제6,703,248호는 모든 목적을 위해서 전부 본원에 참고문헌으로 포함된다. 이들 문헌에 따른 비드는 AlphaScreenTM 비드로 거래되며, Perkin Elmer Life and Analytical Sciences(매사츄세츠 보스톤)으로부터 구입가능하다. 폴리머 비드는 예를 들면 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐 클로리드, 폴리비닐나프탈렌 및 폴리메타크릴레이트 중의 하나 이상의 폴리머로 구성될 수 있다. 적합한 비드는 라텍스 입자의 형태일 수 있다. 또한, 폴리머 비드는 예를 들어 약 0.1 내지 약 25 중량%의 양으로 고차 알킬방향족 화합물 및 고차 알킬옥시방향족 화합물 및 플루오르화탄소와 같은 가소제를 포함한다. 비드는 직경 약 20 nm 내지 lOO μm, 예를 들면 직경 약 175 nm 내지 275 nm일 수 있다. 생물학적, 예를 들면 키나제 분석에 사용될 때, 비드는 수용성 매질(110), 예를 들면 적합한 완충액에 분산된다.
공여체 비드(102)는 광 공급원, 예를 들면 레이저에 의한 여기(활성화)시 주변 산소를 활성 산소로 변환시키는 감광기를 혼입한다. 적합한 감광기의 예는 엔도페록시드 또는 프탈로시아닌을 포함한다. 공여체 비드는 또한 생체분자(106)의 결합을 촉진시키는 표면 코팅(103)을 가진다. 대체로, 표면 코팅은 생체분자(106) 상의 링커(108)에 상보적이다. 예를 들어, 공여체 비드 표면 코팅(103)은 아비딘, 예 를 들면 스트렙타비딘이고, 생체분자(106) 상의 상보적 링커(108)는 비오틴이다. 다른 적합한 링커는 글루타티온-S-전이효소, 단백질 A, 단백질 G, 및 6x 히스티딘 태깅된 분자에 대한 킬레이트된 Ni2 +를 포함한다. 적합한 공여체 비드는 Perkin Elmer Life and Analytical Sciences(메사츄세츠 보스턴)에서 구입가능한 AlphaScreen 공여체 비드이다.
키나제 분석의 경우, 생체분자(106), 예를 들어 단백질, 지질 또는 핵산(또는 그것의 구성성분, 예를 들면, 단백질, 펩티드)은 그것의 생물학적 활성을 조절하기 위하여 키나제에 의하여 인산화할 수 있다. 그것은 공여체 비드 표면 코팅(103) 및 링커(108)를 통하여 공여체 비드의 표면에 결합된다. 생체분자(106)는 특정 분석에서 관심있는 키나제에 기초하여 선택된다. 예를 들면, 분석의 목적이 단백질 세린/트레오닌 키나제 PDK1에 대한 억제제를 확인하는 것인 경우, 생체분자(106)는 당업계에 공지된 바와 같이, PDK1에 의하여 인산화를 할 수 있는 단백질(또는 구성성분)일 것이다. 본 발명의 분석이 적용될 수 있는 키나제의 일부 예는 하기와 같다: 키나제는 Akt 키나제 패밀리, 오로라 키나제 패밀리, PDK1, MAPKAP K2, Erk 키나제 패밀리, CAMK 키나제 패밀리, 사이클린 의존적 키나제(예를 들면, CDK1, CDK2, CDK4, CDK6), RAF 키나제 패밀리, 카세인 키나제 패밀리, PKC 패밀리, PKA 패밀리, PKB 패밀리, PKG 패밀리, GSK3 베타, ROCK, SGK, Rsk 패밀리 및 Nek 패밀리를 포함한 단백질 세린/트레오닌 키나제; 수용체 티로신 키나제, 예를 들면 FGFR, EGFR, PDGFR, c-Kit, IGFR, 인슐린 수용체, TrkA, TrkB, TrkC, c- Met 또는 c-Ret, 및 세포질 티로신 키나제, 예를 들면 Src, Lck, Lyn, Fyn, Yes, Syk, Hck, Ab1 및 Eph 패밀리를 포함한 단백질 티로신 키나제; 또는 지질 키나제, 예를 들면 PI3 키나제, PI4 키나제 또는 PI5 키나제일 수 있다.
수용체 비드(104)는 활성 탄소의 존재에서 화학발광 신호를 발생시키는 화학발광 화합물을 혼입시킨다. 따라서, 활성화된 공여체(102) 및 수용체(104) 비드가 밀접하게 근접해 있을 때, 즉, 단지 그것의 수명 동안 수용액에서 활성 산소에 의하여 이동하게 되는 비드 간의 거리, 예를 들면 단지 약 200 nm의 거리에 있을 때, 화학발광 신호는 발생된다. 한 구체예에서, 화학발광 화합물은 티옥센 유도체이고 520과 620 nm 사이에 방출된 빛으로 화학발광 신호 판독을 방출한다.
수용체 입자(104)는 일반적으로 표면 코팅(112)을 가지고 있어서 덱스트란 또는 폴리펩티드 히드로겔과 같은 비특이적 결합을 방지한다. 그것은 또한 예를 들면 수용체 입자(104) 표면 코팅(112)에 공유결합된 링커(115)를 통하여 비드(104) 표면에 복합체를 이룬 3가 금속 이온(114)을 가진다. 3가 금속 이온(114)은 Ga3 +, Fe3 +, Al3+, In3 +, Ru3 +, Sc3 +, 및 Y3 + 중 적어도 하나일 수 있다.
3가 금속 이온을 크로마토그래피 기질에 복합체를 이루는 것은 통상적으로 6xHis 함유 단백질의 정제에 사용된 2가 Ni2 + 복합체를 이룬 니트릴로트리아세트산(NTA; 카르복시메틸-리신이라고도 함) 또는 이미노디아세트산(IDA) 수지 대신에 3가 금속으로 치환함으로써 가능한 것으로 확인되었다. Porath, J. IMAC-immobilized metal ion affinity based chromatography. Trends Anal. Chem. 7, 254-259 (1988), 모든 목적을 위하여 본원에 전부 참고문헌으로 포함된다. 3가 금속 이온은 이 기술을 2가 Ni2 + 복합체를 이룬 니트릴로트리아세트산(NTA) AlphaScreenTM 수용체 비드에 적용시킴으로써 본 발명에 따라서 수용체 비드로서 적합한 폴리머 비드에 복합체를 이룰 수 있는 것으로 확인되었다. 게다가, 하기의 실시예에 더 설명되는 바와 같이, 3가 금속 이온은 수용체 비드로서 적합한 수지, 예를 들면 AlphaScreenTM 콘쥬게이트되지 않은, "원" 수용체 비드에 직접 결합될 수 있다. AlphaScreenTM 비드는 Perkin Elmer Life and Analytical Sciences (메사츄세츠 보스턴)로부터 구입가능하다.
3가 금속 이온은 또한 적합하게 치환된 N-함유 헤테로사이클, 예를 들면 트리아조헤테로사이클, 예를 들면 트리아조사이클로노나네오노난인 링커(115)를 통하여 본 발명에 따른 수용체 비드로서 적합한 폴리머 비드에 복합체를 이룰 수 있다. 화합물 1-아세타토-4-벤질-트리아조사이클로노난은 단백질 정제 및 다른 응용을 위한 Ni/NTA의 대안으로 설명되었다(D.L. Johnson and LX. Martin, J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 2018-2019 (및 관련된 추가 정보), 본원에 전부 모든 목적을 위해서 참고문헌으로 포함된다). 적합한 치환은 트리아조헤테로사이클을 수용체 비드(104)의 표면에 결합시키는 기능을 제공하는데, 이는 전술한 바와 같이 일반적으로 비특이적 결합을 방지하기 위한 표면 코팅(112), 예를 들면 덱스트란 또는 폴리펩티드 히드로겔의 코팅을 가질 것이다. 적합한 치환은 카르복실기 및 자유 아민을 포함한다. 이러한 적합한 링커(115)의 한 구체적 예는 1-프로필아미노-4-아세타토- 1,4,7-트리아자사이클로노난이며
Figure 112007025851619-PCT00001
,
그 제조는 하기의 실시예에 설명된다.
이론에 얽매이려는 의도는 아니지만, 트리아조헤테로사이클릭 링커(115)가 3가 금속 이온과 더 강하게 복합체를 이룰 수 있어서, 분석에 반응 정지로 사용된 금속 이온 킬레이터(예를 들면, EDTA)에 의하여 수용체 비드로부터 이온이 떨어지는 것을 저지하는 것으로 믿어진다. 나아가, 이 유형의 링커의 강성은 복합체를 이룬 복합체를 이룬 금속 이온을 수용체 비드 표면에서 멀리 떨어지게 하고, 공여체 비드 쪽으로 향하게 함으로써, 분석으로부터 신호를 향상시키는 것으로 믿어진다.
전술한 바와 같이, 화학발광 신호는 활성화된 공여체와 수용체 비드가 밀접하게 결합될 때 발생한다. 이것은 비드 상의 표면 결합기들 간의 생물학적 상호작용이 있을 때 이루어질 수 있다. 수용체 비드(104) 상의 3가 금속 이온(114)은 생체분자가 키나제에 의하여 인산화되었다면 생체분자(106)의 인산기(116)에 결합하여 비드와 밀접하게 결합할 것이다. 그러나, 후보 화합물이 키나제 억제성 화합물인 경우, 그것은 생체분자의 인산화 및 그에 따라서 화학발광 신호의 발생을 억제하고, 후보 억제성 화합물이 결핍된 대조군 조성물로부터 방출된 화학발광에 비해서 분석 조성물에 의하여 방출된 화학발광은 키나제가 억제된 범위만큼 감소 또는 제거된다. 이것은 키나제 억제의 표시 또는 측정, 또는 둘 다를 제공한다.
따라서, 본 발명에 따른 분석은 키나제 억제성 화합물을 검출하기 위하여 수행될 수 있다. 상기 방법은 감광제와 키나제에 의하여 인산화할 수 있는 표면 결합된 인산화되지 않은 생체분자를 가진 공여체 입자, 및 입자 표면과 화학발광 화합물에 복합체를 이룬 3가 금속 이온을 가진 수용체 입자를 포함한 조성물을 제공하는 단계를 포함한다. 화학발광 화합물은 감광제가 활성화되고 공여체와 수용체 입자가 밀접하게 근접해 있을 때 발광 신호를 발생시킨다는 점에서 특징이 있다. 키나제 및 후보 키나제 억제성 화합물은 후보 화합물의 부재시는 어떤 인산화도 일어나지 않도록 조성물에 도입된다. 이를 수행하기 위한 많은 방법이 있다. 인산화 반응이 시작되기 위해서는, 세 가지 성분이 존재해야 한다: 키나제, 키나제 기질(예를 들면, 단백질(또는 구성부분)과 같은 인산화될 생체분자) 및 ATP. 세 가지 중 임의의 두 가지를 조합시켜서 혼합 또는 화합물을 함유한 웰에 첨가한다. 억제제 후보는 인산화가 일어나기 위해 필요한 요소 모두가 조합되기 전에 첨가되어야 한다. 그 다음 세 번째 성분을 첨가한다.
그 다음 후보 억제성 화합물이 결핍된 대조군 조성물로부터 방출된 화학발광에 비해서 감소 또는 제거된 화학발광으로 관찰된 후보 억제성 화합물에 의한 키나제의 억제를 검출함으로써 후보 화합물이 키나제 억제제인지 아닌지를 결정할 수 있다.
AlphaScreenTM 기술로 수행된 것과 같은 사전 발광 근접 분석에서, 추천하는 정지 완충액은 EDTA, 통상적이고 편리한 금속 킬레이터를 포함한다는 것을 주의해 야 한다. 본 발명에 따른 3가 금속 이온-매개 발광 근접 분석은 3가 금속 이온을 수용체 비드에 복합체를 이루게 하는 데 사용된 EDTA 및 링커의 3가 금속 이온의 상대적 친화력에 따라서, EDTA를 포함한 정지 완충액을 사용할 수도 또는 사용하지 않을 수도 있다. EDTA의 친화력이 링커보다 더 큰 경우, 반응 정지 완충액이 첨가될 때 비드로부터 3가 금속 이온을 떨어뜨릴 위험을 피하기 위해서, 대체 반응 정지 완충액이 분석에 사용될 수 있다. 예를 들면, 비-EDTA 완충액, 예를 들면 EDTA를 함유하지 않은 IMAPTM 결합 완충액은 금속 이온이 떨어지는 것을 피하기 위한 이러한 예에서 사용될 수 있다. 또한 낮은 pH 용액은 이러한 예에서 수용가능한 정지 완충액을 제공할 수 있다. 링커의 친화력이 EDTA 보다 더 큰 경우, EDTA가 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일부 구체예, 예를 들어 NTA 3가 금속 이온 링커를 사용한 경우에는 EDTA가 충분히 강한 금속 킬레이터이어서 NTA 복합체를 이룬 금속 이온을 수용체 비드에서 떼어낼 수 있기 때문에 EDTA-함유한 반응 정지 완충액을 사용하지 않는다. 한편, EDTA-함유하는 반응 정지 완충액은 본 발명의 구체예에서 사용될 수 있는데, 이러한 링커는 EDTA보다 더 큰 친화력을 가진 3가 금속 이온과 복합체를 이룸으로써 EDTA에 의하여 금속 이온이 비드로부터 떨어지는 것을 방지하는 것으로 믿어지기 때문에, 트리아조헤테로사이클릭 링커, 예를 들면 1-프로필아미노-4-아세타토-1,4,7-트리아자사이클로노난이 사용된다.
본 발명의 구체예
본 발명은 예를 들어 하기와 같은 조성물, 키트 또는 방법으로 구현될 수 있다:
감광제를 포함한 공여체 입자; 감광제가 활성화되고 공여체와 수용체 입자가 밀접하게 근접해 있을 때 발광 신호를 발생시키는 특성이 있는 화학발광 화합물을 포함한 수용체 입자; 및 공여체 또는 수용체 입자 중 하나의 표면에 복합체를 이룬 3가 금속 이온을 포함한 조성물.
입자 표면 및 감광제와 화학발광 화합물 중 하나에 복합체를 이룬 3가 금속 이온을 포함한 폴리머 입자를 포함한 조성물. 입자는 감광제를 포함한 두 번째 입자와 화학발광 화합물이 밀접하게 근접해 있고 감광제가 활성화될 때 발광 신호가 발생된다는 점을 특징으로 할 수 있다.
패키지된 조합으로 분석을 수행하기 위한 시약을 포함한, 분석에 사용하기 위한 키트로서, 상기 시약은 감광제를 포함한 공여체 입자; 감광제가 활성화되고 공여체와 수용체 입자가 밀접하게 근접해 있을 때 발광 신호를 발생시키는 특성이 있는 화학발광 화합물을 포함한 수용체 입자; 및 공여체 또는 수용체 입자 중 하나의 표면에 복합체를 이룬 3가 금속 이온을 포함하는 키트. 또한 키트는 하기에 설명되는 본 발명의 양태에 따라서 키나제 억제성 화합물을 검출하는 방법과 같은 3가 금속 매개된 균질 발광 근접 분석을 수행하기 위한 설명서를 함유할 수 있다.
키나제 억제성 화합물을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 감광제 및 키나제에 의하여 인산화할 수 있는 표면 결합된 인산화되지 않은 생체분자를 포함한 공여체 입자, 및 감광제가 활성화되고 공여체와 수용체 입자가 밀접하게 근접해 있을 때 발광 신호를 발생시키는 특성이 있는 화학발광 화합물과 입자 표면에 복합체를 이룬 3가 금속 이온을 포함한 수용체 입자를 포함한 조성물을 제공하는 단계; 조성물에 후보 키나제 억제성 화합물을 도입하는 단계; 조성물에 키나제를 도입하는 단계; 및 후보 억제성 화합물이 결핍된 대조군 조성물로부터 방출된 화학발광에 비해서 감소된 화학발광으로 관찰되는 후보 억제성 화합물에 의하여 키나제의 억제를 검출함으로써 후보 키나제 억제성 화합물이 키나제 억제성 화합물이라는 것을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
포스파타제 또는 포스포디에스테라제 억제성 화합물을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 감광제 및 포스파타제 또는 포스포디에스테라제에 의하여 탈인산화할 수 있는 표면 결합된 인산화된 생체분자를 포함한 공여체 입자, 감광제가 활성화되고 공여체와 수용체 입자가 밀접하게 근접해 있을 때 발광 신호를 발생시키는 특성이 있는 화학발광 화합물과 입자 표면에 복합체를 이룬 3가 금속 이온을 포함한 수용체 입자를 포함한 조성물을 제공하는 단계; 조성물에 포스파타제 또는 포스포디에스테라제를 도입하는 단계; 조성물에 후보 포스파타제 또는 포스포디에스테라제 억제성 화합물을 도입하는 단계; 및 후보 억제성 화합물이 결핍된 대조군 조성물로부터 방출된 화학발광에 비해서 증가된 화학발광으로 관찰되는 후보 억제성 화합물에 의하여 포스파타제 또는 포스포디에스테라제의 억제를 검출함으로써 후보 포스파타제 또는 포스포디에스테라제 억제성 화합물이 포스파타제 또는 포스포디에스테라제 억제성 화합물이라는 것을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
본 발명의 조성물, 키트 또는 방법 중 어떤 것의 경우, 활성화된 감광제는 광 공급원에 의하여 여기시 주변 산소를 활성 산소로 변환시킬 수 있다. 광 공급원은 레이저일 수 있다. 감광제는 엔도페록시드일 수 있다. 화학발광 화합물은 티옥센 유도체일 수 있다. 수용체 및 공여체 입자는 수용성 매질에 분산될 수 있다. 밀접하게 근접한 거리는 단지 그것의 수명 동안 수용액에서 활성 산소에 의하여 이동할 수 있는 거리, 예를 들면 단지 200 nm이다. 입자는 폴리머 비드일 수 있다. 폴리머 비드는 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐 클로리드, 폴리비닐나프탈렌 및 폴리메타크릴레이트로 구성된 군 중에서 선택된 폴리머를 포함할 수 있다. 폴리머 비드는 고차 알킬방향족 화합물 및 고차 알킬옥시방향족 화합물 및 플루오르화탄소로 구성된 군 중에서 선택된 가소제의 약 0.1 내지 약 25 중량%을 포함할 수 있다. 어떤 경우에, 폴리머 비드는 직경이 약 200 nm 내지 약 100 μm일 수 있다. 다른 경우에, 폴리머 비드는 직경이 약 175 nm 내지 약 275 nm일 수 있다. 비드는 대안적으로 라텍스 입자를 포함할 수 있다. 어떤 경우에, 3가 금속 이온은 수용체 입자 표면에 복합체를 이룰 수 있고; 다른 경우에는, 공여체 입자 표면에 복합체를 이룰 수 있다. 3가 금속 이온은 N-함유 링커, 예를 들면 카르복시메틸-리신 및 1-프로필아미노-4-아세타토-1,4,7-트리아자사이클로노난 링커 중 하나, 예를 들면 1-프로필아미노-4-아세타토-1,4,7-트리아자사이클로노난 링커를 통하여 공여체 또는 수용체 입자 중 하나의 표면에 복합체를 이룰 수 있다. 공여체 입자는 키나제에 의하여 인산화할 수 있는 생체분자의 결합을 촉진하기 위한 표면 코팅을 더 포함할 수 있다. 코팅은 상보적 결합쌍 중 하나를 포함할 수 있다. 공여체 비드는 단백질, 지질, 핵산 및 그것들의 구성성분으로 구성된 군 중에서 선택된 표면 결합된 생체 분자를 더 포함할 수 있는데, 이 생체분자는 생체분자의 생물학적 활성을 조절하기 위하여 키나제에 의하여 인산화할 수 있다. 키나제는 단백질 세린/트레오닌 키나제, 단백질 티로신 키나제 및 지질 키나제로 구성된 군 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 키나제는 Akt 키나제 패밀리, 오로라 키나제 패밀리, PDK1, MAPKAP K2, Erk 키나제 패밀리, CAMK 키나제 패밀리, 사이클린 의존적 키나제, RAF 키나제 패밀리, 카세인 키나제 패밀리, PKC 패밀리, PKA 패밀리, PKB 패밀리, PKG 패밀리, GSK3 베타, ROCK, SGK, Rsk 패밀리 및 Nek 패밀리로 구성된 군 중에서 선택된 단백질 세린/트레오닌 키나제일 수 있고; 또는 키나제는 수용체 티로신 키나제 및 세포질 티로신 키나제로 구성된 군 중에서 선택된 단백질 티로신 키나제일 수 있으며; 또는 키나제는 FGFR, EGFR, PDGFR, c-Kit, IGFR, 인슐린 수용체, TrkA, TrkB, TrkC, c-Met 및 c-Ret으로 구성된 군 중에서 선택된 티로신 키나제일 수 있고; 또는 키나제는 Src, Lck, Lyn, Fyn, Yes, Syk, Hck, Ab1 및 Eph 패밀리로 구성된 군 중에서 선택된 세포질 티로신 키나제일 수 있으며; 키나제는 PI3 키나제, PI4 키나제 및 PI5 키나제로 구성된 군 중에서 선택된 지질 키나제일 수 있다. 생체분자는 공여체 비드 상의 표면 코팅에 상보적인 링커를 더 포함할 수 있다. 공여체 비드는 아비딘, 예를 들면 스트렙타비딘을 포함할 수 있고, 생체분자 상의 상보적 링커는 비오틴을 포함할 수 있다. 수용체 비드 상의 3가 금속 이온과 공여체 비드 상의 인산화된 생체분자의 인산기 간의 생물학적 상호작용은 비드를 매우 밀접하게 붙잡을 수 있다. 3가 금속 이온은 Ga3 +, Fe3 +, Al3 +, In3 +, Ru3 +, Sc3 +, 및 Y3 +으로 구성된 군 중에서 선택될 수 있다. 본 발명의 방법에서, 후보 키나제 억제제 화합물은 키나제의 도입 전에 또는 그것과 동시에 도입될 수 있고, ATP는 조성물에 더 도입될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 어떤 양태 및 성분 재료 및 그것들의 제조를 설명하기 위하여 제공된다. 실시예는 본 발명을 더 설명하기 위한 것이며, 어떤 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하려는 의도는 아니다.
실시예 1
재료 및 방법
AlphaScreenTM 스트렙타비딘 공여체 비드, AlphaScreenTM Ni2 +-킬레이트 수용체 비드 및 AlphaScreenTM 콘쥬게이트되지 않은, "원" 수용체 비드는 Perkin Elmer Life and Analytical Sciences (메사츄세츠 보스턴)으로부터 구입하였다. IMAPTM 결합 완충액은 5x 농도로 Molecular Devices (캘리포니아 서니베일)로부터 구입하였다. 3가 금속 이온염은 Sigma Aldrich(미주리 세인트루이스)(FeCl3) 및 Alfa Aesar(메사츄세츠 워드힐)(GaCl3 및 AlCl3)로부터 구입하였다. Akt3 키나제 및 비오틴화된 크로스타이드 기질은 Upstate(버지니아 Charlottesville)로부터 구입하였다. 시아노보로수소화나트륨 및 카르복시메틸-L-리신은 Sigma Aldrich로부터 구입하였다. 본원에 설명된 다른 용액들은 VWR International, 펜실베니아 웨스트체스 터에서 구입한 연구용 재료로 만들었다. 처음으로, 3가 금속 이온을 AlphaScreenTM 수용체 비드에 복합체를 이루는 두 가지 방법을 개발하였고 하기에 설명한다.
방법 1: Ni2 +-킬레이트 AlphaScreenTM 비드 상의 Ni2 + 대신에 3가 금속 이온으로 치환하는 방법
1) 원심분리(13,000 x g, 20 분, 4℃)로 250 ㎍ (50 ㎕의 5mg/ml) Ni2 +-킬레이트 수용체 비드를 침전시킨다.
2) 1 mL 스트립 완충액(500 mM NaCl, 100 mM EDTA, 50 mM TrisHCl, pH 8)에 침전된 비드를 재현탁한다. 와동, 초음파분쇄하고 암실에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베인션한다.
3) 0.1 M TrisHCl, pH 8에서 3회 세척한다(13,000 x g, 20 분, 4℃)
4) 100 mM M3 + 용액(예를 들면, FeCl3, GaCl3, 또는 GaNO3) 1 mL에 재현탁한다. 와동, 초음파분쇄하고 37℃ 암실에서 1시간 동안 인큐베인션한다.
5) 보관 완충액(25 mM HEPES/100 mM NaCl, pH 7.4) 1 mL에서 2회 세척한다.
6) 100 ㎕ 보관 완충액에서 최종 세척물을 재현탁한다.
방법 2: NTA (카르복시메틸-리신)을 통하여 AlphaScreenTM 수용체 비드에 3가 금속 이온을 직접 결합시키는 방법.
1) 1.5 ml 마이크로퓨즈 튜브에 아래 용액을 혼합시킨다:
400 ㎍의 원 AlphaScreenTM 알데히드 수용체 비드 (40 ㎕의 20 mg/ml)
10 ㎕의 l% Tween-20
8 ㎕의 NaCNBH4 (시아노보로수소화나트륨) 용액 (25 mg/ml)
400 ㎍의 카르복시메틸-리신 (0.1 M MOPS 중에 20 mg/ml 40 ㎕, pH 8)
62 ㎕의 0.1 M MOP, pH 8
2) 37 ℃ 암실에서 48 내지 60 시간 동안 교반하며 반응물을 인큐베이션한다.
3) 10 ㎕의 1 M Tris-HCl, pH 7.5를 첨가하여 반응을 차단한다. 37 ℃ 암실에서 1 시간 동안 인큐베이션한다.
4) 비드를 침전시키고, 상청액을 가만히 따라 내고, 200 ㎕의 O.1M Tris-HCl, pH 8에서 와동하면서 재현탁한다.
5) 단계 4를 2회 반복한다.
6) 1.5 mM NaOH에 준비된 100 mM M3 + 용액(예를 들면, FeCl3, GaCl3, 또는 GaNO3)에서 비드를 재현탁한다. 37 ℃ 암실에서 1 시간 동안 인큐베이션한다.
7) 13,000 x g, 4℃에서 20분 동안 침전시켜 세척하고 200 ㎕의 0.1 M Tris-HCl, pH 8에 재현탁한다.
8) 단계 7을 반복한다.
9) 최종 세척 후, 수용체 비드 보관 완충액(25 mM HEPES/100 mM NaCl, pH 7.4)에 침전물을 재현탁한다.
결과
방법 1:
프로토콜. 비오틴화된 크로스타이드 펩티드 (552 μM 원액) 및 ATP (10 mM 원액)를 완전반응 완충액(CRB: 10 mM TrisHCl, 10 mM MgCl2, 0.01% BSA, 1 mM DTT, pH 7.2)에 각각 1 μM 및 20 μM로 희석하여 2x 농축 기질/ATP 용액을 만들었다. Akt3 키나제(Upstate, 약 2 μM 원액)를 CRB에 20 nM로 희석하여 2x 농축 키나제 용액을 만들었다. 10 ㎕의 2x 기질/ATP 용액을 10 ㎕의 CRB 단독 또는 10 ㎕의 2x Akt3 키나제 용액 (최종 분석 농도: 10 nM Akt3, 10 μM ATP, 500 nM 크로스타이드)와 조합하여 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 대조군으로서 일부 반응을 5 μM 스타우로스포린, 잠재적 판-키나제 억제제로 15분 동안 사전-인큐베이션하였다. 3x 농축 IMAPTM 결합 완충액에 AlphaScreenTM 스트렙타비딘 공여체 (10 ㎍/ml)와 3가 금속 이온 복합체 수용체 (20 ㎍/ml) 비드의 30 ㎕의 혼합물을 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 각 조건에 대한 발광 수를 Packard Fusion Alpha에서 판독하였고 도 1 및 2에 나타냈다(도 1 및 2에 나타난 값은 4회 반복값의 평균이다).
방법 2:
프로토콜. 비오틴화된 Crosstide 펩티드 (552 μM 원액) 및 ATP (10 mM 원액)을 완전반응 완충액(CRB: 10 mM TrisHCl, 10 mM MgCl2, 0.01% BSA, 1 mM DTT, pH 7.2)에 1 μM로 희석하여 2x 농축 기질/ATP 용액을 만들었다. 그 다음 이 용액을 1:1로 연속적으로 희석하여 펩티드 농도를 고정시키고(1 μM) ATP 농도를 다양하게 한(20, 10, 5 및 2.5 μM) 용액을 만들었다. Akt3 키나제(Upstate, 약 2 μM 원액)를 CRP에 연속적으로 희석하여 2x 농축 키나제 용액 (20, 10, 5, 및 2.5 nM)을 만들었다.
2x 기질/ATP 용액 각각의 10 ㎕를 10 ㎕의 CRB 단독 또는 10 ㎕의 2x Akt3 키나제 용액 농도 (최종 분석 농도: 1.25 내지 1O nM Akt3, 1.25 내지 10 μM ATP, 500 nM 크로스타이드) 각각을 조합하여 실온에서 1 시간 및 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 대조군으로서, 일부 반응을 5 μM 스타우로스포린으로 15분 동안 인큐베이션하였다.
처음 15 ㎕의 AlphaScreenTM 스트렙타비딘 공여체 (0.1 ㎍/㎕)의 혼합물을 첨가하고 최종 2 시간의 인큐베이션 기간 후 3x 농축 IMAPTM 결합 완충액 중의 15 ㎕ Fe3 + 복합체 수용체 (0.2 ㎍/㎕) 비드를 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 각 조건의 발광수를 Packard Fusion Alpha에서 판독하였고 도 3 내지 6에 나타냈다.
토의
상기 결과는 3가 금속 이온 (M3 +) 치환된 AlphaScreenTM 수용체 비드가 키나제 분석을 빠르게 최적화하고 검증하기 위한 강력하고 간단한 방법일 수 있다는 것을 분명하게 나타낸다. M3 + 치환된 비드는 약 20의 S/B 비율의 초기 실험에서 용이하게 만들었고 크로스타이드 인산화가 성공적으로 검출되었다.
실시예 2: 1- 프로필아미노 -4- 아세타토 -1,4,7- 트리아자사이클로노난을 통하여 3가 금속 이온을 AlphaScreen TM 수용체 비드에 직접 결합시키는 방법
상기 방법 2에서 NTA를 통한 결합에 대하여 설명한 것과 동일한 방식으로 1-프로필아미노-4-아세타토-1,4,7-트리아자사이클로노난 또는 다른 N-함유 헤테로사이클을 통하여 3가 금속 이온을 AlphaScreenTM 수용체 비드에 결합시킬 수 있다. 간단히 말하면, 원 AlphaScreenTM 알데히드 수용체 비드를 완충된 1-프로필아미노-4-아세타토-1,4,7-트리아자사이클로노난, Tween-20 및 NaCNBH4 (시아노보로수소화나트륨) 용액과 조합할 수 있다. 반응을 37℃ 암실에서 48 내지 60 시간 동안 교반하며 인큐베이션한 후, 37℃ 암실에서 1 시간 동안 다시 인큐베이션 하기 전에 1 M Tris-HCl, pH 7.5를 첨가하여 차단하였다. 그 다음 비드를 침전시켜 상청액을 가만히 따르고, 침전된 비드를 0.1M Tris-HCl, pH 8에 재현탁하였다. 비드를 1.5 mM NaOH에 준비된 100 mM M3 + 용액(예를 들면, FeCl3, GaCl3, 또는 GaNO3)에 재현탁하고 37℃ 암실에서 1 시간 동안 인큐베이션하기 전에, 이 침전과 재현탁 과정을 2회 반복하였다. 그 다음 최종적으로 수용체 비드 보관 완충액(25 mM HEPES/100 mM NaCl, pH 7.4)에 재현탁하기 전에 비드를 0.1 M Tris-HCl, pH 8에서 몇 번 침전 및 재현탁하여 세척하였다.
실시예 3: 1- 프로필아미노 -4- 아세타토 -1,4,7- 트리아자사이클로노난
1-프로필아미노-4-아세타토-1,4,7-트리아자사이클로노난을 어떤 적합한 기술 에 의하여 획득하거나 제조할 수 있으며, 예를 들면 모든 목적을 위하여 전부 본원에 참고문헌으로 포함된 문헌(A. Warden, B. Graham, M. T. W. Hearn, L. Spiccia Org. Letters, 2001, 3, 2855-2858 (및 관련 보충 정보)에서 확인된 과정의 하기 변형에 따라서 합성하였다. 1,4,7,-트리아자사이클로노난 Tris HCl (2.0 g)을 물(12 mL)에 용해시켰다. 수산화나트륨(1.3 g)을 할당 방식으로 첨가하였고 생성된 용액을 1 시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 진공 속에서 흰 반죽이 될 때까지 농축하고, 이것을 톨루엔으로부터 농축함으로써 수회 더 건조시켰다. 결과의 잔여물에 톨루엔을 첨가하고 결과의 현탁액을 수 분 동안 초음파처리한 후 가만히 따라서 흰 고체를 제거하였다. 디메틸포름아미드 디메틸 아세테이트를 톨루엔 용액에 첨가하고 혼합물을 4 시간 동안 역류기에서 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 약간 노란색 오일이 나올 때까지 농축하였다. 이 오일을 아세토니트릴(5 mL)에 취하고 N-(3-브로모프로필)프탈이미드를 첨가하여 짙은 노란색 용액을 만들었다. 이 용액을 밤새 교반하여 흰색 침전물을 만들고, 이것을 여과하여 수집하고, 아세토니틀릴 및 에테르로 세척하여(추가 고체를 여과물에서 회수하였다) 2.2 g(이론치의 67%)의 1-(N-(3-프로필)프탈이미도)-1,4,7-트리아자사이클로노난 오르토아미디늄 브로마이드를 산출하였다. LC/MS Rt = 1.4 분, m/z = 327. 1-(N-(3-프로필)프탈이미도)-1,4,7-트리아자사이클로노난 오르도아미디늄 브로마이드 (870 mg)을 물(10 mL)에 용해하고 밤새 역류기에서 가열한 후 진공 속에서 농축시켰다. 잔류수를 톨루엔으로 공동-증발시킴으로써 제거하여 점성의 노란색 오일을 만들어, 이것을 즉시 아세토니트릴에 취하였다. 5분 동안 초음파 처리 후, 탄산나 트륨(2 g) 및 에틸 브로모아세테이트(0.29 mL)를 첨가하고 결과 혼합물을 2일 동안 역류기에서 가열하였다. 실온까지 냉각시킨 후, 고체를 여과하여 제거하고 여과물을 진공 속에서 노란색 오일이 될 때까지 농축시켰다. 오일을 물에서 취하여 클로로포름으로 추출하였다. 혼합된 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고 농축하여 499 g의 담황색 오일을 산출하였다. 이 오일을 5 M HCl(11 mL)에 용해시키고 93℃에서 20 시간 동안 가열하였다. 용액을 실온까지 냉각시킨 후 밤새 냉장고에 넣어 흰색 침전물이 형성되게 하였다. 고체를 여과하여 제거하고 여과물을 유성 잔류물로 농축시켰고, 이를 히드로브롬산(4 mL) 및 아세트산(4 mL)에 용해시켰다. 두 층이 관찰될 때까지 에테르를 첨가하고 혼합물을 냉장고에 3일 동안 보관하였다. 결과의 흰색 고체를 질소 덮개 하에 여과하여 수집하고 물로 세척하였다. 고체를 진공 속에서 더 건조시켜 300 mg의 표제 화합물을 산출하였다. LC/MS Rt =0.3 분 m/z = 245. 공개된 데이터와 일치된 NMR (1H, 300 MHz).
대안적 구체예
전술한 바와 같이, 본 발명은 단백질 키나제 분석과 관련하여 본원에 주로 설명되었지만, 어떤 인산화 또는 탈인산화 반응 효소에도 넓게 적용가능하다. 지질 키나제, 포스파타제 및 포스포디에스테라제를 포함한 다른 유형의 효소의 분석에서 본 발명의 조성물 및 과정을 대안적으로 사용할 수 있다.
PI3K와 같은 지질 키나제의 경우, 생리학적 반응은 PI-4,5-P2를 PI-3,4,5-P로 만드는 것이다. PI(포스파티딜이노시톨) 그 자체 또한 기질로 사용될 수 있다. PI 또는 PIP2가 인산화되면, 비드는 인산의 첨가로 인하여 증가된 신호를 나타낸 다.
포스파타제 및 포스포디에스테라제의 경우, 포스파타제 및 포스포디에스테라제가 인산기를 제거하기 때문에 분석은 키나제 분석과 반대로 수행될 것이며, 예를 들면 포스파타제 및 포스포디에스테라제 억제제는 대조군에 비해서 높은 화학발광 신호를 발생시킬 것이다.
결론
본 발명은 일부 바람직한 구체예의 면에서 설명되었지만, 상기에 제시된 구체예에 한정되어서는 안된다. 상기 설명된 바람직한 구체예에 많은 변형이 채용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 하기 청구범위와 관련하여 넓게 해석되어야 한다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 모든 목적을 위하여 전부 본원에 참고문헌으로 포함된다.

Claims (27)

  1. 감광제를 포함한 공여체 입자;
    감광제가 활성화되고 공여체와 수용체 입자가 밀접하게 근접해 있을 때 발광 신호를 발생시키는 특성이 있는 화학발광 화합물을 포함한 수용체 입자; 및
    공여체 또는 수용체 입자 중 하나의 표면에 복합체를 이룬 3가 금속 이온
    을 포함한 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 활성화된 감광제는 광 공급원에 의한 여기시 주변 산소를 활성 산소로 변환시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 광 공급원은 레이저인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 감광제는 엔도페록시드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 2 항에 있어서, 화학발광 화합물은 티옥센 유도체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 입자는 수용성 매질에 분산되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 밀접한 근접성은 활성 산소가 수용액에서 그 수명 동안 이동한 거리 이하인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 거리는 200 nm 이하인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서, 입자는 폴리머 비드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서, 3가 금속 이온은 수용체 입자 표면에 복합체를 이룬 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서, 3가 금속 이온은 공여체 입자 표면에 복합체를 이룬 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 1 항에 있어서, 3가 금속 이온은 N-함유 링커를 통하여 공여체 또는 수용체 입자 중 하나의 표면에 복합체를 이룬 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 3가 금속 이온은 카르복시메틸-리신 및 1-프로필아미노-4-아세토-1,4,7-트리아자사이클로노난 링커 중 하나를 통하여 공여체 또는 수용체 입자 중 하나의 표면에 복합체를 이룬 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 1 항에 있어서, 3가 금속 이온은 Ga3 +, Fe3 +, Al3 +, In3 +, Ru3 +, Sc3 +, 및 Y3 +로 구성된 군 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 감광제를 포함한 공여체 입자;
    감광제가 활성화되고 공여체와 수용체 입자가 밀접하게 근접해 있을 때 발광 신호를 발생시키는 특성이 있는 화학발광 화합물을 포함한 수용체 입자; 및
    1-프로필아미노-4-아세토-1,4,7-트리아자사이클로노난 링커를 통하여 수용체 입자의 표면에 복합체를 이루는 3가 금속 이온
    을 포함한 조성물.
  16. 분석에 사용하기 위한 키트로서, 상기 키트는 패키지된 조합으로 분석을 수행하기 위한 시약을 포함하고, 상기 시약은
    감광제를 포함한 공여체 입자;
    감광제가 활성화되고 공여체와 수용체 입자가 밀접하게 근접해 있을 때 발광 신호를 발생시키는 특성이 있는 화학발광 화합물을 포함한 수용체 입자; 및
    공여체 또는 수용체 입자의 표면에 복합체를 이룬 3가 금속 이온
    을 포함한 것을 특징으로 하는 키트.
  17. 제 16 항에 있어서, 3가 금속 이온은 N-함유 링커를 통하여 공여체 또는 수용체 입자 중 하나의 표면에 복합체를 이룬 것을 특징으로 하는 키트.
  18. 제 17 항에 있어서, 3가 금속 이온은 카르복시메틸-리신 및 1-프로필아미노-4-아세토-1,4,7-트리아자사이클로노난 링커 중 하나를 통하여 공여체 또는 수용체 입자 중 하나의 표면에 복합체를 이룬 것을 특징으로 하는 키트.
  19. 제 18 항에 있어서, 3가 금속 이온은 1-프로필아미노-4-아세토-1,4,7-트리아자사이클로노난 링커를 통하여 수용체 입자의 표면에 복합체를 이룬 것을 특징으로 하는 키트.
  20. 제 16 항에 있어서, 3가 금속 매개 균질 발광 근접 분석을 수행하기 위한 설명서를 더 포함한 것을 특징으로 하는 키트.
  21. 키나제 억제성 화합물을 검출하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
    감광제 및 키나제에 의하여 인산화할 수 있는 표면 결합된 인산화되지 않은 생체분자를 포함한 공여체 입자, 및
    입자 표면에 복합체를 이룬 3가 금속 이온 및 감광제가 활성화되고 공여체와 수용체 입자가 밀접하게 근접해 있을 때 발광 신호를 발생시키는 특성이 있는 화학발광 화합물을 포함한 수용체 입자;
    를 포함한 조성물을 제공하는 단계;
    조성물에 후보 키나제 억제성 화합물을 도입하는 단계;
    조성물에 키나제를 도입하는 단계;
    후보 억제성 화합물이 결핍된 대조군 조성물로부터 방출된 화학방출에 비해서 감소된 화학방출로 관찰된 후보 억제성 화합물에 의하여 키나제의 억제를 검출함으로써 후보 키나제 억제성 화합물이 키나제 억제성 화합물인 것을 결정하는 단계
    를 포함한 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 3가 금속 이온은 N-함유 링커를 통하여 수용체 입자의 표면에 복합체를 이룬 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 3가 금속 이온은 카르복시메틸-리신 및 1-프로필아미노-4-아세토-1,4,7-트리아자사이클로노난 링커를 통하여 수용체 입자의 표면에 복합체를 이룬 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 3가 금속 이온은 1-프로필아미노-4-아세토-1,4,7-트리아자사이클로노난 링커를 통하여 수용체 입자의 표면에 복합체를 이룬 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 21 항에 있어서, 후보 키나제 억제제 화합물을 키나제의 도입 전에 도입시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 21 항에 있어서, 후보 키나제 억제제 화합물과 키나제를 동시에 도입시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 포스파타제 또는 포스포디에스테라제 억제성 화합물을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
    감광제 및 포스파타제 또는 포스포디에스테라제에 의하여 탈인산화할 수 있는 표면 결합된 인산화된 생체분자를 포함한 공여체 입자, 및
    입자 표면에 복합체를 이룬 3가 금속 이온 및 감광제가 활성화되고 공여체와 수용체 입자가 밀접하게 근접해 있을 때 발광 신호를 발생시키는 특성이 있는 화학발광 화합물을 포함한 수용체 입자
    를 포함한 조성물을 제공하는 단계;
    조성물에 포스파타제 또는 포스포디에스테라제를 도입하는 단계;
    조성물에 후보 포스파타제 또는 포스포디에스테라제 억제성 화합물을 도입하는 단계; 및
    후보 억제성 화합물이 결핍된 대조군 조성물로부터 방출된 화학방출에 비해서 증가된 화학방출로 관찰된 후보 억제성 화합물에 의하여 포스파타제 또는 포스포디에스테라제의 억제를 검출함으로써 후보 포스파타제 또는 포스포디에스테라제 억제성 화합물이 포스파타제 또는 포스포디에스테라제 억제성 화합물인 것을 결정하는 단계
    를 포함한 것을 특징으로 하는 방법.
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