KR20060095114A

KR20060095114A - 인간 리포칼린 2를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용약학적 조성물, 이를 이용한 암 전이 억제 방법

Info

Publication number: KR20060095114A
Application number: KR1020050016514A
Authority: KR
Inventors: 이은경; 이호정; 이공주; 김장성; 박두홍; 윤엽
Original assignee: 재단법인 목암생명공학연구소
Priority date: 2005-02-28
Filing date: 2005-02-28
Publication date: 2006-08-31
Also published as: US20100256073A1; US20090311224A1; KR100681763B1; WO2006091035A1

Abstract

본 발명은 암 전이 억제용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 리포칼린 2 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터 또는 상기 발현벡터로 형질도입된 세포를 유효성분으로 함유하는 신규한 암전이 억제용 약학적 조성물, 이를 이용한 암전이 억제 방법, 암전이 가능성 예측키트 및 상기 키트를 이용한 암 전이 위험군의 선별 방법에 관한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 암 전이를 특이적으로 억제함으로써 항암치료 효과를 혁신적으로 향상시킬 수 있으며, 본 발명의 예측키트 및 상기 키트를 이용한 암전이 위험군 선별방법은 암 종양조직 또는 체액에서 리포칼린 2 발현을 조사하여 전이위험이 높은 위험군을 선별할 수 있음으로써, 실제 임상에서의 암환자의 관리에 있어서, 유용하게 사용될 수 있다.

리포칼린 2, NGAL, 예후인자, 전이억제제.

Description

인간 리포칼린 2를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물, 이를 이용한 암 전이 억제 방법{A therapeutic agent comprising lipocalin 2 against cancer metastasis, and methods of early diagnosis and inhibition of cancer metastasis using lipocalin 2}

도 1은 서로 다른 전이능을 보이는 대장암 세포주에서 리포칼린 2 유전자의 발현을 노던 블롯(northern blot) 분석으로 나타낸 사진이다.

도 2는 본 발명의 pLenti-NGAL 및 pLenti-L6H의 개열지도이다.

도 3a는 확립된 리포칼린 2 과발현 대장암 세포주에서 리포칼린 2 유전자의 과발현을 노던 블롯 분석으로 나타낸 사진이고, 도 3b는 리포칼린 2의 과발현이 확인된 대장암 세포주들의 배양액을 농축하여 단백질 수준에서의 과발현을 웨스턴 블롯(western blot) 분석으로 나타낸 사진이다.

도 4는 확립된 간암세포주들(a: Chang liver, b: SK-Hep-1, c: Huh-7)에서 리포칼린 2 유전자의 과발현을 노던 블롯 분석으로 나타낸 사진이다.

도 5는 리포칼린 2의 대량 발현을 위한 발현벡터 pNGAL6H의 개열지도이다.

도 6은 대장균에서 리포칼린 2를 발현, 정제하는 과정을 폴리아크릴아마이드 겔 사진으로 나타낸 사진이다.

도 7a는 사람의 대장암 세포주인 KM12SM 세포주에서 리포칼린 2 유전자를 세포내 발현할 경우의 침윤능을 조사하여 나타낸 그래프이며, 도 7b는 사람의 대장암 세포주인 KM12SM 세포주에 리포칼린 2의 재조합 단백질을 처리한 경우의 침윤능을 나타낸 그래프이다.

도 7c 내지 7e는 간암세포주인 Chang liver(도 7c), Huh-7(도 7d), SK-Hep-1(도 7e)에서 리포칼린 2 단백질을 발현할 경우 침윤능을 조사하여 나타낸 그래프이다.

도 8은 Chang liver, SK-Hep-1에서 리포칼린 2에 의해 MMP-2 유전자의 발현이 감소됨을 노던 블롯 분석으로 나타낸 사진이다.

도 9a는 10% 우태아혈청(FBS)을 포함하는 배지조건에서, 도 9b는 무혈청 배지조건에서 재조합 리포칼린 2 단백질을 간암세포 Chang liver에 처리한 후 MMP-2 유전자의 발현을 RT-PCR 방법으로 확인한 아가로즈 겔 사진이다.

도 10은 리포칼린 2의 과발현이 대장암 세포의 생장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 세포증식시험으로 세포 수를 계수하여 나타낸 그래프이다.

도 11a는 대조군 및 리포칼린 2 과발현 대장암 세포를 마우스의 피하에 이식한 후 세포성장을 관찰하여 나타낸 그래프이다.

도 11b는 마우스의 피하에 자란 대장암에서의 리포칼린 2의 발현을 조사하기 위하여 고형암 조직들로부터 단백질을 추출하여 웨스턴 블롯 분석으로 나타낸 사진이다.

도 12a는 대조군(KM12SM, SM-Mock) 및 리포칼린 2 유전자 과발현하는 대장암 세포주(SM-NGAL)를 생쥐의 비장에 주입하여 간으로의 전이를 유도한 후 21일 째에 적출한 간을 나타낸 사진이고, 도 12b는 도 12a의 간 표면에 존재하는 대장암 간전이암을 계수한 값을 나타낸 그래프이다.

도 13은 재조합 리포칼린2 단백질에 의한 대장암 세포의 간전이 억제효능을 간 표면의 대장암 콜로니의 개수를 계수하여 그래프로 나타낸 결과이다.

본 발명은 암 전이 억제용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 인간 리포칼린 2(lipocalin 2)를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물, 이를 이용한 암 전이 진단 및 전이 억제 방법에 관한 것이다.

대부분의 암환자는 현존하는 여러 치료방법(수술, 항암제, 방사선처리)을 이용하여도 암전이(metastasis)의 발생결과로서 주로 사망하게 된다. 암 전이가 일어나기 전에 1차 종양이 관찰된 환자의 대부분은 치료 가능성이 상당히 높지만 이런 환자는 쉽게 발견하기 어려우며, 대부분의 환자에서는 1차 종양이 관찰된 시점에서 이미 암의 전이가 발견된다. 대부분의 암의 전이는 다발성, 전신성이며, 그 존재 여부의 판정도 어렵기 때문에 현재의 암 치료방법으로는 치료효능이 만족스럽지 못하다. 하지만 암 전이는 1차 종양을 구성하는 암세포의 극히 일부분만이 전 이과정의 여러 단계를 성공적으로 마치고 전이암으로 되는 비효율적인 과정이다. 따라서, 전이 과정을 잘 이해하고, 임상적, 생물학적으로 유용한 치료표적을 발굴하고 이를 효과적으로 억제할 수 있는 방법을 개발하면 암 전이에 의한 사망을 효과적으로 제어할 수 있는 유용한 치료법의 개발이 가능하게 된다.

암의 전이는 1차 종양에서의 신생혈관 형성을 수반한 성장, 1차 종양 내부로부터 혈관 및 림프관으로의 전이성 암세포의 침윤, 혈관 내에서의 암세포의 생존, 원격지로의 이동 및 침윤, 그리고 새로운 미세전이암이 신생혈관의 형성을 통해 전이암으로 성장하는 과정을 포함하는 복잡한 과정이다(Chambers et al., Nat. Rev. Cancer, 2: 563-572, 2002). 이론적으로, 이들 중 어느 단계를 억제하여도 전이의 성공적인 차단이 가능하다.

원발성 종양을 갖는 모든 암환자에서 원격전이가 발견되지는 않는다. 원발종양이 원격전이에 필요하지만 충분조건은 아니라는 사실은, 특정한 유전자(군)의 기능적 손실이 전이억제 효능을 나타낼 수 있을 수 있는 가능성을 보여준다. 이러한 가설에 근거하여 현재까지 최소 11종 이상의 전이억제유전자가 발견되었다(Kauffman et al., J. Urol., 169: 1122-1133, 2003; Shevde et al., Cancer Lett., 198: 1-20, 2003; Berger et al., Anticancer Drugs, 15: 559-568, 2004). 유전자의 기능적 손실이 종양의 성장을 유도하는 암억제유전자(tumor suppressor gene)와는 다르게 전이억제유전자(metastasis suppressor gene)는 원발종양의 성장에는 영향을 미치지 않으며 원격전이만 선택적으로 억제할 수 있는 유전자로 정의된다. 이러한 전이억제유전자의 발견은 악성(malignant) 종양 조직과 비활동성 (indolent) 조직을 병리학적으로 구분하고, 임상에서 전이위험이 높은 위험그룹을 선택적으로 구별하여 암환자의 향후 맞춤치료 전략을 수립하는데 유용하게 이용될 수 있다.

현재까지 발견된 전이억제유전자들이 어떠한 작용기전에 의해 암전이를 억제하는지에 대해서는 많은 부분이 알려져 있지 않다. 여러 연구 결과에 의하면, 원발암에서 박리되어 성공적으로 원격지의 조직으로 침윤해 들어온 암세포가 종종 원격지에서 증식하는데 실패하는 경우가 보고되었다(Chambers et al., Nat. Rev. Cancer, 2: 563-572, 2002; Yoshida et al., J. Natl. Cancer Inst., 92: 1717-1730, 2000). 이러한 연구 결과들은 혈관으로부터 원격지의 조직 내로 침윤한 암세포가 증식하는 과정(전이증식; metastatic colonization)에서 일종의 증식조절(post-extravasation growth control)을 받으며, 이러한 조절단계가 전이과정을 완성하는데 결정적인 속도결정단계(rate-limiting step)로 작용함을 개시한다. 일부 전이억제단백질들에 의해 영향 받는 신호전달체계가 보고되기는 하였지만(Shevde et al., Cancer Lett., 198: 1-20, 2003; Kauffman et al., J. Urol., 169: 1122-1133, 2003), 대다수 전이억제단백질들이 어떠한 신호전달체계를 통하여 전이증식과정을 조절하는지에 대해서는 많은 부분이 밝혀지지 않았다. 암전이는 다양한 유전적 또는 후생유전적인 변이가 결집된 결과로 발생하는 매우 복잡한 과정이며, 다양한 세포 내 신호전달체계가 단독 또는 서로 영향을 받으며 전이의 각 단계를 조절할 것으로 생각된다. 이러한 전이와 연관된 각 신호전달경로에 속한 특정 유전자의 발현 증가 혹은 감소는 아직 규명되지 않은 신호전달 경로에 상당한 영향을 미칠 수 있기 때문에 필연적으로 예상보다 더 큰 변화를 수반하게 된다. 따라서 특정 전이억제유전자에 의한 전이억제효능은 그 유전자의 발현 증가 또는 감소에 의한 직접적인 결과로 이해하기 보다는, 그 유전자의 발현에 의해 조절되는 신호전달 경로의 변화에 기인한 결과로 이해해야 한다( Griend et al., J. Natl. Cancer Inst., 96: 344-345, 2004). 암세포(예를 들어 대장암세포)가 전이되는 특정 기관 및 조직(예를 들어 간)에서 증식하는 능력은 상피세포성장인자(epidermal growth factor, EGF)와 같은 성장인자 수용체들의 발현 등을 포함하는 암세포의 특정 유전형질과 그 기관 및 조직에서 상기 수용체와 연관된 특정 성장인자(예를 들어 형질전환성장인자-알파:　transforming growth factor-alpha)의 발현과 같은 조직의 특정 미세환경, 이들 간의 상호작용에 의해 결정된다(Chambers et al., Nat. Rev. Cancer, 2: 563-572, 2002; Radinsky, Cancer Metastasis Rev., 14: 323-338, 1995; Fidler, Natl. Cancer Inst., 87: 1588-1592, 1995; Radinsky, Eur. J. Cancer, 31A: 1091-1095, 1995; Radinsky and Ellis, Surg. Oncol. Clin. N. Am., 5: 215-229, 1996). 따라서 암세포의 원격지로의 전이는 암세포와 전이지에서의 미세환경의 서로 다른 조합에 따라 상이한 결과를 보일 수 있는 복잡한 과정이므로, 특정 모델 및 조직에서 관찰된 전이관련 유전자 및 그에 의한 신호전달 경로의 변화에 기인한 전이억제 효능을 일반화 하는 것은 불가능하다. 일례로, 전이억제유전자의 하나인 MAPK 카이네이즈 4(mitogen-activated protein kinase kinase 4,MKK4)에 의해 매개되어 활성화된 c-Jun N-터미널 카이네이즈(c-Jun N-terminal kinase(JNK)/p38) 신호전달 경로는 전립선암과 난소암의 경우 전이억제 효능과 밀 접한 관련을 보이는 반면에(Yamada et al., Cancer Res., 62: 6717-6723, 2002; Kim et al., Cancer Res., 61: 2833-2837, 2001), MKK4에 의한 동일한 신호전달 경로의 활성화는 비소세포폐암(non-small cell lung carcinoma)의 경우에는 종양이 악성으로 진행하는데 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려졌다(Xiao et al., Cancer Res., 60: 400-408, 2000). 또한, 결합조직성장인자(connective tissue growth factor,CTGF)의 발현 증가는 유방암, 췌장암, 피부암의 경우에 환자의 생존율(disease-free survival)의 감소와 연관된 반면에 폐암의 전이를 억제하는 기능이 존재하는 것으로 알려졌다(Chang et al., J. Natl. Cancer Inst., 96: 364-375, 2004; Xie et al., Cancer Res., 61: 8917-8923, 2001; Wenger et al., Oncogene, 18: 1073-1080, 1999; Kubo et al., Br. J. Dermatol., 139: 192-197, 1998). 그러므로, 특정 전이억제유전자 및 그에 의해 매개되는 신호전달 경로에 의한 전이억제 효능은 각각의 암종 및 전이지에 따라 개별적으로 결정되어야 할 것으로 보인다.

리포칼린(lipocalin)은 진화적으로 잘 보존되어 있는 단백질군으로, 이들 단백질들은 서로 간에 아미노산 서열의 낮은 상동성에도 불구하고, 8 개의 역평행 베타 시트(anti-parallel beta-sheet)가 컵 모양의 리간드와의 결합 공간을 형성하는 공통된 단백질 3차구조가 잘 보존되어 있는 특징이 있다. 리포칼린 단백질들은 다양한 소수성 분자들과의 결합, 세포표면의 수용체와의 결합 및 수용성 거대분자와의 복합체 형성 등의 공통된 특성을 보인다. 리포칼린의 주 기능은 작은 소수성 리간드의 운반이라고 알려져 있지만, 여러 연구에 의하면 레티놀(retinol) 운반, 착색(coloration), 후각(olfaction), 페로몬 운반, 프로스타글란딘 생합성 등의 다양한 기능이 보고되었다. 또한, 리포칼린은 면역반응을 조절하고 세포의 항상성(homeostasis)을 조절하는 기능이 존재함이 알려졌다 (Flower, D. R., Biochem. J., 318: 1-14, 1996).

리포칼린 2(lipocalin 2 (LCN2) 또는 호중구 젤라틴분해효소 관련 리포칼린; neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL)이라고도 불림)는 약 25 kDa의 당단백질로 호중구(neutrophil)의 분비과립에서 처음 분리되었다 (Kjeldsen et al., J. Biol. Chem., 268: 10425-10432, 1993; Triebel et al., FEBS Lett., 314: 386-388, 1992). 지방산 및 철의 운반 (Chu et al., J. Pept. Res., 52: 390-397, 1998; Yang et al., Mol. Cell, 10: 1045-1056, 2002), 호중구 및 다른 과립구 세포에서 세포사멸(apoptosis)의 유도(Devireddy et al., Science, 293: 829-834, 2001), 카테콜레이트형 철 시데로포어(ferric siderophore)와 결합하여 철(iron)을 격리함으로써 세균의 성장을 저해하는 등(Goetz et al., Mol. Cell, 10: 1033-1043, 2002; Flo et al., Nature, 432: 917-921, 2004)의 다양한 리포칼린 2의 효능이 보고되었다. 그 이외에, 미생물에 노출될 가능성이 높은 조직에서 리포칼린 2의 발현이 증가하고(Cowland and Borregaard, Genomics, 45: 17-23, 1997; Friedl et al., Histochem. J., 31: 433-441, 1999), 세균의 지질다당류(lipopolysaccharide)에 의한 생쥐 대식세포(macrophage)에서의 리포칼린 2 유도(Meheus et al., J. Immunol., 151: 1535-1547, 1993), FMLP(N-FORMYL-Met-Leu-Phe) 및 혈소판활성인자(platelet activating factor), 류코트리엔 B4(leukotrien B4) 등의 다른 호지성(lipophilic) 염증유도인자와의 결합(Bratt et al., Biochim. Biophys. Acta, 1472: 262-269, 1999), 염증반응을 보이는 대장 상피세포에서의 리포칼린 2의 활발한 생산(Nielsen et al., Gut, 38: 414-420, 1996) 등의 결과에 근거하여 리포칼린 2는 염증반응의 매개인자로 알려졌다.

암세포에서 리포칼린 2에 대한 관심은 세포증식이 활발한 세포에서 리포칼린 2의 발현이 증가되어 있다는 사실에 집중되어 왔다. 생쥐의 리포칼린 2 유사체인 24p3는 생쥐 신장세포가 SV40나 폴리오마 바이러스 감염에 의해 휴지상태에서 증식기로 전환될 때 급격히 발현이 증가되며(Hraba-Renevey et al., Oncogene, 4: 601-608, 1989), 생쥐의 섬유아세포가 혈청, 섬유아세포 성장인자 2, 포르볼 에스터(phorbol ester) 등의 세포성장인자에 의해 발현이 유도가 된다는 사실(Liu Q. and Nilsen-Hamilton M., J. Biol. Chem., 270: 22565-22570, 1995)은 리포칼린 2가 세포의 증식 조절에 연관되었을 가능성을 시사한다. 이러한 가설은 상피세포의 교체가 빈번할 것으로 추정되는 염증반응을 보이는 대장 상피세포나 다양한 암에서 리포칼린 2의 발현이 높다는 사실에 의해 뒷받침된다(Missiaglia et al., Int. J. Cancer, 112: 100-112, 2004; Santin et al., Int. J. Cancer, 112: 14-25, 2004; Nielsen et al., Gut, 38: 414-420, 1996; Bartsch et al., FEBS Lett., 357: 255-259, 1995; Furutani et al., Cancer Lett., 122: 209-214, 1998). 유방암의 경우, 리포칼린 2의 발현과 DNA 복제를 보이는 세포주기(cell cycle)의 S기 세포분획 사이에 높은 연관을 보였다(Stoesz et al., Int. J. Cancer, 79: 565-572, 1998). 하지만, 상기의 세포의 증식과 리포칼린 2의 발현 사이의 연관은 리포칼린 2에 의 해 유도된 결과라기보다 일치되어 관찰된 결과일 뿐이며, 현재까지 리포칼린 2가 암세포의 증식에 직접적인 영향을 미친다는 실험결과는 보고되지 않았다.

인간에서 리포칼린 2는 충수염(appendicitis), 염증성 장질환, 대장암 등의 다양한 염증반응이 존재하는 대장상피세포에서 발견되지만 정상 대장상피에서는 거의 발견되지 않는다. Nielson 등에 의해 보고된 흥미로운 사실은, 대장암의 경우 리포칼린 2의 발현은 대장강 쪽의 상피세포에서만 주로 존재하며, 리포칼린 2를 발현하는 원발성 대장암 환자의 림프절에 전이된 전이암에서는 리포칼린 2의 발현이 존재하지 않는다는 점이다(Nielsen et al., Gut, 38: 414-420, 1996). 이 사실에 근거하여 리포칼린 2의 발현은 종양세포의 고유형질이 아니라 종양에 수반된 염증반응의 결과로서 생긴 것으로 추측되고 있다. 그러나, 리포칼린 2의 암의 전이억제효능과 관련해서 현재까지 보고된 직접적인 연구결과는 없다.

이에 본 발명자 등은 리포칼린 2에 의한 종양의 성장과 전이에 대한 영향을 명확히 이해하기 위하여, 인간 대장암 세포주인 KM12SM 및 간암 세포주인 Chang liver, Huh-7, SK-Hep-1에 리포칼린 2 유전자를 생체 외(ex vivo) 조건에서 전달하고 이 세포주를 이용한 동물실험을 통해서 이들 유전자의 전달이 종양의 성장 및 전이에 미치는 영향을 분석한 결과, 리포칼린 2 유전자의 도입은 종양세포의 성장에는 영향을 미치지는 않으나 종양의 전이는 효과적으로 억제됨을 확인하였다. 또한 본 발명에서는 재조합 리포칼린2 단백질을 외부에서 전신성으로 투여할 경우에도 대장암 세포의 간 전이를 효과적으로 제어할 수 있음을 보임으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주된 목적은 암 전이 억제용 약학적 조성물 및 이를 이용한 암 전이 억제방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 암 전이 마커를 발굴하여, 환자의 암전이 가능성을 예측할 수 있는 예측 키트 및 예측방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 암전이 억제 단백질인 인간 리포칼린 2를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 리포칼린 2를 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자치료용 발현벡터를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 리포칼린 2 또는 이를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물, 그를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 유전자 치료용 발현벡터를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 전이 억제방법을 제공한다.

더 나아가, 본 발명은 상기 리포칼린 2 단백질에 특이적인 항체 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 프라이머를 포함하는 암세포 전이능 예측 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 암세포 전이능 예측 키트를 이용한 암전이 위험군을 선별하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 리포칼린 2 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터 또는 상기 발현벡터가 형질도입된 포유동물 세포를 유효성분으로 함유하는 암전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다. 이때, 리포칼린 2 단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 서열번호 2로 기재되는 전체 리포칼린 2 단백질 아미노산 서열 또는 서열번호 11로 기재되는 상기 전체 리포칼린 2 단백질에서 분비서열(서열번호 2의 1 내지 20번째 아미노산)을 제외한 성숙된 형태(mature form)의 인간 리포칼린 2 단백질인 것이 바람직하고, 서열번호 11로 기재되는 성숙한 형태(mature form)의 인간 리포칼린 2 단백질인 것이 더욱 바람직하다. 상기 유전자는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나 상기 서열번호 2 또는 서열번호 11의 인간 리포칼린 2 단백질을 코딩하는 서열번호 1로 기재되는 유전자인 것이 바람직하고, 상기 발현벡터는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터인 것이 바람직하고, 상기 바이러스성 벡터는 아데노 바이러스 벡터, 렌티바이러스를 포함하는 레트로바이러스 벡터, 아데노-부속 바이러스 벡터 또는 헤르페스-심플렉스 바이러스 벡터인 것이 바람직하고, 렌티바이러스 벡터인 것이 더욱 바람직하고, 도 2의 pLenti-NGAL로 기재되는 렌티바이러스 벡터인 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 약학적 조성물은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 약학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함한다. 한편, 상기 암은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 대장암 또는 간암인 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물은 암환자의 암세포의 성장에는 영향을 미치지 않지만, 암세포의 전이만을 특이적으로 억제함으로써, 다른 항암제와 함께 사용함으로써 항암치료에 획기적인 진전을 가져올 수 있다.

또한, 본 발명은 리포칼린 2를 발현하는 유전자 치료용 발현벡터를 제공한다. 이때, 상기 발현벡터는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 아데노 바이러스 벡터, 렌티바이러스를 포함하는 레트로바이러스 벡터, 아데노-부속 바이러스 벡터 또는 헤르페스-심플렉스 바이러스 벡터인 것이 바람직하고, 렌티바이러스 벡터인 것이 더욱 바람직하며, 도 2의 pLenti-NGAL로 기재되는 렌티바이러스 벡터인 것이 가장 바람직하다. 또한, 본 발명은 상기 렌티 바이러스 벡터를 감염시켜 수득한 재조합 렌티바이러스를 제공한다.

한편, 본 발명은 상기 발현벡터 또는 재조합 렌티바이러스가 형질도입된 세포주를 제공한다. 이때 상기 세포주는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 정상 세포주 또는 암세포주인 것이 바람직하고, 상기 암세포주는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 암세포주는 KM12C, SW480, KM12SM, SW620, Chang liver, SK-Hep1 및 Huh7으로 구성된 그룹으로부터 선택되어지는 것이 바람직하다.

아울러, 본 발명은 본 발명의 암전이 억제용 약학적 조성물을 암환자에게 투 여하는 단계를 포함하는 암 전이 억제 방법을 제공한다. 이때, 상기 암은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 대장암 또는 간암인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 본 발명의 암전이 억제용 약학적 조성물 및 통상적인 항암제를 동시 또는 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는 신규한 암치료방법을 제공한다.

더 나아가, 본 발명은 리포칼린 2에 특이적인 항체 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 프라이머쌍을 포함하는 암 전이 가능성 예측 키트를 제공한다. 이때, 상기 항체는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 항체는 단클론성 항체인 것이 바람직하고, 인간화 단클론성 항체인 것이 더욱 바람직하다. 한편, 상기 프라이머쌍은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 서열번호 3 및 4로 기재되는 핵산인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 ⅰ) 암환자로부터 암표본을 수득하는 단계; ⅱ) 상기 암표본으로부터 박리 표본, 파쇄액 및 총 RNA로 선택되는 리포칼린 2 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 검출시료를 준비하는 단계; ⅲ) 상기 검출시료로부터 리포칼린 2 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA를 검출하는 단계; 및 iv) 리포칼린 2 단독 또는 다른 암전이 억제 유전자의 발현수준과 조합하여 발현량을 분석하는 단계를 포함하는 상기 암전이 가능성 예측 키트를 이용한 암전이 위험군을 선별하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 단계 ⅲ은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 인 시추 혼성화 (in situ hybridization), 면역조직화학적 염색(immunohistochemical staining), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴 블롯, 노던 블롯, RT-PCR 및 실시간 RT-PCR로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명하기로 한다.

대장암의 경우, 원발성 종양(primary tumor)에서 분리한 세포주인 KM12C 및 SW480에서 발현되는 리포칼린 2가 동일 세포주의 간전이 및 림프절 전이암에서 분리한 세포주인 각각 KM12SM 및 SW480에서는 감쇄된다는 사실로부터, 리포칼린 2가 대장암 세포의 전이를 억제할 수 있는 기능이 존재할 수 있다는 가설을 도출하였다. 이 가설을 증명하고자 본 발명자들은 전이능력(metastatic potential)이 높으면서도 낮은 리포칼린 2 발현을 보이는 KM12SM에 리포칼린 2 과발현을 유도하고, 그것이 KM12SM 세포주의 증식 및 간전이(liver metastasis)에 미치는 영향을 분석하였다.

상기 목적을 위해 CMV 프로모터의 조절 하에 리포칼린 2를 지속적으로 발현할 수 있도록 조작한 재조합 렌티바이러스 벡터(pLenti-NGAL)와 이를 포함하는 재조합 렌티바이러스를 제작한 후 KM12SM 세포주를 형질유도(transduction)하였다. 이때 재조합 바이러스는 렌티바이러스에 제한되지 않으나, 본 발명의 실시예에서는, 대조군 렌티바이러스 벡터 및 리포칼린 2를 발현하도록 제작한 pLenti-LGAL 벡터를 이용하여 제작한 세포주를 각각 SM-Mock 및 SM-NGAL 이라 명명하고 추후의 실 험에 이용하였다.

리포칼린 2가 세포의 증식에 중요한 역할을 할 것이라는 지금까지의 가설과는 달리, 리포칼린 2 과발현 세포주와 대조군 세포주 사이에는 시험관 내 조건에서 대장암 세포의 증식에 유의한 차이를 보이지 않았으며, 세포사멸을 유도하는 효과도 관찰되지 않았다. 또한, 실험동물의 피하에 이종이식한 후 종양의 성장을 관찰한 결과, 리포칼린 2의 과발현은 생체 내 조건에서 대장암의 성장에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.

반면에, 본 발명자들은 마트리겔 침윤 분석 방법(Matrigel invasion assay)을 통하여 리포칼린 2가 대장암 세포의 세포외 기질을 침윤하는 능력을 현저히 감소시킨다는 사실을 발견하였다. 암세포가 원격지로 전이하기 위해서는 원발종양에서부터 혈관 및 림프관으로 침윤할 수 있어야 하며, 혈관 및 림프관에서 원격지로 다시 침윤해 들어갈 수 있어야 하는데, 이 과정들은 원발종양과 혈관 및 림프관을 둘러싸는 기저막(basement membrane)을 분해하여야만 가능하다. 마트리겔은 기저막을 구성하는 성분과 유사한 세포외 기질(extracellular matrix) 성분으로 구성되어 있기 때문에 마트리겔을 침윤할 수 있는 능력은 전이능력을 나타내는 주요 지표로 활용될 수 있다. 따라서 리포칼린 2 과발현에 따른 대장암 세포의 침윤능력의 감소는 곧 전이능력의 감소로 이어질 수 있다. 이 가설을 증명하기 위하여, 리포칼린 2 과발현 대장암 세포주(SM-NGAL) 및 대조군 세포주를 면역결핍 생쥐의 비장에 주입하여 간으로의 전이를 실험적으로 유도하였다. 그 결과, 대조군 세포주에 비하여 리포칼린 2 과발현 대장암 세포주를 주입한 생쥐에서는 간전이가 현저히 감 소되었다. 이상의 결과에서 본 발명자들은 리포칼린 2가 대장암 세포의 증식에는 영향을 미치지 않으면서도 대장암 세포의 침윤(invasion) 능력을 감소시켜 대장암의 간 또는 림프절로의 전이를 억제하는 전이억제인자(metastasis suppressor)로서의 신규 기능이 존재함을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에서는 또한 간암 세포주를 대상으로 한 일련의 실험을 통해 리포칼린 2가 간암세포에서 기질 메탈로프로테아제-2(matrix metalloprotease-2)의 발현을 감소시켜 마트리겔에서 침윤능력을 저하시킨다는 사실을 발견하였으며, 이는 전이억제제로서의 리포칼린 2의 기능이 대장암의 경우에 국한되지 않으며, 다수의 암종에서 전이억제인자로 기능할 수 있음을 시사한다.

리포칼린 2를 발현하는 대장암 환자의 경우 원발암에서는 높은 수준으로 리포칼린 2의 발현이 관찰되지만 동일 환자의 간전이에서는 리포칼린 2의 발현이 관찰되지 않는다는 사실에 근거하여, 본 발명 이전에는 리포칼린 2의 발현은 대장 등의 상피세포가 염증반응에 접할 때만 수반되는 비유전성 표현형질로 인식되어 왔다. 하지만 염증반응이 없는 시험관 내 조건에서 연속적으로 계대배양한 세포주에서도 전이능력과 반비례하는 리포칼린 2의 발현수준을 유지한다는 사실은 리포칼린 2 발현이 안정적으로 유지되는 일종의 암세포의 유전형질(inherent phenotype)임을 시사한다. 어떠한 원인에 의해서 리포칼린 2의 발현이 전이암과 원발암에서 다르게 조절되는지에 대해서는 많은 부분이 밝혀져 있지 않다. 하지만 최근 연구에 의하면 대부분의 전이억제유전자(metastasis suppressor genes)의 경우 암억제유전자와는 다르게 유전자 상에 돌연변이를 수반하지 않으며, DNA 메틸화, 히스톤 단백질 의 아세틸화 등의 후생유전학적인(epigenetic) 변화에 의해 주로 조절된다는 보고가 있다. 췌장암의 경우 정상췌장세포에서는 리포칼린 2 유전자의 프로모터 부분에 과메틸화가 되어있는 반면, 리포칼린 2 발현이 높은 췌장암 세포에서는 프로모터 메틸화가 저해되어있다는 사실이 보고되었으며(Sato et al., Cancer Res., 63: 4158-4166, 2003), 이 결과는 대장암 및 간암의 경우에서도 리포칼린 2의 발현이 유사한 방법으로 조절될 수 있음을 나타낸다.

상기의 연구결과를 바탕으로, 본 발명자들은 노던 블롯 분석 또는 웨스턴 블롯 분석을 통하여, 암환자의 종양조직, 또는 혈액, 림프액 등의 체액으로 박리된 암세포를 대상으로 단독 또는 다른 암전이억제유전자의 발현 수준과 조합하여 리포칼린 2의 발현량을 분석함으로써 환자의 암 전이가능성을 간접적으로 예측 가능할 것으로 기대된다. 이 때, 발현량 분석방법은 특별히 노던 블롯 분석 및 웨스턴 블롯 분석만으로 제한되지 않으며, 원발종양 조직을 ① 웨스턴 블롯(western blot) ② 면역조직화학적 염색(immunohistochemical staining) ③ 인 시추 혼성화 방법(in situ hybridization) 등의 방법을 이용하거나, 종양조직 또는 박리 암세포를 분리하여 ① 역전사효소중합반응(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) ② 실시간 정량적 RT-PCR(real-time quantitative RT-PCR) ③ 노던 블롯(Northern blot) 등을 이용하여 수행할 수 있다.

리포칼린 2는 세포에서 생합성되고 난 후 선도펩타이드(leader peptide)가 가공되면서(processing) 세포 외로 분비되는 단백질이므로, 리포칼린 2 유전자의 도입에 의해 대장암의 간전이가 현저히 억제된다는 사실은, 외부에서 재조합 리포칼린 2 단백질을 첨가할 경우에도 유사한 전이억제 효능을 보일 수 있는 가능성이 충분하다. 실제로, 본 발명은 실시예에서 재조합 리포칼린 2 단백질이 KM12SM 대장암 세포의 마트리겔 침윤능력을 억제하고, 간암세포주의 경우 기저막의 분해에 주 역할을 수행하여 암전이에 중요한 역할을 수행하는 기질 메탈로프로테아제-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)의 발현 감소 및 메트리겔 침윤 능력의 감소를 유도할 수 있음을 보였다. 또한, 재조합 리포칼린2 단백질을 외부에서 전신성으로 투여할 경우 대장암 세포의 간 전이를 효과적으로 제어할 수 있음을 보였다. 따라서 상기의 결과는 재조합 리포칼린 2 단백질을 전이억제 치료제로 이용할 수 있음을 시사한다.

한편, 본 발명의 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 치료용 조성물은 상기 유효성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 치료용 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 치료용 조성물의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하며, 정맥내 주사에 의한 투여가 더욱 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 리포칼린 2 또는 리포칼린 2 발현벡터를 마우스에 정맥 내 주사에 의하여 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 독성시험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 1,000 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단된다.

본 발명의 치료용 조성물은 암의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 대장암세포의 전이능에 따른 리포칼린 2의 발현 양상 분석

대장암 세포의 전이능에 따른 리포칼린 2의 발현 양상을 알아보기 위하여, 전이능이 각각 다른 것으로 알려진 대장암 세포들의 RNA를 노던 블롯(northern blot)으로 분석하였다. 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)으로부터 분양받은 사람의 대장암 세포인 KM12C, KM12C를 생체 내 이식한 후 간으로 전이된 암으로부터 분리한 세포주로서, 모세포인 KM12C에 비해 전이능이 높은 KM12SM(Morikawa et al., Cancer Res., 48: 6863-6871, 1988), SW480, SW480을 분리한 환자의 림프절로 전이된 암에서 분리한 세포주로 모세포인 SW480에 비해 전이능이 높은 SW620(Hewitt et al., J. Pathol., 192: 446-454, 2000) 세포로부터의 총 RNA를 RNA 추출 시약(Trizol^ㄾ, Gibco BRL, USA)을 이용하여 분리한 뒤, 이 중 20 ㎍의 RNA를 2.2 M 포름알데히드 변성 겔에 주입하여 전기영동하고, 리포칼린 2 의 RNA양은 ³²P가 표지된 리포칼린 2 DNA를 프로브를 이용하여 노던 블롯으로 분석하였다(도 1). 도 1은 서로 다른 전이능을 보이는 대장암 세포주에서 리포칼린 2 유전자의 발현을 노던 블롯(northern blot) 분석으로 나타낸 사진이다.

도 1에서 보듯이, 전이능이 낮은 것으로 알려진 KM12C의 경우 전이능이 상대적으로 높은 KM12SM 세포주에서보다 리포칼린 2의 발현이 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 다른 대장암 세포인 SW480, SW620의 경우에서도 같은 결과를 나타냈다. 따라서, 전이능이 낮은 세포주들(KM12C, SW480)에서 리포칼린 2의 발현이 더 높게 나타난다는 것을 시사한다.

<실시예 2> 리포칼린 2 과발현 재조합 렌티바이러스의 제조

성인 인간의 간 cDNA 라이브러리(Invitrogen, USA)를 주형으로 중합효소 연쇄 반응( ExTaq^TM, TakaRa, Japan)을 시행하여 분비 서열을 포함한 서열번호 1로 개시되는 전체 리포칼린 2의 유전자를 확보하였다. 사용된 프라이머의 서열은 각각 5'-CACCATGCCCCTAGGTCTCCTGTGGCTG-3'(서열번호 3)과 5'-TCAGCCGTCGATACACTG-3'(서열번호 4)이었고, 중합 효소 연쇄 반응은 95℃, 1분, 48℃, 1분, 72℃, 1분의 조건에서 30 사이클을 수행하였다. 상기 반응에 의해 얻어진 리포칼린 2 유전자를 렌티바이러스 발현 벡터(pLenti6/V5-D-TOPO, Invitrogen, USA)의 Spe I 및 Apa I 제한효소 인지서열 사이에 삽입하기 위하여, pGEM-T Easy(Promega, USA) 벡터에 클로닝하였다(pT-NGAL). 그 후 Spe I/Apa I의 제한효소를 처리하여 5'-말단과 3'-말 단의 Spe I과 Apa I 제한효소 부위가 절단된 리포칼린 2 유전자 단편을 얻고, 렌티바이러스 발현벡터의 Spe I과 Apa I 사이에 삽입하여 리포칼린 2의 렌티바이러스 발현벡터인 pLenti-NGAL을 완성하였다(도 2). 더불어 3'-말단에 6개의 히스티딘이 첨가된 형태의 리포칼린 2에 대한 렌티바이러스 발현벡터를 제조하기 위하여 상기의 pT-NGAL을 주형으로 하여 다음의 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소반응을 수행하였다. 이때 사용된 프라이머의 서열은 각각 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAATACT-3'(서열번호 5)과 5'-TCCCCGCGGTCAATGGTGATGGTGATGATGGCCGTCGATACACTG-3'(서열번호 6)이다. 중합효소반응에서 얻어진 유전자 단편을 Spe I/Sac II의 제한 효소로 처리하여 렌티바이러스 발현 벡터(pLenti6/V5-D-TOPO; Invitrogen, USA)의 Spe I과 Sac II의 사이에 삽입하였다. 6개의 히스티딘이 3'-말단에 첨가된 형태의 리포칼린 2의 렌티바이러스 발현벡터는 pLenti-L6H라 명명하였다(도 2). pLenti-L6H의 제작목적은 리포칼린2 단백질을 용이하게 정제하기 위한 목적일 뿐이며, 여러 시험을 통하여 6개의 히스티딘 첨가는 리포칼린2의 기능에 별다른 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 삽입 유전자가 없는 pLenti6/V5-D-TOPO 벡터를 대조군 벡터로 사용하였다. 완성된 발현 벡터들은 각각 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'(서열번호 7)과 5'-ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT-3'(서열번호 8)의 두 개의 프라이머를 이용한 DNA 염기서열분석을 통하여 벡터의 염기서열을 확인하였다. 제작된 리포칼린 2 발현 재조합 렌티바이러스 발현벡터(pLenti-NGAL)와 대조군 렌티바이러스 발현벡터(pLenti6/V5-D-TOPO)를 이용하여 각각의 재조합 렌티바이러스(LV-NGAL, LV-Mock)를 293FT 세포주(Invitrogen, USA)에서 생산하였다(도 2). 도 2는 본 발명의 pLenti- NGAL 및 pLenti-L6H의 개열지도이다. 이를 위해 렌티바이러스 입자의 구성에 필요한 단백질을 공급하기 위한 발현 벡터인 pLP1, pLP2, pLP/VSVG(ViraPower^TM Lentiviral Expression System, Invitrogen, USA)의 3가지 플라스미드를 상기 제조한 리포칼린 2 발현 벡터 또는 대조군 벡터와 동시에 293FT 세포에 형질도입하였다. 24시간 후 새로운 10% 우태아 혈청(Gibco, USA)가 함유된 DMEM 배지로 갈아주었으며, 이후 48 내지 72 시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하여 상등액을 분리하였다. 원심분리(1000 rpm, 15분)와 여과(0.22 ㎛) 과정을 거쳐 재조합 렌티 바이러스 액을 얻었으며, 사용시까지 -70℃에 보관하였다. 생산된 재조합 대조군 렌티바이러스(LV-Mock)와 리포칼린 2 발현 렌티바이러스(LV-NGAL)는 HT1080 세포주를 이용하여 바이러스 타이터(titer)를 결정하였으며, 대체로 5 x 10⁵TU (transduction unit)/ml의 타이터 전후로 결정되었다.

<실시예 3> 리포칼린 2 과발현 암세포주의 확립

생산된 LV-Mock과 LV-NGAL을 이용하여 대조군과 리포칼린 2 과발현 세포주를 만들고자 실험을 수행하였다. 각각의 실험 대상 암세포주(대장암 세포주인 KM12C, SW480, KM12SM, SW620 및 간암 세포주인 Chang liver, SK-Hep1, Huh7)를 1-2 x 10⁵/ml의 농도로 6웰 배양접시에 2 ml씩 접종하였다. 24 시간 경과 후 배지에 LV-Mock과 LV-NGAL을 약 1.0 MOI(multiplicity of infection)의 비율로 첨가하여 대상 암세포에 형질도입(transduction)하였다. 다시 1일 경과 후 배지를 제거하고 새로운 배지를 첨가하였으며, 이후 3-4일마다 3 ㎍/ml 블라스티시딘(blasticidin, Invitrogen, USA)이 첨가된 새 배지로 교환하여 렌티바이러스에 의하여 형질도입된 재조합 세포를 선별하였다. 약 2주 정도의 선별 기간을 거친 후 희석 배양법을 이용, 대조군(Mock) 암세포주와 리포칼린 2를 발현하는 암세포주의 개별 클론들을 5-10개 씩 분리하였다.

최종 실험에 사용하기로 선정된 대조군 클론들과 리포칼린 2 과발현 클론들에 대해서는 각각의 세포 stock을 마련하여 액체 질소 저장고 안에 보관하였으며, 실험에 사용되는 렌티바이러스에 의한 재조합 암세포들은 3 ㎍/ml 블라스티시딘이 첨가된 배지에서 계속 배양하였다. 상기의 방법으로 제작된 재조합 세포주 중 KM12SM에 LV-Mock 및 LV-NGAL을 형질도입하여 얻은 세포주를 각각 SM-Mock과 SM-NGAL로 명명하였다. Chang liver에 LV-mock 및 LV-NGAL을 형질도입하여 얻은 세포주의 경우엔 각각 CL-Mock과 CL-NGAL로 명명하였다. Huh7의 경우엔 각각 H7-Mock과 H7-NGAL로 명명하였으며, SK-Hep1의 경우엔 각각 SK-Mock과 SK-NGAL로 명명하였다.

분리된 대장암 개별 클론들에 대하여 노던 블롯(도 3a) 및 웨스턴 블롯(도 3b)을 수행하였다. 도 3a는 확립된 리포칼린 2 과발현 대장암(KM12SM) 세포주(SM-NGAL)에서 리포칼린 2 유전자의 과발현을 노던 블롯 분석으로 나타낸 사진이고, 도 3b는 리포칼린 2의 과발현이 확인된 대장암 세포주들(SM-NGAL #1, 3, 4, 6 및 8)의 배양액을 농축하여 단백질 수준에서의 과발현을 웨스턴 블롯(western blot) 분석으 로 나타낸 사진이다. 이때 도 3a에서 SM-Mock은 대조군으로서 렌티바이러스만을 대장암 세포에 주입한 것이며, 밴드 A는 세포 내로 주입된 렌티 바이러스에 의해 과발현되는 리포칼린 2를, 밴드 B는 대장암 세포주인 KM12SM에서 자체적으로 발현되는 리포칼린 2를 나타낸다.

도 3a 및 3b에서 보듯이, 대조군 클론들에 비해 리포칼린 2 과발현 클론들에서 리포칼린 2가 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다.

비슷한 방법으로 간암 세포주 Chang liver(도 4a), SK-Hep1(도 4b) 및 Huh-7(도 4c)의 개별 클론들에 대한 노던 블롯을 수행하였다. 도 4는 확립된 간암세포주들(a: Chang liver, b: SK-Hep-1, c: Huh-7)에서 리포칼린 2 유전자의 과발현을 노던 블롯 분석으로 나타낸 사진이다.

도 4a 내지 4c에서 보듯이, 대조군(a: CL-Mock, b: SK-Mock, c: H7-Mock)에 비해 리포칼린 2 클론들(a: CL-NGAL, b: SK-NGAL, c: H7-NGAL)에서 리포칼린 2가 과발현됨을 확인하였다.

<실시예 4> 리포칼린 2 재조합 단백질의 제조

상기에서 언급한 리포칼린 2 발현 재조합 렌티바이러스 발현벡터(pLenti-NGAL)를 주형으로 5'-GGAATTCCATATGCAGGACTCCACCTCAGAC-3'(서열번호 9) 및 5'-CGCGGATCCTCAATGGTGATGGTGATG-3'(서열번호 10)를 프라이머로 사용한 중합효소연쇄반응을 수행하여 리포칼린 2의 구조유전자 단편을 얻었다. 얻어진 유전자 단편은 분비서열을 포함한 전체 리포칼린 2 단백질 아미노산 서열 중에서 21번째 아미노산 부터 178번째 아미노산까지(서열번호 11)를 포함하고 있으며, 대장균 발현을 위해 ATG 개시코돈이 추가되었고, 손쉬운 정제를 위하여 3'-말단에 6개의 히스티딘 코돈을 첨가하였다. 얻어진 리포칼린 2 유전자 단편은 Nde I/BamH I의 제한효소를 처리하여 대장균 pET11a 발현벡터(Novagen, Germany)에 삽입하였으며, 상기와 같이 제조된 재조합 리포칼린 2 발현벡터를 pNGAL6H로 명명하였다(도 5). 도 5는 리포칼린 2의 대량 발현을 위한 발현벡터 pNGAL6H의 개열지도이다. 재조합 리포칼린 2 발현 벡터 pNGAL6H를 대장균 발현 균주인 E. coli BL21(DE3)에 형질전환 시키고, 재조합 리포칼린 2 단백질 발현에 이용하였다.

리포칼린 2를 발현하는 대장균을 배양 후 균체를 수집하고, 이를 파쇄하여 수용성 세포 분획을 얻은 후 PBS 완충액에서 투석하였다. 투석 후 수용성 분획을 다시 분리해낸 후 C-말단에 첨가된 히스티딘 태그에 대한 친화성 컬럼 크로마토그래피(affinity column chromatography)를 이용하여 분리하였다. 1 M 이미다졸(imidazole)을 이용하여 리포칼린 2 단백질을 용출(elution)하였으며, 이를 인산 나트륨 완충액(sodium phosphate buffer, pH 6.6)을 이용하여 투석을 수행하였다. 순도를 높이기 위하여 FPLC 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 재조합 리포칼린 2 단백질을 순수 정제하였다. 최종 FPLC 정제는 SP-Sepharose resin을 이용하여 20 mM 인산 나트륨(pH 6.6) 완충용액에서 0내지 0.5 M의 NaCl 농도구배를 이용하여 수행되었다. 폴리아크릴아마이드 전기영동으로 재조합 리포칼린 2 단백질의 발현을 확인하였다(도 6). 도 6은 대장균에서 리포칼린 2를 발현, 정제하는 과정을 폴리아크릴아마이드 겔 사진으로 나타낸 사진이다. 이때 상기 도에서 레인 M은 단백질 분자량 마커이며, 레인 1은 전체 세포 파쇄액, 레인 2는 봉입체(inclusion body) 분획, 레인 3은 수용성 분획, 레인 4는 히스티딘 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 리포칼린 2 단백질, 레인 5는 FPLC에 의해 정제된 리포칼린 2를 나타낸다.

도 6에서 보듯이, 리포칼린 2 단백질은 주로 수용성 단백질로 발현됨을 확인하였다.

<실시예 5> 리포칼린 2에 의한 대장암 및 간암 세포의 침윤억제 효과

세포 내에서의 리포칼린 2의 발현 및 외부에서 재조합 리포칼린 2 단백질(rNGAL)의 처리에 따른 암세포의 침윤억제 효과를 확인하기 위하여 시험관 내 조건(in vitro)에서 침윤 분석(invasion assay)을 수행하였다. 대장암 세포의 경우, 8 ㎛ 구경을 가지면서 직경이 6.5 mm인 폴리카보네이트 필터가 장착된 트랜스웰(transwell; Costar, USA)을 이용하여, 필터 상방에 40 ㎍의 마트리겔(Matrigel, BD Biosciences, USA)을 도포시키고, 1 x 10⁵개의 세포를 필터 상방에 분주한 다음, 필터 하방에 10 ng/ml의 표피세포성장인자(Epidermal growth factor, EGF)가 함유된 배양액을 넣고 2일간 배양하고, 필터 상방의 세포를 면봉으로 제거하여 필터 아랫면으로 이동하여 부착된 세포를 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색한 후, 이를 30% 아세트산(acetic acid)에 용출시켜 595 nm에서의 흡광도를 조사하여 침윤능을 결정하였다(도 7a 및 b). 도 7a는 사람의 대장암 세포주인 KM12SM 세포주에서 리포칼린 2 유전자를 세포내 발현할 경우의 침윤능을 조사하여 나타낸 그래 프이며, 도 7b는 사람의 대장암 세포주인 KM12SM 세포주에 리포칼린 2의 재조합 단백질을 처리한 경우의 침윤능을 나타낸 그래프이다.

도 7a에서 보듯이, 리포칼린 2를 과발현시킨 대장암 세포들(SM-NGAL; 클론 #1, #6, 및 #8)의 경우 대조군 세포(KM-12SM, SM-Mock)에 비해 침윤능이 현저히 감소하였고, 도 7b에서 보듯이, 외부로부터 리포칼린 2 재조합 단백질을 처리한 경우(EGF + rNGAL)에도 마찬가지로 침윤능의 감소를 나타냈다. 즉 리포칼린 2에 의해 대장암세포의 침윤능이 저하됨을 확인할 수 있었다.

동일한 방법으로 리포칼린 2에 의한 간암세포의 침윤억제 효과를 확인하였다. 5 x 10⁴개의 간암세포주(Chang liver, Huh-7 또는 SK-Hep-1)를 필터 상방에 분주하고 필터하방에 5 ng/ml 농도의 종양성장인자-베타 1(TGF-beta 1)과 10 ng/ml 농도의 표피세포성장인자(EGF)가 함유된 배양액을 넣고 약 24시간 배양한 후, 동일한 방법으로 침윤능을 조사하였다(도 7c 내지 7e). 도 7c 내지 7e는 간암세포주인 Chang liver(도 7c), Huh-7(도 7d), SK-Hep-1(도 7e)에서 리포칼린 2 단백질을 발현할 경우 침윤능을 조사하여 나타낸 그래프이다.

도 7c 내지 7e에서 보듯이, 리포칼린 2를 과발현시킨 Chang liver(CL-NGAL), Huh-7(H7-NGAL) 및 SK-Hep-1(SK-NGAL)등의 간암세포주의 경우에서도 대장암 세포와 마찬가지로, 대조군 세포에 비해 침윤능이 상대적으로 낮아지는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 6> 리포칼린 2 과발현에 의한 간암 세포의 MMP-2 유전자 발현 억제 효과

상기 실시예 2에서 제작한 재조합 렌티 바이러스를 이용하여 간암 세포주인 Chang liver와 SK-Hep-1 세포주를 대상으로 대조군(mock) 및 리포칼린 2 과발현 세포주를 제조하였다. 각각의 재조합 세포주에서 4-5개의 개별 안정(stable) 클론들을 선별하였으며, mRNA와 단백질 수준에서 각각 노던 블롯과 웨스턴 블롯을 이용하여 대조군 클론에서는 리포칼린 2 발현이 없으나 리포칼린 2 발현 세포주 클론에서는 높은 수준으로 리포칼린 2가 발현된다는 사실을 확인하였다. 확인된 대조군 클론들과 리포칼린 2 발현 클론들에 대하여 Chang liver와 SK-Hep-1에서의 MMP-2 발현 수준을 노던 블롯 분석으로 확인하였다(도 8a 및 8b). 도 8은 각각 Chang liver, SK-Hep-1에서 리포칼린 2에 의해 MMP-2 유전자의 발현이 감소됨을 노던 블롯 분석으로 나타낸 사진이다.

도 8a에서 보듯이, Chang liver 간암 세포주에서 대조군(CL-Mock)에 비해 리포칼린 2를 과발현 세포주(CL-NGAL1, CL-NGAL2) 모두에서 리포칼린 2 발현에 의하여 MMP-2의 발현이 현저히 감소함을 확인하였으며, 도 8b에서 보듯이, 대조군(SK-Mock)에 비해 리포칼린 2를 과발현하는 SK-Hep-1(SK-NGAL) 감암 세포주에서도 리포칼린 2 발현에 의하여 MMP-2의 발현이 현저히 감소함을 확인하였다.

<실시예 7> 재조합 리포칼린 2 단백질에 의한 간암 세포의 MMP-2 발현 억제 효과

10% 우태아혈청(FBS)을 포함하는 DMEM 배지에서 직경 100-mm 배양접시에 약 90% 밀도로 Chang liver 세포를 배양한 후, 상기 실시예 4의 대장균에서 제조한 재 조합 리포칼린 2 단백질을 동일배지 조건에서 0, 1 또는 5 ㎍/ml의 농도로 6시간 동안 세포에 처리하고, 무혈청 배주조건에서 재조합 리포칼린 2 단백질을 0, 1, 또는 3 ㎍/ml의 농도로 처리하였다. RT-PCR을 이용하여 각각의 재조합 리포칼린 2 단백질 처리 농도에서 Chang liver 간암 세포에서 MMP-2의 발현을 측정하였다(도 9). 도 9a는 10% 우태아혈청(FBS)을 포함하는 배지조건에서, 도 9b는 무혈청 배지조건에서 재조합 리포칼린 2 단백질을 간암세포 Chang liver에 처리한 후 MMP-2 유전자의 발현을 RT-PCR 방법으로 확인한 아가로즈 겔 사진이다.

도 9a에서 보듯이, 10% 우태아혈청(FBS)을 포함하는 배지조건에서 1 ㎍/ml의 재조합 리포칼린 2 단백질 처리 조건에서 MMP-2의 발현이 처리하지 않은 대조군에 비해 감소함을 확인하였다. 하우스 키핑(house keeping) 유전자인 GADPH의 양으로 동일량의 조건에서 시행되었음을 확인하였다. 도 9b에서 보듯이, FBS를 첨가하지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 리포칼린 2 단백질을 Chang liver 세포에 처리하였을 때도 1 ㎍/ml의 농도에서 MMP-2의 발현이 세포에서 감소함을 확인하였다.

<실시예 8> 리포칼린 2의 과발현이 암세포의 증식 및 고형암에 미치는 영향

리포칼린 2의 과발현이 암세포의 증식 및 고형암의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기 실험을 수행하였다. 먼저 리포칼린 2가 암세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 6-웰 세포배양접시에 대장암 세포 KM12SM을 1 x 10⁵개 씩 접종한 후 배양하고, 2-3일 간격으로 수거한 뒤 트립판 블루(trypan blue)로 염 색하여 살아있는 세포의 개수를 계측하였다(도 10). 도 10은 리포칼린 2의 과발현이 대장암 세포의 생장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 세포증식시험으로 세포 수를 계수하여 나타낸 그래프이다.

도 10에서 보듯이, 리포칼린 2를 과발현하는 KM12SM 세포주(SM-NGAL)의 경우 대조군(KM12C, KM12SM, SM-Mock) 세포에 비하여 증식 속도가 약간 저하되는 결과를 얻었으나, 통계적 유의성은 없었다.

또한 생체 내 실험(in vivo) 조건에서 리포칼린 2가 암세포의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 대조군(KM12SM, SM-Mock) 및 리포칼린 2 과발현 대장암 세포(SM-NGAL)를 마리당 2 x 10⁶개 씩 누드마우스의 피하에 이식하였다. 고형암의 크기는 24일 동안 3-4일 간격으로 측정하였다(도 11a). 도 11a는 대조군 및 리포칼린 2 과발현 대장암 세포를 마우스의 피하에 이식한 후 세포성장을 관찰하여 나타낸 그래프이다.

도 11a에서 보듯이, 리포칼린 2를 과발현하는 KM12SM 대장암세포(SM-NGAL)와 대조군 세포(KM12SM, SM-Mock)를 이식한 실험군 사이에는 고형암의 성장에서의 유의한 차이를 보이지 않았다.

실험기간 동안 이식한 종양조직 내에서 리포칼린 2의 발현이 정지되어 종양 성장의 차이를 유도하지 않을 수 있을 가능성을 배제하기 위하여 실험 종료시 수집한 종양조직에서 추출한 단백질을 이용한 웨스턴 블롯을 수행하였다(도 11b). 도 11b는 마우스의 피하에 자란 대장암에서의 리포칼린 2의 발현을 조사하기 위하여 고형암 조직들로부터 단백질을 추출하여 웨스턴 블롯 분석으로 나타낸 사진이다.

도 11b에서 보듯이, 리포칼린 2를 과발현하는 SM-NGAL 세포주는 전체 실험기간 동안 종양 조직 내에서 리포칼린 2를 잘 발현됨을 알 수 있었다. 상기의 결과에서와 같이 리포칼린 2의 과발현은 암세포의 증식 및 고형암의 성장 자체에는 큰 영향을 미치지 않는 것을 시사한다.

<실시예 9> 리포칼린 2에 의한 대장암 세포의 간전이 억제 효과

대조군(KM12SM, SM-Mock) 및 리포칼린 2 과발현 대장암 세포(SM-NGAL)를 마리당 1 x 10⁶개씩 무작위 교배계 수컷 BALB/c nu/nu 누드마우스(Charles River Japan Inc., Japan)의 비장에 주입한 후 간으로의 전이를 관찰하였다. 세포를 이식한지 21일째 되는 날에 마우스를 해부하여 간을 적출하고, 간에 전이된 전이암(대장암)의 콜로니 수를 계측하였다(도 12a 및 12b). 도 12a는 대조군(KM12SM, SM-Mock) 및 리포칼린 2 유전자 과발현하는 대장암 세포주(SM-NGAL)를 생쥐의 비장에 주입하여 간으로의 전이를 유도한 후 21일 째에 적출한 간을 나타낸 사진이고, 도 12b는 도 12a의 간 표면에 존재하는 대장암 간전이암을 계수한 값을 나타낸 그래프이다.

도 12a 및 12b에서 보듯이, 리포칼린 2를 과발현하는 대장암 세포(SM-NGAL)를 이식한 실험군 그룹에서는 대조군(KM12SM, SM-Mock) 그룹에 비하여 전이된 콜로니의 개수가 약 60% 정도 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 10> 재조합 리포칼린 2 단백질에 의한 대장암 세포의 간전이 억제 효과

외부로부터 투여된 재조합 리포칼린 2 단백질에 의한 대장암 세포의 간전이 억제 효과를 관찰하기 위하여, 상기에서 확립한 대장암 간전이 실험동물 모델을 이용하여 전이억제 실험을 수행하였다. 인간의 대장암 세포인 LS174T(American Type Culture Collection, USA)를 마리 당 3 x 10⁵개씩 마취시킨 누드마우스의 비장에 주입한 후, 재조합 리포칼린 2 단백질을 한 마리 당 10 mg/kg 씩 17일간 매일 복강으로 주입하였다. 세포를 이식한지 18일째 되는 날에 마우스를 해부하여 간을 적출하고, 간 표면에 존재하는 전이 암세포(대장암)의 콜로니 수를 계측하였다(도 13). 도 13은 재조합 리포칼린2 단백질에 의한 대장암 세포의 간전이 억제효능을 간 표면의 대장암 콜로니의 개수를 계수하여 그래프로 나타낸 결과이다.

도 13의 그래프에서 보듯이, 재조합 리포칼린 2 단백질(rNGAL)을 주입한 실험군 그룹에서는 대조군 그룹에 비하여 전이된 콜로니의 개수가 약 60% 이상 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 리포칼린 2 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질도입된 세포를 유효성분으로 함유하는 신규한 암전이 억제용 약학적 조성물, 이를 이용한 암전이 억 제 방법, 암전이 가능성 예측키트 및 상기 키트를 이용한 암 전이 위험군의 선별 방법에 관한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 암 전이를 특이적으로 억제함으로써 항암치료 효과를 혁신적으로 향상시킬 수 있으며, 본 발명의 예측키트 및 상기 키트를 이용한 암전이 위험군 선별방법은 암 종양조직 또는 체액에서 리포칼린 2 발현을 조사하여 전이위험이 높은 위험군을 선별할 수 있음으로써, 실제 임상에서의 암환자의 관리에 있어서, 유용하게 사용될 수 있다.

<110> MOGAM BIOTECHNOLOGY INSTITUTE <120> A therapeutic agent comprising lipocalin 2 against cancer metastasis and methods of early diagnosis and inhibition of cancer metastasis using lipocalin 2 <130> 5p-01-62 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 597 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgcccctag gtctcctgtg gctgggccta gccctgttgg gggctctgca tgcccaggcc 60 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 120 aacttccagg acaaccaatt ccaggggaag tggtatgtgg taggcctggc agggaatgca 180 attctcagag aagacaaaga cccgcaaaag atgtatgcca ccatctatga gctgaaagaa 240 gacaagagct acaatgtcac ctccgtcctg tttaggaaaa agaagtgtga ctactggatc 300 aggacttttg ttccaggttg ccagcccggc gagttcacgc tgggcaacat taagagttac 360 cctggattaa cgagttacct cgtccgagtg gtgagcacca actacaacca gcatgctatg 420 gtgttcttca agaaagtttc tcaaaacagg gagtacttca agatcaccct ctacgggaga 480 accaaggagc tgacttcgga actaaaggag aacttcatcc gcttctccaa atctctgggc 540 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggctga 597 <210> 2 <211> 198 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Leu Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Ala Leu Leu Gly Ala Leu 1 5 10 15 His Ala Gln Ala Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro 20 25 30 Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu 50 55 60 Asp Lys Asp Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu 65 70 75 80 Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys 85 90 95 Asp Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe 100 105 110 Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val 115 120 125 Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys 130 135 140 Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg 145 150 155 160 Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser 165 170 175 Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile 180 185 190 Asp Gln Cys Ile Asp Gly 195 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of lipocalin 2 <400> 3 caccatgccc ctaggtctcc tgtggctg 28 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer of lipocalin2 <400> 4 tcagccgtcg atacactg 18 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of pTNGAL <400> 5 atttaggtga cactatagaa tact 24 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer of lipocalin 2 containing 6 His and SacII restriction site <400> 6 tccccgcggt caatggtgat ggtgatgatg gccgtcgata cactg 45 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward sequencing primer of lipocalin 2 <400> 7 cgcaaatggg cggtaggcgt g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward sequencing primer of lipocalin 2 <400> 8 accgaggaga gggttaggga t 21 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of lipocalin 2 containing NdeI restriction site <400> 9 ggaattccat atgcaggact ccacctcaga c 31 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer of lipocalin 2 containing BamHI restrction site <400> 10 cgcggatcct caatggtgat ggtgatgatg 30 <210> 11 <211> 178 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp Tyr Trp Ile 65 70 75 80 Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn 85 90 95 Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Ser Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly

Claims

리포칼린 2 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터 또는 상기 발현벡터가 형질도입된 포유동물 세포를 유효성분으로 함유하는 암전이 억제용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1로 기재되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 발현벡터는 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 바이러스성 벡터는 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스를 포함하는 레트로바이러스 벡터, 아데노-부속 바이러스 벡터 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터는 도 2로 나타내어지는 pLenti-NGAL인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 암은 대장암 또는 간암인 것을 특징으로 하는 암전이 억제용 약학적 조성물.
리포칼린 2 단백질을 유효성분으로 함유하는 암전이 억제용 약학적 조성물.
제 8항에 있어서, 상기 리포칼린 2 단백질은 서열번호 2 또는 서열번호 11로 기재되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 8항 또는 제 9항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 8항에 있어서, 상기 암은 대장암 또는 간암인 것을 특징으로 하는 암전이 억제용 약학적 조성물.
도 2의 pLenti-NGAL로 나타내어지는 리포칼린 2의 렌티바이러스 발현벡터.
제 12항의 발현벡터를 형질감염시켜 수득된 재조합 렌티바이러스.
제 13항의 재조합 렌티바이러스가 형질도입된 세포주.
제 14항에 있어서, 상기 세포주는 암세포 또는 정상세포인 것을 특징으로 하는 세포주.
제 15항에 있어서, 상기 암세포주는 KM12C, SW480, KM12SM, SW620, Chang liver, SK-Hep-1 및 Huh-7으로 구성된 그룹으로부터 선택되어지는 것을 세포주.
제 1항 또는 제 8항의 약학적 조성물을 암환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암전이 억제 방법.
제 17항에 있어서, 상기 암은 대장암 또는 간암인 것을 특징으로 하는 암 전이 억제 방법.
리포칼린 2에 특이적인 항체 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적 인 프라이머쌍을 포함하는 암 전이 가능성 예측 키트.
제 19항에 있어서, 상기 항체는 단클론성 항체 또는 다클론성 항체인 것을 특징으로 하는 암전이 가능성 예측 키트.
제 19항에 있어서, 상기 프라이머쌍은 서열번호 3 및 4로 기재되는 것을 특징으로 하는 암 전이 가능성 예측 키트.
하기의 단계를 포함하는 제 19항의 키트를 이용한 암전이 위험군을 선별하는 방법:

ⅰ) 암환자로부터 암표본을 수득하는 단계;

ⅱ) 상기 암표본으로부터 박리 표본, 파쇄액 및 총 RNA로 선택되는 리포칼린 2 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 검출시료를 준비하는 단계;

ⅲ) 상기 검출시료로부터 리포칼린 2 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA를 검출하는 단계; 및

iv) 리포칼린 2 단독 또는 다른 암전이 억제 유전자의 발현수준과 조합하여 리포칼린 2의 발현량을 분석하는 단계를 포함하는 암 전이 위험군의 선별 방법.
제 22항에 있어서, 단계 ⅲ은 인 시추(in situ) 혼성화, 면역조직화학적 염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴 블롯, 노던 블롯, RT-PCR 및 실시간 RT-PCR로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암전이 위험군의 선별 방법.