KR20060035602A

KR20060035602A - 말-２인플루엔자 바이러스의 ｈａ1을 발현하는 ｄｎａ 백신

Info

Publication number: KR20060035602A
Application number: KR1020057021763A
Authority: KR
Inventors: 알렉산더 라이
Original assignee: 더 보드 오브 리전츠 포 오클라호마 스테이트 유니버시티
Priority date: 2003-05-15
Filing date: 2004-04-16
Publication date: 2006-04-26
Also published as: CA2523676A1; BRPI0410091A; JP2007525456A; NZ543196A; EP1623015A2; WO2005014778A2; ZA200509187B; US7244435B2; EP1623015A4; AU2004263816A1; WO2005014778A3; MXPA05012199A; US20050032732A1; CN1925870A

Abstract

본 발명은 말-２인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA1) 유전자를 발현하는 DNA 백신에 관한 것이다. HA1 내에 종결코돈을 갖도록 조작하여, HA1의 발현을 담보하였다. 상기 DNA 백신을 리포좀으로 피막하고, 비강 접종함으로써, 본 발명의 DNA 백신은 전장의 HA 유전자를 발현하는 DNA 백신과 비교하여 상당히 적은 접종량으로도 예방 면역을 유발하기에 충분하다. 적은 접종량은 항-DNA 항체 생산의 위험성을 감소시킨다. 기도 상피세포에의 직접적인 비강 접종은 DNA 삽입 위험성을 감소시킨다. 본 발명의 백신은, 백신을 갱신할 경우 단지 신종 바이러스의 코딩서열만 대체하면 되기 때문에, 현재 사용하는 불활성화된 또는 살아있는 약독화된 백신과 비교하여 장점이 있다.

DNA 백신, 말 인플루엔자 바이러스, 항체, 항원, 리포좀

Description

말-２인플루엔자 바이러스의 ＨＡ1을 발현하는 ＤＮＡ 백신 {DNA VACCINE EXPRESSING HA1 OF EQUINE-2 INFLUENZA VIRUS}

본 발명은 말 인플루엔자 바이러스에 대한 백신, 더욱 구체적으로는 말-2 인플루엔자 바이러스의 HA1 코딩서열 포함하며, 전형적인 접종량보다 적은 양으로 비강접종되어 양호한 점막 면역을 유발할 수 있는 DNA 백신에 관한 것이다.

말 인플루엔자 바이러스 (EIV)는 말의 상기도(upper respiratory) 감염을 일으키는 주요한 병원체이다. 상기 바이러스는 수세기 동안 전염성 호흡기 질환의 발병 원인으로서 지목되어 왔다. 상기 바이러스는 빠르게 전파하며 이환률(morbidity)이 극히 높다. 감염된 말은 전형적으로 "감기" 증상을 나타낸다: 빠른 호흡기 질환 발생, 기침, 발열, 및 점액분비. 드문 경우에 2차 박테리아성 감염에 의한 기관지폐렴으로 죽기도 한다. 비록 치사율이 낮으나, 말 인플루엔자 바이러스 감염의 효과는 중대하다. 1992년 홍콩에서의 발병으로 인한 경마의 중단으로 수입에 있어 1.2억 미국 달러의 손실이 초래된 것으로 추정된다. 말을 이용하는 기타 스포츠에 있어서도 경제적 중요성은 덜할지 몰라도, 말 인플루엔자의 발생은 몇몇 경우에 있어 국제적인 말 관련 행사를 중단시켰다. 임상적 증상이 없으나 감염된 말은 고된 훈련을 받는 경우, 감소된 폐기능과 같은 장기 후유증으로 고생한 다. 임상적 증상이 있는 말의 경우도 훈련시간의 단축이라는 명백한 불이익을 받게 된다.

말 인플루엔자 바이러스는 오르토믹소바이러스목 (Orthomyxoviridae)의 일원인 유형 A 인플루엔자 바이러스이다. 상기 바이러스의 게놈은 8개의 네카티브-RNA 가닥으로 구성된다. 바이러스의 캡시드는 두 개의 표면 바이러스 당단백질, 즉 헤마글루티닌 (HA) 및 뉴라미니다제 (NA)가 부착되어 있는 지질외피로 피막(encapsulate)되어 있다. HA는 EIV의 단백질 중 가장 항원성이 높은 것으로 생각된다. HA는 분자량이 약 77 kD이다. 상기 바이러스 단백질은 HAO로서 합성되어, 후속적인 단백질 분해효소의 작용 및 이황화결합의 환원으로 절단되어, 아미노 말단의 HA1 부분 (50 kD) 및 카르복시 말단의 HA2 부분 (27 kD)으로 된다. 상기 HA2 부분은 막의 지질 이중층에 부착되며, HA1 부분은 비공유결합에 의해 HA2에 결합된다. 헤마글루티닌은 바이러스의 숙주세포막의 수용체에의 결합에 관여하여, 후속적 침투 및 바이러스의 외피의 제거를 초래하여, 그 결과 바이러스 복제가 개시된다. 예방접종의 주목적은 상기 바이러스가 코딩하는 분자에 대한 면역을 유도하는 것이다.

말 인플루엔자 바이러스에는 두 종류의 아형이 있다. 유형 1, 또는 말-1 인플루엔자 바이러스 (H7N7)는 지난 15년 동안 선진국에서는 발견되지 않았다. 그러나, 말-2 인플루엔자 바이러스 (H3N8)는 방대한 예방접종 프로그램에도 불구하고 전세계에 퍼져있다. H3N8 바이러스의 성공은 추측건대 항원소폭변이에 기인하는 것이다: 아미노산의 치환에 의한 HA 항원성의 연속적 변이[1]. 최근 분리된 말-2 인플루엔자 바이러스는 "미국" 계통 또는 "유라시아" 계통으로 분류될 수 있다. 나아가, 더욱 최근의 말-2 인플루엔자 바이러스는 다수의 계통으로 분기하였으며[2], 적어도 북미에서는 두 가지의 진화계통이 해마다 교대로 퍼진다 [3]. 현재 EIV 백신은 전형적으로 바이러스 전체를 불활성화시킨 p-프로피오락톤 또는 포르말린으로 구성된다. 항원성 구성성분은 말 인플루엔자 바이러스 유형 1 및 유형 2로 구성된다. A/Eq/Prague/56은 유형 1에 대한 유일한 백신 균주(strain)인 반면에, 유형 2의 백신으로는 초기의 원형 A/Eq/Miami/63 및 그 후에 개발된 예컨대 A/Eq/Kentucky/81 또는 A/Eq/Fontainebleau/79가 있다. WHO/OIE 말 인플루엔자 규제 위원회 (WHO/OIE Consultations on Control of Equine Influenza)는 최근 회의에서 백신은 "미국"바이러스 (A/Eq/Kentucky/94) 및 "유라시아"바이러스 (A/Eq/Newmarket/2/93) 모두를 포함해야 하며, 원형 A/Eq/Miami/63은 사용을 중지해야 한다는 종전의 권고를 확인하였다 [4].

최근의 유망한 연구에서, Morley et. al. [5]은 현재 통용되는 백신은 바이러스 감염에 대해 예방을 하지 못하며, 단지 임상적 증상을 억제하는 최소한의 효과만을 가지고 있다는 것을 보여주었다. 현재 통용되는 백신의 예방성 결여는 하나 이상의 다음과 같은 요인 또는 이들의 조합에 기인한다:

면역원성의 결여;

잘못된 백신 균주 선택; 및/또는

부적절한 면역 유도.

계속적인 말-2 인플루엔자 바이러스 (H3N8)의 진화로 인하여, 예방적 면역 유도를 위해서는 주기적으로 백신 균주를 갱신하여야 한다. 그러나, 백신 제조사들 간에 있어서, 백신 균주의 선택의 범위가 넓다.

초기의 EIV에 의해 유도된 면역은, 아미노산 치환 (항원소폭변이)의 결과, HA의 항원성의 변화로 인해서, 후에 분리된 바이러스에 대해서는 예방작용을 할 수 없을 것이다. 이러한 바이러스의 특징은 "실패가 없는" 효과적인 백신에 대한 주 장애이다. 더욱 자주, 그리고 더욱 최근의 바이러스 균주로 교체하는 백신의 갱신이 권장되어 왔다 [6]. 어떤 제조사들은 여전히 구식 바이러스 균주를 제품으로 판매하고 있다. 비록 말 인플루엔자 바이러스에 특이적인 항체가 유도된다고 하더라도, 이들 백신은 문제가 있다. 첫째, 혈청 항체 농도는 예방에 대한 지표가 되기 어렵다. 둘째, 현재 퍼져있는 바이러스 균주는 상기 백신 균주와 상당히 다르기 때문에, 교차-반응성이 최소이다. 상기 구식 백신에 의한 "부분적" 면역은 감염된 말을 무증상의 보균자, 즉, 감염은 되었으나, 부분적 면역으로 인해서, 임상적 증상은 억제된 말이 되게 한다. 상기의 감염된 말은 눈에 띄지 않기 때문에 바이러스의 전염을 용이하게 한다.

인플루엔자 바이러스는 상기도의 섬모가 달린 상피세포에 부착하여 감염을 개시한다. 그러므로, 점막 항체는 바이러스에 대하여 효과적인 방어책이 될 수 있다. 사실, 말 인플루엔자 바이러스에 대한 예방에 있어서, 코 항체의 중요성은 수년 동안 인식되어 왔다. 마우스 모델에서, IgA의 전달이 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 예방이 될 수 있다는 것이 증명되었다 [7].

반면, 현재 백신은 혈청 항체로서, 점막 면역을 표적으로 하는 것은 없다. 혈청 항체 농도와 백신 효능간의 상관관계는 항원 및 항체의 측정의 표준화 결여로 인해, 불명확하다 [8].

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면역 자극 복합체(ISCOM)의 사용 [9]을 포함하며, 점막부위에 직접 접종하는[10] 수개의 전략이 현재의 말 인플루엔자 바이러스 백신에 대한 점막 면역 반응을 증대시키기 위해 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 전략에 의한 향상은 단지 제한적일 뿐이었다.

재조합 저온-적응 (온도민감성 돌연변이체) 및 약독화 말 인플루엔자 바이러스를 기본으로 하는 최근에 인가된 Heska Corp. (Fort Collins, Colorado)의 백신은 점막 면역 유도를 시도한 것이다. 상기 백신은 점막 면역의 유도를 위해 비강 접종된다. 저온-적응 약독화 바이러스의 점막부위로의 비강을 통한 직접 접종은 점막-연관 림프조직(MALT)을 강하게 활성화한다. 그러므로, 상기 백신은 고 면역원성으로서 점막 면역을 유도한다. 그러나, 상기 백신은 재-배치를 통한 재조합 바이러스를 기본으로 하기 때문에, 백신의 갱신을 위해서는 저온-적응 약독화 바이러스를 유전공학적으로 재배치하여야 한다. 또한 갱신된 백신은 허가 전에, 요구되는 모든 안전성 및 효능 검사를 마쳐야만 한다.

DNA 백신 또는 유전적 면역분야는 빠르게 대두하는 기술분야이다. 이는 단백질 코딩서열을 포함하는 DNA 플라스미드를 마우스의 근육에 주사할 경우, 항원이 발현될 뿐만 아니라, 상기 항원에 대한 면역반응이 또한 유도된다는 우연한 발견에 서 비롯되었다 [11, 12]. 세포는, 시험관내에서의 DNA 전달이입과 유사한 방식으로 생체내에서 DNA 플라스미드를 받아들이는 것으로 생각된다. 상기 DNA 플라스미드는 숙주세포에서 복제하지는 않지만, 코딩된 항원은 숙주세포에서 전사되고 번역된다. 상기 항원은 세포표면상에 발현되거나 또는 분비되어, 면역반응을 유발한다 [13]. 이러한 새로운 면역화 방법은 많은 연구자에 의해, 일반적인 인플루엔자 바이러스 [14], 및 특정 말 인플루엔자 바이러스 [15]를 포함하는 광범위한 감염제에 대하여 효과적인 것으로 증명되었다. A/Eq/Kentucky/81의 HA 유전자를 발현하는 DNA 백신을 피부 및 점막 접종한 경우, 말에게서 동종 바이러스 감염에 대하여 예방작용을 하는 것으로 나타났다 [15].

특허 기술분야에서, U. S. 특허 Nos. 6,482, 414; 6,436, 408; 6,398, 774; 6,177, 082; 6,045, 790; 4,920, 213; 4,693, 893; 4,689, 224; 4,683, 137; 4,631, 191; 및 4,619, 827는 EIV에 대한 백신 및 방법론을 기술하고 있으며, 이들 모두를 본 발명에 참조하였다. U. S. 특허 Nos. 4,920, 213 및 4,631, 191는 말 인플루엔자 바이러스에 대한 재조합 말 면역용 백신에 관한 것이다. 두 가지 바이러스 균주 유래의 HA 및 NA 당단백질을 코딩하는 DNA 서열을 사용하여 백시니아에 의해 전달되는 백신을 제조하고, 프라이머 및 추가 접종용 합성 펩타이드를 디자인하여, HA 및/또는 NA 단백질을 기본으로 하는 재조합 백신을 합성하였다.

현재 백신이 가지고 있는 상기 문제점을 해결하기 위해, 말 인플루엔자 바이러스에 대한 이상적인 백신은 고 면역원성이며, 점막 면역을 유발하고, "갱신"이 용이하여야 한다.

발명의 요약

본 발명은 말-2 인플루엔자 바이러스 유래의 HA 당단백질의 HA1 단편을 코딩하는 서열을 포함하는, DNA 백신이 비강내 접종시 예방성 면역을 부여한다는 발견을 기본으로 한다. 상기 HA1을 발현하는 DNA 백신을 리포좀 벡터로 피막(encapsulate)하여 Balb/c 마우스의 비강에 접종하였다. 2회의 추가 접종 후에, 상기 마우스를 준치사량의 동종의 감염성 바이러스로 감염하였다. 비-면역화 대조군의 경우, 최대 7.9 %의 체중감소를 관찰하였다. DNA 백신으로 면역된 군 및 양성 대조군 (불활성화된 동종 바이러스로 면역됨) 의 경우, 관찰된 체중감소량은 각각 1.8 % 및 1.6 % 이었다. 부가적으로, 바이러스에 특이적인 IgG 및 IgA 항체가 유발되었다. HA의 전구체는 HA1 및 HA2로 절단된다. HA1는 항원성 부위가 바로 이 부위에 위치하기 하므로, 면역원성 바이러스 당단백질로 분류된다. 상술한 결과는 HA1 단독 발현이 예방성 면역 유발에 충분하다는 것을 보여준다. 나아가, 전장 HA 유전자를 발현하는 DNA 백신과 비교하여, 훨씬 적은 접종량의 HA1 DNA 백신으로도 예방을 할 수 있다는 것을 발견하였다.

본 발명의 DNA 백신은, 백신의 갱신과 관련해서는 단지 신종 바이러스 유래의 HA1 코딩서열을 삽입하여 항원을 대체하기만 하면 되기 때문에, 현재의 불활성화된 또는 살아있는 약독화된 백신과 비교하여 또다른 장점을 가진다. 나아가, 상기 백신은 점막 면역을 목적으로 하여 비강 접종될 수 있다. 상기 백신은 또한 발현되는 항원의 면역원성을 최적화하기 위해 조작될 수 있다.

유전자 총, 근육내, 또는 피하 주사를 이용하여 DNA 백신을 전달하며, 도입된 DNA가 숙주세포의 염색체로 삽입될 수 있는 위험성이 있는 선행기술과 비교하여, 본 발명은 주요한 다른 장점이 있다. 종래의 기술은 부작용을 초래하는 돌연변이 또는 암의 발생이라는 잠재적 위험성도 있다. 리포좀으로 피막한 후에 비강 접종을 하면 DNA 백신이 기도의 상피세포에 직접 전달된다. 상피세포는 빠른 속도로 교체되기 때문에, 염색체내로의 삽입가능성은 상당히 감소된다. 나아가, 하기에 기술하는 바와 같이, HA1 단독 사용 (조작된 종료 코돈을 포함)으로 필요한 접종량이 감소하여, 따라서 삽입의 위험성 및 항-DNA 백신 유발 위험성이 추가로 감소한다.

따라서, 본 발명의 구현예에서, 말-2 인플루엔자 바이러스의 HA1의 서열 또는 그 에피토프를 코딩하는 DNA를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기에서 상기 백신은 추가로 약리학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다. HA1 코딩서열은 바람직하게는 공지의 말-2 인플루엔자 바이러스균주로부터 선택되며, 한 구현예에서 바람직하게는 A/Eq/Kentucky/98 바이러스 균주로부터 선택된다. 구체적 예로서, HA1 코딩서열은 SEQ ID NO: 1의 핵산서열을 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 DNA 백신은 면역 반응의 향상 및/또는 접종 후의 적절한 흡수 속도의 촉진을 위해 애주번트와 조합된다.

본 발명의 추가의 구현예에서, 말 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 감염의 심각성을 감소하기 위한, 말에서의 면역반응 유발 방법을 제공하며, 상기 방법은 말 인플루엔자 바이러스 감염 통제 수단을 제공하기 위해, 위험에 처해 있는 동물에게 면역에 유효한 양의 본 발명의 예방 백신을 단독으로, 또는 애주번트 또는 추가의 항원성 성분 또는 코딩 서열과 조합으로 접종하는 것을 포함하며, 상기 백신은 추가로 약리학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.

바람직하게, DNA 백신은 벡터를 포함하며, 가장 바람직하게는, 상기 DNA는 포좀으로 피막되며, 대상체의 기도로 비강 접종되어, 우수한 점막 면역을 유발한다.

당업자라면, 하기의 상세한 설명으로부터, 본 발명 및 그 목적 및 장점의 보다 잘 이해할 수 있음이 명백하며, 다음에서는 본 발명의 실시에 가장 적합한 양태만을 예로 들어, 본 발명의 바람직한 예만을 기술한다. 인식하는 바와 같이, 본 발명의 범위 및 정신에서 벋어나지 않으면서, 본 발명은 명백한 다양한 관점에서 변형될 수 있다. 따라서, 다음의 설명은 그 성질상 예시적인 것일 뿐, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

본 발명의 자세한 기술에 앞서, 본 발명은 그 적용에 있어, 본 명세서에 기술된 단계 및 예시된 구축물로 한정되는 것이 아님을 인식하는 것이 중요하다. 본 발명의 다른 구현예 및 다양한 방식의 다른 실시도 가능하다. 본 명세서의 용어 및 어구는 본 발명을 기술하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아님을 알려둔다.

본 발명은 신규한 DNA 백신 및 EIV에 대한 예방 방법을 제공한다. 본 발명은 DNA-매개된 예방접종에 관한 것으로 바람직하게는, 본 발명은 임의의 당대의 바이러스 균주로부터 선택되는 HA1 또는 그 에피토프를 코딩하는 분리된 DNA 벡터를 사용하여 직접 도입하는 것을 포함하며, 상기 벡터에 포함된 HA1 또는 그 에피토프는 이어서 접종된 말의 세포내에서 발현된다. 본 발명의 백신은 단독으로 또는 추가의 항원성 성분 또는 코딩 서열과 조합으로 또는 기술분야의 당업자에게 공지된 다른 백신과 조합으로 접종될 수 있다.

바람직하게, 상기 분리된 HA1 코딩서열은 A/Eq/Kentucky/98, A/Eq/Miami/63, A/Eq/Kentucky/81, A/Eq/Fontainebleau/79, A/Eq/Saskatoon/90, A/Eq/Kentucky/92, A/Eq/Kentucky/94 및 A/Eq/Newmarket/2/93, A/Eq/New York/99, A/Eq/Oklahoma/00균주로 구성되는 군으로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는, A/Eq/Kentucky/98균주로부터 선택된다. 가장 바람직하게는 HA1 코딩서열은 Kentucky/98 유래의 SEQ ID NO: 1의 핵산 서열을 포함한다.

그러나, 본 명세서로부터도 알 수 있듯이, 본 발명은 다른 바이러스 균주의 HA1 코딩서열 및 효과적으로 HA1을 코딩하는 그의 유사체, 단편, 돌연변이, 치환체, 합성물, 또는 변이체, 그의 에피토프, 및/또는 모방체를 포함한다 (HA1 유전자 서열을 얻을 수 있는, GenBank 접근 번호가 함께 기재된 다양한 바이러스 균주의 목록에 대하여는 예를 들면, 본 명세서에 참조로 도입된, 하기 참조문헌[2], 표 1 및 3을 참조). 그 결과, 본 발명은 적절하게 형질전환된 세포에서, 전장 항원, 항원의 단편, 항원 유도체 또는 상기 전장 항원, 항원 단편 또는 항원 유도체의 다른 단백질과의 융합 산물일 수 있는 단백질을 발현하고/하거나 이를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 것이다. 본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 것을 포함하는 당대의 바이러스균주의 면역원성 특징을 갖는 분리된 재조합 균주를 갖는 DNA 백신을 또한 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "분리된" DNA는 원래 천연 서열에 동반되는 기타 세포성 성분으로부터 실질적으로 분리된 것이다. 상기 용어는 그의 천연 환경으로부터 분리된 핵산 서열을 포함하며, 재조합 또는 클로닝된 DNA 및 화학적으로 합성된 유사체 또는 생물학적으로 합성된 유사체를 포함한다.

용어 "벡터"는 일반적으로 임의의 DNA 백신용 벡터를 일컫는 것으로, 당업계에 다수가 공지되어 있으며, 그 자체로는 "불활성"(면역을 유발하지 않음)이며, 대상체에게 용이하게 전달될 수 있으며, 대상체의 염색체로 삽입되지 않는다. 본 명세서에 참조로 도입되었으며, 당업계의 다양한 벡터 및 전달 시스템에 대하여 자세히 기술하고 있는 U. S. 특허 Nos. 6,468, 984 및 6,339, 068을 참조한다. 바람직한 벡터는 pVAXl 및 pcDNA3.1/V5-His-TOPO 진핵세포 발현용 벡터로 이는 미국, 캘리포니아주, 칼스배드시 소재의 Invitrogen사로부터 구입할 수 있다.

본 발명의 백신은 HA1 코딩서열에 작동가능하게 연결되어 이의 발현을 조절하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 발현조절 서열이 핵산 서열의 전사 및 적절한 경우, 번역을 조절 및 제어하는 경우에 발현조절 서열이 상기 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 따라서, 발현조절 서열은 적절한 프로모터, 인해서(enhancer), 전자종결서열, 단백질 코딩 서열의 앞의 개시코돈(i. e. , ATG), 인트론 스플라이싱 신호서열, 적합한 mRNA의 번역을 위한 정확한 번역틀 유지용 서열, 및 종결코돈을 포함할 수 있다.

본 발명의 백신은 추가로 약리학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다. 백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 설탕 등을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트를 들 수 있다. 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 예를 들면 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것이 추가로 존재할 수 있다. 바람직한 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함한다.

용어 "애주번트"는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로, 본 명세서에 사용된 대로, 임의의 흡수-촉진제를 포함한다. 허용가능한 애주번트는 프로인트 완전애주번트, 프로인트 불완전애주번트, 사포닌, 미네랄 젤 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀전, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 등을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 바람직한 애주번트는 Fort Dodge Animal Health의 METASTIM

애주번트이다.

본 방법은 동물에게 면역에 유효한 양의 본 발명의 백신을 접종하는 것을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해 본 발명의 "면역에 유효한 양"의 백신은 체중 1g 당 0.001㎍ 이상이며, 바람직하게는 체중 1g 당 0.001㎍ 내지 0.01㎍의 범위이다.

본 발명의 백신은 바람직하게는 상술한 바대로 리포좀/애주번트 중에서 피막된 후, 비강접종되어 목적하는 점막 면역을 유발하지만, 필요에 따라 기술분야의 당업자에게 공지된 방법, 예를 들면 근육, 피하, 복강, 정맥, 경구, 진피, 또는 안구 접종될 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예를 통하여 추가로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 식으로든 후에 첨부되는 청구범위에 기재된 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실험재료 및 방법

바이러스 및 바이러스 증폭 :

말-2 인플루엔자 바이러스, A/Eq/Kentucky/98는 University of Kentucky의 Dr. Thomas Chambers로부터 수득하였다. 바이러스 증폭 및 이의 특성 규명은 종전에 기술된 대로 수행하였다 [2]. 요약하면, 상기 바이러스를 9 내지 11일 된 발육란 상에서 37℃에서 72시간 동안 배양한다. 요막액을 Mahr et al. [16]에 기술된 대로 수집 한 후, 1000 g에서 15분 동안 원심분리하여, 상층액만을 분리하고, 닭 적혈구를 사용한 헤마글루티닌화 분석에 의해 역가를 결정하였다.

DNA 백신의 구축:

클로닝용 DNA 주형 합성을 위해, 역전사 및 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 사용하여 HA1 해독틀을 제조하였다. 바이러스 RNA를 추출하여, uni-12 프라이머(5'AGCAAAAGCAGG3') (SEQ. ID NO: 2) 및 MMLV 역전사효소 (Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 주형은 프라이머 EH3-29+ (5'CATGAAGACAACCATTATTTT3') (SEQ. ID NO: 3) 및 EH3-1061- (5'TCTGATTTGCTTTTCTGGTA3') (SEQ. ID NO: 4) 또는 EH3-29+ 및 EH3- 1061 STOP (5'TCATCTGATTTGCTTTTCTGGTA3') (SEQ. ID NO: 5)을 사용하여 PCR에 의해 합성하였다. PCR은 Taq DNA polymerase (Stratagene, La Jolla, California)를 사용하여, 95℃, 1 분, 45℃, 2 분, 및 72℃, 3분을 1주기로 하는 반응을 25주기 수행하였다. PCR 산물을 제조자의 권고에 따라, pcDNA3.1/V5-His-TOPO 진핵세포 벡터에 결찰(ligation)하였다. 두 개의 클론, pTOPO/KY98-6, 및 pTOPO/KY98-11 (역방향 프라이머에 종결코돈이 내재 되어 있음)을 다음의 실험에 사용하였다. 회복기에 있는 감염된 말의 혈청을 사용하여, HA1의 발현을 PCR 및 웨스턴블롯으로 확인하였다. pTOPO/KY98-11을 BamHI 및 XhoI의 제한효소로 절단한 후, pVAXI의 BamHI 및 XhoI의 제한효소 부위로 결찰하여 추가의 클론 pVAX/KY98-11을 구축하였다.

DNA 면역화 및 바이러스 감염:

플라스미드 DNA를 E. coli에서 증폭한 후, 추출하고, MaxiPrep Kit (Qiagen, Valencia, California)을 사용하여 정제하였다. 상기 제조된 DNA의 농도 및 순도 는 분광분석, 및 제한효소로 절단 후 아가로스젤 전기영동을 하여 측정하였다.

DNA 백신의 경우, 상기 DNA 제제를 Dulbecco's Modified Eagle's 배지(DMEM) (Roche Applied Science, Indiapolis, Indiana)에 20㎍/ml의 농도로 희석하였다. 상기 현탁액을 동량의 lipofectamine (Roche) 용액(DMEM 중의 20㎍/ml)과 접종전 실온에서 20분간 혼합하였다.

4 내지 8 주령의 암컷 Balb/c 마우스 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine)를 4개의 그룹으로 나누었다. 비강 접종을 위해, 각 마우스를 이소플루란(forane, 1-choro-2, 2,2-trifluoroethyldifluoromethyl ether)으로 마취하였다. 마이크로파이펫으로, DNA 현탁액 25.0㎕ (접종량, 0.01 ㎍/g 체중)를 비강에 떨어뜨렸다. 두 그룹의 마우스는 DNA 백신으로 접종되었으며, 한 그룹은 pTOPO/KY98-6로, 두 번째 그룹은 pTOPO/KY98-11로 접종하였다. 두 개의 음성 대조군을 포함시켰다. 하나는 인산완충식염수 (PBS)로 두 번째는 본 실험과 관련이 없는 녹색형광 단백질을 발현하는 플라스미드 DNA 벡터(pGFP/Green Lantern, Gibco, BRL)로 접종하였다. 양성 대조군으로서, 하나의 부가의 그룹을 uv-불활성화 A/Eq/Kentucky/98로 마우스 당 접종량 8.0 HA unit (1.6 x 10⁷50%난감염접종량 [EID₅₀], 또는 1 x 10⁶ 플라크 형성 유니트 [pfu]와 동등)로 접종하였다. 동일한 양의 2회의 추가 접종을 21일 및 35일째 하였다. 바이러스 감염은 50일째 (2회째 추가 접종 후 15일 후)에 하였다. 각 마우스를 16 HA unit (3.2 x 10 ⁷ EID₅₀, 또는 2 x 10⁶ pfu와 동 등)의 상동 바이러스(A/Eq/Kentucky/98)로 비강 접종하고, 각 마우스에 대하여 그 후 10일간 체중 변화를 측정하였다.

부가하여, DNA 백신이 특정 항체반응을 유발하는지 여부를 조사하기 위하여, 0, 21, 35, 50 및 65일째에 마취 후, 눈 뒤에서 혈액을 수집하였다. 상기 시간 지점은 각각, "혈액 채취 전", 제1 및 제2 추가접종, 바이러스 감염, 및 감염 후 15일째에 해당한다.

바이러스 특이적 IgG 및 IgA의 역가 측정:

슈크로스-구배의 현탁액을 사용하여 정제된 상동 말 인플루엔자 바이러스, A/Eq/Kentucky/98를 사용하여 ELISA 플레이트를 준비하였다. 상기 바이러스를 50 mM NaHC0₃ 완충액 중에서 0.6 HA unit/ml로 희석하고, 상기 바이러스 현탁액 100㎕를 ELISA 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 항원이 플레이트 상에 "코팅"되도록 플레이트를 실온에서 24시간 동안 정치하였다. ELISA 플레이트를 PBS로 3회 세척한 후에, 블로킹 완충액 [2.0 % 소혈청알부민(BSA) 및 1.0 % 탈지유를 포함하는 PBS]을 첨가한 후 추가로 실온에서 1시간 인큐배이션 하였다. PBS로 세척한 후 100㎕의 희석 마우스 혈청(2.0 % BSA를 포함하는 PBS로 1: 10 희석)을 첨가하고, 상기와 같이 인큐배이션 하였다. 실온에서 1시간 인큐배이션하고, PBS로 세척한 후, 100㎕의 희석된 (2% BSA를 포함하는 PBS로 1: 2000) 알칼린-포스파타제-컨쥬게이트된 래빗 항-뮤린 IgG 또는 IgA 항혈청(Sigma, St. Louis, Missouri)을 첨가하였다. 실온에서 1시간 인큐배이션한 후, 플레이트를 다시 PBS로 세척한 후, 100㎕의 "기질"[1.0 mg/ml의 4-니트로페닐 포스페이트 용액 (pNPP), Sigma]을 첨가하였다. 실온에서 2.5시간 인큐배이션한 후, 마이크로 플레이트 판독기(Biotek Instruments, Winooski, Vermont)를 사용하여 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 모든 혈청 시료는 삼중으로 분석하였다. "혈액 채취 전"의 평균 흡광도를 면역된 혈청의 흡광도 값에서 빼고, 결과를 405nm 에서의 흡광도의 증가(△O. D. 405)로서 표현하였다.

DNA 백신 검증:

세 개의 DNA 백신 벡터를 구축하고 확인하였다. 이들을 PCR 및 제한효소 절단에 의해 특성을 규명하였다. 도 1에 나타낸 바대로, PCR 및 제한효소 분석은 삽입된 서열의 크기가 정확 (약 1.0 kb)하였으며, pcDNA3.1/V5-His-TOPO 및 pVAXI 벡터의 CMV 프로모터에 대하여 정확한 방향으로 삽입되었음을 나타내었다. EH3-1061STOP 프라이머에 포함된 종결코돈으로 인하여 삽입된 HA1 유전자의 번역은 pTOPO/KY98-11 벡터의 V5 에피토프 코딩서열 및 His6 tag 코딩 서열 전에서 종결된다. pVAX/KY98-11은 HA1내에 "내재된" 종결코돈을 사용한다. 반면, pTOPO/KY98-6 벡터의 경우에는, 삽입체의 번역종결은 벡터 상의 종결코돈에 의존하며, 따라서, 상기 산물은 그 카르복시 말단의 His6"tag" 및 V5에 연결된다. 회복기 말 혈청을 사용한 웨스턴 블롯 분석으로, MDBK 세포로의 전달이입 후, 양 벡터 모두 약 50 KD의 단백질을 생산한다는 것을 확인하였으며, 이는 HA1 항원의 정확한 발현과 일치 하는 것이다 (결과는 나타내지 않음).

DNA 면역화 및 바이러스 감염:

마우스는 인플루엔자 바이러스 감염에 특징적인 명백한 기도 증상을 나타내지 않기 때문에, 체중감소 모델을 사용하여 상기 DNA 백신의 효능을 평가하였다. 바이러스 감염 후 체중감소 및 후속적 회복을 기준으로 채용하여 증상의 심각성, 및 이에 따른 DNA 백신에 의한 예방 정도를 비교하였다. 바이러스 감염 후 매일 각 마우스의 체중을 재고, 그 결과를 바이러스 감염 전의 체중에 대한 체중변화 백분율로서 나타내었다. 각 그룹에 대한 평균 체중감소 플러스 평균 표준편차(SEM)를 감염 후 경과일 수에 대하여 플롯하여 도 2에 나타내었다.

예방접종된 마우스(양 DNA 백신 벡터 모두 또는 uv-불활성화 바이러스로 예방접종된 마우스)는 바이러스 감염에 의한 식욕부진, "복슬복슬한 털" 외관(발열의 증거) 및 비활동성과 같은 임상적 증상을 거의 또는 전혀 보이지 않았다. PBS로 예방접종된 음성대조군의 경우, 이들은 심각한 감염 증상을 나타내었으며, 1일째부터 체중이 감소하기 시작하였으며, 바이러스 감염 후 8일째에 최대 7.9%의 체중감소가 있었다. 체중감소는 10일이 넘게 지속하였다.

제2 음성 대조군(pGFP) 또한 최초 3일 동안 상당한 체중감소(4.6% 체중감소)를 나타낸 후, 회복하기 시작하였다. 대조적으로, 면역화된 어떤 그룹도 심각한 체중감소를 나타내지 않았다.

체중변화에 대하여 Paired Student's t-test를 수행하여 통계적 유의성을 검 증하였다. pTOPOKY98-6 및 pTOPOKY98-11을 PBS 대조군에 비교한 P 값은 각각 0.001 및 0.006이었다. 이는 양성 대조군(uv-불활성 바이러스로 면역화된 대조군)과 PBS 대조군간의 P 값인 0.0001에 필적하는 것이다. 그러므로, 양 DNA 백신 벡터 모두의 경우에 있어, 불활성 바이러스에 유도된 것과 유사한 예방성 면역을 유발하였다.

바이러스 특이적 IgG 및 IgA 의 역가측정 :

ELISA 결과를 도 3A 및 3B에 나타내었다. 상술한 바와 같이, 대조군 혈청의 O. D. 405nm를 측정하고, 결과를 삼중 웰에 대한 차 플러스 평균 증가된 O. D. 405nm 플러스 표준편차로 나타내었다. 추가예방 접종을 21일 및 35일째에 하고, 마우스를 50일째에 생바이러스로 감염하였다. 혈청을 바이러스 감염 후 15일째에 테스트하였다.

uv-불활성 바이러스 (양성대조군)로 면역화된 마우스의 경우, 바이러스 특이적 IgG를 가장 빨리는 21일째에 검출하였으며, 이때 증가된 O. D.는 0.49이었다(도 3A). 그러나, IgA의 경우는 증가한 O. D.가 0.09로 증가량이 미미하였다. 제1 추가접종 2주 후인 35일째에, IgG 농도는 3배가 넘게 증가하였다. 흥미롭게도 제2 추가 접종 후에는 추가의 증가 대신에, 50일째 IgG 농도는 실제로 35일째의 농도보다 더 낮았다. 그러나 생 바이러스로의 감염 후에는 예상한 대로, O. D.가 1.2에서 약 1.7로 변하면서 IgG 농도가 증가하였다. IgA의 경우, 유사한 패턴을 관찰하였다. 그러나 농도는 IgG보다 상당히 낮았다.

DNA 백신으로 면역된 그룹의 경우, 양 경우 모두 검출가능한 바이러스 특이적 IgG 및 IgA 반응이 있었으며, uv-불활성화 바이러스로 유도된 것과 유사한 패턴을 나타내었다. 추가 예방접종 후, 1.5 내지 2배의 IgG 및 IgA (pTOPO/KY98-6 예방접종 그룹의 경우, 각각, 0. 31에서 0.55로의 증가 및 0.17에서 0.36으로의 증가)의 증가가 있었다. 유사하게, 제2 추가접종 후에는 IgG 또는 IgA의 농도가 추가로 증가하지는 않았다. 그러나 IgG는 바이러스 감염 후 3배가 넘게 증가하였으며, IgA는 비록 2배 미만이지만 증가하였다.

흥미롭게도, 비특이적 벡터, pGFP로 예방접종된 음성대조군의 경우, 바이러스 감염 전에도 바이러스 특이적 IgG 또는 IgA가 "검출"되었다. 그러나, O. D. 0.2 미만의 증가는 비-특이적 결과일 수도 있다. 바이러스 감염 후, 일차 감염에서 예상한 대로 IgG 및 IgA 모두가 검출되었다 (도 3A 및 3B). 유사하게, PBS로 면역된 그룹의 경우, 바이러스 감염 후 15일째, IgG 및 IgA의 O. D.는 각각 1.68 ±0.12 및 0.35 ±0.03이었다 (데이터 나타내지 않음).

검토

더 적은 양의 DNA 로 예방가능

인플루엔자 비아러스를 DNA 백신연구에서 모델생물체로서 사용하였다. 이르게는 1993년에, HA 발현 플라스미드가 인플루엔자에 대한 예방을 할 수 있는 것으로 나타났다 [17] [18] [19] [13]. 그러나, 상기의 연구는

전장 HA 유전자로 구성되는 DNA 구조체를 사용하여 수행된 것이다. HA는 수용체 결합 및 막 융합을 위한 바이러스 당단백질이며, 대부분의 HA2 분자는 막관통 단백 질이다. 헤마글루티닌은 HAO 전구체로서 합성된 후, 단백질 분해효소에 의해 HA1 및 HA2으로 절단된다. HA1은 주된 보호성 항원부위를 포함하며, 이는 비공유결합에 의해 HA2에 연결되어 있으며, 이는 바이러스 피막에 고정되어 있다[20]. 본 발명자들은 여기에서 HA1의 단독 발현이 예방성 면역유발에 충분하다는 것을 보고한다. 조직 특이적 단백질 분해효소가 HAO 전구체의 HA1 및 HA2로의 절단에 필요하기 때문에, 본 발명은 HA2를 사용하지 않아 이러한 효소처리가 필요하지 않을 수 있다. 나아가, HA2의 부재시, 합성된 HA1은 막에 결합되지 않기 때문에, 더 많은 양의 HA1이 방출되게 되고, 항원제시 세포에 흡수되어 더 강력한 면역 반응을 유발하게 될 것이다. 그러므로, 본 발명의 DNA 백신을 사용하여 면역원성을 상당히 향상시킬 수 있다. 부가하면, 면역을 위해 본 발명의 DNA 백신은 더 적은 양만을 필요로 한다. 체중 1g 당 가장 적게는 0.Ol㎍ DNA를 이용하여 예방 면역을 유도할 수 있으며, 이는 Wong et al. [21]에 의해 보고된 것보다 10배 적은 양이며, 유전자 총을 이용한 접종의 경우보다 2배 더 적은 양이다 [17]. 만약 Fynan et al 이 보고한 대로, 동일한 접종량을 평균 몸무게가 400 kg인 말에 적용할 경우, 필요한 DNA는 접종 당 4.0 mg이라는 것을 주목해야 한다.

나아가, 더 적은 양의 DNA로의 면역화, DNA 백신의 피막 및 점막 부위에서의 접종에 의해, DNA의 체세포 또는 생식세포로의 잠재적인 삽입이 상당히 감소된다.

IgA 의 역할

인플루엔자 바이러스는 기도에서 감염을 개시한다. 많은 종전의 연구에서 보는 바와 같이, 점막 면역은 인플루엔자 바이러스 또는 기타 기도 감염에 대한 예방에 있어 중요하다[22,23]. 분비성 IgA는 점막 면역에서 중대한 역할을 한다. IgA는 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 방어를 책임지는 것으로 나타났다 [24]. 나아가, 인플루엔자-특이적 IgA의 수동적 전달도 수용체 마우스를 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 보호한다 [7]. Lunn et al.은 조랑말에서 말 인플루엔자 바이러스에 대한 DNA 백신을 연구하였다[15]. 유전자 총을 사용하여, DNA 백신을 혀, 결막, 및 제3안검을 포함하는 수 개의 점막 부위에 전달하였다. 각각의 경우에, 강한 IgG 반응이 유발되었다. 그러나, IgA 반응 유도는 불량하였다.

상기 결과는 DNA 백신의 리포좀으로의 피막화 및 상기 DNA 백신의 기도로의 전달에 의해, 보다 나은 점막 면역이 유발됨을 나타낸다. 상기 예방은 추측컨대, 혈청에서의 상응하는 바이러스 특이적 IgA의 증가로부터 알 수 있듯이, 기도에서 (점막 부위에서의)의 IgA에 의해 매개된다.

추가접종 및 비특이적 면역

상기 결과는 바이러스 특이적 IgG 또는 IgA의 역가가 증가하지 않기 때문에, 제2 추가접종은 필요하지 않을 수 있다는 것을 암시한다. 아마도, 제1 추가접종 후의 역가가 수주 동안 잔존하기 때문에, 이는 제2 추가 접종을 불필요하게 할 수 있다. 대안적으로, 바이러스 특이적 항체의 존재가 제2 추가접종으로 도입된 추가의 항원을 중화시킨다.

흥미롭게도, DNA로 예방접종된 그룹의 경우, 바이러스 감염 후, IgG 농도가 3배 넘게 증가하였다 (pTOPOKY98-6 및 pTOPOKY98-ll 모두의 경우, 도 3A 참조). 대조적으로, uv-불활성화 바이러스의 경우 1배 미만의 증가가 있었다. 이러한 관찰은 DNA 백신이 양호한 초기 반응을 유도한다는 다른 연구자에 의한 종전의 보고에 필적하는 것이다. 이러한 DNA 백신에 의한 "예방성(anamnesty)" 반응은 아마도 불활성화된 항원에 의해 유발된 것과 비교하여 DNA 백신의 항원제시 경로 및 카이네틱스의 차이에 기인하는 것이다. 나아가, DNA 백신에 의한 면역반응의 유도를 위한 실제 이용가능한 항원의 양을 결정하기는 어려우며, 이러한 향상된 "시동효과" 기전을 앞으로 밝혀져야 한다.

또한, pGFP (음성대조군으로 사용)로 접종된 마우스의 경우, 다른 음성대조군(PBS)과 비교하여 상당히 이른, 3일째 체중감소가 최고조에 달하여, 4일째에 회복하기 시작하였다. PBS 대조군에 대한 paired Student's t- test 결과 P 값이 0.033이었다. 그러나, 이들 마우스는 PBS 대조군과 유사한 임상적 특징이 있었다. 나아가, 체중감소도 바이러스 감염 후 최초 3일의 경우는 PBS 대조군에 필적하였다. 만약 진정한 예방에 대한 기준이 임상적 증상이 전혀 없는 것이라면, 이들 마우스는 P 값이 유의적이라도 "예방"되지 않은 것이다. 바이러스 감염 전에 바이러스 특이적 항체가 검출되지 않았기 때문에(흡광도 값은 배경 값 수준이었다t). 상기 "이른 회복"은 특이적인 면역에 기인하는 것이 아니다. DNA 백신 벡터의 특정 모티브가 비-특이적 면역을 유발한다는 것은 주지된 것이다. 점막 부위로의 리포좀의 도입이 또한 비-특이적 면역을 유발할 수 있다.

추가의 데이터

말에서의 점막 면역을 위한 추가의 프로토콜을 확립하기 위해, 수개의 말을 본 발명의 DNA 백신으로 비강 접종하고, 수주 후에 비강 세척물을 검사한 결과, 바이러스 특이적 항체에 대한 양성 결과를 나타내었다.

도 1은 예시적 구현예로서, 본 발명의 DNA 백신의 도식적 지도이다.

A/Eq/Kentucky/98의 HA1 유전자를 진핵세포 발현벡터 pcDNA3.1/V5-His-TOPO 또는 pVAXl (양 벡터 모두 Invitrogen (Carlsbad, California)사에서 구입가능)에 삽입하였다. 구축한, 말-2 인플루엔자 바이러스 (예로서, A/Eq/Kentucky/98)의 HA1을 발현하는 벡터 중에서, pTOPO/KY98-6는 벡터에 있는 종결코돈을 사용하는 반면, pTOPO/KY98-11 및 pVAX/KY98-11의 경우는 종결코돈이 PCR 동안 역방향 프라이머에 의해 제공된다. 삽입체: A/Eq/Kentucky/98의 HA1의 아미노산 서열 (GenBank Accession No. AF197241). 신호 펩타이드는 첫 번째 줄에 나타낸다. 박스 서열: 항원성 부위 A (132-146); 부위 B (187-199); 부위 C (51-55,273-278) ; 및 부위 D (171-174,209-217, 241-246). V5: V5 에피토프; His6: 6개 히스티딘 tag; BGHpA : 소성장 호르몬 폴리아데닐화 서열.

도 2는 상술한 체중감소 연구의 실험 결과를 나타내는 그래프이다. 감염된 마우스에서의 체중감소 백분율은 바이러스 감염 후 경과일수로서 플롯한다. 불활성화된 KY98 : 양성대조군; PBS 및 pGFP : 음성대조군. pTOPO/KY98-6 및 pTOPO/KY98-11: DNA 백신 면역그룹. PBS 대조군과 pTOPO/KY98-6 및 pTOPO/KY98-11 면역그룹간의 Student's t-test에 의한 P값은 각각 0.001 및 0.006이다.

도 3a는 상술한 바이러스 특이적 혈청 IgG에 대한 ELISA의 실험결과를 나타내는 그래프이다. 추가접종을 21일 및 35일째에 하였다. 바이러스 감염은 *에 의해 나타낸 대로, 제2 추가접종 후 15일째인 50일째, 및 감염 후 15일째에 하였다.

도 3b는 상술한 바이러스 특이적 혈청 IgA에 대한 ELISA의 실험결과를 나타내는 그래프이다. 추가접종을 21일 및 35일째에 하였다. 바이러스 감염은 *에 의해 나타낸 대로, 제2 추가접종 후 15일째인 50일, 및 감염 후 15일째에 하였다.

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상술한 내용을 참조하면, 수 개의 본 발명의 목적을 달성되고, 기타 유리한 효과가 수득되었음을 알 것이다. 본 발명의 범위를 벋어나지 않으면서, 다양한 변형이 가해질 수 있기 때문에, 상술한 설명 및 수반하는 도면에 있는 모든 내용은 단지 예시적인 것으로 해석될 것이지 제한의 의미로 해석되는 것은 아니다. 본 발명은 어느 정도 구체적으로 설명하였지만, 본 발명은 예시적인 목적의 실시예로 한정되는 것은 아니며, 본 발명은 단지, 청구항에 기재된 각 구성요소의 완전한 범위의 균등범위를 포함하는, 첨부된 청구항의 범위로만 한정되는 것이다.

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하기의 문헌은 본원에 참조로 도입되었다:

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Claims

말 인플루엔자 바이러스에 대한 백신에 있어서, 면역에 유효한 양의 분리된 DNA 및 약리학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하며, 상기 분리된 DNA는 말-2 인플루엔자 바이러스 균주(strain)의 HA1 코딩서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 말 인플루엔자 바이러스에 대한 백신.
제 1 항에 있어서, 상기 HA1 코딩서열은 A/Eq/Kentucky/98, A/Eq/Miami/63, A/Eq/Kentucky/81, A/Eq/Fontainebleau/79, A/Eq/Kentucky/94, A/Eq/Newmarket/2/93, A/Eq/New York/99, 및 A/Eq/Oklahoma/2000 바이러스 균주로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신.
제 1 항에 있어서, 상기 HA1 코딩서열은 A/Eq/Kentucky/98 바이러스 균주 유래인 것을 특징으로 하는 백신.
제 1 항에 있어서, 상기 HA1 코딩서열은 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 1 항에 있어서, 부가적인 항원성 성분, 부가적 항원성 성분을 코딩하는 서열, 및 기타 백신을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 1 항에 있어서, 상기 HA1 코딩서열을 함유하는 벡터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 6 항에 있어서, 상기 벡터는 진핵세포 발현벡터인 것을 특징으로 하는 백신.
제 7 항에 있어서, 상기 벡터는 pcDNA3.1/V5-His-TOPO 및 pVAXI로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신.
제 1 항에 있어서, 애주번트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 9 항에 있어서, 상기 애주번트는 프로인트 완전애주번트, 프로인트 불완전애주번트, 사포닌, 미네랄 젤, 계면활성제, 플루론 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀젼, 키홀림펫 헤모시아닌 및 디니트로페놀로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신.
제 9 항에 있어서, 상기 애주번트는 METASTIM
인 것을 특징으로 하는 백신.
제 1 항에 있어서, 상기 HA1 코딩서열을 피막하는 리포좀을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
말 인플루엔자 바이러스에 대한 면역반응 유도 방법에 있어서, 말에게 면역에 유효한 양의 제 1 항의 백신을 접종하는 것을 포함하는, 말 인플루엔자 바이러스에 대한 면역반응 유도 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 HA1 코딩서열을 벡터에 삽입하는 단계 및 상기 백신을 비강으로 접종하여 기도로 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 벡터는 진핵세포용 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 상기 벡터는 pcDNA3.1/V5-His-TOPO 및 pVAXI로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 상기 벡터는 리포좀인 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 백신은 체중 1g 당 0.01㎍ 이상의 DNA 양으로 접종되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 백신은 체중 1g 당 0.001㎍ DNA 내지 0.01㎍ DNA의 범위의 양으로 접종되는 것을 특징으로 하는 방법.