KR20050117958A

KR20050117958A - 복방 생약 추출물이 함유된 나노 리포좀 조성물 및 이를이용한 피부 미백용 화장료

Info

Publication number: KR20050117958A
Application number: KR1020040043252A
Authority: KR
Inventors: 이순근; 김주현; 윤세준; 조용백; 한창균; 표성수; 신정주
Original assignee: 에스케이케미칼주식회사
Priority date: 2004-06-12
Filing date: 2004-06-12
Publication date: 2005-12-15

Abstract

본 발명은 복방 생약 추출물이 함유된 나노 리포좀 조성물 및 이를 이용한 피부 미백용 화장료에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 천화분, 하고초 및 위령선을 적정비로 혼합 추출하여 수득된 복방 생약 추출물을 유효성분으로 함유하고, 수소화된 레시친, 글리세린, 카프리릭ㆍ카프릭트리글리세라이드, 콜레스테롤 및 정제수 등을 일정량 첨가하여 나노 사이즈의 리포좀을 얻음으로써 유효성분의 장기간 보관 안정성, 경피흡수성, 보습지속성 향상은 물론 소량의 추출물을 유효성분으로 함유해도 미백개선 효과, 항산화 효과, 자외선에 의한 자극억제 효과가 뛰어나면서 매우 안정한 피부 미백용 화장료에 적용가능한 나노 리포좀 조성물에 관한 것이다.

Description

복방 생약 추출물이 함유된 나노 리포좀 조성물 및 이를 이용한 피부 미백용 화장료{Topical nano liposome formulation including extracted purified herbal mixture and whitening cosmetics using this formulation}

현대인의 피부는 자외선, 환경오염 등 외부의 각종 유해환경 및 스트레스에 노출되어 손상받고 있으며, 고령화되면서 피부의 생리활성이 저하되어 손상된 피부의 회복속도가 느려져 건조, 탄력저하, 주름형성, 피부 민감화 등의 다양한 피부 노화현상을 경험하게 된다. 또한, 오존층 파괴로 인한 자외선 과다 노출로 피부색소 침착에 의한 기미, 주근깨 등이 생성된다. 이러한 노화현상 중 특히 동양여성에 있어서 미백효과에 거는 기대는 매우 높으며, 이러한 피부색소 침착의 개선을 통한 맑고 하얀 피부를 만들기 위해서는 형성된 멜라닌을 담색화 하거나 생성자체를 억제해야 한다. 따라서, 노화현상과 피부색소 침착을 개선하기 위하여 다양한 화장료가 개발되고 있으나, 대부분이 단방약제나 기존 합성 미백원료로 멜라닌 형성을 저해하는 제품에 편중되어 있을 뿐만 아니라 미백제가 제형에 적용되어도 통상의 사용조건에서 변색, 변취, 제형의 불안정성을 유발하는 등의 미백효과를 극대할 수 없는 단점을 가지고 있었다.

특히, 기존의 합성 미백제, 예를 들면 코직산은 티로시나제의 활성부위에 존재하는 구리이온을 흡착시켜 효소활성을 저해하는 반면, 화장품에 배합 시 불안정성과 피부부작용의 문제가 있고, 비타민-C 및 그 유도체는 산화가 잘되는 불안정성 때문에 화장품 원료로서 사용이 어려우며, 하이드로퀴논은 피부에 대한 미백효과는 탁월하지만 알러지를 유발하는 성질, 멜라닌 세포에 대한 독성, 피부에의 영구 탈색화등 피부에 대한 자극성이 높아 각 나라별로 제한적인 농도만 허가하고 있으며, 알부틴은 하이드로퀴논에 글루코피라노사이드(Glucopyranoside)가 결합된 유도체로 하이드로퀴논 사용 시 나타나는 부작용이 적으면서 인체에 대한 독성은 없이 멜라닌 색소의 합성을 억제하는 작용이 있어, 멜라닌 색소 침착이 증가되는 피부질환의 치료제로서 이용가능성이 제시되었으나, 피부효소에 의해 일부 분해되는 단점이 있다,

따라서, 근래에는 식물의 생약성분을 추출하여 그 추출액을 미백 화장료로 사용하는 방법에 관한 많은 연구가 행해져 왔으며, 상백피 성분을 이용한 미백 화장료[일본특허공개 소55-44375호], 감초의 성분을 이용한 미백 화장료[일본특허공개 소60-214721호]를 비롯하여 고삼, 녹차, 월귤나무엽, 산수유 등 다수의 생약성분을 이용한 미백 화장료들이 알려진 바 있다.

그러나, 이러한 종래의 식물 추출물을 활용한 미백 화장료들은 대부분 단일추출물이거나 복합추출물이라 하여도 높은 농도로 사용해야 효과가 있어, 제형 적용농도의 한계성과 장기 보관 시 변색, 변취 등의 문제점이 있었다.

한편, 리포좀을 활용한 약물전달 및 유효성분의 안정화 기술은 제약분야 뿐만 아니라 화장품, 식품분야에서도 생리학적 물질의 전달매개체로 많이 연구되고 있다. 그러나, 이러한 리포좀은 생체막과 구조가 비슷한 특성을 가지고 있어도 외용도포제형이 주를 이루는 화장료에 있어 그 입자가 초미립자화 되지 않으면 각질세포를 통과하여 흡수되는 것은 한계성이 있으며, 그래서 각질 세포간 지질을 통과하는 경로가 일반적이어서 경피 흡수성을 극대화하기가 어려웠다.

리포좀 형성물질인 지질은 지방족 탄화수소쇄를 가지는 물질로 지방산, 글리세라이드, 장쇄알코올, 스핑고지질, 인지질, 당지질, 스테롤 등으로 대표된다. 이것은 화장료 배합성분으로도 잘 알려져 있고, 피부친화성이나 안전성향상, 생체기능막에 의한 유효성향상등의 응용화 연구가 진행되고 있으나, 실제적용 사례는 적은 편이다. 이는 지질특유의 유효성을 발휘하기 위해서는 제제 안정성을 확보해야 하는데, 이를 구성하는 성분인 인지질, 스테롤, 스핑고지질, 세라마이드 등은 수용액 중에 안정하게 배합하는 것이 쉽지 않고 이를 특수유화기계로 안정화하여도 장기안정성이 약화되는 등 나노형태로 만드는 것이 어렵기 때문이다.

이 지질로 구성된 리포좀이 화장품 제제로서의 장점은 수용성 및 유용성 활성성분 모두를 막 내부에 내포 가능한 점, 생체유래성분으로 생체적합성 및 자극성이 낮은점, 경피흡수성을 높일 수 있는 점, 보습효과의 지속성 향상할 수 있는 점등 많은 장점에도 불구하고 유효성분 내포량의 제한성과 제형 적용시 불안정성 때문에 응용분야의 확대는 미미한 편이었다.

따라서, 리포좀의 막구성성분인 인지질(레시친)은 다음과 같은 제한요건으로 적용면에서 여러 가지 한계성을 나타냈다. 즉, 인지질의 과산화물가나 산가가 낮을 것, 질소치환을 충분히 행한 것, 초기의 pH를 6 ∼ 7로 설정할 것, 등장제로서 당또는 다가알코올류를 이용할 것, 리포좀 제제 중의 인지질의 장기보존안정성이 포스파티딜콜린성분의 순도와 지방산조성에 영향을 받는 점, 인지질 단독으로는 염이나 전하를 지닌 성분에 의해 계면막이 파괴되기 쉬운 점, 열이나 pH조건 미생물에 의해 가수분해되기 쉬운 점, 인지질을 구성하는 지방산에 불포화 결합이 존재하면 지질의 유동성이 좋아 각질세포사이의 간극을 쉽게 통과할 수 있지만 지질견고성이 약하고 인지질에 존재하는 이중결합의 안정도가 낮아 경시적으로 pH가 낮아지고 분산물의 응집이나 변취 등의 변화를 일으키는 점, 포화지방산 유래 인지질(수소화된 레시친)은 물리화학적 안정성이 뛰어나기 때문에 포화레시친으로 제조된 리포좀은 제조, 보관 중 산화안정성이 좋지만 수소화된 포화탄화수소의 지방산 사슬의 융점이 실온보다 높아 지질견고성 때문에 각질층 지질과 융합에 의한 경피 흡수가 쉽지 않으며, 실온 근처에서 겔-액정상전이 온도 영역이 존재해 지질이분자막에 상변화를 일으키고 내포성분의 배출이나 리포좀 자신이 응집을 일으키는 등의 단점이 있어 화장품의 일반적인 보관조건 및 사용환경에서 안정한 리포좀을 만들기 어려웠다. 특히, 스킨과 같은 가용화를 기반으로 한 투명제품 또는 저점도 액상제품에서 제형내의 전하를 띈 물질들과 결합하여 침전발생의 우려가 있고, 외부의 자외선 등 물리적 요인에 의해 색상변화가 발생하는 문제가 있기도 하였다.

따라서, 본 발명은 복방 생약 추출물을 나노 리포좀 기술을 활용하여 안정화하였으며, 나노 리포좀 조성물을 화장료에 적용함에 따라 변색, 변취, 유효성분의 활성저하 등의 취약점을 극복하여 멜라닌 생성 억제, 항산화, 자외선에 의한 자극경감 등 복합적인 피부 미백기작에 적합성을 검증하였다. 또한, 유효성분의 경피흡수성을 향상하여 소량의 추출물만으로도 효능을 향상시키고자 하였다

본 발명에 있어 복합적인 미백기작을 발휘하는 여러 가지 성분 중 천화분, 하고초, 위령선 복방생약 추출물이 알부틴과 같은 티로시나제 저해활성이 뛰어날 뿐만 아니라 비타민C와 같은 항산화작용, 감초산과 같은 자극경감 효과 등 자외선노출에서 멜라닌 형성단계까지 미백에 필요한 여러 가지 복합적인 효능을 갖는 물질임을 확인하였다.

이에, 본 발명자들은 이러한 리포좀의 안정화 문제를 연구한 결과, 상기 복방 생약 추출물을 함유하기에 적합한 나노 리포좀을 제공하여, 피부자극이 적고 유효성분의 경피흡수율이 뛰어나면서도 내포된 성분의 안정도가 우수한 나노 리포좀 함유 피부 미백용 화장료를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 천화분, 하고초 및 위령선의 복방 생약 추출물을 함유한 나노 리포좀 및 이를 이용한 피부미백효과, 항산화효과, 자외선에 의한 자극완화효과가 모두 우수하면서도 경피흡수가 잘되는 피부 미백 화장료를 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 천화분, 하고초 및 위령선의 복방 생약 추출물을 0.01 ∼ 20.0 중량%를 함유하는 나노 리포좀을 그 특징으로 한다.

또한, 상기 나노 리포좀을 함유하는 피부 미백 화장료를 또 다른 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 천화분, 하고초 및 위령선을 적정비로 혼합 추출하여 수득된 복방 생약 추출물을 유효성분으로 함유하고, 수소화된 레시친, 글리세린, 카프리릭ㆍ카프릭트리글리세라이드, 콜레스테롤 및 정제수 등을 일정량 첨가하여 나노 사이즈의 리포좀을 얻음으로써 유효성분의 장기간 보관 안정성, 경피흡수성, 보습지속성 향상은 물론 소량의 추출물을 유효성분으로 함유해도 미백개선 효과, 항산화 효과, 자외선에 의한 자극억제 효과가 뛰어나면서 매우 안정한 피부 미백용 화장료에 적용가능한 나노 리포좀 조성물에 관한 것이다.

먼저, 생약 추출물로 사용한 천화분(Trichosanthes kirilowii Var)은 다년생 덩굴성 초본인 하눌타리의 뿌리를 가을에 캐내 깨끗이 씻어 외피를 깍아내고 적당한 길이로 잘라 햇볕에 말린 것을 약재로 사용하여온 무독한 생약이다. 지금까지 알려진 성분으로는 단백질류인 트리코산틴(Trichosanthin)이 가장 널리 알려져 있고 그 외 아미노산 성분으로는 아르기진(Arginin), 시트룰린(Citrulline)이 있으며 지방산으로서 팔미틴산(Palmitic acid), 리놀산(Linoleic acid)이 알려져 있다. 최근에는 브리오놀산(Bryonolic acid), 쿠쿠르비타신(Cucrbitacin)및 알파-스피나스테롤(a-Spinasterol) 등의 스테놀류가 밝혀져 있으며 한방에서는 소갈병을 멈추게 하고 각종 종기, 타박상, 피부습진, 상처소독, 치루유선염 등에 유효하며 배농, 해독, 해열작용에 이용되어 왔다[한국유용식물자원 연구총람, 한국화학연구소 1988, 도해향약 대사전-영림사1990]

하고초(Prunella vulgaris Linne)는 다년생 초본식물 중에서 꿀풀과 식물 하고초 및 동속근연식물의 과수로서 여름에 채집하여 이삭이 반정도 시들면 채집하여 햇빛에 말려 약재로 사용한다. 하고초의 성분으로는 올레아놀산(Oleanolic acid), 우르솔린산(Ursolic acid)등의 사포닌류와 카로틴(Carotine), 비타민C(Vitamine C), 비타민K(Vitamin K), 탄닌(Tannin), 카페인산(Caffeic acid), 클로르제닌산(Chlorogenic acid), 로스마리닌산(Rosmarinic acid)등이 알려져 있으며 한방에서는 만성적인 종기, 두창, 급성유선염 및 임파선 결핵 등에 사용되어 왔다[한국유용식물자원 연구총람, 한국화학연구소 1988, 하고초성분연구 이작평 외 3인, 북경의과학대학학보1991, 중약대사전].

위령선(Clematis chinensis Osbeck)은 으아리 및 미나리아제비과 식물 위령선의 뿌리를 일컫는 것으로 가을에 채취하여 뿌리를 썰어서 햇볕에 말린 것을 약재로 사용하여온 무독한 한방생약이다. 이제까지 알려진 성분으로는 크레마틴(Clematin), 크레몬타노 사이드(Clemontanoside), 크레마토사이드(Clematoside)등의 사포닌류 등이 있으며, 이외에도 아네모닌(Anemonin), 아네모놀(Anemonol), 스테롤(Sterol), 당류(Glucose), 락톤(Lactone), 아미노산(Amino acid) 등이 알려져 있으며 한의서의 질병적용예는 전염성 간질환, 결막염, 편도염등의 증상을 가진 질병에 널리 사용되어 왔다[한국유용식물 자원연구총람, 한국화학연구소 1988, 도해향약대사전-영림사, 1990].

또한, 본 발명은 상기 천화분, 하고초 및 위령선을 일정비율 혼합 사용하여 복방 생약 추출물 및 이를 함유하는 나노 리포좀을 다음과 같이 제조한다.

천화분, 하고초 및 위령선을 각각 0.5 ∼ 2.0 : 0.5 ∼ 1.5 : 1의 중량비로 혼합하는 것이 바람직한데, 이는 복방 생약 추출물의 피부미백효과, 항산화 효과, 자외선에 의한 자극억제 효과가 최대로 상승되기 때문이다.

상기 복방 생약 추출물을 추출함에 있어서 추출용매는 물 또는 알코올성 수용액으로 추출하는 단계와 상기 추출단계에서 얻어진 여액을 동량의 수포화 n-부탄올을 첨가하여 층분리한 후, n-부탄올층만을 모아 감압농축한 후 동량의 물을 가해 현탁시켜 동결건조하여 최종 추출물을 제조하는 단계를 거쳐서 만들어진다. 또는 상기의 동일추출단계에서 동량의 에탄올을 첨가하여 에탄올층을 분리한 후 에탄올층만을 모아 최종추출물을 제조하는 단계를 거쳐서 만들 수 있다.

상기와 같은 복방 생약 추출물의 유효성분을 보호, 안정화시켜 피부침투가 용이하도록 하기 위하여 나노 리포좀에 내포시킨다.

상기 복방 생약 추출물은 나노 리포좀의 총 중량에 대하여 0.01 ∼ 20.0 중량%로 함유되는 것이 바람직하다. 이때, 복방 생약 추출물의 함량이 0.01 중량% 미만이면 제형적용시 효과를 기대하기 어렵고 20.0 중량%를 초과하면 뚜렷한 효력상승이 나타나지 않고 피부 도포시 착색되는 단점이 있다.

상기의 방법으로 제조된 복방 생약 추출물을 함유하는 나노 리포좀은 전체 리포좀 조성 중량에 대하여 수소화된 레시친 10 ∼ 15 중량%, 글리세린 10 ∼ 50 중량%, 카프릴릭ㆍ카프릭트리글리세라이드 10 ∼ 40 중량%, 콜레스테롤 0.3 ∼ 2.0중량% 및 정제수 3 ∼ 70 중량%를 포함하여 고압미세균질기에 수회 통과시켜 나노사이즈의 리포좀을 제조한다. 이때, 수소화된 레시친의 함량이 10 중량% 미만 사용하면 100 나노사이즈 이상의 입자가 되어 경피흡수가 줄게 되는 문제점이 있고, 15 중량% 초과하면 더 이상 나노입자가 작게 되지 않으면서 피부자극성이 높아지는 문제점이 있다. 또한, 글리세린의 함량이 적으면 추출물의 용해성이 낮아 석출의 염려가 있고, 그 함량이 높으면 피부에 자극을 초래할 수 있기 때문에 바람직하지 못하다. 또한, 카프릴릭ㆍ카프릭트리글리세라이드의 상기 함량은 나노 리포좀의 보조형성제로서의 역할과 피부흡수도와 안전성에 적합성을 주는 함량으로서, 10 중량% 미만 사용하면 복합생약추출물의 용해성에 문제점이 있고, 40 중량% 초과하면 나노입자가 크지는 문제점이 있다. 또한, 콜레스테롤의 함량이 0.3 중량% 미만 사용하면 계면막강화제로서의 역할을 못하는 문제점이 있고, 2.0 중량% 초과하면 제조과정에서 가열온도를 높여야 하기 때문에 복방생약추출물의 활성도가 떨어지는 문제점이 있다. 정제수의 함량이 3 중량% 미만 사용하면 복방생약추출물의 용해성에 문제점이 있고, 70 중량%를 초과하면 나노리포좀 제조후 입자응집으로 경시변화 안정성이 떨어지는 문제점이 있다.

상기에서 제조된 나노 리포좀은 입자크기가 20 ∼ 100 nm이고, 바람직하게는 30 ∼ 50 nm이며, 수용성이거나 폴리올 용해성, 반지용성의 복방 생약 추출물을 과량 내포할 수 있으면서, 장기간 보관 안정성, 경피 흡수성, 보습지속성 향상은 물론 소량의 추출물을 유효성분으로 함유해도 미백개선 효과, 항산화 효과, 자외선에 의한 자극억제 효과가 뛰어나므로 피부 미백 화장료로 사용할 수 있다.

따라서, 상기 복방 생약 추출물을 함유한 나노 리포좀을 화장료에 적용시, 유연화장수, 수렴화장수, 로션, 에센스, 크림, 겔, 팩, 비누, 에센스시트, 하이드로겔 패취 또는 마스크, 자외선 차단제품 등 다양한 제형에 적용가능하며, 특히 액상 또는 투명화장료에도 적용이 가능하다. 또한, 상기 나노 리포좀은 전체 화장료 조성에 대하여 0.01 ∼ 20 중량% 배합하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 단방 생약 추출물의 제조

천화분, 하고초, 위령선을 활용하여 피부기작에 적합한 천연미백제를 개발하기 위해 각각의 생약재 150 g을 잘게 세절하여 음건한 다음 환류냉각기를 부착시킨 둥근 플라스크에 넣은 뒤, 생약재 중량의 10배에 해당하는 물, 에탄올, 부탄올, 에틸아세테이트 및 클로로포름 용매를 각각 넣고 수욕상에서 80 ±5 ℃로 6 ∼ 8시간 가온추출하였다. 여과한 다음 감압 농축하여 얻어진 각각의 추출물을 대상으로 수율[표 1] 및 실험예 1과 같이 머쉬룸 티로시나제 활성법으로 미백효능시험을 예비로 실험하였으며, 그 결과를 토대로 효능을 극대화할 수 있는 복방 생약 추출물의 제조방법인 실시예 2와 실시예 3의 미백효능을 실험하여 다음 표 2에 나타내었다.

실시예 2: 복방 생약 추출물의 제조(1)

건조된 상태의 위령선을 수도물로 세척하여 음건한 것 100 g, 1 ∼ 2 cm로 세절된 천화분 200 g, 늦여름에 채취된 하고초의 과수 부분 100 g을 고루 섞은 후 4 ℓ의 물을 가해 잘 교반하여 준 후, 80 ±5 ℃로 6 ∼ 8시간 가온 추출하여 여액을 모으고 잔사에 대해서 3 ℓ의 물을 가해 3시간 정도 가온 추출하여 여액을 모두 합하였다. 여기에 동량의 에탄올을 가하여 섞은 후 원심분리하여 상등액을 모아 55 ∼ 60 ℃로 생약 추출물이 건조될 때까지 감압농축하여 21 g의 추출물을 얻었다. 얻어진 추출물을 액체 크로마토그라피법에 의해 분석한 결과, 각 지표성분의 함량은 올레아놀산 0.62%, 로스마린산 0.08%였다.

실시예 3: 복방 생약 추출물의 제조(2)

건조된 상태의 위령선을 물로 세척하여 부착물을 제거한 것 300 g, 1.0 ∼ 2.0 cm로 세절된 천화분 600 g, 늦여름에 채취된 하고초의 잎과 과수부분 300 g을 고루 섞은 후 12 ℓ의 물을 가해 잘 교반하면서 80 ±5 ℃에서 6 ∼ 8시간 가온 추출하여 여액을 모으고 잔사에 대해서 5 ℓ의 물을 가해 3시간 정도 가온 추출하여 여액을 모두 합하였다. 여기에 동량의 수포화 n-부탄올을 가하여 3회 층분리한 후 n-부탄올층만을 모아 55 ∼ 60 ℃로 생약추출물이 건조될 때까지 감압농축한 후 동량의 물을 가해 현탁시켜 동결건조하여 28 g의 추출물을 얻었다. 얻어진 추출물을 가스크로마토그래피에 의해 분석한 결과, 잔류 n-부탄올의 양은 136 ppm이었고, 액체 크로마토그래피법에 의해 분석한 결과, 지표성분의 함량은 올레아놀산 6.18%, 로스마린산 0.43%였다.

실험예 1: 머쉬룸 티로시나제 활성억제를 통한 미백효과실험

96 웰 플레이트의 각 웰에 농도별 시험물질 및 양성대조물질 40 ㎕를 넣고 이어서 각 웰에 0.1M 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 6.5) 100 ㎕와 머쉬룸 티로시나제(Mushroom tyrosinase) 2000 units/㎖를 20 ㎕ 및 1.5 mM L-티로신 40 ㎕를 넣었다. 37 ℃ 배양기에서 10분간 반응시킨 후 ELISA 리더(VERSAmax)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시험물질 및 음성대조군의 Balnk 흡광도를 보정한 후 음성대조군을 기준으로 티로시나제 활성 저해율(%)을 다음 수학식 1에 의해 구하였으며, 구해진 티로시나제 활성 저해율의 50 %를 저해하는 각 물질의 농도를 IC₅₀로 나타내었다. 그 결과를 다음 표 2에 나타내었다.

As : 시험물질의 O.D. 값

Asb : 시험물질 Balnk의 O.D 값

Anc : 음성대조군의 O.D 값

Ancb : 음성대조군 Balnk의 O.D 값

각 추출물의 수율(중량%)

추출용매	천화분	하고초	위령선	천화분:하고초:위령선(2:1:1)
물	16.6	29.3	19.6	22.3
에탄올	5.9	13.7	6.8	8.2
부탄올	1.4	1.9	1.3	1.6
에틸아세테이트	1.7	3.4	2.1	2.5
클로로포름	1.3	2.6	1.9	1.8
실시예 2	-	-	-	5.2
실시예 3	-	-	-	2.3

구분	IC₅₀(ppm)
음성대조군(시료 무처리)	-
비타민 C	95.9
알부틴	531.9
유용성 감초 추출물	54.3
상백피 추출물	214.1
녹차 추출물	1000 <
천화분 열수 추출물	245.2
천화분 에탄올 추출물	86.7
천화분 부탄올 추출물	98.9
천화분 에틸아세테이트 추출물	102.4
천화분 클로로포름 추출물	114.3
하고초 열수 추출물	356.2
하고초 에탄올 추출물	241.8
하고초 부탄올 추출물	172.0
하고초 에틸아세테이트 추출물	188.7
하고초 클로로포름 추출물	212.6
위령선 열수 추출물	298.3
위령선 에탄올 추출물	162.5
위령선 부탄올 추출물	152.0
위령선 에틸아세테이트 추출물	196.7
위령선 클로로포름 추출물	231.1
실시예 2 추출물	68.0
실시예 3 추출물	87.9

본 실험예는 피부 색소 침착의 원인 중 하나인, 멜라닌생성 억제효과를 버섯티로시나제 활성 억제율을 통하여 증명한 것으로, 실시예 2와 실시예 3의 복방 생약 추출물이, 양성대조군인 유용성 감초 추출물보다는 다소 효능이 미약한 것을 제외하고는 비타민C보다는 약간 효능이 높게 나왔으며, 알부틴보다는 우수한 효능이 있음을 알 수 있고, 단방 추출물로는 천화분 에탄올추출물이 비타민C와 알부틴보다 효과가 좋았으며, 전반적으로 천화분, 하고초, 위령선 단독 추출물이거나 이를 혼합하여 추출한 복방 생약 추출물이든 관계없이 상기의 추출용매로 추출한 물질에서 티로시나제 활성억제 효과가 높아 천연물 미백제로서의 가능성을 검증하였다.

실험예 2: B16/F10 멜라닌 생성 세포를 이용한 미백 효능실험

① MTT 분석

96 웰 플레이트의 각 웰에 한국세포주은행에서 분양받은 B16 멜라닌 생성 세포를 2.5 ×10³ cell/웰(Final volume 200 ㎕)로 넣고 37 ℃, 5% CO₂인큐베이터(MCO-20AIC, Sanyo)에서 24시간 배양한 후 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium)으로 갈아주었다. 각각의 웰에 상기에서 추출한 시료 및 기존 미백원료 2 ㎕씩 첨가한 후 인큐베이터에서 72시간 배양하고 배양이 끝나기 3시간 전 20 ㎕의 MTT용액(5 mg/㎖ in DMEM)을 각 웰에 넣었다. 배양이 끝나면 각 웰의 배양액을 제거하고 150 ㎕의 DMSO 용액을 여기에 넣는다. ELISA 리더를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였으며 시료 대신 DMSO를 처리한 음성대조군을 기준으로 세포생존율(%)을 다음 수학식 2에 의하여 구하였다.

② 티로시나제 활성 저해 측정

6 웰 플레이트의 각 웰에 B16/F10 멜라닌 생성 세포를 1 ×10⁵ cell/웰(Final volume 3 ㎖)을 넣고 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양한 후 각 웰에서 배지를 제거하고 새로운 DMEM으로 갈아주었다. MTT 분석 결과 설정된 독성이 없는 농도의 시험물질을 각각의 웰에 30 ㎕씩 첨가하고 인큐베이터에서 24시간 배양한 뒤 배양액을 제거하고 PBS를 1 ㎖씩 넣고 세척하였다. 각 웰에 1 ㎖의 라이시스 버퍼(1% Triton X-100과 1% 0.1mM PMSF이 함유된 100 mM Sodium phosphate buffer(pH 6.8))를 넣고 -70 ℃에서 2시간 방치하고 상온에서 해동시킨 뒤 세포 스크래퍼(Cell scraper)로 각 웰의 세포를 떼어내어 각각의 1.5 ㎖ 튜브로 옮기고 4 ℃, 13000 rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액을 새로운 1.5 ㎖튜브로 옮겼다. 총 단백질 분석을 실시하여 단백질을 0.3 ㎎/㎖로 희석한 후 분석 샘플로 사용하였다. 96 웰 플레이트의 각 웰에 50 ㎕의 100 mM 소디움 포스페이트 버퍼(pH 6.8)를 넣고 이어서 각 웰에 상기 샘플 100 ㎕ 및 100 mM 파이로카테콜(Pyrocatechol) 50 ㎕를 넣었다. ELISA 리더를 이용하여 37 ℃에서 10분 간격으로 405 nm에서 흡광도를 60분간 측정하였다. 음성대조군을 기준으로 티로시나제 활성 억제율(%)을 다음 수학식 3에 의하여 구하였다. 음성대조군은 시료 대신 DMSO를 처리하여 샘플로 사용하였다.

③ 멜라닌 생성 억제 효과 측정

6 웰 플레이트의 각 웰에 B16/F10 멜라닌 생성 세포를 1 ×10⁵ cell/웰(Final volum 3 ml)로 넣고 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양한 후 각 웰에서 배지를 제거하고 새로운 DMEM으로 갈아주었다. MTT 분석 결과로 설정된 독성이 없는 농도의 시험물질을 각각의 웰에 30 ㎕씩 첨가하여 인규베이터에서 72시간 배양한 뒤 배양액을 제거하고 PBS를 1 ㎖씩 넣어 세포 스크래퍼로 각 웰을 긁어 세포를 떼어내어 각각의 1.5 ㎖ 튜브로 옮겼다. 이어서 4 ℃, 13000 rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 회수하여 60 ℃에서 3시간 건조시킨 뒤 10% DMSO가 첨가된 1N NaOH를 1 ㎖씩 넣어 60 ℃에서 1시간 동안 세포내 멜라닌을 용해시켰다. 합성 멜라닌(Sigma)을 단계 희석하여 표준용액으로 준비하였다. 96 웰 플레이트의 각 웰에 용해시켜 얻은 상층액과 표준용액을 150 ㎕씩 넣어 ELISA 리더(VERSA)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군은 시료 대신 DMSO로 처리하였다. 합성 멜라닌을 사용하여 작성된 표준곡선(Standard curve)에서 멜라닌 양을 구하여 음성대조군을 기준으로 멜라닌 생성 억제율을 다음 수학식 4에 의해 구하였다.

A : 대조군의 멜라닌 양

B : 시험물질의 멜라닌 양

상기 표 1의 추출물 중 머쉬룸 티로시나제 활성 억제율이 가장 좋았던 실시예 2와 실시예 3을 다음의 합성 미백원료와 함께 실험예 2의 방법으로 B16 멜라닌 생성세포에서의 미백효과를 평가하였는데, 각 시료는 세포생존율을 감안하여 최대농도에서 실험하였으며 그 결과를 다음 표 3 및 도 1에 나타내었다.

구분	적용최대농도(ppm)	티로시나제 활성 억제율(%)	멜라닌 형성 억제율(%)
음성대조군(시료무처리)	DMSO 1%	-	-
비타민 C	100	58.4	74.1
알부틴	500	71.2	67.3
유용성 감초 추출물	12.5	52.4	58.6
녹차 추출물	50	36.9	27.8
상백피 추출물	50	13.4	3.7
실시예 2 추출물	50	84.8	73.2
실시예 3 추출물	50	72.4	81.8

상기 실험예 2의 B16 멜라닌 생성 세포를 활용한 티로시나제 활성억제 및 멜라닌 형성 억제실험에서 최대 세포생존율을 고려한 농도에서 실시예 2 및 실시예 3의 복방 생약 추출물이 양성대조군인 비타민C보다는 효과가 약간 높거나, 다소 낮은 효과를 나타냈지만 알부틴과 녹차, 상백피 추출물보다는 우수한 효과를 나타내 천연미백제로서의 충분한 가능성을 보여 주었다.

실험예 3: DPPH 라디칼 소거활성법에 의한 항산화 효과실험

상기 표 1 추출물의 항산화 활성을 측정하기 위해 96 웰 플레이트의 각각의 웰(triplicate/sample)에 시험물질 100 ㎕를 넣고 대조군에는 DMSO 100 ㎕를 넣었다. 각 웰에 0.2 mM DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl, Sigma)용액 100 ㎕를 넣었다. 단, 대조군 및 시험물질 Blank 웰에는 메탄올 원액 100 ㎕를 넣었다. 여기서 시험물질이 고상인 경우에는 용매인 DMSO에 대한 용해도를 측정하여 고농도(ppm단위)를 스톡 솔루션(Stock solution)하고 액상인 경우에는 원액을 스톡 솔루션으로 하여 IC₅₀을 얻기 위한 적정 농도로 계열희석(5단계)하여 조제한 후 시험에 적용하였다. 상기 시험물질을 37 ℃ 배양기에서 20분간 반응시키고 ELISA 리더를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시험물질 및 대조군의 Blank 흡광도 값을 보정한 후 공시험군을 기준으로 DPPH 라디칼에 대한 전자공여능(Electron donating ability : EDA %)으로 항산화능을 표시하였다 [수학식 5]. 구해진 EDA 수치의 50 %를 저해하는 각 물질의 농도를 IC₅₀로 나타내었다. 그 결과를 다음 표 4 및 도 2에 나타내었다.

As : 시료물질의 O.D 값

Asb : 시료물질 Blank 의 O.D 값

Ac : 대조군의 O.D 값

Acb : 대조군 Blank의 O.D 값

구분	IC₅₀(ppm)
음성대조군(시료 무처리)	-
비타민 C	13.2
BHT	17.4
유용성 감초 추출물	103.6
루틴	24.8
상백피 추출물	956.0
녹차 추출물	512.0
천화분 열수 추출물	121.1
천화분 에탄올 추출물	66.3
천화분 부탄올 추출물	18.2
천화분 에틸아세테이트 추출물	102.6
천화분 클로로포름 추출물	111.3
하고초 열수 추출물	52.2
하고초 에탄올 추출물	11.3
하고초 부탄올 추출물	7.2
하고초 에틸아세테이트 추출물	19.7
하고초 클로로포름 추출물	20.6
위령선 열수 추출물	94.3
위령선 에탄올 추출물	22.1
위령선 부탄올 추출물	32.0
위령선 에틸아세테이트 추출물	66.7
위령선 클로로포름 추출물	91.1
실시예 2 추출물	22.4
실시예 3 추출물	10.5

DPPH 라디칼 소거능을 활용한 항산화 효과 시험결과, 단독 추출물로는 하고초의 에탄올, 부탄올 추출물 및 위령선 에탄올 추출물, 실시예 2 및 실시예 3의 복방생약 추출물이 기존 미백원료에 비해 비슷하거나 동등이상의 효과를 나타냄을 알 수 있어 복방 생약 추출물이 항산화 효과가 우수함을 알 수 있었다.

실시예 4: 복방 생약 추출물 함유 나노 리포좀의 제조(1)

상기 실시예 2에서 만들어진 복방 생약 추출물 10 g, 글리세린 40 g, 정제수9.40 g을 넣고 혼합하여 55 ℃로 가온, 용해한 후 여기에 미리 55 ℃로 가온용해시킨 수소화된 레시친 10 g, 카프릴릭ㆍ카프릭트리글리세라이드 30 g, 콜레스테롤 0.6 g을 첨가하여 고압미세균질기(Microfluidizer,모델명 M110F, MICROFUIDICS사, 미국)를 사용하여 600 bar에서 5회 재순환 처리하면서 냉각하여 나노 리포좀으로 된 반투명 젤 상의 초미세유화물을 수득하였고, 그 입자크기를 고해상도 투과 전자현미경 FF-TEM(JEM1010, JEOL, 일본) 사진을 도 3에, 입도분석기(ZETASIZER 3000H, MALVERN사, 영국)를 활용한 입도분포를 도 4에 나타내었다.

실시예 5: 복방 생약 추출물 함유 나노 리포좀의 제조(2)

상기 실시예 3에서 만들어진 복방 생약 추출물 10 g, 글리세린 40 g, 정제수9.40 g을 넣고 혼합하여 55 ℃로 가온, 용해한 후 여기에 미리 55 ℃로 가온 용해시킨 수소화된 레시친 10 g, 카프릴릭ㆍ카프릭트리글리세라이드 30 g, 콜레스테롤 0.6 g을 첨가하여 고압미세균질기(Microfluidizer)를 사용하여 600 bar에서 5회 재순환 처리하면서 냉각하여 나노 리포좀으로 된 반투명 젤 상의 초미세유화물을 수득하였다.

비교예 1

상기 실시예 4에서 콜레스테롤 0.6 g을 넣지 않는 것과 그 잔량을 정제수로 대체한 것 외에는 실시예 4의 제조방법과 동일하다.

비교예 2

상기 실시예 4에서 복방 생약 추출물 10g 을 넣지 않은 것과 그 잔량을 정제수로 대체한 것 외에는 실시예 4의 제조방법과 동일하다.

구분(중량%)	실시예 4	실시예 5	비교예 1	비교예 2
실시예 2 추출물	10.0	-	10.0	-
실시예 3 추출물	-	10.0	-	-
농글리세린	40.0	40.0	40.0	40.0
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량
수소화된 레시친	10.0	10.0	10.0	10.0
카프릴릭ㆍ카프릭트리글리세라이드	30.0	30.0	-30.0	30.0
콜레스테롤	0.60	0.60	-	0.60

상기 실시예 4 및 5에서 제조된 복방 생약 추출물을 포집한 나노 리포좀은 안정성, 유변학적 특성, 균일성, 높은 계면면적 등 기존의 에멀젼과는 다른 물리화학적 특성을 지닌다.

처방예 1 ∼ 2 및 비교처방예 1 ∼ 2

본 발명의 실시예 4, 5 및 비교예 1의 나노 리포좀과 실시예 2의 추출물을 함유한 화장료 중 화장수의 처방예는 다음과 같다.

구분(중량%)	처방예 1	처방예 2	비교처방예 1	비교처방예 2
실시예 4 나노 리포좀	5.00	-	-	-
실시예 5 나노 리포좀	-	5.00	-	-
비교예 1 나노 리포좀	-	-	5.00	-
실시예 2 추출물	-	-	-	0.50
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량
1,3-부틸렌글리콜	6.00	6.00	6.00	6.00
하이드록시프로필셀룰로오스	0.05	0.05	0.05	0.05
피이지-피피지 18/4 코폴리머	1.00	1.00	1.00	1.00
디소디움 이디티에이	0.02	0.02	0.02	0.02
피피지-26-부테스-26/피이지-40 경화 피마자유	0.03	0.03	0.03	0.03
메틸파라벤	0.15	0.15	0.15	0.15
에탄올	8.00	8.00	8.00	8.00
향	적량	적량	적량	적량

처방예 3 ∼ 4 및 비교처방예 3 ∼ 5

실시예 4, 5의 나노 리포좀을 함유하는 크림 조성물(처방예 3 ∼ 4), 실시예 3의 추출물과 비교예 2의 나노 리포좀을 첨가한 크림 조성물(비교처방예 3), 실시예 3의 추출물만 첨가한 크림 조성물(비교처방예 4) 및 아무것도 첨가하지 않은 대조 크림 조성물(비교처방예 5)을 각각 제조하였다.

구분(중량%)	처방예 3	처방예 4	비교처방예 3	비교처방예 4	비교처방예 5
실시예 4 나노 리포좀	5.00	-	-	-	-
실시예 5 나노 리포좀	-	5.00	-	-	-
실시예 3 추출물	-	-	0.50	0.50	-
비교예 2 나노 리포좀	-	-	4.50	-	-
알라키딜알코올/비헤닐알코올/아라키딜글루코사이드	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
세테아릴알코올/세테아릴글루코사이드	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
세테아릴알코올	3.50	3.50	3.50	3.50	3.50
피토스쿠알렌	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00
쉐어버터	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00
에뮤 오일	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
홍화씨 오일	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
마카다미아 오일	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
사이크로메치콘	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00
1,3-부틸렌글리콜	6.00	6.00	6.00	6.00	6.00
산탄검	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
디소디움 이디티에이	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
베타 글루칸(0.4%)	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00
방부제	적량	적량	적량	적량	적량
향	적량	적량	적량	적량	적량
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량
전체	100	100	100	100	100

실험예 4: 나노리포좀의 안정성 비교시험

본 발명에 따른 천화분, 하고초, 위령선의 복방 생약 추출물을 안정화시킨 나노 리포좀을 함유한 화장수 제형의 처방예 1 ∼ 2와 비교처방예 1 ∼ 2에 대한 안정성을 다음의 방법으로 측정하였다. 화장수 제형을 선택할 경우 비교적 짧은 기간에 층분리, 변색 등 안정성에 대한 육안판별이 가능하기 때문이다.

상기 처방예 1 ∼ 2 및 비교처방예 1 ∼ 2를 45 ℃의 항온조에서 3개월간 투명초자 용기에 담아 3개월간 보관한 시료, 4 ℃, 차광조건 하에서 3개월간 투명초자에 냉장 보관한 시료, 실온에서 3개월간 투명초자에 보관한 시료에 대하여 제품변색 및 분리정도를 비교 측정하여 다음 표 6에 나타내었다.

화장수에 적용된 나노 리포좀의 안정도시험

시료보관온도	각 시료의 분리/변색정도
시료보관온도	처방예 1	처방예 2	비교처방예 1	비교처방예 2
4 ℃	0	0	0	1
실온	0	0	0	1
45 ℃	0	0	1	2
분리강도 : 침전강도 혹은 부유오일량이 많을수록 값이 높음, 0 ∼ 5 변색정도 : 변색이 심할수록 값이 높음, 0 ∼ 5

상기 표 6에서 나타낸 바와 같이, 처방예 1 및 2의 화장수에 첨가된 나노 리포좀 조성물은 변색이나 분리현상이 없이 매우 안정하였으며, 비교처방예 1의 화장수에 첨가된 콜레스테롤을 첨가하지 않은 나노 리포좀 조성물은 45 ℃의 고온보관 조건에서 극소의 변색정도와 용기상층부의 극소량의 분리띠가 형성되었으며, 실시예 2 추출물과 나노 리포좀을 별도로 첨가한 비교처방예 2의 화장수는 분리 및 변색정도가 실온 및 45 ℃ 보관 조건에서 육안구별이 뚜렷하게 나타날 정도로 불안정하였다. 이는 나노 리포좀을 형성하는 수소화된 레시친(포화지방산 유래 인지질)이 겔-액정상전이 온도영역에서 지질 이분자막에 상 변화를 일으켜 실시예 2 추출물의 배출이나 나노 리포좀의 입자 균일도가 떨어져 작은 크기의 입자가 큰 입자에 흡수, 융합되는 오스트발트 라이프닝을 일으키는 것에 기인하는데 이를 억제할 목적으로 콜레스테롤의 첨가가 필요하며 상전이 온도 이하에서는 소수기간의 상호작용이 약화되고 지질상전이 온도 이상에서는 내포막의 안정성을 향상시키고 겔-상전이온도가 소멸되어 매우 안정한 나노 리포좀이 형성되어 있음을 시사한다. 또한, 수소화된 레시친과 콜레스테롤을 일정비율로 사용하여 안정화된 복방 생약 추출물 함유 나노 리포좀은 색, 냄새, pH 저하 등 경시 안정성을 향상시킬 뿐만 아니라 피유화물의 HLB값을 고려하지 않아도 되는 장점이 있다.

실험예 5: 화장수에 적용된 나노 리포좀의 올레아놀산 유지율 평가

나노 리포좀의 안정성에 대한 콜레스테롤의 첨가 효과와 안정성과의 관계를 알아보기 위해 처방예 1, 비교처방예 1 및 2를 기준으로 실시예 2의 복방 생약 추출물의 지표성분중 하나인 올레아놀산 함량유지율을 기준으로 유효성분의 안정성을 평가하였다. 안정성은 제조직후의 올레아놀산 역가와 45 ℃, 1, 3개월 경과후의 올레아놀산 역가를 HPLC로 213 nm에서의 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 다음 표 7에 나타내었다.

화장수에 적용된 나노 리포좀의 올레아놀산 역가 변화

구분	각 시료의 올레아놀산 역가(45 ℃)
구분	제조 직후	제조 1개월 후	제조 4개월 후
처방예 1	98.2%	96.4%	95.5%
비교처방예 1	97.3%	89.1%	83.3%
비교처방예 2	96.7%	76.3%	60.8%

상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 처방예 1의 화장수에서 실시예 2 추출물을 함유하면서 콜스레스테롤이 포함된 나노 리포좀은 45 ℃, 3개월이 경과해도 올레아놀산의 역가 유지율이 매우 좋아 안정하였고, 콜레스테롤을 함유하지 않고 실시예 2 추출물을 나노 리포좀에 내포시킨 비교처방예 1의 화장수는 비교적 안정한 반면, 실시예 1 추출물이 별도로 첨가된 비교처방예 2의 화장수는 시간경과에 따라 올레아놀산의 역가가 상당히 감소함을 알 수 있었다. 이는 복방 생약 추출물을 안정하게 함유하는 나노 리포좀으로 만들기 위해서는 수소화된 레시친과 더불어 내포막 강화제 역할을 하는 콜레스테롤 사이에 적합한 비율(10:0.60)이 안정도에 상당한 영향을 미침을 알 수 있고, 실시예 2 추출물을 화장수 제형에 별도 첨가할 경우 올레아놀산 등 유효성분의 유지율이 약화됨을 알 수 있다.

실험예 6: 무모생쥐에서의 경피 흡수 측정시험

처방예 4 및 비교처방예 3 ∼ 4에서 제조한 크림을 이용하여 경피 흡수 시험을 실시하였다. 경피 투과는 4주령의 무모생쥐(Hairless mouse)로부터 피부층만을 적출한 다음, 진피층의 지방층을 제거한 피부를 채취하여 평방 1 cm²의 면적으로 절단한 후 이를 투과경의 직경이 0.9 cm인 투과 셀에 장치한 후 클램프로 고정하였다. 피부의 한쪽 면에 화장료 조성물(처방예 4 및 비교처방예 3 ∼ 4에서 제조한 크림)을 0.5 ㎖ 도포하고 반대쪽은 0.025M 인산완충용액으로 된 용매와 접촉하도록 하였다. 실험온도는 실제 피부온도인 32 ㅁ0.5 ℃ 유지하면서 자석교반기를 이용하여 600 rpm으로 교반하였으며, 투과된 성분은 정량을 위하여 도포 후 일정시간 간격으로 인산완충용액 일부를 채취한 후, 프란츠 확산 셀은 다시 인산완충용액을 채워 넣었다. 채취된 인산완충용액을 대상으로 HPLC로 복방 생약 추출물의 지표성분인 올레아놀산을 측정하여 흡광도 213 nm에서 HPLC로 정량분석하였으며, 그 결과는 다음 표 8 및 도 5에 나타내었다.

시간	실시예 1 추출물 중 올레아놀산 투과량(㎍/㎖)
시간	처방예 4	비교처방예 3	비교처방예 4
0	0	0	0
4	9.2	2.3	1.4
8	20.4	5.1	2.6
12	34.8	8.5	3.8

보통 사람의 화장 지속시간은 8시간 이내임을 생각할 때, 상기 표 8에서 나타낸 것과 같이 복방 생약 추출물(올레아놀산 지표성분)을 함유한 나노 리포좀을 적용한 처방예 4가 나노 리포좀과 복방 생약 추출물을 별도 첨가한 비교처방예 3 및 실시예 3 추출물만 첨가한 비교처방예 4에 비해 4 ∼ 8배 이상의 경피흡수도가 증가됨을 알 수 있고 약물 방출패턴이 서방성이 있음을 알 수 있었다.

실험예 7: 갈색 기니피그 피부에서의 미백효과 시험

본 발명의 화장료의 미백효과를 색차계(Chromameter CR-300, Minolta사)를 이용하여 평가하였다. 평가방법으로는 사람의 피부와 같이 자외선, 알러지 반응에 의해 색소 침착이 생기는 갈색 기니피그(Brown guinea pigs)의 배후의 털을 제거한 피부에 2.5 ×2.5 cm의 정방향의 구멍이 뚫린 크세논램프(파장 290 ∼ 400 nm)로 1.50 mW/cm², 5분간, 1일 1회로 3일간 조사하여 색소 침착을 유도하였다. 시료 도포시기는 자외선 조사 후 색소 침착이 가장 높은 2주 후에 도포하여 개선효과를 판정하였는데, 그 횟수는 1일 1회 30일 동안 연속 도포하였다. 피부색소 침착정도 판정은 색차계의 L값(명도:Lightness)을 지표로 하여 측정하였으며, 1개부위에 3회 이상 반복하여 평균값을 취하였다. 도포시작시점과 완료시점의 피부색의 차이(△L값)를 다음 수학식 6에 따라 계산하여 색소 침착의 소실속도를 비교하였다[표 9].

구분	미백 효과 L값(%)
처방예 3 크림	86
처방예 4 크림	80
비교처방예 3 크림	78
비교처방예 4 크림	72
비교처방예 5 크림	16

상기 표 9를 통하여 실시예 2의 복방 생약 추출물을 함유한 나노 리포좀이 비교처방예 5의 대조군에 비해 뛰어난 미백효과가 있음을 알 수 있고, 또한 비교처방예 3 및 4를 통하여 복방 생약 추출물을 단순 첨가한 크림 조성물보다 이를 나노 리포좀에 내포시킨 쪽이 미백효과가 상대적으로 높음을 알 수 있었다.

실험예 8: 자외선에 의한 자극 억제효과

자외선에 민감한 피부를 가진 피험자 30명을 대상으로 본 발명에서 추출된 복방 생약 추출물 및 이를 안정화시킨 나노 리포좀을 대상으로 자외선에 대한 피부 자극억제 효과를 시험하였다. 이 실험에 사용한 시료는 각각의 천화분, 하고초, 위령선 단방 추출물 및 실시예 2 ∼ 3의 복방 생약 추출물 0.5%를 1.3-부틸렌글리콜에 용해한 시료와 실시예 4 ∼ 5의 나노 리포좀 5.0%를 1.3-부틸렌글리콜에 분산한 용액, 1.3-부틸렌글리콜만 함유한 첩포용 시료를 추출물의 최종농도를 같게 하여 등좌측상 부위에 첩포한 후 24시간이 지난 뒤에 떼어내고 마킹팬(Marking pen)으로 시험부위를 표시하고, 1시간 경과 후 2MED(Minimal Erythema Dose;최소홍반량)의 자외선을 조사하고 24시간이 지난 후에 홍반 등의 자극 감소유무를 관찰하였다. 또한, 제형적용시의 자외선에 의한 자극억제 효과를 알아보기 위해 우측등상측 부위에 처방예 3 ∼ 4 및 비교처방예 3 ∼ 5의 크림 조성물을 대상으로 동일한 방법으로 시험하였다. 본 실험은 국제접촉피부염연구회(ICDRG)의 판정기준에 따라 자극정도를 5등급으로 분류하였고 다음 수학식 7에 따라 평균값을 산정한 후 시료의 결과 판정표에 따라 자극억제 유무를 판정하여 그 결과를 다음 표 10에 나타내었다.

반응자수: 홍반을 나타낸 사람 수

반응강도: 자극등급에 따라 결정한 자극값

최고반응강도: 자극등급에서의 최고 값

평균피부 반응도 판정기준

판정기준(등급)	평균값	자극형태
무자극(1등급)	0.00 ∼ 0.75	무자극
미자극(2등급)	0.76 ∼ 1.50	희미한 홍반
경자극(3등급)	1.51 ∼ 2.50	약한 홍반, 부종 및 구진
중자극(4등급)	2.51 ∼ 4.00	뚜렷한 홍반, 구진 및 소수포
강자극(5등급)	4.00 이상	심한 홍반, 대수포, 가피형성

다음 표 11 ∼ 12 및 도 6에 나타낸 자극 억제율은 복방 생약 추출물을 미처리한 경우와 크림제형 내에 복방 생약 추출물을 미처리한 각각의 음성대조군을 기준으로 시료 적용시의 상대적인 감소정도를 백분율로 표시한 것이다.

구분	평균값	자극 억제율(%)
음성대조군(시료 무처리)	4.09	-
천화분 열수 추출물	2.65	35.21
천화분 에탄올 추출물	2.43	40.59
천화분 부탄올 추출물	2.54	37.90
천화분 에틸아세테이트 추출물	2.62	35.94
천화분 클로로포름 추출물	2.87	29.83
하고초 열수 추출물	2.76	32.52
하고초 에탄올 추출물	2.31	43.52
하고초 부탄올 추출물	2.48	39.36
하고초 에틸아세테이트 추출물	2.56	37.41
하고초 클로로포름 추출물	2.72	33.50
위령선 열수 추출물	2.32	43.28
위령선 에탄올 추출물	1.81	55.75
위령선 부탄올 추출물	1.63	60.15
위령선 에틸아세테이트 추출물	2.13	47.92
위령선 클로로포름 추출물	2.43	40.59
실시예 2 복방 생약 추출물	2.28	44.25
실시예 3 복방 생약 추출물	2.02	50.61
실시예 4 나노 리포좀	1.47	64.06
실시예 5 나노 리포좀	1.32	67.73

구분	평균값	자극 억제율(%)
비교처방예 5(추출물 미첨가)	3.61	-
비교처방예 4	1.88	47.92
비교처방예 3	1.64	54.58
처방예 3	1.22	66.20
처방예 4	1.09	69.81

상기 실험예 8을 통하여 단방 추출물로는 추출물 미처리의 음성대조군에 비해 위령선의 에탄올 및 부탄올 추출물이 자외선에 의한 자극경감효과가 가장 우수하였고, 복방 생약 추출물로는 실시예 3의 추출물과 이를 함유한 실시예 5의 나노 리포좀이 추출물 미첨가의 음성대조군에 비하여 자극경감효과가 좋았다. 한편, 제형음성대조군인 비교처방예 5에 비하여 실시예 4 ∼ 5의 나노 리포좀 및 처방예 3 ∼ 4가 자외선에 의한 자극억제효과가 높음을 알 수 있는데, 복방 생약 추출물 자체가 자극억제효과도 있지만, 이를 함유한 나노 리포좀의 지속적인 서방성 효과에 기인하여 나노 리포좀화 될 때 그 효과가 더 상승됨을 알 수 있다.

실험예 9: 임상시험을 통한 미백효과

본 발명의 실험예는 실시예 2의 복방 생약 추출물을 안정하게 내포시킨 실시예 4의 나노 리포좀을 크림 조성물에 적용한 처방예 3과 천연물을 함유하지 않은 크림인 비교처방예 5의 크림을 안면에 기미와 색소 침착을 갖고 있는 신체 건강한 여성 30명(평균연령 : 38.4세)을 대상으로 8주간 좌우 안면 도포시의 개선효과를 설문평가하였고, 팔하박 내측의 인공색소 침착 후 개선정도를 기기평가법으로 판정하였다.

① 인공색소 침착 후 기기평가에 의한 미백효과

팔 하박 내측의 인공색소침착 부위를 선정(1.5 ×1.5 cm)하여 UV-B램프(TL20W/01RS)가 장착된 자외선 조사장치를 이용하여 순차적으로 자외선량을 증가시켜 2MED(최소홍반량의 2배)를 흑화상태에 따라 2 ∼ 3회 반복 조사하였다. 색소 침착 전, 제품 사용 전, 제품사용 4주 및 8주 후에 분광광도계 CM 2600D를 이용하여 항온ㆍ항습상태에서 20분간 적응시킨 후, 각 부위를 3회 측정하여 △L(명도값의 차이)를 구하고 그 평균값을 사용하였다.

인공색 침착 후의 피부색 개선효과

구분	처방예 3 크림(시험군)	비교처방예 5 크림(대조군)
흑화 전 피부색 평균값	66.81	66.74
흑화 후 제품 사용 전 평균값	59.81	59.83
제품 사용 4주 후 평균값	64.13	60.94
제품 사용 8주 후 평균값	68.26	62.32
△L(흑화 후-흑화 전) 평균값	-7.00	-6.91
△L(4주-0주) 평균값	4.32	1.11
△L(8주-0주) 평균값	8.45	2.49

상기 처방예 3의 크림을 좌측에 대조군인 비교처방예 5의 크림을 우측에 도포하여 사용에 따른 피부색의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 처방예 3의 크림은 제품사용전과 비교하여 제품사용 4주(명도: 대조군보다 3.8배 증가함)와 8주 후(명도: 대조군보다 3.4배 증가함) 피부색의 밝기가 매우 증가하였으나, 비교처방예 5의 크림은 흑화 후 제품사용 전에 비하여 시간이 지나도 피부색의 밝기 증가가 미약하였다.

① 사용성 실험을 통한 미백효과

상기의 동일 피험자와 동일 시료를 대상으로 1일 2회 8주간 안면좌측에는 처방예 3을, 안면우측에는 비교처방예 5의 크림을 도포하여 사용자 설문에 의한 미백효과를 평가하였다. 시험제품을 사용한 후 4주, 8주 사용시점에서 제품의 미백효과와 피부안전성 및 사용성에 관한 설문을 작성하는 방식으로 자가평가를 실시하였으며, 그 결과를 종합하여 질문에 긍정적으로 응답한 피험자를 군별/시점별로 정리하여 다음 표 14 ∼ 16에 나타내었다

구분		비교처방예 5(대조군)		처방예 3(시험군)
구분		인원수	%	인원수	%
미백효과	제품 사용 4주 후	2	6.67	19	63.33
미백효과	제품 사용 8주 후	3	10.00	23	76.67

구분		비교처방예 5(대조군)		처방예 3(시험군)
구분		인원수	%	인원수	%
피부자극성	제품 사용 4주 후	3	10.00	0	0.00
피부자극성	제품 사용 8주 후	3	10.00	1	3.33

구분		비교처방예 5(대조군)		처방예 3(시험군)
구분		인원수	%	인원수	%
향	제품 사용 4주 후	18	60.00	18	60.00
향	제품 사용 8주 후	20	66.67	21	70.00
사용감	제품 사용 4주 후	21	70.00	23	76.67
사용감	제품 사용 8주 후	21	70.00	22	73.33
흡수성	제품 사용 4주 후	22	73.33	24	80.00
흡수성	제품 사용 8주 후	21	70.00	23	76.67
피부적합성	제품 사용 4주 후	23	76.67	25	83.33
피부적합성	제품 사용 8주 후	23	76.67	25	83.33
보습유지성	제품 사용 4주 후	19	63.33	24	80.00
보습유지성	제품 사용 8주 후	20	66.67	26	86.67

상기 실험결과를 통하여 복방 생약 추출물을 함유한 나노 리포좀을 크림제형 적용시 우수한 미백효과를 나타내며, 사용성 시험항목 중 특히 보습 유지성이 상대적으로 좋음을 알 수 있었는데, 이는 생체 친화성물질인 수소화된 레시친의 영향 때문인 것으로 판단되며, 특히 피부 안전성평가에서 시험군의 크림이 대조군의 크림보다 우수한 것은 복방 생약 추출물 자체가 자극완화 효과를 가짐과 동시에 나노 리포좀으로 안정화되어 서방적인 유효성분 방출효과를 가지기 때문이다.

이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명은 천화분, 하고초 및 위령선의 복방 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 나노 리포좀 조성물 및 이를 이용한 피부 미백용 화장료에 관한 것으로서, 나노입자로 안정되게 포접된 복방 생약 추출물의 유효성분이 피부적용시 경피 흡수 촉진효과, 미백효과, 항산화 효과, 자외선에 의한 자극억제효과를 동시에 가지는 피부 미백용 화장료를 제공한다.

Claims

천화분, 하고초 및 위령선의 복방 생약 추출물 0.01 ∼ 20.0 중량%가 유효성분으로 함유된 것임을 특징으로 하는 나노 리포좀 조성물.
제 1 항에 있어서, 전체 나노 리포좀 조성에 대하여 수소화된 레시친 10 ∼ 15 중량%, 글리세린 10 ∼ 50 중량%, 카프리릭ㆍ카프릭트리글리세라이드 10 ∼ 40 중량%, 콜레스테롤 0.3 ∼ 2.0 중량% 및 정제수 3 ∼ 70 중량%이 함유된 것임을 특징으로 하는 나노 리포좀 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 복방 생약 추출물은 천화분, 하고초 및 위령선의 혼합비가 0.5 ∼ 2 : 0.5 ∼ 1.5 : 1의 중량비로 혼합되어 추출된 것임을 특징으로 하는 나노 리포좀 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 나노 리포좀의 입자크기는 20 ∼ 100 nm인 것임을 특징으로 하는 나노 리포좀 조성물.
청구항 1 내지 4 중에서 선택된 한 항의 나노 리포좀 조성물을 제형화한 것임을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료.