KR20050111645A

KR20050111645A - 각막 지각 회복제

Info

Publication number: KR20050111645A
Application number: KR1020057019780A
Authority: KR
Inventors: 요시코 다카야마; 요시쿠니 나카무라; 준 이노우에; 미츠요시 아즈마
Original assignee: 센주 세이야꾸 가부시키가이샤
Priority date: 2003-04-18
Filing date: 2004-04-16
Publication date: 2005-11-25
Also published as: CN1777445A; KR101076638B1; JP4566130B2; ATE525111T1; CN1777445B; US20070093513A1; JPWO2004091662A1; EP1616577B1; PL1616577T3; EP1616577A4; EP1616577A1; ES2370245T3; WO2004091662A1

Abstract

본 발명은 각막 수술 후에 각막 지각을 회복시키고 드라이 아이 증상을 개선시키는 신규한 약물을 제공하고자 한다. Rho 단백질 저해제를 함유한 이 약물은 백내장 수술 후, LASIK 수술 후, PRK 수술 후, 또는 각막 이식수술 후의 각막 지각 저하, 또는 신경마비성 각막증, 각막 궤양, 당뇨병성 각막증 등과 관련된 각막 지각 저하를 치료하고, 드라이 아이 증상을 개선시키는 데 유용하다.

Description

각막 지각 회복제{AGENT FOR REPAIRING CORNEAL PERCEPTION}

본 발명은 Rho 단백질 저해제를 함유하는 각막 신경돌기형성 촉진제, 및 각막 신경돌기형성 촉진에 기초한 각막 지각의 회복제 또는 개선제, 또는 드라이 아이 (dry eye) 의 치료제에 관한 것이다.

레이저 광굴절성 각막절제술 (Laser photorefractive keratectomy; PRK), 레이저를 이용한 원위치 미세각막절삭술 (Laser-Assisted-In-Situ Keratomileusis; LASIK), 각막이식 (keratoplasty) 등과 같은 각막 수술에 의해서 각막 신경이 절단되면, 일반적으로 약 3 주 내지 1 년 동안 각막 지각이 저하되는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 각막 신경이 LASIK 후에 명백하게 절단된 것 (Tuuli U. Linna et al., Experimental Eye Research 66: 755-763, 1998), 및 라식 후 신경상이 관찰되지 않거나 신경 다발이 연결을 생성하기에는 너무 짧은 각막 영역에서 각막 지각이 저하된 것 (Tuuli U. Linna et al., Investigative Ophthalmology & Visual Sciences, 41: 393-397, 2000) 이 보고되어 있다.

PRK 및 LASIK 후의 각막 지각저하가 누선 반응 저하 및 누액 감소를 야기시키는 것은 증명되어 있다 (Ang, Robert T. et al., Current Opinion in Ophthalmology 12: 318-322, 2001). 각막 지각의 기능 저하의 결과로서, 각막 수술 후의 환자에게서는 순목 횟수가 감소하여, 드라이 아이 증상이 나타나는 것이 문제가 되고 있다. 드라이 아이 환자에게서는, 누액 기능저하가 각막 지각저하를 발생시키고, 이것이 추가적인 누액 기능저하와 함께 각막 표면의 상태를 악화시키는 것이 문제가 되고 있다.

그러나, 현재 각막 수술 후의 각막 지각의 회복은 자연 회복에만 맡겨두고 있으며, 드라이 아이의 치료에 있어서도, 각막 지각을 회복시키기 위한 적극적인 치료는 제공되고 있지 않다.

또한, 각막 지각저하는 신경마비성 각막증, 각막 궤양, 당뇨병성 각막증 등과 같은 각막 신경변성을 동반하는 질환에 의해서도 야기된다.

Rho 단백질은 Rho 패밀리 (Rho, Rac, Cdc42 등을 함유함) 에 포함되는 저분자량 G 단백질이며, 액틴 세포골격 조직화 및 신경돌기 퇴축 반응에 연관되는 것으로 알려져 있다.

예를 들면, Rho 단백질 저해제인 C3 효소는 3T3 섬유아세포의 세포 돌기를 신장시키는 것으로 알려져 있고 (Hirose, M. et al., The Journal of Cell Biology, 141: 1625-1636, 1998), Rho 단백질 저해제의 유효량을 환자에게 투여함으로써 중추 신경 축색의 성장을 촉진하는 방법이 개시되어 있다 (JP-T-2001-515018 및 EP-1,011,330-A). 또한, Rho 단백질의 효과기 분자 중 하나인 Rho 키나아제 저해제는 망막 신경절 세포의 축색 신장 작용을 가지며, 시신경 세포에 대한 재생 촉진 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다 (WO 02/83175 및 EP-1,142,585-A). WO 03/020281은 신경 재생 또는 신경돌기 신장을 촉진할 수 있는 화합물을 LASIK 등과 같은 수술 후의 각막 신경 상해에 의해 야기되는 질환 상태를 치료하는 데 사용할 수 있음을 교시한다. 이러한 화합물의 예로서, 향신경성 인자 자극 물질인 네오트로핀 (neotrofin) 등을 들 수 있지만, Rho 단백질 저해제에 대한 것으로서의 기재나 제안은 없었다.

삼차 신경에 대한 것으로는, 래트 삼차 신경 조직 배양 (전조직 표본 배양에서의 삼차 신경 척수로) 시스템에 있어서, 신경 성장 인자 (NGF) 등의 향신경인자 유도성 신경 축색의 신장은 Rho 활성화제 (리소포스파티드산) 에 의해서 저해되고, 우성 음성 Rho를 세포에 도입함으로써 촉진되는 것으로 보고되어 있다 (Ozdinler, P. Hande et al., The Journal of Comparative Neurology, 438: 377-387, 2001). 그 한편, 향신경인자의 부재하에서도 Rho가 삼차 신경 척수로 신경 축색 신장에 효과적인지는 알려져 있지 않다는 기재가 있으며, Rho 단백질 저해제의 삼차 신경에 대한 효과도 판명되어 있지 않다.

한편, Rho 활성화 효과를 갖는 화합물은 각막 상피 이동 작용을 가지고, Rho 단백질 저해제인 C3 효소는 그 각막 상피의 이동을 저해하기 때문에, Rho 활성화 효과를 갖는 화합물dl 각막 궤양, 각막 상피 박리, 각막염 등과 같은 각막 장해에 유용한 것으로 개시되어 있다 (JP2000-264847A 및 EP-1,142,585A).

발명의 개시

본 발명은 레이저 광굴절성 각막절제술 (PRK), 레이저 원위치 미세각막절삭술 (LASIK), 각막이식 등과 같은 각막 수술 후에 각막 지각의 기능이 저하된 환자에게서 각막 지각의 기능적 회복을 나타내는 약학적 활성제를 제공한다.

본 발명자는 각막 수술 후에 각막 지각을 회복시키거나, 드라이 아이에 있어서 각막 지각 상태를 개선시키는 신규 유형의 약학적 활성제를 제공하는 것을 목적으로 연구를 수행하던 중, Rho 단백질 저해제가 삼차 신경 (이하, 때때로 각막 신경으로도 언급됨) 세포에 대한 신경돌기형성 촉진 효과를 갖는 것을 최초로 발견하였다. 이러한 발견을 기초로 추가 연구를 수행하여, Rho 단백질 저해제를 각막 지각의 회복 등을 위한 약물로 이용하는 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 다음에 관한 것이다:

(1) Rho 단백질 저해제를 함유한 각막 신경돌기형성 촉진제,

(2) Rho 단백질 저해제를 함유한 각막 신경 축색의 신장 촉진제,

(3) Rho 단백질 저해제를 함유한 각막 지각의 회복제,

(4) Rho 단백질 저해제를 함유한 드라이 아이 치료제,

(5) Rho 단백질 저해제를 함유한 각막 신경돌기형성 촉진용 약학적 조성물,

(6) Rho 단백질 저해제를 함유한 각막 신경 축색의 신장 촉진용 약학적 조성물,

(7) Rho 단백질 저해제를 함유한 각막 지각의 회복용 약학적 조성물,

(8) Rho 단백질 저해제를 함유한 드라이 아이의 치료용 약학적 조성물,

(9) 각막 신경돌기형성 촉진용 약학적 조성물의 제조를 위한 Rho 단백질 저해제의 용도,

(10) 각막 신경 축색의 신장 촉진용 약학적 조성물의 제조를 위한 Rho 단백질 저해제의 용도,

(11) 각막 지각의 회복용 약학적 조성물의 제조를 위한 Rho 단백질 저해제의 용도,

(12) 드라이 아이의 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 Rho 단백질 저해제의 용도,

(13) 각막 신경돌기형성의 촉진이 필요한 대상에게 Rho 단백질 저해제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 각막 신경돌기형성 촉진 방법,

(14) 각막 신경 축색의 신장 촉진이 필요한 대상에게 Rho 단백질 저해제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 각막 신경 축색의 신장 촉진 방법,

(15) 각막 지각의 회복이 필요한 대상에게 Rho 단백질 저해제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 각막 지각 회복 방법,

(16) 드라이 아이를 겪는 대상에게 Rho 단백질 저해제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 드라이 아이 치료 방법.

도 1은 실험예 1에서의, 배양된 토끼 삼차 신경 세포의 형광 현미경 상으로서, 여기서 A는 C3 효소 무첨가 배양액에서 24 시간 동안 배양한 토끼 삼차 신경 세포이고, B는 C3 효소를 최종 농도 2 ㎍/mL로 함유한 배양액에서 24 시간 동안 배양한 세포를 나타낸다.

도 2는 실험예 1에서의, 전 세포수에 대한 신경돌기형성 세포의 비율 (%) 을 나타낸 것으로서, 여기서 종축은 전 세포에 대한 신경돌기형성 세포의 %를 나타내고, 각 값은 3 개 실험의 평균 ± 표준 오차를 나타낸 것이며, *은 대조군에 대한 유의적인 차이 (p < 0.05) 를 나타낸다.

도 3은 실험예 2에서의, 배양된 토끼 삼차 신경 세포의 형광 현미경 상으로서, 여기서 A는 48 시간 동안 시험 물질 무첨가 배양액에서 배양한 세포를 나타내고, B는 화합물 1 첨가 (최종 농도 10 μM) 배양액에서 배양한 세포를 나타내며, C는 화합물 2 첨가 (최종 농도 10 μM) 배양액에서 배양한 세포를 나타내고, D는 화합물 3 첨가 (최종 농도 1 μM) 배양액에서 배양한 세포를 나타내며, E는 화합물 4 첨가 (최종 농도 10 μM) 배양액에서 배양한 세포를 나타낸다.

도 4는 실험예 2에서의, 계수된 전 세포수에 대한 신경돌기형성 세포의 비율 (%) 을 나타낸 그래프로서, 여기서 각 값은 3 개 실험의 평균 ± 표준 오차를 나타낸 것이고, *은 무첨가 군에 대한 유의적인 차이 (p < 0.05) 를 나타내고, **은 무첨가 군에 대한 유의적인 차이 (p < 0.01) 를 나타낸다.

도 5는 실험예 3에서의, 토끼 각막 (C) 및 삼차 신경절 (T) 의 ROCK I 및 ROCK II 웨스턴 블로팅 결과를 나타낸 것이다.

본 명세서에서, "Rho 단백질 저해제"는 불활성 GDP-결합 Rho 단백질이 활성 GTP-결합 Rho 단백질로 활성화되는 것을 저해하는 모든 저해제, Rho 단백질 또는 Rho 단백질 프래그먼트에 대한 항체 등, 및 Rho 단백질의 작용을 전달하는 효과기 분자, 예컨대 Rho 키나아제 (ROCK) 의 작용을 저해하는 모든 저해제 등을 포함하는 것이다. "각막 신경"은 지각 뉴런인 삼차 신경의 제어하에 각막 주변에 형성되는 환상 신경총, 각막 실질에 망상형으로 분포된 실질 신경총, 보우만 막 (Bowman's membrane) 바로 아래에 형성된 상피하 신경총, 및 보우만 막 관통 후에 바로 형성된 기저 세포 신경총과 신경 섬유를 가리킨다. 본 발명에 있어서, "신경돌기"는 뉴런 (신경 세포) 의 세포체로부터 나온 돌기 (수지상 돌기 및 축색) 를 가리키며, "형성"은 세포체로부터 상기 신경돌기의 생성 및/또는 신장을 가리킨다. 어느 정도의 신경돌기형성을 촉진으로 간주할 것인가 하는 것은 당업자에게는 자명한 일이다. 신경돌기형성의 촉진은, 예를 들면 신경 세포를 형광 염색하여 형광 현미경으로 세포 상태를 관찰함으로써 확인할 수 있다. 또한, 형광 현미경을 사용하여 관찰한 결과를 상 분석 소프트웨어 등을 사용하여 분석할 수도 있다. 또한, 결과를 통계학적으로 처리함으로써 신경돌기형성의 상태를 수치화할 수 있다. 보다 또 다른 방법으로서, 신경 세포체 및 신경돌기를 구성하는 물질, 예컨대 뉴로필라멘트를 인식하는 항체 및 상기 항체와 반응하는 양고추냉이 페록시다아제 (HRP) 콘쥬게이션된 항체로 표지한 후에, HRP를 발색시켜 흡광도를 측정함으로써 뉴로필라멘트의 양을 구하여, 신경돌기형성의 지표로서 사용할 수도 있다.

Rho 단백질 저해제로는, 예를 들면 세포외효소 C3 (Exoenzyme C3; 본 명세서에서는 때때로 단순하게 C3 효소로도 언급됨), 톡신 A (Toxin A), 톡신 B (Toxin B) 및 Rho 키나아제 저해제를 언급할 수 있다.

물론, Rho 키나아제 저해제 (이하, 때때로 ROCK 저해제로도 언급됨)로서, 예를 들면 JP61-227581A (USP 4,678,783) 에 기재된 화합물, 예컨대 FASUDIL 히드로클로라이드 등으로 대표되는 이소퀴놀린 술포닐 유도체; WO 00/57914 및 JP2000-44513A에 기재된 Rho 키나아제 저해제와 같은 화합물 (예를 들면, 에타크린산 및 4-[2-(2,3,4,5,6-펜타플루오로페닐)아크릴로일]신남산 등); WO 02/076977 (EP-1,370,552-A 및 1,370,553-A) 에 기재된 Rho 키나아제 저해제와 같은 화합물 (예를 들면, 2-클로로-6,7-디메톡시-N-[5-1H-인다졸릴]퀴나졸린-4-아민 등); 및 WO 02/100833에 기재된 Rho 키나아제 저해제와 같은 화합물 (예를 들면, N-(1-벤질-4-피페리디닐)-1H-인다졸-5-아민 디히드로클로라이드 모노히드레이트 등) 을 언급할 수 있다.

하기 설명에서, 본 발명에서 사용되는 Rho 단백질 저해제를 함유한 약학적 활성제 및 조성물은 또한 때때로 "본 발명의 약학적 활성제"로서 총괄적으로 언급되기도 한다.

본 발명의 약학적 활성제는 각막 신경에 손상, 절단 또는 결함이 발생된 포유류 (예를 들면, 인간, 래트, 마우스, 토끼, 소, 돼지, 개, 고양이 등) 의 각막 지각 능력 저하를 회복시키는 데 유용하다. 예를 들면, 이것은 PRK, LASIK 등 후의 각막 지각 저하, 신경마비성 각막증, 각막 궤양, 당뇨병성 각막증 등과 같은 각막 신경변성에 동반되는 각막 지각 저하를 회복시키는 치료약으로서, 또는 각막 지각을 저하시키는 드라이 아이에 대한 치료약으로서 유용하다.

본 발명의 약학적 활성제는 전신적 또는 국소적으로 투여된다. 전신적으로는, 경구 투여, 및 정맥 내 주사, 피하 주사, 근육 내 주사 등으로 비경구 투여된다. 국소적으로는, 눈에 투여된다.

본 발명의 약학적 활성제의 투여 형태로는, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 좌약 등과 같은 고형제; 시럽, 주사액, 점안액 등과 같은 액제 등을 언급할 수 있다.

본 발명의 약학적 활성제를 과립 및 정제로 제조하는 경우에는, 예를 들면 부형제 (락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 전분, 미세결정성 셀룰로오스 등), 윤활제 (스테아르산 마그네슘, 활석, 스테아르산, 스테아르산 칼슘 등), 붕해제 (전분, 카르멜로오스 소듐, 탄산 칼슘 등), 결합제 (전분 페이스트 용액, 히드록시프로필셀룰로오스 용액, 카르멜로오스 용액, 아라비아 고무 용액, 젤라틴 용액, 알긴산 나트륨 용액 등) 등을 사용하여 임의의 투여 형태를 제조할 수 있다. 과립 및 정제에서는, 적절한 코팅제 (젤라틴, 수크로오스, 아라비아 고무, 카르노바 왁스 등), 장용 코팅제 (예를 들면, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 메타크릴산 공중합체, 히드록시프로필셀룰로오스 프탈레이트, 카르복시메틸에틸셀룰로오스 등) 등을 사용하여 코팅 필름을 형성시킬 수도 있다.

약학적 활성제를 캡슐로 제조하는 경우에는, 적절한 부형제, 예컨대 유동성 및 활주성 향상을 위한 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 활석, 경질 실릭 무수물 등, 가압하에서의 유동성을 위한 미세결정성 셀룰로오스, 락토오스 등, 뿐만 아니라 전술한 붕해제 등을 적절하게 첨가한 혼합물을 균일하게 혼합 또는 과립화하거나, 과립화된 것을 적절한 코팅제로 코팅하여 필름을 형성한 다음 캡슐에 충전하거나, 적절한 캡슐 기제 (젤라틴 등), 글리세린 또는 소르비톨 등을 함유하여 소성이 증가된 캡슐 기제로 캡슐화 성형시킨다. 이들 캡슐은 필요에 따라 착색제, 보존제 [이산화 황, 파라벤 (메틸 파라옥시벤조에이트, 에틸 파라옥시벤조에이트 또는 프로필 파라옥시벤조에이트)] 등을 함유할 수 있다. 캡슐은 통상의 캡슐, 장용 코팅 캡슐, 위장용 코팅 캡슐 또는 방출 제어 캡슐일 수 있다. 장용 캡슐로 제조하는 경우에는, 장용 코팅제로 코팅한 화합물 또는 화합물에 전술한 적절한 부형제를 첨가한 것을 통상의 캡슐에 충전하거나 캡슐 그 자체를 장용 코팅제로 코팅할 수도 있고, 장용 중합체를 기제로 사용하여 성형할 수도 있다.

본 발명의 약학적 활성제를 좌약으로 제조하는 경우에는, 좌약용 기제 (예를 들면, 카카오 버터, 마크로골 등) 를 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.

약학적 활성제를 시럽으로 제조하는 경우에는, 예를 들면 안정제 (소듐 에데테이트 등), 현탁제 (아라비아 고무, 카르멜로오스 등), 교정제 (단순 시럽, 글루코오스 등), 방향제 등을 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 활성제를 주사액 또는 점안액으로 제조하는 경우에는, 약학적 허용성 첨가제, 예컨대 등장제 (염화 나트륨, 염화 칼륨, 글리세린, 만니톨, 소르비톨, 붕산, 붕사, 글루코오스, 프로필렌 글리콜 등), 완충제 (포스페이트 완충제, 아세테이트 완충제, 보레이트 완충제, 카르보네이트 완충제, 시트레이트 완충제, 트리스 완충제, 글루타메이트 완충제, ε-아미노카프로에이트 완충제 등), 보존제 (p-옥시벤조에이트, 클로로부탄올, 벤질 알코올, 염화 벤잘코늄, 소듐 디히드로아세테이트, 소듐 에데테이트, 붕산, 붕사 등), 증점제 (히드록시에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 등), 안정제 (소듐 비술파이트, 소듐 티오술페이트, 소듐 에데테이트, 소듐 시트레이트, 아스코르브산, 디부틸히드록시톨루엔 등), pH 조정제 (염산, 수산화 나트륨, 인산, 아세트산 등) 등을 적절하게 함유한 용액에 저해제를 용해 또는 분산시킴으로써 제조할 수 있다.

전술한 시럽, 주사액 및 점안액에 사용되는 첨가제의 양은 사용되는 첨가제의 종류, 용도 등에 따라 다양하지만, 첨가제의 목적을 달성할 수 있는 농도로 첨가할 수 있으며, 등장제는 일반적으로 약 0.5 내지 약 5.0 w/v%로 첨가하여 삼투압을 약 229 내지 약 343 mOsm으로 만들도록 한다. 또한, 완충제는 약 0.01 내지 약 2.0 w/v%로 첨가하고, 증점제는 약 0.01 내지 약 1.0 w/v%로 첨가하며, 안정제는 약 0.001 내지 약 1.0 w/v%로 첨가한다. pH 조정제는 일반적으로 약 3 내지 약 9, 바람직하게는 약 4 내지 약 8의 pH에 도달되도록 적절하게 첨가한다.

본 발명의 약학적 활성제를 점안액으로서 특정하게 사용하는 경우에, 본 발명의 약학적 활성제에 함유된 Rho 단백질 저해제 농도의 하한은 일반적으로 약 0.00001 w/v%, 바람직하게는 약 0.00005 w/v% 또는 보다 바람직하게는 0.0001 w/v%로 조정되고, 상한은 약 0.1 w/v%, 바람직하게는 약 0.05 w/v%, 보다 바람직하게는 약 0.01 w/v%, 훨씬 바람직하게는 약 0.005 w/v% 또는 보다 훨씬 바람직하게는 약 0.001 w/v%로 조정된다.

본 발명의 약학적 활성제의 투여량은 목표 질환, 증상, 투여 대상, Rho 단백질 저해제의 종류, 투여 방법 등에 따라 다양하지만, 예를 들어 PRK 수술 후의 각막 지각 회복제로서 성인의 눈에 국소적으로 투여하는 경우에는, 예를 들면 C3 효소 약 0.001 w/v% 또는 N-(1-벤질-4-피페리지닐)-1H-인다졸-5-아민·2히드로클로라이드·1/2히드레이트와 같은 Rho 단백질 저해제 약 0.003 w/v%를 함유한 점안액을 바람직하게는 투여당 약 20 내지 약 50 μL로 1 일에 수회 점안한다.

또한, 본 발명의 약학적 활성제를 LASIK 수술 후의 각막 지각 회복제로서 성인에게 경구 투여하는 경우에는, 예를 들면 4-[2-(2,3,4,5,6-펜타플루오로페닐)아크릴로일]신남산과 같은 Rho 단백질 저해제 약 10 mg을 함유한 정제를 바람직하게는 1 일에 1 회 또는 2 회 투여한다.

본 발명을 하기 실험예 및 실시예에 따라 보다 상세하게 설명할 것인데, 이들은 제한적인 것으로서 간주되지 않는다.

실험예 1

배양된 토끼 삼차 신경 세포에서의 신경돌기형성에 대한 촉진 효과

1) 사용된 동물

Fukusaki Rabbit Warren으로부터 구입한 일본 백색 토끼 (생후 2 내지 3 일) 를 사용하였다.

2) 시험 물질

C3 효소 [Upstate 제조; 세포외효소 C3 (이. 콜라이에서 발현되는 재조합 효소); Catalog #13-118, Lot #23330].

3) 시험 방법

세포 배양: 삼차 신경 세포를 Chan 등의 보고 (Chan, Kuan Y. and Haschke, Richard H., Exp. Eye Res., 41: 687-699, 1985) 에 따라 분리하였다. 명확히 말하자면, 토끼를 에테르 마비하에서 식염수로 심장 관류시킨 후에, 삼차 신경절을 제거하여, 신경 분산액 (SUMITOMO BAKELITE Co., Ltd.) 을 사용하여 분산시킨 다음, 폴리리신으로 코팅한 8-웰 배양 슬라이드 (BECTON DICKINSON Co., Ltd.) 에 세포를 접종하였다. 세포수는 웰당 약 3 × 10³ 세포이고, 배양 조건은 5 % CO₂, 95 % 공기, 습도 100 % 및 37 ℃ 였다. 세포 배양을 위해서, B27 보충액 (GIBCO; 0.02 mL/mL 배양액) 및 L-글루탐산 (GIBCO; 최종 농도 1 mM) 을 첨가한 뉴로베이절 배지 (GIBGO) 를 사용하였고, 세포 접종 직후에 C3 효소 (2 ㎍/mL 최종 농도) 를 배지에 첨가하여 세포를 24 시간 동안 배양하였다.

면역염색: 배양 24 시간 후에, 세포를 4 % 파라포름알데히드로 실온에서 2 시간 동안 고정시키고, 신경 세포 특이성 중간체 필라멘트인 뉴로필라멘트를 특이적으로 인식하는 항-뉴로필라멘트 200 항체 (Sigma 제조) 및 이것과 반응하는 형광 2 차 항체 (Molecular Probes 제조) 를 사용하여 신경 세포체 및 신경돌기를 형광 염색하였다. 염색된 세포를 형광 현미경으로부터 컴퓨터로 상 (하나의 상: 1.83 mm × 1.36 mm) 으로서 이입시켜, 각 상의 전 세포수 (t) 를 계수하였다. 이와 함께, 세포 신경돌기의 길이를 상 분석 소프트웨어 (MacSCOPE, MITANI CO. 제조) 를 사용하여 측정하여, 길이가 세포체 직경의 2 배 이상인 신경돌기를 갖는 세포를 신경돌기형성 세포 (a) 로서 계수하였다. 각각의 상에서의 전 세포수의 합계 (t₁+t₂+…+t_n=Σt) 가 약 100 이상에 도달할 때까지 복수의 상을 이입시켰다. 그 다음, 세포수 합계 (Σt) 에 대한 신경돌기형성 세포수 합계 (a₁+a₂+…+a_n=Σa) 의 비율 (%) 을 계산하였다. 이 비율에 대해 C3 효소 첨가 군과 무첨가 군 (대조군) 을 비교하기 위해서, t-시험을 수행하여 위험률 5 % 미만을 유의적인 것으로 판정하였다.

4) 시험 결과

도 1은 배양된 토끼 삼차 신경 세포의 형광 현미경 상을 나타낸 것으로서, 여기서 A는 C3 효소 무첨가 배양액에서 24 시간 동안 배양한 대조군의 세포를 나타내고, B는 C3 효소를 최종 농도 2 ㎍/mL로 함유한 배양액에서 24 시간 동안 배양한 세포를 나타내며, 도 2는 각 군에서의 전 세포수에 대한 신경돌기형성 세포수의 비율을 나타낸다.

대조군에서는 전 세포수에 대한 신경돌기형성 세포의 비율이 약 21 %였고, C3 효소 첨가 군에서는 전 세포수의 약 46 % 였다. C3 효소의 첨가는 세포돌기 생성을 나타내는 세포수를 유의적으로 증가시켰다 (도 2).

이상의 결과로부터, Rho 저해 활성을 갖는 C3 효소는 삼차 신경 세포의 신경돌기 생성을 촉진함을 알 수 있었다.

실험예 2

배양된 토끼 삼차 신경 세포에서의 신경돌기 생성 촉진 효과

1) 사용된 동물

KITAYAMA LABES Co., Ltd.로부터 구입한 일본 백색 토끼 (생후 2 내지 3 일) 를 사용하였다.

2) 시험 물질

ROCK 저해제로서, 2-클로로-6,7-디메톡시-N-[5-1H-인다졸릴]퀴나졸린-4-아민, N-(1-벤질-4-피페리디닐)-1H-인다졸-5-아민 디히드로클로라이드, 4-[2-(2,3,4,5,6-펜타플루오로페닐)아크릴로일]신남산 및 파수딜 히드로클로라이드를 사용하였다.

사용된 2-클로로-6,7-디메톡시-N-[5-1H-인다졸릴]퀴나졸린-4-아민 (이하, 화합물 1로 기재함) 은 참고예 1에 따라 합성하였다. 사용된 N-(1-벤질-4-피페리디닐)-1H-인다졸-5-아민 디히드로클로라이드·1/2 히드레이트 (이하, 화합물 2로 기재함) 는 참고예 2에 따라 합성하였다. 사용된 4-[2-(2,3,4,5,6-펜타플루오로페닐)아크릴로일]신남산 (이하, 화합물 3으로 기재함) 은 참고예 3에 따라 합성하였다. 사용된 파수딜 히드로클로라이드 (이하, 화합물 4로 기재함) 는 시판용 파수딜 히드로클로라이드 히드레이트 주사액 "Eril Injection 30 mg" (Asahi Kasei Corporation 제조) 였다.

3) 세포 배양

삼차 신경 세포를 실험예 1에서와 동일한 방식으로 분리하였다. 세포 배양을 위해서, B27 보충액 (GIBCO 제조; 최종 농도 2 % v/v) 및 L-글루타민 (GIBCO 제조; 농도 1 mM) 을 뉴로베이절 배양액 (GIBGO 제조) 에 첨가함으로써 수득한 배양액을 사용하였다. 폴리리신/라미닌 코팅한 원형 커버 글래스 (직경 12 mm; SUMITOMO BAKELITE 제조) 를 24 웰 플레이트의 각 웰에 넣고, 세포를 커버 글래스 위에 약 3 × 10³세포/웰이 되도록 접종하였다. 세포가 커버 글래스에 접착된 후 (약 2 시간), 전술한 배양액을 각 시험 물질 (화합물 1, 최종 농도 10 μM; 화합물 2, 최종 농도 10 μM; 화합물 3, 최종 농도 1 μM; 화합물 4, 최종 농도 10 μM) 을 함유한 배양액으로 교체하고, 세포를 48 시간 동안 배양하였다. 배양 조건은 5 % CO₂, 95 % 공기, 습도 100 %, 37 ℃ 였다.

4) 면역염색

배양 48 시간 후의 세포를 2 시간 동안 실온에서 4 % 파라포름알데히드를 사용하여 고정시켰다.

신경 세포 특이성 중간체 필라멘트인 뉴로필라멘트를 인식하는 항-뉴로필라멘트 200 항체 (Sigma 제조) 및 이것과 반응하는 형광 2 차 항체 (Molecular Probes 제조) 를 사용하여, 고정된 표본을 형광 염색한 다음, 염색된 세포를 형광 현미경으로 검출하였다. 염색 상을 컴퓨터로 1 상: 1.83 mm × 1.36 mm으로서 이입시켰다. 각 상의 전 세포수 (t) 를 계수하였다. 이와 함께, 세포 신경돌기의 길이 및 세포체의 직경을 상 분석 소프트웨어 (MacSCOPE, MITANI CO. 제조) 로 측정하여, 길이가 세포체 직경의 2 배 이상인 신경돌기를 갖는 세포를 신경돌기형성 세포 (a) 로서 계수하였다. 그 다음, 세포수 합계 (Σt) 에 대한 신경돌기형성 세포수 합계 (a₁+a₂+…+a_n=Σa) 의 비율 (%) 을 계산하였다.

5) 통계학적 처리

Dunnet's 다중 시험에 의해서, 신경돌기형성 세포의 비율에 대해 무첨가 군 (대조군) 과 시험 물질 첨가 군을 비교하여, 위험률 5 % 미만을 유의적인 것으로 판정하였다.

6) 시험 결과

도 3은 배양된 토끼 삼차 신경 세포의 형광 현미경 상을 나타낸다.

도 3A는 시험 물질 무첨가 배양액에서 48 시간 동안 배양한 세포를 나타내고, 도 3B는 화합물 1 첨가 배양액에서 48 시간 동안 배양한 세포를 나타내며, 도 3C는 화합물 2 첨가 배양액에서 48 시간 동안 배양한 세포를 나타내고, 도 3D는 화합물 3 첨가 배양액에서 48 시간 동안 배양한 세포를 나타내며, 도 3E는 화합물 4 첨가 배양액에서 48 시간 동안 배양한 세포를 나타낸다.

도 4는 전 세포수에 대한, 무첨가 군 및 각각의 시험 물질 첨가 군의 신경돌기형성 세포수의 비율 (%) 을 나타낸다. 전 세포에 대한 신경돌기형성 세포의 비율은 무첨가 군에서 약 31 %, 화합물 1 첨가 군에서 약 41 %, 화합물 2 첨가 군에서 약 57 %, 화합물 3 첨가 군에서 약 51 %, 및 화합물 4 첨가 군에서 약 70 %였는데, 시험 물질 첨가 군은 신경돌기형성 세포 비율의 유의적인 증가 또는 증가 경향을 나타냈다.

이상의 결과로부터, ROCK 저해제는 삼차 신경 세포에서 신경돌기형성 촉진 효과를 나타냄이 명백해졌다.

참고예 1

2-클로로-6,7-디메톡시-N-[5-1H-인다졸릴]퀴나졸린-4-아민의 합성 (WO 02/076977, 실시예 1)

2,4-디클로로-6,7-디메톡시퀴나졸린 (8.6 g, 64.58 mmol), 5-아미노인다졸 (4.8 g, 36.04 mmol) 및 아세트산 칼륨 (7.351 g, 74.91 mmol) 을 테트라히드로푸란/정제수 (138 mL/62 mL) 에 첨가하고, 혼합물을 하룻밤 동안 실온에서 교반하였다. 정제수 (130 mL) 를 혼합물에 첨가하여 결정을 침전시켰다. 침전된 결정을 정제수로 세척하고, DMF-H₂O로부터 재결정시켜, 목적한 2-클로로-6,7-디메톡시-N-[5-1H-인다졸릴]퀴나졸린-4-아민을 미황색 분말로서 수득하였다.

용융점 278.7 내지 283.8 ℃.

C₁₇H₁₅N₅O₂Cl·1/2H₂O에 대한 분석 계산값: C, 55.97, H, 4.14, N, 19.20. 측정값: C, 56.05, H, 4.46, N, 19.22.

참고예 2

N-(1-벤질-4-피페리디닐)-1H-인다졸-5-아민 디히드로클로라이드 1/2 히드레이트의 합성 (WO 02/100833, 실시예 1)

1-벤질-4-피페리돈 (14.21 g, 75.1 mmol, 13.92 mL) 의 1,2-디클로로에탄 (80 mL) 용액에 실온에서 5-아미노인다졸 (10.0 g, 75.10 mmol), 트리아세트옥시소듐 보로히드라이드 (11.5 g, 52.6 mmol) 및 아세트산 (4.29 mL, 75.1 mmol) 을 첨가하고, 혼합물을 하룻밤 동안 실온에서 교반하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 1 N 수산화 나트륨 수용액에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 포화 염수로 세척하고, 무수 황산 마그네슘 상에서 건조시켰다. 용매를 감압하에서 증발시킴으로써 수득한 잔류물을 메탄올로부터 재결정시켜, N-(1-벤질-4-피페리디닐)-1H-인다졸-5-아민 (7.8 g, 34 %) 을 수득하였다.

용융점 150.1 내지 152.2 ℃.

C₁₉H₂₂N₄에 대한 분석 계산값: C, 74.48, H, 7.24, N, 18.29. 측정값: C, 74.42, H, 7.27, N, 18.37

수득된 N-(1-벤질-4-피페리디닐)-1H-인다졸-5-아민 (6.0 g, 19.58 mmol) 의 테트라히드로푸란 (60 mL) 용액에 실온에서 1 N 염산/에테르 용액 (38 mL) 및 4 N 염산/에틸 아세테이트 용액 (13 mL) 을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과에 의해서 수집하여, 메탄올로부터 재결정시킴으로써, N-(1-벤질-4-피페리디닐)-1H-인다졸-5-아민 디히드로클로라이드 1/2 히드레이트 (4.32 g, 56 %) 를 수득하였다.

용융점 193.0 내지 194.6 ℃.

C₁₉H₂₂N₄2HCl 1/2H₂O에 대한 분석 계산값: C, 58.76, H, 6.49, N, 14.43. 측정값: C, 58.49, H, 6.48, N, 14.45.

참고예 3

4-[2-(2,3,4,5,6-펜타플루오로페닐)아크릴로일]신남산의 합성 (JP2000-44513A, 실시예 8)

단계 1

질소 대기하에서 드라이 아이스로 냉각시키면서, (2,3,4,5,6-펜타플루오로페닐)아세트산 (20 g, 93.5 mol), 에테르 (7 mL) 및 농축 황산 (0.5 mL) 을 이소부텐 (27 mL) 에 첨가하고, 혼합물을 내압관 중 실온에서 3 일 동안 교반하였다. 10 % 탄산수소나트륨 수용액 및 얼음의 혼합물에 드라이 아이스로 냉각시킨 반응 혼합물을 첨가하고, 혼합물을 교반하였다. 에테르를 첨가하여 혼합물을 추출하였다. 유기층을 포화 염수로 세척하고, 무수 황산 마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 감압하에서 농축시켜, (2,3,4,5,6-펜타플루오로페닐)아세트산 t-부틸 에스테르 (24.4 g, 97 %) 를 수득하였다.

단계 2

4-포르밀벤조산 (20 g, 0.133 mol) 의 피리딘 (138 mL) 용액에 에틸 말로네이트 모노포타슘 염 (46 g, 0.270 mol), p-톨루엔술폰산 모노히드레이트 (50 g, 0.263 mol) 및 피페리딘 (2.0 mL) 을 첨가하고, 혼합물을 점진적으로 가열하였다. 혼합물을 120 ℃에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 빙냉하에서, 반응 혼합물을 2 N 염산으로 산성화시키고, 침전물을 수집하여 4-카르복시신남산 에틸 에스테르 (26.58 g, 91 %) 를 결정으로서 수득하였다.

단계 3

질소 대기하에서, 4-카르복시신남산 에틸 에스테르 (5.0 g, 22.7 mmol) 의 클로로포름 (15 mL) 용액에 염화 티오닐 (8.4 mL) 을 적가하고, 디메틸포름아미드 (1 방울) 를 첨가한 다음, 혼합물을 30 분 동안 가열 환류시켰다. 반응 혼합물을 감압하에서 농축시켜 산 클로라이드를 수득하였다.

질소 대기하에서 드라이 아이스로 냉각시키면서, 단계 1에서 수득한 (2,3,4,5,6-펜타플루오로페닐)아세트산 t-부틸 에스테르 (6.35 g, 23.5 mmol) 의 테트라히드로푸란 (100 mL) 용액에 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드의 1 M 톨루엔 용액 (26 mL) 을 적가하였다. 5 분 후에, 단계 2에서 수득한 산 클로라이드의 테트라히드로푸란 (100 mL) 용액을 적가하였다. 적가 완료 20 분 후에, 혼합물을 실온에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 5 % 시트르산 수용액 (120 mL) 을 반응 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 에테르로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 염수로 세척하고, 무수 황산 마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 감압하에서 농축시켰다. 수득된 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 4-[(2RS)-2-(t-부톡시카르보닐)-2-(2,3,4,5,6-펜타플루오로페닐)아세틸]신남산 에틸 에스테르 (4.83 g, 44 %) 를 결정으로서 수득하였다.

단계 4

단계 3에서 수득한 4-[(2RS)-2-(t-부톡시카르보닐)-2-(2,3,4,5,6-펜타플루오로페닐)아세틸]신남산 에틸 에스테르 (5.6 g, 11.6 mmol) 의 디옥산 (24 ml) 용액을 내압관에 넣고, 농축 염산 (24 ml) 을 첨가하였다. 혼합물을 130 ℃까지 가열하면서, 4 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙냉시키고, 침전물을 여과에 의해서 수집하여, 4-[(2,3,4,5,6-펜타플루오로페닐)아세틸]신남산 (3.7 g, 90 %) 을 결정으로서 수득하였다. 4-[(2,3,4,5,6-펜타플루오로페닐)아세틸]신남산 (2.03 g, 5.7 mmol) 의 디옥산 (115 mL) 용액을 내압관에 넣고, 파라포름알데히드 (0.7 g), 디메틸아민 히드로클로라이드 (1.86 g, 22.8 mmol), 아세트산 (10 방울) 및 무수 황산 마그네슘 (8 g) 을 첨가한 다음, 혼합물을 130 ℃까지 가열하면서, 하룻밤 동안 교반하였다. 빙냉하에서, 반응 혼합물을 0.1 N 염산으로 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 포화 염수로 세척하고, 무수 황산 마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 감압하에서 농축시켰다. 침전물을 여과에 의해서 수집하여 표기 화합물 (1.46 g, 93 %) 을 결정으로서 수득하였다.

용융점 214.0 내지 217.0 ℃.

실험예 3

토끼 삼차 신경절 및 각막 조직에서의 ROCK I, ROCK II의 단백질 발현

1) 사용된 동물

KITAYAMA LABES Co., Ltd.로부터 구입한 수컷 일본 백색 토끼를 사용하였다.

2) 조직 가용성 단백질의 제조

동물을 안락사시켜 삼차 신경절 및 각막을 적출하였다. 적출된 조직을 빙냉된 포스페이트-완충 염수 (Invitrogen 제조) 에 넣고, 세척한 다음, 0.1 % Triton X-100 (Pharmacia Biotech 제조) 및 1 정제/10 ml 의 프로테아제 저해제 칵테일 (complete, Mini; Roche 제조) 을 함유한 빙냉된 20 mM 트리스-히드로클로라이드 완충액 (pH 7.5) 에 넣고 초음파처리하였다. 초음파처리에 의해 수득된 각 조직 유래의 세포 조 파쇄액을 원심분리 (10,000 ×g, 15 분, 4°) 하고, 상등액을 회수하여 조직 가용성 단백질 용액을 수득하였다. 용액 중의 단백질 양은 BCA 단백질 분석 시약 (PIERCE 제조) 으로 정량하였다.

3) 웨스턴 블로팅을 사용한 ROCK I, ROCK II의 검출

제조된 조직 가용성 단백질에 함유된 ROCK I 및 ROCK II를 웨스턴 블로팅으로 검출하였다. 25 ㎍의 단백질을 함유한 제조 용액을 8 % SDS-폴리아크릴아미드 겔 (TEFCO 제조) 을 사용하여 전기영동에 의해서 분리하고, 겔 내의 분리된 단백질을 PVDF 막 (Immobilon-P; Millipore) 상에 전기적으로 이동시켰다. 단백질을 이동시킨 막을 5 % 탈지 우유로 블로킹한 후에, 염소 항-ROCK I 항체 또는 염소 항-ROCK II 항체 (둘 다 SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY 제조) 와 반응시키고, 알칼리성 포스파타아제 (AP) 콘쥬게이션된 항-염소 IgG 항체 [Bio-Rad (Richmond, CA) 제조] 로 2 차 표지하였다. AP 발색 키트 [Bio-Rad (Richmond, CA) 제조] 를 사용하여 항원을 면역검출하였다.

4) 시험 결과

웨스턴 블로팅의 결과를 도 5에 나타냈다. ROCK I 및 ROCK II 둘 다 토끼 삼차 신경절 및 각막 조직의 가용성 단백질 중에 단백질 수준으로 발현되었음이 확인할 수 있었다.

실시예 1: 정제

C3 효소 10 mg

락토오스 80 mg

전분 17 mg

스테아르산 마그네슘 3 mg

미세결정성 셀룰로오스 10 mg

상기 성분을 1 정제분의 재료로 사용하여, 통상의 방법에 따라 정제를 형성하였다. 정제는 필요에 따라 통상의 장용 코팅 (예를 들면, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트 등), 당의 (sugar coating) 또는 필름 (예를 들면, 에틸셀룰로오스) 으로 코팅할 수 있다. 주약인 C3 효소는 화합물 1, 2, 3 또는 4로 대체할 수도 있다. 첨가제의 배합비를 변경시킴으로써, 주약 함량이 20 mg, 5 mg, 1 mg, 0.5 mg 또는 0.1 mg/정제인 정제를 제조할 수 있다.

실시예 2: 캡슐

C3 효소 50 mg

만니톨 75 mg

전분 17 mg

스테아르산 칼슘 3 mg

상기 성분을 1 캡슐분의 재료로 사용하여, 균일하게 혼합하고, 통상의 방법에 따라 과립화한 다음, 경질 캡슐에 충전하였다. 충전 전에, 과립을 필요에 따라 통상의 장용 코팅 (예를 들면, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트), 당의 또는 필름 (예를 들면, 에틸셀룰로오스) 으로 코팅할 수 있다. 주약인 C3 효소는 화합물 1, 2, 3 또는 4로 대체할 수도 있다. 첨가제의 배합비를 변경시킴으로써, 주약 함량이 20 mg, 10 mg, 5 mg, 1 mg, 0.5 mg 또는 0.1 mg/캡슐인 캡슐을 제조할 수 있다.

실시예 3: 주사액

C3 효소 750 mg

카르복시메틸셀룰로오스 소듐 500 mg

주사용수 전량 100 mL

상기 성분을 통상의 방법에 따라 무균 혼합하여 주사액을 제조하였다. 주약인 C3 효소는 화합물 1, 2, 3 또는 4로 대체할 수도 있다. 첨가제의 배합비를 변경시킴으로써, 주약 함량이 1000 mg, 500 mg, 200 mg 또는 100 mg/100 mL인 주사액을 제조할 수 있다.

실시예 4: 점안액

C3 효소 5 mg

붕산 700 mg

붕사 적당량 (pH 7.0)

염화 나트륨 500 mg

히드록시메틸셀룰로오스 0.5 g

소듐 에데테이트 0.05 mg

염화 벤잘코늄 0.005 mg

멸균 정제수 전량 100 mL

멸균 정제수 (80 mL) 를 약 80 ℃까지 가열하고, 히드록시메틸셀룰로오스를 첨가한 다음, 액체 온도가 실온에 도달할 때까지 혼합물을 교반하였다. C3 효소, 염화 나트륨, 붕산, 소듐 에데테이트 및 염화 벤잘코늄을 이 용액에 첨가하여 용해시켰다. 적당량의 붕사를 첨가하여 pH를 7로 조정하였다. 멸균 정제수를 첨가하여 100 mL까지 측정하였다. 주약인 C3 효소는 화합물 1, 2, 3 또는 4로 대체할 수도 있다. 첨가제의 배합비를 변경시킴으로써, 주약 함량이 1 w/v%, 0.5 w/v%, 0.3 w/v%, 0.1 w/v%, 0.05 w/v%, 0.03 w/v%, 0.01 w/v%, 0.003 w/v% 및 0.001 w/v%인 점안액을 제조할 수 있다.

실시예 5: 점안액

C3 효소 10 mg

D-만니톨 4.5 g

인산 2수소 나트륨 0.1 g

수산화 나트륨 적당량 (pH 7.0)

멸균 정제수 전량 100 mL

C3 효소, D-만니톨 및 인산 2수소 나트륨을 멸균 정제수 (80 mL) 에 첨가하여 용해시켰다. 적당량의 수산화 나트륨을 첨가하여 pH를 5.0으로 조정하였다. 멸균 정제수를 첨가하여 100 mL까지 측정하였다. 제조된 점안약을 막 여과기로 무균 여과시켜, 1 회용 (단위 투여량) 용기에 충전 후 밀봉하였다. 주약인 C3 효소는 화합물 1, 2, 3 또는 4로 대체할 수도 있다. 첨가제의 배합비를 변경시킴으로써, 주약 함량이 1 w/v%, 0.5 w/v%, 0.3 w/v%, 0.1 w/v%, 0.05 w/v%, 0.03 w/v%, 0.005 w/v%, 0.003 w/v% 및 0.001 w/v%인 점안액을 제조할 수 있다.

Rho 단백질 저해제를 함유한 본 발명의 약학적 활성제는 삼차 신경 세포에 대한 신경돌기형성 촉진 효과를 갖기 때문에, 각막 신경 손상 등과 관련된 각막 지각의 기능 저하, 및 각막 지각의 기능 저하와 관련된 드라이 아이 증상을 개선시키는 데 유용하다. 구체적으로는, Rho 단백질 저해제를 적용함으로써, 백내장 수술 또는 LASIK 수술 후의 각막 지각 저하, 신경마비성 각막증, 각막 궤양, 당뇨병성 각막증 등과 같은 각막 신경변성과 관련된 각막 지각 저하 및 드라이 아이의 개선 효과를 기대할 수 있다.

이상, 본 발명의 일부 구현예를 상세하게 설명하였지만, 당업자라면 나타낸 특정 구현예에 대해, 본 발명의 신규한 교시 및 이점으로부터 실질적으로 벗어나지 않는 범위 내에서 각종 수정 및 변경이 가능함을 잘 알고 있을 것이다. 따라서, 이러한 수정 및 변경도 첨부된 청구의 범위에서 청구한 본 발명의 취지 및 범위 내에 포함시키고자 한다.

본 출원은 일본에서 출원된 특허 출원 제 114819/2003 호 및 제 273177/2003 호를 기초로 하고 있으며, 그 내용은 본 출원에서 참고로 인용된다.

Claims

Rho 단백질 저해제를 함유한 각막 신경돌기형성 촉진제.
Rho 단백질 저해제를 함유한 각막 신경 축색의 신장 촉진제.
Rho 단백질 저해제를 함유한 각막 지각의 회복제.
Rho 단백질 저해제를 함유한 드라이 아이 (dry eye) 치료제.
Rho 단백질 저해제를 함유한 각막 신경돌기형성 촉진용 약학적 조성물.
Rho 단백질 저해제를 함유한 각막 신경 축색의 신장 촉진용 약학적 조성물.
Rho 단백질 저해제를 함유한 각막 지각의 회복용 약학적 조성물.
Rho 단백질 저해제를 함유한 드라이 아이 치료용 약학적 조성물.
각막 신경돌기형성 촉진용 약학적 조성물의 제조를 위한 Rho 단백질 저해제의 용도.
각막 신경 축색의 신장 촉진용 약학적 조성물의 제조를 위한 Rho 단백질 저해제의 용도.
각막 지각의 회복용 약학적 조성물의 제조를 위한 Rho 단백질 저해제의 용도.
드라이 아이의 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 Rho 단백질 저해제의 용도.
각막 신경돌기형성의 촉진이 필요한 대상에게 Rho 단백질 저해제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 각막 신경돌기형성 촉진 방법.
각막 신경 축색의 신장 촉진이 필요한 대상에게 Rho 단백질 저해제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 각막 신경 축색의 신장 촉진 방법.
각막 지각의 회복이 필요한 대상에게 Rho 단백질 저해제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 각막 지각 회복 방법.
드라이 아이를 겪는 대상에게 Rho 단백질 저해제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 드라이 아이 치료 방법.