KR20050044855A

KR20050044855A - 인슐린 화합물의 제조 방법

Info

Publication number: KR20050044855A
Application number: KR1020047007129A
Authority: KR
Inventors: 보그스네스아르; 크리스티안센인군; 발쉬미드트퍼
Original assignee: 노보 노르디스크 에이/에스
Priority date: 2001-11-19
Filing date: 2002-11-15
Publication date: 2005-05-13
Also published as: EP1448786A2; JP2005509687A; JP4404631B2; RU2004118503A; RU2376379C2; ATE464390T1; WO2003044210A2; CA2464616C; CA2464616A1; IL161358A0; BR0213583A; HUP0500037A3; HUP0500037A2; KR100925381B1; PL210437B1; AU2002342597A8; DE60236014D1; AU2002342597A1; CN100424179C; IL161358A

Abstract

인슐린 전구체를 인슐린 화합물로 전환하는 바람직한 방법은 수용성 배지에서 효소적 펩티드 절단을 수행하고, 그 후에, 형성된 중간체 생성물을 제거하지 않고, 아미노산 에스테르 또는 펩티드 에스테르와 유기 용매를 첨가하여 원하는 연관이 일어나도록 하는 것이다.

Description

인슐린 화합물의 제조 방법{PROCESS FOR PREPARING INSULIN COMPOUNDS}

본 발명은 인슐린 인슐린 글라르긴 체를 선택적으로 인슐린 에스테르를 경유하여 인슐린 화합물로 전환하기 위한 개선된 방법과 관련된다.

인슐린은 혈당 농도의 조절에 관련된 췌장 호르몬이다. 예를 들어, 인간, 돼지, 소 인슐린, 인슐린 유사체 및 혼합 인슐린이 인슐린-의존적 당뇨병이 있는 환자에게 그들의 혈당 농도를 조절하기 위해서 제공된다.

돼지와 소 인슐린은, 대개 췌장선으로부터 제조된다. 인간 인슐린은 반합성적으로, 돼지 인슐린으로부터 제조할 수 있다. 대안적으로, 인간 인슐린과 많은 인슐린 유사체를 유전 공학에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 세균 또는 효모에서 수행되는 유전 공학에 의해, 인슐린 인슐린 글라르긴 체를 제조하고, 그 후 이것을 원하는 생성물로 전환한다. 이 전환은 다른 방식으로 수행될 수 있다.

한 가지 가능성은 펩티드 절단과 펩티드 커플링이 같은 반응 조건에서 같은 반응 혼합물에서 연속적으로 발생하는 이른바 트랜스펩티데이션이다. 예를 들어, US 특허 No. 4,343, 898 (Novo Industri) 참조.

다른 가능성은, 첫번째 단계에서, 인슐린 인슐린 글라르긴 체를 절단하여(예를 들어, Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem. 359 (1978),799 참조), 중간체 생성물을 분리하고, 그 다음, 첫번째 단계에서 사용된 것과 다른 반응 혼합물에서 원하는 커플링을 수행하는 것이다. 예를 들어, Nature 280(1979), 412. 참조.

EP 87,238 에 따르면, 적어도 약 50%(vol/vol) 부탄 -1,4-디올을 포함하는 약 75% 내지 97% (vol/vol)의 적어도 하나의 비-수성 반응 혼화성 용매를 포함하는 용매 시스템에서 트랜스펩티데이션 반응이 수행된다.

US 4,579, 820에 따르면, L- 특이적 세린 카르복시펩티다아제 효소, 예를 들어 카르복시펩티다아제 Y를 사용하여 트랜스펩티데이션 과정이 수행된다.

US 4,601,979(Nordisk Insulinlaboratorium)에 따르면, 트랜스펩티데이션 또는 오직 펩티드 커플링이 실질상 유기 용매가 없는 수성 반응 배지에서 수행된다.

WO 83/00504 (Nordisk insulinlaboratorium)에 따르면, 돼지 생성물을 카르복시펩티다아제 A로 처리하였고, 형성된 des-알라닌-B30 인슐린 생성물을 저급 알코올에서 현탁하고 이 현탁액을 L- 트레오닌 에스테르와 트립신의 용액과 혼합하였다. 모든 특정 실시예들에서, des-알라닌-B30 인슐린 생성물을 동결 건조 또는 침전에 의해 분리하였다.

본 발명의 목적은 선행 기술의 단점을 적어도 일부 극복 또는 개선하는 것이다. 따라서, 하기 언급된 세부 목적이 완전히 극복 또는 개선하는 것은 아니다.

정의

여기서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화 될 수 있는 아미노산을 말한다. 유사하게, 이는 아미노산에서 카르복시기로부터 히드록시가 제거되거나 및/또는 아미노 기로부터 수소가 제거된 용어 아미노산 잔기에 적용된다.

유사하게, 용어 펩티드와 펩티드 잔기는 아미노산 잔기로 구성되어 있다. 바람직하게는, 펩티드는 많아야 10개의 아미노산 잔기를 함유한다.

여기서 사용된 바와 같이, 용어 아미노산 아미드는 선택적으로 치환된 C 말단 카르복시 아미드기를 가지는 아미노산을 말한다.

여기서 사용된 바와 같이, 용어 펩티드 아미드는 선택적으로 치환된 C 말단 카르복시 아미드기를 가지는 펩티드를 말한다.

여기서 사용된 바와 같이, 용어 "인슐린 인슐린 글라르긴 체"는 인슐린과 유사하게, 2개의 펩티드 사슬 사이에 2개의 이황 결합(하나의 시스테인(Cys) 잔기부터 다른 시스테인 잔기까지)을 통해 서로 연결된 2개의 펩티드 사슬(인슐린의 A 와 B 사슬에 대응, 이하, A와 B 사슬로 지정된)로 구성된 폴리펩티드를 말하며 인슐린에서처럼, A 사슬에 있는 하나의 시스테인 잔기로부터 A 사슬에 있는 다른 시스테인 잔기로 이황 결합이 있다. 이 인슐린 인슐린 글라르긴 체에, B 사슬에 적어도 하나의 라이신 또는 아르기닌 잔기가 있다. 선택적으로, 이 인슐린 인슐린 글라르긴 체에, A 와 B 사슬은 B 사슬의 C 말단과 A 사슬의 N 말단사이에 세번째 펩티드 사슬(인슐린에서 연결된 펩티드에 대응)을 통해 서로 연결되어 있다. A 와 B 사슬이 각각 이 세번째 펩티드 사슬을 통해 서로 연결되어 있는 경우에, 라이신은 이 세번째 펩티드의 C 말단에 존재한다. 선택적으로, 이 인슐린 인슐린 글라르긴 체에, 네번째 펩티드 사슬은 B 사슬의 N 말단에 연결된다. 이 네번째 펩티드 사슬이 B 사슬의 N 말단에 연결된 경우에, 라이신은 이 네번째 펩티드 사슬의 C 말단에 존재한다. 그리고, 이 인슐린 인슐린 글라르긴 체에서, 세번째와 네번째 펩티드 사슬은 이 계산에서 제외된다는 조건하에 아미노산 잔기는 인간 인슐린과 비교하여 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85 %, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%의 동일성이 있다. 인간 인슐린에서, Cys^A6과 Cys^A11 사이, Cys ^A7 과 Cys^B7 사이, Cys^A20 과 Cys^B19 사이에 이황 결합이 있고 B29 위치에 라이신이 있다.

여기서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산 에스테르"는 C 말단 카르복시 보호기와 선택적으로, 히드록시 보호기를 가지는 아미노산을 말한다.

여기서 사용된 바와 같이, 용어 "펩티드 에스테르"는 적어도 C 말단 카르복시기가 카르복시 보호기를 가지는 펩티드를 말한다. 선택적으로, 히드록시기는 보호되고 선택적으로, 라이신 잔기의 ε-amino 기는 바람직하게는 소수성기로 예를 들어 적어도 10 개의 탄소 원자를 가지는 아실기로 파생된다. 바람직하게는, 펩티드 에스테르는 많아야 10 개의 아미노산 잔기를 함유한다.

여기서 사용된 바와 같이, 용어 친핵성 화합물은 아미노산 에스테르, 아미노산 아미드, 펩티드, 펩티드 에스테르, 펩티드 아미드를 말한다. 이러한 아미노산 에스테르에서, 아미노산 아미드, 펩티드, 펩티드 에스테르, 펩티드 아미드, 라이신 기에서 아미노 기는 선택적으로, 바람직하게는 소수성 기, 예를 들어, 적어도 10 개의 탄소 원자를 가지는 아실기로 파생된다.

여기서 사용된 바와 같이, 용어 "인슐린 화합물"은 돼지 인슐린, 소 인슐린, 인간 인슐린과 같이 어떠한 종에서 유래한 인슐린과 아연 염과 프로타민 염과 같은 염을 말한다. 그리고, 여기서 사용된 바와 같이, 용어 "인슐린 화합물"은 "인슐린 유사체"로 간략히 지정될 수 있는 것을 말한다. 여기서 사용된 바와 같이, 인슐린 유사체은 상기 인슐린 유사체이 충분한 인슐린 활성을 가진다면 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기와 교환되고/또는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 삭제 및/또는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 첨가되는 인슐린 화합물을 말한다. 인슐린 유사체의 예는 다음 특허와 동등물: US 5,618, 913; EP 254,516 ; EP 280,534 ; US 5,750, 497; US 6,011, 007에 기술되어 있다. 특이적 인슐린 유사체의 예는 인슐린 아스파르트(즉, [Asp^B28]인간 인슐린), 인슐린 리스프로(즉, [Lys^B28, Pro^B29] 인간 인슐린), 인슐린 글라르긴(즉,[Gly^A21, Arg^B31,Arg^B32] 인간 인슐린)이다. 여기 사용된 바와 같이 용어 "인슐린 유사체"은 또한 인슐린 파생물로 지정될 수 있는 것, 즉, 당업계의 능숙한 이가 일반적으로 인슐린의 파생물로 간주하는 화합물 예를 들어, 모 인슐린 분자에 존재하지 않는 치환기를 가지는 인슐린을 포함한다. 일반적 교본 참조. 인슐린 파생물의 예는 선택적으로 치환된 카르복시 아미드 기를 가지는 인슐린 또는 인슐린 유사체이다. 인슐린 파생물과 인슐린 유사체로 간주될 수 있는 화합물은 여기에서 용어 인슐린 유사체에 포함된다. 그러한 화합물의 예는 다음 특허와 동등물에 기술되어 있다: US 5,750, 497 과 US 6,011,007. 따라서, 특이적 인슐린 유사체의 추가 예는 인슐린 디터미르 (즉, des-Thr^B30 인간 인슐린 γLys^B29 테트라데카노일)이다. 본 발명에 의해 제조된 인슐린 화합물은 당뇨병 환자를 치료하는 데 사용되는 충분히 높은 항-당뇨병 활성을 가진다. 항-당뇨병 활성은 이른바 자유 지방 세포 검정을 사용하여 결정할 수 있다.

여기서 사용된 바와 같이, 용어 pH 값은 pH 값이 측정된 용액에 있는 pH 미터에 직접 연결된 칼로멜 조합 유리 전극을 담그어서 pH 미터 로 측정하는 값을 말한다. pH 미터는 수용성 표준 버퍼로 눈금을 정한다.

SEQ ID NO.:1 는 펩티드 부분 Glu-(Glu-Ala)₃-Pro-Lys- ; SEQ ID NO.:2 는 펩티드 부분 Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys-; SEQ ID NO.: 3은 펩티드 부분 Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr 이다.

본 발명의 간단한 기술

본 발명은 인슐린 화합물을 제조하는 과정과 관련된다. 이러한 인슐린 화합물은 약제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, B 사슬의 C 말단에 트레오닌(Thr)을 가지는 인슐린 화합물을 제조한다.

당업계에 능숙한 이, 예를 들어, 의사는 당뇨병 환자에게 투여하는 인슐린 화합수분 함량 과 언제 투여할 지를 결정할 수 있다.

본 발명의 방법에 대한 시작 물질은 펩티드 절단과 펩티드 커플링 반응 을 선호하고 중간체 생성물이 분리되지 않는 조건에서 이 두 반응을 거치는 인슐린 인슐린 글라르긴 체이다. 즉, 인슐린 인슐린 글라르긴 체는 펩티드 절단을 거치고 형성된 생성물, 즉, 중간체 생성물은 펩티드 연관을 거친다. 펩티드 절단을 선호하는 조건은 펩티드 연관을 선호하는 조건과 같지 않다. 따라서, 본 발명의 첫번째 단계, 즉 절단 단계 또는 절단 반응에서, 반응 혼합물에서 펩티드 절단을 선호하도록 반응 조건이 선택되고 본 발명의 두번째 단계, 즉 연관 단계 또는 커플링 반응에서, 반응 혼합물에서 반응 조건은 펩티드 결합을 선호하도록 변경된다.

본 발명의 한 구체예에서, 첫번째 단계에서, 인슐린 인슐린 글라르긴 체를 우세하게 수용성 배지에 용해하고 절단에 사용되는 효소를 첨가한다. 이 반응 혼합물은 유기 용매가 없거나 실질상 없다. 대안적으로, 반응 혼합물은 인슐린 인슐린 글라르긴 체의 적절한 용해성을 보증하는 특정 양의 유기 용매를 함유한다. 하지만, 효소적 절단에 원하지 않는 영향을 미치는 유기 용매를 사용하지 않는 것이 바람직하다. 본 발명 방법의 첫번째 단계에서, 라이신 잔기 또는 아르기닌 잔기에서 절단을 선호하도록 pH 값, 온도, 시간과 같은 반응 변수가 선택된다.

특정, 원하는 정도로 절단 반응이 수행될 때, 친핵성 화합물과 유기 용매는 반응 혼합물과 혼합되어(중간체 생성물의 이전 분리 없이), 친핵성 화합물이 원하는 중간체 생성물의 라이신 또는 아르기닌 잔기에 커플링된다. 이 단계에서, 커플링 반응 에 선호적으로 반응 변수가 설정된다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 친핵성 화합물은 아미노산 에스테르 예를 들어, 트레오닌 에스테르 또는 펩티드 에스테르이다.

그 후에, 원하면 보호기는 생성된 화합물로부터 제거된다.

알려진 트랜스펩티데이션 반응과 비교하여, 본 발명의 방법에 의해 획득된 잇점은 같은 양의 효소로 비슷하거나 더 높은 수율을 얻는 데 짧은 전체 반응 시간이다. 수용성 배지에서 절단, 중간체 생성물의 분리, 유기 용매와 물의 혼합물에서 결합하는 2개의 포트 반응과 비교하여, 본 발명의 방법에 의해 획득된 잇점은 짧은 전체 반응 시간, 적은 양의 효소의 사용, 쉬운 공정 흐름이다.

더 정확하게, 본 발명은 다음 구체예와 관련이 있다.

제 1항에서 명백하듯이, 첫번째로 펩티드 절단이 되고, 그 후에, 커플링 반응 이 나타난다.

간략하게, 절단 반응(즉, 효소적 절단)은 다음과 같이 수행된다:

인슐린 인슐린 글라르긴 체의 효소적 절단(즉, 펩티드 절단)은 적어도 약 55%, 바람직하게는 적어도 약 60%, 더 바람직하게는 적어도 70%의 물(중량/중량)을 함유하는 반응 혼합물에서 일어난다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 효소적 절단이 나타나는 반응 혼합물에서 인슐린 인슐린 글라르긴 체의 농도는 적어도 2 %, 바람직하게는 약 5 내지 약 10% (중량/vol)이다.

절단 반응은 바람직하게는 약 6 내지 약 11, 더 바람직하게는 약 8 내지 약 10의 범위의 pH 값을 가지는 중성 또는 염기성 배지에서 일어난다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 인슐린 인슐린 글라르긴 체의 양과 비교하여 효소의 양은 대략 0.05 내지 대략 5%(중량/중량), 바람직하게는 대략 0.1 내지 대략 2%의 범위에 있다.

트립신 효소는 본 발명을 수행하기 위한 재료가 아니다. 트립신은 명백히 소 또는 돼지에서 기원하여 고순도로 유용한 잘 특성이 규명된 효소이다. 미생물 에서 기원한, Acromobacter lyticus 프로테아제 I(이하 ALP로 지정)을 획득할 수 있다. 더욱이, 본래의 효소 또는 활성 고정된 효소 또는 효소 파생물이던 간에, 효소 형태는 본 발명을 실행하기 위한 재료가 아니다. 아르기닌의 C 말단에서 분리하는 것이 바람직하면, 트립신을 사용할 수 있고 라이신의 C 말단에서 분리하는 것이 바람직하면, 트립신 또는 ALP를 사용할 수 있다. 라이신의 C 말단에서 분리하기 위해서, ALP 가 바람직하다.

활성 효소 파생물의 예로서 아세틸화 트립신, 숙시닐화 트립신, 글루타르알데히드 처리된 트립신, 고정된 트립신 또는 ALP 파생물이 언급된다.

고정된 트립신 또는 ALP가 사용되면, 반응 혼합물에 현탁되거나 컬럼으로 포장된다.

대부분, 효소의 작용은 물과 용매 양의 상호관계, pH 값, 반응 온도에 의해 조절된다. 반응 혼합물에 있는 유기 용매의 농도를 증가시키고 pH 값을 중성 근처로 낮추면 보통의 효소 반응을 절단에서 연관쪽으로 이동시킨다. 온도를 낮추면 반응 비율을 감소시키며 또한 부산물 형성과 효소 변성을 감소시킨다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 인슐린 인슐린 글라르긴 체는 약 5 mM 내지 약 500 mM, 바람직하게는 약 20 mM 내지 약 200 mM 범위의 농도로 아세테이트 이온을 가지는 수용성 배지에 용해된다. 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄 아세테이트 또는 트리에틸 암모늄 아세테이트가 사용될 수 있다.

본 발명의 구체예에 따라, 인슐린 인슐린 글라르긴 체(펩티드)는 다음 일반식1로 예를 들 수 있다:

상기 식에서, Z_n과 Z_m은 서로 독립적으로 각각 n 과 m 아미노산 잔기를 함유하는 2개의 펩티드 부분을 나타낸다. R¹은 라이신 또는 아르기닌 잔기를 선택적으로 함유하는 펩티드 잔기를 나타낸다. R²는 아미노산 잔기 또는 펩티드 잔기를 나타내고, R³는 라이신 또는 아르기닌 잔기를 선택적으로 함유하는 펩티드 잔기를 나타내며, R⁴는 라이신 또는 아르기닌 잔기 또는 라이신 또는 아르기닌 잔기를 함유하는 펩티드 잔기를 나타내거나 R¹와 R⁴는 함께 라이신 또는 아르기닌 잔기를 함유하는 펩티드 잔기이며, 두 개의 수직선은 2개의 시스테인 잔기 사이의 이황 결합을 나타내고 R¹과 Z_n에 존재하는 2개의 시스테인 잔기 사이에 이황 결합이 있다.

바람직하게는, 식I의 인슐린 인슐린 글라르긴 체에 존재하는 아미노산 잔기는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있는 것들이다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따라, R¹ 과 R⁴ 에 있는 아미노산 잔기의 수가 함께 약 8 내지 약 50인 인슐린 인슐린 글라르긴 체가 사용된다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, Z_n은 12개 아미노산 잔기를 함유한다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, Z_m은 11개 아미노산 잔기를 함유한다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, R²는 1 개의 아미노산 잔기 예를 들어, Asn 또는 Gly를 함유한다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, R³ 는 6 개의 아미노산 잔기를 함유한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 인슐린 인슐린 글라르긴 체는 단일 사슬 인슐린 글라르긴 체, 즉 식I의 화합물이고 R¹과 R⁴는 함께 라이신 또는 아르기닌 잔기를 함유하는 펩티드 잔기이다. 따라서, 바람직하게는, 인슐린 인슐린 글라르긴 체는 돼지 인슐린, 토끼 인슐린, 개 인슐린 또는 고래 인슐린과 같은 포유동물 인슐린이 아니다.

본 발명의 다른 구체예에 따라, 식 I의 인슐린 인슐린 글라르긴 체는 인간 인슐린의 위치 A1부터 A21 과 위치 B1 부터 B29 까지에 존재하는 것과 같은 아미노산 잔기를 함유한다.

본 발명의 다른 구체예에 따라, B28 아미노산 잔기가 Asp라는 조건하에 식I의 인슐린 인슐린 글라르긴 체는 위치 A1부터 A21 과 위치 B1부터 B29 까지에 존재하는 것과 같은 아미노산 잔기를 함유한다.

본 발명의 다른 구체예에 따라, B28 아미노산 잔기는 Lys 이고 B29 아미노산 잔기는 Pro라는 조건하에 식I의 인슐린 인슐린 글라르긴 체는 인간 인슐린의 위치 A1부터 A21 과 위치 B1 부터 B29 까지에 존재하는 것과 같은 아미노산 잔기를 함유한다.

본 발명의 다른 구체예에 따라, A21 아미노산 잔기는 Gly 이고 B31 과 B32 아미노산 잔기는 Arg라는 조건하에 식 I의 인슐린 인슐린 글라르긴 체는 인간 인슐린의 위치 A1부터 A21 과 위치 B1 부터 B29 까지에 존재하는 것과 같은 아미노산 잔기를 함유한다.

본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 특이적 인슐린 인슐린 글라르긴 체의 예는 인간 전구 인슐린; 원숭이 전구 인슐린;[Ala³¹,Lys³²]-des(33-63) 돼지 전구 인슐린; 돼지 인슐린;[Asp²⁸]-des(30-65) 인간 전구 인슐린은 Glu-(Glu-Ala)₃-Pro-Lys-(SEQ ID NO.: 1)으로 N-말단적으로 확장되고; [Asp²⁸,Met³⁰,Trop³¹,Lys ³²]-des(33-65) 인간 전구 인슐린은 Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys-(SEQ ID NO.: 2)으로 N-말단적으로 확장된다.

식I의 인슐린 전구체는 출원 번호가 WO 01/49742, WO 01/49870, WO 01/079250, WO 02/079254인 국제 출원에 기술된 바와 같이 또는 유사하게 제조할 수 있고 이들의 내용은 여기에 참고 문헌으로 통합되어 있다.

원하는 중간체 생성물(즉, 원하는 절단 생성물)은 인슐린 전구체에 대응하고 적어도 하나의 라이신 또는 아르기닌 잔기는 절단되어 각각 라이실 또는 아르기닐 부분을 형성한다. 그리고 원하는 중간체 생성물에서, 2개의 이황 결합을 통해서 서로 연결된 A 와 B 사슬은 B 사슬의 C 말단과 A 사슬의 N 말단사이의 펩티드 사슬을 통해서 서로 연결되지 않는다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 원하는 중간체 생성물에 존재하는 아미노산 잔기의 수는 약 48 내지 약 52의 범위, 바람직하게는 약 49 내지 약 51 범위, 더 바람직하게는 50이다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 인간 인슐린의 대응하는 위치에 존재하지 않는 원하는 중간체 생성물에 존재하는 아미노산 잔기는 4개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 더 바람직하게는 2개 이하, 더 바람직하게는 1개 이하가 있다.

본 발명의 구체예에 따라, 원하는 중간체 생성물(원하는 절단 생성물)은 일반식 Ⅱ으로 예를 들 수 있다.

상기 식에서 Z_n 과 Z_m 은 각각 독립적으로, 각각 n 과 m 아미노산 잔기를 함유하는 두 개의 펩티드 부분을 나타내고 각각, R^,1은 펩티드 잔기를 나타내고, R^,2는 아미노산 잔기 또는 펩티드 잔기를 나타내고, R^,3 은 펩티드 잔기를 나타내고, R^,4 는 라이신 또는 아르기닌 또는 C 말단에 라이신 또는 아르기닌 잔기를 함유하는 펩티드 잔기를 나타내며, 2개의 수직선은 2개의 시스테인 잔기사이의 이황 결합을 나타내며 R^,1 과 Z_n에 존재하는 2개의 시스테인 잔기사이에 이황 결합이 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서,R^,1은 인간 인슐린에서 A1부터 A6 까지 이 순서로 아미노산 잔기이고 여기서 선택적으로, 아미노산 잔기의 한 개 또는 2개는 다른 아미노산 잔기와 교환되거나 아미노산 잔기의 한 개 또는 2개는 존재하지 않는다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, R^,2 는 -Asn 또는 -Gly이다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, R^,3 는 인간 인슐린에서 B1부터 B6 까지 이 순서로 아미노산 잔기이고 여기서 선택적으로, 아미노산 잔기의 한 개 또는 2개는 다른 아미노산 잔기와 교환되거나 아미노산 잔기의 한 개 또는 2개는 존재하지 않는다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, B28 에 Asp와 B29에 Lys를 가진다는 조건하에 R^,4는 인간 인슐린에서 B20부터 B29까지 이 순서로 아미노산 잔기이고 B28에 Lys를 가진다는 조건하에 B20부터 B28까지 이 순서로 아미노산 잔기이고 각각 선택적으로, 하나 또는 2개의 아미노산 잔기는 다른 아미노산 잔기와 교환되며 하나 또는 2개의 아미노산 잔기는 존재하지 않거나 이러한 펩티드 잔기의 일부는 C 말단으로부터 하나 또는 그 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 제외한다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, Z_n은 인간 인슐린에서 A8 부터 A19 까지 이 순서로 아미노산 잔기이고 여기서 선택적으로, 하나 또는 2개의 아미노산 잔기는 다른 아미노산 잔기와 교환되며 또는 하나 또는 2개의 아미노산 잔기는 존재하지 않는다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, Zm은 인간 인슐린에서 B8 부터 B18 까지 이 순서로 아미노산 잔기이며, 선택적으로, 하나 또는 2개의 아미노산 잔기는 다른 아미노산 잔기와 교환되거나 하나 또는 2개의 아미노산 잔기는 존재하지 않는다.

절단 반응과 커플링 반응동안에, 반응 온도는 반응 혼합물의 동결 온도부터 약 50˚C의 범위에 있다. 바람직한 온도는 약 0˚C 내지 약 25˚C의 범위에 있다.

간략하게, 커플링 반응은 다음과 같이 수행된다:

인슐린 전구체의 적어도 약 25 %, 바람직하게는 적어도 50 %, 더 바람직하게는 적어도 75 %, 바람직하게는 적어도 85 %, 더 바람직하게는 적어도 95 %가 원하는 중간체 생성물로 절단될 때 한편으로, 친핵성 화합물과, 다른 한 편으로, 유기 용매는 커플링 단계에 편리하거나 호의적인 반응 조건을 획득하기 위해서 절단이 되는 반응 혼합물과 혼합된다. 절단(전환)의 비율은 절단에 사용되는 반응 혼합물에서 가능한 균형에 근거한다. 대개, 효소적 절단 반응의 시작부터 특정 기간이 경과할 때까지, 원하는 중간체 생성물 예를 들어, 원하는 절단 생성물의 수율은 증가하여 최대 농도에 도달한다. 그 후에, 원하는 절단 생성물의 농도는 감소한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 커플링 반응이 일어나기 전에 절단 반응으로부터 형성되는 반응 혼합물로부터 조성물은 제거되지 않는다. 절단 반응 후에, 이를 수행하는 단순한 방법은 친핵체 화합물과 충분한 양의 유기 용매를 첨가하는 것이다. 이 방식으로, 예를 들어, 절단 단계에서 사용된 효소는 또한 커플링 단계에서 사용된다.

본 발명의 방법은 또한 원하는 중간체 생성물 외에 적은 양의 부분적으로 절단된 인슐린 전구체 및/또는 반응하지 않는 인슐린 전구체를 함유하는 반응 혼합물에서 커플링 반응을 포함한다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 친핵성 화합물은 아미노산 아미드 또는 펩티드 아미드이고 여기서 카르복시 아미드기는 치환되지 않거나 많아야 16 개 이하의 탄소 원자가 있는 알킬기와 단일 또는 이중 치환되며 인접한 질소 원자와 함께 알킬기는 링을 형성하거나 카르복시 아미드기는 아릴기와 단일 또는 이중 치환된다. 지방성 치환기가 바람직하다. 치환된 카르복시 아미드기의 예는 N,N-디메틸 카르복시 아미드, N, N-디에틸 카르복시 아미드, N-헥실카르복시 아미드이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 뉴클레오티드 화합물은 아미노산 에스테르이고 여기서 카르복실기는 보호되고 히드록시기는 선택적으로 보호된다. 본 발명의 추가 구체예에서, 뉴클레오티드 화합물은 트레오닌 에스테르이고 카르복실기는 보호되고, 선택적으로, 히드록시기는 보호된다. 따라서, L-트레오닌 에스테르는 다음 일반식 Ⅲa 으로 예를 들 수 있다:

Thr(R⁵)-OR ⁶ (Ⅲa)

상기 식에서 R⁶는 카르복실 보호기를 나타내고, R⁵는 수소 또는 하이드록실 보호기를 나타낸다. 더 분명하게 나타내기 위해서, 트레오닌 에스테르는 일반식 CH₃-CH(OR ⁵)-CH(NH₂)COOR ⁶로 예를 들 수 있고 R⁶와 R⁵는 상기 언급된 바와 같다.

일부 친핵성 화합물은 알려진 화합물이고 남아 있는 친핵성 화합물은 알려진 화합물의 제조와 유사하게 또는 알려진 방법과 유사하게 제조될 수 있다.

친핵성 화합물은 염산, 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트와 같은 자유 염기 또는 이것의 가용성 염 형태로 사용된다.

커플링 반응을 개시할 때, 친핵성 화합물과 원하는 중간체 생성물의 몰 비율이 바람직하게는 약 5: 1 을 초과하여 상당한 양의 친핵성 화합물이 커플링 반응 혼합물 용액에 존재하는 것이 바람직하다. 커플링 반응을 시작할 때, 반응 혼합물에 있는 친핵성 화합물의 농도는 바람직하게는 0.1 몰을 초과해야 하고, 상위 농도 제한은 이것의 용해성이어야 한다.

본 발명을 수행하기 위해서 여기에서 중요한 양태로 간주되는 60% 수율을 획득하기 위해서, 반응 온도, 수분 함량 , pH 값은 기술된 범위 내에서 상호관련되어 있다.

본 발명을 수행하는 데 적절한 유기 용매는 물과 혼합될 수 있고 고농도의 원하는 중간체 생성물(예를 들어 식 Ⅱ)과 친핵성 화합물을 함유할 수 있는 극성 용매이다. 적절한 유기 용매의 예는 N,N-디메틸 포름아미드, N,N-디메틸 아세트아미드, N-메틸피롤리돈-2, 디메틸 설폭사이드와 같은 비양성자성 용매와 아세트산, 에탄올, 메탄올, 2-프로판올, 1-프로판올, 부탄올, 1,4-부탄 디올과 같은 양성자성 용매이다. 디옥산, 아세톤, 테트라하이드로퓨란, 포름아미드, 아세토니트릴을 또한 사용하고 친핵성 화합물로 사용되는 아미노산 에스테르를, 전적으로 또는 부분적으로, 유기 용매로 사용할 수 있다. 용매의 성질은 전체적으로 시스템에 영향을 주고 고수율을 내는 용매에 적합한 상호관계는 다른 용매에 적용되지 않는다. 최상의 수율 결과는 비양성자성 용매로 획득하고, 비양성자성 용매는 본 발명을 수행하기 위해 가장 선호된다.

명백하게, 반응 혼합물에 있는 수분 함량을 계산 또는 결정할 때, 친핵성 화합물이 유기 용매로 간주된다.

염산, 포름산, 아세트산, 프로피온산 또는 부탄산과 같은 산 또는 피리딘, 트리스, N-메틸모포린, 트리에틸아민 또는 N-에틸모포린과 같은 염기의 첨가는 선택적이다. 이것들은 반응 혼합물에 포함되어서 적절한 pH 값으로 유도한다. 광물 산 또는 염기가 본 발명을 수행하는 데 사용되어도, 유기 산과 염기 특히 상기 확인된 것들이 바람직하다. 유기 산이 가장 바람직하다.

커플링 반응을 시작할 때, 반응 혼합물에 있는 트립신 또는 ALP(결정 트립신 또는 ALP 또는 대응하는 트립신 또는 ALP 파생수분 함량 으로 계산되는)와 원하는 중간체 생성물의 중량비는 바람직하게는 약 1: 1000 내지 약 1: 10, 더 바람직하게는 약 1: 200 내지 약 1: 50 이다.

일부 경우에, 절단 단계에 첨가되는 효소는 커플링 반응을 수행하는데 효과적이며, 그러한 경우에, 커플링 단계 동안에 효소의 추가량을 첨가할 필요는 없다. 다른 경우에, 커플링 단계동안에 효소의 추가량을 첨가하는 것이 바람직하다.

용액에 있는 원하는 중간체 생성물과 친핵성 화합물의 고농도가 높은 전환 비율을 촉진하기 때문에, 용매 선택은 반응물이 용해성인 용매쪽으로 편향된다. 반응물이 고농도로 존재해야 하기 때문에 친핵성 화합물의 용해성이 특히 중요하다. 커플링 반응을 개시할 때, 원하는 중간체 생성물에 대한 친핵성 화합물의 몰 비율은 바람직하게는 5: 1, 바람직하게는 50: 1 을 능가한다. 커플링 반응을 시작할 때, 반응 혼합물에 있는 친핵성 화합물의 농도는 바람직하게는 적어도 0.1 몰이어야 한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 인슐린 분자에서 실질적인 역행할 수 없는 변경을 야기하는 조건하에서 형성된 인슐린 화합물로부터 제거될 수 있고 카르복시 보호기를 가지는 친핵성 화합물을 사용한다. 그러한 카르복실 보호기의 예는 저급 알킬, 예를 들어, 메틸, 에틸, 3차-부틸과 p-메톡시 벤질, 디페닐메틸, 2,4,6-트리메틸벤질, 일반식 -CH₂-CH₂-SO₂R⁷의 기(여기서R ₇은 메틸, 에틸, 프로필, n-부틸과 같은 저급 알킬을 나타낸다)와 같은 치환된 벤질 기이다.

적절한 하이드록실 보호기는 인슐린 분자에서 실질적인 역행할 수 없는 변경을 야기하지 않는 조건에서 제거될 수 있는 것들이다. 그러한 기의 예로서 3차-부틸이 언급될 수 있다.

사용되는 추가 보호기는 Wunch : Metoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), Vol. XV/1, editor: Eugen Muller, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974에 기술되어 있다.

본 발명의 구체예에 따라, 본 발명의 방법은 일반식 IV 의 화합물을 생성한다:

상기 식에서 Z_n 과 Z_m 은 각각 독립적으로, 각각 n 과 m 아미노산 잔기를 함유하는 두 개의 펩티드 부분을 나타내며 R^,1은 펩티드 잔기, R^,2 는 아미노산 잔기 또는 펩티드 잔기, R^,3 는 펩티드 잔기를 나타내고, R^,4는 상기 언급되어 있으며 R ^,6 는 카르복시 보호기 또는 펩티드 잔기, 선택적으로 카르복시 보호기를 가지는 아미노산이다.

인슐린 화합물에 존재하는 카르복시 보호기(예를 들어, R⁶)와 히드록시 보호기(예를 들어, R⁵)가 알려진 방법 또는 원래 알려진 방법으로 제거될 수 있다. 카르복시 보호기가 메틸, 에틸 또는 일반식 -CH₂-CH₂-SO₂R⁷의 기(R₇은 상기 정의되어 있다)인 경우에, 수용성 배지에서 적당한 염기성 조건 바람직하게는 약 8 내지 약 12의 범위, 예를 들어, 약 9.5의 pH 값에서 상기 보호기는 제거될 수 있다. 염기는 예를 들어, 3차 아민, 예를 들어 트리에틸 아민, 수산화 나트륨과 같은 염기성 금속의 수산화물 또는 수산화 칼슘 또는 수산화 마그네슘과 같은 염기성 토금속의 수산화물과 같은 강한 염기가 사용될 수 있다. 카르복시 보호기가 3차-부틸인 경우에, p-메톡시 벤질 또는 2,4,6-트리메틸벤질 또는 디페닐메틸과 같은 치환된 벤질과 같은 상기 기는 산가수분해, 바람직하게는 트리플루오로아세트산으로 제거될 수 있다. 트리플루오로아세트산은 비수용성이거나 약간의 물을 함유하거나 디클로로메탄과 같은 유기 용매로 희석된다. 히드록시 보호기(예를 들어,R₅)가 3차-부틸인 경우에, 상기 기는 산가수분해로 제거될 수 있다. 상기 참조.

바람직하게, 제조된 인슐린 화합물은 히드록시 보호기가 없다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 인슐린 전구체(예를 들어, 식 I)를 카르복시 보호기가 없는 인슐린 화합물을 형성하도록 비차단될 수 있는 B 사슬의 C 말단 아미노산 잔기에 카르복시 보호기를 가지는 인슐린 화합물(예를 들어, 식 IV)로 전환한다.

상기 설명에 따라 반응 조건을 선택하고 다음 예에서 얻은 결과를 고려할 때, 60% 이상 수율로, 80% 이상 수율로, 90% 이상 수율의 특정 바람직한 조건에서 인슐린 화합물을 획득하는 것이 가능하다.

본 발명의 방법으로, 수용가능한 순도의 인슐린 화합물을 획득할 수 있고 원하면 치료 목적으로 더 정제될 수 있다.

더 특이적으로, 예를 들어, 인슐린 아스파르트는 Glu-(Glu-Ala)₃-Pro-Lys-(SEQ ID NO.: 1)으로 N-말단적으로 확장되는 [Asp²⁸]-des(30-65) 인간 전구 인슐린과 같은 인슐린 전구체의 ALP 로 효소 절단과 L-트레오닌 메틸 에스테르와 같은 친핵성 화합물과 커플링에 후속하여 가수분해로 제조할 수 있다.

인슐린 리스프로는 예를 들어, 돼지 인슐린과 같은 전구체의 트립신으로 효소적 절단에 의해 그리고 Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr (SEQ ID NO.: 3)과 같은 친핵성 화합물과의 커플링으로 제조할 수 있다.

인슐린 글라르긴은 예를 들어, [Gly⁸⁶]-des(30-65) 인간 전구 인슐린과 같은 인슐린 전구체의 ALP로 효소적 절단과 Thr-Arg-Arg-OMe 과 같은 친핵성 화합물과 커플링에 후속하여 가수분해로 제조할 수 있다.

여기에서 사용되는 축약은 IUPACIUB Commission on Biochemical Nomenclature에 의해 승인된(1974) 규칙과 일치한다. Collected Tentative Rules & Recommendations of the Commission on Biochemical NomenclatureIUPAC-IUB, 2^nd edition, Maryland 1975. 참조

여기에 참고문헌으로 언급하는 것은 선행 기술문을 구성한다는 승인이 없다.

여기에서, 단어 "이루어지다" 는 "포함한다", "함유한다 "또는 "함축하다"를 의미하는 것으로 널리 해석된다(EPO 지침서 C 4.13 참조).

다음 실시예는 제한없이 예시를 통해서 제공된다.

실시예 1.

200 mg 의 [Ala³¹,Lys³²]-des (33-63) 돼지 전구 인슐린을 1.35 ㎖ 물에 현탁하고 10 ㎕의 트리에틸 아민으로 pH 값을 9 로 조정한다. 375 ㎕ N, N-디메틸 아세트아미드와 460 ㎕ 물의 혼합물을 약간 흔들어서 첨가하고 형성된 용액에 Achromobacter lyticus 라이실 특이적 프로테아제 (EC 3.4. 21.50) (여기에 ALP로 지정된)의 5.4 mg/ml 수용액 315㎕를 첨가한다. pH 값을 20 ㎕ 트리에틸 아민으로 9.8 로 조정하고 반응 용액을 1 시간동안 23 ℃에 놓았다. 반응 용액을 70㎕ 4 N 염산을 첨가하여 산성화하고 얼음조에서 냉각시킨다. 4.85 ㎖ N, N-디메틸 아세트아미드에 있는 300 mg L-트레오닌 메틸 에스테르의 용액을 첨가하고 450 ㎕ 4 N 염산을 첨가하여 pH 값을 6.5 로 조정한다. 반응 용액을 4 시간동안 23 ℃에 놓고 그 후에 염산을 첨가하여 pH 값을 3 이하로 하여 반응을 멈춘다. 0.125 M 암모늄 설페이트를 함유하는 에탄올-물 희석제로 4mm x 250 mm 5 ㎛ C18 실리카 칼럼에서 역 상 HPLC 분석을 하여 pH 값을 4로 조정하고, 전체 반응 5 시간 후에 인간 인슐린 메틸 에스테르로 86%의 전환 수율이 발견되었다.

비교를 위해서, 한 단계 전환이 수행되었다:

100 mg[Ala³¹, Lys³²]-des (33-63) 돼지 전구 인슐린을 887㎕ 물과 175㎕ N, N-디메틸 아세트아미드의 혼합물에 현탁한다. 150 mg L-트레오닌 메틸 에스테르를 2.265 ㎖ N, N-디메틸아세트아미드에 용해하고 천천히 얼음으로 냉각된 혼합물에 첨가한다. pH 값을 340 ㎕ 아세트산으로 6.5 로 조정하고 ALP 의 5.4 mg/ml 수용성 용액 158 ㎕ 을 첨가한다. 전환 반응 후에 산성화된 표본의 RP-HPLC 분석이 후속한다. 5시간 후, 인간 인슐린 메틸 에스테르로 53% 전환이 발견되었고 24 시간 후에 전환은 최대 87% 에 도달했다.

10 mg/ml의 농도에서 pH 10에서 물에 용해하여 분리된 인간 인슐린 메틸 에스테르는 인간 인슐린으로 전환되었다. 1 N 염산으로 pH 값을 5.2 로 조정하여 반응은 24시간 후에 종결되었고 침전된 인간 인슐린을 원심분리로 분리하고 역 상 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하였다.

같은 반응 시간, 예를 들어, 5 시간에, 본래 알려진 과정과 비교하여 본 발명의 방법에 의한 수율은 62 %로 개선되었다. 본래 알려진 한 단계 전환의 반응 시간이 거의 5배로 연장되면, 본 발명의 방법에 대한 반응 시간과 비교하여 2가지 공정은 거의 같은 수율을 획득하였다.

실시예 2.

200 mg 의 돼지 인슐린을 1.37 ml의 물에 현탁하고, 294 ㎕ 의 N-메틸-2-피롤리돈과 326 ㎕ 물의 혼합물을 약간 교반하여 첨가하였다. 10㎕의 2 N 수산화 나트륨으로 pH 값을 9.0 으로 조정하고 형성된 용액에 ALP의 5.4 mg/ml 수용성 용액의 315 ㎕를 첨가하였다. pH 값을 12 ㎕ 2 N 수산화 나트륨으로 9.8 로 조정하고 반응 용액을 4 시간동안 23 ℃에 놓았다. 반응 용액을 70 ㎕ 4 N 염산을 첨가하여 산성화하고 얼음조에서 냉각하였다. 4.4 ml N-메틸-2-피롤리돈에 있는 300 mg L-트레오닌 메틸 에스테르의 용액을 500 ㎕ 4 N 염산으로 산성화한다. 인슐린 용액을 천천히 첨가하고 pH 값을 50㎕ 2 N 염산으로 6.5로 조정하였다. 반응 용액을 4 시간동안 23 ℃에 놓고 그 후에 염산을 pH 3 이하까지 첨가하면 반응은 멈추었다. pH 4로 조정된 0.125 M 암모늄 설페이트를 함유하는 에탄올-물 용리제로 4mm x 250 mm 5 ㎛ C18 실리카 칼럼에서 역 상 HPLC 분석으로, 전체 반응 8 시간 후에인간 인슐린 메틸 에스테르로 86%의 전환 수율이 발견되었다.

비교를 위해 , 한 단계 전환이 수행되었다:

100 mg 돼지 인슐린을 848㎕ 물과 147 ㎕ N메틸-2-피롤리돈의 혼합물에 현탁한다. 150 mg L-트레오닌 메틸 에스테르를 2.2 ml N-메틸-2-피롤리돈에 용해하고 얼음으로 냉각된 혼합물에 천천히 첨가하였다. pH 값을 300 ㎕ 아세트산으로 6.5 로 조정하고 ALP 의 5.4mg/ml 수용성 용액 158 ㎕을 첨가한다. 반응 용액을 23 ℃에 놓고 전환 반응 후에 산성화된 표본의 RP-HPLC 분석이 후속한다. 8 시간 후에, 전환은 54% 로 발견되고 48 시간 후에 인간 인슐린 메틸 에스테르로 최대 86% 전환되었다.

분리된 인간 인슐린 메틸 에스테르는 염기성 가수분해로 인간 인슐린으로 전환될 수 있다.

같은 반응 시간에, 예를 들어, 8 시간, 본 발명의 방법 수율은 본래 알려진 방법과 비교하여 59 % 로 개선되었다. 본래 알려진 한 단계 전환의 반응 시간이 거의 6배로 연장되면, 본 발명의 방법에 대한 반응 시간과 비교하여 두 가지 공정은 거의 같은 수율을 획득하였다.

실시예 3.

펩티드 Glu-(Glu-Ala)₃-Pro-Lys-(SEQ ID NO.:1)로 N-말단적으로 확장된 200 mg [Asp²⁸]-des(30-65) 인간 전구 인슐린을 1.35 ml의 물에 현탁한다. 350 ㎕ 의 N,N-디메틸 포름아미드와 425㎕ 물의 혼합물을 약간 교반하여 첨가하고 45 ㎕ 의 트리에틸아민으로 pH 값을 9로 조정한다. 형성된 용액에 ALP의 8.5 mg/ml 수용성 용액의 200 ㎕를 첨가하고 pH 값을 20 ㎕ 트리에틸아민으로 9.8 로 조정한다. 반응 용액을 1 시간동안 23 ℃에 놓았다. 반응 용액을 70 ㎕ 4 N 염산을 첨가하여 산성화하고 얼음조에서 냉각하였다. 4.95 ml N,N-디메틸포름아미드에 있는 300 mg L-트레오닌 메틸 에스테르의 용액을 첨가하고 pH 값을 470 ㎕ 4 N 염산을 첨가하여 6.5로 조정한다. 반응 용액을 4 시간동안 23 ℃에 놓고 그 후에 염산을 pH 3 이하까지 첨가하면 반응은 멈추었다. pH 4로 조정된 0.125 M 암모늄 설페이트를 함유하는 에탄올-물 용리제로 4mm x 250 mm 5 ㎛ C18 실리카 칼럼에서 역 상 HPLC 분석으로, 전체 반응 5 시간 후에 [Asp^B28]-인간 인슐린 메틸 에스테르로 87%의 전환 수율이 발견되었다.

비교를 위해 , 한 단계 전환이 수행되었다:

펩티드 Glu-(Glu-Ala)₃-Pro-Lys-(SEQ ID NO.: 1)로 N-말단적으로 확장된 90 mg[Asp²⁸]-des(30-65) 인간 전구 인슐린을 887 ㎕ 물과 175 ㎕ N, N-디메틸 포름아미드의 혼합물에 현탁하였다. 150 mg L-트레오닌 메틸 에스테르를 2.13 ㎖ N, N-디메틸 포름아미드에 용해하고 얼음-냉각된 혼합물에 천천히 첨가하였다. pH 값은 250 ㎕ 아세트산으로 6.5로 조정하고 ALP 의 8.5 mg/ml 수용성 용액의 118 ㎕을 첨가한다. 전환 반응 후에 산성화된 표본의 RP-HPLC 분석이 후속한다. 5 시간 후에, 전환은 47% 로 발견되고 24 시간 후에 [Asp^B28]-인간 인슐린 메틸 에스테르로 전환은 최대 81 %에 도달했다.

분리된 인슐린 메틸 에스테르는 염기성 가수분해로 [Asp^B28]-인간 인슐린으로 전환될 수 있다.

같은 반응 시간, 예를 들어, 5 시간에, 본 발명의 방법에 의한 수율은 본래 알려진 방법과 비교하여 거의 2배가 되었다. 본래 알려진 한 단계 전환의 반응 시간이 거의 5배로 연장되면, 본 발명의 방법에 대한 반응 시간과 비교하여 2 방법에 의한 비교할만한 수율을 획득하였다.

실시예 4

펩티드 Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys-(SEQID NO.: 2)로 N-말단적으로 확장된 1.5 g 인슐린 아스파르트 전구체[Asp²⁶, Met³⁰, Trp³¹, Lys³²]-des(33-65) 인간 전구 인슐린을 3.5 g 물에 현탁한다. 약간 교반하고 주위 온도에서, 4M 수산화 나트륨을 점차로 pH 값 10.67 까지 첨가하여 전구체를 용해한다. 물에 있는 에탄올의 45 %(중량/중량) 용액의 3.7 g 을 첨가한다. ALP 의 5.8 mg/ml 수용성 용액 1.5 ml 를 첨가하고 혼합물을 2 시간동안 반응하도록 한다. pH 값은 4 N 염산을 첨가하여 4.7 로 조정한다. 2.025 g L-트레오닌 에틸 에스테르를 16.2 ml 에탄올에 녹이고 용액을 최대 온도 15 ℃에서 첨가한다. pH 값은 4 N 염산으로 6.5로 조정하였다. 온도를 주위 온도로 조정하고 반응 혼합물을 20 시간동안 이 온도에 놓았다. pH 3.6 으로 조정된 200mM 나트륨 설페이트를 함유하는 아세토니트릴 -물 용리제로 4mm x 250 mm 5 ㎛ C18 실리카 칼럼에서 역 상 HPLC 분석으로, 반응 1 시간 후에 89. 1 % 의 인슐린 아스파르트 에틸 에스테르 전환 수율이 발견되고 반응 20 시간 후에, 90.5% 의 전환 수율이 발견되었다.

분리된 인슐린 아스파르트 에틸 에스테르는 염기성 가수분해로 인슐린 아스파르트로 전환될 수 있다.

실시예 5

펩티드 Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys-(SEQ ID NO.: 2)으로 N-말단적으로 확장된 10.9 g 인슐린 아스파르트 전구체[Asp ²⁸,Met ³⁰,Trp ³¹,Lys³²]-des(33-65) 인간 전구 인슐린을 49.3 g 물에 현탁한다. 약하게 교반하고 주위 온도에서, 0.36 M 수산화 나트륨, 0.27 M 초산 나트륨, 36 % N-메틸-2-피롤리돈을 함유하는 혼합물로부터 37.6 g 을 점차로 첨가하여 전구체를 용해한다. 9.2 ㎖ 0.5 M 수산화 나트륨으로 pH 값을 9.7로 조정한다. ALP의 7.1 mg/mL 수용성 용액의 7.1 mL 을 첨가하고 혼합물을 5 시간동안 반응하도록 한다. 반응동안 0.5 M 수산화 나트륨을 첨가하여 pH 값은 9.7 로 일정하게 유지되었다. 반응 혼합물을 5℃ 로 냉각하고 2.73 g 4 N 염산을 첨가하여 pH 값을 5.7 로 조정하였다. 14.02 g L-트레오닌 에틸 에스테르를 첨가하고 pH 값은 4 N 염산으로 6.0 으로 조정하였다. 344 g 냉각된 (4 ℃ ) N-메틸-2-피롤리돈을 첨가한다. 온도를 22℃로 조정하고 pH 값은 4 N 염산으로 6.5로 조정되었다. 반응 혼합물을 9 시간동안 이 온도에 놓았다. pH 3.6 으로 조정된 200mM 나트륨 설페이트를 함유하는 아세토니트릴 -물 용리제로 4mm x 250 mm 5 ㎛ C18 실리카 칼럼에서 역 상 HPLC 분석으로, 전체 반응 14 시간 후에 인슐린 아스파르트 에틸 에스테르로 87. 5 % 의 전환 수율이 발견되었다.

<110> Novo Nordisk A/S <120> PROCESS FOR PREPARING INSULIN COMPOUNDS <150> PCT/PA 2001 01716 <151> 2002-11-19 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 1 Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Pro Lys 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 2 Glu Glu Gly Glu Pro Lys 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 3 Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr 1 5

Claims

a) 적어도 약 55%, 바람직하게는 적어도 약 60 %, 더 바람직하게는 적어도 70 % 의 물(중량 /중량)을 함유하는 반응 혼합물에서, 인슐린 전구체를 효소 절단시키고, 그 후에, 반응 혼합물로부터 중간체 생성물을 분리하지 않고

b) 상기 중간체 생성물을, 약 10 % 내지 약 50 % 물(중량 /중량 )의 범위, 바람직하게는 약 20 % 내지 약 40 % 의 물(중량 /중량 )의 범위의 수분 함량을 가지는 반응 혼합물에서 친핵체 화합물과 커플링시키고

c) 원하면, 보호기를 제거하는 것을 특징으로 하는 인슐린 화합물의 제조 방법.
a) 적어도 약 55 %, 바람직하게는 적어도 약 60 %, 더 바람직하게는 적어도 70 %의 물(중량 /중량)을 함유하는 반응 혼합물에서 인슐린 전구체를 효소 절단시키고, 그 후에,

b) 중간체 생성물을, 효소 절단 반응에 사용된 반응 혼합물에서 반응 혼합물 내의 수분 함량이 약 10 % 내지 약 50 % 물(중량 /중량)의 범위, 바람직하게는 약 20 % 내지 약 40 % 의 물(중량 /중량)의 범위가 되도록 반응 혼합물의 조성을 변경한 상태에서 친핵체 화합물과 커플링시키고

c)원하면 보호기를 제거하는 것을 특징으로 하는 인슐린 화합물의 제조 방법.
제 2항에 있어서, 절단 단계와 커플링 단계 사이에 중간체 생성물의 분리는 수행되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 절단 단계에 사용되는 효소는 커플링 단계에도 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 커플링 반응이 개시되기 전에 적어도 약 25 %, 바람직하게는 적어도 50 %, 더 바람직하게는 적어도 75 %, 바람직하게는 적어도 85 %, 더 바람직하게는 적어도 95 %의 인슐린 전구체가 절단되어 중간체 생성물이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 절단에 사용되는 효소는 트립신 또는 라이실 특이적 프로타아제, 바람직하게는 Achromobacter lyticus 프로타아제-I인 것을 특징으로 하는 방법.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 친핵체 화합물은 아미노산 에스테르인 것을 특징으로 하는 방법.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 친핵체 화합물은 트레오닌 에스테르인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 친핵체 화합물은 아미노산 아미드인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 친핵체 화합물은 펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 친핵체 화합물은 펩티드 에스테르인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 친핵체 화합물은 펩티드 아미드인 것을 특징으로 하는 방법.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 인슐린 화합물로부터 보호기를 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 형성된 인슐린 화합물은 B30 위치에 트레오닌을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 형성된 인슐린 화합물은 인간 인슐린, 인슐린 아스파르트, 인슐린 리스프로, 인슐린 글라르긴 또는 인슐린 디터미르인 것을 특징으로 하는 방법.
선행하는 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 인슐린 화합물.
신규 특징 또는 여기에 기술된 특징들의 조합.