KR20050044559A - 자성 콜로이드 입자를 이용한 분석물의 검출 방법 - Google Patents

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디아그노스티카 스타고
제롬 비베뜨
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Abstract

본 발명은 액체 매질 중에서 적어도 1종의 분석물을 검출 및/또는 정량하는 방법에 있어서,
검출 및/또는 분석하고자 하는 분석물에 대하여 특이적인 적어도 하나의 리간드에 의하여 기능화된 표면을 가지는 자성 콜로이드 입자를 이용하는 것을 특징으로 하며,
1) 상기 분석하고자 하는 매질과 상기 입자를 접촉시키는 단계;
2) 상기 자성 입자가 사슬 형태로 구성되도록 하기에 충분한 강도의 자장을 상기 매질에 인가하는 단계;
3) 한 사슬 내의 이웃하는 두 입자 상에 각각 존재하는 적어도 2개의 특이적인 리간드와 상기 분석물이 커플링 또는 조합되기에 충분한 시간 동안 상기 자장을 유지시키는 단계;
4) 상기 자장을 제거하는 단계; 및
5) 상기 분석물의 존재 및/또는 부재를 측정하고, 적당한 경우, 상기 액체 매질 중의 자성 콜로이드 입자의 영구 사슬의 존재 및/또는 부재에 의하여 상기 분석물의 농도를 측정하는 단계
를 포함한다.

Description

자성 콜로이드 입자를 이용한 분석물의 검출 방법 {METHOD FOR DETECTING ANALYTE(S) USING MAGNETIC COLLOIDAL PARTICLES}
본 발명은 생물학적 또는 합성 액체 샘플 중의 적어도 하나의 분석종의 검출에 유용한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 분석종을 응집 시약(agglutinating reagent)과 같은 시약에 커플링(coupling)시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
지금까지, 이미 많은 "응집" 방법이 제안되어 왔다. 이들은 주로 진단 목적의 항원 및/또는 항체의 검출에 사용된다. 보다 구체적으로, 이들 방법은 생분석(bioassay)(임신 테스트, 응고 테스트) 또는 감염성 질환의 진단에 활용된다. 그러나, 이러한 방법들은 일반적으로 제한된 감도(sensitivity)를 갖는다. 실제로, 이들 테스트의 일반적인 원리는, 분석물(analyte)의 존재 하에 형성되는 콜로이드 입자의 겔 형성을 검출하는 데 있다. 이러한 유형의 테스트에서, 분석물은, 가장 넓은 의미에서 분석하고자 하는 분석물을 인식하는 분자로 피복(cover)된 표면을 가지는 2개의 콜로이드 입자를 부착시킬 수 있어야 한다.
도 1은 자장 하에서의 자성 콜로이드 입자의 라인 형성 원리를 나타내는 도면 및 현미경 사진.
도 2는 자장이 제거된 후 바이오틴화 BSA 및 그래프트된 자성 콜로이드 입자를 함유하는 용액의 현미경 사진.
도 3은 자장이 제거된 후 용액 중의 바이오틴화 BSA의 농도 함수에 따른 라인의 평균 길이를 나타낸 그래프.
도 4의 A는 0% 희석 시의 실시예 2에 따르는 용액의 현미경 사진(대조군).
도 4의 B는 0.1% 희석 시의 실시예 2에 따르는 용액의 현미경 사진.
도 4의 C는 1% 희석 시의 실시예 2에 따르는 용액의 현미경 사진.
도 4의 D는 100% 희석 시의 실시예 2에 따르는 용액의 현미경 사진.
본 발명은 보다 구체적으로 콜로이드 응집 시약으로서 자성 입자를 사용하는 것을 기초로 한다.
자성 입자는 이미 생물학적 분리 기술 또는 진단 테스트 기술에 사용되고 있다(WO 94/09368; EP 180 384; WO 98/51435). 자성 분리는 실시가 용이하고 신속하며, 단순화 설비가 요구되는 것으로 밝혀져 있다. 포획하고자 하는 분석물을 인식하는 분자로 피복된 자성 입자를 사용하면, 자장 하에, 복잡한 혼합물로부터 해당 분석물을 분리할 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들면 "ELISA" 분석(효소 결합 면역분석)에 유용하다. 사용되는 자성 입자는 일반적으로 천연 상태에서 유기질인 지질(matrix)에 자성 물질, 즉 예를 들면 마그네타이트, 페라이트, 크롬 옥사이드 또는 니켈 옥사이드를 혼입시킨다. 이들의 표면은 분리하고자 하는 활성종과 반응할 항원, 합텐, 또는 항체 유형의 반응성 기에 의하여 기능화(functionalize)된다.
잔류 자기와 관련된 문제를 피하기 위해서는, 일반적으로 통상의 강자성(ferromagnetic) 물질보다는 초상자성(superparamagnetic) 물질이 더 바람직하다. 자성유체(ferrofluid)는 고도의 자화능(magnetization) 및 포화능(100mT 이상)을 가지며, 외부 자장의 부재 하에서는 어떠한 잔류 자기도 나타내지 않는 것으로서, 초상자성 콜로이드의 제조 프로토콜에 통합시키기에 좋은 후보물질이다.
본 발명은 목적은, 자장 하에서 특이적인 구조적 조직(organization)을 채용하는 이러한 자성 콜로이드에 의해 나타나는 능력의 장점을 취하는 데 있다.
이 경우, 자장에 의하여 유도되는 응집으로 인하여, 콜로이드의 체적비에 따라, 개별적인 "사슬(chain)", 또는 소위 "클러스터(cluster)"라 불리는 사슬의 군이 생성된다. 이하, 사슬 또는 클러스터는 구분하지 않고 사슬이라 칭한다. 이들 구조 및 그의 형성에 대한 보다 자세한 내용은 많은 공개 문헌에서 찾아볼 수 있을 것이다.
바꾸어 말하면, 자장의 부재 하에서, 상기 입자들은 분산된 형태를 취한다. 자장의 존재 하에서, 이들 입자는 조직화되어 수용액 중에서 입자의 사슬을 형성한다. 이러한 사슬은 물론 가역적인 것으로서, 열 교반 하에, 자장이 제거되는 경우 신속하게 와해된다. 유리하게는, 이들 입자가 충분히 작고, 따라서 브라운 운동을 하며 극성을 띠는 경우, 이들 사슬은 그들에게 인가된 자장의 축을 따라 신속하게 형성되며, 중력에 감응하지 않는다. 이러한 현상은 도 1의 A에 모식적으로 예시하였다. 도 1의 B는 자장 하에서 그러한 입자들에 의하여 형성된 사슬의 현미경 사진을 나타낸다.
본 발명자들은, 자장 하에서 입자의 사슬로 신속하게 조직화되는 자성 콜로이드 입자의 능력을, 액체 매질 중에서 특정 종의 검출 및/또는 정량을 목적으로 활용할 수 있음을 밝혀내었다.
이 경우, 이들 자성 콜로이드 입자의 표면이 특정 리간드로 피복되고, 그들이 분산되는 연속상이 적어도 2개의 특정 리간드와 반응할 수 있는 종을 함유한다면, 자장은 그러한 자장에 의하여 유도된 사슬 내의 2개의 개별적인 이웃 입자에 대한 해당 종의 부착을 촉매할 것이다. 자장이 제거된 후에도, 해당 종이 부착된 입자는 영구 사슬(permanent chain)로 조직화된 상태를 유지하므로, 분석한 매질 내의 표적화된 종의 존재를 나타낸다.
보다 정확하게, 본 발명은 액체 매질 중에서 적어도 1종의 분석물을 검출 및/또는 정량하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 검출 및/또는 분석하고자 하는 분석물에 대하여 특이적인 적어도 하나의 리간드에 의하여 표면이 기능화된 자성 콜로이드 입자를 이용하는 것을 특징으로 하며,
1) 상기 입자를 상기 매질과 접촉시키는 단계;
2) 상기 자성 입자가 사슬 형태로 구성되도록 하기에 충분한 강도의 자장을 상기 매질에 인가하는 단계;
3) 한 사슬 내의 이웃하는 두 입자 상에 각각 존재하는 적어도 2개의 특이적인 리간드와 해당 분석물의 커플링(coupling) 또는 조합(combination)을 가능하게 하기에 충분한 시간 동안 상기 자장을 유지시키는 단계;
4) 상기 자장을 제거하는 단계; 및
5) 상기 분석물의 존재 및/또는 부재를 측정하고, 적당한 경우, 상기 액체 매질 중의 자성 콜로이드 입자의 영구 사슬(permanent chain)의 존재 및/또는 부재에 의하여 상기 분석물의 농도를 측정하는 단계
를 포함한다.
이들 단계가 나열된 순서는 본 발명의 바람직한 일면에 해당하는 것으로서, 본 발명 하에서, 이들 단계는 다른 순서로 실시될 수 있음을 이해해야 하며, 예를 들면, 분석하고자 하는 매질을 도입하는 단계 이전에 자장을 활성화하는 단계가 실시될 수 있다.
본 발명에 따르면, 검출, 분석 또는 표시하고자 하는 분석물에 결합된 자성 콜로이드 입자를 수집할 수도 있다.
본 발명에 따르면, 매우 다양한 장 및 장 구배 기하학, 그리고 매우 다양한 "응집 셀(cell)" 기하학을 사용할 수도 있다. 이러한 변화는 경우에 따라, 조건에 따라 길이 및 두께가 매우 가변적일 수 있는 리간드-수용체 회합의 신속성 및 영구 사슬의 검출 둘 모두를 최적화할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명은 채널의 폭 또는 높이가 100㎛ 미만인 마이크로 유체 기구(microfluid device)를 포함한다. 상기 채널의 축에 대하여 수직 또는 평행하게 배향된 장이 사용될 수 있다.
상기 방법은 분석기와 같은 진단 도구에 적용되는 것이 유리하다. 자동 분석기가 특히 바람직하다.
보다 구체적으로, 영구 사슬의 특성화는, 분석되는 매질을 간단히 현미경 조사하여 실시하는 것이 유리할 수 있다. 그러나, 특히 자동 분석기를 사용하는 경우에는, 사슬의 존재를 광학적으로 검출하는 것이 바람직하다. 그렇게 하면, 예를 들면 광도측정(photometry) 또는 탁도측정(turbidimetry)에 의하여 빛의 산란을 측정함으로써, 사슬의 존재를 검출할 수 있다. 또 다른 방법으로는, 예를 들면 CCD(charge-coupled device) 카메라로 포착한 영상을 처리하는 방법이 있다. 이 방법은 사슬의 크기를 정밀하게 분석할 수 있다는 장점이 있다. 이러한 검출 방법의 변형 방법에는 임의의 적합한 광원, 바람직하게는 레이저가 사용될 수 있다.
물론, 종래의 응집제(agglutinate)에 필적하는, 사슬의 형성은 일차적으로는 분석되는 매질 내의 분석물의 농도에 따라 좌우되고, 이차적으로는 입자의 농도에 따라 좌우된다. 상기 매질 내에 분석물의 양이 많을수록, 사슬은 더 길어지고, 입자의 농도가 높을수록, 사슬은 더 두꺼워져, 더욱 필적하게 응집할 것이다. 따라서, 본 발명에 따르면, 영구 자석의 형태로 조직화된 자성 입자의 밀도를 정량함으로써 분석물의 농도를 측정할 수 있음이 입증된다. 이러한 밀도 측정은 종래의 기술에 의하여 실시될 수 있다. 주어진 분석물에 대하여 참조 보정(reference calibration)을 미리 설정할 수 있다.
본 발명의 방법은 감도 면에서 특히 유리하다. 따라서, 본 발명의 방법은 액체 매질 중에 저농도로 존재하는 분석물을 검출하는 데 유용한 것으로 판명되었다.
이하의 실시예에 나타난 바와 같이, 상기 사슬은 항원의 경우, 동일한 리간드-수용체 커플(바이오틴-스트렙트아비딘)을 이용해 실시하는 종래의 응집 분석의 경우 10-5 mol/ℓ인 데 비하여 대략 10-9 mol/ℓ의 분석물의 농도에서도 존속한다 이러한 농도 역치는, 동일한 항원-항체 커플을 이용해, 자장의 부재 하에 실시하는 종래의 응집 분석에서 기대한 바와 같이 응집체의 존속 또는 겔 형성에 필요한 농도 역치보다 낮다.
따라서, 본 발명의 방법은 종래의 응집 분석에 대한 유리한 대체 방법일 수 있으며, 분석에 대한 감도를 크게 증가시킬 수 있다.
본 발명의 목적을 위하여, "콜로이드"란 용어는 입자의 크기가 5 내지 10,000 nm, 보다 바람직하게는 100 내지 500 nm인 것을 의미한다. 그러나, 이는 가능한 한 작은 크기의 입자를 사용하는 것이 특히 유리하며, 동시에 그러한 입자들이 브라운 운동 및 자성 쌍극력(dipolar force)의 공액 작용(conjugated action) 하에서 즉각적인 응집을 허가하기에 충분한 대자율(magnetic susceptibility)을 가짐을 보증한다. 일반적으로, 이러한 절충안은 자성 물질, 통상 캡슐화된 산화철의 양이 최대인 경우, 수 ㎛ 이하, 바람직하게는 대략 0.1 내지 0.5 ㎛의 입경에 도달한다.
상술한 바와 같은 이유에서, 개별적인 자성 콜로이드 입자를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명과 관련된 원하는 품질을 가지는 초상자성 콜로이드 입자의 제조 기술로는 다양한 여러 종류가 존재한다. 예를 들면, 수계 자성유체에 의한 천연 또는 합성 폴리머의 공침(coprecipitation) 기술 또는 유기상 중에서의 자성유체에 의한 에멀젼화 기술이 있다.
이러한 유형의 콜로이드 물질을 조절된 방식으로 얻는 바람직한 기술은 에멀젼화에 이어, 중합 및 그래프팅(grafting) 프로토콜을 수반하는 원리에 기초한다. 이러한 에멀젼은 특히 계면활성제가 풍부한 수상 및 유기 자성유체로 이루어지는 혼합물의 전단(shearing)에 의하여 생성될 수 있다. 자성유체는 그의 유기상이 수상에 대해 가용성이 다소 약한 것이 선택된다. 이 경우, 각각의 소적(droplet)은 해당 자성 물질, 바람직하게는 자성 산화철(마그헤마이트)의 나노미터 크기의 입자의 구형 응괴(conglomeration)로 전환되고, 이때 각각의 소적은 대략 60 부피%의 산화철 함유한다. 이어서, 이렇게 얻어진 입자는 스티렌과 같은 소수성 모노머의 도입에 의하여 중합되며, 상기 반응은 소적 내에서 발생한다. 중합 반응의 종료 시, 수용성의 작용성 모노머를 도입하면, 표면이 기능화된다. 이러한 두 조작 과정, 즉 에멀젼화 및 중합 반응을 통해, 산화철이 풍부하고, 중합된 기능화 층으로 코팅된 구형 입자가 얻어진다. 이러한 에멀젼의 제조에 관해서는, 특히 J. Bibette에 의하여 J. Magn. and Nagn. Mat. V. 122, p. 37 (1993)에 발표된 절차 및 T. Mason 및 J. Bibette에 의하여 Phys. Rev. Lett. 77, 3481 (1996) 및 WO 97/38787 및 FR 2800836에 발표된 절차를 참조할 수 있다.
혼입되는 자성 물질은 산화철, 산화코발트, 및 최종적으로는 분할되고 안정화된 금속으로 이루어지는 군으로부터 선택하는 것이 유리하고, 그 중 마그헤마이트가 바람직하다. 그러한 자성 물질은 40 부피%, 바람직하게는 60 부피%의 비율로 상기 입자에 혼입된다. 본 발명의 바람직한 다른 일면에 따르면, 기본 자성 물질은 자성유체이다.
이렇게 얻어진 자성 콜로이드 입자는, 종래의 공업적 방법에 따라, 많은 다양한 리간드가 그들의 표면에 고정된 상태로 존재할 수 있는 한 특히 유용하다.
유리하게는, 이들은 많은 다양한 특이적 리간드와 조합되어, 특히 본 명세서에 개시된 면역 분석 및 응집 분석에 사용되는 시약으로 전환될 수 있다.
리간드라 일컬어지는 분자는 흡착성 상호작용, 공유결합성 상호작용(covalent interaction), 및/또는 고도 친화성 상호작용에 의하여 자성 콜로이드 입자의 표면에 고정화될 수 있다.
공유결합성 커플링은, 예를 들면 입자의 표면에 존재하는 화학 반응성 기를 이용하여 실시될 수 있다. 이러한 기의 예로는, 카르복시기, 아미노기, 알데하이드기, 및 에폭시기를 들 수 있다. 특성화하고자 하는 분석물이 화학 반응성 종인 경우, 이들 기는 그 자체가 표적화된 분석물에 대하여 특이적인 리간드의 역할을 수행할 수 있다.
고도 친화성 상호작용에 의한 고정화의 경우에는, 일반적으로 (폴리)카르보하이드레이트/일렉틴, 바이오틴 또는 바이오틴화 화합물/아비딘 또는 스트렙트아비딘, 단백질 수용체 및 그의 특이적인 리간드, 합텐/항체 등과 같은 고도 친화성 결합 커플의 두 파트너에 의하여 매개된다.
끝으로, 리간드를 입자의 표면에 부착시키는 과정은, 소위 "링커(linker)" 또는 "스페이서(spacer)"라고도 일컬어지는 스페이서 요소(spacer element)를 이용하여 실시되거나 직접 실시된다.
이러한 공유결합성 또는 고도 친화성 상호작용은 예를 들면 펩타이드, 유리된 형태 또는 복합체 형태의 당단백질, 지단백질, 및 그의 유사체 또는 유도체를 포함하는 단백질, 면역글로불린, DNA 또는 RNA와 같은 핵산 및 그들의 동족체(homolog), 단당류 또는 이당류, 올리고당류, 및 다당류와 같은 당류, 지질, 호르몬, 수용체, 대사산물, 또는 그 외의 생물학적 물질과 같은 천연 또는 합성 리간드를 고정시킬 수 있다.
본 발명의 방법에 의하여 검출 및/또는 분석될 수 있는 분석물로는, 본 발명의 기능화 입자에 대하여 고도 친화성을 가지고 특이적으로 상호작용할 수 있는 물질이 바람직하다. 그러므로, 이들은 면역반응에 의하여 측정될 수 있는 항원 및 항체, 또는 혼성화 반응에 의하여 검출될 수 있는 핵산, 보다 일반적으로는 모든 유형의 단백질일 수 있다.
분석물은, 분석하고자 하는 매질 내에서 상기 입자의 확산 계수와 적어도 동등한 확산 계수를 갖는 것이 바람직하다.
동정하고자 하는 분석물은, 그의 천연 형태에서, 통상 여러 개의 회합 부위를 제공하는, 예를 들면 항원 및 항체와 동일한 방식으로, 2개의 상이한 리간드와 반응할 수 있다.
반대의 경우, 분석하고자 하는 매질은 본 발명의 방법을 실시하기 전에 사전처리하여, 분석물이 적어도 두 분자의 특이적인 리간드 중 하나에 대하여 반응성을 가지도록 조작된다. 이러한 유형의 사전처리는 특히 상술한 "고도 친화성" 커플의 파트너 중 하나의 적어도 하나의 분자에 의하여 상기 분석물을 기능화하는 단계를 포함한다. 당업자라면 누구나 이러한 유형의 사전처리를 실시할 수 있다.
본 발명의 일면은 바이러스, 박테리아 또는 원생동물과 같은 병원체 및 기타 감염성 제제에 대한 항체, 종양에 대항하여 유도되는 항체, 알레르겐(allergen)에 대항하여 유도되는 항체, 또는 자가항체(autoantibody) 유형의 분석물을 액체 샘플 중에서 검출 및/또는 정량하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 다른 일면은 유리된 형태의 항원, 예를 들면 혈액 단백질 및 응고 인자와 같은 혈액 인자, 대사산물, 호르몬 또는 매개인자(mediator), 또는 담체에 부착된 항원, 예를 들면 미생물의 표면 항원, 막에 결합된 수용체, 혈액형 항원 및 주요 조직 적합성 시스템의 항원 등을 포함하는 항원을 검출 및/또는 정량하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 또한 예를 들면 천연 또는 인공 약물과 같은 비생물학적 분자의 검출 및/또는 정량에도 사용될 수 있으며, 이때 해당 약물은 리간드에 대하여 이중 친화성을 직접적으로 가질 수 있는 것으로 이해된다. 그렇지 않은 경우에는, 회합(association)에 의하여, 이러한 유형의 분석물을 지정된 리간드에 대하여 이가(bivalent)가 되도록 조작하는 사전처리가 필요하다. 본 발명은 분석 화학 및 미시 분석 화학(micro-analysis chemistry)에 특히 유용할 수 있다.
본 발명의 특정한 다른 일면에 따르면, 여러 유형의 자성 콜로이드 입자가 응집 시약으로서 동일한 분석에 사용될 수 있다. 이는 분석물이 2가지 유형의 리간드에 대하여 용이한 반응성인 경우 유용할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따라 사용되는 콜로이드 입자는 제1 라벨(label)을 함유할 수 있다.
이러한 라벨링(labeling)은 현미경 검출 방식과 제2 검출 방식의 조합을 가능하게 하거나, 또는 현미경 검출의 간단한 개선을 가능하게 할 수 있는 경우에 유용할 수 있다. 이러한 추가적인 라벨은 특히 가시적, 광학적, 기계적, 및/또는 전기적으로 특성화될 수 있다. 본 발명의 다른 일면에 따르면, 사슬의 특성화는 선택된 라벨의 성질에 따라, 현미경 하에서의 육안관찰에 의하여 직접적으로 실시되거나, 광학적, 기계적 또는 전기적 방법에 의하여 간접적으로 실시될 수 있다. 본 발명에 적합한 라벨의 예로는, 착색 안료, 형광성 제제, 또는 인광성 제제(phosphorescence agent)를 들 수 있다.
분석된 액체 매질은, 예를 들면 생물학적 유체와 같은 천연 또는 합성 매질일 수 있다. 이는 특히 예를 들면 희석된 형태 또는 희석하지 않은 형태로 사용되는 혈액(전체 혈액 또는 분리 혈액), 혈청, 혈장(plasma), 타액, 요, 또는 뇌척수액과 같은 체액일 수 있다.
자성유체는 당 기술분야에 공지된 다양한 수단, 예를 들면 헬름홀츠 코일(Helmholtz coil), 전자석 또는 영구 자석에 의하여 생성될 수 있다.
인가된 연속성 자장의 강도는 일반적으로 1 내지 500 mT, 바람직하게는 1 내지 100 mT이다.
일반적으로, 필수적으로 균일한 자장을 인가하는 것이 유리하다. 그러한 자장을 생성시키는 간단한 수단은 "응집" 구역의 양쪽 각각에 영구 자석 또는 전자석의 양극, 즉 N극과 S극을 각각 발생시키는 것이다. 또 다른 수단은 필수적으로 전류 발생기에 의하여 자화되는 헬름홀츠 코일과 중심이 같은 환형 축을 가지는 채널을 제작하는 것이다.
본 발명의 바람직한 일면에 따르면, 교류(oscillating)(교번; alternating) 자장이 인가된다.
자장의 교류는 분석하고자 하는 분석물이 두 입자 상에 각각 존재하는 2개의 특이적인 리간드 부근에 존재할 가능성을 증가시킬 수 있다. 각각의 자장 사이클에서, 입자는 서로 회합하여, 이미 형성된 사슬에 영향을 주지 않고 사슬을 형성하거나 확장시킬 수 있다. 따라서, 이러한 수단을 이용하면, 분석하고자 하는 분석물 및 기능화된 자성 콜로이드 입자의 리간드 사이의 반응을 완성시킬 수 있다.
그렇게 하면, 보다 낮은 농도의 분석물을 분석할 수 있으므로, 보다 양호한 감도의 분석을 실시할 수 있다.
그러나, 본 발명의 몇몇 용도에는 불균일 자장이 요구될 수 있음을 유의해야 한다. 보다 구체적으로, 사슬을 집중시킬 수 있는 자장 구배 및 입자의 응집을 제공할 수 있는 자장을 모두 이용해야 하는 경우도 있을 수 있다. 자장 및 그의 구배는 동시에 조작될 수 있다. 그러므로, 분석물을 1차 농축시킨 뒤, 충분한 크기의 응집체를 형성시킴으로써 이들을 가시화할 수 있다. 본 발명의 다른 일면에 있어서, 상기 응집은 마이크로 유체 채널 내에서 실시하는 것이 바람직하다. 예를 들면(E.M. Lawrence et al., Int. J. of Modern Phys. B, 8, 2765-2777, 1994), 자성 입자가 풍부한 사슬 또는 칼럼의 직경 및 간격은 자장 및 셀의 두께에 따라 결정된다. 그러므로, 고려하는 용도에 가장 적합한 응집 조건을 선택할 수 있다.
분석하고자 하는 매질을 도입하는 수단으로는 다음과 같은 것들이 있다:
- 겔 전기 영동에서와 같은, 샘플이 증착되는 하나 이상의 노치(notch) 또는 "웰(well)", 참조: "Electrophoresis: theory, techniques and biochemical and clinical applications, A. T. Andrews, Oxford University Press, NY 1986",
- 모세관 전기 영동에서와 같은, 가압 또는 감압 시스템, 참조: "Capillary Electrophoresis", P. D. Grossman, J. C. Colburn published by Academic Press, San Diego, CA, USA, 1992),
- 액맥(liquid vein)내 전기 영동에서와 같은, 샘플이 연속적으로 점적하여 유출되는 채널,
- 크로마토그래피에 사용되는 샘플 도입 방법 ("Chromatographie en phase liquide et supercritique" [Liquid Chromatography and supercritical fluid chromatography], R. Rosset, M. Caude, A. Jardy, published by masson, Paris 1991; "Practical High Performance Liquid Chromatography", V. R. Meyer, published by John Wiley, Chichester, NY, USA; "Chromatography of polymer", T. Prodver, published by ACS publ., Washington DC, 1993),
- 자동 분석기에 통상적으로 사용되는 큐베트(cuvette) 또는 기타 용기.
가장 간단한 방식에서, 실험은 하기 프로토콜에 따라 실시되고, 이를 기초로 하여, 많은 변형을 용이하게 구상할 수 있다.
상술한 특성을 가지는 콜로이드 입자에는, 분석하고자 하는 항원에 대하여 특이적인 항체가 그래프트된다. 투명성을 위하여, 본 명세서에서는 스트렙트아비딘-바이오틴 리간드-수용체 커플을 고려한다. 스트렙트아비딘은 입자로 그래프트되므로, 검출하고자 하는 항원은, 예를 들면 바이오틴 분자가 양 말단에 그래프트된 작은 폴리에틸렌 글리콜 폴리머이다. 이러한 항원의 충분한 양을 1 부피% 이상의 비율로 입자와 혼합하는 경우, 종래의 응집 분석에서 기대되는 겔 형성에 있어서의 응집은 수초, 심지어는 수분 내에 가시화될 수 있다. C*는 항원의 농도로서, 이 값 이하에서는, 통상적인 의미의 응집이 더 이상 검출되지 않는다.
본 발명에 따르는 실험은 입자를 대략 0.1 부피%의 비율로 C* 훨씬 이하의 농도(C)의 항원과 혼합하는 단계; 상기 혼합물을 직사각형 단면을 가지는 모세관으로 흡수시키는 단계; 및 모세관의 축에 평행하게 자장을 인가하는 단계로 이루어진다. 상기 자장은 모세관의 양쪽 끝에 각각 배열된 2개의 자석에 의하여 인가될 수 있다. 자장은 예를 들면 적어도 500 가우스의 강도로 2분 동안 지속된다. 이어서, 현미경을 이용해 모세관을 관찰하여, 사슬 또는 응집체의 존재를 검출한다.
따라서, 바이오틴-스트렙트아비딘 커플의 예를 통해, 자장 프로토콜 하에서의 응집에 따른 응집체의 검출이 대략 C*/1000의 항원 농도에서까지 이루어질 수 있음을 확인할 수 있다.
본 발명의 방법은 마이크로 유체 시스템 내의 적어도 1종의 분석물을 검출하고, 적당한 경우, 이를 정량하는 데 특히 유용하다. 이러한 특정한 일면에 있어서, 마이크로 유체 시스템의 제1 구역 내에서의 자성 응집 및 상이한 구역에서의 검출을 실시할 수 있다. 이러한 일면은, 응집을 진행한 바 없는 입자들로부터 입자의 영구 사슬을 분리하는 데 특히 유리하게 적합하다.
본 발명에 따르는 방법은 동일한 분석에서 여러 분석물을 동시에 분석하는 다기준 분석(multicriteria analysis)에 특히 유용하다.
이러한 일면에 따르면, 기능화된 자성 콜로이드 입자의 여러 집단이 사용된다. 각각의 입자 집단은 검출하고자 하는 분석물 중 1종에 대하여 특이적인 적어도 하나의 리간드에 의하여 기능화된다.
이어서, 교호 자장을 인가하여, 각각의 분석물에 대하여 특이적인 동일한 집단의 입자로 이루어지는 사슬의 형성을 점진적으로 유도한다.
이들을 구별하고 그 분석 결과를 판독하기 위하여, 다양한 집단의 자성 콜로이드 입자에는 검출하고자 하는 각각의 분석물에 대하여 특이적인 제2 라벨이 담지된다.
본 발명의 대상은 또한 적어도 1종의 분석물에 대하여 특이적인 적어도 하나의 리간드에 의하여 표면이 기능화된 적어도 자성 콜로이드 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 액체 매질, 바람직하게는 생물학적 유체 중의 적어도 1종의 분석물을 검출하는 시약 키트이다.
본 발명은 하기 실시예 및 도면을 참조하여 보다 구체적으로 예시될 것이다.
실시예 1: 자성 콜로이드 입자를 이용한 분석물의 검출
본 실시예는 바이오틴/스트렙트아비딘 고도 친화성 커플로부터 유래된 모델 분석물의 검출을 예시하는 것으로서, 주어진 분석물에 대한 본 발명의 방법의 감도 역치를 특성화하는 것을 목적으로 한다. 분석물은 바이오틴으로 이루어지며, 스트렙트아비딘은 콜로이드 입자가 그래프트된다.
보다 구체적으로, 바이오틴화 분석물은 분자량 5000의 폴리에틸렌 글리콜 폴리머로 구성되며, 바이오틴 분자의 양쪽 말단 모두 그래프트되어 있다. 이들 제품은 상업적으로 입수 가능하다(Shearwater USA).
스트렙트아비딘이 그래프트된 초상자성 콜로이드 입자는 미리 제조된다. 콜로이드 입자는 Bibette, J. Magn. and Magn. Mat. V. 122, p. 37(1993) 및 F. Leal Calderon, T. Strora, O. Mondain-Monval, P. Poulin and J. Bibette, Phys. Rev. Lett., 72, 2959(1994)에 제시된 절차에 따라 제조하거나, 또는 T. Mason 및 J. Bibette, Phys. Rev. Lett. 77, 3481 (1996) 및 WO 97/38787에 제시된 절차에 따라 제조한다. 이들 입자의 중합은 특허 출원 FR 2800836에 제시된 프로토콜에 따라 실시된다. 스트렙트아비딘을 카르복시 부위에 그래프트하는 방법은 당 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면 다음을 참조할 수 있다: Molday RS, Dreyer WJ, Rembaum A, Yen SP, J Cell Biol 1975 Jan; 64(1): 75-88 및 Staros JV, Wright RW, Swingle DM, Anal Biochem. 1986 Jul; 156(1): 220-2.
자장 하에서의 응집 분석은 스트렙트아비딘이 그래프트된 자장 콜로이드 입자와 "PEG-바이오틴" 분석물을 혼합하는 단계를 포함한다. 선택한 검출 방법은 현미경 하에서 직접 관찰하는 것이다.
대략 10-4 내지 10-2 부피비 Φ를 가지는 주어진 입자에 대하여, 분석 감도의 임계값을 검출하기 위하여 분석물(C)의 농도를 변화시킨다.
용이한 분석을 위하여, 2개의 평평형 자석 사이에 배치된 50㎛ 두께의 평평한 모세관으로 관심 혼합물을 흡수시킨다. 이때, 자장은 대략 50 mT 이상의 크기로, 모세관의 축에 평행한 방향으로 생성된다. 이 자장은 시판되는 평평형 자석을 이용해 생성시킨다. 대략 2분간 자장을 인가하고, 자장의 부재 하에서 현미경을 이용해 모세관을 관찰한다. 사슬 또는 응집체(도 2)의 존재가 현미경 하에 관찰된 경우를 양성으로 평가하고, 열 교반 하에 입자가 점진적으로 재확산되는 경우는 음성으로 평가한다.
본 실시예에 따르면, 분석은 분석물의 농도가 대략 10-9 mol/ℓ으로 낮은 경우에도 양성을 나타낸다. 비교해 보면, 종래의 응집 분석은 10-5 mol/ℓ 이하에서는 실시가 불가능하다.
상보적인 연구에서, 분석하고자 하는 분석물(바이오틴화 BSA, 8 내지 12 바이오틴/BSA)의 농도 함수로서 사슬의 평균 길이를 측정하였다. 도 3은, 바이오틴화 BSA의 농도 함수로서, 10 mT의 자장 하에 10분간 방치한 후의 사슬의 평균 길이(실선) 및 자장의 부재 하에 24시간 방치한 후의 사슬의 평균 길이(점선)를 나타낸다.
자장의 인가는 10-9 mol/ℓ 정도로 낮을 수 있는 분석물 농도에 대하여 신속한 분석물의 검출을 가능하게 하며, 이는 현재 시판되는 분석의 감도보다 큰 감도를 나타낸다.
또한, 형성된 사슬의 평균 길이는 분석물의 농도에 대한 함수로서 증가하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명은 또한 사슬의 평균 길이를 측정함으로써, 분석하고자 하는 분석물의 정량적 검출을 가능하게 한다.
실시예 2: 항-vWF 면역글로불린 G(IgG)가 그래프트된 자성 콜로이드 입자의 제조 및 본 윌레브랜드 인자(von Willebrand factor)의 평가
포스페이트 완충액(20 mT, pH7.2) 중에 1 부피%의 자성 콜로이드 입자(직경 206 nm, 프랑스의 Ademtech사로부터 입수 가능)를 함유하는 200㎕의 콜로이드 입자 용액을 제조하였다.
입자를 활성화하기 위하여, 0.01 g/ℓ 농도의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDAC)의 수용액 200㎕를 상기 용액에 첨가하고, 혼합물을 44℃에서 20분 동안 교반하였다. 이어서, 0.001% 농도의 Tween 20 수용액으로 세척하여 과량의 EDAC를 제거하였다.
그런 다음, 활성화된 입자의 콜로이드 용액 400㎕를 IgG 용액 400㎕(398㎕의 물에 20 mg/㎖의 농도로 용해된 IgG의 용액 1.7㎕)에 첨가하여, IgG를 콜로이드 입자에 그래프트시켰다. 용액을 44℃에서 20분 동안 교반한 뒤, 상온에서 10분간 교반을 계속하였다.
이어서, 포화 완충액(0.001% 농도의 Tween 20을 함유하는 글리신-BSA 완충액)으로 세정하여 과량의 IgG 용액을 제거하였다. 그런 다음, 이렇게 얻어진 그래프트된 입자를, 1.2㎛의 필터를 통해 여과시켜 분리하였다.
이렇게 제조된 그래프트된 입자는 조절된 밀도 및 배향으로 그래프트된 항체를 나타내었다. 또한, 그래프팅은, 심지어 용액 중에 계면활성제 또는 다른 단백질이 존재하는 경우에도, 안정적이었다. 본 윌레브랜드 인자(von Willebrand factor)의 평가를 위하여, 200%(2 국제 단위)의 본 윌레브랜드 인자를 함유하는 Liatest(R) vVF 보정 플라스마(STA vWF 칼리브레이터, Diagnostica Stago사로부터 입수 가능)를 이용하여, 그래프트된 자성 입자의 콜로이드 용액이 사용된 것을 제외하고는, 이러한 평가 용도의 사양에 지시된 절차를 실질적으로 실시하였다.
오렌-콜러 완충액(Owren-Koller buffer)을 이용해, 본 윌레브랜드 인자에 대하여 100%, 1%, 및 0.1% 농도의 혈장 희석액을 제조하였다. 대조군(0%)으로서 오렌-콜러 완충액을 사용하였다.
그런 다음, 그래프트된 자성 입자의 글리신 완충액 2부피 및 콜로이드 용액 3부피를 상기 희석액 1부피에 첨가하였다.
이어서, 얻어진 용액을 50㎛ 단면 크기를 가지는 정사각형 모세관에 넣었다. 5분간 70mT 강도의 자장을 인가해 어셈블리를 배열시켰다. 자장을 제거한 후, 샘플을 광학 현미경 플랫폼 상에 탑재하였다. 도 4의 A, B, C 및 D는 연구한 다양한 희석액에 대한 현미경 하의 샘플의 외관을 나타낸다. 특히, 상기 방법은 대조군(0%)의 0.1% 농도의 샘플을 가시적으로 구분시킬 수 있음을 알 수 있다. 이러한 결과는, Liatest(R)에 대해 지적된 2%의 검출 역치보다 월등하다.

Claims (27)

  1. 액체 매질 중에서 적어도 1종의 분석물(analyte)을 검출 및/또는 정량하는 방법에 있어서,
    검출 및/또는 분석하고자 하는 분석물에 대하여 특이적인 적어도 하나의 리간드에 의하여 기능화(functionalize)된 표면을 가지는 자성 콜로이드 입자를 이용하는 것을 특징으로 하며,
    1) 상기 분석하고자 하는 매질과 상기 입자를 접촉시키는 단계;
    2) 상기 자성 입자가 사슬 형태로 구성되도록 하기에 충분한 강도의 자장을 상기 매질에 인가하는 단계;
    3) 한 사슬 내의 이웃하는 두 입자 상에 각각 존재하는 적어도 2개의 특이적인 리간드와 상기 분석물이 커플링(coupling) 또는 조합(combination)되기에 충분한 시간 동안 상기 자장을 유지시키는 단계;
    4) 상기 자장을 제거하는 단계; 및
    5) 상기 분석물의 존재 및/또는 부재를 측정하고, 적당한 경우, 상기 액체 매질 중의 자성 콜로이드 입자의 영구 사슬(permanent chain)의 존재 및/또는 부재에 의하여 상기 분석물의 농도를 측정하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 입자가 초상자성(superparamagnetic) 콜로이드 입자인 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 초상자성 콜로이드 입자가 수계 자성유체(ferrofluid)와 폴리머의 공침(coprecipitation) 또는 유기상 중의 자성유체에 의한 에멀젼화에 의하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자성 콜로이드 입자의 크기가 5 내지 10,000 nm, 보다 바람직하게는 100 내지 500 nm인 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 특정 리간드가 흡착성 상호작용, 공유결합성 상호작용(covalent interaction), 및/또는 고도 친화성 상호작용에 의하여 상기 입자의 표면에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고정화된 리간드가 고도 친화성 결합 커플(high affinity binding couple)의 두 파트너 중 하나인 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 리간드가 (폴리)카르보하이드레이트/일렉틴, 바이오틴 또는 바이오틴화 화합물/아비딘 또는 스트렙트아비딘, 단백질 수용체 및 그의 특이적인 리간드, 및 합텐/항체 커플의 파트너들 중 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고정화된 리간드가 펩타이드; 유리된 형태 또는 복합체 형태의 당단백질, 지단백질, 및 그의 유사체 또는 유도체를 포함하는 단백질; 면역글로불린; DNA 또는 RNA와 같은 핵산 및 그들의 동족체(homolog); 단당류 또는 이당류, 올리고당류, 및 다당류와 같은 당류; 지질; 호르몬; 수용체; 대사산물, 또는 그 외의 생물학적 물질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물인 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적이 되는 상기 분석물이 항원, 항체, 및 핵산 및/또는 단백질인 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    분석하고자 하는 상기 매질을 사전처리하여, 상기 분석물이 적어도 두 분자의 특이적인 리간드 중 하나에 대하여 반응성을 가지도록 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 사전처리 단계가 고도 친화성 결합 커플의 파트너 중 하나에 의해 상기 분석물을 기능화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스, 박테리아 또는 원생동물을 포함하는 병원체 및 기타 감염성 제제에 대한 항체, 종양에 대항하는 항체, 알레르겐(allergen)에 대항하여 유도되는 항체, 또는 자가항체(autoantibody) 유형의 분석물의 검출 및/또는 정량에 사용되는 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    혈액 단백질, 및 응고 인자를 포함하는 혈액 인자, 대사산물, 호르몬 및 매개인자(mediator)를 포함하는 유리된 형태의 항원, 및 미생물의 표면 항원을 포함하는 담체에 부착된 형태의 항원, 막에 결합된 형태의 수용체, 혈액형 항원, 및 주요 조직-적합성 시스템의 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원의 검출 및/또는 정량에 사용되는 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자성 콜로이드 입자가 제2 라벨을 추가로 가지는 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 라벨이 가시적, 광학적, 기계적, 및/또는 전기적으로 특성화(characterize)되는 것임을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 라벨이 착색 안료 및 형광성 제제 또는 인광성 제제(phosphorescence agent)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    검출하고자 하는 다양한 분석물에 대하여 특이적인 적어도 하나의 리간드에 의하여 각각 기능화된 복수 집단(population)의 자성 콜로이드 입자가 사용되는 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자장이 연속 자장인 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 연속 자장의 강도가 5 내지 500 mT, 바람직하게는 10 내지 100 mT인 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자장이 교번(alternating) 자장인 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 사슬의 특성화가 현미경 하의 육안관찰에 의하여 직접적으로 이루어지거나, 광학적, 기계적 또는 전기적 방법에 의하여 간접적으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 사슬의 특성화가 광도측정(photometry) 또는 탁도측정 (turbidimetry)에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 사슬의 특성화가 영상 처리(image processing)에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    영상-포착기(image-capturing device)로서 CCD(charge-coupled device) 카메라가 사용되는 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    광원으로서 레이저가 사용되는 것을 특징으로 하는 검출 및/또는 정량 방법.
  26. 표적이 되는 상기 분석물에 대하여 특이적인 적어도 하나의 리간드에 의하여 기능화된 표면을 가지는 적어도 자성 콜로이드 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 액체 매질 중의 분석물 검출용 시약(reagent) 키트.
  27. 마이크로 유체 시스템(microfluid system) 중의 적어도 1종의 분석물을 검출 및/또는 정량하기 위한, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따르는 방법의 용도.
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