KR20050034724A - 티세포의 분리 및 식별 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 향상된 자기이식 T세포 백신과 개선된 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 자기이식 T세포 백신을 이용하여 다발성 경화증(MS : multiple sclerosis) 또는 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis)과 같은 자가면역 질병을 치료하는 방법과도 관련된다. 본 발명은 또한 T세포 관련 질병의 진단에 관련된다.
Description
본 발명은 다발성 경화증(MS : multiple sclerosis)과 같은 자가면역 질병의 진단 및 치료 분야에 일반적으로 관련된다. 특히, 항원특이성 T세포의 분리에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 MS와 같은 자가면역질병의 치료를 위한 항원특이성 T세포의 이용에 관한 것이다.
세포독성 T림프구 또는 T헬퍼 세포의 T 세포 수용체(TCR)로 이루어진 세포내 인식 복합체 및 항원제시세포(APC:antigen presenting cells)의 MHC/펩티드 복합체는 각 유기체 내에서 T세포의 레퍼토리가 발현되는 동안과 적합한 면역반응의 조절(T헬퍼) 및 효과기 단계(T킬러)동안에 T세포를 활성화하는 다양한 세포-세포 충돌 세트에서의 일반적인 인식성분이다.
적합한 면역반응에서, 항원은 어떠한 항원을 인식할 수 있도록 충분히 다양한 구조로 발현되는 항체 또는 TCR과 같은 과변성 분자에 의하여 인식된다. 항체는 항원 표면의 어떠한 부분에 결합될 수 있다. 그러나 TCR은 APC 표면의 주조직적합성복합체(MHC:major histocmpatibility complex)의 클래스Ⅰ 또는 클래스Ⅱ에 결합된 짧은 펩티드에 결합하는 것이 제한된다. 펩티드/MHC 복합체의 TCR 인식은 T세포의 활성화(클론 증대)를 유발한다.
TCR은 αβ(알파-베타) 또는 γδ(감마-델타)일 수 있는 두개의 사슬로 구성된 이형이량체(heterodimer)이다. TCR의 구조는 면역글로불린(Ig)의 그것과 매우 유사하다. 각 사슬은 면역글로불린 폴드(fold)인 두개의 세포외 영역을 갖는다. 아미노 말단 영역은 변이가 크고, 가변(V:variable)영역으로 불린다. 막에 가장 가까운 영역은 불변(C:constant)영역이다. 이들 두 영역은 면역글로불린의 그것과 유사하며, Fab 단편과 닮았다. 각 사슬의 V영역은 세개의 상보성 결정영역(CDR:complementarity determining regions)을 갖는다. 막에 근접하여, 각 TCR 사슬은 두 사슬간에 이황화결합을 형성하는 시스테인 잔기로 짧게 연결된 서열을 갖는다.
αβ 또는 γδ 이형이량체를 암호화하는 유전자는 T세포 계통에서만 발현된다. 네개의 TCR 자리( α,β,γ 및 δ)는 면역글로불린의 그것과 매우 유사한 생식계통 조직을 갖는다. β 및 δ사슬은 V, D 및 J 단편의 재조합으로 생성되는 데에 반하여, α 및 γ사슬은 V 및 J 단편의 재조합으로 생성된다. TCR 사슬에 대한 유전자 단편은 α사슬의 V 및 J 단편 사이에 있는 δ사슬 유전자 단편을 제외하고는 다른 염색체 상에 위치한다. δ사슬 유전자 단편의 위치는 중요한 의미를 갖는다: α사슬 유전자 단편의 생산적 재조합은 δ사슬의 C 유전자를 제거하기 때문에 주어진 세포에서 αβ이형단량체는 γδ수용체와 함께 발현될 수 없다.
쥐에는, 약 100 Vα 및 50 Jα 유전자 단편과 단 하나의 Cα단편이 있다. δ사슬 유전자계는 약 10 V, 2 D 및 2 J 유전자 단편을 갖는다. β사슬 유전자계는 20~30 V 단편과 1 Dβ, 6 Jβ 및 1 Cβ를 포함하는 두개의 동일한 반복을 갖는다. 결국, γ사슬 유전자계는 7 V 및 3개의 다른 J-C 반복을 포함한다. 인간에서의 조직은 쥐의 그것과 유사하나, 단편의 수는 다르다.
α 및 β사슬에서 유전자 단편의 재조합은 면역글로불린에서의 그것과 유사하다. α사슬은 면역글로불린의 가벼운 사슬과 같이 V, J 및 C 유전자 단편에 의해 암호화된다. β사슬은 면역글로불린의 무거운 사슬과 같이 V, D 및 J 유전자 단편에 의하여 암호화된다. α사슬 유전자 단편의 재조합은 VJ 결합이 되고, β사슬의 재조합은 VDJ 결합이 된다. 재조합된 유전자의 전사, RNA 가공 및 번역 후에, T세포 세포막내의 이황화결합에 의하여 α 및 β 사슬이 연결 발현된다.
TCR 유전자 단편은 12 뉴클레오티드(1회전) 또는 23 뉴클레오티드(2회전) 중 하나의 개입서열과 함께 헵타머(heptamer) 및 노나머(nonamer)를 포함하는 인식신호서열(RSS:recognition signal sequences)에 의하여 측면에 접해진다. 면역글로불린에서와 같이, 재결합 활성 유전자(RAG-1 및 RAG-2)에 의해 암호화되는 효소로 재결합이 진행된다. RAG1/2는 면역글로불린 재조합과 같은 방법으로 RSS를 인식하고 V-J 및 V-D-J 단편을 결합한다. 간단히 말하면, 이들 효소는 유전자 단편과 RSS 사이의 하나의 DNA 가닥을 자르고, 암호화 서열에서 헤어핀(hairpin)의 형성을 촉진한다.
α사슬의 V 및 J 단편과 β사슬의 V, D 및 J 단편의 조합결합은 가능한 많은 분자를 생성하며, 그에 의해서 TCR의 다양성이 생긴다. TCR에서 다양성은 또한 유전자 단편의 선택적 결합에 의해서 얻어진다. 면역글로불린과는 대조적으로, β 및 δ유전자 단편은 선택적인 방법으로 결합될 수 있다. β 및 δ유전자 단편에서 RSS 인접 유전자 단편은 β사슬 내에 VJ 및 VDJ를, δ사슬 상에 VJ, VDJ 및 VDDJ를 생성할 수 있다. 면역글로불린의 경우와 같이, 다양성은 또한 유전자 단편의 결합에서의 변이성에 의해서도 생긴다.
상보성 결정영역(CDRs:complementarity determining regions)인 TCR의 과변루프는 MHC 분자 및 결합 펩티드로부터 생성된 혼성표면을 인식한다. CDR1 및 CDR3 루프가 펩티드와 MHC 분자 모두에 접촉하는 반면, α 및 β의 CDR2는 APC 표면의 MHC 분자에만 접촉한다. Ig와 비교하여, TCR은 CDR1 및 CDR2에서 더 제한된 다양성을 가진다. 그러나, TCR은 증가된 접합 다양성을 이끄는 하나 이상의 D 단편과 결합할 수 있기 때문에, TCR에서 CDR3 루프의 다양성은 Ig의 그것보다 더 크다.
많은 자가면역 질병의 발생은 유기체에 내재하는 자기 항원에 반응하는 자가면역 T세포에 의해 야기되는 것으로 여겨진다. 클론의 선택전형과는 대조적으로, 모든 자기반응 T 세포가 흉선에서 제거되지는 않는다. 이들 T 세포는 자기항원의 넓은 스펙트럼에 대한 TCR로 정상 T 세포 레퍼토리의 일부를 발현하고 말초에서 자연스럽게 순환한다. 자기반응성 T 세포가 그들의 순환동안 흉선에서 분화를 수행하도록 허용되고, 말초에서 수용되는 이유는 분명하지 않다. 그 생리학적 역할은 알려지지 않지만, 이들 자기반응성 T 세포가 활성화되면 자가면역 질병을 유도할 잠재적인 위험을 갖는다. 자동적인 자기반응의 항원인식이 자기파괴 과정을 중재하기에 충분하지 않다는 것이 확인되어 왔다. 병원성이 될 자기반응성 T 세포에 대한 선행조건 중 하나는 그들이 활성화되는 것이다.
자기반응성 T 세포는 다발성 경화증(MS:multiple sclerosis) 및 류머티스 관절염(RA:rheumatoid arthritis)와 같은 자가면역 질병의 발병에 관련된다. MS 에서 자기반응성 T 세포의 발병은 미엘린 항원, 특히 미엘린 염기성 단백질(MBP:myelin basic protein)에 대해 반응하는 T 세포로부터 일반적으로 발생한다. MBP-반응성 T 세포는 생체내 활성화를 수행하고, 대조표준에 대응되는 MS 환자의 혈액 및 뇌척수액에서의 높은 선구물질 빈도를 발생하는 것으로 알려진다. 이들 MBP-반응성 T 세포는 중앙신경계로의 염증성 세포의 이동을 촉진하고, MS에서 미엘린-파괴 염증성 반응을 악화시키는, 예를 들어 IL-2, TNFα, 및 γ-엔터페론(IFNγ)인 TH1 사이토카인을 생성한다.
미엘린-반응성 T 세포는 또한 MS와 닮은 동물내의 실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE:experimental autoimmune encephalomyelitis)의 발병과 관련되는 것으로 알려져 왔다. EAE는 보조제에 유화된 미엘린 단백질을 주입하여 민감한 동물 내에서 적극적으로 유발되거나, 미엘린-민감성 동물로부터 유래된 클론 및 미엘린-반응성 T 세포선 주입으로 수동적으로 유발될 수 있다. 생체외에서 활성화되면, 동일한 반응성을 갖는 100겹(100fold) 이상의 휴면 T 세포가 EAE를 매개할 수 없는 반면, 아주 적은 수의 미엘린 반응성 T 세포가 EAE의 유발에 요구된다.
EAE는 T-세포 백신이라고 하는 과정인, 비활성화된 미엘린-반응성 T 세포의 백신접종으로 예방되고 또한 치료되는 것으로 알려져왔다.(벤-넘 등., 네이쳐, 1982; 292: 60-61). T 세포 백신은 미엘린-반응성 T 세포의 감소를 이끄는 항-에르고타입 T 세포와 항-이디오타입 T 세포를 포함하는 조절 면역반응을 유발한다. 미엘린-반응성 T 세포의 감소에 의해, EAE 및 다른 실험적 자가면역질병 모델에서 치료효과가 관찰된다(리더 등, 사이언스, 1988; 239:820-822:로스 등, 사이언스, 1989;244:820-822)
자가면역질병 모델에서의 성공에 따라, T 세포백신은 최근에 MS 환자의 치료적 시도까지 진행되었다. EAE와 같은 실험적 모델에서의 결과에 기초하여, 자기반응성 T 세포의 감소가 MS 및 다른 자가면역 질병의 치료과정을 향상시킬 수 있을 것으로 여겨진다.
시험적인 임상적 시도에서, 방사선 조사된 자기조직 MBP-반응성 T 세포클론의 백신은 특이적으로 인식되고 순환하는 MBP-반응성 T 세포가 용해된 CD8+ 세포용해성 T 세포를 유도했다(쟝 등., 사이언스, 1993;261:1451-1454, 메더 등.,란세트 1995:346:807-808). 방사선 조사된 MBP-반응성 T 세포 클론의 피하접종은 MS 환자에서 순환하는 MBP-반응성 T 세포의 감소를 유발했다.
예비적 임상적 시도에서, 순환하는 MBP-반응성 T 세포는 방사선 조사된 자기조직의 MBP-반응성 T 세포로 환자에게 세번 피하주사를 접종함으로써 재발된 MS환자 및 2차 진행의 MS 환자에서 감소되었다(Zhang 등., J Neurol.,2002;249:212-8). T 세포백신은 재발율, 확장된 장애범위정도 및 MRI 병변 활동성에 의하여 측정되는 바와 같이 환자의 각 그룹에 도움을 주었다. 그러나, 최후의 주입에서 약 12개월 후 진행이 가속화되는 경향이 있었다. 명백히 가속화된 진행의 의미는 알 수 없지만, MBP-반응성 T 세포에 대한 T 세포 백신에 의해 유도된 면역성의 점차적 감소와 관련될 수 있다. 면역화된 환자의 약 10~12%에서, MBP-반응성 T 세포는 가속화된 진행과 같은 시간에 나타났다. 몇몇의 경우에, 재출연한 MBP-반응성 T 세포는 백신접종 전에 검출되지 않은 다른 클론집단으로부터 유래되었으며, 이는 MBP-반응성 T 세포는 클론변화 또는 에피토프 확산을 수행할 수 있음을 나타낸다. MBP-반응성 T 세포의 클론변화는 종래의 연구에서 관찰되어 왔으며(Zhang 등. 1995), 진행중인 질병진행과 관련될 수 있다.
T 세포백신이 미엘린-반응성 T 세포의 감소에 효과적이고 MS 환자에게 잠재적인 이익을 주는 것으로 알려져 왔지만, 그 치료에는 몇가지 문제점이 있다. 미엘린-반응성 T 세포의 T 세포수용체는 매우 다양하고, 다른 MS 환자 간에 다르기 때문에, 각 환자에 대한 T 세포 백신 치료는 개별적으로 다루어져야 한다(Vandevyver 등., Eur.J.Immunol.,1995;25:958-968, Wucherpfennig 등., J.Immunol.,1994;152:5581-5592, Hong 등.,J.Immunol.,1999;163:3530-3538).
각 환자에 대한 개별화 뿐만 아니라, 8주까지가 현재의 과정을 이용하는 주어진 T 세포 백신을 생산하는데에 요구된다. T 세포백신의 생산은 환자의 뇌척수액(CSFMCs) 또는 말단혈액(PBMCs)에서 단핵세포를 분리하면서 시작된다. 분리된 단핵세포는 미엘린-반응성 T 세포를 활성화하기 위해 미엘린 펩티드로 7~10일동안 배양된다. 다음에 배양은 3일의 기간이상 미엘린 펩티드의 존재하에서 [3H]-티미딘 융합을 측정함으로써 미엘린 펩티드에 대한 특이적 증식이 테스트된다. 미엘린 펩티드에 대한 특이적 증식에 양성 테스트되는 배양은 다음에 클론 T 세포를 얻기 위해 희석되거나 또는 직접 확장된다. 세포들은 다음에 T 세포를 증대시키기 위해 6~8 주까지 배양된다. 최종의 T 세포 백신 생산물이 클론화될 때, T 세포는 Vβ-Dβ-Jβ유전자 사용의 단일 패턴과 상동이다. 보통, 클론 세포선의 6에서 3은 Vβ-Dβ-Jβ유전자 사용의 다양한 패턴으로 이종의 조직을 생산하기 위해 조합된다. 최종의 T 세포 백신 생산물이 직접 확장에 의해 생산되는 경우, T 세포는 Vβ-Dβ-Jβ유전자 사용의 하나보다 많은 패턴과 이종이다.
T 세포 백신의 개별화된 성질 및 각 백신의 생산에 필요한 장기의 세포배양은 현재의 계통적 분리법 하에서는 치료를 비싸게 하고, 노동력이 집약되게 한다. 세포배양에 요구되는 연장된 시간은 또한 오염의 심각한 위험을 일으킨다. 결국, 미엘린-반응성 T 세포의 클론 변화 또는 에피토프 확산의 가능성은 Vβ-Dβ-Jβ유전자 사용의 다른 패턴으로 각 환자에 대한 T 세포백신의 2차적 생산을 필요로 할 수 있다.
그러므로, MS와 같은 T 세포매개 질병의 환자의 치료를 위한 T 세포백신를 생산하기 위해 사용될 수 있는 MBP와 같은 항원에 대한 특이성으로 T 세포를 분리하는 개선된 방법을 발전시킬 필요가 존재한다. 또한 자기반응성 T 세포의 클론 변화의 원인이 되는 Vβ-Dβ-Jβ유전자 사용의 이형적 패턴으로 T 세포 백신을 생산하는 개선된 방법을 발전시킬 필요가 존재한다.
도 1은 자극전(왼쪽), MBP의 83~99 잔기로 자극 후(가운데), 그리고 MBP의 83~99 잔기로 자극 후(오른쪽), 다발성 경화증환자에서 CD69 및 γIFN(위)와 CD69 및 TNFα(아래)를 발현하는 세포의 FACS 식별을 나타낸다.
도 2는 자극전(왼쪽), MBP의 83~99 잔기로 자극 후(가운데), 그리고 MBP의 83~99 잔기로 자극 후(오른쪽), 건강한 대조표준 환자에서 CD69 및 γIFN(위)와 CD69 및 TNFα(아래)를 발현하는 세포의 FACS 식별을 나타낸다.
1. 정의
본 발명의 이해를 돕기위해 몇가지 용어를 아래와 같이 정의한다.
여기에서 사용된 "자가항원" 또는 "자기항원"은 포유류에 내재된 상기 포유류 질병에 면역원성이고 자가면역의 병원과 관련될 수 있는 포유류로부터의 항원 또는 에피토프이다.
여기에서 사용된 "CD", "분화 클러스트(cluster of differentiation)" 또는 "공통 결정인자(common determinant)"는 항체에 의해 인식된 세포표면 분자를 말한다. 몇몇 CD의 발현은 특정의 계통 또는 성숙경로의 세포에 특이적이고, 다른 것들의 발현은 활성화 상태, 위치 또는 동일 세포의 분화에 따라 다양하다.
뉴클레오티드 서열의 문맥 상에서 "~로부터 유래된" 또는 "그 유도체"는, 그 뉴클레오티드 서열이 기술된 특정 서열에 한정되는 것이 아니라, 그 서열에서의 변화를 포함하며, 이것은 또한 뉴클레오티드 추가, 고갈, 치환 또는 적절하거나 매우 제한된 조건하에서 기술된 서열의 보체로 혼성화할 수 있는 능력을 가진 기술된 서열에 대한 변화범위까지의 변형을 포함할 수 있다. 펩티드 또는 폴리펩티드 서열에 관한 문맥에서, "~로부터 유래된" 또는 "그 유도체"는 펩티드 또는 폴리펩티드가 기술된 특정서열에 한정되는 것이 아니라, 그 서열에서의 변화를 포함하며, 이것은 아미노산 추가, 고갈, 치환, 또는 기술된 서열에 대한 면역반응을 유도하는 능력을 보유하는 리스트된 서열에서의 변화범위까지의 변형을 포함할 수 있다.
펩티드 또는 폴리펩티드를 기술하는 데에 사용되는 경우, "면역원성"은 펩티드 또는 폴리펩티드가 매개된 T 세포, 항체 또는 양쪽 중 하나로 면역반응을 유도할 수 있다는 것을 의미한다.
"면역관련질병"은 면역시스템이 질병의 병원에 관련되는 질병을 의미한다. 면역관련 질병의 일부는 자가면역질병이다. 자가면역 질병은 류마티스 관절염, 중증성 근무력증, 다발성 경화증, 건선, 전신홍반성 낭창, 자가면역 갑상선염(하시모토 갑상선), 중증성 질병, 염증성 장 질환, 자가면역 포도막망막염, 다근염 및 특정 타입의 당뇨병을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 개시의 관점에서, 해당분야의 숙련된 자는 본 발명의 구성과 방법에 의하여 다룰 수 있는 다른 자가면역 질병을 쉽게 이해할 수 있다.
"PCR"은 예를 들어, 미국 특허 제 4,683,202호(1987.7.28에 Mullis에 발행)에서 일반적으로 기재된 것처럼 중합효소 연쇄 반응을 의미하며, 참고를 위하여 여기에 구체화되었다. PCR은 (DNA 또는 RNA 중합효소와 같은)중합제 및 뉴클레오티드 삼인산의 존재하에 핵산 주형에 잡종화될 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 프라이머를 선택하는 증폭 기술이고, 이에 의한 확장 생산물은 상기 프라이머로 부터 형성될 수 있다. 이들 생산물은 변성된 다음 이후의 검출을 용이하게 할 수 있는 핵산의 수와 양을 증폭시키는 순환반응에서의 주형으로서 사용될 수 있다. PCR 기술의 다양성은 본 기술분야에 알려져 있으며, 여기에 개시된 것과 관련되어 이용될 수 있다.
"펩티드" 또는 "폴리펩티드"는 아미노산의 연결된 서열이며, 고유, 합성, 또는 변형 또는 고유 및 합성의 조합일 수 있다.
"프라이머"는 주형 분자상의 특이적 뉴클레오티드 서열에 충분히 상보적인 뉴클레오티드 합성의 개시점처럼 작용할 수 있는 고유의, 합성의 올리고뉴클레오티드 또는 그 변형 중의 하나를 의미한다.
"프로브"는 충분히 상보적인 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 고유의, 합성의 올리고뉴클레오티드 또는 그 변형 중의 하나를 의미한다.
"T 세포 매개된 질병"이란 자기항원을 인식하는 T 세포의 결과로서 발생하는 질병을 말한다.
질병으로부터 동물의 보호를 언급할 때의 "치료" 또는 "치료하는 것"이란, 질병을 예방, 억제, 진압 또는 완전히 제거하는 것을 의미한다. 질병의 예방은 질병의 징후에 앞서 동물에 대해 본 발명의 조성물을 처방하는 것을 뜻한다. 질병 억제는 임상으로 나타나기 전, 질병의 유발 후 동물에 본 발명의 조성물을 처방하는 것을 뜻한다. 질병의 진압은 질병이 임상으로 나타난 후 동물에 본 발명의 조성물을 처리하는 것을 뜻한다.
2. 항원특이성 T 세포의 분리
a. 모노클로날 항원특이성 T 세포의 분리
T 세포는 세포배양에서 목표항원 및 항원존재 세포와 배양함으로써 활성화되고 확장된다. 일단 활성화되면, T 세포는 많은 유전자 생산물의 전사와 발현을 이끄는 세포 신호의 복잡한 캐스케이드(cascade)를 수행한다. 여기에 기술된 발명은 원하는 항원 특이성으로 T 세포의 식별과 분리를 위해 활성화된 T 세포에 특이적인 유전자 생산물을 이용한다.
첫번째 관점에서, 본 발명은 대상항원에 특이적인 T 세포를 분리하는 방법에 관한 것이다. T 세포를 포함하는 샘플은 대상항원에 특이적인 T 세포의 활성화를 야기하는 특정 항원과 배양될 수 있다. 샘플은 1에서 7일동안 항원과 배양될 수 있다. 샘플은 또한 하루이하 동안 항원과 배양된다. 샘플은 또한 16시간 이하 동안 항원과 배양될 수 있다. 샘플은 또한 12시간 이하 동안 항원과 배양될 수 있다. 샘플은 또한 8시간 이하 동안 항원과 배양될 수 있다. 샘플은 또한 4시간 이하 동안 항원과 배양될 수 있다. 샘플은 또한 2시간 이하동안 항원과 배양될 수 있다.
대상항원에 특이적인 T 세포는 상기한 바와 같이 활성화된 T 세포의 유전자 생산물을 발현하는 T 세포를 선택함으로써 분리될 수 있다. 활성화된 T 세포의 일부는 일부 특이적 유전자 생산물 또는 세포 표면 표지(예, CD4 대 CD8)로 T 세포를 선택함으로써 분리될 수 있다.
대상 항원은 미엘린 염기성 단백질(MBP), 프로테올리핀 단백질(PLP:proteolipid protein), 미엘린 핍지신경교 글리코단백질(MOG:myelin oligodendrocyte glycoprotein), 또는 그 단편을 포함한다. 대상 항원은 또한 MBP의 83~99 잔기 또는 151~170 잔기를 포함하는 면역우성 단편일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 대상 항원은 또한 둘 이상의 각각의 대상 항원의 조합일 수 있다.
T 세포를 활성화하기 위해 사용되는 항원 또는 그 유도체는 대상 항원에 대한 면역반응을 유도할 수 있는 어떠한 면역원일 수 있다. 활성화 항원은 대상 항원 또는 그 유도체일 수 있다. 활성화 항원은 MBP, PLP, MOD 또는 그 단편 및/또는 유도체일 수 있다. 활성화 항원은 MBP의 83~99 잔기 또는 151~170 잔기 또는 그 단편 및/또는 유도체를 포함하나, 그에 한정되는 것은 아닌, 면역우성 단편일 수 있다. 활성화 항원은 또한 둘 이상의 각각의 활성화 항원의 조합일 수 있다. 활성화 항원은 대상 항원에 특이적인 T 세포를 활성화하기 위해 한번 이상 사용된다.
T 세포는 단핵세포를 포함하는 어떠한 샘플에서도 존재한다. 샘플은 MS 환자의 말초혈액이나 뇌척수액으로부터 또는 RA 환자의 활액으로부터 분리될 수 있다. 다른 자가면역 질병 환자로부터의 T 세포는 그 질병과 관련된 말초혈액 및/또는 조직으로부터 동일하게 분리될 수 있다. 단핵세포는 피코 그레디언트(Ficill?gradients)를 포함하나 그에 한정되지 않는 기술분야에 알려진 원심분리기술을 이용하여 샘플에서 진하게 될 수 있다.
활성화된 T 세포를 식별하고 음성적으로 선택하는 유전자 생산물은 세포표면 표지 또는 사이토카인 또는 그 조합일 수 있다. 활성화된 T 세포를 식별하기 위한 세포표면 표지는 CD69, CD4, CD8, CD25, HLA-DR, CD28, CD134를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. CD69는 B 및 T림프구, NK 세포 및 과립구에서 발견되는 조기 활성화 표지이다. CD25는 IL-2 수용체 및 활성화된 T 및 B세포의 표지이다. CD4는 TCR 공동수용체이고 및 흉선세포, TH1- 및 TH2-형 T 세포, 단핵세포 및 매크로파지의 표지이다. CD8은 또한 TCR 공동수용체이고 세포독성 T 세포의 표지이다. CD134는 활성화된 CD4+ T 세포에서만 발현된다.
활성화된 T 세포의 음성 선택을 위한 세포표면 표지는 CD36, CD40 및 CD44를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. CD28은 T 세포 수용체 경로에 독립적인 T 세포 활성화 경로 자극제로서 작용하고 CD4+ 및 CD8+ 세포에서 발현된다. CD36은 세포막 글리코단백질이고 혈소판, 단핵세포 및 내피 세포의 표지이다. CD40은 B 세포, 매크로파지 및 수지상 세포의 표지이다. CD44는 매크로 파지 및 다른 식세포의 표지이다. T 세포의 일부는 헬퍼 T 세포 또는 세포독성 T 세포의 세포 표면 유전자 생산물의 발현을 위한 양성 선택, 음성 선택 또는 그 조합을 이용하여 분리될 수 있다(예, CD4 대 CD8).
본 발명의 활성화된 T 세포를 식별하기 위한 사이토카인은 TH1-형 T 세포(세포매개반응) 및 TH2-형 T 세포(항체반응)에 의하여 생성된 사이토카인을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 활성화된 TH1-형 T 세포를 식별하기 위한 사이토카인은 IL-2, 감마 인터페론(γIFN) 및 조직괴사인자α(TNFα)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 활성화된 TH2-형 T 세포를 식별하기 위한 사이토카인은 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. T 세포의 일부는 또한 헬퍼 T 세포 또는 세포독성 T 세포의 사이토카인 유전자 산물의 발현을 위한 양성 선택, 음성 선택 또는 그 조합을 이용하여 분리될 수 있다(예, γIFN 대 IL4).
대상 항원에 특이적인 활성화된 TH1-형 T 세포는 CD69, CD4, CD25, IL-2, IFNγ, TNFα 또는 그 조합을 발현하는 세포를 식별함으로써 분리될 수 있다. 대상 항원에 특이적인 활성화된 TH1-형 T 세포는 IFNγ 또는 TNFα와 함께 CD69 및 CD4를 발현하는 세포를 식별함으로써 분리될 수 있다. 대상 항원에 특이적인 활성화된 TH2-형 T 세포는 CD69, CD4, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 또는 그 조합을 발현하는 세포를 식별함으로써 분리될 수 있다. 대상 항원에 특이적인 활성화된 TH1-형 T 세포 및 TH2-형 T 세포의 조합은 CD69, CD4, CD25, IL-2, IFNγ, TNFα 또는 그 조합을 발현하는 세포와 CD69, CD4, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 또는 그 조합을 발현하는 세포를 식별함으로써 분리될 수 있다.
본 발명의 화성화된 T 세포의 양성 또는 음성 선택에 사용된 유전자 산물을 형광활성세포분류(FACS:fluorescence activated cell sorting), 마그네틱 세포분류, 패닝(panning) 및 크로마토그래피를 포함하나 이에 한정되는 것은 아닌 항체를 사용하는 기술분야에 알려진 면역선택 기술에 의하여 식별될 수 있다. 활성화된 T 세포상의 둘 이상의 표지의 면역선택은 하나 이상의 단계로 수행될 수 있으며, 여기에서 각 단계는 하나 이상의 표지를 양성 또는 음성선택한다. 둘 이상의 면역선택은 FACS를 이용하는 하나의 단계에서 수행되고, 둘 이상의 다른 항체는 다른 형광단으로 표시될 수 있다.
마그네틱 세포분류는 산화철 및 폴리사카리드 도금으로 구성된 초-강자성 마이크로비드를 사용하여 수행될 수 있다. 마이크로비드는 직경이 약 50 나노미터이고, 전형적인 포유류 세포의 약 백만분의 일의 부피를 갖는 것이 바람직하다. 마이크로비드는 콜로이탈 서스펜션에 남기에 충분히 작은 것이 바람직하며, 세포 표면 항원에 빠르고 효과적으로 결합할 수 있게 한다. 마이크로비드는 흐름 혈구계산을 방해하지 않고, 생분해 가능하며, 세포기능상 무시할만한 효과를 갖는다. 마이크로비드로와의 결합항체는 2차항체를 통하여 직접적 또는 간접적으로 플루오레세인과 같은 리간드가 된다.
항체는 Fab, F(ab`)2, Fd 및 단일가닥 항체, 다이아바디, 복특이성 항체, 복기능 항체 및 그 유도체를 포함하는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE, 또는 그 단편이나 유도체일 수 있다. 항체는 활성화된 T 세포에 특이적인 유전자산물의 에피토프 또는 그로부터 유래한 서열에 대해 충분한 결합 특이성을 나타내는 모노클로날 항체, 폴리클론 항체, 친화성 순화항체 또는 그 혼합일 수 있다. 항체는 또한 키메라 항체일 수 있다.
항체는 또한 항체가 결합되는 활성화된 T 세포의 식별 및/또는 선택을 허용하는 기술분야에 알려진 하나 이상의 화학제품, 펩티드, 또는 폴리펩티드 일부분의 부착에 의하여 얻어질 수 있다. 항체는 형광 염료와 같은 화학제품 일부와 결합될 수 있다. 형광표지된 항체에 의해 결합된 활성화된 T 세포는 형광활성세포분류법(FACS)를 포함하나 그에 한정되는 것은 아닌 기술을 사용하여 분리될 수 있다. 항체는 강자성 마이크로비드와 같이 마그네틱 입자와 결합될 수 있다(Miltenyi Biotec, 독일). 자성표지된 항체로 결합된 활성화된 T 세포는 마그네틱 세포분류법을 포함하나 그에 한정되는 것이 아닌 기술을 이용하여 분리될 수 있다.
유전자산물이 발현된 세포표면으로 인해, 항체는 유전자산물에 직접 결합될 수 있고, 세포선택에 이용될 수 있다. 낮은 농도에서 발현된 세포표면 유전자산물로 인해, 자기형광 리포솜(Scheffold 등, Nature Med 6:107-110,2000)은 세포선택에 이용될 수 있다. 낮은 수준의 발현에서, 종래의 형광표지된 항체는 유전자 산물이 발현된 세포표면의 존재를 검출하기에는 충분히 민감하지 않을 수 있다. 리포솜을 포함하는 형광단은 대상의 특이성으로 항체에 결합할 수 있으며, 그로 인해 유전자 산물이 발현된 세포표면의 검출이 가능하다.
사이토 카인과 같은 세포내 유전자 산물로 인해, 항체는 세포 투과화 후에 이용된다. 대신, 투과화로 인한 세포죽음을 피하기 위해 세포내 유전자 산물은 그것이 궁극적으로 세포로부터 분리된다면 세포 표면상의 "캐치(catch)" 항체를 이용하는 세포막을 통하여 분리되어 검출될 수 있다. 캐치항체는 두개의 다른 항원에 특이적인 이중의 항체일 수 있다:(ⅰ) 분리된 대상 유전자 산물 및 (ⅱ) 세포표면 단백질. 세포표면 단백질은 T 세포, 특히 림프구에 일반적으로 존재하는 어떠한 표지일 수 있다(예, CD45). 캐치 항체는 우선 세포표면 단백질에 결합하고, 그 다음 세포막을 통해서 분리된 세포내 대상 유전자 산물에 결합하며, 그로 인해 세포표면 상에 유전자 산물이 유지된다. 다음에 포획된 유전자산물에 특이적인 표지된 항체는 유전자 산물에 결합하는 데에 이용될 수 있으며, 이는 활성화된 T 세포의 선택을 가능하게 한다(Manz 등, Proc.Natl.Acad.Sci.미국 92:1921-1925,1995, 참조로서 여기에 구체화됨) .
사이토카인의 특정 형태는 또한 낮은 농도에서 세포표면상에 발현된다. 예를 들어, γIFN은 낮은 농도에서 세포내 γIFN 발현의 그것과 유사한 작용으로 세포표면에 디스플레이된다(Axxenmacher 등, Eur J.Immunol,1996,26:263-267). 세포표면에 발현된 사이토카인의 형태로 인해, 종래의 형광표지된 항체 또는 리포솜을 포함하는 형광단이 대상 사이토카인의 검출에 사용될 수 있다. 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 활성화된 T 세포에 특이적인 세포외 및 세포내 유전자 산물을 검출하고 선택하는 기술을 인지할 것이다.
본 발명에 의해 분리된 T 세포는 모든 혈액으로부터 적어도 90% 까지 증대될 수 있다. 상기 T 세포는 또한 모든 혈액으로부터 적어도 95% 까지 증대될 수 있다. 상기 T 세포는 또한 모든 혈액으로부터 적어도 98% 까지 증대될 수 있다. 상기 T 세포는 또한 모든 혈액으로부터 99.5% 분리될 수 있다.
b. 분리된 모노클로날 항원특이성 T 세포
두 번째 관점에서, 본 발명은 본 발명의 첫번째 관점의 방법에 의하여 분리된 대상 항원에 특이적인 T 세포에 대한 것이다.
c. 폴리클로날 항원특이성 T 세포의 분리
세 번째 관점에서, 본 발명은 하나 이상의 대상 항원에 특이적인 T 세포를 분리하는 방법에 대한 것이다. T 세포를 포함하는 샘플은 하나 이상의 항원과 배양되고, 이는 하나 이상의 항원에 특이적인 T 세포의 활성화를 야기한다. 하나 이상의 항원에 특이적인 T 세포는 그 후 본 발명의 첫 번째 관점에서와 같이 분리될 수 있다.
상기 T 세포는 대상 항원에 각각 특이적인 다른 TCR을 발현하는 Vβ-Dβ-Jβ유전자 이용의 이형적 패턴을 가질 수 있다. 상기 T 세포는 또한 하나 보다 많은 대상 항원에 특이적인 다른 TCR을 발현하는 Vβ-Dβ-Jβ유전자 이용의 이형적 패턴을 가질 수 있다. 아래 기술된 바와 같이, Vβ-Dβ-Jβ유전자 이용의 이형적 패턴을 포함하는 T 세포는 백신접종된 환자에서 에피토프 확산을 저지할 수 있는 폴리클로날 T 세포를 조제하는 데에 이용될 수 있다.
d. 분리된 폴리클로날 항원특이성 T 세포
네 번째 관점에서, 본 발명은 본 발명의 세 번째 관점의 방법에 의해 분리된 하나 이상의 대상 항원에 특이적인 T 세포에 대한 것이다.
3. 항원특이성 T 세포 수의 측정
다섯 번째 관점에서, 본 발명은 본 발명의 첫 번째 또는 세 번째 관점의 방법에 의해 분리된 T 세포의 수를 측정하여 샘플 내에서 하나 이상의 대상항원에 특이적인 T 세포의 상대적 빈도수를 측정하는 방법에 대한 것이다.
4. 자가면역질병의 진단
본 발명의 여섯 번째 관점에서, 자가면역질병 환자는 환자로부터의 샘플을 획득하고 본 발명의 첫 번째 또는 세 번째 관점의 방법에 의하여 자기반응성 T 세포를 분리함으로써 진단될 수 있다. 자가면역질병은 대조군에 대한 환자 내의 자기반응성 T 세포의 수준을 비교함으로써 진단될 수 있다. 자기반응성 T 세포의 수준은 본 발명의 다섯 번째 관점의 방법에 따라서 측정될 수 있다.
5. 자가면역질병 진행의 감시
본 발명의 일곱 번째 관점에서, 자가면역질병은 본 발명의 다섯 번째 관점에 따라 자가면역질병 환자로부터의 샘플에서의 자기반응성 T 세포의 빈도수를 측정함으로써 감시될 수 있다. 자가면역질병의 징후의 심각성은 자기반응성 T 세포의 수와 상호관련될 수 있다. 또한, 샘플내에서의 자기반응성 T 세포 수의 증가는 징후의 심각성을 경감하기 위한 치료적용 및/또는 징후의 발생 전에 질병을 치료하기 위한 표시로 이용될 수 있다.
6. 자가면역질병의 치료를 위한 백신 생산
본 발명의 여덟 번째 관점에서, 조성물은 본 발명의 첫 번째 또는 세 번째 관점의 방법으로 분리되는(그리고 여기에 기술된 것처럼 배양에서 시각적으로 확장되는) 자기반응성 T 세포를 비활성화함으로써 자가면역질병을 치료하기 위하여 생산될 수 있다. 자기반응성 T 세포는 화학적 비활성화 또는 방사선 요법을 포함하나 이에 한정되는 것은 아닌 기술분야에 알려진 많은 방법을 이용하여 비화성화 될 수 있다. 자기반응성 T 세포는 동결보존을 포함하나 이에 한정되지 않는 기술분야에 알려진 많은 기술을 이용하여 비활성화 전 또는 후에 보존될 수 있다. 이하에 기술된 바와 같이, 상기 조성물은 자가면역 환자내에서 자기반응성 T 세포를 감소시키는 백신으로서 사용될 수 있다.
상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있으며, 기술분야에서 잘 알려진 방법을 이용하여 생산될 수 있다. 질병 또는 질환의 치료에서 예방 또는 치료적 요법으로 이용되는 약학적 조성물은 당업자에의해 생산될 수 있다. 이러한 원리는 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어 참고로서 여기에 구체화된 Braunwald 등,Harrison's Principle of Internal Medicin, 11판, McGraw-Hill출판사, 뉴욕(1987)에 개시되었다. 상기 약학적 조성물은 상기 조성물의 유용한 효과를 실험할 수 있는 어떠한 동물에도 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물을 주입받는 동물은 인간 또는 다른 포유류일 수 있다.
a. 백신
아홉 번째 관점에서, 본 발명은 본 발명의 여덟 번째 관점의 방법으로 생산된 조성물과 관련된다. 상기 조성물은 백신일 수 있으며, 자가면역 환자의 자기반응성 T 세포를 감소시키기 위해 이용된다.
7. 자가면역질병의 치료
열 번째 관점에서, 자가면역질병은 본 발명의 아홉 번째 관점에 따른 조성물을 처방함으로써 자기반응성 T 세포를 가진 환자를 치료할 수 있다. 상기 조성물은 백신일 수 있으며, 환자 내의 자기반응성 T 세포의 감소를 인도할 수 있다.
백신은 Vβ-Dβ-Jβ유전자 이용의 상동("모노클로날") 또는 이형("폴리클로날")의 패턴을 포함하는 자기반응성 T 세포를 포함한다. 임상 연구는 자기세포의 모노클로날 T 세포 백신을 접종받은 자가면역 환자가 미엘린 반응성 T 세포에 대한 면역성의 점차적 감소를 보일 수 있다는 것을 나타낸다. 몇 가지 경우에, 재발하는 자기반응성 T 세포는 다른 클론집단으로부터 유래될 수 있으며, 미엘린 반응성 T 세포는 진행하는 질병경과와 잠재적으로 관련된 클론변화나 에피토프 확산을 수행할 수 있는 것을 나타낸다. 클론변화나 에피토프 확산은 자기반응성 T 세포에 의해 매개된 자가면역질병에서 문제가 될 수 있다. 자기반응성 T 세포의 다양한 집단을 감소시킬 수 있는 폴리클로날 자기반응성 T 세포를 포함하는 백신은 클론변화 또는 에피토프 확산의 문제를 제거할 수 있다.
상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있고, 그 의도된 목적을 달성하는 어떠한 수단에 의해 투여된다. 예를 들어, 비경구, 피하, 정맥 내, 동맥 내, 피 내, 근육 내, 복강 내, 경피, 점막, 뇌 내, 포막 내, 또는 심장내의 경로로 투여될 수 있다. 약학적 조성물은 대량의 주사 또는 점차적인 투여에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다.
투여량은 복용자의 나이, 성별, 건강, 체중, 진행 중인 치료의 종류, 만일 있다면, 치료의 빈도, 바라는 효과의 성질에 따를 수 있다. 상기 약학적 조성물의 투여량 범위가 원하는 효과를 발생하기에 충분히 많을 수 있으며, 예를 들어, 그로 인해 자기반응성 T 세포가 본 발명의 일곱 번째 관점에 의해 측정된 바와 같이 감소되고, 그 자가면역질병은 상당히 예방, 억제 또는 치료된다. 투여량은 또한 원하지 않는 교차반응, 일반화된 면역억제, 과민성 반응 등과 같은 불리한 부작용을 야기할 정도로 많지는 않을 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 이용될 수 있는 표본으로 활동성 조성물의 진행을 용이하게 할 수 있는 부형제 및 보조제를 포함하는 적합한 약학적으로 수용가능한 캐리어를 더 포함할 수 있다. 약학적 조성물의 첨가제는 명반, 키토산 또는 기술분야에 알려진 다른 보조제의 함유를 포함할 수 있다(예를 들어, 참조로 여기에 구체화된 Warren 등.,Ann.Rev.Immunol.4:369-388(1986);Chedid,L.,Feder.Proc.45:2531-2560(1986)을 보라). 상기 약학적 조성물은 또한 본 기술분야에 알려진 방법 및 조성물을 이용하여, 도출 및 생물활성을 향상시키는 리포솜을 더 포함할 수 있다.
적절한 비경구적 처방은 예를 들어 수용액내의 수용성 소금인 비활성화된 자기반응성 T 세포의 수용액을 포함한다. 또한, 비활성화된 자기반응성 T 세포를포함하는 오일 서스펜션이 처방될 수 있다. 적절한 지방친화성 용제 또는 부형약은 예를 들어 참깨 오일 또는 예를 들어 올레인산 에틸 또는 트리글리세리드인 합성 지방산 에스테르인 지방성 오일을 포함한다. 수성 주사 서스펜션은 예를 들어 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 서스펜션의 점도를 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 상기 서스펜션은 또한 안정제를 포함할 수 있다.
비활성화된 자기반응성 T 세포는 주사로 투여하기 위한 종래의 약학적으로 수용가능한 비경구적 부형약을 이용하여 제조될 수 있다. 이들 부형약은 비독성이고 치료적이며, 많은 조제가 레밍턴 파마서티칼 사이언스(상기함)에서 시작되었다. 부형제의 무제한적인 예는 물, 염수, 링거(Ringer) 용액, 덱스트로스 용액 및 행크(Hank) 등장 염 용액이다. 약학적 조성물은 또한 등장성, 생리학적 pH, 안정성을 유지하는 기질로서 보다 적은 양의 첨가제를 포함할 수 있다.
비활성화된 자기반응성 T 세포는 약 5×102 cells/ml에서 약 1×109 cells/ml를 포함하는 전체 세포농도에서 제조될 수 있다. 자가면역질병의 예방, 억제 또는 치료에 이용하는 비활성화된 자기반응성 T 세포의 바람직한 투여량은 약 2×106 세포에서 약 9×107 세포의 범위이내 일 수 있다.
8. TCR 레퍼토리의 결정
열한 번째 관점에서, 본 발명은 본 발명의 첫 번째 또는 세 번째 관점에 의해 분리된 T 세포로부터 하나 이상의 T 세포 수용체를 암호화하는 핵산을 증폭함으로써 자가면역 환자에서 하나 이상의 T 세포 수용체를 암호화하는 핵산의 레퍼토리 또는 그 일부를 결정하는 방법에 관련되며, 상기 증폭은 프라이머 쌍을 이용하여 수행된다. 프라이머 쌍의 제1프라이머는 TCR 유전자의 가변영역을 포함하는 핵산으로 혼성화하는 약 15~30 길이의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 프라이머 쌍의 제2프라이머는 TCR 유전자의 불변영역을 포함하는 핵산으로 혼성화하는 15~30 길이의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 상기 프라이머 쌍은 TCR 유전자의 Vβ-Dβ-Jβ영역으로 혼성화하는 핵산을 증폭시키기 위해 이용될 수 있다.
T 세포로부터의 하나 이상의 T 세포 수용체를 암호화하는 핵산("목표서열") 또는 그 단편은 기술분야에 알려진 어떤 특정의 중합효소 연쇄반응(PCR:polymerase chain reaction) 기술 또는 기구를 이용하는 PCR에 의해 샘플로부터 증폭될 수 있다. 예를 들어, PCR 증폭은 다음 성분을 포함하는 반응 혼합물이 제조되는 과정 후에 진행된다: 5μL 10xPCR 완충제 Ⅱ(100mM 트리스-HCl, pH 8.3, 500mM KCl), 3μL 25mM MgCl2, 1μL 10mM dNTP 믹스, 0.3μL Taq 중합효소(5U/μL)(AmpliTaq Gold, Perkin Elmer, Norwalk, Conn.), 제1프라이머 30 pmol, 제2프라이머 30 pmol, 및 샘플 DNA 1μL . 중합효소는 적어도 95℃의 온도에서 안정적일 수 있고, 50~60의 진행을 갖으며, 분당 50 뉴클레오티드 이상의 신장률을 갖을 수 있다.
상기 PCR 반응은 총 40 순환 동안 95℃에서 1분(변성), 56℃에서 20분(어닐링), 및 72℃에서 40초(신장)의 증폭 형태로 수행될 수 있다. 첫 순환이 시작하기 전에, 반응 혼합물은 약 5분 에서 15분의 기간동안 초기변성을 수행할 수 있다. 유사하게, 최종 순환이 종료된 후, 반응 혼합물은 약 5분에서 10분의 기간동안 최종 신장을 수행할 수 있다. 특정 PCR 반응은 15에서 20순환보다 적게 또는 50순환보다 많이 작용할 수 있다. 특이적 PCR 반응에 따라서, 증폭 형태의 각 단계동안 더 길거나 또는 더 짧은 배양시간 및 더 높거나 더 낮은 온도가 이용될 수 있다.
목표서열을 포함하는 샘플은 게놈 DNA, cDNA, PCR로 미리 증폭된 DNA, 또는 DNA의 다른 형태와 같은 핵산일 수 있다. 상기 샘플은 말초혈액 단핵세포(PBMC:peripheral blood mononuclear cell)와 같은 T 세포를 포함하는 어떤 동물 또는 인간 조직으로부터 직접 또는 간접적으로 분리될 수 있다. 게놈 DNA는 T 세포를 포함하는 조직으로부터 직접적으로 분리될 수 있다. cDNA는 T 세포를 포함하는 조직으로부터 직접 분리된 mRNA의 역전사에 의해 간접적으로 분리될 수 있다.
목표서열을 검출하는 능력은 두 단계의 PCR 반응에 의해, 게놈 DNA, cDNA, 또는 DNA의 다른 형태의 증폭으로 직접적으로 샘플 DNA를 분리함으로써 향상될 수 있다. 예를 들어, 첫 번째 PCR 증폭반응은 제1 및 제2프라이머가 반대편 가닥에 선택적으로 결합할 수 있는 단편을 포함하며 그 보다 긴 예비적 단편을 증폭하기 위해 수행될 수 있다. 그 다음 두 번째 PCR 증폭반응은 목표서열을 포함하는 단편을 증폭하기 위해 제1 및 제2프라이머와 템플레이트로서의 예비적 단편을 사용하여 수행될 수 있다. 만일 제1 또는 제2프라이머 중 하나가 예비적 단편을 증폭시키기 위해 첫 번째 PCR 반응에서 이용될 경우, 두 번째 PCR 반응은 "반-네스트(semi-nested)"된다. 만일 제1 또는 제2프라이머가 예비적 단편을 증폭하기 위해 첫 번째 PCR 반응에서 이용될 경우, 두 번째 PCR 반응은 "네스트(nested)"된다.
전형적인 두 단계 PCR 반응에서, T 세포로부터 하나 이상의 T 세포 수용체를 암호화하는 하나 이상의 핵산은 TCR 유전자의 Vβ영역으로 복원하는 제1 예비적 프라이머와 TCR 유전자의 Cβ영역으로 복원하는 제2 예비적 프라이머를 이용하는 첫번째 PCR 반응을 수행하여 증폭될 수 있고, 이는 네스트 또는 반-네스트될 수 있는 두 번째 PCR 반응이전에 Vβ부터 Vβ-Dβ-Jβ결합을 통과하여 Cβ까지 신장하는 예비적 단편을 확장한다. 본 발명의 개시의 관점에서, 숙련된 기술자는 목표서열의 PCR 증폭을 위한 적절한 반응 조건과 프라이머를 선택할 수 있을 것이다.
목표 서열의 증폭 후, 증폭된 생산물은 많은 과정에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 증폭 생산물의 일부는 전기영동 겔 위에 위치될 수 있고, 전기적 영역은 크기에 따라 DNA 분자를 분리하는 데에 적용된다. 또 다른 방법에서, 증폭 생산물의 일부는 DNA에 결합하고 검출가능한 신호를 방출하는 SYBR 그린, 브롬화 에티듐 또는 또 다른 분자로 착색된 겔 상에 위치될 수 있다. 건조 겔은 목표 서열로 혼성화하는 표지된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 필름에 겔을 노출함으로써 자동방사선사진을 얻을 수 있다.
다음의 실시예들은 본 발명의 바람직한 구체예를 설명하기 위한 것이다. 다음의 실시예들에 개시된 기법들은 본 발명의 실시에 있어서 잘 기능하도록 하기 위하여 본 발명자에 의하여 발견된 기법을 나타내는 것으로 당업자들에게 평가되어져야 하며, 따라서 그 실시를 위한 바람직한 방법을 구성하는 것으로 고려되어져야 한다. 그러나 당업자는 본 발명의 개시의 관점에서, 공개된 상세한 실시예에서 많은 변화가 가능하며, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서 여전히 동일 또는 유사한 결과를 얻을 수 있음을 인정해야 한다.
실시예 1
T 세포 백신의 위한 미엘린 반응성 T 세포의 분리
1. PBMC의 표본 및 제1차 자극
MS 환자 및 대조군 환자로부터의 신선한 혈액표본은 수집 2시간 안에 처리되었다. 또한, 단핵세포는 MS 환자의 뇌척수액(CSFMC)으로부터 얻어질 수 있다. 말초혈액 단핵세포(PBMC)는 표준 피콜(Ficoll) 구배 분리방법에 의해 전체 혈액으로부터 분리되었다. 구체적으로, 헤파린화된 혈액은 행크 등장염용액(HBSS:Hanks balanced salt solution)(1:1 혈액/HBSS)으로 희석된 다음 원심분리 튜브에 피콜-하이패크 용액을 천천히 넣고, 18℃에서 25℃까지에서 1800 rpm으로 20분간 계속하여 원심분리된다. PBMC는 과잉의 HBSS를 첨가함으로써 세척된 후 18℃에서 25℃까지에서 10분간 1700rpm에서 원심분리된다. 정화된 PBMC는 원심분리에 의해 RPMI 1640 배지에서 세번 세척되고 그 후 AIM V 배지(Gibco, Grand ixland, N.Y.)에 재현탁된다. 세포 수를 계산하고 세포는 200,000 세포/well의 농도에서 96-well U-bottomed 배양 상에 평판배양 되었다. 모든 플레이트는 환자번호와 환자 이니셜로 표지되었다. 상기 세포는 20μg/ml의 농도에서 미엘린 염기
성 단백질(MBP), 프로테올레핀 단백질(PLP) 및 미엘린 핍지신경교 글리코단백질(MOG)인 세개의 미엘린 단백질의 주지된 면역우성영역에 대응하는 표 1에 리스트된 합성 펩티드의 존재하에 37℃에서 배양되었다. 플레이트는 37℃에서 CO2배양기에 놓여지고 시각적으로 매일 조사되었다. 세포는 항원 특이성 T 세포를 선택적으로 성장시키기 위해 배양배지의 교체없이 7~10일 동안 배양된다.
미엘린항원펩티드 | 아미노산 서열 | |
미엘린염기성단백질,펩티드-1(MBP-1) | ENPVVHFFKNIVTPRTP | 서열번호 1 |
미엘린염기성단백질,펩티드-2(MBP-2) | SKIFKLGGRDSRSGSPMARR | 서열번호 2 |
프로테올리핀단백질,펩티드-3(PLP-3) | LFCGCGHEALTGTEKLIETY | 서열번호 3 |
프로테올리핀단백질,펩티드-4(PLP-4) | WTTCQSIAFPSKTSASIGSL | 서열번호 4 |
미엘린핍지신경교글리코단백질,펩티드-6(MOG-6) | GQFRVIGPRHPIRALVG | 서열번호 5 |
미엘린핍지신경교글리코단백질,펩티드-7(MOG-7) | EVELPCRISPGKNATGMEVGW | 서열번호 6 |
2. 항원 특이성 T 세포의 식별 및 선택
다음에 상기의 세포는 활성화된 T 세포를 나타내는 유전자 산물의 발현을 위해 선택된다. 상기한 2(a)를 참고하라. 사이토카인 캐치 시약(Miltenyi Biotec)(상기된 바와 같음)은 상기 세포로부터 최종적으로 분비될 때 세포 내 사이토카인 γIFN 또는 TNFα를 검출하기 위하여 사용된다. 즉, 사이토카인 캐치 시약(활성화된 T 세포 표지 및 분비된 사이토카인 양쪽 모두에 결합하는 전형적인 이중특이성 항체)는 세포 표면 또는 CD69와 같은 다른 활성화된 T 세포 표면 표지에서 CD45 분자에 결합하기 위해 4~8℃에서 세포들과 처음 배양된다. 다음에 세포는 결합된 사이토카인 캐치 시약과 함께, 사이토카인이 배양기간 동안 세포내부에서 분비됨에 따라 세포 내의 γIFN 또는 TNFα가 사이토카인 캐시 시약에 또한 결합되도록 하기 위해 45분동안 37℃에서 배양된다. γIFN 또는 TNFα는 이제 플루오르크롬 PE에 결합된 대상 사이토카인에 특이적인 항체를 사용하여 검출된 사이토카인 캐치 시약에 의해 세포 표면에 결합되었다.
세포 표면 분자 CD4 및 CD69는 다른 플루오르크롬에 결합된 항체를 사용하여 검출된다. CD4+ 세포 집단은 이 집단 내에서 게이팅(gating)에 의해 선택되고, "이중 양성(double-positive)" (CD69 및 IFNγ 또는 CD69 및 TNFα) 염색된 세포는 FACS에 의해 분리되고, 무균적으로 수집된다.
다음에 분리된 미엘린 반응성 T 세포는 7~10일 동안 방사선 조사된 자기조직성 PBMC의 존재하에 rIL-2, PHA, 항-CD3 또는 다른 일반적인 T 세포 유사분열물질로 자극됨으로써 직접 신장된다.
실시예 2
MS의 진단
혈액 2~100 ml가 환자로부터 수집되고 하나 이상의 합성 펩티드가 T 림프구를 준비하고 자극하기 위해 모든 혈액에 직접 첨가된다. 상기 펩티드는 미엘린 염기성 단백질(MBP), 프로테올리핀 단백질(PLP), 및 미엘린 핍지신경교 글리코단백질(MOG)인 세개의 미엘린 단백질의 주지된 면역우성영역에 대응한다. 상기 혈액은 미엘린 특이성 T 세포를 활성화하기 위해 1~7일간 상기 펩티드와 함께 배양된다. 이 항원 개시기간의 말기에, 세포는 단기 재자극 분석에서 항원으로 재조사된다.
미엘린 펩티드 활성화된 T 세포는 세정용액으로 세포막을 침투화하고, 세포를 세척한 다음, 세포표면의 CD4 또는 CD69 또는 세포 내 IFNγ 또는 TNFα를 검출하기 위해 하나이상의 염색 항체와 함께 배양함으로써 검출된다. 염색 항체는 다른 플루오르크롬에 결합하므로 FASC 분석에 의해 488 나노미터 레이저로 자극될 때 다른 파장에서 형광을 발한다. CD4+ T 세포 집단은 우선 게이팅을 위한 CD4+세포를 이용함으로써 선택된 다음, 이 집단 내에서 양쪽의 항체(CD69 및 γIFN 또는 CD69 및 TNFα)와 면역반응성인 세포가 식별된다. "이중 양성(double-positive)" 미엘린 반응성 T 세포의 집단은 유사한 연구에서 건강한 대조군과 비교하여 다발성 경화증(MS:multiple sclerosis) 환자에게서 상당한 증가를 보였다(도 1, MS 환자, 도 2, 건강한 대조군). 이 방법을 이용하여, 환자의 혈액 내에서 순환하는 미엘린 반응성 T 세포의 수가 자기반응성 T 세포 집단에 대한 MS 치료의 효과를 측정하기 위해 치료 전, 치료 중 및 치료후에 측정될 수 있다. 종료점은 이중 양성 착색된 세포의 백분율이나 이중 양성 착색된 세포의 절대값 중의 하나로서 측정될 수 있다.
실시예 3
항체결합 리포솜을 이용하는 MS의 진단
모든 혈액은 환자로부터 얻어지고 실시예 2에서 기술된 하나이상의 합성 펩티드로 자극된다. 상기 혈액은 미엘린 특이성 T 세포를 활성화하기 위해 3~6시간 동안 펩티드와 함께 배양된다. 초회항원 자극 기간이 종료될 때, 상기 세포는 IFNγ, TNFα또는 그 조합에 대한 항체에 결합된 자기형광 리포솜으로 착색하기 전에 단기 재자극분석에서 항원으로 재자극될 수 있다. 상기 세포는 또한 CD4 및/또는 CD69에 대한 항체로 착색된다. 착색된 미엘린 반응성 T 세포는 실시예 2에서 기술된 바와 같이 검출된다.
실시예 4
TCR 클론의 레퍼토리의 측정
세포집단에서 나타난 T 세포 수용체(TCR) 클론의 레퍼토리는 실시예 2 및 실시예 3에서 기술된 바와 같이 세포 분류에 의한 이중 양성 염색된 세포집단을 분리함으로써 분석될 수 있다. DNA는 분리된 세포로부터 추출되고, 공지된 TCR 가변 베타 사슬(Vβ) 유전자단에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하는 정량적 중합효소 연쇄반응(PCR:polymerase chain reaction)을 수행하는 데에 이용된다. 이 과정은 TCR Vβ유전자 이용의 기여도에 대한 정보를 산출하고, 병원성의 T 세포 집단의 클론성을 나타낸다. 이 방법은 또한 미엘린 반응성 T 세포집단의 클론 변화 또는 에피토프 변화가 MS 환자에게서 발생하는지를 결정하기 위해서도 이용된다.
실시예 5
T 세포백신에 의한 미엘린 반응성 T 세포의 감소
재발-소실(RR:relapsing-remitting) MS 환자 및 2차 진행성(SP:secondary-progressive) MS 환자는 직접적 신장에 의해 분리된 방사선 조사된 자기조직의 미엘린 반응성 T 세포 클론을 세번 피하로 주사받고, 그로부터 4, 12 및 20 주 이후에 세번의 추가주사를 받았다. 환자들은 24 개월의 기간동안 미엘린 반응성 T 세포의 선구 빈도, 재발율, 확대된 장애 상태 점수(EDSS:expanded disability status score) 및 MRI 병변 활성도의 변화에 대해 관찰되었다. 그 결과는 자기쌍(self-paired) 방식으로 예비 백신접종 값과 비교되었다. 또한, 베타-인터페론-1a 치료 시도에서의 RR-MS 와 최근의 베타-IFN-1b 연구에서의 SP-MS의 위약 처방의 치료 데이터는 비교를 위한 MS의 고유 병력 데이터를 제공하기 위해 포함되었다. 상기 T 세포 빈도는 20중에서의 백신접종 후 현저히 감소하거나 검출되지 않았다. 상기 결과는 MS 환자에서 T 세포 백신접종에 의해 미엘린 반응성 T 세포의 감소를 확인시켜준다.
실시예 6
자기조직 미엘린 반응성 T 세포를 사용하는 MS 환자의 백신접종
상기 백신접종 실험은 종래의 임상적 연구에서 사용된 것과 유사하다(Zhang 등.,1993,Medaer 등.,1995). 즉, 실시예 1에 따라 준비된 미엘린 반응성 T 세포 클론은 부세포의 근원으로서의 자극된 PBMC의 존재하에 식물성혈구응집소(PHA:phytohemagglutinin)(4 μg/ml)로 활성화되었다. 다음에 세포들은 10% 열-비활성화된 인간 AB 혈청과 1 mL 당 100개의 rIL-2 로 보충된 RPMI 1640 배지에서 10일 동안 배양된다. 그 후 활성화된 미엘린 반응성 T 세포는 잔여 PHA, rIL-2 및 세포 조각을 제거하기 위해 무균의 염수로 세번 세척되고, 염수 2ml에서 최종적으로 재현탁된다. 방사선 조사 후(10,000 rads, 137Ce 선원), 세포들은 양 팔에 피하 주사된다(1 ml/팔). T 세포의 수는 주사 당 40×106부터 80×106 세포까지 백신접종 범위에 사용하고, 상관된 피부 표면영역을 기초로 하여 실험용 동물에 효과적인 T 세포 복용량으로 외삽하여 선택된다(Ben-Nun 등.,1981). 두번의 피하주사를 받은 각 환자는 그 후 4, 12 및 20주에 반복 주사된다.
환자들은 그 다음 장애의 확인된 진행의 시작, EDSS, 재발율 및 MRI 병변 활동성을 기간동안 감시받는다. 상기 결과는 RR-MS 및 SP-MS 환자에서 두개의 최근의 임상적 시도의 위약 뿐만 아니라 환자 자신의 예비 치료 과정과 비교되며, MS의 고유병력의 평가로서 사용된다(Jacobs 등.,1996, European Study Group,1998). 진행시간은 적어도 2달 동안 존속하는 EDSS 상에 적어도 1.0의 증가에 의해 결정된다(Poser 등.,1983). 연구 중의 악화는 새로운 신경학상의 징후의 출연 또는 적어도 48시간 동안 지속되는 선재한 신경학상의 징후의 악화에 의해 규명되며, 신경학적 실험에서의 객관적 변화가 수반된다(EDSS상에서 적어도 0.5포인트의 악화). 환자들은 계획된 정기 방문 사이의 경과를 보고하도록 지시받고, 징후가 악화되었는지가 신경학자에 의해 진찰된다. 안전 평가는 불리한 경과, 치명적 신호 및 정기방문시의 생리적 검진을 포함하였다. T 세포 백신 접종의 전후에 연구 환자에서 임상적 가변의 차이는 윌콕슨 랭크섬 테스트(Wilcoxon's rank-sum test)를 사용하여 분석된다.
실시예 7
백신접종 후 MS의 임상 과정의 변경
환자들은 부작용을 갖지 않는 실시예 1에 따라 준비된 T 세포 백신접종을 받는다. 평균 EDSS는 백신접종 후 24개월의 기간동안 RR-MS 환자에게서 감소된다. 비교하면, 베타-IFN-1a 시험을 이용하여 처리된 시험에서 보고된 바와 같이, 동일한 관찰기간 동안 RR-MS(n=56)의 고유 병력에서는 0.61까지 평균 EDSS가 증가한다(Jacobs 등.,1996). 또한, 불변 또는 향상된 EDSS 중의 하나를 갖는 환자의 분율은 고유의 MS 병력의 그것보다 높았다. 처리된 RR-MS 그룹 내의 극히 일부의 환자들은 MS의 고유병력에서 환자의 18%에 비하여 24 개월이내에 2.0 EDSS가 넘게 진행한다.
SP-MS 코호트에서, 평균 EDSS는 SP-MS 고유병력에서 기록된 +0.6에 비하여 24개월 동안 느리게 진행한다(European Study Group,Lancet 1998;352:1491-1497). 뿐만 아니라, 카플랜-미어(Kaplan-Meier) 방법을 이용하는 확인된 진행에 대한 시간의 측정은 MS 환자의 고유병력과 비교하여 상당한 지연을 나타낸다(RR-MS에 있어서 12개월에, SP-MS에 있어서 9개월에 20% 진행)(Jacobs 등.,Ann.Neurol,1996;39:285-294, European Study Group,1998).
본 발명은 일반적으로 항원 특이성 T 세포를 분리하는 방법에 관련되고, 특히 자기자신 또는 자기항원에 특이적인 T 세포에 관련된다. 관심 항원에 특이적인 하나이상의 T 세포를 분리하는 방법은 상기 항원으로 환자로부터 얻어진 T 세포를 포함하는 샘플을 배양하고; CD69, CD4, CD25, CD36 및 HLADR로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제1표지; 및 IL-2, IFNg, TNFα, IL5, IL-10 및 IL-13으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제2표지를 발현하는 하나 이상의 T 세포를 선택하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법은 자가면역 질병의 발병에 역할을 담당하는 자기반응성 T 세포의 분리에 특히 유용하다.
본 발명의 방법은 또한 질병의 진행을 감시하고 질병의 치료효과를 감시하는 것 뿐만 아니라 자가면역 질병의 진단도 가능하게 한다.
본 발명의 방법은 또한 T 세포 관련 자가면역 질병의 치료를 위한 자기조직의 T 세포백신의 제조도 가능하게 한다.
백신제조 방법은 일반적으로 분리된 항원특이성 T 세포 집단을 확장하게 하는 배양단계가 이후에 선택적으로 진행되는 상기의 항원특이성 T 세포의 분리와 관련된다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법을 이용하여 분리된 항원특이성 T 세포를 포함하는 약학적 조성물 및 T 세포 백신과 관련된다.
본 발명의 방법은 또한 T 세포 수용체 및 그들의 암호화 핵산을 특징지우는데에 유용하다.
SEQUENCE LISTING
<110> Baylor College of Medicine
Opexa Pharmaceuticals Inc.
Zhang, Jingwu Z
<120> Isolation and Identification of T Cells
<130> 213838-00068
<150> US 60/402,521
<151> 2002-08-08
<160> 6
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(17)
<223> amino acids 110 to 126 of human myelin basic protein
<400> 1
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<223> amino acids 167 to 186 of human mylelin basic protein
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Met Ala Arg Arg
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<213> Artificial
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<223> amino acids 31 to 50 of human myelin proteolipid protein
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<223> amino acids 181 to 200 of human myelin proteolipid protein
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Ile Gly Ser Leu
20
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<223> amino acids 1 to 17 of human myelin oligodendrocyte glycoprotein
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Gly
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<223> amino acids 18 to 38 of human myelin oligodendrocyte glycoprotein
<400> 6
Glu Val Glu Leu Pro Cys Arg Ile Ser Pro Gly Lys Asn Ala Thr Gly
1 5 10 15
Met Glu Val Gly Trp
20
Claims (30)
- (a) T 세포를 포함하는 샘플을 상기 항원 또는 그 유도체와 함께 배양하는 단계;(b) CD69, CD4, CD25, CD36 및 HLADR로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제1표지와 IL-2 IFNγ와 TNFαIL5 IL-10 및 IL-13로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제2표지를 발현하는 하나 이상의 T 세포를 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 대상 항원에 특이적인 하나 이상의 T 세포의 분리 방법.
- 제1항에 있어서,상기 항원은 자기항원인 것을 특징으로 하는 대상 항원에 특이적인 하나 이상의 T 세포의 분리 방법.
- 제2항에 있어서,상기 자기항원은 미엘린 염기성 단백질(myelin basic protein), 프로테올리핀 단백질(proteolipid protein), 미엘린 핍지신경교 글리코단백질(myelin oligodendrocyte glycoprotein), 콜라겐 타입Ⅱ 펩티드, 열 충격(heat shock) 단백질, MAGE, PSA, CA125, GAD 단백질 및 항원관련 종양으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 대상 항원에 특이적인 하나 이상의 T 세포의 분리 방법.
- 제1항에 있어서,상기 항원은 자기 항원의 면역우성 에피토프인 것을 특징으로 하는 대상 항원에 특이적인 하나 이상의 T 세포의 분리 방법.
- 제4항에 있어서,상기 면역우성 에피토프는 미엘린 염기성 단백질의 83-99 잔기 및 미엘린 염기성 단백질의 151-170 잔기로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 대상 항원에 특이적인 하나 이상의 T 세포의 분리 방법.
- 제1항에 있어서,상기 제1 및 제2표지를 발현하는 세포는 각각 상기 제1 및 제2표지에 대한 항체를 사용하거나, 상기 제2 표지에 결합하는 항체와 공동으로 제1 및 제2표지 양쪽에 결합하는 이중특이성 항체를 선택적으로 사용하여 선택되는 것을 특징으로 하는 대상 항원에 특이적인 하나 이상의 T 세포를 분리하는 방법.
- 제6항에 있어서,하나 이상의 상기 항체는 형광으로 표지되는 것을 특징으로 하는 대상 항원에 특이적인 하나 이상의 T 세포의 분리 방법.
- 제7항에 있어서,상기 T 세포는 형광 활성화된 세포분류에 의해 선택되는 것을 특징으로 하는 대상 항원에 특이적인 하나 이상의 T 세포의 분리 방법.
- 제6항에 있어서,상기 제1항체는 자성 마이크로비드에 접합하는 것을 특징으로 하는 대상 항원에 특이적인 하나 이상의 T 세포의 분리 방법.
- 제9항에 있어서,상기 T 세포는 자성 활성화된 세포분류로 선택되는 것을 특징으로 하는 대상 항원에 특이적인 하나 이상의 T 세포의 분리 방법.
- 제1항에 있어서,상기 항원은 1~7일 동안 상기 샘플과 함께 배양되는 것을 특징으로 하는 대상 항원에 특이적인 하나 이상의 T 세포의 분리 방법.
- 제1항에 있어서,상기 항원은 1일 이내 동안 상기 샘플과 함께 배양되는 것을 특징으로 하는 대상 항원에 특이적인 하나 이상의 T 세포의 분리 방법.
- 제12항에 있어서,상기 항원은 16시간 이내 동안 상기 샘플과 함께 배양되는 것을 특징으로 하는 대상 항원에 특이적인 하나 이상의 T 세포의 분리 방법.
- 제13항에 있어서,상기 항원은 12시간 이내 동안 상기 샘플과 함께 배양되는 것을 특징으로 하는 대상 항원에 특이적인 하나 이상의 T 세포의 분리 방법.
- 제14항에 있어서,상기 항원은 8시간 이내 동안 상기 샘플과 함께 배양되는 것을 특징으로 하는 대상 항원에 특이적인 하나 이상의 T 세포의 분리 방법.
- 제15항에 있어서,상기 항원은 4시간 이내 동안 상기 샘플과 함께 배양되는 것을 특징으로 하는 대상 항원에 특이적인 하나 이상의 T 세포의 분리 방법.
- 제16항에 있어서,상기 항원은 2시간 이내 동안 상기 샘플과 함께 배양되는 것을 특징으로 하는 대상 항원에 특이적인 하나 이상의 T 세포의 분리 방법.
- 제1항의 방법에 의하여 분리된 T 세포.
- 제1항에 있어서,상기 분리된 T 세포는 TH1 또는 TH2 T 세포 또는 그 조합인 것을 특징으로 하는 대상 항원에 특이적인 하나 이상의 T 세포의 분리 방법.
- (a) T 세포를 포함하는 샘플을 상기 항원 또는 그 유도체와 함께 배양하는 단계;(b) CD69, CD4, CD25, CD36 및 HLADR로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제1표지와 IL-2 IFNγ및 TNFαIL5 IL-10 및 IL-13으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제2표지를 발현하는 하나 이상의 T 세포를 선택하는 단계; 및(c) 단계(b)에 의해 선택된 T 세포의 수를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 T 세포는 하나 이상의 대상 항원에 특이적인 것을 특징으로 하는 샘플 내의 T 세포 수 측정 방법.
- (a) T 세포를 포함하는 자가면역질병 환자로부터 유래된 샘플을 상기 질병과 관련된 하나 이상의 자기항원과 함께 배양하는 단계;(b) CD69, CD4, CD25, CD36 및 HLADR로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제1표지와 IL-2 IFNγ및 TNFαIL5 IL-10 및 IL-13으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제2표지를 발현하는 하나 이상의 T 세포를 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가면역질병 환자의 진단 방법.
- (a) T 세포를 포함하는 자가면역질병 환자로부터 유래된 샘플을 하나 이상의 자기항원과 배양하는 단계;(b) CD69, CD4, CD25, CD36 및 HLADR로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제1표지와 IL-2 IFNγ및 TNFαIL5 IL-10 및 IL-13으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제2표지를 발현하는 하나 이상의 T 세포를 선택하는 단계; 및(c) 단계(a)에 의해 선택된 자기반응성 T 세포의 수를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 환자 내 자기면역질병의 감시 방법.
- (a) T 세포를 포함하는 자가면역질병 환자로부터 유래된 샘플을 하나 이상의 자기항원과 배양하는 단계;(b) CD69, CD4, CD25, CD36 및 HLADR로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제1표지와 IL-2 IFNγ및 TNFαIL5 IL-10 및 IL-13으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제2표지를 발현하는 하나 이상의 T 세포를 선택하는 단계;(c) 상기 선택된 자기반응성 T 세포를 비활성화하는 단계; 및(d) 단계(b)에 의해 비활성화된 상기 자기반응성 T 세포를 상기 환자에게 투약하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 환자 내 자가면역질병의 치료 방법.
- (a) T 세포를 포함하는 자가면역질병 환자로부터 유래된 샘플을 하나 이상의 자기항원과 배양하는 단계;(b) CD69, CD4, CD25, CD36 및 HLADR로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제1표지와 IL-2 IFNγ및 TNFαIL5 IL-10 및 IL-13으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제2표지를 발현하는 하나 이상의 T 세포를 선택하는 단계; 및(c) 상기 자기반응성 T 세포를 비활성화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 환자 내 자가면역질병의 치료를 위한 조성물의 제조 방법.
- 제23항 또는 제24항에 있어서,단계(b)에서 선택된 자기반응성 T 세포 수를 확대하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 환자 내 자가면역질병의 치료 방법 및 치료를 위한 조성물의 제조 방법.
- 제24항 또는 제25항의 방법에 의해 제조된 자가면역질병 환자의 치료를 위한 조성물.
- (a) T 세포를 포함하는 샘플을 하나이상의 대상 항원과 배양하는 단계;(b) CD69, CD4, CD25, CD36 및 HLADR로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제1표지와 IL-2 IFNγ및 TNFαIL5 IL-10 및 IL-13으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제2표지를 발현하는 하나 이상의 T 세포를 선택하는 단계; 및(c) T 세포 수용체 유전자의 가변영역에 특이적인 적어도 하나의 제1프라이머와 T 세포 수용체 유전자의 불변영역에 특이적인 제2프라이머를 이용하는 단계(b)에 의해 분리된 T 세포로부터 T 세포 수용체를 암호화하는 핵산을 증폭하는 단계를 포함하며, 상기 T 세포 수용체는 대상 항원에 특이적인 것을 특징으로 하는 T 세포 수용체를 암호화하는 핵산 또는 그 일부분의 분리 방법.
- (a) T 세포를 포함하는 샘플을 하나 이상의 항원과 함께 배양하는 단계;(b) CD69, CD4, CD25, CD36 및 HLADR로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제1표지와 IL-2 IFNγ및 TNFαIL5 IL-10 및 IL-13으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제2표지를 발현하는 하나 이상의 T 세포를 선택하는 단계; 및(c) T 세포 수용체 유전자의 가변영역에 특이적인 적어도 하나의 제1프라이머와 T 세포 수용체 유전자의 불변영역에 특이적인 제2프라이머를 이용하는 단계(b)에 의해 분리된 T 세포로부터 하나 이상의 T 세포 수용체를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 증폭하는 단계를 포함하며, 상기 하나 이상의 T 세포 수용체는 하나 이상의 대상 항원에 특이적인 것을 특징으로 하는 하나 이상의 T 세포 수용체를 암호화하는 하나 이상의 핵산의 분리 방법.
- (a) T 세포를 포함하는 환자로부터 유래된 샘플을 하나 이상의 항원과 함께 배양하는 단계;(b) CD69, CD4, CD25, CD36 및 HLADR로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제1표지와 IL-2 IFNγ및 TNFαIL5 IL-10 및 IL-13으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제2표지를 발현하는 하나 이상의 T 세포를 선택하는 단계;(c) T 세포 수용체 유전자의 가변영역에 특이적인 적어도 하나의 제1프라이머와 T 세포 수용체 유전자의 불변영역에 특이적인 제2프라이머를 이용하는 단계(b)에 의해 분리된 T 세포로부터 하나 이상의 T 세포 수용체를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 증폭하는 단계; 및(d) 단계(c)에 의해 증폭된 상기 하나 이상의 핵산의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 하나 이상의 T 세포 수용체는 하나 이상의 대상 항원에 특이적인 것을 특징으로 하는 하나 이상의 T 세포 수용체를 암호화 하는 핵산 또는 그 일부분의 레퍼토리 결정 방법.
- (a) T 세포를 포함하는 자가면역 환자로부터 유래된 샘플을 하나 이상의 자기항원과 함께 배양하는 단계;(b) CD69, CD4, CD25, CD36 및 HLADR로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제1표지와 IL-2 IFNγ및 TNFαIL5 IL-10 및 IL-13으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제2표지를 발현하는 하나 이상의 T 세포를 선택하는 단계;(c) T 세포 수용체 유전자의 가변영역에 특이적인 적어도 하나의 제1프라이머와 T 세포 수용체 유전자의 불변영역에 특이적인 제2프라이머를 이용하는 단계(b)에 의해 분리된 T 세포로부터 하나 이상의 T 세포 수용체를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 증폭하는 단계; 및(d) 단계(c)에 의해 증폭된 상기 하나 이상의 핵산의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 하나 이상의 T 세포 수용체는 하나 이상의 대상 자기항원에 특이적인 것을 특징으로 하는 자가면역 환자 내에서 하나이상의 T 세포 수용체를 암호화하는 핵산 또는 그 일부분의 레퍼토리 결정 방법.
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