FR2992427A1 - Methode de pronostic d'un lymphome et kit pour sa mise en oeuvre - Google Patents

Abstract

L'invention se rapporte à une méthode de diagnostic et pronostic d'évolution d'un lymphome notamment intraoculaire comprenant la mesure du CD25 soluble, ainsi qu'à un kit conçu pour la mise en oeuvre de cette méthode.

Description

L'invention se rapporte à un nouveau kit de dosage du CD25 soluble, utilisable dans une méthode de diagnostic et pronostic d'évolution d'un lymphome 5 notamment intraoculaire. Le terme de lymphome intraoculaire regroupe un ensemble hétérogène de pathologies tumorales affectant l'oail et se manifestant dans la plupart des cas par une uvéite postérieure résistante à un traitement par corticostéroïde. Dans tous les 10 cas, il s'agit d'une prolifération lymphoïde monoclonale avec un envahissement d'une structure ciblée de l'oail et selon le point de départ de la lymphoprolifération, on distingue les lymphomes intraoculaires primitifs ou secondaires. Les lymphomes intraoculaires (L10) primitifs (ou PIOL pour Primary Infra Ocular Lymphoma) font partie des lymphomes primaires du système nerveux 15 central (PCNSL). L'atteinte oculaire se présente avec ou sans atteinte cérébrale concomitante et les cellules lymphomateuses envahissent préférentiellement la rétine ou le corps vitré. Dans la majorité des cas, il s'agit de lymphomes non Hodgkiniens, diffus à grandes cellules B, de haut grade de malignité. Le PIOL est un lymphome rare associant des formes oculaires et 20 cérébrales, de diagnostic difficile et mettant en jeu le pronostic vital du patient. Dans approximativement 80% des cas, il s'agit d'une atteinte oculaire bilatérale chronique avec une infiltration sous-rétinienne ou vitréenne, mais des présentations initiales unilatérales sont possibles. Une complication par un lymphome cérébral est retrouvée dans environ 80% des cas en l'absence de 25 traitement, et lorsque l'envahissement est bifocal (oeil et cerveau), on retient le terme de lymphome oculo-cérébral (LOC) (Peterson et al, Cancer. 1993 Aug 1;72(3):843-9). Es symptômes cliniques du PIOL ne sont pas spécifique, et peuvent orienter à tort le clinicien vers une uvéite postérieure chronique. Le diagnostic est 30 donc difficile, souvent tardif, et requiert un haut degré de suspicion clinique de la part du clinicien qui devra être alerté en cas d'uvéite résistante à un traitement par corticoïdes. Idéalement, le traitement des lymphomes oculaires devrait avoir deux objectifs : éradiquer la tumeur intra-oculaire et prévenir les rechutes et les 35 complications cérébrales. Aucune prise en charge thérapeutique optimale n'a été identifiée pour le moment, les traitements étant la radiothérapie (irradiation oculaire, la tumeur étant sensible au traitement, mais ne guérissant pas : les rechutes sont fréquentes et un envahissement cérébral ultérieur reste possible) ou la chimiothérapie (la principale difficulté résidant dans le défaut de pénétration des molécules anti-cancéreuses à travers la barrière hémato-oculaire), en particulier la chimiothérapie locale (administration intra-vitréenne de méthotrexate). qui permet une rémission à long terme et peut être répétée de nombreuses fois. Ainsi que vu plus haut, en raison de l'absence de signes cliniques spécifiques, le diagnostic de lymphome oculaire n'est pas aisé. L'examen ophtalmologique permettra de mettre en évidence des anomalies au niveau du segment antérieur ou postérieur de l'oail. Ces anomalies seront explorées par une ponction de chambre antérieure (PCA) et le diagnostic sera confirmé par la vitrectomie. La ponction de chambre antérieure est peu invasive et réalisée en première intention lorsqu'on suspecte un PIOL. Le rendement est faible, le volume du prélèvement étant d'environ 100p1. Elle est surtout réalisée dans le cadre des suivis des PIOL traités et pour la détection des rechutes car le prélèvement peut être réalisé à intervalle de temps court. La vitrectomie est un acte chirurgical effectué sous anesthésie, et destiné à retirer partiellement ou totalement le corps vitré dans un but diagnostique. En pratique, elle est réalisée lorsque les résultats de l'examen de la PCA évoquent un PIOL et doit être faite à distance d'une corticothérapie afin d'éviter un résultat faussement négatif par lyse des cellules tumorales. Le vitré est fragmenté grâce à un vitréotome mis en place à l'intérieur de l'oeil, et l'aspiration est compensée par un apport liquidien (solution saline hypertonique, de type Borate Buffer Saline) pour éviter le risque d'hypotonie oculaire. La première aspiration est considérée comme du vitré « pur » qui doit être privilégiée pour le dosage de cytokine à visée diagnostique. Les aspirations suivantes rapportent du vitré « dilué », qui pourra être utilisé pour l'examen cytologique. La biopsie rétinienne est réalisée lorsque la vitrectomie n'est pas contributive. Les échantillons ainsi prélevés sont alors examinés, notamment par 35 analyse cytologique (effectuée sur le vitré, compte tenu du faible volume des PCA), ce qui permet de poser un diagnostic définitif de PIOL et de débuter rapidement un traitement. On peut aussi mettre en évidence le caractère monoclonal T ou B des cellules tumorales par analyse moléculaire (réaction de polymérisation en chaîne, PCR) permettant d'identifier des réarrangements dans la majorité des cas de lymphomes intraoculaires (translocation entre les chromosomes 14 et 18 ou [t(14;18)], impliquant les gènes IGH et BOL-2, rapporté dans plus de 67% des cas). Les dosages de l'interleukine-10 (1L-10) et de l'interleukine-6 (1L-6) dans les prélèvements de vitrés et d'humeurs aqueuses font désormais partie des examens systématiquement réalisés et fournissent un argument quasi indispensable pour poser un diagnostic lorsque le lymphome intra-oculaire est suspecté. En effet, les lymphocytes B tumoraux sécrètent des taux relativement élevés d'IL-10 alors que les cellules inflammatoires réactionnelles produisent de l'IL-6. Le dosage de ces deux cytokines et la détermination de leur ratio donnent donc une bonne idée de la composante tumorale et inflammatoire impliquées dans le processus pathologique (Merle-Béral et al., Br. J. Haematol. 2004 Feb;124(4):469-73). L'IL-10 agit comme un facteur de la croissance tumorale en favorisant la prolifération des lymphomes à cellules B (Beatty et al., J. lmmunol. 1997 May 20 1;158(9):4045-51), et est produite par les cellules lymphomateuses à des taux très élevés. Les taux intra-oculaires d'IL-6 sont élevés dans les uvéites et peuvent être très importants dans les infections oculaires évolutives (choriorétinite toxoplasmique, nécrose rétinienne aigüe liée au virus de la varicelle et du zona) 25 (Ongkosuwito et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1998 Dec;39(13):2659-65). L'IL6 est un médiateur important de l'inflammation intraoculaire (Hoekzema et al., Curr. Eye Res. 1990;9 Supp1:207-11) à cause de son rôle actif dans l'amplification du recrutement leucocytaire, et son dosage dans les liquides oculaires permet de faire le diagnostic différentiel entre une panuvéite d'origine infectieuse, inflammatoire ou 30 auto-immune et une pseudo-uvéite due à un PIOL (Cassoux et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2007 Jul;48(7):3253-9). Dans la plupart des études publiées, le dosage de l'IL-10 et de l'IL-6 repose sur un test de type ELISA « sandwich ». Plusieurs kits prêts à l'emploi sont 35 commercialisés. Les dosages peuvent être effectués sur l'humeur aqueuse ou sur le vitré.

Le seuil d'IL-10 dans l'humeur aqueuse pour lequel la probabilité de PIOL est probable est de 50 ng/mL, avec une sensibilité de 89% et une spécificité de 93% (dosage par test ELISA, kit Quantikine®, R&D System). Pour les prélèvements vitréens, le cutoff est de 400 pg/mL avec une sensibilité de 80% et une spécificité de 99% (Cassoux et al, op. cit.). D'autre part, la dilution des prélèvements de l'humeur vitrée qui a lieu pendant la vitrectomie est un paramètre à prendre en compte pour l'interprétation des résultats. La détermination du ratio entre l'IL-10 et l'IL-6 permet de s'affranchir de l'effet de la dilution, chaque cytokine étant diluée dans les mêmes proportions. Un rapport IL-10/IL-6 supérieur à 1 suggère un processus lymphomateux (VVhitcup et al., Arch. Ophthalmol. 1997 Sep;115(9):1157-60). Ainsi, d'après une étude portant sur 35 cas de PIOL et 64 uvéites, la valeur du ratio supérieure à 1 a permis de confirmer le diagnostic de PIOL dans 74% des cas, avec une sensibilité de 74,3% et une spécificité de 74,7%. L'inconvénient principal de cette technique est le volume important d'échantillon nécessaire pour chaque test. Plus récemment, la détection de ces cytokines a été mise en place grâce à une technique de cytométrie en flux, appelée Cytometric Bead ArrayTM (CBATM commercialisée par la société BD Biosciences). Cette technique apporte un réel progrès dans le diagnostic des PIOL, car elle offre la possibilité de détecter et de quantifier simultanément plusieurs cytokines dans un prélèvement unique et de faible volume, contrairement à la technique ELISA utilisée habituellement, consommatrice de prélèvement. Il s'agit d'une détection de type « sandwich », mettant en oeuvre des microbilles de polystyrène fluorescentes recouvertes d'un anticorps anti-cytokine (anticorps primaire), servant de réactif de capture, et d'un anticorps spécifique de détection (anticorps secondaire) couplé à un fluorochrome, la phycoérythrine (PE), pour révéler le complexe. Les billes sont homogènes en taille et en structure mais possèdent une intensité de fluorescence spécifique, définie par le fabriquant, aisément repérable au cytomètre par un nuage de point bien individualisé sur un dot plot représentant la fluorescence en APC (Allophycocyanine) / APCCy7 (Allophycocyanine liée au à la cyanin-7 (Cy7), émettant par FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer). Pour l'APCCy7, l'APC est excitée à 633nm. Elle émet, seule à 665nm, et fonctionne comme un donneur d'énergie pour la Cy7 lorsqu'elle lui est liée. La Cy7 émet à une longueur d'onde de 767nm. Ainsi, en fonction de la quantité de fluorescence dans les billes et du ratio APC / APCCy7, chaque nuage de point correspondant à un type de bille est associé à une position alphanumérique.

Chaque type de bille est couplé à un anticorps primaire spécifique d'une cytokine, de telle sorte qu'a chaque position donnée corresponde une cytokine. Par exemple, dans le kit Human IL-10 Flex Set de BD Bioscience, les billes couplées à des anticorps primaires permettant de capturer de l'IL-10 sont positionnées en B7.

Après liaison entre la bille et la cytokine, le complexe est révélé par l'anticorps secondaire couplé à la PE, dont l'intensité de fluorescence permet la quantification de la cytokine d'intérêt. Cette quantification nécessite la réalisation en parallèle d'une gamme étalon établie avec une cytokine recombinante. Ainsi, l'ajout dans un prélèvement de plusieurs billes de spécificités 15 différentes permettra de doser simultanément plusieurs cytokines en une seule réaction à partir d'un volume de prélèvement très faible Actuellement, il n'existe pas d'éléments clinico-biologiques auxquels on puisse accorder une valeur pronostique. Un tel outil pourrait s'avérer utile au 20 clinicien, notamment pour anticiper la prise en charge thérapeutique des patients dont le pronostic serait d'emblée mauvais. La Demanderesse a ainsi évalué la valeur pronostique de plusieurs facteurs solubles intraoculaires. Le dosage de ces biomarqueurs a été combiné à ceux de l'IL-10 et de l'IL-6 grâce à la même technique d'analyse en cytométrie en 25 flux (CBATm), de manière à pouvoir doser simultanément tous ces analytes sur un volume de prélèvement constant et faible quel que soit le nombre d'analytes à doser, soit un volume de 50p1. Quatre cytokines ont été retenues : le CD25s (ou récepteur soluble de l'IL-2), MI P-la (Macrophage Inflammatory Protein 1 alpha), et RANTES (Regulated upon Activation, Normal T cell Expressed and Secreted, ainsi 30 que l'IFN-y. Chacune de ces cytokines semble pouvoir présenter un intérêt pour la diangostic et/ou le pronostic, ce qui est démontré pour la première fois, mais la cytokine CD25s est la plus intéressante. Le récepteur de l'interleukine-2 (1L-2) existe sous deux formes : une forme 35 membranaire, située sur les lymphocytes activés T, B et NK (Natural Killer), et une forme libre, détectable dans le sérum.

La forme membranaire est un hétérotrimère constitué de trois sous-untités protéiques : une sous-unité IL-2Ra (encore appelée Ag Tac ou CD25 ou p55), une sous-unité IL-2R[3 (p75) et une sous-unité IL-2Ry (p64). La chaine a est une glycoprotéine de 55 kDa constituée de 251 acides aminés dont 219 sont extra 5 cellulaires, et constitue le site de reconnaissance spécifique de l'IL-2. Cette chaîne a est issue d'une phase ouverte de lecture menant à la production d'une protéine de 272 acides aminés (SEQ ID N° 1), dont le peptide signal de 21 acides aminés est clivé (Kuziel et Greene, J Invest Dermatol. 1990 Jun;94(6 Suppl):27S-32S). La forme libre du récepteur n'est constituée que de la chaine a. Cette partie 10 soluble, appelée II-2Ras ou CD25s, est une protéine de 45kDa, détectable dans les liquides biologiques et capable se lier spécifiquement à l'IL-2. Cette protéine présente trois régions épitopiques A, B et C. La Demanderesse a montré que la quantité de CD25s dans un prélèvement 15 oculaire d'un patient était un facteur permettant d'anticiper la probabilité d'une évolution clinique de la maladie, et pouvant également être utilisé pour affiner le diagnostic dans certains cas. Par ailleurs, la Demanderesse a également montré que certains autres facteurs (IFNy, MIP-1 a, RANTES) peuvent également être utilisés dans une optique diagnostique et pronostic des PIOL. 20 À la vue des contraintes liées à la quantité de prélèvement disponible dans ces maladies, la Demanderesse a donc mis au point un kit de détection du CD25s, qui est notamment utilisable par cytométrie de flux. En particulier, la Demanderesse envisage que ce kit de détection puisse être utilisable en parallèle avec la détection d'autres analytes, et notamment de l'IL-10 et l'IL-6. Il est en effet 25 important que la détection de nombreux facteurs puisse être réalisée simultanément, en raison du faible volume présent dans les échantillons prélevés sur les patients. La Demanderesse a, pour la première fois, et sans que les résultats rapportés dans la présente demande n'aient été attendus ou prévisibles, démontré que le CD25s était un analyte important à doser pour poser un pronostic 30 d'évolution des PIOL. La Demanderesse a donc été la première à se poser la question de l'intérêt de développer un test de détection de ce composé, qui puisse être utilisé pour des petits volumes de prélèvement, et simultanément à la détection d'autres composés. Ainsi, la Demanderesse a, en particulier, mis au point un système de 35 détection qui puisse être utilisé avec le système CBATM développé par la société BD Bioscience.

L'invention se rapporte ainsi à un kit de détection du CD25s comprenant un ensemble de billes émettant une fluorescence sous excitation à une longueur d'onde d'excitation, ladite fluorescence émise par lesdites billes l'étant à une longueur d'onde d'émission différente de la longueur d'onde d'excitation, chacune des billes comprenant, couplée à sa surface, une pluralité d'anticorps dirigés contre la protéine CD25s. Dans un mode de réalisation particulier, la longueur d'onde de la fluorescence émise, après excitation, par chacune des billes de l'ensemble présent 10 dans le kit est identique. Dans un mode de réalisation particulier, les anticorps de la pluralité d'anticorps dirigés la protéine CD25s sont tous identiques : ceci signifie que chacune des billes présentes dans l'ensemble de billes contient, à sa surface, une pluralité d'exemplaires du même anticorps dirigé contre CD25s (c'est-à-dire ayant 15 la même séquence). Ainsi, dans ce mode de réalisation, la pluralité d'anticorps dirigés contre la protéine CD25s est une pluralité d'anticorps monoclonaux, c'est-à-dire que le même anticorps monoclonal reconnaissant CD25s est présent, en de nombreux exemplaires, à la surface de chacune des billes. Dans un autre mode de réalisation, les anticorps de la pluralité d'anticorps 20 dirigés la protéine CD25s ne sont pas tous identiques, mais reconnaissent tous le même épitope (ou domaine) de la protéine CD25s : ceci signifie que chacune des billes présentes dans l'ensemble de billes contient, à sa surface, plusieurs anticorps identiques contre CD25s (c'est-à-dire ayant la même séquence). 25 Dans un mode de réalisation préféré, la longueur d'onde d'excitation est inférieure ou égale à 650nm. De préférence, cette longueur d'onde d'excitation est égale à 633nm. Dans ce mode de réalisation, la longueur d'onde d'émission (que l'on détecte après excitation) est supérieure à 655nm. En particulier, elle peut être 30 égale à 660-665nm ou 767-773nm. La longueur d'onde de 633nm correspond à une longueur d'onde permettant l'excitation de l'allophycocyanine. Celle-ci émet à une longueur d'onde autour de 660nm, détectable avec un filtre à 665nm. Lorsqu'elle est couplée à la cyanine-7, la cyanine 7 est en effet excitée par la fluorescence émise par 35 l'allophycocyanine et émet alors à 767nm ou 773nm, détectée à 767nm avec un filtre approprié. Ce rayonnement est basé sur la fluorescence par transfert d'énergie par résonnance (FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer). Dans un mode de réalisation particulier, lesdites billes émettent une 5 fluorescence à deux longueurs d'onde différentes. Ceci est le cas lorsque les billes contiennent deux fluorophores émettant à ces deux longueurs d'onde. De telles billes sont notamment décrites dans les brevets US 7,445,844, US 6,929,859, US 6,632,526, US 6,599,331, US 6,514,295. 10 Dans un cas particulier, lesdites longueurs d'onde d'émission sont 660- 665nm et 767-773nm, ce qui correspond à des billes contenant à la fois de l'allophycocyanine et de l'allophycocyanine couplée à la cyanine-7. Dans ce mode de réalisation, et ainsi que vue plus haut, lesdites billes contiennent à la fois de l'allophycocyanine et de l'allophycocyanine couplée à la 15 cyanine-7, la quantité et le ratio étant identiques pour chacune des billes. Ainsi, le passage des billes dans un cytomètre de flux, l'excitation à une longueur d'onde de 633nm, et la collecte de la quantité de fluorescence émise par les billes à 655nm et 767nm, permet d'observer, sur un diagramme 2D (abscisse quantité de fluorescence APC, ordonnée quantité de fluorescence APCCy7), les 20 billes à une position spécifique de ce diagramme. Dans un mode de réalisation préféré, lesdites billes sont des microbilles de polystyrène. Elles ont, de préférence, un diamètre compris entre 5 et 10 pm, de façon plus préférée 7,5 pm. 25 Dans un autre mode de réalisation, lesdites billes sont des billes de silice (voir US 20090068639). Dans un mode de réalisation particulier, ledit kit de détection contient également des anticorps secondaires susceptibles de se lier au CD25s. Dans le 30 mode de réalisation préféré, ces anticorps secondaires doivent être susceptibles de se lier au CD25s après liaison de cette protéine à un anticorps présent à la surface desdites billes. On préfère que ces anticorps secondaires soient liés à un composé fluorescent. Le fluorochrome choisi présente de préférence des longueurs d'onde d'excitation et d'émission différentes de celles des fluorochromes 35 présents dans les billes.

Ainsi, on choisit plutôt un fluorochrome ayant des longueurs d'onde d'excitation et d'émission inférieures à 600nm. On peut ainsi choisir la phycoérythrine (PE), ou tout autre fluorochrome. L'homme du métier connaît d'autres fluorochromes utilisables (listés notamment sur wikipedia).

Ainsi que vu plus haut, il est préférable que les anticorps présents à la surface des billes reconnaissent tous le même épitope de la protéine CD25s. En particulier, on préfère qu'ils reconnaissent l'épitope B de la protéine CD25s. De même, les anticorps secondaires reconnaissent tous un même épitope ou domaine de CD25s. En particulier, on préfère qu'ils reconnaissent l'épitope (domaine) A de la protéine CD25s. Enfin, il est préféré que le kit selon l'invention contienne également une solution de CD25s humain recombinant, qui permet d'effectuer des contrôles et 15 des quantifications plus précises. Dans un mode de réalisation préféré, le kit de détection comprend a) des microbilles de polystyrène, ayant en particulier un diamètre d'environ 7,5 pm, contenant un mélange de fluorophores Allophycocyanine - 20 Allophycocyanine liée à la cyanine-7, lesdites billes comprenant, couplée à leur surface, une pluralité d'anticorps monoclonaux murins dirigés contre l'épitope B du CD25s humain b) une solution d'anticorps monoclonaux murins dirigés contre l'épitope A du CD25s humain, liés à la phycoérythrine 25 Ce kit comprend également éventuellement une solution de CD25s humain recombinant. Dans un mode de réalisation particulier, les billes apparaissent en A4, après passage dans un cytomètre de flux BD FACSCant0TM Il (BD Bioscience), et 30 analyse par un logiciel approprié tel que le FACSDiva (BD Bioscience). Ceci signifie que la fluorescence émise par les billes est similaire ou identique à la fluorescence émise par les billes de référence 558578 vendues par BD Bioscience. On peut toutefois choisir n'importe quelles autres billes, en particulier les billes A5, B4, B5, E5, E8, C8, D8 (classification BD Bioscience). Toutes ces billes 35 sont disponibles chez BD Bioscience. Elles ne diffèrent que dans la quantité et le ratio des fluorochromes APC et APCCY7.

Dans un mode de réalisation préféré, le kit de détection est utilisé en cytométrie de flux pour doser le CD25s dans un échantillon obtenu d'un patient. Dans un mode de réalisation particulier, cet échantillon est un vitré ou tout autre 5 prélèvement intraoculaire, et l'on dose en même temps d'autres cytokines. Ainsi, le kit de détection peut aussi contenir au moins un autre ensemble de billes, lesdites billes comprenant, couplés à leur surface, une pluralité d'anticorps reconnaissant une autre protéine que la protéine CD25s, lesdites billes émettant une fluorescence sous excitation à la même longueur d'onde d'excitation que celle 10 excitant les billes destinées à doser CD25s, ladite fluorescence émise par lesdites billes l'étant a) à une longueur d'onde d'émission différente de ladite longueur d'onde d'émission des billes couvertes de la pluralité d'anticorps dirigés contre la protéine CD25s, et/ou 15 b) à une intensité différente de l'intensité observée pour les billes couvertes de la pluralité d'anticorps dirigés contre la protéine CD25s. En particulier, ladite autre protéine que la protéine CD25s est choisie dans le groupe constitué de l'interleukine 6 (IL-6) et l'interleukine 10 (IL-10). 20 On choisit notamment des billes contenant les mêmes fluorochromes (APC / APCCy7) que les billes destinées à la détection du CD25s, mais dans des proportions et/ou quantités différentes. Ainsi, ces billes du second ensemble seront localisées, sur le diagramme 2D (abscisse quantité de fluorescence APC, ordonnée quantité de fluorescence 25 APCCy7), les billes à une position spécifique de ce diagramme qui est différente de celle des billes couvertes d'anticorps anti-CD25s. Le kit peut ainsi contenir plusieurs ensembles de billes, chacun destiné à la détection et au dosage d'une protéine différente, les billes de chaque ensemble 30 ayant un profil de fluorescence propre et différent de celui des billes d'un autre ensemble. On préfère lorsque le kit permet le dosage simultané de l'IL-6 et de l'IL-10 (en plus du CD255). On peut notamment se procurer d'autres ensembles de billes chez BD 35 Bioscience (San Jose, Californie, États-Unis), par exemple sous la référence 560484 (Human Th1/Th2/Th17 CBA Kit qui regroupe des billes pour la détection simultanée des IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IFN-y, et TNF), ou cytokine par cytokine. Par exemple, on peut citer la référence 558274 (IL-10, billes B7) ou 558276 (IL-6, billes A7) de chez BD Bioscience.

Le kit ainsi décrit, même s'il peut être utilisé dans d'autres applications, a été spécialement conçu pour la mise en oeuvre de la mesure (dosage) in vitro de la quantité (concentration) de CD25s dans un prélèvement oculaire chez un patient. En effet, ainsi que vu plus haut, la Demanderesse a du spécifiquement mettre au point ce kit, afin de pouvoir effectuer des dosages simultanés de plusieurs cytokines dans un échantillon de très faible volume, du fait de l'intérêt du CD25s dans le pronostic du lymphome intraoculaire primitif. L'invention se rapporte également à une méthode de pronostic d'un lymphome intraoculaire chez un patient, comprenant l'étape de mesure (in vitro) de la quantité de CD25s dans un prélèvement oculaire chez ledit patient, une concentration de CD25s supérieure à 200 pg/ml dans ledit prélèvement étant indicatrice d'un pronostic défavorable d'évolution de la maladie chez ledit patient. Dans un mode de réalisation préféré, cet échantillon oculaire est un prélèvement de vitré. La concentration mesurée in vitro est alors celle effectivement présente in vivo. Lorsque l'échantillon n'est pas du vitré pur, il convient alors de connaître la dilution pour recalculer la concentration effective présente in vivo. Ainsi, si le prélèvement est un vitré dilué à 50 %, il convient de multiplier la concentration mesurée in vitro par deux pour pouvoir conclure. Il est entendu que la méthode ainsi décrite est effectuée in vitro sur un 25 échantillon qui a été obtenu après prélèvement sur un patient. Cette méthode n'inclut pas l'étape de prélèvement de l'échantillon oculaire. Cette mesure (dosage) est notamment réalisée en utilisant le kit décrit plus haut, qui est particulièrement bien adapté à une telle utilisation, ayant été développé dans ce but. 30 Ainsi ce dosage est préférentiellement réalisé par cytométrie de flux. On peut utiliser des appareils disponibles dans le commerce, tels que les cytomètres à deux lasers développés par BD Bioscience. Instrument Détection des anticorps Paramètres de détection des billes secondaires BD FACSVerseTM flow PE CBA Red et CBA NI R cytometer BD AccuriTM 06 flow FL2 F L4 (675/25) et F L3 cytometer* (780/60) BD FACSArray TM Yellow Red et NIR bioanalyzer BD FACSCantoTM II flow cytometer PE APC et APC-CyTM7 BD LSRFortessaTM flow PE APC et APC-Cy7 cytometer BD FACSAriaTM III cell PE APC et APC-Cy7 sorter BD FACSCaIiburTM flow FL2 FL4 et FL3 cytometer Avec les logiciels tels que BD FACSDiva Software, il est possible d'isoler les billes correspondant à un couple APC / APCCy7 particulier, et de visualiser la fluorescence en PE de la population cernée sur un histogramme représentant l'intensité de fluorescence en abscisse et le nombre d'évènement en ordonnée. Le logiciel rend une moyenne d'intensité de fluorescence (MIF) pour chaque tube, correspondant à une concentration déterminée à partir d'une gamme étalon réalisée en parallèle. Par « pronostic défavorable d'évolution de la maladie », on entend une forte 10 probabilité (supérieure à 50 %) que la maladie du patient présente au moins une évolution suivante : - rechute dans l'année suivant l'arrêt du traitement - non-réponse au traitement (réfractaire au traitement) Ceci signifie en particulier que plus de 50 % des patients pour lesquels la 15 concentration de CD25s est supérieure à 200 pg/ml présenteront l'évolution clinique mentionnée ci-dessus. De même, parmi les patients présentant une telle évolution clinique, plus de 50 % présentent une concentration de CD25s supérieure à 200 pg/ml. En particulier, une quantité de CD25s supérieure à 500 pg/ml dans 20 l'échantillon oculaire est indicatrice d'une forte probabilité de présenter une rechute dans l'année suivant l'arrêt du traitement.

De même, une concentration de CD25s inférieure à 125 pg/ml, voire à 150 pgml dans l'échantillon oculaire est indicatrice d'une forte probabilité de rémission complète. Afin d'affiner cet aspect pronostic, il peut être également intéressant de 5 mesurer la quantité d'IL-6 dans ledit prélèvement. En effet, la présence de niveaux élevés de ces deux cytokines inflammatoires est indicatrice d'un mauvais pronostic d'évolution de la maladie. Ainsi, une quantité d'IL-6 supérieure à 50 pg/ml est indicatrice d'un pronostic défavorable d'évolution de la maladie. En particulier, une quantité de'l L-6 10 supérieure à 100 pg/ml dans l'échantillon oculaire est indicatrice d'une forte probabilité de présenter une rechute dans l'année suivant l'arrêt du traitement. Enfin, il est possible et envisager de doser et mesurer la quantité de CD25s dans un échantillon de liquide céphalorachidien d'un patient, notamment par 15 utilisation du kit ainsi décrit, dans des méthodes de diagnostic et/ou pronostic d'un lymphome du système nerveux central. Ce dosage est bien entendu effectué in vitro. D'une façon générale, dans les méthodes décrites ci-dessus, l'étape de mesure in vitro de la quantité de CD25s (dosage de CD255) est préférentiellement 20 effectuée à l'aide d'un kit tel que décrit ci-dessus. Description des Figures Figure 1 : Représentation de la position alphanumérique des billes portant les anticorps destinés à détecter des cytokines selon le standard développé par 25 BD Bioscience pour la technique CBATM, en représentation APC/APC-Cy7 Figure 2 : Résumé des renseignements cliniques obtenus pour 25 patients atteints de LIO. Figure 3: concentration intravitréenne de CD25s mesurés chez des patients en rémission complète ou réfractaire au traitement (A.), ayant présenté une rechute 30 dans l'année suivant l'arrêt du traitement (rechute <1 an) ou plus d'un an après l'arrêt du traitement (rechute >1 an) (B.), la figure C. synthétisant les figures A. et B. RC : rémission complète Exemples 35 Exemple 1. Préparation d'un kit pour la détection de CD25s par CBATM a) Préparation des billes couplées à des anticorps anti CD25 Le dosage du CD25s en CBATM peut être effectué en réalisant un couplage de billes avec des anticorps spécifiques. Pour cela, ont été choisis des billes non couplées, un couple d'anticorps monoclonaux reconnaissant chacun un épitope différent du CD25s, l'un purifié, 5 destiné à être conjugué aux billes, et l'autre marqué à la PE. Un recombinant standard de CD25s permet de réaliser la gamme étalon. Les billes ont été choisies de telle sorte qu'elles possèdent une position sur le dot plot en APC/APCCy7 assez éloignée des autres billes susceptibles d'être utilisées en parallèle pour le dosage des autres cytokines. Le choix des billes en 10 position A4 (BD Biosciences, ref 558578) a été retenu, car cette position se trouve assez éloignée de celle de l'IL-6, de l'IL-10, de MIP1-a, de RANTES et de l'IFN-y positionnées respectivement en A7, B7, B9, D4 et E7. La position prévisionnelle des cytokines est représentée sur la Figure 1. 15 L'anticorps primaire choisi est un anticorps monoclonal purifié de souris NA/LE anti-CD25 humain (clone M-251) dirigé contre le domaine (épitope) B de la protéine. L'anticorps secondaire est un anticorps monoclonal de souris anti-CD25 humain (clone 2A3), dirigé contre le domaine (épitope) A de la protéine, couplé à la phycoérythrine (excitée à une longueur d'onde de 488nm, et émettant une 20 flourescence à une longueur d'onde de 580nm). Les deux anticorps peuvent être achetés auprès de BD Biosciences (San Jose, Californie) sous les références 555429 et 341011 respectivement. Ces anticorps ou d'autres anticorps sont également disponibles auprès d'autres fournisseurs (par exemple Stemcell, ou Miltenyi Biotec). 25 L'anticorps primaire NA/LE anti-CD25 a été couplé aux billes A4 selon les préconisations du fabriquant. Le principe de la réaction de conjugaison consiste à réduire les ponts disulfures situés à la surface des billes de polystyrène grâce à un agent réducteur, le dithiothreitol. Parallèlement, les fonctions aminées primaires 30 des anticorps réagissent avec un agent de conjugaison hétéro-bifonctionnel, le sulfo-SMCC, et forment un dérivé de maléimide très réactif. Ce dernier peut alors former une liaison de thioether stable avec les fonctions thiol des billes via une réaction radicalaire, aboutissant ainsi à l'ancrage covalent des anticorps. 35 b) Procédure de marquage Les billes couplées à l'anticorps primaire ont été utilisées pour la détection du CD25s, suivant la procédure de marquage suivante : pour chaque test, 50p1 d'échantillon ont été incubés pendant 1h à l'obscurité avec 1p1 de billes A4 conjuguées préalablement lavées et diluées dans un tampon de lavage.

L'anticorps secondaire anti-CD25 couplé à la PE dilué au 1/20ème a ensuite été ajouté. Après une incubation de 2h et un dernier lavage, l'échantillon peut être analysé au cytomètre. c) Analyse sur cytomètre FACSCant0IITM - Gammes étalons - Linéarité Chaque tube contenant le milieu réactionnel a été analysé sur un cytomètre FACSCant0IITM 8 couleurs (BD Bioscience ; Becton Dickinson), en mode manuel, en acquérant au minimum 300 événements à une vitesse « medium ». Les données ont été analysées à l'aide du logiciel informatique BD FACSDiva Software (Becton Dickinson).

La stratégie d'analyse comprend tout d'abord un conditionnement de l'ensemble des billes dans une fenêtre d'analyse taille/structure. Elles sont ensuite fenêtrées en APC et APC-Cy7 de manière à cerner au maximum les billes A4. Cette dernière sélection permet d'éliminer de la fenêtre d'analyse toutes les impuretés liées à la conservation ou les doublets de billes générés pendant l'étape de couplage. La fluorescence en PE de la population cernée en A4 peut être visualisée sur un histogramme représentant l'intensité de fluorescence en abscisse et le nombre d'évènement en ordonnée. Le logiciel rend une moyenne d'intensité de fluorescence (MIF) pour chaque tube, correspondant à une concentration déterminée à partir d'une gamme étalon réalisée en parallèle.

Sur la base des mesures effectuées sur la gamme étalon, on a observé qu'il existe une bonne linéarité pour les valeurs comprises entre 0 et 10000 pg/ml. Ainsi, lors des dosages ultérieurs, le point extrême de la gamme ne devrait pas dépasser 10000 pg/ml.

Le dosage du CD25s n'ayant jamais été testé sur des prélèvements intraoculaires, il n'était pas possible de prédire avec certitude quelle serait la gamme de concentration attendue avant de tester des échantillons de patients. Toutefois, il a été considéré que les résultats devraient être du même ordre de grandeur que ceux de l'IL-10 et de l'IL-6, pour lesquels la valeur maximale détectée en CBA est de 5000 pg/ml. Ainsi, le point supérieur de la gamme de calibration du CD25s a été fixé à 8000 pg/ml : ce point se trouve dans le domaine de linéarité de la courbe et permet de balayer un intervalle de concentration très large. Les résultats de dosage de CD25s supérieurs à 8000 pg/ml ont donc été rendus « >8000 pg/ml ».

Une gamme étalon en 12 point avec des concentrations plus diluées de CD25s, allant de 7,8 pg/ml à 8000 pg/ml, a été réalisée. Les résultats de cette gamme montrent que l'intensité de fluorescence correspondant aux très faibles concentrations comprises entre 0 et 30 pg/ml ne varient pas de manière proportionnelle. Le seuil de détection a ainsi été fixé à 30 pg/ml. d) Test de dosage multiplex Afin de tester la compatibilité des billes ainsi conçues avec d'autres billes commerciales, pour démontrer la possibilité d'effectuer une détection de l'ensemble des cytokines via une seule expérience, les réactifs permettant la détection du CD25s, de l'IL-10, de l'IL-6, et de l'IFN-y ont été combinés pour voir s'il était possible de doser simultanément toutes ces cytokines, sans qu'il n'y ait d'interférences pour leur détection. Pour cela, une gamme étalon a été réalisée à partir d'un mélange de CD25s, d'IL-10, d'IL-6, et d'IFN-y recombinants. Chaque cytokine se trouve initialement à une concentration de 5000 pg/ml dans le premier tube qui constitue le point supérieur de la gamme. Il a été dilué en cascade pour obtenir les différents points de gamme, chaque cytokine se trouvant alors diluées dans les mêmes proportions. Enfin, le mélange de tous les réactifs permettant la détection de chaque cytokine a été ajouté dans chaque tube correspondant à un point de gamme. On a observé que les billes n'interfèrent donc pas entre elles pour leur détection puisque la linéarité est bonne pour chaque droite d'étalonnage. On peut cependant noter que l'intensité du signal est plus faible pour le CD25s, même si la 30 linéarité reste tout à fait acceptable. Exemple 2. Marquage pour le dosage multiplex du CD25s, de IL-10, de IL-6, de MIP1-a, de RANTES et de IFN-y en CBATM dans des prélèvements oculaires Ce mode opératoire décrit la technique de marquage des cytokines qui a 35 été appliquée. Les kits prêts à l'emploi (kits Flex Set BDTM CBA) ont été utilisés pour le dosage de l'IL-10, de l'IL-6, de l'IFN-y, de MIP-la et de RANTES. Chaque kit permet de réaliser 50 tests et contient les billes de captures couplées à l'anticorps primaire, l'anticorps secondaire, et un recombinant standard sous forme lyophilisée à reconstituer au moment de la préparation de la gamme étalon. Les kits CBATM utilisés ont été développés par BD Biosciences ey sont commercialisés sous les références 558274 (IL- 10), 558276 (1L-6), 558324 (RANTES), 558449 (MIP-1a) et 561515 (IFNy). Pour le CD25s, ont été utilisées les billes A4 fonctionnelles décrites plus haut, l'anticorps secondaire anti-CD25 et le recombinant standard sous forme liquide.

Les tampons nécessaires à la réalisation du dosage recommandés par le fabriquant sont fournis dans le kit CBATM Human Soluble Protein Master Buffer Kit, BD Bioscience. a) Préparation de la solution de billes de capture Les billes sont à utiliser à raison de 1pL par test, soit 50pL de chaque bille pour une série de 50 tests. Elles sont d'abord lavées dans 500pL de tampon de lavage VVash Buffer BD, centrifugées 5 min à 1500tr/min. Le surnageant est délicatement aspiré et les billes sont remises en suspension dans 2500p1 de tampon de dilution Capture Bead Diluent for Serum/Plasma, soit 50p1 par test. La solution est incubée 15min à température ambiante et à l'obscurité pour éviter d'exciter les fluorochromes présents sur les billes. b) Préparation extemporanée de la solution d'anticorps secondaires PE Pour l'IL-10, l'IL-6, l'IFN-y, MIP-1 a et RANTES, 1p1 d'anticorps secondaire 25 est nécessaire pour un test, soit 50pL de chaque anticorps pour une série de 50 tests. La quantité minimale nécessaire utile pour un test n'ayant pas été évaluée avec précision pour le CD25s, la même quantité d'anticorps secondaire que celle choisie pour les mises au point techniques, soit 5 pl par test, a été utilisée. Au total 250p1 d'anticorps anti-CD25s sont nécessaires pour 50 tests. 30 Le mélange de l'ensemble des anticorps nécessaires pour une série de 50 tests représente un volume de 500p1. Ce volume est dilué au quart dans 2m1 de tampon Diluent Detector et 200p1 de cette dilution sont nécessaires pour chaque test. 35 c) Marquage des échantillons Le marquage s'effectue sur un volume de 50p1 d'échantillon. Un volume de 50p1 du mélange de billes, préalablement vortexés est ajouté à l'échantillon puis incubé 1h à l'obscurité et à température ambiante. Après cette incubation, 50p1 de la solution de mélange d'anticorps secondaires PE est ajouté à l'échantillon. Le 5 mélange est incubé 2h à l'obscurité et à température ambiante. À l'issue de cette étape, les échantillons sont lavés pour éliminer l'excès d'anticorps secondaires. Un volume de 1000p1 de tampon VVash Buffer BD est ajouté, l'échantillon est centrifugé pendant 5 min à 1500tr/min. Le surnageant est retiré délicatement et le culot de billes est remis en suspension dans 300p1 de tampon VVash Buffer BD. 10 Les échantillons sont prêts pour être analysés au cytomètre. d) Analyse au cytomètre Avant chaque passage au cytomètre, l'échantillon doit être vortexé pour remettre en suspension les billes. L'analyse doit être faite dès la fin de l'étape de 15 marquage pour éviter un découplage entre les billes et les cytokines pouvant entraîner une perte de signal. Les échantillons sont analysés au cytomètre en mode manuel en acquérant au minimum 300 événements à une vitesse « medium ». Les données sont analysées à l'aide du logiciel informatique BD FACSDiva SoftwareTM et basculées sur le logiciel de traitement des résultats 20 FCAP-ArrayTM. e) Validation technique du test sur des prélèvements intraoculaires Le dosage multiplex des cytokines sur 15 échantillons intraoculaires de patients atteints de PIOL (7 PCA et 8 vitrés) et 18 prélèvements intraoculaires de 25 patients atteints d'uvéite a été réalisé, sur des prélèvements conservés à -80°C depuis environ 2 ans. L'IL-10 et l'IL-6 avaient été mesurés initialement et simultanément avec la technique CBATM. Le dosage multiplexe des 6 cytokines a été réalisé après avoir décongelé les prélèvements, et les résultats d'IL-10 et d'IL-6 obtenus avant et après congélation ont été comparés pour voir si d'une part, la 30 conservation altère la qualité du prélèvement et d'autre part pour voir si le dosage simultané de 6 cytokines a un impact sur leurs résultats respectifs. Les résultats sont bien corrélés pour l'IL-10 (R2=0,9511) ainsi que pour I'l L6 (R2=0,9873) ce qui a permis de conclure d'une part, que la congélation n'a pas 35 entrainé de dégradation du matériel et d'autre part, que le dosage simultané de 6 cytokines n'interfère pas sur les résultats de chaque cytokine. Le test ainsi mis au point est donc valide sur le plan technique et fournit des résultats fiables. Exemple 3. Dosage de différentes cytokines chez des patients En dehors de l'IL-10, l'IL-6 et de l'IFN-y qui sont régulièrement dosés en routine dans des prélèvements intraoculaires, le dosage du CD25s, RANTES et MIP1-a n'avait jamais été pratiqué dans ce type de prélèvement. Après avoir mis au point le dosage combiné de ces 6 cytokines en technique CBATM, il a été appliqué à une cohorte de patients atteints de lymphome intraoculaire (L10) pour voir d'une part, si ces cytokines sont détectables dans des prélèvements intraoculaires, et d'autre part, pour étudier la signification clinique des résultats. a) Patients et prélèvements L'étude a porté sur une cohorte rétrospective de 36 patients atteints de LIO, tous issus du service d'ophtalmologie de la Pitié-Salpêtrière et pour lesquels le diagnostic initial a été posé grâce à l'examen cytologique sur un prélèvement d'humeur vitrée et/ou grâce au dosage de l'IL-10 et de l'IL-6 (dosés en technique CBATM, sauf pour les prélèvements antérieurs à janvier 2009 pour lesquels le dosage a été réalisé en ELISA).

Le dosage multiplex des 6 cytokines a été réalisé sur les prélèvements d'humeur vitrée correspondant au prélèvement au diagnostic pour chacun des 36 patients. Tous les prélèvements étaient conservés à -80°C et en quantité suffisante pour effectuer un nouveau dosage, soit un volume de prélèvement d'au moins 50p1. Tous ces prélèvements ont été effectués entre le mois d'avril 2004 et de janvier 2012. La cohorte comprenait 17 hommes et 19 femmes. La moyenne d'âge était de 65 ans avec des valeurs extrêmes allant de 44 à 88 ans. Pour 25 patients, des renseignements cliniques ont été obtenus à partir des dossiers médicaux mis à disposition par le service d'Ophtalmologie.

En parallèle, une cohorte de contrôle « non-PIOL » a été constitutée, comportant 16 prélèvements d'humeur vitrée de patients avec un profil cytokinique d'uvéite (concentration intraoculaire en IL-6 augmentée, IL-10 basse) et deux patients pour lesquels l'IL-10 et l'IL-6 n'étaient pas détectables. Les renseignements cliniques n'ont pas pu être recueillis pour ces 18 patients. b) Résultats d'IL-10 et d'IL-6 Les concentrations d'IL-10 dans les vitrés des patients atteints de LIO sont en moyenne de 1787 pg/ml alors qu'elles sont de 5 pg/ml dans les prélèvements des patients du groupe témoin. Les médianes des concentrations de chaque cytokine ont été comparées entre les deux groupes avec un test non paramétrique de Mann-Whitney, adapté aux petites séries. La médiane des concentrations en IL-10 est significativement supérieure dans le groupe des LIO (P<0,05). A l'inverse, la médiane des concentrations en IL-6 est supérieure dans le groupe des uvéites (P<0,05). Les résultats récapitulatifs des dosages sont représentés dans le tableau 1.

IL-10 (pg/ml) IL-6 (pg/ml) Ratio I L-10/1L-6 LIO Uvéite PIOL Uvéite LIO Uvéite Mediane 1110 2 52 207 17,7 0,003 Moyenne 1787 5 265 1406 37 0,008 Ecart type 1774 4,7 824 2092 44 0,2 Minimum 80 1 6 2 0,9 0 Maximum 5000 14 5000 5000 211 0,5 Tableau 1 Résultats d'IL-10 et d'IL-6 dans le groupe de lymphomes intraoculaires (n= 36) et les uvéites (n=16) D'après une étude réalisée dans les laboratoires de la Demanderesse, portant sur 56 vitrés dans lesquels l'IL-10 et l'IL-6 ont été mesurés en CBA, le seuil de 37 pg/ml en IL-10 a été proposé pour porter le diagnostic de LIO. La valeur minimale en IL-10 détectée dans cette série de LIO est de 80 pg/ml, ce qui est en accord avec ce seuil diagnostique proposé. De plus, le calcul du ratio I L-10/IL-6 est souvent considéré comme pertinent pour apporter une aide au diagnostic lorsque sa valeur est supérieure à 1 (VVhitcup et al, op. cit.). Ce ratio a été déterminé, et il a été observé qu'il est systématiquement supérieur à 1, à l'exception d'un patient pour lequel il est de 0,9. Ces résultats ont donc confirmé le diagnostic de LIO ou d'uvéite initialement posé dans chaque groupe et ont permis de conforter la validité 25 technique du test que nous avons mis au point, puisque les diagnostics initiaux restent inchangés.

La moyenne des concentrations en IFN-y dans le groupe des LIO est de 8 pg/ml alors qu'elle est de 3 pg/ml dans le groupe des uvéites. Les médianes sont significativement différentes (P<0,05). La dispersion des résultats est faible dans les deux groupes, et seuls 3 patients du groupe de LIO ont des concentrations plus élevées à 21, 37 et 124 pg/ml. Toutefois, compte tenu du chevauchement important des valeurs des concentrations entre les deux groupes, l'IFN-y ne semble pas être un paramètre pertinent pour le diagnostic de LIO. c) Résultats de CD25s, RANTES et MIP-la Les concentrations de RANTES et MIP-1 a sont supérieures dans les LIO (P<0,05 pour RANTES et pour MIP-1a) mais il existe un chevauchement important des valeurs entre les deux groupes sur un intervalle de valeur compris entre 0 et 50 pg/ml pour RANTES et entre 0 et 40 pg/ml pour MIP-la. Les quelques patients pour lesquels les valeurs de RANTES et de M IP-la sont élevées correspondent à des valeurs en IL-10 déjà très fortes. Ces marqueurs n'apportent donc pas une aide diagnostique supplémentaire. Les concentrations en CD25s ne sont pas significativement différentes dans les deux groupes d'études, mais on peut observer une importante hétérogénéité des résultats dans le groupe de LIO. Les valeurs vont de 30 à 8000 pg/ml dans le groupe des LIO alors qu'elles vont de 30 à 837pg/m1 dans le groupe des uvéites. Les concentrations élevées en CD25s ont tendance à être associées aux concentrations élevées en IL-10 sans qu'il n'existe toutefois de corrélation entre les deux paramètres (R2=0,4265).

Conclusion Le CD25s, RANTES, MIP-la et l'INF-y n'apparaissent pas réellement plus pertinents que l'IL-10 et l'IL-6 pour le diagnostic des LIO. Toutefois, ils pourraient être utilisés en seconde intention pour affiner un pronostic, mais le dosage des IL-30 10 et IL-6 et le calcul du ratio restent a priori les meilleurs éléments du diagnostic. Exemple 4. Interprétation des résultats : versant pronostique Pour chaque patient, un nombre limité de paramètres (lorsqu'ils étaient disponibles) ont été étudiés : le diagnostic, la présentation oculaire unilatérale ou 35 bilatérale, la présence d'une atteinte cérébrale concomitante au diagnostic, le délai d'apparition d'une atteinte cérébrale secondaire, le type de réponse au traitement de première ligne (réponse complète supérieure à un an, réponse partielle ou absence de réponse), le délai de rechute et le décès après l'annonce du diagnostic. a) Description clinique de 25 patients issus de la cohorte de LIO Les renseignements cliniques n'ont pu être obtenus que pour 25 patients issus de la cohorte de LIO. L'ensemble des renseignements cliniques obtenus est résumés dans la Figure 2.

Parmi ces 25 patients, 13 sont atteints de PIOL (pas d'atteinte cérébrale au diagnostic), 7 sont atteints de lymphome oculo-cérébral (LOC), 2 présentent une localisation oculaire d'une rechute d'un lymphome cérébral primitif, et 3 sont des lymphomes oculaires secondaires à un lymphome systémique (1 lymphome folliculaire, 1 lymphome ethmoïdal et 1 lymphome B à grandes cellules).

Parmi les 12 patients atteints de PIOL, 8 ont une présentation oculaire unilatérale, et 5 bilatérale. Trois patients ont développé un envahissement cérébral dans un délai de 10 mois, 23 mois et 24 mois après l'annonce du diagnostic. Cinq patients ont développé une rechute oculaire de leur lymphome dans un délai inférieur à 1 an alors qu'une seule patiente a rechuté dans un délai supérieur à 1 an. Trois patients sont en rémission complète depuis plus d'un an et cela, dès la première ligne de traitement, et 5 patients sont réfractaires au traitement initial (réponse partielle nécessitant un traitement de deuxième ligne ou absence de réponse). Parmi les 7 LOC, 2 ont une atteinte oculaire unilatérale et 4 bilatérale. Un 25 patient est en rémission complète depuis plus d'un an dès la première ligne de traitement, et 2 patients ont développé une rechute oculaire de leur lymphome cérébral traité dans un délai supérieur à un an. Deux patients ont présenté une rechute oculaire d'un lymphome cérébral en rémission depuis 7 ans pour l'un et 1 an pour l'autre. Ce dernier est décédé 4 30 mois après le début de la rechute oculaire. Enfin 3 patients sont atteints de lymphome intraoculaire secondaire à un lymphome systémique (un lymphome ethmoïdal, un lymphome folliculaire et un lymphome B à grandes cellules). Pour ces 3 patients, les lymphomes systémiques étaient en rémission au moment de la rechute oculaire. Parmi eux, un patient 35 présente une atteinte cérébrale concomitante. De manière générale, il a été difficile de savoir si les patients étaient toujours en vie au moment de l'étude. 4 patients étaient décédés, mais les informations cliniques permettant d'établir un lien entre le décès et le lymphome n'ont pas été retrouvées, sauf pour un patient. b) Analyse univariée des résultats Compte tenu de la faible proportion de renseignements cliniques obtenus pour effectuer une analyse multivariée significative, un test de comparaison non paramétrique de Mann-Whitney a été réalisé, afin de voir si l'augmentation d'une cytokine pouvait être associée à une situation clinique particulière. Les concentrations en IL-10, IL-6, CD25s, RANTES, MIP-la et IFNy ont été comparées dans les groupes suivants : - les PIOL par rapport aux LOC : les 3 patients atteints de lymphome oculaire secondaire ont été exclus pour effectuer cette comparaison, qui a donc été réalisée sur 13 patients atteints de PIOL et 7 patients atteints de LOC. - les atteintes oculaires unilatérales par rapport aux atteintes bilatérales, 15 sans distinction au niveau du diagnostic de PIOL, LOC ou lymphome oculaire secondaire, ce qui représente 12 atteintes oculaires unilatérales et 11 atteintes bilatérales. - les patients en rémission complète dès la première ligne de traitement depuis au moins un an (7 patients) par rapport aux patients réfractaires au 20 traitement, c'est-à-dire répondant partiellement au traitement ou nécessitant plusieurs lignes de traitement (12 patients). - les patients présentant un délai de rechute inférieur à 1an (5 patients), par rapport aux patients avec un délai de rechute supérieur à 1an (5 patients). 25 c) Comparaison entre les PIOL et les LOC Les médianes des concentrations en IL-10, RANTES et IFNy sont significativement plus élevées dans les PIOL par rapport aux LOC. Cette différence est beaucoup plus marquée pour l'IL-10, puisque la médiane est de 1535 pg/ml dans les PIOL et de 428 pg/ml dans les LOC. Pour RANTES et l'IFNy, même si les 30 concentrations sont significativements différentes, les valeurs restent très faibles dans les PIOL et les LOC. L'IL-6 et le CD25s montrent une légère tendance à être augmentés dans les PIOL mais de façon non significative. Enfin les concentrations en MIP-la sont équivalentes dans les deux groupes (Tableau 2). 35 d) Comparaison entre les atteintes unilatérales et bilatérales Il n'existe pas de différences significatives pour les différentes cytokines selon que l'atteinte oculaire est unilatérale ou bilatérale. L'IL-10, IL-6 et le CD25s semblent avoir tendance à être augmentés dans les formes unilatérales (Tableau 2).

Concentration pg/ml PIOL LOC Atteinte Atteinte unilatérale bilatérale IL-10 1535 428 NS 1189 862 NS IL-6 128 22 NS 202 34 NS CD25s 430 183 NS 314 188 NS RANTES 43 13 * 33 35 NS MIP-la 8 7 NS 10 7 NS IFNy 3 1 * 3 1 NS NS: Non Significatif * : P< 0,05 Tableau 2 : Comparaison des médianes des concentrations intravitréennes dans les différents groupes de patients étudiés e) Comparaison entre les patients en rémission complète et les patients réfractaires au traitement Il n'existe pas de différences statistiquement significatives entre les patients en rémission complète depuis plus d'un an dès la première ligne de traitement et les patients réfractaires au traitement. Toutefois, les concentrations en IL-10, IL-6 et CD25s ont tendance à être supérieures chez les patients réfractaires au traitement. RANTES semble également être augmenté mais dans une moindre mesure puisque les concentrations sont globalement assez faibles (Tableau 3). f) Comparaison entre les patients avec un délai de rechute inférieur à 1 an et un délai de rechute supérieur à 1 an Là encore, il n'existe pas de différences significatives des concentrations en cytokine entre les patients qui rechutent dans un délai d'un an après l'arrêt du traitement et ceux qui rechutent plus tardivement, à l'exception de l'IFNy, pour lequel les concentrations sont cependant très basses. On observe toutefois une tendance à l'augmentation non significative en IL-6, CD25s, RANTES et I FNy chez les patients rechutant précocement alors que les patients en rémissions complètes depuis plus d'un an et les patients qui rechutent tardivement semblent avec des concentrations en cytokine comparables (Tableau 3, et figure 3).

Concentration pg/ml Rechute Rechute Rémission complète Réfractaire au < 1an > 1an traitement IL-10 693 532 NS 200 1134 NS IL-6 195 53 NS 20 72 NS CD25s 651 198 NS 115 281 NS RANTES 43 19 NS 18 33 NS M IP-la 8 8 NS 7 10 NS IFNy 7 2 * 1 3 NS NS: Non Significatif * : P< 0,05 Tableau 3 : Comparaison des médianes des concentrations intravitréennes dans les différents groupes de patients étudiés g) Synthèse des résultats Compte tenu du faible effectif étudié à chaque fois, il est difficile d'observer des différences significatives entre les groupes que nous avons constitués. Cependant il faut tenir compte de l'ordre de grandeur des concentrations en cytokine pour l'interprétation de ces résultats. En effet, RANTES, MIP-la et l'IFNy sont globalement toujours inférieurs à 100 pg/ml alors que l'IL-10, l'IL-6 et le CD25s peuvent montrer une dispersion importante des résultats avec des valeurs pouvant souvent atteindre plus de 1000 pg/ml. En prenant en compte ces éléments et avec toute la réserve liée au nombre limité de patients étudiés, il convient d'interpréter les profils cytokiniques dans leur ensemble, plutôt que chaque marqueur pris un à un. On remarque que l'IL-6, et le CD25s (1'IFNy et RANTES dans une moindre mesure) varient dans le même sens. Elles ont tendance à être augmentées chez les patients dont le délai de rechute est précoce (1<an) par rapport à ceux dont le délai est plus tardif. De plus, ces même cytokines ont également tendance à être augmentées chez les patients répondant moins bien au traitement, par rapport à ceux dont la rémission complète est obtenue de façon rapide et durable. Si on combine ces résultats, on constate également que les médianes des concentrations de ces cytokines chez les patients avec un délai de rechute tardif et chez les patients en rémission complète sont proches.

Ainsi, l'augmentation des cytokines inflammatoires au diagnostic semble donner une bonne indication sur la réponse au traitement. Un environnement tumoral avec une composante inflammatoire importante serait plutôt associé à une moins bonne réponse au traitement. Ainsi, les cytokines RANTES, l'IFNy, MIP-1 a et le CD25s n'apparaissent 5 pas réellement plus pertinentes que l'IL-10 et l'IL-6 pour le diagnostic des lymphomes intraoculaires, mais peuvent être utiles dans des cas complexes en deuxième intention, notamment le CD25s, pour conforter un diagnostic complexe. Par ailleurs, l'IL-6 et le CD25s ont tendance à être augmentés chez les 10 patients qui rechutent dans un délai inférieur à un an après l'arrêt du traitement, par rapport à ceux dont le délai de rechute est supérieur à un an. Cette différence n'est pas significative statistiquement compte tenu du faible effectif étudié mais l'écart entre les médianes est important. RANTES et l'IFNy sont également augmentés mais dans une moindre mesure. De plus, les patients dont la rémission 15 complète a été obtenue rapidement et de façon durable ont des concentrations d'IL-6 et de CD25s comparable à ceux dont la rechute est plus tardive. Autrement dit, les patients qui rechutent précocement présenteraient une imprégnation augmentée en cytokiniques pro-inflammatoires, en particulier l'IL-6 et le CD25s. On peut donc se demander si une réponse inflammatoire augmentée au 20 moment du diagnostic ne jouerait pas un rôle délétère chez l'hôte et conditionnerait une moins bonne réponse thérapeutique à long terme. De plus, l'IL-10, l'IL-6, le CD25s et RANTES ont tendance à être augmentés dans les PIOL en comparaison aux LOC. Cette tendance s'accentue si 25 on retire les points supérieurs d'IL-10, d'IL-6 et de CD25s dans le groupe des LOC, qui correspondent à un même patient dont le profil cytokinique est plutôt atypique. Cette tendance à l'augmentation se retrouve également mais dans une moindre mesure pour l'IL-10 et l'IL-6 dans les formes atteinte oculaire unilatérale comparées aux atteintes bilatérales. Les concentrations en cytokines semblent 30 donc avoir tendance à varier en fonction de la localisation unique purement oculaire ou de la localisation secondaire bilatérale ou bifocale. Ces résultats donnent l'impression que l'imprégnation en cytokines est plus importante lorsque l'atteinte tumorale est compartimentée à l'oeil, voir même au niveau d'un seul oeil, et qu'elle diminue lorsque l'atteinte s'étend à un autre site, 35 comme si la réaction immune avait tendance à s'épuiser ou à se déplacer vers un autre compartiment. Pour confirmer cette hypothèse, il faudrait doser ces cytokines dans des vitrés et de LCR à différent moment de l'évolution de la maladie, au diagnostic et au moment de l'envahissement cérébral pour suivre la cinétique de ces marqueurs lorsque la maladie se déplace vers un autre compartiment.

De manière très intéressante, des concentrations très importantes de CD25s ont été détectées dans les vitrés de patients de PIOL. De manière générale, l'origine et le rôle de la sécrétion de CD25s ne sont pas totalement élucidés. Certains auteurs lui attribuent une origine tumorale alors que d'autres considèrent qu'elle reflète l'activation des cellules immunitaires, notamment, les lymphocytes Treg (lymphocytes T régulateurs CD4+/CD25+/FOXP3) qui expriment fortement le CD25 membranaire. Il n'est donc pas impossible que la concentration intraoculaire de CD25s reflète de manière indirecte l'infiltration par les Treg, qui ont plutôt tendance à favoriser la progression tumorale en inhibant la réponse immunitaire. Si cette hypothèse se vérifie, on peut facilement comprendre que des concentrations élevées en CD25s soient associées à un mauvais pronostic pour le patient. Les patients qui rechutaient dans un délai inférieur à 1 an après l'arrêt du traitement ont tendance à avoir des concentrations en IL-6, CD25s, RANTES et 20 IFNy plus élevées que les patients dont la rechute est tardive. Sans être lié par cette théorie, on peut émettre l'hypothèse qu'une augmentation de ces cytokines traduirait une réponse inflammatoire importante et délétère s'opposant à une bonne réponse thérapeutique. Cette réponse inflammatoire s'accompagnerait d'un recrutement de lymphocytes T régulateurs 25 qui favoriseraient la progression tumorale. Les concentrations d'IL-10, d'IL-6 et de CD25s ont également tendance à être augmentées dans les atteintes purement oculaires ce qui pourrait s'expliquer par une cible tumorale plus agressive et une concentration des mécanismes immunitaires au niveau de l'oail.

Claims (19)

1. REVENDICATIONS1. Kit de détection de la protéine CD25s comprenant un ensemble de billes émettant une fluorescence sous excitation à une longueur d'onde d'excitation, ladite fluorescence émise par lesdites billes l'étant à une longueur d'onde d'émission différente de la longueur d'onde d'excitation, chacune des billes comprenant, couplée à sa surface, une pluralité d'anticorps dirigés contre la protéine CD25s.
2. 2. Kit de détection selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite longueur d'onde d'excitation est inférieure à 650nm.
3. 3. Kit de détection selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite longueur d'onde d'émission est supérieure à 655nm.
4. 4. Kit de détection selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que lesdites billes émettent une fluorescence à deux longueurs d'onde d'émission après excitation à la longueur d'onde d'excitation.
5. 5. Kit de détection selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que lesdites longueurs d'onde d'émission sont détectées à 665nm et 767nm.
6. 6. Kit de détection selon l'un des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que lesdites billes sont des microbilles de polystyrène. 25
7. 7. Kit de détection selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le même anticorps monoclonal reconnaissant CD25s est présent, en de nombreux exemplaires, à la surface de chacune des billes. 30
8. 8. Kit de détection selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il contient également des anticorps secondaires susceptibles de se lier au CD25s après liaison de cette protéine auxdits anticorps présents à la surface desdites billes. 35
9. 9. Kit de détection selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la les anticorps présents à la surface des billes reconnaissent l'épitope B de la protéine CD25s.
10. 10. Kit de détection selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que lesdits anticorps secondaires reconnaissent l'épitope A de la protéine CD25s.
11. 11. Kit de détection selon l'une des revendications 1 à 10, comprenant a) des microbilles de polystyrène contenant un mélange de fluorophores Allophycocyanine - Allophycocyanine liée à la cyanine-7, lesdites billes comprenant, couplée à leur surface, une pluralité d'anticorps monoclonaux murins dirigés contre l'épitope B du CD25s humain b) une solution d'anticorps monoclonaux murins dirigés contre l'épitope A du CD25s humain, liés à la phycoérythrine c) éventuellement une solution de CD25s humain recombinant
12. 12. Kit de détection selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il contient également au moins un autre ensemble de billes, lesdites billes comprenant, couplés à leur surface, une pluralité d'anticorps reconnaissant une autre protéine que la protéine CD25s, lesdites billes émettant une fluorescence sous excitation à ladite longueur d'onde d'excitation, ladite fluorescence émise par lesdites billes l'étant a) à une longueur d'onde d'émission différente de ladite longueur d'onde d'émission des billes couvertes de la pluralité d'anticorps dirigés contre la protéine CD25s, et/ou b) à une intensité différente de l'intensité observée pour les billes couvertes de la pluralité d'anticorps dirigés contre la protéine CD25s.
13. 13. Kit de détection selon la revendication 12, caractérisé en ce que ladite autre protéine que la protéine CD25s est choisie dans le groupe constitué de l'interleukine 6 (IL-6) et l'interleukine 10 (IL-10).
14. 14. Méthode de pronostic d'un lymphome intraoculaire chez un patient, comprenant l'étape de mesure in vitro de la quantité de CD25s dans un prélèvement oculaire chez ledit patient, une concentration de CD25s supérieure à 200 pg/ml dans ledit prélèvement étant indicatrice d'un pronostic défavorable d'évolution de la maladie chez ledit patient.35
15. 15. Méthode selon la revendication 14, caractérisée en ce que le pronostic défavorable d'évolution de la maladie chez ledit patient est la probabilité de présenter une rechute dans l'année suivant l'arrêt du traitement (supérieure à 500 pg/ml).
16. 16. Méthode selon la revendication 14, caractérisée en ce que le pronostic défavorable d'évolution de la maladie chez ledit patient est la probabilité d'être réfractaire au traitement.
17. 17. Méthode selon la revendication 14, caractérisée en ce que l'on mesure également la quantité d'IL-6 dans ledit prélèvement.
18. 18. Méthode de diagnostic d'un lymphome du système nerveux central d'un patient comprenant l'étape de mesure in vitro de la quantité de CD25s dans un échantillon de liquide céphalorachidien dudit patient.
19. 19. Méthode selon l'une des revendications 14 à 18, caractérisé en ce que ladite étape de mesure in vitro de la quantité de CD25s est effectuée à l'aide d'un kit selon l'une des revendications 1 à 13.20