KR20050004784A - 항-ccr5 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 세포의 표면에 있는 CCR5와 결합하는 (i) 각각의 경쇄가 pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명된 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 경쇄 및 (ii) 각각의 중쇄가 pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명된 플라스미드 또는 pVg1:HuPRO140 (mutB+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명된 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 항-CCR5 항체, 또는 그 단편을 제시한다.
Description
인간 면역결핍 바이러스 타입 1(HIV-1)은 표적 세포속으로 침입하기 위해서 바이러스-세포막 융합을 유도한다(8, 15, 66). 바이러스와 세포 표면 사이에서의 최초의 고친화성 상호작용은 바이러스 표면 당단백질 gp120의 CD4 항체와의 결합이다(13, 30, 41, 42). 이것은 차례로 gp120에서의 구조 변화를 유도하여, gp120이 여러 키모카인 수용체 중 하나와 상호작용할 수 있도록 한다(4, 5, 21, 36). CC-키모카인 수용체 CCR5는 매크로파아지-계통(R5) 종에 대한 주요 공수용체이고, HIV-1의 성적 경로를 통한 전달에서 결정적인 역할을 한다(4, 5, 21, 36). T세포주-계통(X4) 바이러스는 표적 세포에 침입하기 위해 CXCR4를 사용하고, 일반적으로 질병 경과의 후기 또는 조직 배양에서 바이러스 전파의 결과로서 나타나지만, 항상 그런 것은 아니다(4, 5, 21, 36). 일부 초대 HIV-1 분리주는 비록 항상 동일한 효율로는 아니지만, 그들이 공수용체 양자를 사용할 수 있기 때문에 이중성(R5X4)이다(11, 57). gp120 코어 결정 구조의 분석과 관련된 돌연변이 연구는 gp120 상에 있는 공수용체 결합 부위가 여러 보존된 잔기를 포함한다는 것을 설명했다(32, 53, 65).
CCR5의 아미노-말단 도메인(Nt)에서의 티로신과 음전하를 띤 잔기가 HIV-1 융합 및 침입을 위해 그리고, 공수용체에 gp120 결합을 위해 필수적이라는 것이 설명되었다(6, 18, 20, 22, 28, 31, 52, 54). CCR5의 세포외 루프(ECL) 1-3에서의 잔기는 공수용체 기능을 위해 없어도 되지만, CCR5 도메인간 구조는 적절한 바이러스의 융합 및 침입을 위해 유지되어야만 한다(24). 이것은 gp120이 ECL상에서 산재된 표면과 상호작용을 형성하거나 Nt가 ECL에서의 잔기와 결합에 의해 기능 구조로 유지된다는 결론을 유도했다. 키메라 공수용체 및 항-CCR5 단클론 항체를 이용한 연구가 또한 바이러스 침입을 위한 세포외 루프의 중요성을 보여줬다(5, 54, 64).
CCR5 및 CXCR4에 특이적으로 결합하여 그들의 리간드와의 상호작용을 저해하는 분자는 공수용체의 구조/기능 관계를 더욱 규명하기 위한 강력한 도구이다. 그와 같은 화합물의 특성을 밝히는 것이 또한 바이러스 침입의 공수용체-매개 단계를 표적으로 하는 효율적인 치료제를 디자인할 때에 도움이 될 수 있다. 현재까지 확인된 CCR5 또는 CXCR4 공수용체 기능의 저해제는 사실상 다양하며 작은 분자(small molecules), 펩타이드, 키모카인(chemokines) 및 그들의 유도체, 및 단클론 항체(mAbs)를 포함한다. CXCR4 공수용체 기능을 방해함으로써 침입을 저해하는 작은 분자들의 작용 메카니즘은 잘 알려져 있지 않다(17, 49, 55, 68). 그와 같은 저해제 중 하나인 음이온성 작은 분자 AMD3100은 바이러스 침입을 저해하기 위하여 CXCR4의 제 4 막관통 (TM) 도메인 및 ECL2에서의 잔기에 의존하지만, 그것이 그렇게 하는 것이 CXCR4에 gp120 결합을 붕괴하는 것에 의해선지 아니면 막 융합을 유도하는 후기-결합 단계를 붕괴하는 것에 의해선지는 명확하지 않다(16, 34, 55). 현재까지, 어떠한 작은 분자들도 CCR5-매개 HIV-1 침입을 특이적으로 저해한다고 보고된 바 없었다. 키모카인에 의한 HIV-1 침입의 저해는 최소한 두개의 명확한 메카니즘에 의해 매개된다: gp120/공수용체 상호작용의 저해 및 키모카인/수용체 복합체의 내포화(3, 26, 59, 63). 변이형 AOP-RANTES는 또한 세포 표면으로 CCR5가 되돌아가는 것을 저해한다(40, 56). RANTES 9-68 및 Met-RANTES와 같은 변이형은 단지 gp120/CCR5 상호작용을 방지하며 CCR5를 낮추는 조절을 하지 않는다(67). SDF-1 변이형은 아마도 CXCR4에 의해 매개되는 바이러스 침입을 저해하기 위하여 유사한 메카니즘을 통해 작용할 것이다(12, 27, 39). 유일한 하나의 항-CXCR4 mAb인, 12G5는 그것의 항-바이러스 특성을 특징으로 한다. 바이러스 침입에 대한 12G5 저해의 효율성은 세포- 및 분리-의존적이라고 보고되었다(43, 58). 이 mAb는 CXCR4의 ECL2에 결합하지만, 그것이 어떠한 메카니즘에 의해 침입을 저해하는지는 알려져 있지 않다(7). 현재까지 HIV-1 침입을 효율적으로 방지하는 특징을 지닌 항-CCR5 mAb는 거의 없다(28, 64). 흥미롭게도, CCR5의 Nt 도메인에 그 항원결정기가 있고, gp120-결합 부위를 포함하는 mAb는 그 항원결정기가 ECL-2에 있는 mAb 2D7 보다 바이러스융합 및 침입을 저해함에 있어 덜 효율적이다. 2D7은 또한 CC-키모카인 활성을 상쇄한다(64).
PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 및 PA14로 명명된 6 종류의 쥐 mAb 패널을 분리하여 특징지었다. 모든 6종류의 mAb는 세포 유형-의존적인 다른 효율성으로 CCR5+ 세포에 특이적으로 결합했다. 항원결정기 지도 제작 연구는 mAb 결합을 위해 중요한 잔기를 확인했고 또한 CCR5 세포외 도메인의 접힘 및 상호작용에 대한 정보를 밝혔다. 모든 mAb가 HIV-1 융합 및 침입을 저해했지만, 융합 및 침입을 저해하는 mAb의 능력 및 CCR5+ 세포에 gp120/sCD4의 결합을 저해하는 능력 사이에 어떠한 상관 관계도 없었다.
본 출원은 2002, 2, 22에 출원되었고, 그 내용이 본 출원 내에 참조로 통합된 미국 출원 Serial No. 10/081,128의 일부계속출원 및 우선권 주장출원이다.
이 출원을 통해서, 다양한 논문들이 아라비아 숫자로 참조되었다. 이 논문들의 완전한 인용은 청구범위의 바로 앞에 위치한 명세서의 끝부분에서 발견될 것이다. 이 논문들의 내용은 본 발명이 속하는 기술분야를 더욱 상세히 설명하기 위해서 본 출원에 참조로 통합되었다.
도 1 :
항-CCR5 단클론 항체의 CCR5+세포에의 결합:
유세포 분석이 L1.2-CCR5+세포 및 새로 분리된 PHA/IL-2-자극된 PBMC의 표면에서 CCR5 단백질 발현을 검출하기 위해 사용되었다. 세포를 각 mAb의 포화 농도로 배양하였으며 PE-표지된 항-마우스 IgG 리포터 항체로 검출하였다. 대표 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 각 mAb에 대한 결과를 평균 형광 강도치(m.f.i.) 및 % gated 세포 양자로 나타내었다. PA8-PA12 및 PA14는 모든 IgG1 아형이고, 그들의 m.f.i.는 직접 비교할 수 있다. 2D7은 IgG2a이다.
도 2 :
mAb 및 바이러스 저해제의 다른 여러 조합에 대한 CI 값:
도 7의 제목에서 기술된 것과 같이, 실험을 바이러스 침입 저해제의 다른 여러 조합에 대해 수행하였다. 항-CCR5 mAb는 서로 서로, CC-키모카인 및 표적 세포에 HIV-1 부착을 저해하는 CD4-IgG2와 함께 조합하여 테스트하였다. PA11 및 PA12 농도 범위는 0-250 ㎍/ml였고; 2D7 및 PA14 농도 범위는 0-25 ㎍/ml였고; RANTES 농도 범위는 0-250 ng/ml였고; CD4-IgG2 농도 범위는 0-25㎍/ml였다. 융합 또는 침입의 50% 및 90%를 저해하기 위하여 요구되는 단일-제제 또는 그들의 혼합물의 농도는 조합 지수(CI)로 알려진 용어로 정량적으로 비교되었다.
도 3:
항-CCR5 mAb에 의한 세포-세포 융합, 바이러스 침입 및 gP120/sCD4 결합의 저해를 위한 IC50값:
비교 목적을 위하여 우리는 항-CCR5 mAb가 테스트된 다른 여러 에세이에서 얻어진 IC50값을 요약하였다. IC50값은 융합, 침입 또는 결합의 >90%을 저해할 수 있는 mAb에 대해서만 단지 계산하였다.
도 4:
항-CCR5 mAb의 항원결정기 지도작성:
두 종류의 컬러 염색 프로토콜을 HA 펩타이드로 C-말단에 태그된 돌연변이 CCR5 단백질에 mAb의 결합을 측정하기 위해 사용하였다. CCR5 점 돌연변이를 발현하는 HeLa 세포를 각 mAb의 포화 농도로 배양한 후 PE-표지된 항-마우스 IgG로 검출하였다. 세포 표면 공수용체 발현을 FITC 표지된 항-HA mAb로 세포를 이중 염색함으로써 측정하였다. 4개의 격자는 CCR5의 4개의 세포외 도메인에 해당한다. 모든 격자의 첫번째 열은 해당 CCR5 세포외 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NOS:1-4)을 나타낸다. 각 잔기의 알라닌 변이체에 대한 항-CCR5 mAb의 결합을 물질 및 방법에서 기술한 것처럼 야생형 CCR5에 대한 결합 백분율로 나타내었다.
도 5:
항-CCR5 mAb에 의한 CCR5+세포로 칼슘 동원의 저해:
L1.2-CCR5+세포를 Indo-1AM에 로딩하였고, 항-CCR5 mAb 또는 PBS로, 그리고 이후 RANTES로 연속적으로 자극하였다(a). 형광 변화를 형광분광계로 측정하였고, 대표 실험의 결과를 기록하였다. PA14 및 2D7에 의한 칼슘 유동 저해를 mAb 농도의 광범위에 걸쳐 테스트하였다(b). 결과를 칼슘 유입의 % 저해 = [1-(mAb 존재하에서 상대적인 형광치 ÷ mAb 부존재하에서 상대적인 형광치)]×100%로 도표화하였고, 결과는 3회의 독립적인 실험으로부터의 평균값이다.
도 6:
항-CCR5 mAb에 의한 CCR5 공수용체 기능의 저해:
항-CCR5 mAb에 의한 세포-세포 융합의 저해를 RET 에세이에서 테스트하였다(a). PA8-PA12의 0-250㎍/ml, 또는 PA14 또는 2D7의 0-25㎍/ml를 HeLa-EnvJR-FL +및 PM1 세포의 혼합에 첨가하였고, 각각 F18 및 R18로 표지하였다. 배양한지 4시간 이후에 형광 RET를 측정하였다. 결과는 3회의 독립적인 실험의 평균값이고 융합의 %저해 = [1-(mAb 존재하에서 % RET ÷ mAb 부존재하에서 % RET)]×100%로서 나타내었다. 항-CCR5 mAb에 의한 HIV-1 침입의 저해를 복제 루시페라제에 기초한 침입 에세이 단회로 테스트했다(b). U87-CD4+CCR5+세포를 PA8-PA12의 0-250㎍/ml, 또는 PA14 또는 2D7의 0-25㎍/ml 존재하에서 JR-FL 외피를 지니는 NLluc+env-리포터 바이러스로 감염시켰다. 루시페라제 활성(상대적인 광 단위, r.l.u.)을 감염 72시간 후 세포 용해물에서 측정하였다. 결과는 대표실험으로부터 결과이고 침입의 %저해 = [1-(mAb 존재하에서 r.l.u. ÷ mAb 부존재하에서 r.l.u.)] × 100%로서 나타내었다. L1.2-CCR5+세포에 대한 비오틴화된 [b] gp120, sCD4 및 b-gp120-CD4 복합체의 결합(c). R5 바이러스 HIV-1JR-FL로부터 유도된 gp120이 sCD4의 등몰량으로 복합체를 형성할 때 강한 결합이 관찰된다. X4 바이러스 HIV-1LAI로부터 유도된 gp120에 대해서 또는 sCD4의 부존재하에서는 어떠한 결합도 관찰되지 않았다. CCR5-L1.2 세포에 대한 백그라운드 결합을 모든 곡선으로부터 제외했다. L1.2-CCR5+세포에 대한 gp120/sCD4 결합의 저해를 각 항체의 다양한 농도 존재하에서 테스트하였다(d). 세포를 항-CCR5 mAb가 든 96-웰 플레이트에서 예비 배양한 후 비오틴화된 gp120/sCD4의 포화 농도로 배양하였다. 마지막으로, PE-표지된 스트렙트아비딘의 세포에 대한 결합을 형광 플레이트 리더를 사용하여 측정했다. 결과는 대표 실험으로부터의 결과이고 gp120/sCD4 결합의 %저해 = [1-(mAb 존재하에서 m.f.i. ÷ mAb 부존재하에서 m.f.i.)]×100%로 나타내었다.
도 7:
PA12 및 2D7에 의한 세포-세포 융합의 상승적 저해:
투여-반응 곡선을 개별적으로 및 조합하여 사용된 mAb에 대해 얻었다. PA12의 0-50㎍/ml, 2D7의 0-25㎍/ml 또는 2:1 비율의 PA12 및 2D7 조합을 각각 R18 및 F18로 표지된 HeLa-EnvJR-FL +및 PM1 세포의 혼합에 첨가하였다. 형광 RET를 배양 4시간 이후에 측정하였다. 결과는 융합의 %저해로 나타내었고, 3회의 독립적인 실험으로부터 평균값이다. 데이터를 하기 식으로 표현될 수 있는 중앙값 효과 원리를 사용하여 분석하였다.
이 때, f는 영향을 받은/감염된 분율이고, c는 농도이고, K는 중앙값 효과를 나타내기 위해 요구되는 약제의 농도이고, m은 투여량-반응 곡선의 모양을 나타내는 실험계수이다. 수학식 (1)은 m=1인 미카엘리스-멘톤 효소 카이네틱스, 랭뮈어 흡착 등온식, 및 헨더슨-해셀바흐 이온화 등온식을 기술하는 공식의 일반화된 형태이다. 본 경우에, K는 IC50값과 같다. K 및 m은 투여량-반응 곡선을 곡선 근사함으로써 결정되며, 수학식(1)은 주어진 f에 대한 c의 계산을 허용하도록 재정리되었다. K 및 c에 대한 가장 적합한 매개변수 값은 PA12에 대해서는 8.8㎍/ml 및 0.54, 2D7에 대해서는 0.36㎍/ml 및 0.68, 및 그들의 조합에 대해서는 0.11㎍/ml 및 1.1이다. 이 곡선들은 도표화되었고, 실험 및 이론 사이에 합리적인 적합도를 나타낸다.
도 8:
이 그림은 본 발명에 의한 마우스 항-CCR5 항체 PA14의 인간화 변형의 경쇄 변이부의 아미노산 서열(SEQ ID NO:6) 및 동일물을 암호화하는 핵산 서열(SEQ ID NO:5)을 나타낸다. SEQ ID NO:7은 SEQ ID NO:6에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 SEQ ID NO:5의 영역과 동일하다. 이 경쇄 변이부는 여기에서 PRO 140 #1 및 #2로 명명된 항체에서 존재한다. 상보성-결정 영역("CDRs")은 밑줄처리하였다.
도 9 :
이 그림은 본 발명에 의한 마우스 항-CCR5 항체 PA14의 인간화 변형의 제 1 중쇄 변이부의 아미노산 서열(SEQ ID NO:9) 및 동일물을 암호화하는 핵산 서열(SEQ ID NO:8)을 나타낸다. SEQ ID NO:10은 SEQ ID NO:9에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 SEQ ID NO:8의 영역과 동일하다. 이 중쇄 변이부는 여기에서 PRO 140 #2로 명명된 항체에서 존재한다. CDR은 밑줄처리하였다.
도 10:
이 그림은 본 발명에 의한 마우스 항-CCR5 항체 PA14의 인간화 변형의 제 2 중쇄 변이부의 아미노산 서열(SEQ ID NO:12) 및 동일물을 암호화하는 핵산 서열(SEQ ID NO:11)을 나타낸다. SEQ ID NO:13은 SEQ ID NO:12에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 SEQ ID NO:11의 영역과 동일하다. 이 중쇄 변이부는 여기에서 PRO140 #1으로 명명된 항체에서 존재한다. CDR은 밑줄처리하였다.
도 11:
인간화 CCR5 항체의 단회 투여는 생체내에서 바이러스 양를 유효하게 감소시킨다:
SCID 마우스를 정상 인간의 PBMC를 사용하여 재구성하였고 HIV-1JR-CSF를 감염시켰다. 바이러스의 안정화 상태에 도달했을 때, 동물들을 인간화 CCR5 항체(PRO 140) 또는 아이소타입 컨트롤 항체를 단회 1 밀리그램 i.p. 투여 처리하였고, 플라즈마 HIV RNA에 대해 조사하였다(Roche Amplicor Assay).
도 12 :
바이러스 양에서 지속된 감소:
SCID 마우스를 정상 인간의 PBMC로 재구성하였고 HIV-1JR-CSF를 감염시켰다. 바이러스의 안정화 상태에 도달했을 때, 동물들을 인간화 CCR5 항체(PRO 140)를 3일에 한번씩 0.1 mg 투여 i.p. 처리하였고 플라즈마 HIV RNA에 대해 조사하였다(Roche Amplicor Assay).
도 13:
본 발명에 의하여 준비된 CCR5 항체(PRO 140)를 사용한 경우 림프구의 고갈은 없었음을 설명한다.
도 14:
인간화 CCR5 항체 (PRO140)는 CCR5-매개 HIV-1 세포-세포 융합을 유효하게 저해한다.
쥐 CCR5 항체를 상보성-결정 부위(CDR) 이식 및 골격 치환 방법을 사용하여 인간화하였다. 인간화 CCR5 항체(PRO 140 #1 및 PRO 140 #2)는 Sp2/0 세포에서 발현되었고 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하였으며 기술된 것처럼 HIV-1JR-FL외피-매개 막 융합의 복제를 저해하는 능력에 대해 테스트되었다(Litwin, et al., J, Virol., 70:6437, 1996).
도 15 :
인간화 CCR5 항체 (PRO140)는 유효한, HIV-1의 아형-비의존적 저해를 매개한다.
본 발명에 의한 CCR5 항체(PRO 140 #1 및 #2)를 기술된 것처럼 말초혈단핵구(PBMCs)에서 야생형 HIV-1의 복제를 저해하는 능력에 대해 테스트하였다(Trkola 등., J. Virol., 72:396, 1998). 바이러스 복제의 정도를 7일 PBMC 배양 부유물의 p24 항원 함량을 검출함으로써 측정하였다.
도 16:
이 그림은 Co et al., J.Immunol., 148:1149,1992에서 기술된 것처럼 인간 카파 상수 영역 뿐만아니라 도 8에서 나타난 경쇄 변이부를 암호화하는 플라스미드 pVK:HuPRO140의 지도를 제공한다.
도 17:
이 그림은 Co et al., Supra에서 기술된 것처럼 인간 IgG4의 인간 중쇄 불변부, CH1, 힌지(hinge), CH2, 및 CH3 뿐만 아니라 도 9에서 나타난 중쇄 변이부를 암호화하는 플라스미드 pVg4-HuPRO140 HG2의 지도를 제공한다.
도 18:
이 그림은 Co et al., Supra에서 기술된 것처럼 인간 IgG4의 인간 중쇄 불변부, CH1, 힌지(hinge), CH2 및 CH3 뿐만 아니라 도 10에서 나타난 중쇄 변이부를 암호화하는 플라스미드 pVg4-HuPRO140 (mut B+D+I)의 지도를 제공한다.
도 19:
HuPRO140은 HIV-1을 저해하지만 RANTES 신호전달을 저해하지 않는다.
본 발명에 의한 PRO140 항체를 L1.2-CCR5 세포에서 RANTES-유도 칼슘 동원을 저해하는 능력에 대해 테스트하였다(Olson, et al., J.Virol., 72:396, 1998). 이 그림은 인간화 CCR5 항체(huPRO140)가 HIV-1을 저해하지만 RANTES 신호전달을 저해하지 않는다는 것을 보여준다.
본 발명의 요약
본 발명은 (i) 각각의 경쇄가 pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명된 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 경쇄 및 (ii) 각각의 중쇄가 pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명된 플라스미드 또는 pVg1:HuPRO140(mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명된 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하며, 인간 세포의 표면에 있는 CCR5와 결합하는 항-CCR5 항체 또는 그와 같은 항체의 단편를 제공한다.
본 발명은 또한 각각의 경쇄가 연속적인 아미노산을 포함하며, 그 아미노산이 SEQ ID NO:6에 기재된 서열을 가지는 2개의 경쇄 및 각각의 중쇄가 연속적인 아미노산을 포함하며, 그 아미노산이 SEQ ID NO:9에 기재된 서열을 가지는 2개의 중쇄를 포함하는 항-CCR5 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 각각의 경쇄가 연속적인 아미노산을 포함하며, 그 아미노산 이 SEQ ID NO:6에 기재된 서열을 가지는 2개의 경쇄 및 각각의 중쇄가 연속적인 아미노산을 포함하며, 그 아미노산이 SEQ ID NO:12에 기재된 서열을 가지는 2개의 중쇄를 포함하는 항-CCR5 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 연속적인 아미노산을 포함하며, 그 아미노산이 SEQ ID NO:6에 기재된 서열을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다. 해당 실시예에서, 상기 핵산은 SEQ ID NO:5에 기재된 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 연속적인 아미노산을 포함하며, 그 아미노산이 SEQ ID NO:9에 기재된 서열을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다. 해당 실시예에서, 상기 핵산은 SEQ ID NO:8에 기재된 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 연속적인 아미노산을 포함하며, 그 아미노산이 SEQ ID NO:12에 기재된 서열을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다. 해당 실시예에서, 상기 핵산은 SEQ ID NO:11에 기재된 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 상기에서 기술된 것과 같은, 최소한 하나의 항-CCR5 항체 또는 그 단편을 담체와 함께 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 방사성 동위원소, 독소, 폴리에틸렌 글리콜, 세포독성제제 및/또는 검출가능 표지와 같은 물질을 부착하고 있는 상기 항-CCR5 항체 또는 그단편을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 (i) 각각의 경쇄가 pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명된 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 경쇄 및 (ii) 각각의 중쇄가 pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명된 플라스미드 또는 pVg1:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명된 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하며, CD4+ 세포의 표면에 있는 CCR5에 결합하는 항체 또는 그와 같은 항체의 단편을, HIV-1 또는 HIV-1 감염 세포의 CD4+ 세포에 대한 융합을 저해하는 양 및 조건하에서, CD4+ 세포와 접촉시켜 CD4+ 세포의 HIV-1 감염을 저해하는 단계를 포함하는 CD4+ 세포의 감염을 저해하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (i) 각각의 경쇄가 pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명된 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 경쇄 및 (ii) 각각의 중쇄가 pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명된 플라스미드 또는 pVg1:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명된 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하며, 인간 세포의 표면에 있는 CCR5와 결합하는 항-CCR5 항체 또는 그와 같은 항체의 단편의 유효한 HIV-1 치료 투여량을, HIV-1 감염된 환자를 치료하기에 유효한 조건하에서, 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 HIV-1으로 고통받는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (i) 각각의 경쇄가 pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명된 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 경쇄 및 (ii) 각각의 중쇄가 pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명된 플라스미드 또는 pVg1:HuPRO140(mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명된 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하며, 인간 세포의 표면에 있는 CCR5와 결합하는 항-CCR5 항체 또는 그와 같은 항체의 단편의 유효한 HIV-1 감염-예방 투여량을, 환자에게서 HIV-1 감염을 예방하기에 유효한 조건하에서, 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자가 HIV-1에 감염되는 것을 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (i) 각각의 경쇄가 pVK:HuPRO140-VK(ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명된 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 경쇄 및 (ii) 각각의 중쇄가 pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명된 플라스미드 또는 pVg1:HuPRO140(mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명된 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하며, 인간 세포의 표면에 있는 CCR5와 결합하는 항-CCR5 항체 또는 그와 같은 항체의 단편을 포함하며, 최소한 하나의 폴리머와 결합된 항-CCR5 항체 복합체를 제공한다.
본 발명은 또한 HIV-1 감염 위험에 있는 환자에게 HIV-1에 의한 상기 환자의 CCR5+ 세포의 감염을 저해하기에 유효한 양 및 조건으로 상기에서 기술된 복합체를 투여하는 단계를 포함하는 HIV-1에 의한 CCR5+ 세포의 감염을 저해하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 HIV-1-감염된 환자에게 상기 환자의 HIV-1 감염을 치료하기에 유효한 양 및 조건으로 상기에서 기술된 복합체를 투여하는 단계를 포함하는 환자에게서 HIV-1 감염을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO:9에 기재된 아미노산 서열을 가지는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO:6에 기재된 아미노산 서열을 가지는 2개의 경쇄를 포함하는 항-CCR5 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 최소한 하나의 벡터, 및 상기 항-CCR5 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 최소한 하나의 벡터의 최소한 두개의 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO:12에 기재된 아미노산 서열을 가지는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO:6에 기재된 아미노산 서열을 가지는 2개의 경쇄를 포함하는 항-CCR5 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 최소한 하나의 벡터, 및 상기 항-CCR5 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 최소한 하나의 벡터의 최소한 두 개의 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO:9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항-CCR5 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO:12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항-CCR5 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명된 플라스미드에 의해 암호화되는 2개의 경쇄 및 pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명된 플라스미드 또는 pVg1:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명된 플라스미드에 의해 암호화되는 2개의 중쇄를 포함하는 항체의 생산을 허용하는 조건하에서 (i) pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호PTA-4097)로 명명된 플라스미드 및 (ii) pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명된 플라스미드 또는 pVg1:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명된 플라스미드를 내포하고 있는 숙주 세포를 배양함으로써, 항-CCR5 항체를 제조하는 단계를 포함하는 항-CCR5 항체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 a) (i) pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명된 플라스미드 및 (ii) pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명된 플라스미드 또는 pVg1:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명된 플라스미드로 숙주 세포를 형질전환하는 단계; 및 b) pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명된 플라스미드에 의해 암호화되는 2개의 경쇄 및 pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명된 플라스미드 또는 pVg1:HuPRO140(mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명된 플라스미드에 의해 암호화되는 2개의 중쇄를 포함하는 항체의 생산을 허용하는 조건하에서 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양함으로써, 항-CCR5 항체를 제조하는 단계를 포함하는 항-CCR5 항체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 항-CCR5 항체의 제조방법에 사용되는 킷트를 제공한다. 상기 킷트는 a) SEQ ID NO:6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항-CCR5 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터; 및 b) SEQ ID NO:9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항-CCR5 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터, 또는 SEQ ID NO:12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항-CCR5 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함한다.
발명의 상세한 설명:
도 16, 18, 및 17에서 pVK-HuPRO140, pVg4-HuPRO140(mut B+D+I) 및 pVg4-HuPRO140 HG2로 각각 언급된 HuPRO140-VK, HuPRO140(mut B+D+I)-VH 및 HuPRO140 HG2-VH로 명명된 플라스미드는 우편번호 20108, 미국, 버지니아주, 매너사스(Manassas)에 있는 ATCC(American Type Culture Collection)에 2002년 2월 22일에 각각 ATCC 수탁번호 PTA 4097, PTA 4099 및 PTA 4098로 기탁되었다. 이들 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트조약의 조항에 따라 행해졌다(부다페스트 조약).
본 발명은 HIV-1 감염 저해를 위한 상승적인 유효량의 최소한 2 종류의 화합물을 포함하는 HIV-1 감염을 저해하는 조성물을 제공하며, 이 때 상기 화합물 중 최소한 하나는 HIV-1과 HIV-1 융합 공수용체 사이의 생산적인 상호작용을 막는다.
여기에서 사용된 "조성물"은 혼합물을 의미한다. 상기 조성물은 환자에게 구강, 직장, 질내, 국소, 코, 눈 또는 비경구 투여를 위해 적합한 것들을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 여기에서 사용된 "비경구"는 피하, 정맥, 근육내 또는 흉골내 주사 또는 주입 기법을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
여기에서 사용된 "HIV-1"은 인간 면역결핍 바이러스 타입-1을 의미한다. HIV-1은 세포외 바이러스 입자 및 HIV-1 감염된 세포에서 발견되는 HIV-1의 형태를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
여기에서 사용된 "HIV-1 감염"은 HIV-1 또는 HIV-1 외피 당단백질+세포와 표적 세포 막의 융합과 같은 방법에 의한 표적 세포로 HIV-1 유전 정보의 도입을 의미한다. 표적 세포는 환자의 체세포일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 표적 세포는 인간 환자로부터의 체세포이다.
여기에서 사용된 " HIV-1 감염을 저해하는 것"은 상기 조성물없이 도입된 양과 비교해서 표적 세포군으로 도입된 HIV-1 유전 정보의 양의 감소를 의미한다.
여기에서 사용된 "화합물"은 분자적 실체를 가진 것을 의미하는 것으로, 펩티드, 폴리펩티드 및 다른 유기 또는 무기 분자 및 그 조합을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
여기에서 사용된 "상승적으로 유효한"은 조합되어 사용되었을 때 화합물의 조합된 효과가 개별적으로 사용되었을 때 그들의 상가적인 효과(additive effect)보다 훨씬 큰 것을 의미한다.
여기에서 사용된 "생산적인 상호작용"은 상기 HIV-1 또는 HIV-1 외피 당단백질+세포와 공수용체를 지니는 막의 융합을 유도하는 HIV-1 및 HIV-1 공수용체의 상호작용을 의미한다.
여기에서 사용되는 "생산적인 상호작용을 방지한다"는 상호작용의 양이 상기 화합물없이 일어날 수 있는 양과 비교했을 때 감소된다는 것을 의미한다. 상기 상호작용은 공수용체의 발현, 집합, 구조, 또는 연관 상태를 변경함으로써 또는 공수용체 또는 HIV-1 상의 상호작용 영역을 변경하거나 가림으로써 방지될 수 있다.
여기에서 사용되는 "HIV-1 융합 공수용체"는 수용체를 발현하는 표적세포와 HIV-1 또는 HIV-1 외피 당단백질+세포 사이의 융합을 매개하는 세포 수용체를 의미한다. HIV-1 융합 공수용체는 CCR5, CXCR4 및 다른 키모카인 수용체를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 HIV-1 또는 HIV-1 외피 당단백질+세포의 표적세포에의 융합을 저해하는 조성물을 제공하는데, 이는 HIV-1 또는 HIV-1 외피 당단백질+세포의 표적세포에 대한 융합을 저해하는데 상승적으로 유효한 양의 최소한 2개의 화합물을 포함하며, 이 때 상기 화합물 중 최소한 하나는 HIV-1 및 HIV-1 융합 공수용체 사이의 생산적인 상호작용을 저해한다 .
여기에서 사용된 "융합"은 포유류 세포 또는 HIV-1과 같은 바이러스에서 발견되는 지질 이중막의 접합 또는 합체를 의미한다. 이 과정은 표적 세포에 대한 HIV-1의 부착과는 구별된다. 부착은 융합 공수용체가 아닌 인간 CD4 수용체에 HIV-1 외부 당단백질의 결합에 의해 매개된다.
여기에서 사용된 "저해한다"는 조성물없이 일어나는 양과 비교해서 양이 감소된다는 것을 의미한다.
여기에서 사용된 "표적 세포"는 HIV-1 또는 HIV-1 감염된 세포와 융합할 수 있거나 HIV-1 또는 HIV-1 감염된 세포에 의해 감염될 수 있는 세포를 의미한다.
여기에서 사용된 "키모카인"은 백혈구 활동을 자극할 수 있는 사이토카인을 의미한다. 그들은 두개의 아미노 말단 시스테인 잔기가 바로 인접해 있는지, 하나의 아미노산에 의해 분리되어 있는지에 따라 cys-cys 또는 cys-X-cys로서의 특징을 지닐 수 있다. 그것은 RANTES, MIP-1α, MIP-1β, SDF-1 또는 HIV-1 감염을 저해하는 또 다른 키모카인을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
상기 조성물에 대한 한 실시예에서, 공수용체는 키모카인 수용체이다. 상기 조성물에 대한 바람직한 실시예에서, 키모카인 수용체는 CCR5 또는 CXCR4이다. 여러 종류의 다른 키모카인 및 관련된 수용체가 HIV 공수용체로서 기능하는 것으로 알려져 있으며, CCR2, CCR3, CCR8, STRL33, GPR-15, CX3CR1 및 APJ를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다(69).
여기에서 사용된 "키모카인 수용체"는 키모카인을 결합하는 7-막관통 세포 표면 단백질과 동족의 일원이다.
여기에서 사용되는 "CCR5"는 키모카인의 C-C기의 일원과 결합하고 그것의 아미노산 서열이 Genbank 수탁번호 1705896 및 관련된 다형 변이체로 제공되는 것을 포함하는 키모카인 수용체이다.
여기에서 사용되는 "CXCR4"는 키모카인의 C-X-C 기의 일원과 결합하고 그것의 아미노산 서열이 Genbank 수탁번호 400654 및 관련된 다형 변이체로 제공되는 것을 포함하는 키모카인 수용체이다.
상기 조성물에 대한 한 실시예에서, 상기 화합물의 최소한 하나는 비펩티드성 분자이다. 한 실시예에서, 비펩티드성 분자는 비사이클램(bicyclam) 화합물 AMD3100이다(16).
여기에서 사용된, "비펩티드성 분자"는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산의 직쇄상 서열의 전체와 일치하지 않는 분자를 의미한다. 그러나, 비펩티드성 분자는 하나 이상의 펩티드 결합을 포함할 수 있다.
상기 조성물에 대한 하나의 실시예에서, 상기 화합물 중 최소한 하나는 항체이다. 한 실시예에서, 항체는 단클론 항체이다. 또 다른 실시예에서, 항체는 항-키모카인 수용체 항체이다. 한 실시예에서, 항체는 항-CXCR4 항체이다. 또 다른 실시예에서, 항 CXCR4 항체는 12G5이다(43). 바람직한 실시예에서, 항체는 항-CCR5 항체이다. 항-CCR5 항체는 PA8, PA9, PA10, PA11, PA12, PA14 및 2D7을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 이 조성물에서 상기 화합물은 적절한 비율로 있다. 이 비율은 1:1 ~ 1000:1의 범위이다.
단클론 항체 PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 및 PA14를 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 요구에 따라 이를 충족시키기 위해 우편번호 10801, 버지니아주 매너사스 대학가, 20110-2209에 있는 ATCC(American Type Culture Collection)에 1998년 12월 2일에 하기의 수탁 번호로 기탁했다.: ATCC 수탁 번호 HB-12605(PA8), ATCC 수탁 번호 HB-12606(PA9), ATCC 수탁 번호 HB-12607(PA10), ATCC 수탁 번호 HB-12608(PA11), ATCC 수탁 번호 HB-12609(PA12), ATCC 수탁 번호 HB-12610(PA14).
상기 조성물에 대한 또 다른 실시예에서, 2 이상의 상기 화합물은 항체이다. 본 발명에 대한 한 실시예에서, 항체는 PA8, PA9, PA10, PA11, PA12, PA14 및 2D7을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 이 조성물에서 항체는 적절한 비율로 있다. 비율은 1:1 ~ 50:1의 범위이다.
여기에서 사용된 "항체"는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하며 항원을 인식하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 면역글로불린 분자는 IgA, 분비 IgA, IgG, 및 IgM을 포함하지만 이에 한정되지 않는 일반적으로 알려진 종류 중 어느 것으로부터 유래될 수 있다. IgG 하위 분류는 또한 본 기술분야에서 당업자에게 잘 알려져 있으며, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 예로서, 그것은 자연적으로 생성되는 및 비자연적으로 생성되는 항체를 모두 포함한다. 특히, "항체"는 다클론성 및 단클론성 항체, 그리고 그 1가 및 2가 단편을 포함한다. 나아가, "항체"는 키메라 항체, 완전 합성 항체, 단일쇄 항체, 및 그 단편들을 포함한다. 선택적으로, 항체는 검출가능 마커로 표지될 수 있다. 검출가능 마커는 예를 들면, 방사성 또는 형광 마커를 포함한다. 항체는 인간의 또는 인간 이외의 항체일 수 있다. 인간 이외의 항체는 사람에서의 면역원성을 감소시키기 위해 재조합 기법에 의해 인간화(humanized)될 수 있다. 항체를 인간화하는 방법은 본 기술분야에서의 당업자에게 알려져 있다.
여기에서 사용된 mAb로 명명된 "단클론 항체"는 그 1차 서열이 근본적으로 동일하고 동일한 항원 특이성을 나타내는 항체 분자를 설명하기 위해 사용되었다. 단클론 항체는 하이브리도마, 재조합, 트랜스제닉 또는 본 기술분야에서의 당업자에게 알려진 다른 기법들에 의해 제조될 수 있다.
여기에서 사용된 "항-키모카인 수용체 항체"는 키모카인 수용체상에서 항원결정기를 인식하여 결합하는 항체를 의미한다. 여기에서 사용된 "항-CCR5 항체"는 CCR5 키모카인 수용체상에서 항원결정기를 인식하여 결합하는 단클론 항체를 의미한다.
여기에서 사용된 "적절한 비율"은 상기 화합물이 상승적인 효능을 나타내는 질량비 또는 몰비를 의미한다.
상기 조성물에 대한 한 실시예에서, 최소한 한 화합물은 키모카인 또는 키모카인 유도체이다. 키모카인은 RANTES, MIP-1α, MIP-1β, SDF-1 또는 그 조합을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 이 조성물에서, 상기 화합물은 적절한 비율로 있다. 키모카인 유도체는 Met-RANTES, AOP-RANTES, RANTES 9-68, 또는 그 조합을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
여기에서 사용된 "키모카인 유도체"는 화학적으로 변형된 키모카인을 의미한다. 화학적 변형은 아미노산 치환, 첨가 또는 결실, 비펩티드 첨가 또는 산화를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 기술분야에서 당업자는 그와 같은 유도체를 만들 수 있을 것이다.
상기 조성물에 대한 또 다른 실시예에서, 최소한 한 화합물은 항체이고 최소한 한 화합물은 키모카인 또는 키모카인 유도체이다. 이 조성물에서 상기 화합물은 적절한 비율로 있다. 비율은 100:1 ~ 1000:1 의 범위이다.
상기 조성물의 또 다른 실시예에서, 최소한 하나의 화합물은 HIV-1 외피 당단백질의 gp41 서브유닛에 결합한다. 한 실시예에서, 최소한 하나의 화합물은 HIV-1 침입의 T-20 펩티드 저해제이다(70).
상기 조성물의 또 다른 실시예에서, 상기 화합물 중 최소한 하나는 표적 세포에 대한 HIV-1의 부착을 저해한다. 한 실시예에서, 최소한 한 화합물은 CD4에 결합한다. 한 실시예에서, 최소한 한 화합물은 HIV-1 외피 당단백질이다. 한 실시예에서, 최소한 하나의 화합물은 항-CD4 항체이다. 한 실시예에서, 최소한 하나의 화합물은 HIV-1 외피 당단백질에 결합한다. 한 실시예에서, 최소한 하나의 화합물은 HIV-1 외피 당단백질에 결합하는 항체이다. 한 실시예에서, 최소한 하나의 화합물은 CD4-계 단백질이다. 한 실시예에서 최소한 하나의 화합물은 CD4-IgG2이다.
상기 조성물에 대한 또 다른 실시예에서, 최소한 하나의 화합물은 항체이고 최소한 하나의 화합물은 HIV-1 외피 당단백질에 결합한다. 한 실시예에서, 상기 화합물은 CD4-계 단백질이다. 한 실시예에서, 상기 화합물은 CD4-IgG2이다. 이 조성물에서, 상기 화합물은 적절한 비율로 있다. 그 비율은 1:1 ~ 10:1의 비율이다.
여기에서 사용된, "부착"은 융합 공수용체가 아닌 인간 CD4 수용체에 HIV-1 외피 당단백질의 결합에 의해 매개되는 과정을 의미한다.
여기에서 사용된 "CD4"는 세포질 도메인, 소수성 막관통 도메인, 및 HIV-1 gp120 외피 당단백질에 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 성숙된, 원래의 막결합 CD4 단백질을 의미한다.
여기에서 사용된 " HIV-1 외피 당단백질"은 gp120 표면 단백질, gp41 막관통 단백질 및 올리고머와 그 전구체를 포함하는 HIV-1 암호화 단백질을 의미한다.
여기에서 사용된 "CD4-계 단백질"은 HIV-1 gp120 외피 당단백질과 복합체를 형성하기 위해 CD4에 대해 요구되는 CD4의 부분과 일치하는 아미노산 잔기 중 최소한 하나의 서열을 포함하는 어떤 단백질을 의미한다.
여기에서 사용된 "CD4-IgG2"는 ATCC 수탁번호 75193 및 75194로 기탁된 발현벡터에 의해 암호화되는 이종4량체의 CD4-인간 IgG2 융합 단백질을 의미한다.
상기 조성물에 대한 하나의 실시예에서, 상기 화합물 중 최소한 하나는 CCR5 항원결정기에 결합하는 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시예에서, 항원결정기는 N-말단, 3개의 세포외 루프 영역 중 하나 또는 그 조합에 위치한다. 한 실시예에서, 항원결정기는 N-말단에 위치한다. 상기 항원결정기는 N-말단에서 N13 및 Y15를 포함할 수 있다. 항원결정기는 N-말단에서 Q4를 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 항원결정기는 N-말단 및 제 2 세포외 루프에서 잔기를 포함한다. 항원결정기는 N-말단에서 D2, Y3, Q4, S7, P8 과 N13 및 제 2 세포외 루프에서 Y176 및 T177을 포함할 수 있다. 항원결정기는 N-말단에서 D2, Y3, Q4, P8 과 N13 및 제 2 세포외 루프에서 Y176 및 T177을 포함할 수 있다. 항원결정기는 N-말단에서 D2 및 제 2 세포외 루프에서 R168 및 Y176을 포함할 수 있다. 한 실시예에서, 항원결정기는 제 2 세포외 루프에 위치한다. 항원결정기는 제 2 세포외 루프에서 Q170 및 K171을 포함할 수 있다. 항원결정기는 제 2 세포외 루프에서 Q170 및 E172를 포함할 수 있다.
여기에서 사용되는 하기 표준 약어는 특정 아미노산을 나타내기 위해 명세서 전반에 걸쳐 사용되었다.
A=ala=알라닌(alanine) R=arg=아르기닌(arginine)
N=asn=아스파라긴(asparagine) D=asp=아스파르트산(aspartic acid)
C=cys=시스테인(cysteine) Q=gln=글루타민(glutamine)
E=glu=글루탐산(glutamic acid) G=gly=글리신(glycine)
H=his=히스티딘(histidine) I=ile=이소류신(isoleucine)
L=leu=류신(leucine) K=lys=리신(lysine)
M=met=메티오닌(methionine) F=phe=페닐알라닌(phenylalanine)
P=pro=프롤린(proline) S= ser=세린(serine)
T=thr=트레오닌(threonine) W=trp=트립토판(tryptophan)
Y=tyr=티로신(tyrosine) V=val=발린(valine)
여기서 사용된 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산을 의미한다.
여기에서 사용된 "항원결정기"는 항체 또는 다른 화합물을 결합하기 위한 표면을 형성하는 한 분자 또는 분자들의 부분을 의미한다. 항원결정기는 접촉 또는 비접촉 아미노산, 탄수화물 또는 다른 비펩티드성 일부분들 또는 올리고머-특이적 표면을 포함할 수 있다.
여기에서 사용된 "N-말단"은 시작 메티오닌 및 제 1 막관통 영역에 걸친 아미노산 서열을 의미한다.
여기에서 사용된 "제 2 세포외 루프"는 표면에서 제시되는 제 4 및 제 5 막관통 영역에 걸친 아미노산 서열을 의미한다.
상기 조성물에 대한 한 실시예에서 상기 화합물 중 최소한 하나는 항체의 경쇄를 포함한다. 상기 조성물에 대한 또 다른 실시예에서, 상기 화합물의 최소한 하나는 항체의 중쇄를 포함한다. 상기 조성물에 대한 또 다른 실시예에서, 상기 화합물의 최소한 하나는 항체의 Fab 부분을 포함한다. 상기 조성물의 또 다른 실시예에서, 상기 화합물의 최소한 하나는 항체의 변이부를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 항체는 아미노산의 개입성 서열을 통해 유전적으로 연결된 중쇄 및 경쇄 변이부를 포함하는 단일 폴리펩티드 또는 "단일쇄" 항체로서 제조된다. 상기 조성물에 대한 또 다른 실시예에서, 상기 화합물의 최소한 하나는 항체의 1 이상의 CDR 부분을 포함한다.
여기에서 사용된 "중쇄"는 하나의 변이부(VH) 및 3개 또는 4개의 불변부(CH1, CH2, CH3 및 CH4)로 이루어진 항체 분자 중 더 큰 폴리펩티드 또는 그 단편을 의미한다.
여기에서 사용된 "경쇄"는 하나의 변이부(VL) 및 하나의 불변부(CL)로 이루어진 항체 분자 중 더 작은 폴리펩티드 또는 그 단편을 의미한다.
여기에서 사용된 "Fab"는 하나의 경쇄 및 중쇄의 일부로 구성된 면역글로불린의 1가 항원 결합 단편을 의미한다. 그것은 간단한 파파인 분해 또는 재조합 방법에 의해 얻어질 수 있다.
여기에서 사용된 "F(ab')2 단편"은 양 경쇄 및 양 중쇄의 부분으로 이루어진 면역글로불린의 2가 항원 결합 단편을 의미한다. 그것은 간단한 펩신 분해 또는 재조합 방법에 의해 얻어질 수 있다.
여기에서 사용된 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 항체의 변이부에서 매우 가변적인 아미노산 서열을 의미한다.
본 발명은 상기 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 제공한다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 본 기술분야에서 당업자에게 잘 알려져 있다. 그와 같은 약제학적으로 허용가능한 담체는 수용성 또는 비수용성 용액, 부유물, 및 유액을 포함할 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 비수용성 용제의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르를 들 수 있다. 수용성 담체는 물, 알코올성/수용성 용액, 유액 또는 부유물, 식염성 및 완충 배지를 포함한다. 비경구 용액은 염화나트륨 용액, 링거의 덱스트로스(Ringer's dextrose), 덱스트로스와 염화 나트륨, 유산을 가한 링거액(lactated Ringer's) 또는 고정된 오일(fixed oil)을 포함한다. 정맥내 용액은 체액 및 영양 보충액, 링거 덱스트로스에 기초한 것과 같은 전해질 보충액 등을 포함한다. 예를 들면, 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 내부 가스 등과 같은 보존제 및 다른 첨가제가 또한 존재할 수도 있다.
본 발명은 상기 조성물의 유효한 투여량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 HIV-1으로 고통받는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
여기에서 사용된 "환자"는 HIV-감염된 상태로 될 수 있는 어떠한 동물 또는 인공적으로 변형된 동물을 의미한다. 인공적으로 변형된 동물은 인간 면역 체계를 지닌 SCID 마우스를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 동물들은 마우스, 랫드, 개, 기니아 피그, 흰족제비, 토끼, 및 영장류를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 실시예에서, 상기 환자는 인간이다.
여기에서 사용된 "치료"는 HIV-1 질병의 진행을 느리게 하는 것, 멈추게 하는 것 또는 되돌리는 것을 의미한다. 바람직한 실시예에서, "치료"는 상기 질병을없애는 시점까지 진행을 되돌리는 것을 의미한다. 여기에서 사용된 "치료"는 또한 바이러스 감염의 수의 감소, 감염성 바이러스 입자수의 감소, 바이러스 감염 세포수의 감소 또는 HIV-1과 관련된 증상의 개선을 의미한다.
여기에서 사용된 "HIV-1으로 고통받는"은 환자가 HIV-1에 의해 감염된 최소한 하나의 세포를 가지는 것을 의미한다.
여기에서 사용된 "투여"는 본 기술분야에서 당업자에게 알려진 방법 중의 하나를 사용해서 이루어지거나 수행될 수 있다. 상기 방법은 정맥내, 근육내 또는 피하 주사의 방법을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여는 환자 및 사용된 투여의 특정 경로에 따라 다양해질 것이다. 투여량은 0.1~100,000 ㎍/kg의 범위일 수 있다. 상기 조성물에 기초해서, 투여는 연속 펌프와 같은 것에 의해 지속적으로 또는 주기적 간격으로 전달될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 개별적인 경우. 특정 조성물의 여러번 투여의 바람직한 시간 간격은 본 기술분야에서 당업자에 의해 과도한 실험없이 결정될 수 있다.
여기에서 사용된 "유효한 투여량"은 환자가 HIV-1 감염되는 것을 예방하거나 환자를 치료하기에 충분한 정도의 양을 의미한다. 본 기술분야에서 통상의 지식을 지닌 자는 상기 환자를 치료하기 위해 요구되는 양을 결정하기 위해 간단한 적정 시험을 수행할 수 있다.
본 발명은 상기 조성물의 유효한 투여량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자가 HIV-1에 감염되는 것을 예방하는 방법을 제공한다.
여기에서 사용된 "HIV-1에 감염"은 HIV-1의 유전 정보를 숙주세포에서 복제하고 및/또는 숙주세포로 통합하여 HIV-1에 감염되는 것을 의미한다.
본 발명은 항-CCR5 단클론 항체를 제공한다. 항체는 하기를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다.: PA8(ATCC 수탁번호 HB-12605), PA9(ATCC 수탁번호 HB-12606), PA10(ATCC 수탁번호 HB-12607), PA11(ATCC 수탁번호 HB-12608), PA12(ATCC 수탁번호 HB-12609), 및 PA14(ATCC 수탁번호 HB-12610).
본 발명은 상기 항체의 인간화 형태를 제공한다.
여기에서 사용된 "인간화"는 CDR 영역 외부의 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부가 인간 면역글로불린 분자로부터 유래된 해당 아미노산으로 치환된 항체를 나타낸다. 항체의 인간화 형태에 대한 한 실시예에서, CDR 영역 외부의 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부가 인간 면역글로불린 분자로부터의 아미노산으로 치환되었지만, 하나 이상의 CDR 영역 내의 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부는 변화되지 않았다. 아미노산의 적은 부분의 첨가, 결실, 삽입, 치환 또는 변형은 주어진 항원에 결합하는 항체의 능력을 제거하지 않는 이상 허용될 수 있다. 적절한 인간 면역글로불린 분자는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgM 분자를 포함할 것이다. "인간화" 항체는 본래 항체와 유사한 항원 특이성, 즉 본 발명에서 CCR5에 결합하는 능력을 지닐것이다.
본 기술분야에서 당업자는 본 발명의 인간화 항체를 제조하는 방법을 알 것이다. 본 출원에서 참조로 통합된 다양한 논문 또한 인간화 항체를 제조하는 방법을 기술한다. 예를 들면, 미국 특허 No. 4,816,567(71)에서 기술된 방법은 하나의항체의 변이부 및 또 다른 항체의 불변부를 지니는 키메라 항체의 제조를 포함한다.
미국 특허 No. 5,225,539(72)는 인간화 항체의 제조에 대한 또 다른 접근을 기술한다. 이 특허는 인간화 항체를 제조하기 위한 재조합 DNA 기술의 사용을 기술하는데, 이 때, 하나의 면역글로불린의 변이부의 CDR이 다른 특이성을 지닌 면역글로불린 유래의 CDR로 치환되어, 인간화 항체가 바람직한 표적을 인식하지만 인간 환자의 면역 체계에 의해 중요한 방식으로 인식되지는 않는다. 특히, 특정부위 돌연변이 유발이 골격(framework)으로 CDR을 이식하기 위해 사용되었다.
항체를 인간화하기 위한 또 다른 접근은 인간화 면역글로불린을 제조하는 방법을 기술한 미국 특허 No. 5,585,089(73) 및 5,693,761(74) 및 WO 90/07861에서 기술되었다. 이들은 하나 이상의 CDR 및 도너 면역글로불린 유래의 가능한 부가적인 아미노산 및 수용하는 인간 면역글로불린 유래의 골격 영역을 지닌다. 이들 특허는 바람직한 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키는 방법을 기술한다. 골격에서의 어떤 아미노산은 어셉터에서 보다 도너에서의 그 부위의 아미노산과 동일한 것으로 선택된다. 특히, 이들 특허는 마우스 단클론 항체의 CDR을 인간 면역글로불린 골격 및 불변부와 조합함으로써 수용체에 결합하는 인간화 항체의 제조를 기술한다. 인간 골격 영역은 마우스 서열과 상동성을 최대화하기 위해 선택될 수 있다. CDR 또는 특정 항원과 상호작용할 것 같은 골격 영역에서 아미노산을 확인하기 위하여 컴퓨터 모델을 사용할 수 있고, 마우스 아미노산은 인간화 항체를 제조하기 위해 이들 부위에서 사용될 수 있다.
상기 특허 5,585,089 및 5,693,761 및 WO 90/07861(75)는 또한 인간화 항체를 다자인할 때에 사용될 수 있는 4개의 가능한 기준을 제안한다. 제 1 안은 어셉터를 위해, 인간화될 도너 면역글로불린에 현저하게 상동적인 특정 인간 면역 글로불린 유래의 골격을 사용하거나 또는 많은 인간 항체 유래의 공통 골격(consensus framework)을 사용하는 것이다. 제 2 안은 만일 인간 면역글로불린의 골격에서 아미노산이 특이하고 그 위치에서 도너 아미노산이 인간 서열에 대해 전형적이라면, 어셉터 보다는 도너 아미노산이 선택될 수 있다. 제 3안은 인간화 면역글로불린 사슬에서 3 CDR에 바로 인접한 위치에서 어셉터 보다는 도너 아미노산이 선택될 수 있다는 것이다. 제 4안은 골격 위치에서 도너 아미노산 잔기를 사용하는 것으로, 그 아미노산이 항체의 3차원 모델에서 CDR의 3A 내에서 곁사슬 원자를 가질 것으로 예상되고, CDR과 상호작용할 수 있을 것으로 예상된다. 상기 방법은 단순히 본 기술분야에서 당업자가 인간화 항체를 제조하기 위해 채용할 수 있는 방법의 일부를 설명하는 것이다. 인간화 항체의 결합의 친화성 및/또는 특이성을 Wu et al.(1999) J. Mol. Biol. 284:151 및 미국 특허 No. 6,165,793; 6,365,408 및 6,413,774에서 기술된 것 처럼 방향 진화의 방법을 사용하여 증가시킬 수 있다.
본 발명에 대한 한 실시예에서, 항체의 인간화 형태는 SEQ ID NO:6에 기재된 경쇄 변이부 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 항체는 SEQ ID NO:9에 기재된 중쇄 변이부 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 항체는 SEQ ID NO:12에 기재된 중쇄 변이부 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 인간화 항체는 SEQ ID NO:6에 기재된 경쇄 변이부 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO:9에 기재된 중쇄 변이부 아미노산 서열을 포함한다. 대신에, 항체는 SEQ ID NO:6에 기재된 경쇄 변이부 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO:12에 기재된 중쇄 변이부 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
인간화 항체의 변이부는 인간 면역글로불린의 면역글로불린 불변부의 최소 한 하나의 부분에 연결될 수 있다. 한 실시예에서, 인간화 항체는 경쇄 및 중쇄 불변부 양자를 포함한다. 중쇄 불변부는 일반적으로 CH1, 힌지(hinge), CH2, CH3 및 때때로 CH4 영역을 포함한다. 한 실시예에서, 인간화 항체의 불변부는 인간 IgG4 아이소타입의 것이다.
본 발명은 항-CCR5 단클론 항체를 암호화하는 분리된 핵산 분자 또는 그들의 인간화 변형물을 제공한다. 핵산 분자는 RNA, DNA, 또는 cDNA일 수 있다. 한 실시예에서, 핵산 분자는 경쇄를 암호화한다. 한 실시예에서, 핵산 분자는 중쇄를 암호화한다. 한 실시예에서, 핵산은 중쇄 및 경쇄 양자를 암호화한다. 한 실시예에서, 하나 이상의 핵산 분자는 Fab 부분을 암호화한다. 한 실시예에서, 하나 이상의 핵산 분자는 CDR 부분을 암호화한다. 한 실시예에서, 핵산 분자는 변이부를 암호화한다. 또 다른 실시예에서, 핵산 분자는 변이부 및 하나 이상의 불변부를 암호화한다.
바람직하게, 예시된 인간화 항-CCR5 항체의 상사형은 보존적인 아미노산 치환에 의해 예시된 인간화 항-CCR5 항체와는 다르다. 보존적인 또는 비보존적인 것으로 아미노산 치환을 분류할 목적을 위해, 아미노산을 다음과 같이 그룹화할 수 있다: Group I(소수성 곁 사슬): met, ala, val, leu, ile; Group II(중성 소수성곁 사슬): cys, ser, thr; Group III(산성 곁사슬):asp, glu; Group IV(염기성 곁사슬): asn, gln, his, lys, arg; Group V(사슬 위치결정에 영향을 미치는 잔기): gly, pro; 및 Group VI(방향족 곁사슬): trp, tyr, phe. 보존적인 치환은 동일한 분류에서 아미노산 사이의 치환과 관련된다. 비보존적인 치환은 이들 분류 중 하나의 일원과 또 다른 분류의 일원을 교환하는 것으로 이루어진다.
인간화 항-CCR5 항체의 상사형은 여기에서 예시된 인간화 PRO 140#1 또는 인간화 PRO 140 #2와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 보여준다. 상사형의 중쇄 및 경쇄 변이부는 엄격한 조건하에서 인간화 PRO 140 #1 또는 인간화 PRO 140 #2 또는 그 퇴화형의 중쇄 또는 경쇄 변이부를 암호화하는 핵산과 혼성화하는 핵산 서열에 의해 암호화된다.
유전 암호의 퇴화 때문에, 다양한 핵산 서열은 본 발명의 인간화 항-CCR5 항체를 암호화한다. 특정 실시예에서, 항체는 상기 핵산 분자와 아주 상동적인 핵산 분자에 의해 암호화된다. 바람직하게 상동적인 핵산 분자는 여기에서 제공된 핵산 서열과 최소한 약 90% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게, 핵산 서열은 여기에서 제공된 핵산과 최소한 약 95% 동일, 최소한 약 97% 동일, 최소한 약 98% 동일 또는 최소한 약 99% 동일하다. 상동성은 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 다양한, 대중적으로 사용가능한 소프트웨어 툴을 사용하여 계산될 수 있다. 예시적인 툴로는 국립 보건 연구소의 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 웹사이트에서 입수할 수 있는 BLAST 시스템을 포함한다.
아주 상동적인 핵산 서열을 확인하는 하나의 방법은 핵산 혼성화를 통한 것이다. 그래서 본 발명은 또한 여기에서 기술된 CCR5-결합 특성 및 다른 기능적 특성을 지니는 인간화 CCR5 항체를 포함하며, 이는 상기 핵산 분자에 대한 매우 엄격한 조건하에서 혼성화하는 핵산 분자에 의해 암호화된다. 관련된 서열의 확인은 또한 PCR(polymerase chain reaction) 및 관련된 핵산 서열을 클로닝하기에 적합한 다른 증폭 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 바람직하게, PCR 프라이머는 CDR과 같은 흥미있는 핵산 서열의 부분을 증폭하기 위해 선택된다.
여기에서 사용된 "매우 엄격한 조건"이란 용어는 본 기술분야에 익숙한 매개변수를 말한다. 핵산 혼성화 매개변수는 그와 같은 방법을 담고있는 참고자료에서 발견될 수 있으며, 상기 참고자료는 예컨대, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, 또는 Current Protocols in Molecular Biology, F.M.Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York. 매우 엄격한 조건의 한 예는 혼성화 버퍼(3.5×SSC, 0.02% 피콜(Ficoll), 0.02% 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 0.02% 소혈청 알부민, 2.5mM NaH2PO4(pII7), 0.5% SDS, 2mM EDTA), 65℃에서 혼성화하는 것이다. SSC는 염화 나트륨 0.15M/구연산 나트륨 0.015M, pH7이고; SDS는 도데실 황산나트륨(sodium dodecyl sulphate)이고; 및 EDTA는 에틸렌디아민테트라세틱산(ethylenediaminetetracetic acid)이다. 혼성화 이후에, 핵산이 옮겨진 멤브레인은 예를 들면, 실온에서 2×SSC로 세척하고 68℃로 승온하여 0.1-0.5×SSC/0.1X SDS로세척한다.
핵산 서열은 서열이 발현조절서열에 실시가능하게 연결된(즉, 기능을 확실하게 하도록 위치된) 이후에 숙주에서 발현된다. 이들 발현 벡터는 숙주 유기체내에서 일반적으로 에피좀(episome)으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 구성 부분으로서 복제될 수 있다. 일반적으로, 발현 벡터는 상기 바람직한 DNA 서열로 형질전환된 그들 세포의 검출을 허용하도록 예를 들어, 테트라사이클린 또는 네오마이신과 같은 선택 마커를 포함할 것이다(예를 들어, 여기에서 참고자료로서 기재한 미국 특허 No. 4,704,362 참조).
E. coli는 본 발명에서의 DNA 서열을 클로닝하기에 특히 유용한 원핵생물 숙주 중 하나이다. 사용하기에 적합한 다른 미생물 숙주는 Bacillus subtilus 와 같은 세균, 및 살모넬라, 세라티아(Serratia) 및 다른 수도모나스(Pseudomonas) 종과 같은 다른 엔테로박테리아(enterobacteriaccae)를 포함한다. 이러한 원핵생물 숙주에서, 또한 숙주 세포와 양립가능한 발현 조절 서열(예를 들어, 복제 원점)을 일반적으로 포함하는 발현 벡터를 만들 수 있다. 게다가, 락토오스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타메이즈(beta-lactamase) 프로모터 시스템 또는 파아지 람다(phage lambda) 유래의 프로모터 시스템과 같은 많은 다양한 종류의 잘 알려진 프로모터가 존재할 것이다. 선택적으로 오퍼레이터 서열과 함께, 프로모터는 일반적으로 발현을 조절할 것이고, 전사 및 번역을 시작하고 완료하기 위해 리보좀 결합 부위 서열 등을 가질 것이다.
효모와 같은 다른 미생물도 발현을 위해 또한 유용할 수 있다.saccharomyces는 바람직하게 3-포스포글리세레이트 카이네이즈(3-phosphoglycerate kinase) 또는 다른 글라이코라이틱 효소(glycolytic enzymes) 및 복제원점을 포함하는 프로모터, 및 종결 서열 등과 같은 발현조절서열을 가지는 적합한 벡터를 지닌 바람직한 숙주이다.
미생물에 더하여, 포유류 조직 세포 배양이 또한 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 제조하기 위해 사용될 수 있다(Winnacker, "From Genes to Clones", VCH Publishers, New York, (1987) 참조). 진핵 세포는 본 기술분야에서 완전한 면역글로불린을 분비할 수 있는 많은 적합한 숙주 세포주가 개발되었기 때문에 실제로 바람직하며, CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, 바람직하게는 마이엘로마 세포주 등 및 형질전환된 B세포 또는 하이브리도마를 포함한다. 이들 세포의 발현 벡터는 복제 원점, 프로모터, 인헨서와 같은 발현 조절 서열(여기에서 참고자료로 기재된 Queen, et al., Immunol. Rev., 89, 49-68(1986) 및 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐레이션 부위 및 전사 종결자 서열과 같은 필수적인 처리 정보 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 발현 조절 서열은 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 보바인 파필로마 바이러스(Bovine Papilloma Virus) 등으로부터 유래한 프로모터이다.
흥미있는 DNA 단편(예를 들어, 중쇄 및 경쇄 암호화 서열 및 발현 조절 서열)을 포함하는 벡터가 잘 알려진 방법에 의해 숙주세포로 전달될 수 있으며, 상기 방법은 세포성 숙주의 유형에 따라 다양하다. 예를 들면, 염화 칼슘 트랜스펙션이 일반적으로 원핵 세포에 대하여 유용한 반면, 인산 칼슘 처리 또는 일렉트로포레이션이 다른 세포성 숙주에 대하여 사용될 수 있다.(일반적으로, 여기에서 참고자료로 기재된 Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press(1982) 참조)
일단 발현되면, 전체 항체, 그 2량체, 개개의 경쇄 및 중쇄 또는 본 발명에서의 다른 면역글로불린 형태가 본 기술분야에서 표준 절차에 따라 정제될 수 있으며, 상기 절차는 황산 암모늄 침전법, 친화 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 젤 전기영동 등을 포함한다. (일반적으로, R.Scopes, "Protein Purification", Springer-Verlag, New York(1982) 참조). 약제학적 용도를 위해, 실질적으로 순수한 면역 글로불린은 최소한 약 90~95% 동질한 것이 바람직하고, 98~99% 이상 동질한 것이 가장 바람직하다. 부분적으로 또는 바람직하게 동질하게, 일단 정제되면, 폴리펩티드는 치료요법으로(체외적으로를 포함하여) 사용될 수 있거나 에세이 절차, 면역형광 염색 등을 개발하거나 수행할 때 사용될 수 있다.(일반적으로 Immunological Methods, Vols. I and II, Lefkovits and Pernis, eds., Academic Press, New York,(1979 및 1981) 참조)
진단 또는 검출 목적을 위하여, 항체는 표지되거나 표지되지 않을 수 있다. 표지되지 않은 항체는 인간 면역 글로불린 불변부에 특이적인 항체와 같이, 상기 인간화 항체와 반응하는 다른 표지된 항체(제 2 항체)와 조합하여 사용할 수 있다. 대신에, 항체는 직접 표지될 수 있다. 방사성핵종(radionuclides), 형광, 효소, 효소기질, 효소 보조인자(enzyme cofactors), 효소 저해제, 리간드(특히 햅텐) 등과 같은 아주 다양한 종류의 표지가 채용될 수 있다. 면역 에세이의 많은 종류가 이용될 수 있으며, CCR5-발현 세포의 검출 또는 CCR5를 발현할 수 있는 세포에서 CCR5 조절의 검출을 위하여 본 기술분야에서 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명은 또한 피복되지 않은(underivatized) 항체 단편에 대한 혈청 반감기에서의 증가, 순환에서 평균체류시간(MRT)에서의 증가 및/또는 혈청 제거율에서의 감소를 부여하기에 유효한 크기 또는 분자량을 지니는 항체 단편-폴리머 복합체를 제공한다.
본 발명의 항체 단편-폴리머 복합체는 비활성 폴리머로 바람직한 항체 단편을 피복함으로써 제조될 수 있다. 바람직한 겉보기 크기를 지닌 복합체를 제공하는 또는 선택된 실제 분자량을 지닌 어떤 비활성 폴리머는 본 발명의 항체 단편-폴리머 복합체를 구성할 때에 사용하기에 적합한 것으로 평가된다.
많은 비활성 폴리머가 약제학적 용도를 위해 적합하다. 예를 들어, Davis et al., Biomedical Polymers: Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use, pp. 441-451(1980) 참조. 본 발명의 모든 실시예에서, 비-단백질성 폴리머가 사용된다. 비단백질성 폴리머는 보통 친수성 합성 폴리머, 즉 자연적으로 발견되지 않는 폴리머이다. 그러나, 원래의 소오스로부터 분리된 폴리머로서, 자연적으로 존재하고 재조합 또는 in vitro 방법에 의해 제조되는 폴리머 또한 유용하다. 예를 들어, 폴리비닐알콜 및 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리비닐 폴리머는 본 발명의 범위에 해당한다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 폴리알킬렌 에테르; 폴리옥시에텔렌, 폴리옥시프로필렌과 같은 폴리옥시알킬렌 및 폴리옥시에틸렌 및 폴리옥시프로필렌의 블록 공중합체(Pluronics); 폴리메타크릴레이트; 카보머; 단당류 D-만노오스, D- 및 L-갈락토오스, 푸코오스, 과당, D-크실로오스, L-아라비노오스, D-글루쿠론산, 시알산, D-갈락투론산, D-만뉴론산(예를 들어, 폴리만뉴론산, 또는 알긴산), D-글루코사민, D-갈락토사민, D-글루코오스, 및 노이라민산을 포함하며, 락토오스, 아밀로펙틴, 전분, 하이드록시에틸 전분, 아밀로오스, 황산 덱스트란, 덱스트란, 덱스트린, 글리코겐, 또는 예를 들어, 히알루론산, 폴리솔비톨 및 폴리만니톨과 같은 당알코올의 폴리머, 헤파린 또는 헤파론, 산 뮤코다당류의 다당류 서브유닛과 같은 동형다당류 및 이형다당류를 포함하는 분지상 또는 분지가 없는 다당류가 특히 유용하다. 교차결합 이전의 폴리머는 수용성일 필요는 없고, 수용성이 바람직하지만 최종 복합체는 수용성이어야 한다. 바람직하게, 복합체는 최소한 약 0.01mg/ml의 수용성, 및 더욱 바람직하게 최소한 약 0.1mg/ml의 수용성 및 훨씬 더 바람직하게는 최소한 약 1mg/ml의 수용성을 나타낸다. 게다가 상기 폴리머는 복합체의 형태에서 아주 면역성이 있으면 안되며 또한 만일 그 복합체가 그와 같은 경로로 투여된다면 정맥 주입 또는 주사와 양립할 수 없는 점도를 가져서도 안된다
한 실시예에서, 상기 폴리머는 반응성있는 단일 군만을 포함한다. 이것은 단백질 분자의 교차결합을 피하도록 한다. 그러나, 교차결합을 감소시키는 반응 조건을 최대화하거나 또는 실질적으로 순수한 유도체를 회수하기 위해 젤 여과 또는 이온 교환 크로마토그래피를 통해 반응산물을 정제하는 것은 본 발명의 범위내이다. 다른 실시예에서 폴리머는 다수의 항체 단편을 폴리머 골격에 결합할 목적으로 2개이상의 반응기를 포함한다. 또, 젤 여과 또는 이온 교환 크로마토그래피를 실질적으로 순수한 형태로 바람직한 유도체를 회수하기 위해 사용할 수 있다.
폴리머의 분자량은 약 500,000 D까지의 범위일 수 있고 바람직하게 최소한 약 20,000 D, 또는 최소한 약 30,000 D 또는 최소한 약 40,000 D이다. 선택된 분자량은 얻어질 수 있는 복합체의 유효한 크기, 폴리머의 성질(예를 들어 직쇄상 또는 분지상과 같은 구조) 및 피복의 정도, 즉, 항체 단편 당 폴리머 분자의 수, 및 항체 단편상에서의 폴리머 부착 부위 또는 부위들에 의존할 수 있다.
폴리머는 폴리머와 반응하고 항체 단편 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 결합될 다기능 교차결합제를 통해 항체 단편에 공유결합할 수 있다. 그러나, 피복된 폴리머를 항체 단편과 반응시킴으로써 폴리머를 직접 교차결합시키거나 또는 그 역의 경우 또한 본 발명의 범위내이다.
항체 단편에서 공유 교차결합 부위는 다른 아미노, 이미노, 카르복실, 설프하이드릴, 하이드록실 또는 다른 친수성기 뿐만아니라 N-말단 아미노기 및 라이신 잔기에서 발견되는 엡실론 아미노기를 포함한다. 폴리머는 미국 특허 제 6,458,355호에서 기술된 것과 같은 다기능(보통 두기능) 교차결합제를 사용하지 않고 항체 단편에 직접 공유 결합될 수 있다.
그와 같은 폴리머와 치환 정도는 항체 단편상에서의 반응 부위의 수, 분자량, 친수성 및 다른 폴리머의 특성 및 선택된 특정 항체 단편 피복 부위에 따라 다양할 것이다. 일반적으로, 복합체는 1 ~ 약 10개의 폴리머 분자를 포함하지만 본 발명의 항체 단편에 부착된 더 많은 수의 폴리머 분자 또한 예상된다. 바람직한 피복양은 복합체의 폴리머 치환 수준이 본 기술분야에서 알려진 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 또는 다른 방법에 의해 결정된 후에 시간, 온도 및 다른 반응 조건이 치환 정도를 변화시키도록 변화된 실험 매트릭스를 사용함으로써 쉽게 얻어진다.
본 발명의 항체 단편을 변형하기 위해 기능화된 PEG 폴리머는 Shearwater Polymers, Inc.(헌츠빌, Ala.)로부터 입수할 수 있다. 그와 같은 상업적으로 입수할 수 있는 PEG 유도체는 아미노-PEG, PEG 아미노산 에스테르, PEG-하이드라지드, PEG-티올, PEG-숙신산, 카르복시메틸레이티드(carboxymethylated) PEG, PEG-프로피오닉산(PEG-propionic acid), PEG 아미노산, PEG 숙신이미딜 숙신산(PEG succinimidyl succinate), PEG 숙신이미딜 프로피오네이트(PEG succinimidyl propionate), 카르복시메틸레이티드 PEG의 숙신이미딜 에스테르(succinimidyl ester of carboxymethylated PEG), PEG의 숙신이미딜 카르보네이트(succinimidyl carbonate of PEG), 아미노산 PEG의 숙신이미딜 에스테르(succinimidyl ester of amino acid PEGs), PEG-옥시카르보닐이미다졸(PEG-oxycarbonylimidazole), PEG-니트로페닐 카르보네이트(PEG-nitrophenyl carbonate), PEG 트레실레이트(PEG tresylate), PEG-글리시딜 에테르(PEG-glycidyl ether), PEG-알데히드, PEG-비닐설폰, PEG-말레이미드, PEG-오르토피리딜-디설파이드(PEG-orthopyridyl-disulfide), 이형작용기의 PEG(heterofunctional PEGs) , PEG 비닐 유도체, PEG 실란(PEG silanes) 및 PEG 포스포라이드(PEG phospholides)를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이들 PEG 유도체를 결합하기 위한 반응 조건은 단백질, 바람직한 PEG화 정도 및 사용되는 PEG 유도체에 따라 다양하다. PEG 유도체의 선택과 관련된 어떤 요소들은 하기를 포함한다: 바람직한 부착점(라이신 또는 시스테인 R-기와 같은), 가수분해성의 안정성 및 유도체의 반응성, 안정성, 결합의 독성 및 항원성, 분석의 적합성 등. 어떤 특정 유도체의 사용을 위한 특이적인 지시가 제조자로부터 입수될 수 있다. 본 발명의 복합체는 젤 여과 또는 이온교환 HPLC에 의해 반응하지 않은 출발물질로부터 분리된다.
항-CCR5 항체 또는 그 단편은 비뉴클레오사이드 역전사효소 저해제(NNRTIs), 뉴클레오시드 역전사효소 저해제, HIV-1 프로테아제 저해제, 바이러스 침입 저해제 및 그 조합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 부가적인 항-바이러스 제제와 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물에서 사용될 수 있는 알려진 NNRTI 화합물은 에파비렌즈(efavirenz), UC-781, HBY 097, 네비라핀(nevirapine) (11-사이클로프로필-5,11,-디하이드로-4-메틸-6H-디피리도[3,2-b:2'3'-][1,4]디아제핀-6-원), 델라버딘(delavirdine)((RescriptorTM; Pharmacia Upjohn) (피페라진, 1-[3-[(1-메틸-에틸)아미노]-2-피리디닐]-4-[[5-[(메틸설포닐)아미노]-1H--인돌-2-일]카르보닐]-모노메탄설포네이트), SJ-3366 (1-(3-사이클로펜텐-1-일)메틸-6-(3,5-디메틸벤조일)-5-에틸-2,4-피리미딘디온), MKC-442 (6-벤질-1-(에톡시메틸)-5-이소프로필우라실), GW420867x (S-3 에틸-6-플루로-4-이소프로폭시카르보닐-3,4-디하이드로-퀴녹살린-2(1H)-온;Glaxo), HI-443 (N'-[2-(2-티오펜)에틸]-N'-[2-(5-브로모피리딜)]-티오우레아), 등을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서의 최소한 하나의 항-CCR5 항체 또는 그 단편과 조합된 상기 조성물에서 사용될 수 있는 뉴클레오시드 역전사효소 저해제는 아바카비어(abacavir)(ZiagenTM, GlaxoSmithKline) ((1S, cis)-4-[2-아미노-6-(사이클로프로필아미노)-9H-퓨린-9-일]-2-사이클로펜텐-1-메탄올 설페이트(염))), 라미부딘(lamivudine)(EpivirTM, GlaxoSmithKline) ((2R, cis)-4-아미노-1-(2-하이드록시메틸-1,3-옥사티오란(oxathiolan)-5-일)-(1H)-피리미딘-2-온), 지도부딘(zidovudine)(RetrovirTM; GlaxoSmithKline) (3'아지도-3'-디옥시티미딘), 스타부딘(stavudine)(Zerit; Bristol-MyersSquibb) (2', 3'-디디하이드로-3'-디옥시티미딘), 자시타빈(zacitabine)(HividTM; Roche Laboratories) (4-아미노-1-베타-D2', 3'-디디옥시리보푸라노실-2-(1H)-피리미돈), 디다노신 등을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항-CCR5 항체 또는 그 단편과 조합하여 상기 조성물에서 사용될 수 있는 HIV-1 프로테아제 저해제는 로피나비어(lopinavir) (1S-[1R*,(R*), 3R*, 4R*]]-N-4-[[(2,6-디메틸페녹시)아세틸]아미노]-3-하이드록시-5-페닐-1-(페닐메틸)펜틸]테트라하이드로-알파-(1-메틸에틸)-2-옥솔(2H)-피리미딘아세트아마이드), 사퀴나비어(saquinavir) (N-tert-부틸-데카하이드로-2-[2(R)-하이드록시-4-페닐-3(S)-[[N-(2-퀴노릴카르보닐)-L-아스파라지닐]아미노]부틸]-(4aS, 8aS)-이소퀴놀린-(3S)-카르복사마이드), 넬피나비어(nelfinavir) 메실레이트 ([3S-[2(2S*, 3S*), 3α, 4β,8αβ]]-N-(1,1-디메틸에틸)데카하이드로-2-[2-하이드록시-3-[(3-하이드록시-2-메틸벤조일)아미노]-4-(페닐티오)부틸]-3-이소퀴놀린카르복사마이드 모노메탄 설포네이트), 인디나비어(indianvir) 설페이트 (([1(1S, 2R), 5(S))]-2,3,5-트리디옥시-N-(2,3-디하이드로-2-하이드록시-1H-인덴-1-일)-5-[2-[[(1,1-디메틸에틸)아미노]카르보닐]-4-(3-피리디닐메틸)-1-피페라지닐]-2-(페닐메틸)-D-에리트로펜톤아마이드 설페이트(1:1)염), 암프레나비어(amprenavir) ((3S)-테트라하이드로-3-푸릴 N-[(1S, 2R)-3-(4-아미노-N-이소부틸벤젠설폰아미도)-1-벤질-2-하이드록시프로필]카바메이트), 리토나비어(ritonavir) ((10-하이드록시-2-메틸-5-(1-메틸에틸)-1-[2-(1-메틸에틸-4-티아조릴]-3,6-디옥소-8,11-비스(페닐메틸)-2,4,7,12-테트라아자트리데칸-13-오익산, 5-티아조릴메틸 에스테르, [5S-(5R*, 8R*, 10R*, 11R*)]) 등을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항-CCR5 항체 또는 그 단편과 조합하여 사용될 수 있는 HIV-1 또는 바이러스 침입 저해제는 PRO 542(Progenics Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY), T-20(Trimeris, Inc., Durham, NC)(미국 특허 제 5,464,933; 6,133,418; 6,020,459), T-1249(미국 특허 제 6,345,568; 6,258,782) 등을 포함한다.
조합 요법을 위하여, 본 발명의 항-CCR5 항체 또는 그 단편은 하나 이상의 기존 항바이러스 제제에 앞서, 이어서, 또는 동시에 환자에게 제공될 수 있다.
본 발명은 하기의 상세한 실험내용으로부터 더 잘 이해될 것이다. 그러나, 이후 특허청구범위에서 더욱 완전히 기술된 것처럼, 본 기술분야에서의 당업자는 논의된 특정 방법과 결과에 대하여 본 발명에 대한 단순한 설명인 것으로 평가할 것이다.
상세한 실험 내용:
실시예 1
A. 물질 및 방법
1)시약
MAb 2D7을 Pharmingen사(샌디에고, CA)로부터 구입했고 CC- 및 CXC-키모카인을 R&D Systems(미네폴리스, MN)에서 입수했다. CD4-IgG2(1), 용해성(s) CD4(2) 및 재조합 HIV-1JR-FLgp120은 Progenics Pharmaceuticals, Inc.에 의해 제조되었다.
2) 항-CCR5 mAb의 분리 및 정제
L1.2-CCR5+세포(63)를, CCR5 발현을 조절하는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터로부터의 전사를 활성화시키는 소디움 부티레이트 5mM 존재하에서 16h 동안 배양하여, 세포 표면 공수용체 밀도가 10배 증가되는 결과를 얻었다. 암컷 Balb/c 마우스를 107L1.2-CCR5+세포로 3주 간격으로 복강내주사하여 면역화하였고, 107L1.2-CCR5+세포를 비장절제술 3일 전에 정맥내 증폭을 실시하였다. 비장세포를 Sp2/0 세포주와 융합시켰다. 제 1 검사에서, 만개의 하이브리도마 배양으로부터의 부유물을 테스트했다; 앞서 언급한 것처럼, 이들 중 120개는 자연적으로 CCR5 및 CD4를 발현하는 PM1 세포(10) 및 공명에너지 전이(RET) 에세이에서의 HeLa-EnvJR-FL +세포 사이에 HIV-1 외피-매개 융합을 저해했다(19, 38). 또한 CCR5+세포를 염색한 가장 강력한 저해 부유물을 생산한 하이브리도마는 희석을 제한함으로써, 서브-클로닝하였다. 복수액을 Harlan Bioproducts for Scinece, Inc.(인디아나폴리스, IN)가 항-CCR5 mAbs PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 및 PA14를 생산하는 하이브리도마를 주입한 Balb/c 마우스로부터 준비하였다. mAb를 황산 암모늄으로 침전하고 단백질-A 크로마토그래피하여 >95% 균질도로 개별적으로 정제하였다. 모든 mAb를 최종 농도 5mg/ml로 PBS(phosphate buffered saline)에 재부유하였다.
3)형광 활성 세포 선별기(FACs) 분석 및 항-CCR5 mAb의 항원결정기 지도제작
유세포 분석기를 CCR5를 사용하여 mAb PA8-PA12 및 PA14의 세포-표면 반응성을 검출하기 위해 사용하였다. 부틸산나트륨 처리된 L1.2-CCR5+세포(106)를 0.25㎍ 항체와 함께 Dulbecco's PBS(DPBS) 50㎕, 0.1% 소디움 아자이드(NaN3), 4℃에서 20분 동안 배양하였다. CCR5 mAb 2D7을 양성 컨트롤로 사용하였고, 비특이적 쥐 IgG1을 음성 컨트롤로서 사용하였다. 세포를 분리제거하였고, 세척하였으며, 제 1 항체 배양에서와 동일한 조건하에서 1:100 희석된 피코에리트린(PE)-표지된 고우트 항-마우스 IgG(Caltag, 버밍엄, CA)를 사용하여 배양하였다. 마지막으로, 세포를 유세포 분석에 의해 분석하였다. PBMC를 분리하여 앞서 기술한 것처럼 자극하였고(60) 유사한 방법을 사용하여 염색하였다.
유사한 절차를 항-CCR5 mAb의 항원결정기 지도제작을 위해 사용하였다. 70개의 CCR5 점 돌연변이주로 이루어진 패널은 이미 기술되었다(20, 24, 52).이들 단백질의 암호화 서열을 5' T7-폴리머라제 프로모터에 의해 전사가 진행될 수 있는 pcDNA3.1 벡터(Stratagene)로 서브-클로닝하였다. CCR5 돌연변이주는 유세포 분석에 의해 또는 세포 용해물에서 단백질의 검출을 위한 C-말단에서 9-잔기 헤마글루티닌(HA) 태그를 지닌다. HeLa 세포(2×106)를 20㎍/ml 리포펙틴 및 야생형 또는 돌연변이체 CCR5-발현 플라스미드의 동일량을 사용하여 OPTI-MEM(Life Technologies, 게이츠버그, MD)에서 5h 동안 배양하였다. 그리고나서 CCR5 발현을 촉진시키기 위하여 vTF7(23)의 2×107p.f.u로 세포를 12h 동안 감염시켰고, PBS에서 2mM EDTA(ethylenediamine tetracetic acid)를 사용하여 분리하였으며, 결합 버퍼(1% BSA, DPBS에서 0.05% NaN3)를 사용하여 한 번 세척하였다. 세포(1×106)를 앞 문단에서 기술한 것처럼 mAb로 표면 표지하였고, 배양 버퍼를 사용하여 한번 세척하였으며 세포막을 투과성이 있도록 하기 위하여 실온에서 30분 동안 물에 1×FACSlyse(Becton Dickinson)의 1ml에 재부유하였다. 그리고나서 세포를 분리제거하였고, 배양버퍼를 사용하여 세척하였으며, 세포간 표지를 위하여 FITC(fluorescein isothiocyanate)-표지된 마우스 항-HA mAb (BabCo, 리치몬드, CA) 4㎍/ml로 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 마지막으로, 세포를 결합 버퍼를 사용하여 한 번 세척하였고, DPBS를 사용하여 한번 세척하였으며 PBS에서 1% 포름알데히드에 재부유하고 유세포 분석에 의해 분석하였다. 돌연변이체 CCR5에 대한 mAb의 결합 정도는 하기 식에 의해 결정되었다(돌연변이체 CCR5 PE m.f.i./wt CCR5 PE m.f.i.)/(돌연변이체 CCR5 FITC m.f.i./wt CCR5 FITC m.f.i.)×100%. 이것은 돌연변이체 공수용체 발현 수준에 대한 mAb 결합을 표준화한다.
4)gp120/sCD4-결합 에세이
gp120을 제조자의 지침에 따라 NHS-비오틴(Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 비오틴화하였고 결합되지 않은 비오틴을 투석여과에 의해 제거하였다. 부틸산 나트륨-처리한 L1.2-CCR5+세포를 sCD4 및 비오틴화된 gp120의 등몰 혼합액의 다양한 희석액, 또는 항-CCR5 mAb PA8-PA12, PA14, 2D7 또는 비특이적인 쥐 IgG1의 다양한 농도 존재하에서 sCD4 1.25㎍/ml 및 비오틴화된 gp120 2.5㎍/ml를 사용하여 DPBS, 0.1% NaN3, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 세포를 배양 버퍼로 세척하였고 1:50으로 희석된 스트렙트아비딘-PE(Becton Dickinson)를 사용하여 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 마지막으로, 세포를 결합 버퍼로 세척하였고 형광 플레이트 리더(Perspective Biosystems, Framingham, MA)를 사용하여 분석하였다.
5)항-CCR5 mAb에 의한 외피-매개 세포-세포 융합 및 HIV-1 침입의 저해
HeLa-EnvJR-FL +및 PM1 세포 사이에서의 HIV-1 외피-매개 융합을 RET 에세이를 사용하여 검출하였다. 플루오레신 옥타데실 에스터(F18)-표지된 외피-발현 세포 및 옥타데실 로다민(R18)-표지된 PM1 세포의 동일한 수(2×104)를 DPBS, 15% 우태혈청(FCS) 96-웰 플레이트에 플레이트하였고 항-CCR5 mAb PA8-PA12, PA14, 2D7 또는 비특이적인 쥐 IgG1의 다양한 농도 존재하의 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 형광 RET를 Cytofluor 플레이트-리더(PerSeptive Biosystems)를 사용하여 측정하였고 % RET를 앞서 기술한 것처럼 결정하였다(38).
JR-FL 또는 Gun-1로부터 외피 당단백질에 의해 트랜스로 보완된 NLluc+env-바이러스를 앞서 기술한 것처럼 제조하였다(20). U87MG-CD4+CCR5+세포(14)를 다양한 농도의 개별 mAb 존재하에서 50-100ng/ml p24를 포함하는 키메라의 리포터 바이러스로 감염시켰다. 37℃에서 2시간 후에, 바이러스-함유 배지를 새로운 mAb-함유 배지로 교체하였다. 항체가 없는 새 배지를 12시간 이후에 다시 첨가하였다. 총 72시간 이후에, 용해 버퍼(Promega사제) 100㎕를 세포에 첨가하였고, 루시페라제 활성(r.l.u.)을 기술한 바와 같이 측정하였다(20). HIV-1 감염의 %저해를 [1-(항체 존재하에서 r.l.u./ 항체 부존재하에서 r.l.u.)]×100%로 정의한다.
6)칼슘 신호전달 에세이
fluorochrome Indo-1AM(Molecular Probes, Eugene, OR)을 최종 농도 5μM로부틸산 나트륨 처리된 L1.2-CCR5+세포에 첨가하였다. 30분 동안 37℃에서 배양한 후에, 세포를 한번 세척하고 Hank's 완충식염수에 재부유하였다. 세포(106)를 항-CCR5 mAb 또는 PBS로 연속적으로 자극하였고 RNATES로 60초 이후에 자극하였다. mAb PA8-PA12 및 PA14를 100㎍/ml 농도로, 2D7을 20㎍/ml 농도로 및 RANTES를 250ng/ml 농도로 사용하였다. PA14 및 2D7에 의한 칼슘 유입 저해를 또한 넓은 범위의 mAb 농도, 0-100㎍/ml 범위에 대해 테스트하였다. 세포간 칼슘 수준을 퍼킨-엘머 LS-50S 형광분광계를 사용하여 358nm에서의 여기에 이은 402nm(정해진 염색) 및 486nm(자유 염색)에서 형광 방출 비율을 측정함으로써 모니터하였다.
B.결과 및 토론
1)항-CCR5 단클론 항체 PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 및 PA14 분리
CCR5의 세포외 도메인에 해당하는 펩티드는 원래의 세포 표면 수용체에 대하여 상승된 특이적, 고역가 항체 반응에서 비효율적이라는 것을 알았다(50). 그래서, Balb/C 마우스를 L1.2-CCR5+세포로 면역화하였고, 하이브리도마 배양 부유물을 RET 에세이에서 CD4+CCR5+PM1 세포를 사용하여 JR-FL 외피-매개 막 융합을 저해하는 능력에 대해 테스트하였다(19, 38). 유세포분석에서 설명한 것처럼, 비록 100 부유물 이상이 >50% 까지 세포-세포 융합을 저해했을 지라도, 단지 6개- PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 및 PA14로 명명된-가 특이적으로 및 강하게 L1.2-CCR5+를 염색했지만 부모 L1.2 세포를 염색하지는 않았다(데이터는 나타내지 않음). 예전 경험에 기초하여, 세포-세포 융합을 저해할 수 있는 다른 mAb는 아마도 LFA-1과 같은 세포 표면 부착 분자 반대로 향하게 될 것으로 추측된다(37). 하이브리도마 PA8-PA12 및 PA14는 IgG1 mAb를 분비하는 ELISA(Cappell, Durham, NC)를 아이소타이프로 나타냄으로써 결정하였다. 복수액을 6개 하이브리도마를 주입한 Balb/C 마우스로부터 준비하였고 IgG1 단편을 정제하였다. PA8, PA9, PA11 , PA12 및 PA14는 명확한 등전 집속 프로파일을 나타내었지만, 반면 PA10은 PA9의 그것과 아주 유사한 프로파일을 나타내었고, 따라서 동일한 mAb의 제 2 분리주일 수 있다(데이터를 나타내지 않음).
2)CCR5+에 mAb 결합
정제된 항-CCR5 mAb 어느 것도 부모 L1.2 세포주를 염색하지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 그러나, 유세포 분석에 의해 결정된 것처럼 mAb PA9-PA12 및 PA14는 L1.2-CCR5+세포의 >90%를 염색하였고, PA8은 L1.2-CCR5+세포의 ~70%를 염색하여, 그들이 CCR5를 인식함을 보여준다(도 1). 우리 실험에서 양성 컨트롤인 항-CCR5 mAb 2D7 또한 L1.2-CCR5+세포의 >90%을 염색하였다. PA8-PA12 및 PA14는 모두 IgG1이고 고우트 항-마우스 IgG와 동일하게 반응하는 반면, 2D7은 IgG2a이고 리포터 항체와 다르게 반응할 수 있다. 단지 mAb PA8-PA12 및 PA14를 사용하여 측정한 평균 형광 강도치(m.f.i.)는 그래서 직접적으로 비교할 수 있다. 평균 형광 강도치(m.f.i.)의 순위는 PA12~ PA11>(2D7=) PA14~ PA10~ PA9>PA8이었다. PA12 m.f.i. 및 PA8 m.f.i.사이의 차이는 3배였다. PA8 및 다른 mAb 사이의 염색 강도에서의 차이는 농도의 넓은 범위에 걸쳐 일정하게 남아 있었고(데이터를 나타내지 않음) 아마도 CCR5에 대한 mAb 친화도에서의 차이와 일치하지는 않는다. 이것은 PA8이 L1.2-CCR5+세포의 표면에 존재하는 CCR5 분자의 서브셋과 단지 상호작용한다는 것을 암시한다.
L1.2-CCR5+세포와 비교하면, 마이토젠-자극 PBMC는 항-CCR5 mAb에 의한 염색의 다른 패턴을 나타냈다. 2D7 및 PA14는 PBMC의 >20%를 염색했고, PA11 및 PA12는 PBMC의 ~10%를 염색했고, PA8, PA9 및 PA10은 PBMC의 <5%를 염색했다(도 1). 염색된 PBMC의 평균 형광 강도치는 각 mAb에 대한 L1.2-CCR5+세포를 사용하여 얻은 것보다 약 10배 더 낮았다; 그들의 순위는 (2D7>) PA14> PA12~ PA11~ PA10~ PA9~ PA8이었다. 또, 이것은 CCR5 감염체에 대해 관찰된 반응 순서와는 다소 달랐다. PA9 m.f.i. 및 PA14 m.f.i. 사이의 차이는 7배였다. 다른 그룹들도 CCR5+세포주 대비 PBMC를 안정하게 염색하기 위한 항-CCR5 mAb 능력에서의 유사한 차이가 관찰되었다(28). 이것은 CCR5 구조, 번역 후기 수정 또는 올리고머화에서 세포-특이적인 차이 때문일 수 있다. 대신에, 다른 세포 표면 분자와 연관이 세포 사이에서 달라질수 있다. 그와 같은 분자에 대한 명확한 선택이 L1.2-CCR5+세포에는 없고, PBMC상에 존재하는 CD4 세포 표면 항원일 수 있기 때문에, 우리는 또한 CCR5를 일시적으로 발현하는 HeLa 세포를 단독으로 또는 CD4와 함께 염색하는 PA8-PA12, PA14 및 2D7 능력을 테스트하였다. CD4 존재하에서 세포 표면 CCR5를 염색하는 mAb의 어떠한 종류의 능력에서도 아무런 차이도 관찰되지 않았다(데이터를 나타내지 않음). 만일 이 두 단백질 사이에 상관성이 있다면, 우리가 이용할 수 있는 항-CCR5 mAb에 의해 인식되는 항원결정기가 관련되지 않는다. 대신에, CCR5 및 CD4 사이에 연합은 제 1기 림프구 상에서 단지 일어날 수 있다.
3)CCR5 알라닌 돌연변이체를 사용하여 mAb의 항원결정기 지도 제작
항체중 어떠한 것도 그들이 민감한 항원결정기를 구조적으로 인식하는 것을 나타내는 웨스턴 블랏팅에 의해 감소된 및 변성된 CCR5 단백질을 검출할 수 없었다.(데이터는 나타나지 않음). mAb 항원결정기 지도작성 연구를 CCR5의 Nt 및 ECL에서 잔기의 70 알라닌 점 돌연변이체로 이루어진 패널을 사용해서 수행하였다. HeLa 세포를 돌연변이체 또는 C-말단 HA 태그가 부착된 야생형 CCR5 암호화 서열을 사용하여 리포펙트하였고, 공수용체 발현을 상승시키기 위하여 vTF7(23)로 감염시켰다. 그리고나서 세포를 항-CCR5 mAb를 사용하여 배양하였고 그들의 결합은 PE-표지된 고우트 항-마우스 IgG에 의해 밝혔다. 제 2, 세포간 염색을 FITC-표지된 항-HA mAb(BabCo)를 사용하여 수행하였다. 이 내부 컨트롤은 우리가 세포 표면상에서 돌연변이체 공수용체 발현 수준에 대한 항-CCR5 mAb에 의한 염색을 직접적으로 표준화하도록 했다. 고로, 각 돌연변이체에 대한 mAb 결합은 야생형 CCR5에 대한 결합의 백분율로서 표현되었다(도 4).
특정 점 돌연변이는 CCR5에 대한 모든 항체의 결합을 >50%까지 감소시켰다. 일반적으로, PA8-PA12가 가장 영향을 많이 받았고, PA14 및 2D7이 시스테인 쌍 C101A 및 C178A, Nt 돌연변이체 Y10A, D11A, K25A, ECL1 돌연변이체 D95A, ECL2 돌연변이체 K171A/E172A, Q188A, K191A/N192A, 및 ECL3 돌연변이체 F263A 및 F264A를 포함하는 돌연변이체의 이 클래스에 의해 가장 영향을 적게 받았다(도 1). 이들 잔기는 mAb 항원결정기 그 자체의 부분이 아니지만, 그들을 알라닌으로 변화시키는 것이 모든 mAb의 결합에서 공통 효과를 가지는 구조적 혼란을 야기한다고 해석할 수 있다. 우리는 만일 돌연변이가 개별 mAb의 결합을 >75% 까지 낮추고 또한 다른 항체의 대부분의 결합을 낮추지 않는다면, 그 잔기는 아마도 mAb에 의해 인식되는 항원결정기에 직접적인 공헌자일 것으로 추측했다. 이러한 엄격한 지침을 사용해서, 7종류의 항-CCR5 mAb가 단지 명확한 항원결정기만의 오버랩핑을 인식한다고 단정했다(도 4). CCR5에 대한 mAb PA8 결합은 Nt에서 N13 및 Y15에 의존했다. mAb PA9 및 PA10은 Nt에서 D2, Y3, Q4, P8 및 N13을 요구했고, ECL2에서 Y176 및 T177을 요구했다. mAb PA9는 또한 Nt에서 S7을 요구했다. mAb PA11 및 PA12 결합은 Nt에서 Q4에 의존했다. PA14는 Nt에서 D2를 요구했고, ECL2에서 R168 및 Y176을 요구했다. 마지막으로, mAb 2D7은 CCR5에 결합하기 위해서 ECL2에서 Q170 및 K171/E172를 요구했다.
4)항-CCR5 mAb 존재하에서 키모카인 신호전달
키모카인 수용체-결합제는 길항제이거나 더욱 드물게는 수용체-매개 세포간신호전달의 작용제일 수 있다. 대신에, 그들은 신호전달에 대한 어떠한 효과도 가질수 없었다. CCR5는 3개의 CC-키모카인, RANTES, MIP-1α 및 MIP-1β를 결합할 수 있고, 시토졸 칼슘 레벨을 조절하는 신호를 변화시킬 수 있다. 우리는 그래서 mAb PA8-PA12, PA14 및 2D7의 다양한 농도의 작용제/길항제 활성을 테스트했다. 세포간 칼슘 농도에서 변화, (Ca2+)i는 Indo-1-로딩된 L1.2-CCR5+세포에서 측정하였다. 어떤 mAb도 (Ca2+)i에서의 변화를 자극하지 못했으며, 이는 그들이 CCR5에 대한 작용제는 아니라는 것을 나타낸다. PA8-PA12는 또한 RANTES에 의해 유도된 Ca2+유입을 심지어 100㎍/ml의 고농도에서도 저해할 수 없었으며(도 5A 및 데이터는 나타나지 않음), 이는 그들이 또한 길항제도 아님을 보여준다. 이들 농도는 유세포분석 및 gp120/CCR5 결합 에세이(도 6D 및 데이터는 나타나지 않음)에서 나타난 것처럼 L1.2-CCR5+세포에 mAb의 포화 결합을 제공한다. 그러나, mAb PA14 및 2D7은 비록 다른 효율성을 가지지만, RANTES에 의해 유도된 칼슘 동원을 저해했다(도 5A, 5B). PA14 칼슘 유입 저해에 대한 IC50은 50㎍/ml이었고, 이는 거의 2D7에 대한 IC50보다 거의 8배 더 높았다(도 5B). RANTES-, MIP-1α- 및 MIP-1β-유도된 칼슘 유입은 각각 PA14의 유사한 농도에 의해 저해되었다(데이터는 나타나지 않음). 어떠한 mAb도 엔도지너스하게 CXCR4를 발현하는 L1.2-CCR5+세포에서 SDF-1-유도 칼슘 동원에 영향을 주지 않았다(데이터는 나타나지 않음). 마지막으로, mAb나 CC-키모카인도 부모 L1.2세포에서 시토졸의 칼슘 레벨에 영향을 주지 못했다(데이터는 나타나지 않음).
5)mAb에 의한 CCR5 공수용체 기능의 저해
mAb PA8-PA12 및 PA14는 HIV-1 외피-매개 세포-세포 융합을 저해하는 능력을 기초로 초기에 선택되었다. 이 활성은 정제된 mAb에 대하여 확인되었고 정량화되었다. 예상한 것처럼, mAb 2D7 뿐만아니라 모든 6종류의 mAb가 RET 에세이에서 CD4+CCR5+PM1 세포 및 HeLa-EnvJR-FL +세포 사이에 융합을 저해했다. 효율성의 순위는 2D7~ PA14> PA12> PA11> PA10~ PA9~ PA8이었다(도. 6A). PA11 및 PA12에 대한 IC50값이 각각 25.5 ㎍/ml 및 10.0㎍/ml인데 대하여 PA14 및 2D7에 대한 IC50값은 각각 1.7㎍/ml 및 1.69㎍/ml이었다(도 3). PA8, PA9 및 PA10은 300㎍/ml에서 단지 10-15% 만큼 융합을 저해했다. 어떤 mAb도 X4 바이러스로부터 전장 외피 단백질을 발현하는 PM1 세포 및 HeLa-EnvLAI +세포 사이 융합에 영향을 미치지 않았다(데이터는 나타나지 않음).
1회 복제, 루시페라제-기초 침입 에세이에서 원형질의 R5 바이러스, JR-FL, 및 R5X4 바이러스, Gun-1의 침입을 저해하는 다른 항-CCR5 mAb의 능력이 또한 테스트되었다. 침입 에세이에서 효율성의 순위는 세포-세포 융합 에세이에서 결정된 것과 유사했다(도 6B). PA8-PA11을 사용하여 JR-FL 또는 Gun-1 침입의 >50% 저해는 얻어질 수 없었다. PA12에 대한 IC50값은 2.5㎍/ml이었다. 그러나, 이 mAb를 사용하여 >60%까지의 침입의 저해는 얻어질 수 없었다. JR-FL 침입의 PA14 및 2D7 저해에 대한 IC50값은 각각 0.024 및 0.026㎍/ml로 정해졌고(도 3), 융합 에세이에서 얻어진 것보다 60배 더 낮았다. 이중성 Gun-1의 침입은 JR-FL 침입 보다 항-CCR5 mAb에 의한 저해에 2-3배 더 민감하였다(데이터는 나타나지 않음).
항-공수용체 mAb는 gp120/CCR5 상호작용에 직접 영향을 줌으로써 또는 활성 융합 복합체의 형성에 관련된 후기-결합 단계를 저해함으로써 외피-매개 융합을 저해하지 않았다. PA8-PA12 및 PA14에 의한 바이러스 융합 및 침입의 저해 메카니즘을 결정하기 위하여, gp120/CCR5 상호작용을 저해하는 다른 mAb의 능력을 테스트하였다. 이를 위해 L1.2-CCR5+세포에 대한 sCD4와 복합체를 형성한 비오틴화된 HIV-1JR-FLgp120의 결합을 검출하는 에세이가 사용되었다. 비오틴화된 gp120의 어떠한 결합도 sCD4 또는 CCR5 부존재하에서, 또는 HIV-1LAIgp120이 사용되었을 때, 관찰되지 않았다(도 6C).
PA8을 제외하고, 모든 mAb는 L1.2-CCR5+에 대한 gp120/sCD4 결합을 폐기하였다(도 6D). PA8에 의한 저해는 ~40%에서 포화되었으며, 이는 이 mAb가 단지 L1.2-CCR5+세포상에서 CCR5 분자의 서브셋에만 단지 결합한다는 것을 암시하면서 유세포 분석 데이터(도 1)와 일치한다. mAb PA9, PA10, PA11, 및 PA12는 각각 0.24, 0.13, 0.33, 0.24 ㎍/ml의 IC50값으로 결합을 저해했다(도 3). 놀랍게도,mAb PA14 및 2D7은 각각 1.58 및 1.38㎍/ml의 IC50값을 가져서, gp120/sCD4의 결합에 대한 두 종류의 최소 효율 저해자였다(도 3). 따라서, gp120/CD4/CCR5-매개 막 융합 및 침입을 저해하는 mAb의 능력 및 공수용체에 gp120/sCD4 결합을 저해하는 그것의 능력 사이에 어떠한 상관관계도 없었다.
6)항-CCR5 mAb 및 다른 바이러스 침입 저해제의 조합에 의한 HIV-1 융합의 상승 저해
공수용체-특이적인 제제는 침입 과정의 여러 단계에서 작용할 수 있으며, 조합으로 사용될 때 첨가된 효과도 나타내지 않는다. 임상적인 관점에서, 그것은 엔도지너스 키모카인과 공수용체-특이적인 후보 약품의 상호작용을 결정하는데에 중요하고, 이는 질병 진행에 대항하여 어떤 수준의 보호를 할 수 있다. 그래서 CCR5 mAb는 서로 서로 또는 RANTES와 함께 또는 표적 세포에 부착을 저해하기 위해 HIV-1 gp120에 결합하는 CD4-IgG2와 함께 조합하여 테스트하였다. 바이러스 융합 및 침입 에세이에서 개별적으로 및 조합하여 사용된 시약에 대하여 투여량-반응 곡선을 얻었다. 데이터를 중앙값 효과 원리를 사용하여 분석하였다(9). 주어진 효과를 얻기 위해 요구되는 단일-시약 또는 그들의 혼합물의 농도를 조합 지수(CI;Combination Index)로 알려진 용어로 정량적으로 비교하였다. 1 보다 더 큰 CI 값은 길항작용을 나타내고, CI~1은 첨가 효과를 나타내고, CI<1은 하나의 약제의 존재가 또 다른 약제의 효과를 강화하는 상승효과를 나타낸다.
PA12 및 2D7의 조합은 0.02~0.29의 CI 값을 가지고, 항체의 비율에 의존하는가장 강력한 상승효과를 나타내었다(도 7 및 도 2). 상승 정도는 시약의 화학양론에 따라 다양하다고 알려졌다. 바이러스 침입 및 융합 에세이는 일반적으로 아주 상승적인 PA12 및 2D7; 적절하게 상승적인, PA12 및 PA14; 상가적인, PA11 및 PA12; 및 약하게 길항적인 PA14 및 2D7인 mAb 조합을 확인할 때에 일반적으로 일치한다. 유세포 분석에 의해 확인된 것처럼(데이터는 나타나지 않음), 만일 CCR5+세포에 결합을 위해 이러한 mAb가 상호-경쟁한다면, PA14 및 2D7 사이의 상승작용의 부족은 놀랍지 않은 것이다. PA11 및 PA12의 상가적인 효과의 관찰은 이러한 mAb가 Nt에서의 잔기 Q4에서 의존성을 공유하는 반면, CCR5에서 근소하게 다른 항원결정기에 결합한다는 것을 나타낼 수 있다.
세포-세포 융합을 저해할 때에 RANTES와 상승작용하는 mAb PA12, PA14 및 2D7의 능력이 또한 테스트되었다. PA12 및 RANTES 조합은 적절한 상승작용을 나타내었다(도 2). PA14 및 2D7은 RANTES와는 어떠한 상승작용도 나타내지 않았으며, 이것은 이들 mAb가 RANTES 결합 및 신호전달의 저해제로 되는 것과 일치한다(도 5A, 5B). 마지막으로, 우리는 mAb PA12, PA14, 2D7 및 gp120과 상호작용하는 CD4-IgG2 사이에 상승작용을 테스트하였다. 우리는 PA12 및 CD4-IgG2 사이에 적절한 상승작용을 관찰했지만, PA14 또는 2D7 및 CD4-IgG2 사이에 어떠한 상승작용도 관찰하지 못했다(도 2).
실험적인 토론
6종류의 쥐 항-CCR5 IgG1 mAb를 분리하였고 특징지었다. PA8, PA9, PA11,PA12 및 PA14가 명확한 분자 종인 반면, PA9 및 PA10은 분석에 의해 구분할 수 없으므로 아마도 동일한 mAb인 것 같다. 본래의 세포 표면 단백질에 반하여 배양된 mAb를 사용한 경우에서 자주 그런것 처럼, 분리된 모든 mAb는 복합체 구조적 항원결정기를 인식한다. 항원결정기 지도 제작은 CCR5 알라닌 점 돌연변이체의 패널을 사용하여 모든 mAb에 대하여 수행되었다. 모든 mAb의 결합에 영향을 미치는 잔기는 유사하게 공수용체에서 구조적 혼란을 야기하고 mAb 항원결정기의 부분을 구성하지는 않을 것으로 추측되었다. 단지 두개의 그와 같은 잔기 Y10 및 D11가 HIV-1 침입에 영향을 주는 것으로 보여진다(20, 52). PA8, PA11 및 PA12 항원결정기는 Nt 도메인에서 배타적으로 위치하고 있다. 이 결과와 일치하게, PA8은 ELISA에서, R31을 통해 잔기 D2를 포함하는 비오틴화된 Nt 펩티드를 결합할 수 있다(데이터는 나타나지 않음). 그러나, 그 결합이 단지 Q4에 강하게 의존하는 PA11 및 PA12는 용액에서 Nt 펩티드에 결합하지 않았다(데이터를 나타내지 않음). 하나의 가능성은 Nt 펩티드는 PA11 및 PA12에 의한 인식을 위해 적절한 구조를 지니지 않는 반면, PA8 결합은 덜 구조-의존적일 수 있다는 것이다. 대신에, PA11 및 PA12는 우리가 돌연변이를 일으키지 않은 잔기와 상호작용하거나 CCR5의 다른 도메인에 위치한 아미노산과 함께 약한 결합을 형성하거나 또는 그 제시가 돌연변이 유발에 의해 변하지 않을 수 있는 펩티드 골격에 결합할 수 있다. 항체 PA9, PA10 및 PA14는 CCR5의 Nt 및 ECL2 도메인 양자에서 잔기를 포함하는 항원결정기를 인식하는 반면, 2D7 항원결정기는 ECL2에서 배타적으로 위치했다.
PA14 항원결정기가 mAb 풋프린트 내에서 이들 두개의 잔기가 서로 서로 인접해 있다는 것을 나타내면서 Nt에서 D2 및 ECL2에서 R168 양자를 포함한다. 그들은 그들의 반대 전하를 통해 심지어 직접적으로 서로서로 상호작용할 수도 있다. mAb PA8-PA12 및 PA14가 다른 강도로 및 세포 유형-의존적인 방법으로 CCR5+세포를 염색했다. PA8을 제외한 모든 mAb는 >90% L1.2-CCR5+세포를 염색했고, PA11 및 PA12에 대하여 최고의 평균 형광강도가 관찰되었다. 그러나, PA14 및 2D7은 PBMC의 최고 퍼센트를 염색했고 또한 이들 세포에 대한 최고의 평균 형광 강도를 나타냈다. Hill 등(28)은 최근에, 트랜스펙션된 세포를 유사하게 염색하지만, 8개 중 단지 두 개만이 PBMC를 염색했고, 아무것도 제 1기 단핵구를 염색하지 않은 항-CCR5 mAb의 패널을 특징지었다. CCR5에 대한 낮은 친화성은 제 1 기 세포를 가진 mAb 중 2개의 비반응성을 설명할 수는 있지만, 이것은 다른 4개가 반응하는데 실패한 것에 대한 설명이 될 것 같진 않다. 우리 mAb 패널에서, 우리는 항원결정기를 가지는 mAb 2D7 및 PA14에 의한 PBMC의 가장 강한 염색은 ECL2의 첫번째 10개의 잔기에서 전체적으로 또는 부분적으로 위치한다는 것을 관찰한다. 그러나, Hill 등은 ECL2 및 ECL3에 대한 mAb가 PBMC를 염색하지 않는 반면, Nt 및 ECL1에 특이적인 mAb가 PBMC를 염색해서 반응의 일치하는 패턴이 확인되지 않았다고 보고한다. mAb에 의한 세포 유형-특이적인 염색에 대한 하나의 설명은 활성화된 PBMC(및 단핵구)가 어떤 mAb 항원결정기를 가리면서 세포 표면 CCR5에 결합하는 CC-키모카인을 분비한다는 것이다. 그러나, 이것은 키모카인-유도 칼슘 동원의 길항제이고 아마도 CCR5에 결합을 위해 CC-키모카인과 경쟁하는 PA14 및 2D7에 대해서는 특히 사실일 것으로 기대할 수 있다. 하지만 이들 mAb는 PBMC를 가장 강하게 염색한다. 대신에, 특이 형태의 CCR5 항원결정기 노출이 세포 유형-특이적인 수용체 올리고머라이제이션, 다른 세포-표면 분자들과의 연관 또는 글라이코실레이션과 같은 다른 후기-번역 변형을 반영할 수 있다. 우리는 mAb 결합에서의 차이가 CD4/CCR5 상호작용에서 세포 유형-특이적인 차이를 반영하지 않는다는 것을 나타냈다.
mAb PA8-PA12는 CCR5+세포에서 CC-키모카인 유도 칼슘 동원을 저해하지 않았고 또한 그들은 CCR5를 통한 신호전달을 매개하지 않았다. mAb 2D7 및 PA14는 CC-키모카인 유도 칼슘 동원의 저해자였지만 2D7은 PA14보다 거의 한 단계 더욱 강력한 순위였다. 이것은 PA14 항원결정기가 2D7 항원결정기보다 CCR5에서 CC-키모카인 결합 도메인과 더 적게 겹치기 때문일 수 있다. 모든 mAb는 또한 HIV-1 침입 및 외피-매개 막 융합을 저해했지만 세포-세포 융합의 저해는 어떤 경우에 바이러스 침입을 저해하는 데 필요로되는 것보다 더욱 두 단계 이상의 항체를 요구했다. 아마도, 응착 분자사이에 상호작용 뿐만 아니라 더 많은 gp120/CD4/CCR5 상호작용이 정해졌고, 바이러스-세포 융합과 비교하여 세포-세포 융합 동안 협동하여 작용하므로, 그것이 저해하기에 더욱 어렵도록 만들것이다. 이것은 일반적으로 LFA-1에 대한 항체 또는 HIV-1 외피 당단백질에 대한 항체에 대해 관찰된다(45, 51). PA8, PA9 및 PA10은 심지어 최고 항체 농도에서도, >15%까지 세포-세포 융합 및 >40%까지 바이러스 침입을 저해할 수 없었다. 그러나, 융합의 >90% 저해가 PA11, PA12 및 PA14를 사용하여 달성되고, 침입의 >90% 저해가 PA14를 사용하여 달성될 수 있었다. 융합 및 침입을 저해할 때 6종류의 mAb 중에서 가장 강력한 것은 PA14였으며,이는 2D7만큼 효과적이었다. 놀랍게도, PA14 및 2D7은 L1.2-CCR5+세포에 gp120/sCD4 결합의 가장 덜 강력한 저해제에 속했으며, 반면 PA9-PA12는 유사한 강도로 저해했으며 PA8은 gp120/sCD4 결합의 >40%를 저해할 수 없었다. 이들 관찰 결과는 다른 세포상에서 제시되는 CCR5 분자의 성질에 대하여 그리고 바이러스 융합 및 침입의 저해 메카니즘에 대한 질문을 일으킨다. mAb 및 gp120-결합 에세이에서 사용된 L1.2 세포상에서 CCR5는 mAb-결합 에세이에서 사용된 PBMC상에서 CCR5 또는 융합 및 침입 에세이에서 사용된 PM1 및 U87MG 세포 상에서 CCR5와 동일한 구조가 아닐 수 있다.
PBMC의 저염색 및 우리 mAb 중 어떤 것에 의한 융합 및 침입의 부분적 저해는 그들이 단지 제 1기 림프구, PM1 및 U87MG-CD4+CCR5+세포주 상에서 발현되는 CCR5 분자의 서브셋과 결합할 수 있다는 것을 나타낸다. 하지만, PA8 이외의 모든 mAb는 L1.2-CCR5+세포를 >90% 염색할 수 있고 이들 세포에 gp120/sCD4 복합체의 결합을 완전히 저해할 수 있다. L1.2-CCR5+및 우리가 사용한 다른 세포 사이의 최소한 하나의 차이는 세포 표면상에서 공수용체 단백질의 밀도이다. 실제로, 우리는 L1.2-CCR5+세포가 PM1 및 U87MG-CD4+CCR5+세포 보다 10배 ~100배 더 많은 세포 표면 공수용체를 발현한다고 추정했다. 그러나 HeLa 세포는 L1.2-CCR5+세포주만큼 많은 공수용체를 일시적으로 발현하도록 조작되었을 때, 우리는 여전히 그들에gp120/sCD4 결합을 검출할 수 없었다(데이터를 나타내지 않음). 그래서 다른 세포-특이적인 인자와 함께 L1.2 상에 CCR5의 과도-발현은 그것이 mAb 및 gp120 양자에 더욱 접근할 수 있도록 하면서, Nt를 현저하게 노출하는 공수용체 구조를 지지할 수 있다. 그와 같은 구조는 G 단백질과 함께 수용체 상호작용에 의해 또는 세포 표면 단백질과 함께 감소되거나 변경된 연관에 의해 수용체 올리고머화에 의해 유도될 수 있다(25, 62). CCR5의 다구조가 세포 표면상에 공존하는가? 및 그들이 모두 바이러스 침입을 허용하는가? mAb 반응성의 패턴은 HIV-1 침입 및 융합이 L1.2-CCR5+세포에 gp120 결합을 위해 요구되는 항원결정기를 포화시키는 mAb 농도의 존재하에서, 감소된 레벨에도 불구하고 일어날 수 있기 때문에 제안될 것이다. 우리는 L1.2-CCR5+세포상에 존재하는 공수용체 분자가 HIV-1 침입할 수 있는 구조를 가지는 반면 PBMC, PM1 및 CCR5+U87MG 상에서의 CCR5 분자가 다수로, 다른 mAb 반응성을 나타내는 침입할 수 있는 상태로 존재한다는 가정을 지지한다. PA14 및 2D7이 모든 구조를 인식할 수 있는 반면에, 다른 mAb는 그러하지 않다. L1.2 세포가 특정의 융합할 수 있는 구조에 도움이 되는 이유가 미제로 남아있다.
gp120-결합 도메인이 CCR5 Nt 도메인의 첫번째 20개의 잔기에 있다는 것이 최근에 설명되었다. CCR5 상에서 gp120-결합 도메인에 대한 mAb가 이 상호작용을 강력하게 저해하지만 그 항원결정기가 이 영역 외부에 있는 PA14 및 2D7처럼, 표적세포로의 HIV-1 융합 및 침입을 저해하는 데 거의 효과적이지 않았다. PA14는 Nt의 끝 및 ECL2에서의 잔기를 인식하는 반면, 2D7 항원결정기는 ECL2에서 배타적으로위치한다. 이들 mAb의 작용 메카니즘이 추측될 수 있다. ECL2의 첫번째 극소수의 잔기에 대한 그들의 결합이 막 융합을 방해하는 공수용체에서 구조 변화를 유도할 수 있을 것이다. 대신에, ECL2 항원결정기의 저해가 공수용체 올리고머화 및 융합할 수 있는 단백질 복합체의 형성을 저해할 수 있다. 하지만 또 다른 가능성은 ECL2에서의 잔기가 융합공의 내부에 접하고 mAb의 결합은 gp41이 플라즈마 막으로 융합 펩티드를 삽입하는 것을 방해한다. 반면에, mAb PA8-PA12는 아마도 gp120/CD4 복합체와 결합하기 위해 단지 직접 경쟁함으로써 융합 및 침입을 저해한다. 우리는 항원결정기 노출 및 CCR5에 대한 친화성 이외의 다른 매개변수가 이들 mAb에 의한 바이러스 침입 저해의 효율성을 결정하는지 여부를 알지 못한다. gp120/공수용체 상호작용에 수반되는 저해 단계가 그 상호작용을 직접 저해하는 것보다 더 효율적인 이유는 명확하지 않다. 이것을 설명하는 한 방법은 CCR5에 gp120 결합의 OFF 속도가 CCR5에 mAb결합의 ON 속도보다 훨씬 더 낮다고 추측하는 것일 것이다. 그래서, 공수용체 분자로부터 mAb가 그 자체를 분리할 때마다 이 상호작용이 막 융합을 유도하기 때문에 바이러스-연관 gp120 분자가 유사-비가역 방법으로 그것을 치환한다.
항-CCR5 mAb의 조합 사이에 상승작용은 아마도 HIV-1 침입의 서로 의존하는 연속적인 단계와 관련된 독특한 항원결정기와 그들의 상호작용의 결과일 것이다. PA12 및 2D7 사이에 관찰되는 상승작용의 정도(많은 상황하에서 CI<0.1)는 <0.2의 CI 값이 항-HIV-1 항체(33, 35, 61), 역전사효소 저해제(29), 또는 프로테아제 저해제(44)의 조합에 대하여 드물게 관찰되기 때문에 특이하다. 그것의 강력함 때문에, PA12:2D7 조합은 상승효과의 높은 레벨이 일관되게 관찰되었으며, 다수 에세이 형태 및 농도 비율로 조사되었다. 적절한 상승작용은 PA14와 조합된 PA12에 대하여 관찰되었다. 우리는 PA12 및 CD4-IgG2 사이에 또한 적절한 상승효과를 관찰하였다. CD4/gp120 복합체는 준안정하고, 만일 공수용체와 상호작용할 수 없다면, 비-융합 유도상태로 퇴화된다(45-48). PA12가 CCR5상에서 gp120-결합 부위를 직접 저해하기 때문에, 그것의 존재는 gp120/CD4 복합체의 불활성을 향해 평형을 이동시킬 수 있다. 이것은 우리가 융합 및 침입의 저해에 대한 CD4-IgG2 및 mAb PA12 사이의 상승작용을 관찰한 이유를 설명할 것이다. mAb PA14 및 CD4-IgG2 사이의 상승작용의 부족은 그들이 바이러스 침입의 두개의 비연속적인 및 독립적인 단계에서 작용한다는 것을 제안한다. 더이상 연구의 조합이 바이러스 융합 및 침입의 저해에 대한 다른 화합물의 상승작용에 대한 정확한 메카니즘을 결정하기위해 필요로 될 것이다.
상기 결과는 HIV-1 침입이 수용체 결합, 공수용체 결합, 및 공수용체 매개 막융합을 포함하는 3개의 명확한 단계로 일어나는 모델과 일치한다. 개별 공수용체 결합 및 융합은 gp120 결합 및 HIV-1 융합/침입을 저해하는 단클론 항체의 능력사이에 상관관계의 부족에 의해 제안된다. 융합 동안의 사건의 배열이 관찰된 상승작용의 패턴에 의해 더욱 제안된다. 그 과정, 소위 gp120 결합, 의 중간 단계를 강력하게 저해하는 PA12와 같은 제제는 이전 및 연속되는 단계의 저해제와 상승적으로 작용한다.
실시예 2
배경: 다약제-내성 HIV-1의 발생 증가가 항레트로바이러스 약제의 새로운 종류에 대한 연구를 하게 했다. CCR5는 최초 HIV-1 분리주에 대한 필수 융합 공수용체이고 항바이러스 요법에 대한 전망있는 표적을 제공한다. PRO140은 시험관내에서 CCR5의 키모카인 수용체 활성에 영향을 주지않는 농도로 HIV-1 침입 및 복제를 강력하게 저해하는 항-CCR5 단클론 항체이다. 본 연구에서, 우리는 HIV-1 감염의 치료요법적 동물 모델을 사용하여 생체내 PRO140의 치료요법적인 가능성을 평가했다.
방법: CD-17 SCID 마우스가 정상 인간 PBMC를 사용하여 재구성되었고 R5 분리주 HIV-1 JR-CSF를 사용하여 감염시켰다. 바이러스 안정화 상태에 도달했을 때, 동물은 PRO140 또는 컨트롤 항체로 복강내주사 처리되었고 로쉬 앰플리코 에세이를 사용하여 바이러스 존재량을 조사하였다. 초기 연구는 PRO 140의 단일 1mg 투여를 조사하였다. 다수번-투여 연구에서, PRO 140은 0.1-1.0mg 범위의 투여량으로 3주동안 3일에 한번씩 투여하였다. 개별 실험에서, 유세포분석이 PRO140 주입에 따른 림프구 고갈의 가능성을 조사하기 위해 사용했다.
결과: PRO140의 단일-투여 및 다수번-투여 양자 모두 모든 처리된 동물에서 검출할 수 없는 정도의 바이러스 양을 감소시켰고 바이러스 양 감소는 1.8 log 10에 이르렀다. 바이러스 복제의 일시적인 조절은 PRO140의 단회 주사 이후에 관찰되었지만 다수번 주사는 치료동안 바이러스 반향에 대한 어떠한 증거도 없이 연장된 조절을 유도했다. 투여량-의존 차이는 바이러스 수에서 PRO 140-매개 감소의 동역학으로 관찰되었다. 유세포측정 분석은 PRO140으로 처리하는 것이 림프구 고갈을 유도하지 않았다는 것을 보여주는데 이는 생체내에서 바이러스 복제에 대한 효과가 유일하게 CCR5-저해물 때문이라는 것을 확인시켜 준다.
결론: PRO140은 HIV-1 감염에 대한 hu-PBL-SCID 마우스 모델에서 안정된 HIV-1 감염을 조절할 때에 아주 효과적이다. 이들 발견은 특히 PRO 140요법을 위한 및 일반적으로 CCR5-저해제 요법을 위한 생체내 증거를 제공한다.
실시예 3
방법:
인간화 CCR5 항체(huPRO 140)는 여기에서 기술된 방법을 사용하여 L1.2-CCR5 세포에서 RANTES-유도 칼슘 동원을 저해하는 능력 및 인간 PBMC에서 HIV-1 CASE C 1/85의 복제를 저해하는 능력을 테스트하였다.
결론:
도 19에서 나타난 것과 같이, 결과는 인간화 CCR5 항체가 HIV-1을 강력하게 저해하지만 RANTES를 저해하지 않는다는 것을 보여준다.
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<160> 13
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 31
<212> PRT
<213> HUMAN
<400> 1
Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr
1 5 10 15
Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Lys Gln Ile Ala Ala Ala Arg
20 25 30
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> HUMAN
<400> 2
His Tyr Ala Ala Ala Gln Trp Asp Phe Gly Asn Thr Met Cys Gln
1 5 10 15
<210> 3
<211> 27
<212> PRT
<213> HUMAN
<400> 3
Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr Cys Ser Ser His Phe Pro
1 5 10 15
Tyr Ser Gln Tyr Gln Phe Trp Lys Asn Phe Gln
20 25
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> HUMAN
<400> 4
Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser Asn Arg Leu Asp
1 5 10 15
Gln
<210> 5
<211> 429
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
tctagaccac catgaagttg cctgttaggc tgttggtgct gatgttctgg attcctgctt 60
ccagcagtga tattgtgatg acccaatctc cactctccct gcctgtcact cctggagagc 120
cagcctccat ctcttgcaga tctagtcagc gccttctgag cagttatgga catacctatt 180
tacattggta cctacagaag ccaggccagt ctccacagct cctgatctac gaagtttcca 240
accgattttc tggggtccca gacaggttca gtggcagtgg gtcagggaca gatttcacac 300
ttaagatcag tagagtggag gctgaggatg tgggagttta ttactgctct caaagtacac 360
atgttcctct cacgttcgga caggggacca aggtggaaat aaaacgtaag tagtcttctc 420
aactctaga 429
<210> 6
<211> 129
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Ser Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Leu Leu
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly His Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser
100 105 110
Ser Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys
<210> 7
<211> 393
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60
attgtgatga cccaatctcc actctccctg cctgtcactc ctggagagcc agcctccatc 120
tcttgcagat ctagtcagcg ccttctgagc agttatggac atacctattt acattggtac 180
ctacagaagc caggccagtc tccacagctc ctgatctacg aagtttccaa ccgattttct 240
ggggtcccag acaggttcag tggcagtggg tcagggacag atttcacact taagatcagt 300
agagtggagg ctgaggatgt gggagtttat tactgctctc aaagtacaca tgttcctctc 360
acgttcggac aggggaccaa ggtggaaata aaa 393
<210> 8
<211> 457
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
acgcgtccac catggaatgg agcggagtct ttatctttct cctgtcagta actgcaggtg 60
tccactccga ggtgcagctg gtggagtctg gtggaggctt ggtaaagcct ggaggttccc 120
ttagactctc ctgtgcagcc tctggttaca ctttcagtaa ctattggatc ggatgggtcc 180
gccaggctcc aggcaaaggg ctggagtgga ttggcgatat ctaccctgga gggaactaca 240
tcaggaacaa tgagaagttc aaggacaaga ccaccctgtc agcagatact tccaagaaca 300
cagcctatct gcaaatgaac agcctgaaaa ccgaggacac agccgtgtat tactgtggaa 360
gcagcttcgg tagtaactac gtgttcgcct ggtttactta ctggggccaa gggactctgg 420
tcacagtctc ctcaggtgag tccttaaaac ctctaga 457
<210> 9
<211> 141
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Ile Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asn Tyr Ile Arg Asn Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Asp Lys Thr Thr Leu Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Gly Ser Ser Phe Gly Ser Asn Tyr Val Phe Ala Trp Phe
115 120 125
Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 10
<211> 412
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
atggaatgga gcggagtctt tatctttctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactccgag 60
gtgcagctgg tggagtctgg tggaggcttg gtaaagcctg gaggttccct tagactctcc 120
tgtgcagcct ctggttacac tttcagtaac tattggatcg gatgggtccg ccaggctcca 180
ggcaaagggc tggagtggat tggcgatatc taccctggag ggaactacat caggaacaat 240
gagaagttca aggacaagac caccctgtca gcagatactt ccaagaacac agcctatctg 300
caaatgaaca gcctgaaaac cgaggacaca gccgtgtatt actgtggaag cagcttcggt 360
agtaactacg tgttcgcctg gtttacttac tggggccaag ggactctggt ca 412
<210> 11
<211> 457
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
tctagaccac catggaatgg agcggggtct ttatctttct cctgtcagta actgcaggtg 60
tccactccca ggtccacctg gtgcagtctg gacctgatgt gaaaaagcct gggacttcaa 120
tgaagatgtc ctgcaagacg tctggataca ccttcagtaa ctattggatc ggatgggtta 180
ggcaggcgcc tggacaaggc cttgagtgga ttggagatat ttaccctgga gggaactata 240
tcaggaacaa tgagaagttc aaggacaaga ccacactgac ggcagacaca tcgaccagca 300
cggcctacat gcaacttggc agcctgagat ctgaagacac tgccgtctat tactgtggaa 360
gcagcttcgg tagtaactac gtgttcgcct ggtttactta ctggggccaa gggactctgg 420
tcacagtctc ctcaggtgag tccttaaaac ctctaga 457
<210> 12
<211> 141
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Ile Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Thr Ser Met Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asn Tyr Ile Arg Asn Asn
65 70 75 80
Gly Lys Phe Lys Asp Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Gly Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Gly Ser Ser Phe Gly Ser Asn Tyr Val Phe Ala Trp Phe
115 120 125
Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 13
<211> 423
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
atggaatgga gcggggtctt tatctttctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag 60
gtccacctgg tgcagtctgg acctgatgtg aaaaagcctg ggacttcaat gaagatgtcc 120
tgcaagacgt ctggatacac cttcagtaac tattggatcg gatgggttag gcaggcgcct 180
ggacaaggcc ttgagtggat tggagatatt taccctggag ggaactatat caggaacaat 240
gagaagttca aggacaagac cacactgacg gcagacacat cgaccagcac ggcctacatg 300
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agtaactacg tgttcgcctg gtttacttac tggggccaag ggactctggt cacagtctcc 420
tca 423
Claims (73)
- (i) 각각의 경쇄가 pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명된 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 경쇄 및 (ii) 각각의 중쇄가 pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁 지정번호 PTA-4098)로 명명된 플라스미드 또는 pVg1:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명된 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하며, 인간 세포의 표면에 있는 CCR5와 결합하는 항-CCR5 항체 또는 그와 같은 항체의 단편.
- 제 1 항에 있어서,상기 중쇄는 pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명된 플라스미드에 의해 발현되는 항-CCR5 항체.
- 제 1 항에 있어서,상기 중쇄는 pVg1:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명된 플라스미드에 의해 발현되는 항-CCR5 항체.
- 각각의 경쇄가 연속적인 아미노산을 포함하며, 그 아미노산이 SEQ ID NO:6에 기재된 서열을 가지는 2개의 경쇄 및 각각의 중쇄가 연속적인 아미노산을 포함하며, 그 아미노산이 SEQ ID NO:9에 기재된 서열을 가지는 2개의 중쇄를 포함하는 항-CCR5 항체.
- 각각의 경쇄가 연속적인 아미노산을 포함하며, 그 아미노산이 SEQ ID NO:6에 기재된 서열을 가지는 2개의 경쇄 및 각각의 중쇄가 연속적인 아미노산을 포함하며, 그 아미노산이 SEQ ID NO:12에 기재된 서열을 가지는 2개의 중쇄를 포함하는 항-CCR5 항체.
- 연속적인 아미노산을 포함하며, 그 아미노산이 SEQ ID NO:6에 기재된 서열을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산.
- 제 6 항에 있어서,상기 연속적인 아미노산은 pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명된 플라스미드에 의해 발현되는 아미노산인 핵산.
- 제 6 항에 있어서,SEQ ID NO:5에 기재된 서열을 포함하는 핵산.
- 제 6 항, 제 7 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,RNA, DNA 또는 cDNA인 핵산.
- 연속적인 아미노산을 포함하며, 그 아미노산이 SEQ ID NO:9에 기재된 서열을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산.
- 제 10 항에 있어서,상기 연속적인 아미노산은 pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명된 플라스미드에 의해 발현되는 아미노산인 핵산.
- 제 10 항에 있어서,SEQ ID NO:8에 기재된 서열을 포함하는 핵산.
- 제 10 항, 제 11 항 또는 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,RNA, DNA 또는 cDNA인 핵산.
- 연속적인 아미노산을 포함하며, 그 아미노산이 SEQ ID NO:12에 기재된 서열을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산.
- 제 14 항에 있어서,상기 연속적인 아미노산은 pVg1:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명된 플라스미드에 의해 발현되는 아미노산인 핵산.
- 제 14 항에 있어서,SEQ ID NO:11에 기재된 서열을 포함하는 핵산.
- 제 14 항, 제 15 항 또는 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,RNA, DNA 또는 cDNA인 핵산.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 의한 항-CCR5 항체 또는 그 단편의 적어도 하나 및 담체를 포함하는 조성물.
- 방사성동위원소, 독소, 폴리에틸렌 글리콜, 세포독성제제 및 검출가능 표지로 이루어진 군에서 선택된 물질을 부착하고 있는 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 항-CCR5 항체 또는 그 단편을 포함하는 조성물.
- (i) 각각의 경쇄가 pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명된 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 경쇄 및 (ii) 각각의 중쇄가 pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명된 플라스미드 또는 pVg1:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명된 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하며, CD4+ 세포의 표면에 있는 CCR5에 결합하는 항체 또는 그와 같은 항체의 단편을, HIV-1 또는 HIV-1 감염 세포의 CD4+ 세포에 대한 융합을 저해하는 양 및 조건하에서, CD4+ 세포와 접촉시켜 CD4+ 세포에 대한 HIV-1 감염을 저해하는 단계를 포함하는 CD4+ 세포의 HIV-1 감염을 저해하는 방법.
- 제 20 항에 있어서,상기 CD4+ 세포는 CCR5를 발현하는 방법.
- (i) 각각의 경쇄가 pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명된 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 경쇄 및 (ii) 각각의 중쇄가 pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명된 플라스미드 또는 pVg1:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명된 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하며, 인간 세포의 표면에 있는 CCR5와 결합하는 항-CCR5 항체 또는 그와 같은 항체의 단편의 유효한 HIV-1 치료 투여량을, HIV-1으로 고통받는 환자를 치료하기에 유효한 조건하에서, 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 HIV-1으로 고통받는 환자를 치료하는 방법.
- (i) 각각의 경쇄가 pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명된 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 경쇄 및 (ii) 각각의 중쇄가 pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명된 플라스미드 또는pVg1:HuPRO140(mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명된 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하며, 인간 세포의 표면에 있는 CCR5와 결합하는 항-CCR5 항체 또는 그와 같은 항체의 단편의 유효한 HIV-1 감염 예방 투여량을, 환자에게서 HIV-1 감염을 예방하기에 유효한 조건하에서, 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자가 HIV-1에 감염되는 것을 예방하는 방법.
- 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서,상기 항-CCR5 항체는 정맥주사, 근육내주사 및 피하주사 방법으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법에 의해 상기 환자에게 투여되는 방법.
- 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서,상기 항-CCR5 항체는 상기 환자에게 지속적으로 투여되는 방법.
- 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서,상기 항-CCR5 항체는 소정의 주기적인 간격으로 상기 환자에게 투여되는 방법.
- 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서,상기 항-CCR5 항체를 검출가능 마커로 표지하는 것을 더 포함하는 방법.
- 제 27 항에 있어서,상기 검출가능 마커는 방사성 또는 형광 마커인 방법.
- 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서,상기 항-CCR5 항체의 투여량은 약 0.1 내지 약 100,000 ㎍/상기 환자의 체중kg 범위인 방법.
- 제 29 항에 있어서,상기 항-CCR5 항체의 투여량은 상기 환자에게서 CCR5에 대한 내인성(endogenous) 키모카인 활성을 저해하지 않는 방법.
- (i) 각각의 경쇄가 pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명된플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 경쇄 및 (ii) 각각의 중쇄가 pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명된 플라스미드 또는 pVg1:HuPRO140(mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명된 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하며, 인간 세포의 표면에 있는 CCR5와 결합하는 항-CCR5 항체 또는 그와 같은 항체의 단편을 포함하는, 최소한 하나의 폴리머와 결합된 항-CCR5 항체 복합체.
- 제 31 항에 있어서,상기 폴리머는 친수성 폴리비닐 폴리머, 폴리알킬렌 에테르, 폴리옥시알킬렌, 폴리메타크릴레이트, 카보머, 분지된 다당류, 분지가 없는 다당류, 당알콜의 폴리머, 헤파린 및 헤파론으로 이루어진 군에서 선택되는 항-CCR5 항체 복합체.
- 제 32 항에 있어서,상기 폴리알킬렌 에테르는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 그 유도체인 항-CCR5 항체 복합체.
- 제 33 항에 있어서,최소한 하나의 PEG는 최소한 20 kD의 평균 분자량을 가지는 항-CCR5 항체 복합체.
- 제 31 항에 있어서,상기 복합체의 겉보기 크기는 최소한 약 500 kD인 항-CCR5 항체 복합체.
- 제 31 항에 있어서,상기 복합체는 복합체를 형성하지 않은 항-CCR5 항체 또는 그 단편과 비교해서, 혈청 반감기(serum half-life)에서의 증가, 순환에 있어 평균체류시간(mean residence time)에서의 증가 및 혈청 제거율(serum clearance rate)에서의 감소 중 최소한 하나를 가지는 항-CCR5 항체 복합체.
- HIV-1 감염 위험에 있는 환자에게 HIV-1에 의한 상기 환자의 CCR5+ 세포의 감염을 저해하기에 유효한 양 및 조건으로 제 31 항에 의한 복합체를 투여하는 단계를 포함하는 HIV-1에 의한 CCR5+ 세포의 감염을 저해하는 방법.
- HIV-1-감염된 환자에게 상기 환자의 HIV-1 감염을 치료하기에 유효한 양 및 조건으로 제 31 항에 의한 복합체를 투여하는 단계를 포함하는 환자에게서 HIV-1 감염을 치료하는 방법.
- 제 38 항에 있어서,상기 복합체의 양은 상기 환자에게서 바이러스 양을 감소시키기에 유효량인 방법.
- 제 38 항에 있어서,상기 복합체의 양은 상기 환자에게서 CD4+ 세포수를 증가시키기에 유효량인 방법.
- 제 38 항에 있어서,상기 환자에게 최소한 하나의 기존 항-바이러스 제제를 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제 37 항 또는 38 항에 있어서,상기 복합체는 정맥주사, 근육내주사 및 피하주사 방법으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법에 의해 상기 환자에게 투여되는 방법.
- 제 37 항 또는 38 항에 있어서,상기 복합체는 상기 환자에게 지속적으로 투여되는 방법.
- 제 37 항 또는 38 항에 있어서,상기 복합체는 소정의 주기적 간격으로 상기 환자에게 투여되는 방법.
- 제 37 항 또는 38 항에 있어서,상기 복합체를 검출가능 마커로 표지하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제 45 항에 있어서,상기 검출가능 마커는 방사성 또는 형광 마커인 방법.
- SEQ ID NO:9에 기재된 아미노산 서열을 가지는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO:6에 기재된 아미노산 서열을 가지는 2개의 경쇄를 포함하는 항-CCR5 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 최소한 하나의 벡터, 및 상기 항-CCR5 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 최소한 하나의 벡터의 최소한 두개의 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주 세포.
- SEQ ID NO:12에 기재된 아미노산 서열을 가지는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO:6에 기재된 아미노산 서열을 가지는 2개의 경쇄를 포함하는 항-CCR5 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 최소한 하나의 벡터, 및 상기 항-CCR5 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 최소한 하나의 벡터의 최소한 두 개의 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주 세포.
- 제 47 항 또는 제 48 항에 있어서,상기 세포는 포유류의 세포인 형질전환된 숙주 세포.
- 제 49 항에 있어서,상기 세포는 COS 세포, CHO 세포 또는 골수종 세포인 형질전환된 숙주 세포.
- 제 47 항 또는 제 48 항에 있어서,상기 세포는 항-CCR5 항체를 분비하는 형질전환된 숙주 세포.
- 제 47 항에 있어서,상기 중쇄를 암호화하는 벡터는 pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명되는 형질전환된 숙주 세포.
- 제 48 항에 있어서,상기 중쇄를 암호화하는 벡터는 pVg1:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명되는 형질전환된 숙주 세포.
- 제 47 항 또는 제 48 항에 있어서,상기 경쇄를 암호화하는 벡터는 pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명되는 형질전환된 숙주 세포.
- 제 47 항에 있어서,상기 중쇄를 암호화하는 벡터는 pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명되고, 경쇄를 암호화하는 상기 벡터는 pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명되는 형질전환된 숙주 세포.
- 제 48 항에 있어서,상기 중쇄를 암호화하는 벡터는 pVg1:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명되고, 상기 경쇄를 암호화하는 벡터는 pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명되는 형질전환된 숙주 세포.
- 제 47 항에 있어서,상기 중쇄를 암호화하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:8에 기재된 핵산 서열을 가지는 형질전환된 숙주 세포.
- 제 48 항에 있어서,상기 중쇄를 암호화하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:11에 기재된 핵산 서열을 가지는 형질전환된 숙주 세포.
- 제 47 항 또는 제 48 항에 있어서,상기 경쇄를 암호화하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:5에 기재된 핵산 서열을 가지는 형질전환된 숙주 세포.
- SEQ ID NO:9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항-CCR5 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터.
- 제 60 항에 있어서,pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명되는 벡터.
- SEQ ID NO:12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항-CCR5 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터.
- 제 62 항에 있어서,pVg1:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명되는 벡터.
- SEQ ID NO:6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항-CCR5 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터.
- 제 64 항에 있어서,pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명되는 벡터.
- pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명된 플라스미드에 의해 암호화되는 2개의 경쇄 및 pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명된 플라스미드 또는 pVg1:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명된 플라스미드에 의해 암호화되는 2개의 중쇄를 포함하는 항체의 생산을 허용하는 조건하에서 (i) pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명된 플라스미드 및 (ii) pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로명명된 플라스미드 또는 pVg1:PRO140 (mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명된 플라스미드를 내포하고 있는 숙주 세포를 배양함으로써, 항-CCR5 항체를 제조하는 단계를 포함하는 항-CCR5 항체의 제조방법.
- a) (i) pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명된 플라스미드 및 (ii) pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명된 플라스미드 또는 pVg1:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명된 플라스미드로 숙주 세포를 형질전환하는 단계; 및b) pVK:HuPRO140-VK (ATCC 기탁지정번호 PTA-4097)로 명명된 플라스미드에 의해 암호화되는 2개의 경쇄 및 pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명된 플라스미드 또는 pVg1:HuPRO140(mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명된 플라스미드에 의해 암호화되는 2개의 중쇄를 포함하는 항체의 생산을 허용하는 조건하에서 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양함으로써, 항-CCR5 항체를 제조하는 단계를 포함하는 항-CCR5 항체의 제조방법.
- 제 66 항 또는 제 67 항에 있어서,상기에서 제조된 항-CCR5 항체를 분리된 형태로 회수하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제 66 항 또는 제 67 항에 있어서,상기 숙주 세포는 포유류의 세포인 방법.
- 제 69 항에 있어서,상기 포유류의 숙주 세포는 COS 세포, CHO 세포 또는 골수종 세포인 방법.
- 제 66 항 또는 제 67 항에 있어서,상기 항-CCR5 항체의 중쇄는 pVg1:HuPRO140 HG2-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4098)로 명명되는 플라스미드에 의해 암호화되는 방법.
- 제 66 항 또는 제 67 항에 있어서,상기 항-CCR5 항체의 중쇄는 pVg1:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (ATCC 기탁지정번호 PTA-4099)로 명명되는 플라스미드에 의해 암호화되는 방법.
- a) SEQ ID NO:6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항-CCR5 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터; 및b) SEQ ID NO:9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항-CCR5 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터, 또는 SEQ ID NO:12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항-CCR5 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 항-CCR5 항체의 제조방법에 사용되는 킷트.
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