ES2316740T3 - Anticuerpo anti-ccr5. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti-CCR5 que comprende (i) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada cadena ligera el producto de expresión de un plásmido denominado pVK:HuPR0140-VK, depósito ATCC Nº PTA-4097, y (ii) dos cadenas pesadas, comprendiendo cada cadena pesada el producto de expresión de un plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 HG2-VH, depósito ATCC Nº PTA-4098, o un plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 (mut B+D+I)-VH, depósito ATCC Nº PTA-4099, o un fragmento de tal anticuerpo anti-CCR5, que se une a CCR5 en la superficie de una célula humana e inhibe la fusión y entrada de HIV-1.

Description

Anticuerpo anti-CCR5.

Por toda esta solicitud, se hace referencia a diversas publicaciones mediante números arábigos. Pueden encontrarse citas completas para estas publicaciones al final de la memoria descriptiva, inmediatamente antes de las reivindicaciones.

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Antecedentes de la invención

El virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1) induce fusión vírica a membrana celular para conseguir entrar en células objetivo (8, 15, 66). La primera interacción de alta afinidad entre el virión y la superficie celular es la unión de la glicoproteína gp120 de la superficie vírica con el antígeno CD4 (13, 30, 41, 42). Esto a su vez induce cambios conformacionales en gp120, que le permiten interactuar con uno de varios receptores de quimioquina (4, 5, 21, 36). El receptor de CC-quimioquina CCR5 es el principal co-receptor para cepas de macrófago-trópicas (R5), y juega un papel crucial en la transmisión sexual de HIV-1 (4, 5, 21, 36). Los virus de linajes de células T-trópicos (X4) usan CXCR4 para entrar en células objetivo y usualmente, pero no siempre, aparecen tarde en la progresión de la enfermedad o como consecuencia de propagación del virus en cultivo de tejidos (4, 5, 21, 36). Algunos aislados de HIV-1 primario son trópicos dobles (R5X4) porque pueden usar ambos co-receptores, aunque no siempre con la misma eficacia (11, 57). Estudios de mutagénesis acoplados con la resolución de la estructura de cristal del núcleo de gp120 demostraron que el lugar de unión a co-receptor en gp120 comprende varios residuos conservados (32, 53,
65).

Se ha demostrado que tirosinas y residuos cargados negativamente en el dominio amino-terminal (Nt) de CCR5 son esenciales para la unión de gp 120 al co-receptor, y para la fusión y entrada de HIV-1 (6, 18, 20, 22, 28, 31, 52, 54). Eran prescindibles residuos en los lazos extracelulares (ECL) 1-3 de CCR5 para función de co-receptor, aunque la configuración inter-dominios de CCR5 tenía que mantenerse para una fusión y entrada vírica óptimas (24). Esto condujo a la conclusión de que gp120 forma interacciones con una superficie difusa en los ECLs o que el Nt se mantiene en una conformación funcional por enlaces con residuos en los ECLs. Estudios con co-receptores quiméricos y anticuerpos monoclonales anti-CCR5 han mostrado también la importancia de lazos extracelulares para entrada vírica (5, 54, 64).

Moléculas que se unen específicamente a CCR5 y CXCR4 y bloquean interacciones con sus ligandos son una herramienta poderosa para sondar adicionalmente las relaciones estructura/función de los co-receptores. La caracterización de tales compuestos podría también ayudar a diseñar agentes terapéuticos eficaces que fijen como objetivo etapas mediadas por co-receptor de entrada vírica. Los inhibidores de la función de co-receptor CCR5 o CXCR4 identificados hasta ahora son de naturaleza diversa e incluyen pequeñas moléculas, péptidos, quimioquinas y sus derivados, y anticuerpos monoclonales (mAbs). Los mecanismos de acción de las pequeñas moléculas que bloquean la entrada interfiriendo con la función de co-receptor CXCR4 no son bien entendidos (17, 49, 55, 68). Un inhibidor tal, la pequeña molécula aniónica AMD3100, depende de residuos en ECL2 y el cuarto dominio trans-membrana (TM) de CXCR4 para inhibir la entrada vírica, pero no está claro si lo hace rompiendo la unión de gp120 a CXCR4 o etapas post-unión que llevan a fusión de membrana (16, 34, 55). Hasta ahora, no se ha informado de moléculas pequeñas que bloqueen específicamente la entrada de HIV-1 mediada por CCR5. La inhibición de la entrada de HIV-1 por quimioquinas es mediada por al menos dos mecanismos distintos: bloqueo de la interacción gp120/co-receptor e internalización del complejo quimioquina/receptor (3, 26, 59, 63). La variante AOP-RANTES inhibe también la recirculación de CCR5 a la superficie celular (40, 56). Variantes tales como RANTES 9-68 y Met-RANTES sólo impiden la interacción gp120/CCR5 y no regulan hacia abajo CCR5 (67). Las variantes SDF-1 actúan presumiblemente a través de un mecanismo similar para bloquear la entrada vírica mediada por CXCR4 (12, 27, 39). Sólo un mAb anti-CXCR4, 12GS, se ha caracterizado por sus propiedades anti-víricas. La eficacia de inhibición de 1205 de la entrada vírica se ha informado que es dependiente de células y aislados (43, 58). Este mAb se une al ECL2 de CXCR4, pero el mecanismo por el que inhibe la entrada es desconocido (7). Pocos de los mAbs anti-CCR5 caracterizados hasta ahora previenen eficazmente la entrada de HIV-1 (28, 64). De manera interesante, mAbs cuyos epítopes están en el dominio Nt de CCR5, que contiene el lugar de unión de gp120, inhiben la fusión y entrada víricas menos eficazmente que el mAb 2D7, cuyo epítope está en ECL2. 2D7 antagoniza también la actividad de CC-quimioquina
(64).

Se ha aislado y caracterizado un panel de seis mAbs de ratón, denominados PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 y PA14. Los seis mAbs se unieron específicamente a células CCR5 pero con diferentes eficacias que eran dependientes del tipo de células. Estudios de representación de mapa de epítopes identificaron los residuos que son importantes para unión de mAbs y revelaron también información sobre el plegado e interacciones de los dominios extracelulares de CCR5. Todos los mAbs inhibieron la fusión y entrada de HIV-1, pero no había correlación entre la capacidad de un mAb para inhibir la fusión y entrada y su capacidad para inhibir la unión de gp120/SCD4 a células CCR5. (Véase Olson et al. (1999) Journal of Virology 73(5):4145-4155 y documento WO 00/35409, publicado el 22 de Junio de 2000). PA14 inhibe la entrada de HIV-1 mediada por CCR5 en concentraciones que no impiden la señalización de CC-quimioquina, bloquea un amplio intervalo de aislados de HIV-1 primario y es más activo que RANTES en el bloqueo de HIV-1 en cultivos de macrófagos. (Véase Trokia et al. (2001) Journal of Virology 75(2):579-588).

Se conocen en la técnica procedimientos de humanización. Véase, por ejemplo, Steinberger et al. Journal of Biological Chemistry (2000) 275(46): 36073-36708, que revela la humanización de un anticuerpo anti-CCR5 policlonal de conejo.

Compendio de la invención

Esta invención proporciona un anticuerpo anti-CCR5 que comprende (i) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada cadena ligera el producto de expresión de un plásmido denominado pVK:HuPR0140-VK (denominación de depósito ATCC PTA-4097) y (ii) dos cadenas pesadas, comprendiendo cada cadena pesada el producto de expresión de un plásmido denominado pVg4:HuPRO140 HG2-VH (denominación de depósito ATCC PTA-4098) o un plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 (mut B+D+I)-VH (denominación de depósito ATCC PTA-4099), o un fragmento de tal anticuerpo, que se une a CCR5 en la superficie de una célula humana.

Esta invención proporciona también un anticuerpo anti-CCR5 que comprende dos cadenas ligeras, comprendiendo cada cadena aminoácidos consecutivos, cuya secuencia de aminoácidos se indica en SEQ ID NO: 6, y dos cadenas pesadas, comprendiendo cada cadena pesada aminoácidos consecutivos, cuya secuencia de aminoácidos se indica en SEQ ID NO: 9.

Esta invención proporciona también un anticuerpo anti-CCR5 que comprende dos cadenas ligeras, comprendiendo cada cadena aminoácidos consecutivos cuya secuencia de aminoácidos se indica en SEQ ID NO: 6, y dos cadenas pesadas, comprendiendo cada cadena pesada aminoácidos consecutivos, cuya secuencia de aminoácidos se indica en SEQ ID NO: 12.

Esta invención proporciona también un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia de aminoácidos se indica en SEQ ID NO: 6. En la realización sujeto, el ácido nucleico comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 5.

Esta invención proporciona también un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia de aminoácidos se indica en SEQ ID NO: 9. En la realización sujeto, el ácido nucleico comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 8.

Esta invención proporciona también un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia de aminoácidos se indica en SEQ ID NO: 12. En la realización sujeto, el ácido nucleico comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 11.

Esta invención proporciona también una composición que comprende al menos un anticuerpo anti-CCR5, o un fragmento del mismo, como se ha descrito antes, junto con un vehículo.

Esta invención proporciona también una composición que comprende el anticuerpo anti-CCR5, o un fragmento del mismo, que tiene incorporado a él un material tal como un radioisótopo, una toxina, polietilenglicol, un agente citotóxico y/o una marca detectable.

Esta invención proporciona también un método para inhibir la infección de una célula CD4+ que comprende poner en contacto la célula CD4+ con un anticuerpo que comprende (i) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada cadena ligera el producto de expresión de un plásmido denominado pVK:HuPR0140-VK (denominación de depósito ATCC PTA-4097) y (ii) dos cadenas pesadas, comprendiendo cada cadena pesada el producto de expresión de un plásmido denominado pVg4:HuPRO140 HG2-VH (denominación de depósito ATCC PTA-4098) o un plásmido denominado pVg4:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (denominación de depósito ATCC PTA-4099), o un fragmento de tal anticuerpo que se une a CCR5 en la superficie de una célula CD4+, en una cantidad y en condiciones tales que se inhibe la fusión de HIV-1 o una célula infectada con HIV-1 a la célula CD4+, inhibiendo por ello la infección con HIV-1 de las células CD4+.

Se revela aquí un método de tratamiento de un sujeto afligido con HIV-1 que comprende administrar al sujeto una dosificación de tratamiento de HIV-1 eficaz de un anticuerpo anti-CCR5 que comprende (i) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada cadena ligera el producto de expresión de un plásmido denominado pVK:HuPR0140-VK (denominación de depósito ATCC PTA-4097) y (ii) dos cadenas pesadas, comprendiendo cada cadena pesada el producto de expresión de un plásmido denominado pVg1:HuPRO140 HG2-VH (denominación de depósito ATCC PTA-4098) o un plásmido denominado pVg1:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (denominación de depósito ATCC PTA-4099), o un fragmento de tal anticuerpo que se une a CCR5 en la superficie de una célula humana, en condiciones eficaces para tratar al sujeto infectado con HIV-1.

También se revela aquí un método para prevenir que un sujeto contraiga una infección con HIV-1 que comprende administrar al sujeto una cantidad de dosificación preventiva de la infección con HIV-1 eficaz de un anticuerpo anti-CCR5 que comprende (i) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada cadena ligera el producto de expresión de un plásmido denominado pVK:HuPR0140-VK (denominación de depósito ATCC PTA-4097) y (ii) dos cadenas pesadas, comprendiendo cada cadena pesada el producto de expresión de un plásmido denominado pVg1:HuPRO140 HG2-VH (denominación de depósito ATCC PTA-4098) o un plásmido denominado pVg1:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (denominación de depósito ATCC PTA-4099), o un fragmento de tal anticuerpo que se une a CCR5 en la superficie de una célula humana, en condiciones eficaces para prevenir en el sujeto la infección con HIV-1.

Esta invención proporciona también un conjugado de anticuerpo anti-CCR5 que comprende un anticuerpo anti-CCR5 que comprende (i) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada cadena ligera el producto de expresión de un plásmido denominado pVK:HuPR0140-VK (denominación de depósito ATCC PTA-4097) y (ii) dos cadenas pesadas, comprendiendo cada cadena pesada el producto de expresión de un plásmido denominado pVg1:HuPRO140 HG2-VH (denominación de depósito ATCC PTA-4098) o un plásmido denominado pVg1:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (denominación de depósito ATCC PTA-4099), o un fragmento de tal anticuerpo que se une a CCR5 en la superficie de una célula humana, conjugado a al menos un polímero.

También se revela aquí un método para inhibir la infección de una célula CCR5+ por HIV-1 que comprende administrar a un sujeto con riesgo de infección con HIV-1 el conjugado descrito antes en una cantidad y en condiciones eficaces para inhibir la infección de células CCR5+ del sujeto por HIV-1.

También se revela aquí un método de tratamiento de una infección con HIV-1 en un sujeto que comprende administrar el conjugado descrito antes a un sujeto infectado con HIV en una cantidad y en condiciones eficaces para tratar la infección con HIV del sujeto.

Esta invención proporciona también una célula hospedante transformada que comprende al menos dos vectores, comprendiendo al menos un vector una secuencia de ácido nucleico que codifica cadenas pesadas de un anticuerpo anti-CCR5, y al menos un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica cadenas ligeras del anticuerpo anti-CCR5, en el que el anticuerpo anti-CCR5 comprende dos cadenas pesadas que tienen la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 9, y dos cadenas ligeras que tienen la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 6.

Esta invención proporciona también una célula hospedante transformada que comprende al menos dos vectores, comprendiendo al menos un vector una secuencia de ácido nucleico que codifica cadenas pesadas de un anticuerpo anti-CCR5, y al menos un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica cadenas ligeras del anticuerpo anti-CCR5, en el que el anticuerpo anti-CCR5 comprende dos cadenas pesadas que tienen la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 12, y dos cadenas ligeras que tienen la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 6.

Esta invención proporciona también un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo anti-CCR5, en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 9.

Esta invención proporciona también un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo anti-CCR5, en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 12.

Esta invención proporciona también un procedimiento para producir un anticuerpo anti-CCR5 que comprende cultivar una célula hospedante que contiene en ella (i) un plásmido denominado pVK:HuPR0140-VK (denominación de depósito ATCC PTA-4097) y (ii) un plásmido denominado pVg4:HuPRO140 HG2-VH (denominación de depósito ATCC PTA-4098) o un plásmido denominado pVg4:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (denominación de depósito ATCC PTA-4099), en condiciones que permiten la producción de un anticuerpo que comprende dos cadenas ligeras codificadas por el plásmido denominado pVK:HuPR0140-VK (denominación de depósito ATCC PTA-4097) y dos cadenas pesadas codificadas por el plásmido denominado pVg4:HuPRO140 HG2-VH (denominación de depósito ATCC PTA-4098) o por el plásmido denominado pVg4:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (denominación de depósito ATCC PTA-4099), para producir por ello un anticuerpo anti-CCR5.

Esta invención proporciona también un procedimiento para producir un anticuerpo anti-CCR5 que comprende a) transformar una célula hospedante con (i) un plásmido denominado pVK:HuPR0140-VK (denominación de depósito ATCC PTA-4097) y (ii) un plásmido denominado pVg4:HuPRO140 HG2-VH (denominación de depósito ATCC PTA-4098) o un plásmido denominado pVg4:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (denominación de depósito ATCC PTA-4099), y b) cultivar la célula hospedante transformada en condiciones que permiten la producción de un anticuerpo que comprende dos cadenas ligeras, codificadas por el plásmido denominado pVK:HuPR0140-VK (denominación de depósito ATCC PTA-4097) y dos cadenas pesadas codificadas por el plásmido denominado pVg4:HuPRO140 HG2-VH (denominación de depósito ATCC PTA-4098) o por el plásmido denominado pVg4:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (denominación de depósito ATCC PTA-4099), para producir por ello un anticuerpo anti-CCR5.

Esta invención proporciona también un juego de uso en un procedimiento para producir un anticuerpo anti-CCR5. El juego comprende a) un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena ligera de un anticuerpo anti-CCR5, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 6, y b) un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo anti-CCR5, en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 9, o un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo anti-CCR5, en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 12.

Breve descripción de las figuras

Figura 1

Unión de anticuerpos monoclonales anti-CCR5 a células CCR5^{+}

Se usó citometría de flujo para detectar expresión de proteína de CCR5 en la superficie de células L1.2-CCR5+ y PBMC estimuladas por PHA/IL-2 aisladas recientemente. Las células se incubaron con concentraciones saturantes de cada mAb, que se detectaron con un anticuerpo informador de IgG anti-ratón marcado con PE. Se muestran los resultados de un experimento representativo. Los resultados para cada mAb se expresan en intensidades de fluorescencia medias (i.f.m.) y en % de células desconectadas. Puesto que PA8-PA12 y PA14 son todas de la subclase IgG1, sus i.f.m. son comparables directamente. 2D7 es una IgG2a.

Figura 2

Valores de CI para diferentes combinaciones de mAbs e inhibidores víricos

Se realizaron experimentos como los descritos en la leyenda de la Fig. 7 para diferentes combinaciones de inhibidores de la entrada vírica. Se ensayaron mAbs anti-CCR5 en combinación entre sí, CC-quimioquinas y CD4-IgG2, que inhibe la incorporación de HIV-1 a células objetivo. El intervalo de concentración de PA11 y PA12 fue 0-250 \mug/ml; el intervalo de concentración de 2D7 y PA14 fue 0-25 \mug/ml; el intervalo de concentración de RANTES fue 0-250 \mug/ml; el intervalo de concentración de CD4-IgG2 fue 0-25 \mug/ml. Las concentraciones de agentes simples o sus mezclas requeridas para producir el 50% y el 90% de inhibición de la fusión o entrada se compararon en una expresión conocida como Índice de combinación (CI).

Figura 3

Valores IC_{50} para inhibición de la fusión célula-célula, entrada vírica y unión de gp120/sCD4 por mAbs anti-CCR5

Con fines de comparación se han resumido los valores IC_{50} obtenidos en los diferentes ensayos en los que se ensayaron los mAbs anti-CCR5. Los valores IC_{50} se calcularon sólo para mAbs que podrían inhibir > 90% de la fusión, entrada o unión.

Figura 4

Representación de mapa de epítopes de mAbs anti-CCR5

Se usó un protocolo de coloración de dos colores para valorar la unión de mAbs a proteínas de CCR5 mutantes, etiquetadas en el término C con el péptido HA. Se incubaron células HeLa que expresan mutantes puntuales de CCR5 con concentraciones saturantes de cada mAb seguido por detección con una IgG anti-ratón marcada con PE. La expresión de co-receptor de la superficie celular se midió por doble coloración de las células con un mAb anti-HA marcado con FITC. Las cuatro rejillas corresponden a los cuatro dominios extracelulares de CCR5. La primera fila de cada rejilla indica la secuencia de aminoácidos del correspondiente dominio extracelular de CCR5 (SEQ ID NOS: 1-4). La unión de mAbs anti-CCR5 al mutante de alanina de cada residuo se expresa como porcentaje de unión a CCR5 de tipo natural, como se describe en Materiales y métodos.

Figura 5

Inhibición de la movilización de calcio a células CCR5^{+} por mAbs anti-CCR5

Se cargaron células L1.2-CCR5^{+} con con Indo-1AM y se estimularon secuencialmente con un mAb anti-CCR5 o PBS, seguido con RANTES (a). Se midieron los cambios de fluorescencia con un espectrofluorómetro y los trazos son de un experimento representativo. Se ensayó la inhibición del flujo de calcio por PA14 y 2D7 para un amplio intervalo de concentraciones de mAb (b). Los resultados se representan como % de inhibición de influjo de calcio = [1-(fluorescencia relativa en presencia de mAb \div fluorescencia relativa en ausencia de mAb)] x 100%, y son medias de valores de tres experimentos independientes.

Figura 6

Inhibición de función de co-receptor CCR5 por mAbs anti-CCR5

La inhibición de la fusión célula-célula por mAbs anti-CCR5 se ensayó en el ensayo RET (a). se añadieron 0-250 \mug/ml de PA8-PA12 o 0-25 \mug/ml de PA14 o 2D7 a una mezcla de células HeLa-Env_{JR-FL}^{+} y PM1, marcadas con F18 y R18 respectivamente. Se midió la fluorescencia RET después de 4 h de incubación. Los resultados son valores medios de tres experimentos independientes y se expresan como % de inhibición de fusión = [1-(% de RET en presencia de mAb \div % de RET en ausencia de mAb)] x 100%. La inhibición de la entrada de HIV-1 por mAbs anti-CCR5 se ensayó en una ronda simple de ensayo de entrada basado en luciferasa de replicación (b). Se infectaron células U87-CD4^{+}CCR5^{+} con virus informador NLluc^{+}env^{-} que lleva la envoltura de JR-FL en presencia de 0-250 \mug/ml de PA8-PA12 o 0-25 \mug/ml de PA14 o 2D7. La actividad de luciferasa (unidades de luz relativas, u.l.r..) se midió en lisados de células 72 h post-infección. Los resultados son de un experimento representativo y se expresan como % de inhibición de la entrada = [1-(u.l.r. en presencia de mAb \div u.l.r. en ausencia de mAb)] x 100%. Unión de gp120 biotinada [b], sCD4 y complejos b-gp120-CD4 a células L1.2-CCR5^{+} (c). Se observa una unión fuerte cuando gyp120 derivada del virus HIV-1_{JR-FL} de R5 se acompleja con una cantidad equimolar de sCD4. No se observa unión en ausencia de sCD4 o para gp120 derivada del virus HIV-1_{LAI} de X4. Se ha sustraído de todas las curvas la unión de fondo a células CCR5-L1.2. La inhibición de la unión de gp120/sCD4 a células L1.2-CCR5^{+} se ensayó en presencia de concentraciones variables de cada anticuerpo (d). Las células se preincubaron en placas de 96 pocillos con un mAb anti-CCR5 seguido por una incubación con un concentración saturante de gp120/sCD4 biotinada. Finalmente, se midió la unión de estreptavidina marcada con PE a células usando un lector de placas de fluorescencia. Los resultados son de un experimento representativo y se expresan como % de inhibición de la unión de gp120/sCD4 = [1-(i.f.m. en presencia de mAb \div; i.f.m.. en ausencia de mAb)] x 100%.

Figura 7

Inhibición sinérgica de fusión célula-célula por PA12 y 2D7

Se obtuvieron curvas dosis-respuesta para los mAbs usados individualmente y en combinación. Se añadieron 0-50 \mug/ml de PA12, 0-25 \mug/ml de 2D7 o una combinación de los dos en una relación 2:1 a una mezcla de células HeLa-Env_{JR-FL}^{+} y PM1, marcadas con R18 y F18 respectivamente. La fluorescencia RET se midió después de 4 horas de incubación. Los resultados se expresan como % de inhibición de la fusión y son las medias de valores de tres experimentos independientes. Los datos se analizaron usando el principio de efecto mediano, que puede escribirse

(1)f = 1/[1 + (K/c)^{m}]

en el que f es la fracción afectada/inhibida, c es concentración, K es la concentración de agente requerida para producir el efecto mediano y m es un coeficiente empírico que describe la forma de la curva dosis-respuesta. La ecuación (1) es una forma generalizada de las ecuaciones que describen la cinética de enzimas de Michaelis-Menton, las isotermas de adsorción de Langmuir y los equilibrios de ionización de Henderson-Hasselbalch, para las que m = 1. En el presente caso, K es igual al valor IC_{50}. K y m se determinaron por ajuste de curva de las curvas dosis-respuesta y la Ecuación (1) se traspuso en términos para permitir el cálculo de c para una f dada. Los parámetros de ajuste óptimo para K y c son 8,8 \mug/ml y 0,54 para PA12, 0,36 \mug/ml y 0,68 para 2D7 y 0,11 \mug/ml y 1,1 para su combinación. Estas curvas se representan e indican una calidad de ajuste razonable entre experimento y teoría.

Figura 8

La figura muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de una versión humanizada de anticuerpo anti-CCR5 de ratón PA14 (SEQ ID NO: 6) y la secuencia de ácido nucleico que codifica el mismo (SEQ ID NO: 5), según la invención. La SEQ ID NO: 7 identifica la región de SEQ ID NO: 5 que codifica la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ D NO: 6. Esta región de variable de cadena ligera está presente en los anticuerpos designados aquí como PRO 140 1 y 2. Se subrayan las regiones que determinan complementariedad ("CDRs").

Figura 9

Esta figura muestra la secuencia de aminoácidos de una primera región variable de cadena pesada de una versión humanizada de anticuerpo anti-CCR5 de ratón PA14 (SEQ ID NO: 9), y la secuencia de ácido nucleico que codifica el mismo (SEQ ID NO: 8), según la invención. La SEQ ID NO: 10 identifica la región de SEQ ID NO: 8 que codifica la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ D NO: 9. Esta región de variable de cadena pesada está presente en el anticuerpo designado aquí como PRO 140 2. Se subrayan las CDRs.

Figura 10

Esta figura muestra la secuencia de aminoácidos de una segunda región variable de cadena pesada de una versión humanizada de anticuerpo anti-CCR5 de ratón PA14 (SEQ ID NO: 12), y la secuencia de ácido nucleico que codifica el mismo (SEQ ID NO: 11), según la invención. La SEQ ID NO: 13 identifica la región de SEQ ID NO: 11 que codifica la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ D NO: 12. Esta región de variable de cadena pesada está presente en el anticuerpo designado aquí como PRO 140 1. Se subrayan las CDRs.

Figura 11

Una dosis simple de anticuerpo de CCR5 humanizado reduce potentemente cargas víricas in vivo

Se reconstituyeron ratones SCID con PBMC humanas normales y se infectaron con HIV-1_{JR-CSF}. Cuando se alcanzó un estado permanente vírico, se trataron los animales. con una dosis i.p. de 1 miligramo simple de anticuerpo de CCR5 humanizado (PRO 140) o anticuerpo testigo isotipo y se comprobó el ARN de HIV en plasma (Ensayo Roche Amplicor).

Figura 12

Reducción sostenida de carga vírica

Se reconstituyeron ratones SCID con PBMC humanas normales y se infectaron con HIV-1_{JR-CSF}. Cuando se alcanzó un estado permanente vírico, se trataron los animales.i.p. con dosis de 0,1 mg de anticuerpo de CCR5 humanizado (PRO 140) cada tres días y se comprobó el ARN de HIV en plasma (Ensayo Roche Amplicor).

Figura 13

Demuestra que no había agotamiento de linfocitos con el uso del anticuerpo de CCR5 (PRO 140) preparado según la invención.

Figura 14

Anticuerpo de CCR5 humanizado (PRO 140) bloquea potentemente la fusión célula-célula de HIV-1 mediada por CCR5

Se humanizó anticuerpo de CCR5 de ratón usando el método de injerto de región determinante de complementariedad (CDR) y sustituciones de estructura. Se expresaron anticuerpos de CCR5 humanizados (PRO 140 1 y PRO 140 2) en células Sp2/0, se purificaron por cromatografía de proteína A y se ensayó su capacidad para bloquear la replicación de la fusión a membrana de HIV-1_{JR-FL} mediada por env como se ha descrito (Litwin et al., J. Virol., 70:6437, 1996).

Figura 15

Anticuerpo de CCR5 humanizado (PRO 140) media en la inhibición potente, independiente del subtipo, de HIV-1

Se ensayó la capacidad de anticuerpos de CCR5 (PRO 140 1 y 2) según la invención para bloquear la replicación de HIV-1 de tipo natural en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) como se ha descrito (Trkola et al., J. Virol., 72:396, 1998). La extensión de la replicación vírica se midió ensayando el contenido de antígeno p24 de sobrenadantes de cultivo de PBMC de 7 días.

Figura 16

Esta figura proporciona un mapa del plásmido pVK-HuPRO140 que codifica la región variable de cadena de plásmido ligera mostrada en la Figura 8 así como las regiones constantes Kappa humanas como se describe en Co et al., J. Immunol., 148:1149, 1992.

Figura 17

Esta figura proporciona un mapa del plásmido pVg4-HuPRO140 HG2 que codifica la región variable de cadena pesada mostrada en la Figura 9 así como las regiones constantes de cadena pesada humanas CH1, bisagra, CH2 y CH3 de IgG4 humana como se describe en He et al., J. Immunol. 160:1029 (1998).

Figura 18

Esta figura proporciona un mapa del plásmido pVg4-HuPRO140 (mut B+D+1) que codifica la región variable de cadena pesada mostrada en la Figura 10 así como las regiones constantes de cadena pesada humanas CH1, bisagra, CH2 y CH3 de IgG4 humana como se describe en He et al., J. Immunol. 160:1029 (1998).

Figura 19

Hu PRO140 bloquea HIV-1 pero no la señalización de RANTES

Se ensayó en anticuerpos PRO14 según la invención su capacidad para bloquear la movilización de calcio inducida por RANTES en células L1.2-CCR5 (Olson et al., J. Virol., 72:396, 1998). Esta figura muestra que un anticuerpo de CCR5 humanizado (huPRO140) bloquea HIV-1 pero no la señalización de RANTES.

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Descripción detallada de la invención

Los plásmidos designados como HuPRO140-VK, HuPRO14 (mut B+D+1)-VH y HuPRO140 HG2-VH, a los que se hace referencia en las Figuras 16, 18 y 17 como pVK-HuPRO140, pVg44-HuPRO140 (mut B+D+I) y pVg4-HuPRO140 HG2 respectivamente se depositaron en la American Type Culture Collection, Manassas, Va., EE.UU. 20108 el 22 de Febrero de 2002, bajo los Nº de admisión ATCC PTA 4097, PTA 4099 y PTA 4098 respectivamente. Estos depósitos se hicieron siguiendo las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos con el propósito de procedimiento de patentes (Tratado de Budapest).

Esta invención proporciona una composición para inhibir la infección con HIV-1 que comprende al menos dos compuestos en cantidades eficaces sinérgicamente para inhibir la infección con HIV-1, en la que al menos uno de los compuestos impide la interacción productiva entre HIV-1 y un co-receptor de fusión de HIV-1.

Según se usa aquí, "composición" significa una mezcla. Las composiciones incluyen, aunque sin limitarse a ellas, las adecuadas para administración oral, rectal, intravaginal, tópica, nasal, oftálmica o parenteral a un sujeto. Según se usa aquí, "parenteral" incluye, aunque sin limitarse a ellas, inyecciones o técnicas de infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular o intraesternal.

Según se usa aquí, "HIV-1" significa el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1. El HIV-1 incluye, aunque sin limitarse a ellas, partículas del virus extracelulares y las formas de HIV-1 encontradas en células infectadas con HIV-1.

Según se usa aquí, "infección con HIV-1" significa la introducción de información genética de HIV-1 en una célula objetivo, tal como mediante fusión de la membrana de la célula objetivo con HIV-1 o una célula de glicoproteína de envoltura de HIV-1. La célula objetivo puede ser una célula corporal de un sujeto. En la realización preferida, la célula objetivo es una célula corporal de un sujeto humano.

Según se usa aquí, "inhibición de la infección con HIV-1" significa la reducción de la cantidad de información genética de HIV-1 introducida en una población de células objetivo en comparación con la cantidad que se habría introducido sin dicha composición.

Según se usa aquí, "compuesto" significa una entidad molecular, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, péptidos, polipéptidos y otras moléculas orgánicas o inorgánicas y combinaciones de ellas.

Según se usa aquí, "eficaz sinérgicamente" significa que el efecto combinado de los compuestos cuando se usan en combinación es mayor que sus efectos aditivos cuando se usan individualmente.

Según se usa aquí, "interacción productiva" significa que la interacción de HIV-1 y el co-receptor de HIV-1 conduciría a la fusión de dicho HIV-1 o célula de glicoproteína^{+} de envoltura de HIV-1 y la membrana que lleva el co-receptor.

Según se usa aquí, "impide la interacción productiva" significa que se reduce la cantidad de interacción en comparación con la cantidad que tendría lugar sin el compuesto. Las interacciones pueden impedirse ocultando o alterando regiones interactivas en el co-receptor o HIV-1, o alterando el estado de expresión, agregación, conformación o asociación del co-receptor.

Según se usa aquí, "co-receptor de fusión de HIV-1" significa un receptor celular que media en la fusión entre la célula objetivo que expresa el receptor y HIV-1 o una célula de glicoproteína de envoltura de HIV-1. Los co-receptores de fusión de HIV-1 incluyen, aunque sin limitarse a ellos, CCR5, CXCR4 y otros receptores de quimioquinas.

Esta invención proporciona también una composición que inhibe la fusión de HIV-1 o una célula de glicoproteína de envoltura de HIV-1 a una célula objetivo, que comprende al menos dos compuestos en cantidades eficaces sinérgicamente para inhibir la fusión de HIV-1, o una célula de glicoproteína^{+} de envoltura de HIV-1 a una célula objetivo, en la que al menos uno de los compuestos impide la interacción productiva entre HIV-1 y un co-receptor de fusión de HIV-1.

Según se usa aquí, "fusión" significa el enlace o unión de las membranas bicapa de lípidos encontradas en células de mamíferos o virus tales como HIV-1. Este procedimiento se distingue de la incorporación de HIV-1 a una célula objetivo. La incorporación es mediada por la unión de la glicoproteína exterior de HIV-1 al receptor CD4 humano, que no es un co-receptor de fusión.

Según se usa aquí, "inhibe" significa que se reduce la cantidad en comparación con la cantidad que tendría lugar sin la composición.

Según se usa aquí, "célula objetivo" significa una célula capaz de ser infectada o fusionarse con HIV-1 o células infectadas con HIV-1.

Según se usa aquí, "quimioquina" significa una citoquina que puede estimular el movimiento de leucocitos. Puede caracterizarse como cis-cis o cis-X-cis dependiendo de si los dos residuos de cisteína amino terminales están inmediatamente adyacentes o separados por un aminoácido. Incluye, aunque no está limitada a ellas, RANTES, MIP-1\alpha, MIP-1\beta, SDF-1 u otra quimioquina que bloquee la infección con HIV-1.

En una realización de las composiciones anteriores, el co-receptor es un receptor de quimioquina. En la realización preferida de las composiciones anteriores, el receptor de quimioquina es CCR5 o CXCR4. Se conocen varios otros receptores de quimioquina y relacionados que funcionan como co-receptores, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, CCR2, CCR3, CCR8, STRL33, GPR-15, CX3CR1 y APJ (69).

Según se usa aquí, "receptor de quimioquina" significa un miembro de una familia homóloga de siete proteínas de la superficie celular que abarcan transmembranas, que se unen a quimioquinas.

Según se usa aquí, "CCR5" es un receptor de quimioquina que se une a miembros del grupo C-C de quimioquinas y cuya secuencia de aminoácidos comprende la proporcionada en el Número de admisión Genbank 1705896 y variantes polimórficas relacionadas.

Según se usa aquí, "CXCR4" es un receptor de quimioquina que se une a miembros del grupo C-X-C de quimioquinas y cuya secuencia de aminoácidos comprende la proporcionada en el Número de admisión Genbank 400654 y variantes polimórficas relacionadas.

En una realización de las composiciones anteriores, al menos uno de los compuestos es una molécula no peptídica. En una realización, la molécula no peptídica es el compuesto biciclam AMD3100 (16).

Según se usa aquí, "molécula no peptídica" significa una molécula que no consiste en su integridad en una secuencia de aminoácidos lineal enlazados por enlaces péptido. No obstante, una molécula no peptídica puede contener uno o más enlaces péptido.

En una realización de las composiciones anteriores, al menos uno de los compuestos es un anticuerpo. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otra realización, el anticuerpo anti-receptor de quimioquina. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo anti-CXCR4. En una realización adicional, el anticuerpo anti-CXCR4 es 12G5 (43). En una realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo anti-CCR5. El anticuerpo anti-CCR5 incluye, aunque sin limitarse a ellos, PA8, PA9, PA10, PA11, PA12, PA14 y 2D7. En esta composición, los compuestos están en una realización apropiada. La relación varía de 1:1 a 1000:1.

Los anticuerpos monoclonales PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 y PA14 se depositaron de acuerdo con, y en satisfacción de, los requisitos del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos con el propósito de procedimiento de patentes en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 el 2 de Diciembre de 1988, bajo los siguientes Números de Admisión: Nº de admisión ATCC HB-12605 (PA8), Nº de admisión ATCC HB-12606 (PA9), Nº de admisión ATCC HB-12607 (PA10), Nº de admisión ATCC HB-12608 (PA11), Nº de admisión ATCC HB-12609 (PA12), y Nº de admisión ATCC HB-12610 (PA14).

En otra realización de las composiciones anteriores, dos o más de los compuestos son anticuerpos. En una realización de la invención, los anticuerpos incluyen, aunque sin limitarse a ellos, PA8, PA9, PA10, PA11, PA12, PA14 y 2D7. En esta composición, los compuestos están en una realización apropiada. La relación varía de 1:1 a 50:1.

Según se usa aquí, "anticuerpo" significa una molécula de inmunoglobulina que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras y que reconoce un antígeno. La molécula de inmunoglobulina puede derivarse de cualquiera de las clases conocidas comúnmente, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, IgA, IgA secretora, IgG e IgM. Las subclases de IgG también son muy conocidas por los técnicos e incluyen, aunque sin limitarse a ellas, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas. Incluye, a modo de ejemplo, anticuerpos de origen natural y de origen no natural. Específicamente, "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, y fragmentos monovalentes y divalentes de ellos. Además, "anticuerpo" incluye anticuerpos quiméricos, anticuerpos totalmente sintéticos; anticuerpos de cadena sencilla y fragmentos de ellos. Opcionalmente, un anticuerpo puede marcarse con un marcador detectable. Los marcadores detectables incluyen, por ejemplo, marcadores radioactivos o fluorescentes. El anticuerpo puede ser un anticuerpo humano o no humano. El anticuerpo no humano puede humanizarse por métodos recombinantes para reducir su inmunogenicidad en el hombre. Los métodos para humanizar anticuerpos se conocen por los expertos en la técnica.

Según se usa aquí, "anticuerpo monoclonal", designado también como mAb, se usa para describir moléculas de anticuerpo cuyas secuencias primarias son esencialmente idénticas y que presentan la misma especificidad antígena. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse por técnicas de hibridomas, recombinantes, transgénicas u otras, conocidas por un experto en la técnica.

Según se usa aquí, "anticuerpo anti-receptor de quimioquina" significa un anticuerpo que reconoce y se une a un epítope en un receptor de quimioquina. Según se usa aquí, "anticuerpo anti-CCR5" significa un anticuerpo monoclonal que reconoce y se une a un epítopo en el receptor de quimioquina CCR5.

Según se usa aquí, "relación apropiada" significa relaciones en masa o en moles en las que los compuestos son eficaces sinérgicamente.

En una realización de las composiciones anteriores, al menos un compuesto es una quimioquina o un derivado de quimioquina. Las quimioquinas incluyen, aunque sin limitarse a ellas, RANTES, MIP-1\alpha, MIP-1\beta, SDF-1 o una combinación de ellas. En esta composición, los compuestos están en una relación apropiada. Los derivados de quimioquina incluyen, aunque sin limitarse a ellos, Met-RANTES, AOP-RANTES, RANTES 9-68 o una combinación de ellos.

Según se usa aquí, "derivado de quimioquina" significa una quimioquina modificada químicamente. Las modificaciones químicas incluyen, aunque sin limitarse a ellas, sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos, adiciones no peptídicas u oxidaciones. Un experto en la técnica será capaz de fabricar tales derivados.

En otra realización de las composiciones anteriores, al menos un compuesto es un anticuerpo y al menos un compuesto es una quimioquina o derivado de quimioquina. En esta composición, los compuestos están en una relación apropiada. La relación varía de 100:1 a 1000:1.

En otra realización de las composiciones anteriores, al menos un compuesto se une a la subunidad gp41 de la glicoproteína de envoltura de HIV-1. En una realización, al menos un compuesto es el inhibidor de péptido T-20 de la entrada de HIV-1 (70).

En otra realización de las composiciones anteriores, al menos uno de los compuestos inhibe la incorporación de HIV-1 a una célula objetivo. En una realización, al menos un compuesto se une a CD4. En una realización, al menos un compuesto es una glicoproteína de envoltura de HIV-1. En una realización, al menos un compuesto es un anticuerpo anti-CD4. En una realización, al menos un compuesto se une a la glicoproteína de envoltura de HIV-1. En una realización, al menos un compuesto es un anticuerpo para la glicoproteína de envoltura de HIV-1. En una realización, al menos un compuesto es una proteína basada en CD4. En una realización, al menos un compuesto es CD4-IgG2.

En otra realización de las composiciones anteriores, al menos un compuesto es un anticuerpo y al menos un compuesto se une a una glicoproteína de envoltura de HIV-1. En una realización, el compuesto es una proteína basada en CD4. En una realización, el compuesto es CD4-IgG2. En esta composición, los compuestos están en una relación apropiada. La relación varía de 1:1 a 10:1.

Según se usa aquí, "incorporación" significa el proceso que es mediado por la unión de la glicoproteína de envoltura de HIV-1 al receptor CD4 humano, que no es un co-receptor de fusión.

Según se usa aquí, "CD4" significa la proteína de CD4 unida a membrana, nativa, madura, que comprende un dominio citoplásmico, un dominio transmembrana hidrófobo y un dominio extracelular que se une a la glicoproteína de envoltura gp120 de HIV-1.

Según se usa aquí, "glicoproteína de envoltura de HIV-1" significa la proteína codificada por HIV-1 que comprende la proteína superficial de gp120, la proteína transmembrana de gp41 y oligómeros y precursores de ellas.

Según se usa aquí, "proteína basada en CD4" significa cualquier proteína que comprende al menos una secuencia de residuos de aminoácidos correspondientes a la porción de CD4 que es requerida para que CD4 forme un complejo con la glicoproteína de envoltura gp120 de HIV-1.

Según se usa aquí, "CD4-IgG2" significa una proteína de fusión de CD4-IgG2 humana heterotetrámera codificada por los vectores de expresión depositados con los Números de Admisión ATCC 75193 y 75194.

En una realización de las composiciones anteriores, al menos uno de los compuestos comprende un polipéptido que se une a un epítope de CCR5. En una realización, el epítope está situado en el término N, uno de las tres regiones de lazo extracelulares o una combinación de ellos. En una realización, el epítope está situado en el término N. El epítope puede comprender N13 e Y15 en el término N. El epítope puede comprender Q4 en el término N. En otra realización, el epítope incluye residuos en el término N y el segundo lazo extracelular. El epítope puede comprender D2, Y3, Q4, S7, P8 y N13 en el término N e Y176 y T177 en el segundo lazo extracelular. El epítope puede comprender D2, Y3, Q4, P8 y N13 en el término N e Y176 y T177 en el segundo lazo extracelular. El epítope puede comprender D2 en el término N y R168 e Y176 en el segundo lazo extracelular. En una realización, el epítope está situado en el segundo lazo extracelular. El epítope puede comprender Q170 y K171 en el segundo lazo extracelular. El epítope puede comprender Q170 y E172 en el segundo lazo extracelular.

Según se usan aquí, las siguientes abreviaturas estándares se emplean por toda la memoria descriptiva para indicar aminoácidos específicos:

A = ala = alanina

R = arg = arginina

N = asn = asparagina

D = asp = ácido aspártico

C = cys = cisteína

Q = gln = glutamina

E = glu = ácido glutámico

G = gly = glicina

H = his = histidina

I = ile = isoleucina

L = leu = leucina

K = lys = lisina

M = met = metionina

F = phe = fenilalanina

P = pro = prolina

S = ser = serina

T = thr = treonina

W = trp = triptófano

Y = tyr = tirosina

V = val = valina

Según se usa aquí, "polipéptido" significa dos o más aminoácidos enlazados por un enlace péptido.

Según se usa aquí, "epítope" significa una porción de una molécula o moléculas que forma una superficie para unión a anticuerpos u otros compuestos. El epítope puede comprender aminoácidos contiguos o no contiguos, hidrato de carbono u otros restos no peptídicos o superficies oligómero-específicas.

Según se usa aquí, "término N" significa la secuencia de aminoácidos que abarca la metionina de iniciación y la primera región transmembrana.

Según se usa aquí, "segundo lazo extracelular" significa la secuencia de aminoácidos que abarca las cuarta y quinta regiones transmembrana y se presentan en la superficie.

En una realización de las composiciones anteriores, al menos uno de los compuestos comprende una cadena ligera de un anticuerpo. En otra realización de las composiciones anteriores, al menos uno de los compuestos comprende una cadena pesada de un anticuerpo. En otra realización de las composiciones anteriores, al menos uno de los compuestos comprende la porción Fab de un anticuerpo. En otra realización de las composiciones anteriores, al menos uno de los compuestos comprende el dominio variable de un anticuerpo. En otra realización, el anticuerpo se produce como un polipéptido simple o anticuerpo de "cadena sencilla" que comprende los dominios variables de cadenas pesada y ligera enlazados genéticamente mediante una secuencia de aminoácidos intermedia. En otra realización de las composiciones anteriores, al menos uno de los compuestos comprende una o más porciones de CDR de un
anticuerpo.

Según se usa aquí, "cadena pesada" significa el polipéptido mayor de una molécula de anticuerpo compuesta por un dominio variable (VH) y tres o cuatro dominios constantes (CH1, CH2, CH3 y CH4) o fragmentos de ellos.

Según se usa aquí, "cadena ligera" significa el polipéptido menor de una molécula de anticuerpo compuesta por un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL) o fragmentos de ellos.

Según se usa aquí, "Fab" significa un fragmento de unión a antígeno monovalente de una inmunoglobulina que consiste en una cadena ligera y parte de una cadena pesada. Puede obtenerse por digestión con papaína breve o por métodos recombinantes.

Según se usa aquí, "fragmento de F(ab')2" significa un fragmento de unión a antígeno bivalente de una inmunoglobulina que consiste en ambas cadenas ligeras y parte de ambas cadenas pesadas. Puede obtenerse por digestión con pepsina breve o métodos recombinantes.

Según se usa aquí, "CDR" o "región determinante de complementariedad" significa una secuencia altamente variable de aminoácidos en el dominio variable de un anticuerpo.

Esta invención proporciona las composiciones anteriores y un vehículo aceptable farmacéuticamente. Los vehículos aceptables farmacéuticamente son muy conocidos por los expertos en la técnica. Tales vehículos aceptables farmacéuticamente pueden incluir, pero no están limitados a ellas, soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas. Son ejemplos de disolventes no acuosos propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, aceites de Ringer o fijos lactatados. Los vehículos intravenosos incluyen rellenadores fluidos y nutrientes, rellenadores de electrolitos tales como los basados en dextrosa de Ringer y similares. Pueden estar presentes también agentes de conservación y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes de quelación, gases inertes y similares.

Esta invención proporciona un método para tratar un sujeto afligido con HIV-1 que comprende administrar al sujeto una dosis eficaz de las composiciones anteriores.

Según se usa aquí, "sujeto" significa cualquier animal o animal modificado artificialmente capaz de resultar infectado con HIV. Los animales modificados artificialmente incluyen, aunque sin limitarse a ellos, ratones SCID con sistemas inmunes humanos. Los animales incluyen, aunque sin limitarse a ellos, ratones, ratas, perros, cobayas, hurones, conejos y primates. En la realización preferida, el sujeto es un ser humano.

Según se usa aquí, "tratamiento" significa retardo, detención o inversión de la progresión de un trastorno de HIV-1. En la realización preferida, "tratamiento" significa inversión de la progresión hasta el punto de eliminar el trastorno. Según se usa aquí, "tratamiento" significa también la reducción del número de infecciones víricas, reducción del número de partículas víricas infecciosas, reducción del número de células infectadas víricamente o la mejora de síntomas asociados con HIV-1.

Según se usa aquí, "afligido con HIV-1" significa que el sujeto tiene al menos una célula que se ha infectado por HIV-1.

Según se usa aquí, "administración" puede efectuarse o realizarse usando cualquiera de los métodos conocidos por un experto en la técnica. Los métodos pueden comprender medios intravenosos, intramusculares o subcutáneos.

La dosis de la composición de la invención variará dependiendo del sujeto y de la vía particular de administración usada. Las dosificaciones pueden variar de 0,1 a 100.000 \mug/kg. En base a la composición, la dosis puede suministrarse continuamente, tal como mediante bomba continua, o a intervalos periódicos. Por ejemplo, en una o más ocasiones separadas. Los intervalos de tiempo deseados de dosis múltiples de una composición particular pueden determinarse sin experimentación indebida por un experto en la técnica.

Según se usa aquí, "dosis eficaz" significa una magnitud en cantidades suficientes para tratar al sujeto o impedir que el sujeto resulte infectado con HIV-1. Una persona de experiencia ordinaria en la técnica puede realizar experimentos de titulación simples para determinar qué cantidad se requiere para tratar al sujeto.

Esta invención proporciona un método para prevenir que un sujeto contraiga HIV-1 que comprende administrar al sujeto una dosis eficaz de las composiciones anteriores.

Según se usa aquí, "que contrae HIV-1" significa que resulta infectado con HIV-1, cuya información genética se replica en y/o se incorpora a las células hospedantes.

Esta invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-CCR5. El anticuerpo incluye, aunque sin limitarse a ellos, los siguientes: PA8 (Nº de admisión ATCC HB-12605), PA9 (Nº de admisión ATCC HB-12606), PA10 (Nº de admisión ATCC HB-12607), PA11 (Nº de admisión ATCC HB-12608), PA12 (Nº de admisión ATCC HB-12609) y PA14 (Nº de admisión ATCC HB-12610).

Esta invención proporciona formas humanizadas de los anticuerpos anteriores.

Según se usa aquí, "humanizado" describe anticuerpos en los que algunos, muchos o todos los aminoácidos fuera de las regiones CDR se sustituyen con aminoácidos correspondientes derivados de moléculas de inmunoglobulina humana. En una realización de las formas humanizadas de los anticuerpos, algunos, muchos o todos los aminoácidos fuera de las regiones CDR se han sustituido con aminoácidos de moléculas de inmunoglobulina humana, pero en las que algunos, muchos o todos los aminoácidos dentro de una o más regiones CDR están inalterados. Son permisibles pequeñas adiciones, supresiones, inserciones, sustituciones o modificaciones de aminoácidos siempre que no abroguen la capacidad del anticuerpo para unirse a un antígeno dado. Las moléculas de inmunoglobulina humana adecuadas incluirían moléculas de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgM. Un anticuerpo "humanizado" conservaría una especificidad antígena similar al anticuerpo original, es decir, en la presente invención, la capacidad para unirse a CCR5.

Un experto en la técnica sabría cómo fabricar los anticuerpos humanizados de la invención sujeto. Diversas publicaciones describen también cómo fabricar anticuerpos humanizados. Por ejemplo, los métodos descritos en la Patente de los EE.UU. Nº 4.816.567 (71) comprenden la producción de anticuerpos quiméricos que tienen una región variable de un anticuerpo y una región constante de otro anticuerpo.

La Patente de los Estados Unidos Nº 5.225.539 (72) describe otro método para producir un anticuerpo humanizado. Esta patente describe el uso de tecnología de ADN recombinante para producir un anticuerpo humanizado en el que las CDRs de una región variable de una inmunoglobulina se sustituyen con las CDRs de una inmunoglobulina con diferente especificidad, de tal modo que el anticuerpo humanizado reconocería el objetivo deseado paro no sería reconocido de manera significativa por el siustema inmune del sujeto humano. Específicamente, se usa mutagénesis dirigida al lugar para injertar las CDRs en la estructura.

Otros métodos para humanizar un anticuerpo se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nº 5.585.089 (73) y 5.693.761 (74) y en el documento WO 90/07861, que describe métodos para producir inmunoglobulinas humanizadas. Éstas tienen una o más CDRs y posibles aminoácidos adicionales de una inmunoglobulina donante y una región de estructura de una inmunoglobulina humana que lo acepta. Estas patentes describen un método para aumentar la afinidad de un anticuerpo para el antígeno deseado. Se escogen algunos aminoácidos de la estructura para que sean los mismos que los aminoácidos en esas posiciones del donante en lugar de en el aceptor. Específicamente, estas patentes describen la preparación de un anticuerpo humanizado que se une a un receptor combinando las CDRs de un anticuerpo monoclonal de ratón con estructura de inmunoglobulina humana y regiones constantes. Las regiones de estructura humana pueden escogerse para maximizar la homología con la secuencia de ratón. Puede usarse un modelo de ordenador para identificar aminoácidos en la región de la estructura que interactúen probablemente con las CDRs o el antígeno específico, y pueden usarse después aminoácidos de ratón en estas posiciones para crear el anticuerpo humanizado.

Las patentes anteriores 5.585.089 y 5.693.761 y el documento WO 90/07861 (75) proponen también cuatro criterios posibles que pueden usarse para diseñar los anticuerpos humanizados. La primera propuesta era para un aceptor, el uso de una estructura de una inmunoglobulina humana particular que sea inusualmente homóloga con la inmunoglobulina del donante a humanizar, o el uso de una estructura de consenso de muchos anticuerpos humanos. La segunda propuesta era que si un aminoácido de la estructura de la inmunoglobulina humana es inusual y el aminoácido del donante en esa posición es típico para secuencias humanas, puede seleccionarse el aminoácido del donante en lugar del aceptor. La tercera propuesta era que en las posiciones inmediatamente adyacentes a las 3 CDRs en la cadena de inmunoglobulina humanizada, puede seleccionarse el aminoácido del donante en lugar aminoácido del aceptor. La cuarta propuesta era usar el residuo de aminoácido del donante en las posiciones de la estructura en las que se predice que el aminoácido tenga un átomo de cadena secundaria dentro de 3A de las CDRs en un modelo tridimensional del anticuerpo y se predice que sea capaz de interactuar con las CDRs. Los métodos anteriores son meramente ilustrativos de algunos de los métodos que podría emplear un experto en la técnica para producir anticuerpos humanizados. La afinidad y/o especificidad de la unión del anticuerpo humanizado pueden aumentarse usando métodos de evolución directa como se describe en Wu et al. (1999) J. Mol. Biol. 284:151 y las Patentes de los EE.UU. Nº 6.165.793, 6.365.408 y 6.413.774.

En una realización de la invención, la forma humanizada del anticuerpo comprende una secuencia de aminoácido variable de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO: 6. En otra realización, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácido variable de cadena pesada como se indica en SEQ ID NO: 9. En una realización adicional, el anticuerpo puede comprender la secuencia de aminoácido variable de cadena pesada como se indica en SEQ ID NO: 12.

En otra realización, el anticuerpo humanizado comprende la secuencia de aminoácido variable de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO: 6 y la secuencia de aminoácido variable de cadena pesada como se indica como se indica en SEQ ID NO: 9. Alternativamente, el anticuerpo puede comprender la secuencia de aminoácido variable de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO: 6 y la secuencia de aminoácido variable de cadena pesada como se indica en SEQ ID NO: 12.

Las regiones variables del anticuerpo humanizado pueden enlazarse a al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina de una inmunoglobulina humana. En una realización, el anticuerpo humanizado contiene regiones constantes de cadena ligera y de cadena pesada. La región constante de cadena pesada incluye habitualmente región de CH1, hurón, CH2, CH3 y algunas veces CH4. En una realización, las regiones constantes del anticuerpo humanizado son del isotipo IgG4 humano.

Esta invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos aislados que codifican estos anticuerpos monoclonales anti-CCR5 o sus versiones humanizadas. La molécula de ácido nucleico puede ser ARN, ADN o cADN. En una realización, la molécula de ácido nucleico codifica la cadena ligera. En una realización, la molécula de ácido nucleico codifica la cadena pesada. En una realización, el ácido nucleico codifica ambas cadenas pesada y ligera. En una realización, una o más moléculas de ácidos nucleicos codifican la porción Fab. En una realización, una o más moléculas de ácidos nucleicos codifican porciones de CDR. En una realización, la molécula de ácido nucleico codifica el dominio variable. En otra realización, la molécula de ácido nucleico codifica el dominio variable y uno o más dominios constantes.

Preferiblemente, los análogos de anticuerpos anti-CCR5 humanizados puestos como ejemplo difieren de anticuerpos anti-CCR5 humanizados puestos como ejemplo por sustituciones de aminoácidos conservadoras. Con fines de clasificación de sustituciones de aminoácidos como conservadoras o no conservadoras, los aminoácidos pueden agruparse como sigue: Grupo I (cadenas secundarias hidrófobas): met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas secundarias hidrófilas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadenas secundarias ácidas): asp, glu,; Grupo IV (cadenas secundarias básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (residuos que influyen en la orientación de la cadena): gly, pro; y Grupo VI (cadenas secundarias aromáticas): trp, tyr, phe. Las sustituciones conservadoras implican sustituciones entre aminoácidos de la misma clase. Las sustituciones no conservadoras constituyen intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra.

Los análogos de anticuerpos anti-CCR5 humanizados muestran identidad de secuencia de aminoácidos sustancial con PRO 140 1 humanizado o PRO 140 2 humanizado, puestos aquí como ejemplo. Regiones variables de cadena pesada y ligera de análogos son codificadas por secuencias de ácidos nucleicos que se hibridan con los ácidos nucleicos que codifican las regiones variables de cadena pesada o ligera de PRO 140 1 humanizado o PRO 140 2 humanizado, o formas degeneradas de ellos, en condiciones rigurosas.

Debido a la degeneración del código genético, una variedad de secuencias de ácidos nucleicos codifican el anticuerpo anti-CCR5 humanizado de la presente invención. En ciertas realizaciones, el anticuerpo es codificado por una molécula de ácido nucleico que es altamente homóloga con las moléculas de ácidos nucleicos anteriores. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico homóloga comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 90% idéntica a la secuencia de nucleótidos proporcionada aquí. Más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos es al menos aproximadamente 95% idéntica, al menos aproximadamente 97% idéntica, al menos aproximadamente 98% idéntica, o al menos aproximadamente 99% idéntica, a la secuencia de nucleótidos proporcionada aquí. La homología puede calcularse usando diversas herramientas de software disponibles públicamente muy conocidas por alguien de experiencia ordinaria en la técnica. Los ejemplos de herramientas incluyen el sistema BLAST disponible del sitio web del National Center for Biotechnology Information (NCBI) en los National Institutes of Health.

Un método para identificar secuencias de nucleótidos altamente homólogas es mediante hibridación de ácidos nucleicos. Así, la invención incluye también anticuerpos de CCR5 humanizados que tienen las propiedades de unión a CCR5 y otras propiedades funcionales descritas aquí, que son codificados por moléculas de ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones de alto rigor con las moléculas de ácidos nucleicos anteriores. La identificación de secuencias relacionadas puede conseguirse también usando reacción en cadena de polimerasa (PCR) y otras técnicas de multiplicación adecuadas para clonación de secuencias de ácidos nucleicos relacionadas. Preferiblemente, se seleccionan cebadores de PCR para multiplicar porciones de una secuencia de ácido nucleico de interés, tales como una CDR.

La expresión "condiciones de alto rigor" según se usa aquí se refiere a parámetros con los que la técnica es familiar. Pueden encontrarse parámetros de hibridación de ácidos nucleicos en referencias que recopilan tales métodos, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., reds., Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, o Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., reds. John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Un ejemplo de condiciones de alto rigor es hibridación a 65 grados centígrados en tampón de hibridación (3,5x SSC, 0,02% de Ficoll, 0,02% de polivinilpirrolidona, 0,02% de albúmna de suero de bovino, NaH_{2}PO_{4} 2,5 mM (pH 7), 0,5% de SDS, EDTA 2 mM). SSC es cloruro sódico 0,15 M/citrato sódico 0,015 M, pH 7; SDS es dodecilsulfato sódico; y EDTA es ácido etilendiaminatetraacético. Después de la hibridación, una membrana sobre la que se transfiere el ácido nucleico se lava, por ejemplo, en 2x SSC a temperatura ambiente y después en 0,1-0,5x SSC/0,1x SDS a temperaturas hasta 68 grados centígrados.

Las secuencias de ácidos nucleicos se expresan en hospedantes después de que las secuencias se ha enlazado operativamente a (es decir, situadas para asegurar el funcionamiento de) una secuencia de control de expresión. Estos vectores de expresión son típicamente replicables en los organismos hospedantes, como episomas o como parte integral del ADN cromosómico del hospedante. Comúnmente, los vectores de expresión contendrán marcadores de selección, por ejemplo, tetraciclina o neomicina, para permitir la detección de las células transformadas con las secuencias de ADN deseadas (véase, por ejemplo, Patente de los EE.UU. Nº 4.704.362).

E. coli es un hospedante procariota útil particularmente para clonar las secuencias de ADN de la presente invención. Otros hospedantes microbianos de uso adecuado incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilis, y otros enterobacterianos, tales como Salmonella, Serratia y diversas especies de Pseudomonas. En estos hospedantes procariotas, se pueden producir también vectores de expresión, que contendrán típicamente secuencias de control de expresión compatibles con la célula hospedante (por ejemplo, un origen de replicación). Además, estará presente cualquier número de una variedad de promotores muy conocidos, tales como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp), un sistema promotor de beta-lactamasa o un sistema promotor de fago lambda. Los promotores controlarán típicamente la expresión, opcionalmente con una secuencia operadora, y tienen secuencias de lugares de unión a ribosoma y similares, para iniciar y completar la transcripción y la traducción.

También pueden ser útiles para expresión otros microbios, tales como levadura. Saccharomyces es un hospedante preferido, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de expresión, tales como promotores, incluyendo 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas y un origen de replicación, secuencias de terminación y similares según se desee.

Además de microorganismos, puede usarse también cultivo de células de tejidos de mamífero para expresar y producir los polipéptidos de la presente invención (véase Winnacker, "From Genes to Clones", VCH Publishers, Nueva York, Nueva York (1987)). Son realmente preferidas células eucariotas, porque se ha desarrollado en la técnica un cierto número de linajes de células hospedantes adecuados capaces de segregar inmunoglobulinas intactas, e incluyen los linajes de células CHO, diversos linajes de células COS, células HeLa, preferiblemente linajes de células de mieloma, etc., y células B transformadas o hibridomas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, un aumentador (Queen et al., Immunol. Rev., 89, 49-68 (1986) y lugares de información de elaboración necesarios, tales como lugares de unión a ribosoma, lugares de empalme de ARN, lugares de poliadenilación y secuencias terminadoras de la transcripción. Las secuencias de control de expresión preferidas son promotores derivados de genes de inmunoglobulina, SV40, adenovirus, citomegalovirus, virus de papiloma de bovino y similares.

Los vectores que contienen los segmentos de ADN de interés (por ejemplo, las secuencias de codificación de cadenas pesada y ligera y las secuencias de control de expresión) pueden transferirse a la célula hospedante por métodos muy conocidos, que varían dependiendo del tipo de hospedante celular. Por ejemplo, se utiliza comúnmente transfección de cloruro cálcico para células procariotas, mientras que puede usarse tratamiento con fosfato cálcico o electroporación para otros hospedantes celulares (véase, en general, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1982)).

Una vez expresados, los anticuerpos completos, sus dímeros, cadenas ligera y pesada individuales, u otras formas de inmunoglobulina de la presente invención, pueden purificarse según procedimientos estándares de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato amónico, columnas de afinidad, cromatografía de columna, electroforesis en gel y similares (véase, en general, R. Scopes, "Protein Purification", Springer-Verlag, Nueva York (1982)). Se prefieren inmunoglobulinas sustancialmente puras, de al menos aproximadamente 90 a 95% de homogeneidad, y más preferidas del 98 al 99% o más de homogeneidad, para usos farmacéuticos. Una vez purificados, parcialmente o hasta homogeneidad según se desee, los polipéptidos pueden usarse después terapéuticamente (incluyendo extracorporalmente) o en el desarrollo y realización de procedimientos de ensayo, coloraciones inmunofluorescentes y similares (véase, en general, Immunological Methods, Vols. I y II, Lefkovits y Pernis, reds., Academic Press, Nueva York, Nueva York (1979 y 1981)).

Con fines de diagnóstico o detección, los anticuerpos pueden marcarse o no marcarse. Pueden usarse anticuerpos no marcados en combinación con otros anticuerpos marcados (segundos anticuerpos) que sean reactivos con el anticuerpo humanizado, tales como anticuerpos específicos para regiones constantes de inmunoglobulina humana. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser marcados directamente. Puede emplearse una amplia variedad de marcas, tales como radionúclidos, fluorescentes, enzimas, sustratos de enzimas, cofactores de enzimas, inhibidores de enzimas, ligandos (particularmente haptenos), etc. Están disponibles numerosos tipos de inmunoensayos y son muy conocidos por los expertos en la técnica para detección de células que expresan CCR5 o detección de modulación de CCR5 en células capaces de expresar CCR5.

La presente invención proporciona también conjugados de fragmento de anticuerpo-polímero que tengan un tamaño o peso molecular eficaces que confiera un aumento de la vida media en el suero, un aumento del tiempo de permanencia medio en circulación (MRT) y/o una disminución de la velocidad de eliminación del suero sobre fragmentos de anticuerpos no derivados.

Los conjugados de fragmento de anticuerpo-polímero de la invención pueden producirse derivando el fragmento de anticuerpo deseado con un polímero inerte. Se apreciará que es adecuado cualquier polímero inerte que proporcione al conjugado el tamaño aparente deseado o que tenga el peso molecular real seleccionado, para su uso en la construcción de los conjugados de fragmento de anticuerpo-polímero de la invención.

Son adecuados muchos polímeros inertes para su uso en productos farmacéuticos. Véase, por ejemplo, Davis et al., Biomedical Polymers: Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use, págs. 441-451 (1980). En todas las realizaciones de la invención, se usa un polímero no proteínico. El polímero no proteínico es ordinariamente un polímero sintético hidrófilo, es decir, un polímero que no se encuentra por lo demás en la naturaleza. Sin embargo, también son útiles polímeros que existen en la naturaleza y se producen por métodos recombinantes o in vitro, como lo son polímeros que se han aislado de fuentes nativas. Los polímeros polivinílicos hidrófilos están dentro del alcance de esta invención, por ejemplo, poli(alcohol vinílico) y polivinilpirrolidona. Son particularmente útiles poli(éteres de alquileno) tales como polietilenglicol (PEG); polioxialquilenos tales como polioxietileno, polioxipropileno y copolímeros de bloques de polioxietileno y polioxipropileno (Pluronics); polimetacrilatos; carbómeros; polisacáridos ramificados o no ramificados que comprenden los monómeros sacáridos D-manosa, D- y L-galactosa, fucosa, fructosa, D-xilosa, L-arabinosa, ácido D-glucurónico, ácido siálico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónico, (por ejemplo, poli(ácido manurónico) o ácido algínico), D-glucosamina, D-galactosamina, D-glucosa y ácido neuramínico, incluyendo homopolisacáridos y heteropolisacáridos tales como lactosa, amilopectina, almidón, hidroxietil almidón, amilosa, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glicógeno o la subunidad polisacárido de mucopolisacáridos ácidos, por ejemplo, ácido hialurónico, polímeros de azúcar alcoholes tales como polisorbitol y polimanitol, heparina o heparón. El polímero antes de la reticulación no necesita ser, aunque lo es preferiblemente, soluble en agua, pero el conjugado final debe ser soluble en agua. Preferiblemente, el conjugado presenta una solubilidad en agua de al menos aproximadamente 0,01 mg/ml y más preferiblemente al menos 0,1 mg/ml aproximadamente y aún más preferiblemente al menos 1 mg/ml aproximadamente. Además el polímero no debe ser altamente inmunógeno en la forma de conjugado, ni debe poseer viscosidad que sea incompatible con inyección o infusión intravenosa si se pretende administrar el conjugado por tales vías.

En una realización, el polímero contiene sólo un grupo simple que sea reactivo. Esto ayuda a evitar reticulación de las moléculas de proteína. Sin embargo, está dentro del alcance de la invención maximizar las condiciones de reacción para reducir la reticulación, o purificar los productos de reacción mediante filtración en gel o cromatografía de intercambio iónico para recuperar derivados sustancialmente homogéneos. En otras realizaciones, el polímero contiene dos o más grupos reactivos con el fin de enlazar fragmentos de anticuerpo múltiples a la cadena principal de polímero.

Nuevamente, pueden usarse filtración en gel o cromatografía de intercambio iónico para recuperar el derivado deseado en forma sustancialmente homogénea.

El peso molecular del polímero puede variar hasta aproximadamente 500.000 D y preferiblemente es al menos aproximadamente 20.000 D, o al menos aproximadamente 30.000 D, o al menos aproximadamente 40.000 D. El peso molecular escogido puede depender del tamaño eficaz del conjugado a conseguir, de la naturaleza (por ejemplo, estructura tal como lineal o ramificada) del polímero y el grado de derivación, es decir, el número de moléculas de polímero por fragmento de anticuerpo y el lugar o lugares de incorporación del polímero en el fragmento de anticuerpo.

El polímero puede enlazarse covalentemente al fragmento de anticuerpo a través de un agente de reticulación multifuncional que reacciona con el polímero y uno o más residuos de aminoácidos del fragmento de anticuerpo a enlazar. Sin embargo, también está dentro del alcance de la invención reticular directamente el polímero haciendo reaccionar un polímero derivado con el fragmento de anticuerpo o viceversa.

El lugar de reticulación covalente en el fragmento de anticuerpo incluye el grupo amino N-terminal y grupos amino epsilon encontrados en residuos de lisina, así como otros grupos amino, imino, carboxilo, sulfhidrilo, hidroxilo u otros hidrófilos. El polímero puede unirse covalentemente directamente al fragmento de anticuerpo sin usar un agente de reticulación multifuncional (ordinariamente bifuncional), como se describe en la Patente de los EE.UU. Nº 6.458.355.

El grado de sustitución con tal polímero variará dependiendo del número de lugares reactivos en el fragmento de anticuerpo, el peso molecular, la hidrofilicidad y otras características del polímero, y los lugares de derivación del fragmento de anticuerpo particular escogidos. En general, el conjugado contiene de 1 a aproximadamente 10 moléculas de polímero, pero se consideran también números mayores de moléculas de polímero incorporadas a los fragmentos de anticuerpo de la invención. La cantidad deseada de derivación se consigue fácilmente usando una matriz experimental en la que se varían el tiempo, la temperatura y otras condiciones de reacción para cambiar el grado de sustitución, tras lo que se determina el nivel de sustitución de polímero de los conjugados por cromatografía de exclusión por tamaños u otros medios conocidos en la técnica.

Están disponibles polímeros PEG funcionalizados para modificar los fragmentos de anticuerpo de la invención de Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala.). Tales derivados de PEG disponibles comercialmente incluyen, aunque sin limitarse a ellos, amino-PEG, ésteres de aminoácidos de PEG, PEG-hidrazida, PEG-tiol, PEG-succinato, PEG carboximetilado, PEG-ácido propiónico, PEG aminoácidos, PEG succinato de succinimidilo, PEG propionato de succinimidilo, éster de succinimidilo de PEG carboximetilado, carbonato de succinimidilo de PEG, ésteres de succinimidilo de aminoácido PEGs, PEG-oxicarbonilimidazol, PEG-carbonato de nitrofenilo, PEG tresilato, PEG-éter de glicidilo, PEG-aldehído, PEG-vinilsulfona, PEG-maleimida, PEG-disulfuro de ortopiridilo, PEGs heterofuncionales, derivados de vinilo de pEG, PEG silanos y PEG fosfolidas. Las condiciones de reacción para acoplar estos derivados de PEG variarán dependiendo de la proteína, el grado deseado de PEGilación y el derivado de PEG utilizado. Algunos factores implicados en la elección de derivados de PEG incluyen: el punto deseado de incorporación (tales como grupos R de lisina o cisteína), estabilidad hidrolítica y reactividad de los derivados, estabilidad, toxicidad y antigenicidad del enlace, idoneidad para análisis, etc. Están disponibles por el fabricante instrucciones específicas para el uso de cualquier derivado particular. Los conjugados de esta invención se separan de los materiales de partida no reaccionados por filtración en gel o HPLC de intercambio iónico.

El anticuerpo anti-CCR5 o fragmentos del mismo pueden usarse en combinación con uno o mas agentes antivíricos adicionales seleccionados del grupo constituido por inhibidores de transcriptasa inversa no nucleósidos (NNRTIs), un inhibidor de transcriptasa inversa nucleósido, un inhibidor de proteasa de HIV-1, un inhibidor de entrada vírica y combinaciones de ellos.

Los compuestos NNRTI conocidos que pueden usarse en la composición de la presente invención incluyen, aunque sin limitarse a ellos, efavirenz, UC-781, HBY 097, nevirapina (11-ciclopropil-5,11-dihidro-4-metil-6H-dipirido[3,2-b:2'3'-][1,4]diazepin-6-ona), delavirdina ((Rescriptor^{TM}; Pharmacia Upjohn) (piperazina, 1-[3-[(1-metil-etil)amino]-2-piridinil]-4-[[5-[(metisulfonil)amino]-1H-indol-2-il]carbonil]-, monometanosulfonato), SJ-3366 (1-(3-ciclopenten-1-il)metil-6-(3,5-dimetilbenzoil)-5-etil-2,4-pirimidinadiona), MKC-442 (6-bencil-1-(etoximetil)-5-isopropiluracilo), GW420867x (S-3 etil-6-fluoro-4-isopropoxicarbonil-3,4-dihidro-quinoxalin-2(1H)-ona; Glaxo), HI-443 (N'-[2-(2-tiofeno)etil]-N'-[2-(5-bromopiridil)-tiourea) y similares.

Los inhibidores de transcriptasa inversa nucleósidos que pueden usarse en la composición en combinación con al menos un anticuerpo anti-CCR5 o fragmento del mismo de la presente invención incluyen, aunque sin limitarse a ellos, abacavir (ziagen^{TM}, GlaxoSmithKline) (sulfato de (1S,cis)-4-[2-amino-6-(ciclopropilamino)-9H-purin-9-il]-2-ciclopenteno-1-metanol (sal)), lamivudina (Epivir^{TM}, GlaxoSmithKline) ((2R, cis)-4-amino-1-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolan-5-il)-(1H)-pirimidin-2-ona), zidovudina (Retrovir^{TM}; GlaxoSmithKline) (3'azido-3'-desoxitimidina), estavudina (Zerit; Bristol-Myers Squibb) (2',3'-dideshidro-3'desoxitimidina), zacitabina (Hivid^{TM}; Roche Laboratories) (4-amino-1-beta-D2',3'-didesoxirribofuranosil-2-(1H)-pirimidona), didanosina y similares.

Los inhibidores de proteasa de HIV-1 que pueden usarse en la composición en combinación con anticuerpo anti-CCR5 o fragmentos del mismo de la presente invención incluyen, aunque sin limitarse a ellos, lopinavir (1S-[1R*,((R*),3R*,4R*]]-N-4-[[(2,6-dimetifenoxi)acetil]acetil]amino]-3-hidroxi-5-fenil-1-(fenilmetil)pentil]tetrahidro-
alfa-(1-metiletil)-2-oxol(2H)-pirimidinaacetamida), saquinavir (N-ter-butil-decahidro-2-[2(R)-hidroxi-4-fenil-3(S)-
[[N-(2-quinolilcarbonil)-L-asparaginil]amino]butil]-(4aS,8aS)-isoquinolina-(3S)-carboxamida), mesilato de nelfinavir (mono-metano sulfonato de [3S-[2(2S*,3S*), 3a, 4\beta, 8\alpha\beta]]-N-(1,1-dimetietil)decahidro-2[2-hidroxi-3-[(3-hidroxi-2-metilbenzoil)amino]-4-(feniltio)butil]-3-isoquinolinacarboxamida), sulfato de indinavir (sal sulfato de (([1(1S,2R),5(S))]-2,3,5-tridesoxi-N-(2,3-dihidro-2-hidroxi-1H-inden-1-il)-5-[2-[[(1,1-dimetiletil)amino]carbonil]-4-(3-piridinil-
metil)-1-piperazinil]-2-(fenilmetil)-D-eritropentonamida (1:1)), amprenavir (N-[(1S,2R)-3-(4-amino-N-isobutil-bencenosulfonamido)-1-bencil-2-hidroxipropil]carbamato de (3S)-tetrahidro-3-furilo)), ritonavir (éster de 5-tiazolilmetilo de ácido (10-hidroxi-2-metil-5-(1-metiletil)-1-[2-(1-metiletil)-4-tiazolil]-3,6-dioxo-8,11-bis(fenilmetil)-2,4,7,12-tetraazatridecan-13-oico), [5S-(SR*, 8R*, 10R*, 11R*)]), y similares.

Los inhibidores de fusión o entrada vírica de HIV-1 que pueden usarse en combinación con el anticuerpo anti-CCR5 o fragmentos del mismo de la presente invención incluyen PRO 542 (Progenics Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY), T-20 (Trimeris, Inc., Durham, NC) (Patentes de los EE.UU. Nº 5.464.933, 6.133.418, 6.020.459), T-1249 (Patentes de los EE.UU. Nº 6.345.568, 6.258.782) y similares.

Para terapia de combinación, el anticuerpo anti-CCR5 o fragmento del mismo de la presente invención puede proporcionarse al sujeto antes de, después de, o al mismo tiempo con uno o más agentes antivíricos convencionales.

Detalles experimentales

Ejemplo 1

A. Materiales y métodos 1) Reactivos

El mAb 2D7 se compró a Pharmingen (San Diego, CA) y las CC- y CXC-quimioquinas se obtuvieron de R&D Systems (Minneapolis, MN). Se produjeron CD4-IgG2 (1), CD4 (2) soluble(s) y gp120 de HIV-1_{JR-RFL} por Progenics Pharmaceuticals, Inc. (59).

2) Aislamiento y purificación de mAbs anti-CCR5

Se incubaron células L1.2-CCR5^{+} (63) durante 16 h en presencia de butirato sódico 5 M, que activa la transcripción del promotor de citomegalovirus (CMV) que controla la expresión de CCR5, produciendo un aumento de 10 veces de la densidad de co-receptor en la superficie celular. Se inmunizaron intraperitonealmente ratones Balb/c hembras con 10^{7} células L1.2-CCR5^{+} a intervalos de 3 semanas, y se administró un refuerzo intravenoso de 10^{7} células L1.2-CCR5^{+} tres días antes de la esplenectomía. Se fusionaron esplenocitos con el linaje celular Sp2/D. En un examen primario, se ensayaron sobrenadantes de cultivos de diez mil hibridomas; ciento veinte de éstos inhibieron la fusión mediada por la envoltura de HIV-1 entre células PM1 (10), que expresan naturalmente CCR5 y CD4, y células HeLa-Env_{JR-FL}^{+} en un ensayo de transferencia de energía de resonancia (RET), como se ha descrito previamente (19, 36). Los hibridomas que produjeron los sobrenadantes inhibidores más potentemente y que coloreaban también células CCR5^{+} se subclonaron por dilución limitante. Se prepararon fluidos ascíticos por Harlan Bioproducts for Science, Inc. (Indianapolis, IN) de ratones Bsalb/c que se inyectaron con hibridomas que producían los mAbs anti-CCR5 PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 y PA14. Los mAbs se purificaron individualmente hasta > 95% de homogeneidad por precipitación con sulfato amónico seguida por cromatografía de proteína A. Todos los mAbs se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con una concentración final de 5 mg/ml.

3) Análisis de clasificación de células activadas con fluorescencia (FACS) y representación de mapa de epítopes de mAbs anti-CCR5

Se usó citometría de flujo para detectar reactividad de la superficie celular de los mAbs PA8-PA12 y PA14 con CCR5. Se incubaron células L1.2-CCR5^{+} (10^{6}) tratadas con butirato sódico con 0,25 \mug de anticuerpo, durante 20 min a 4ºC en 0,1% de azida sódica (NaN_{3}) en 50 \mul de PBS de Dulbecco (DPBS). Se usó como testigo positivo el mAb de CCR5 2D7, y se usó como testigo negativo una IgG1 de ratón no específica. Las células se precipitaron por centrifugación, se lavaron y se incubaron con IgG anti-ratón de cabra marcada con ficoeritrina (PE) (Caltag, Burlingame, CA) diluida 1:100, en las mismas condiciones que la primera incubación con anticuerpo. Finalmente, se analizaron células por citometría de flujo. Se aislaron y estimularon PBMC como se ha descrito previamente (60) y se colorearon usando métodos similares.

Se usó un procedimiento similar para representar el mapa de epítopes de los mAbs anti-CCR5. Se ha descrito un panel de setenta mutantes puntuales de CCR5 (20, 24, 52). Las secuencias de codificación de estas proteínas se subclonan en el vector pcDNA3.1 (Stratagene) desde el que puede conducirse la transcripción por un promotor de polimerasa T7 5'. Los mutantes de CCR5 llevan una etiqueta de hemaglutinina (HA) de 9 residuos en el término C para detección de proteína en lisados de células o por citometría de flujo. Se incubaron células HeLa (2 x 10^{6}) durante 5 h con 20 \mug/ml de lipofectina y una cantidad igual de plásmido que expresa CCR5 de tipo natural o mutante en OPTI-MEM (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Las células se infectaron después durante 12 h con 2 x 10^{7} u.f.p. de vTF7 (23) para reforzar la expresión de CCR5, se separaron con ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) 2 mM en PBS y se lavaron una vez con tampón de unión (1% de BSA, 0,025% de NaN_{3} en DPBS). Se marcaron en superficie células (1 x 10^{6}) con mAbs como se ha descrito en el párrafo precedente, se lavaron una vez con el tampón de incubación y se resuspendieron en 1 ml de 1x FACSlisa en agua (Becton Dickinson) durante 30 min a temperatura ambiente, para permeabilizar las membranas de células. Las células se precipitaron por centrifugación, se lavaron con el tampón de incubación y se incubaron durante 1 h a 37ºC con 4 \mug/ml de un mAb anti-HA de ratón marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (BabCo, Richmond, CA) para marcado intracelular. Finalmente, se lavaron las células una vez con tampón de unión y una vez con DPBS, se resuspendieron en formaldehído al 1% en PBS y se analizaron por citometría de flujo. La extensión de unión de un mAb a CCR5 mutante se determinó por la ecuación (i.f.m. de PE de CCR5 mutante/i.f.m.. de PE de CCR5 de tipo natural) x 100%. Esto normaliza la unión de mAb para niveles de expresión de co-receptor mutante.

4) Ensayo de unión de gp120/sCD4

Se biotinó gp120 usando NHS-biotina (Pierce, Rockford, IL) según las instrucciones del fabricante, y se separó biotina desacoplada por diafiltración. Se incubaron células L1.2-CCRS^{+} tratadas con butirato sódico con diluciones variables de una mezcla equimolar de sCD4 y gp120 biotinada, o 1,25 \mug/ml de sCD4 y 2,5 \mug/ml de gp120 biotinada en presencia de concentraciones variables de mAbs anti-CCR5 PA8-PA12, PA14, 2D7 o una IgG1 de ratón no específica, durante 1 h a temperatura ambiente en NaN_{3} al 0,1% en DPBS. Se lavaron células con el tampón de incubación y se incubaron con estreptavidina-PE (Beckton Dickinson) diluido 1:50, durante 1 h a temperatura ambiente. Finalmente, se lavaron células con tampón de unión y se analizaron usando un lector de placas de fluorescencia (Perspective Biosystems, Framingham, MA).

5) Inhibición de la fusión célula-célula mediada por envoltura y entrada de HIV-1, por mAbs anti-CCR5

La fusión mediada por envoltura de HIV-1 entre células HeLa-Env_{JR-FL}^{+} y PM1 se detectó usando el ensayo RET. Se pusieron en placa números iguales (2 x 10^{4}) de células que expresan envoltura marcadas con éster de octadecilo de fluoresceína (F18) y células PM1 marcadas con octadecil rodamina (R18) en placas de 96 pocillos en 15% de suero de becerro fetal en DBPS y se incubaron durante 4 h a 37ºC en presencia de concentraciones variables de los mAbs anti-CCR5 PA8-PA12, PA14, 2D7 o una IgG1 de ratón no específica. La RET de fluorescencia se midió con un lector de placas Cytofluor (PerSeptive Biosystems) y se determinó el % de RET como se ha descrito previamente
(38).

Se produjeron virus NLluc^{+}env^{-} complementados en trans por glicoproteínas de envoltura de JR-FL o Gun-1 como se ha descrito previamente (20). Se infectaron células U87MG-CD4^{+}CCRS^{+} (14) con virus informadores quiméricos que contenían 50-100 ng/ml de p24 en presencia de concentraciones variables de los mAbs individuales. Después de 2 h a 37ºC, se sustituyeron medios que contenían virus con medios que contenían mAb nuevos. Se añadieron otra vez medios nuevos, sin anticuerpos, después de 12 horas. Después de un total de 72 h, se añadieron a las células 100 \mul de tampón de lisis (Promega) y se midió la actividad de luciferasa (u.l.r.) como se ha descrito (20). El % de inhibición de la infección con HIV-1 se define como [1-(u.l.r. en presencia de anticuerpo/u.l.r. en ausencia de anticuerpo)] x 100%.

6) Ensayos de señalización de calcio

Se añadió el fluocromo Indo-1AM (Molecular Probes, Eugene, OR) a células L1.2-CCR5^{+} tratadas con butirato sódico en una concentración final de 5 \muM. Después de incubar a 37ºC durante 30 min, se lavaron las células una vez y se resuspendieron en solución salina tamponada de Hank. Se estimularon secuencialmente células (10^{6}) con un mAb anti-CCR5 o PBS, seguido 60 s después con RANTES. Se usaron los mAbs PA8-PA12 y PA14 en una concentración de 100 \mug/ml, 2D7 en 20 \mug/ml y RANTES en 250 ng/ml. Se ensayó también la inhibición del flujo de calcio por PA14 y 2D7 para un amplio intervalo de concentraciones de mAb, variables de 0 a 100 \mug/ml. Se comprobaron los niveles de calcio intracelular usando un espectrofotómetro de fluorescencia Perkin-Elmer LS-50S midiendo la relación de emisiones de fluorescencia a 402 nm (colorante unido) y 486 nm (colorante libre) tras excitación a 358 nm.

B. Resultados y discusión 1) Aislamiento de anticuerpos monoclonales anti-CCR5 PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 y PA14

Se encontró que péptidos correspondientes a los dominios extracelulares de CCR5 son ineficaces para producir respuestas de anticuerpos de alto título, específicas, contra el receptor de la superficie celular nativo (50). Se inmunizaron por tanto ratones Balb/c con células L1.2-CCR5^{+} y se ensayó la capacidad de sobrenadantes de cultivo de hibridomas para inhibir la fusión de membrana mediada por la envoltura de JR-FL con células CD4^{+}CCR5^{+}PM1 en el ensayo RET (19, 38). Incluso aunque bastante más de cien sobrenadantes inhibían la fusión célula-célula en > 50%, sólo seis, denominados PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 y PA14, coloreaban específica e intensamente L1.2-CCR5^{+} pero no las células progenitoras L1.2, como se demuestra por citometría de flujo (datos no mostrados). En base a la experiencia previa, se supuso que los otros mAbs capaces de inhibir la fusión célula-célula se dirigían probablemente contra moléculas de adhesión de la superficie celular tales como LFA-1 (37). Se determinó por ELISA isotópico (Cappell, Durham, NC) que los hibridomas PA8-PA12 y PA14 segregan mAbs de IgG1. Se prepararon fluidos ascíticos de ratones Balb/C que se inyectaron con los seis hibridomas y se purificaron las fracciones de IgG1. PA8, PA9, PA11, PA12 y PA14 presentaban perfiles de enfoque isoeléctrico distintos, mientras que PA10 tenía un perfil muy similar al de PA9 y puede ser por tanto un segundo aislado del mismo mAb (datos no mostrados).

2) Unión de mAb a células CCR5^{+}

Ninguno de los mAbs anti-CCR5 purificados colorearon el linaje de células L1.2 progenitoras (datos no mostrados). Sin embargo, los mAbs PA9-PA12 y PA14 colorearon > 90%, y PA8 coloreó \sim 70% de células L1.2-CCR5^{+} como se determinó por citometría de flujo, mostrando que reconocían CCR5 (Figura 1). El mAb 2D7 anti-CCR5, que era un testigo positivo en los experimentos, coloreó también > 90% de células L1.2-CCR5^{+}. PA8-PA12 y PA14 son todos IgG1 y reaccionan igualmente bien con una IgG anti-ratón de cabra, mientras que 2D7 es una IgG2a y puede reaccionar diferentemente con el anticuerpo informador. Sólo las intensidades de fluorescencia medias (i.f.m.) medidas con los mAbs PA8-PA12 y PA14 son por tanto directamente comparables. El orden de rango de intensidades de fluorescencia medias (i.f.m.) fue PA12-PA11 > (2D7=) PA14\simPA10 \sim PA9> PA8. La diferencia entre las i.f.m. de PA12 y las i.f.m. de PA8 fue tres veces. Las diferencias de intensidad de coloración entre PA8 y los otros mAbs permanecieron constantes en un amplio intervalo de concentraciones (datos no mostrados) y probablemente no corresponden a diferencias en afinidades de mAbs por CCR5. Esto implica que PA8 interactúa sólo con un subgrupo de moléculas de CCR5 presentes en la superficie de células L1.2-CCR5^{+}.

En comparación con células L1.2-CCR5^{+}, PBMC estimuladas con mitógeno presentaban diferentes modelos de coloración por los mAbs anti-CCR5, 2D7 y PA14 coloreaban > 20%, PA11 y PA12 coloreaban \sim 10%, PA8, PA9 y PA10 coloreaban < 5% de PBMC (Figura 1). Las intensidades de fluorescencia medias de las PBMC coloreadas fueron aproximadamente diez veces más bajas que las obtenidas con células L1.2-CCR5^{+} para cada mAb; su orden de rango fue (2D7>) PA14 > PA12 \sim PA11\sim PA10\sim PA9\sim PA8. Nuevamente, esto difiere algo del orden de reactividades observado en transfectantes de CCR5. La diferencia entre las i.f.m. de PA9 y las i.f.m. de PA14 fue siete veces. Otros grupos han observado diferencias similares en la capacidad de mAbs anti-CCR5 para colorear linajes de células CCR5^{+} estables frente a PBMC (28). Esto puede ser debido a diferencias específicas de las células en conformación de CCR5, modificación post-traducción u oligomerización. Alternativamente, la asociación con otras moléculas de la superficie celular puede diferir entre células. Puesto que una elección obvia para tal molécula sería el antígeno de la superficie celular CD4, que está ausente de células L1.2-CCR5^{+} y presente en PBMCs, se ensayó también la capacidad de PA8-PA12, PA14 y 2D7 para colorear células HeLa que expresan transitoriamente CCR5 solo o con CD4. No se observaron diferencias en la capacidad de cualquiera de los mAbs para colorear CCR5 de la superficie celular en presencia de CD4 (datos no mostrados). Si hay una asociación entre estas dos proteínas, no implica epítopes reconocidos por los mAbs anti-CCR5 disponibles para los inventores. Alternativamente, una asociación entre CCR5 y CD4 sólo podría tener lugar en linfocitos primarios.

3) Representación de mapa de epítopes de los mAbs usando mutantes de alanina de CCR5

Ninguno de los anticuerpos era capaz de detectar proteína de CCR5 reducida y desnaturalizada por manchas de Western, indicando que reconocen epítopes sensibles conformacionalmente (datos no mostrados). Se realizaron estudios de representación de mapas de epítopes de mAb usando un panel de setenta mutantes puntuales de alanina de residuos en el Nt y ECLs de CCR5. Se lipofectaron células HeLa con mutante de secuencias de codificación de CCR5 de tipo natural añadidas con etiquetas de HA C-terminales., y se infectaron con vTF7 (23) para reforzar la expresión de co-receptor. Se incubaron después las células con los mAbs anti-CCR5 y se reveló su unión por una IgG anti-ratón de cabra marcada con PE. Se realizó una segunda coloración intracelular con un mAb anti-HA marcado con FITC (BabCo). El testigo interno permitió a los inventores normalizar directamente la coloración por los mAbs anti-CCR5 por niveles de expresión de co-receptor mutante en la superficie celular. Por ello, la unión de mAb a cada mutante se expresa como porcentaje de la unión a CCR5 de tipo natural (Figura 4).

Ciertas mutaciones puntuales redujeron la unión de todos los anticuerpos a CCR5 en > 50%. En general, PA8-PA12 eran los más afectados, PA14 y 2D7, los menos afectados por esta clase de mutantes, que incluían el par de cisteínas C101A y C178A, los mutantes Nt Y10A, D11A, K25A, el mutante de ECL1 D95A, los mutantes de ECL2 K171A/E172A, Q188A, K191A/N192A, y los mutantes de ECL3 F263A y F264A (Fig. 1). Una interpretación es que estos residuos no son parte de los epítopes de mAbs per se, pero que cambiándolos a alaninas se ocasionan perturbaciones conformacionales que tienen un efecto común en la unión de todos los mAbs. Se supuso que si una mutación disminuía la unión de un mAb individual en > 75%, y no disminuía también la unión de muchos de los otros anticuerpos, el residuo era probablemente un contribuyente directo al epítope reconocido por el mAb. Usando estas líneas de guía rigurosas, se concluyó que los siete mAbs anti-CCR5 reconocen superposición pero epítopes distintos (Figura 4). La unión de mAb PA8 a CCR5 dependía de N13 e Y15 en el Nt. Los Mabs PA9 y PA10 requerían D2, Y3, Q4, P8 y N13 en el Nt, e Y176 y T177 en el ECL2. El mAb PA9 también requería S7 en el Nt. La unión de los mAbs PA11 y PA12 dependía de Q4 en el Nt. PA14 requería D2 en el Nt, y R168 e Y176 en el ECL2. Finalmente, el mAb 2D7 requería Q170 y K171/E172 en ECL2 con el fin de unirse a CCR5.

4) Señalización de quimioquina en presencia de mAbs abti-CCR5

Los agentes de unión a receptor de quimioquina pueden ser antagonistas o, más raramente, agonistas de señalización intracelular mediada por receptor. Alternativamente, podrían no tener efecto en la señalización. CCR5 es capaz de unirse a tres CC-quimioquinas, RANTES, MIP-1\alpha y MIP-1\beta, y transducir una señal que modula niveles de calcio citosólico. Se ha ensayado por tanto la actividad agonista/antagonista de diversas concentraciones de mAbs PA8-PA12, PA14 y 2D7. Se midieron cambios en concentraciones de calcio intracelular, (Ca^{2+}) i, en células L1.2-CCR5^{+} cargadas con indo-1. Ninguno de los mAbs estimuló un cambio en (Ca^{2+}) i, indicando que no son agonistas para CCR5. PA8-PA12 también eran incapaces de inhibir flujos de Ca^{2+} inducidos por RANTES (Fig. 5A y datos no mostrados), incluso en concentraciones tan altas como 100 \mug/ml, mostrando que no son antagonistas ninguno. Estas concentraciones proporcionan unión saturante de los mAbs a células L1.2-CCR5^{+}, como se muestra por citometría de flujo y el ensayo de unión de gp120/CCR5 (Fig. 6D y datos no mostrados). Los mAbs PA14 y 2D7, sin embargo, bloqueaban la movilización de calcio inducida por RANTES, aunque con diferentes potencias/Fig. 5A, 5B). La IC_{50} para inhibición del influjo de calcio de PA14 fue 50 \mug/ml, que era aproximadamente 8 veces más alta que la IC_{50} para 2D7 (Fig. 5B). Los flujos de calcio inducidos por RANTES, MIP-1\alpha y MIP-1\beta se inhibieron cada uno por concentraciones similares de PA14 (datos no mostrados). Ninguno de los mAbs afectó a la movilización de calcio inducida por SDF-1 en células L1.2-CCR5^{+}, que expresan endógenamente CCR4 (datos no mostrados). Finalmente, ni mAbs ni CC-quimioquinas afectaron a los niveles de calcio citosólico en células L1.2 progenitoras (datos no mostrados).

5) Inhibición de la función de co-receptor CCR5 por los mAbs

Se seleccionaron inicialmente los mAbs PA8-PA12 y PA14 sobre la base de su capacidad para inhibir fusión célula-célula mediada por envoltura de HIV-1. Esta actividad se confirmó y cuantificó para los mAbs purificados. Como era de esperar, los seis mAbs, así como mAb 2D7, bloqueaban la fusión entre células CD4^{+}CCR5^{+} PM1 y células HeLa-Env_{JR-FL}^{+} en el ensayo RET. El orden de rango de potencia fue 2D7 \sim PA14 > PA12 > PA11 > PA10 \sim PA9 \sim PA8 (Fig. 6A). Los valores IC_{50} para PA14 y 2D7 fueron 1,7 \mug/ml y 1,6 \mug/ml respectivamente, para PA11 y PA12 éstos fueron 25,5 \mug/ml y 10,0 \mug/ml respectivamente (Figura 3). PA8, PA9 y PA10 inhibían la fusión en sólo 10-15% a 300 \mug/ml. Ninguno de los mAbs afectó a la fusión entre células PM1 y células HeLa-Env_{LAI}^{+}, que expresa la proteína de envoltura de longitud completa de un virus X4 (datos no mostrados).

Se probó también en un ensayo de entrada basado en luciferasa la capacidad de los diferentes mAbs anti-CCR5 para inhibir la entrada de un virus R5 prototípico, JR-FL, y un virus R5X4, Gun-1, en una ronda simple de replicación. El orden de rango de potencia en el ensayo de entrada fue similar al determinado en el ensayo de fusión célula-célula (Fig. 6B). No era posible obtener una inhibición > 50% de la entrada de JR-FL o Gun-1 con PA8-PA11. El valor IC_{50} para PA12 fue 2,5 \mug/ml. Sin embargo, no era posible obtener una inhibición de entrada > 60% con este mAb. Los valores IC_{50} para inhibición de PA14 y 2D7 de la entrada de JR-FL se determinó que eran 0,024 y 0,026 \mug/ml respectivamente (Figura 3), y eran 60 veces más bajos que los obtenidos en el ensayo de fusión. La entrada de Gun-1 doble-trópico fue 2-3 veces más sensible a inhibición por mAbs anti-CCR5 que la entrada de JR-FL (datos no mostrados).

Los mAbs anti-co-receptor podrían inhibir la fusión mediada por envoltura afectando directamente a la interacción gp120/CCR5 o impidiendo etapas post-unión implicadas en la formación de un complejo de fusión activo. Para determinar el mecanismo de inhibición de la fusión y entrada vírica por PA8-PA12 y PA14, se ensayó la capacidad de los diferentes mAbs para bloquear la interacción gp120/CCR5. Para esto, se usó un ensayo que detecta la unión a células L1.2-CCR5^{+} de HIV-1_{JR-FL}gp120 biotinado acomplejado con sCD4. No se observó unión de gp120 biotinada en ausencia de sCD4 o CCR5, o cuando se usó HIV-1_{LAI}gp120 (Fig. 6C).

Con la excepción de PA8, todos los mAbs abrogaron la unión de gp120/sCD4 a L1.2-CCR5^{+} (Fig. 6D). Inhibición por PA8 saturado a \sim 40%, lo que está de acuerdo con datos de citometría de flujo (Figura 1) sugiriendo que este mAb se une sólo a un subgrupo de moléculas CCR5 en células L1.2-CCR5^{+}. Los mAbs PA9, PA10, PA11 y PA12 inhibieron la unión con valores IC_{50} de 0,24, 0,13, 0,33 y 0,24 \mug/ml respectivamente (Figura 3). Sorprendentemente, los mAbs PA14 y 2D7 fueron los dos inhibidores menos eficaces de la unión de gp120/sCD4, con valores IC_{50} de 1,58 y 1,38 \mug/ml respectivamente (Figura 3). Por tanto, no había correlación entre la capacidad de un mAb para inhibir la fusión a membrana y la entrada mediadas por gp120/CD4/CCR5 y su capacidad para bloquear la unión de gp120/sCD4 al co-receptor.

6) Inhibición sinérgica de la fusión de HIV-1 por combinaciones de mAbs anti-CCR5 y otros inhibidores de la entrada vírica

Agentes específicos de co-receptores pueden actuar en fases múltiples del proceso de entrada y presentar efectos no aditivos cuando se usan en combinación. Desde una perspectiva clínica, es importante determinar las interacciones de candidatos a fármacos específicos de co-receptores con quimioquinas endógenas, que pueden proporcionar algún nivel de protección contra la progresión de la enfermedad. Se ensayaron por tanto mAbs de CCR5 en combinación entre sí o con RANTES, o con CD4-IgG2, que se une a gp120 de HIV-1 para inhibir la incorporación a células objetivo. Se obtuvieron curvas dosis-respuesta de los agentes usados individualmente y en combinación en ensayos de fusión y entrada víricas. Se analizaron datos usando el principio de efecto mediano (9). Las concentraciones de agentes simples o sus mezclas requeridas para producir un efecto dado se compararon cuantitativamente en una expresión conocida como Índice de combinación (CI). Un valor de CI mayor que 1 indica antagonismo, CI \sim 1 indica un efecto aditivo y CI < 1 indica un efecto sinérgico en el que la presencia de un agente aumenta el efecto de otro.

Las combinaciones de PA12 y 2D7 eran las más potentemente sinérgicas, variando los valores de CI entre 0,02 y 0,29, dependiendo de la relación de anticuerpos (Fig. 7 y Figura 2). Se sabe que el grado de sinergia varía con la estequiometría de los agentes. Los ensayos de entrada y fusión víricas eran consecuentes generalmente en la identificación de combinaciones de mAbs que son altamente sinérgicas, PA12 y 2D7; moderadamente sinérgicas, PA12 y PA14; aditivas, PA11 y PA12; y débilmente antagonistas, PA14 y 2D7. La falta de sinergia entre PA14 y 2D7 no es sorprendente dado que estos mAbs compiten entre sí para unirse a células CCR5^{+} como se determina por citometría de flujo (datos no mostrados). La observación de un efecto aditivo de PA11 y PA12 puede ser una indicación de que estos mAbs se unen a epítopes ligeramente diferentes en CCR5, mientras que comparten una dependencia del residuo Q4 en el Nt.

Se ensayó también la capacidad de los mAbs PA12, PA14 y 2D7 para actuar sinérgicamente con RANTES en el bloqueo de la fusión célula-célula. Las combinaciones de PA12 y RANTES presentaban sinergia moderada (Figura 2). PA14 y 2D7 no presentaban sinergia con RANTES, lo que es consecuente con que estos mAbs son inhibidores de la unión de RANTES y la señalización (Fig. 5A, 5B). Finalmente, se ensayó la sinergia entre los mAbs PA12, PA14, 2D7 y CD4-IgG2, que interactúa con gp120. Se observó una sinergia moderada entre PA12 y CD4-IgG2 pero no se observó sinergia entre PA14 o 2D7 y CD4-IgG2 (Figura 2).

Discusión experimental

Se aislaron y caracterizaron seis mAbs IgG1 anti-CCR5 de ratón. Mientras que PA8, PA9, PA11, PA12 y PA14 son especies moleculares distintas, PA9 y PA10 son indistinguibles por los análisis y son por tanto probablemente los mismos mAbs. Todos los mAbs que se aislaron reconocen epítopes conformacionales complejos, y es a menudo el caso con mAbs producidos contra proteínas de la superficie celular nativas. La representación de mapa de epítopes se realizó para todos los mAbs usando un panel de mutantes puntuales de alanina de CCR5. Se supuso que los residuos que afectan a la unión de todos los mAbs de modo similar causan perturbaciones conformacionales en el co-receptor y no constituyen parte de los epítopes de mAbs. Sólo dos de tales residuos, Y10 y D11, se ha mostrado que afectan a la entrada de HIV-1 (20, 52). Los epítopes de PA8, PA11 y PA12 están situados exclusivamente en el dominio Nt. Consecuente con este resultado, PA8 era capaz de unirse a un péptido de Nt biotinado, que contiene residuos D2 a R31, en un ELISA (datos no mostrados). Sin embargo, PA11 y PA12, cuya unión depende fuertemente sólo de Q4, no se unía al péptido de Nt en solución (datos no mostrados). Una posibilidad es que el péptido de Nt no supone la conformación apropiada para reconocimiento por PA11 y PA12, mientras que la unión de PA8 puede ser menos dependiente de la conformación. Alternativamente, PA11 y PA12 podría interactuar con residuos que no se han mutado por los inventores, o forman enlaces débiles con aminoácidos situados en otros dominios de CCR5, o se unen a átomos de la cadena principal de péptido cuya presentación puede ser inalterada por mutagénesis. Los anticuerpos PA9, PA10 y PA14 reconocían epítopes que incluían residuos en ambos dominios Nt y ECL2 de CCR5, mientras que el epítope de 2D7 estaba situado exclusivamente en ECL2.

El epítope de PA14 comprende D2 en el Nt y R168 en ECL2, indicando que estos dos residuos están próximos entre sí dentro del contexto de una huella de mAb. Pueden incluso interactuar directamente entre sí a través de sus cargas opuestas.

Los mAbs PA8-PA12 y PA14 colorearon células CCR5^{+} con diferentes intensidades y de una manera dependiente del tipo de célula. Todos los mAbs excepto PA8 colorearon > 90% de células L1.2-CCR5^{+}, observándose la intensidad de fluorescencia media más alta con PA11 y PA12. Sin embargo, PA14 y 2D7 colorearon el mayor porcentaje de PBMC y produjeron también las intensidades de fluorescencia media más altas en estas células. Hill et al, (28) han caracterizado recientemente un panel de mAbs anti-CCR5 que coloreaban de modo similar células transfectadas, pero sólo dos de ocho coloreaban PBMC y ninguno coloreaba monocitos primarios. Una baja afinidad por CCR5 da cuenta probablemente de la no reactividad de dos de los mAbs con células primarias, pero era improbable que ésta fuera la explicación del fallo de los otros cuatro para reaccionar. En el panel de mAbs de los presentes inventores, se observa la coloración más intensa de PBMC por los mAbs 2D7 y PA14, que tienen epítopes situados total o parcialmente en los primeros diez residuos de ECL2. Hilla et al. indican, no obstante, que mAbs específicos para el Nt y ECL1 colorean PBMCs, mientras que mAbs para ECL2 y ECL3 no colorean PBMC, de manera que no se ha identificado un modelo consecuente de reactividad. Una explicación de la coloración específica del tipo de célula por mAbs sería que PBMCs (y monocitos) activados segregan CC-quimioquinas, que se unen a CCR5 de la superficie celular, ocultando algunos epítopes de mAbs. Sin embargo, sería de esperar que esto fuera especialmente cierto para PA14 y 2D7, que son antagonistas de la movilización de calcio inducida por quimioquina y compiten presumiblemente con CC-quimioquinas por unirse a CCR5. A pesar de todo, estos mAbs colorean PBMC lo más intensamente. Alternativamente, la exposición de epítope de CCR5 diferencial puede reflejar oligomerización del receptor específico del tipo de célula, asociación con otras moléculas de la superficie celular o diferentes modificaciones post-traducción tales como glicosilación. Se ha mostrado que diferencias de unión de mAbs no reflejan probablemente diferencias específicas del tipo de célula en interacciones CD4/CCR5.

Los mAbs PA8-PA12 no inhibieron la movilización de calcio inducida por CC-quimioquina en células CCR5^{+}, ni mediaron en la señalización a través de CCR5. Los mAbs 2D7 y PA14 eran inhibidores de la movilización de calcio inducida por CC-quimioquina, pero 2D7 era casi un orden de magnitud más potente que PA14. Esto puede ser porque el epítope de PA14 se superpone menos con el dominio de unión de CC-quimioquina en CCR5 que el epítope de 2D7. Todos los mAbs bloqueaban también la entrada de HIV-1y la fusión de membrana mediada por envoltura, pero la inhibición de fusión célula-célula requería en algunos casos casi dos órdenes de magnitud más de anticuerpo que cuando era necesario bloquear la entrada vírica. Presumiblemente, se establecen más interacciones gp120/CD4/CCR5 así como interacciones entre moléculas de adhesión y actúan cooperativamente durante la fusión célula-célula, comparado con la fusión virus-célula, haciéndola más difícil de inhibir. Esto se observa comúnmente con anticuerpos para LFA-1 o para la glicoproteína de envoltura de HIV-1 (45, 51). PA8, PA9 y PA10 eran incapaces de bloquear la fusión célula-célula en > 15% y la entrada vírica en > 40%, incluso con las más altas concentraciones de anticuerpo. Sin embargo, podía alcanzarse > 90% de inhibición de la fusión con PA11, PA12 y PA14, y podía alcanzarse > 90% de inhibición de la entrada con PA14. El más potente de los seis mAbs en bloqueo de fusión y entrada fue PA14, que era tan eficaz como 2D7. Sorprendentemente, PA14 y 2D7 estaban entre los inhibidores menos potentes de la unión de gp120/sCD4 a células L1..2-CCR5^{+}, mientras que PA9-PA12 bloqueaban con potencias similares, y PA8 era incapaz de bloquear > 40% de la unión de gp120/sCD4. Estas observaciones plantean cuestiones sobre la naturaleza de las moléculas de CCR5 presentadas en diferentes células y sobre los mecanismos de inhibición de fusión y entrada víricas. Puede ser que CCR5 en células L1.2, usadas en los ensayos de unión de mAb y gp120, no esté en una conformación idéntica a CCR5 en PBMC, usada en el ensayo de unión de mAb, o a CCR5 en células PM1 y U87MG usadas en los ensayos de fusión y entrada.

La baja coloración de PBMC y la inhibición parcial de la fusión y entrada por algunos de los presentes mAbs indican que son sólo capaces de unirse a un subgrupo de moléculas de CCR5 expresadas en linfocitos primarios, linajes de células PM1 y U87MG-CD4^{+}CCR5^{+}. Con todo, salvo PA8, todos los mAbs eran capaces de colorear > 90% de células L1.2-CCR5^{+} y bloquear completamente la unión a estas células del complejo gp120/sCD4. Al menos una diferencia entre L1.2-CCR5^{+} y las otras células que se han usado es la densidad de proteína de co-receptor en la superficie celular. Realmente, se estima que las células L1.2-CCR5^{+} expresan de 10 a 100 veces más co-receptor de la superficie celular que células PM1 y U87MG-CD4^{+}CCR5^{+}. Pero cuando se diseñan células HeLa para expresar transitoriamente tanto co-receptor como el linaje de células L1.2-CCR5^{+}, se era incapaz aún de detectar la unión de gp120/sCD4 a ellas (datos no mostrados). La sobreexpresión de CCR5 en L1.2, junto con otros factores específicos de las células, podrían favorecer por tanto una conformación de co-receptor que expone destacadamente el Nt, haciéndolo más accesible a los mAbs y gp120. Tal conformación podría inducirse por oligomerización del receptor, por asociaciones disminuidas o alteradas con proteínas de la superficie celular o por interaciones del receptor con proteínas G (25, 62). ¿Co-existen múltiples conformaciones de CCR5 en la superficie celular, y permiten todas la entrada vírica?. Los modelos de reactividad de mAbs lo sugerirían, porque pueden tener lugar la entrada de HIV-1 y la fusión, aunque en niveles reducidos, en presencia de concentraciones de mAbs que saturen los epítopes requeridos para unión de gp120 a células L1.2-CCR5^{+}. Los presentes inventores apoyan la hipótesis de que las moléculas de co-receptor presentes en células L1.2-CCR5^{+} poseen una conformación competente para entrada de HIV-1, mientras que las moléculas de CCR5 en PBMC, PM1 y CCR5^{+} U87MG existen en estados competentes para entrada, múltiples, que presentan diferentes reactividades de mAbs. Mientras que PA14 y 2D7 pueden reconocer todas las conformaciones, otros mAbs pueden no hacerlo. Por qué las células L1.2 conducen a una conformación competente para fusión particular queda por determinar.

Se ha demostrado recientemente que el dominio de unión de gp120 está en los primeros veinte residuos del dominio Nt de CCR5. Los mAbs para el dominio de unión de gp120 bloquean potentemente esta interacción pero no son tan eficaces para inhibir la fusión y la entrada de HIV-1 en células objetivo como PA14 y 2D7, cuyos epítopes están fuera de esta región. PA14 reconoce el extremo del Nt y residuos en ECL2, mientras que el epítope de 2D7 está situado exclusivamente en ECL2. Sólo puede especularse con el mecanismo de acción de estos mAbs. Puede ser que su unión a los primeros pocos residuos de ECL2 induzca cambios conformacionales en el co-receptor que impiden la fusión de membrana. Alternativamente, la obstrucción de epítopes de ECL2 podría impedir la oligomerización de co-receptor y la formación de un complejo de proteína competente para fusión. Otra posibilidad todavía es que residuos de ECL2 estén de cara al interior del poro de fusión y la unión de los mAbs impida que gp41 inserte el péptido de fusión en la membrana de plasma. Como contraste, los mAbs PA8-PA12 inhiben probablemente la fusión y entrada sólo compitiendo directamente por la unión con los complejos gp120/CD4. No se sabe si parámetros distintos de la exposición de epítopes y la afinidad por CCR5 determinan la eficacia de inhibición de la entrada vírica por estos mAbs. No está claro por qué etapas de inhibición subsiguientes a la interacción gp120/co-receptor serían más eficaces que el bloqueo directamente de esa interacción. Una manera de explicar esto sería suponer que la velocidad hacia fuera de la unión de gp120 a CCR5 es mucho más baja que la velocidad hacia dentro de la unión de mAb a CCR5. Así, cada vez que un mAb se desprende de una molécula de co-receptor, una molécula de gp120 asociada a virión lo sustituye de manera casi irreversible porque esta interacción conduce a fusión de membrana.

La sinergia entre combinaciones de mAbs anti-CCR5 es probablemente un resultado de sus interacciones con epítopes distintos que están implicados en etapas consecutivas interdependientes de la entrada de HIV-1. El grado de sinergia observado entre PA12 y 2D7 (CI < 0,1 en muchas circunstancias) es extraordinario, porque se observan raramente valores de CI < 0,2 para combinaciones de anticuerpos anti-HIV-1 (33, 35, 61), inhibidores de transcriptasa inversa (29) o inhibidores de proteasa (44). Debido a su potencia, se examinó la combinación PA12:2D7 en formatos de ensayo y relaciones de concentración múltiples, para los que se observaron niveles altos consecuentemente de sinergia. Se observó sinergia moderada para PA12 combinado con PA14. Se observó también sinergia moderada entre PA12 y CD4-IgG2. El complejo CD4/gp120 es metaestable y, si es incapaz de interactuar con un co-receptor, decae en un estado no fusogénico (45-48). Puesto que PA12 bloquea directamente el lugar de unión de gp120 en CCR5, su presencia puede cambiar el equilibrio hacia inactivación del complejo gp120/CD4. Esto explicaría por qué se observa sinergia entre CD4-IgG2 y mAb PA12 con respecto a inhibición de la fusión y entrada. La falta de sinergia entre mAb P14 y CD4-IgG2 sugiere que actúan en dos etapas no consecutivas e independientes de entrada vírica. Se necesitará una combinación de estudios adicionales para determinar los mecanismos precisos de sinergia de los diferentes compuestos con respecto a inhibición de la fusión y entrada víricas.

Los resultados anteriores son consecuentes con un modelo en el que la entrada de HIV-1 tiene lugar en tres etapas distintas que implican unión de receptor, unión de co-receptor y fusión de membrana mediada por co-receptor. Se sugieren sucesos de unión de co-receptor y fusión separados por la falta de correlación entre las capacidades de anticuerpos monoclonales para bloquear la unión de gp120 y la fusión/entrada de HIV-1. La cronología de sucesos durante la fusión se sugiere adicionalmente por los modelos de sinergias observados. Agentes tales como PA12, que inhiben potentemente la etapa intermedia del proceso, a saber, unión de gp120, actúan sinérgicamente con inhibidores de las etapas anterior y subsiguiente.

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Ejemplo 2

Fundamento

La incidencia creciente de HIV-1 resistente a fármacos múltiples obliga a la búsqueda de nuevas clases de agentes retrovíricos. El CCR5 es un co-receptor de fusión indispensable para aislados de HIV-1 primario y proporciona un objetivo prometedor para terapia antivírica. PRO 140 es un anticuerpo monoclonal anti-CCR5 que inhibe potentemente la entrada y replicación de HIV-1 en concentraciones que no afectan a la actividad del receptor de quimioquina de CCR5 in vitro. En el presente estudio, se evaluó el potencial terapéuticob de PRO 140 in vivo usando un modelo terapéutico de animal de infección con HIV-1.

Métodos

Se reconstituyeron ratones CD-17 SCID con PBMC humanas normales y se infectaron con el aislado de R5 HIV-1 JR-CSF. Cuando se alcanzó el estado permanente vírico, el animal se trató intraperitonealmente con PRO 140 o anticuerpo testigo y se comprobó la carga vírica usando el ensayo Roche Amplicor. Estudios iniciales examinaron una dosis simple de 1 mg de PRO 140. En estudios de dosis múltiples, se administró PRO 140 una vez cada tres días durante tres semanas en dosis variables de 0,1 a 1,0 mg. En un experimento separado, se usó citometría de flujo para examinar el potencial de agotamiento de linfocitos tras inyección de PRO 140.

Resultados

PRO 140 de dosis simple o de dosis múltiples redujo las cargas víricas hasta niveles indetectables en todos lo animales tratados, y las reducciones de cargas víricas variaron hasta 1,8 log 10. Se observó un control transitorio de replicación vírica tras inyección simple de PRO 140, mientras que inyecciones múltiples condujeron a un control prolongado sin evidencia de rechazo durante la terapia. Se observaron diferencias dependientes de la dosis en la cinética de las reducciones mediadas por PRO 140 en la carga vírica. Los análisis de citometría de flujo mostraron que el tratamiento con PRO 140 no condujo a agotamiento de linfocitos, confirmando que el impacto sobre la replicación vírica in vivo era debido exclusivamente a bloqueo de CCR5.

Conclusiones

PRO 140 es altamente eficaz para controlar infección con HIV-1 establecida en el modelo de ratón hu-PBL-SCID de infección con HIV-1. Estos hallazgos proporcionan verificación de concepto in vivo para terapia de PRO 140 en particular y para terapia de inhibidores de CCR5 en general.

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Ejemplo 3

Métodos

Se ensayó la capacidad de un anticuerpo de CCR5 humanizado (huPRO 140) para bloquear la movilización de calcio inducida por RANTES en células L1.2-CCR5 y la capacidad para bloquear la replicación d HIV-1 CASE C 1/85 en PBMCs humanas usando métodos descritos aquí.

Resultados

Los resultados como se muestran en la Figura 19 indican que el anticuerpo de CCR5 humanizado bloquea potentemente HIV-1 pero no RANTES.

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<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 429

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,6cm

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 393

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 457

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 423

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 457

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

12

\hskip0,8cm

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 423

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

14

Claims (46)

1. Un anticuerpo anti-CCR5 que comprende (i) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada cadena ligera el producto de expresión de un plásmido denominado pVK:HuPR0140-VK, depósito ATCC Nº PTA-4097, y (ii) dos cadenas pesadas, comprendiendo cada cadena pesada el producto de expresión de un plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 HG2-VH, depósito ATCC Nº PTA-4098, o un plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 (mut B+D+I)-VH, depósito ATCC Nº PTA-4099, o un fragmento de tal anticuerpo anti-CCR5, que se une a CCR5 en la superficie de una célula humana e inhibe la fusión y entrada de HIV-1.

2. El anticuerpo anti-CCR5 de la reivindicación 1ª, en el que cada cadena pesada comprende el producto de expresión del plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 HG2-VH, depósito ATCC Nº PTA-4098.

3. El anticuerpo anti-CCR5 de la reivindicación 1ª, en el que cada cadena pesada comprende el producto de expresión del plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 (mut B+D+I)-VH, depósito ATCC Nº PTA-4099.

4. Un anticuerpo anti-CCR5 que comprende dos cadenas ligeras, comprendiendo cada cadena aminoácidos consecutivos, cuya secuencia de aminoácidos se indica en SEQ ID NO: 6, y dos cadenas pesadas, comprendiendo cada cadena pesada aminoácidos consecutivos, cuya secuencia de aminoácidos es como se indica en SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 12.

5. El anticuerpo anti-CCR5 de la reivindicación 4ª, en el que cada cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 9.

6. El anticuerpo anti-CCR5 de la reivindicación 4ª, en el que cada cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 12.

7. Un ácido nucleico seleccionado del grupo constituido por:

(a) un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia de aminoácidos se indica en SEQ ID NOs: 6, 9 o 12.

(b) Un ácido nucleico que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NOs: 5, 8 u 11; y

(c) un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos, en el que los aminoácidos consecutivos son los aminoácidos expresados por un plásmido denominado pVK:HuPR0140-VK, depósito ATCC Nº PTA-4097, un plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 HG2-VH, depósito ATCC Nº PTA-4098, o un plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 (mut B+D+I)-VH, depósito ATCC Nº PTA-4099.

8. El ácido nucleico de la reivindicación 7ª, en el que el ácido nucleico es ARN, ADN o cADN.

9. Una composición que comprende al menos un anticuerpo anti-CCR5 o el fragmento de tal anticuerpo anti-CCR5 de cualquiera de las reivindicaciones 1ª-6ª, y al menos un agente anti-HIV.

10. La composición de la reivindicación 9ª, en la que el agente anti-HIV se selecciona del grupo constituido por inhibidores de transcriptasa inversa no nucleótidos, inhibidores de transcriptasa inversa nucleótidos, inhibidores de proteasa e inhibidores de entrada vírica.

11. Una composición que comprende al menos un anticuerpo anti-CCR5 o el fragmento de tal anticuerpo anti-CCR5 de cualquiera de las reivindicaciones 1ª-6ª, y un vehículo.

12. Una composición que comprende al menos un anticuerpo anti-CCR5 o fragmento de tal anticuerpo anti-CCR5 según cualquiera de las reivindicaciones 1ª-6ª, que tiene incorporado a él un material seleccionado del grupo constituido por radioisótopos, toxinas, polietilenglicol, agentes citotóxicos y marcas detectables.

13. Un método in vitro para inhibir la infección con HIV-1 de una célula CD4+ que comprende poner en contacto la célula CD4+ con un anticuerpo que comprende (i) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada cadena ligera el producto de expresión de un plásmido denominado pVK:HuPR0140-VK, depósito ATCC Nº PTA-4097, y (ii) dos cadenas pesadas, comprendiendo cada cadena pesada el producto de expresión de un plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 HG2-VH, depósito ATCC Nº PTA-4098, o un plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 (mut B+D+I)-VH, depósito ATCC Nº PTA-4099, o un fragmento de tal anticuerpo anti-CCR5 que se une a CCR5 en la superficie de la célula CD4+, e inhibe la fusión y entrada de HIV-1 en una cantidad y en condiciones tales que se inhibe la fusión de HIV-1, o una célula infectada con HIV-1, a la célula CD4+, inhibiendo por ello la infección con HIV-1 de la célula CD4+.

14. El uso de un anticuerpo anti-CCR5 que comprende (i) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada cadena ligera el producto de expresión de un plásmido denominado pVK:HuPR0140-VK, depósito ATCC Nº PTA-4097, y (ii) dos cadenas pesadas, comprendiendo cada cadena pesada el producto de expresión de un plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 HG2-VH, depósito ATCC Nº PTA-4098, o un plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 (mut B+D+I)-VH, depósito ATCC Nº PTA-4099, o un fragmento de tal anticuerpo anti-CCR5, que se une a CCR5 en la superficie de una célula humana y que inhibe la fusión y entrada de HIV-1, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un sujeto infectado con HIV-1 o para prevenir que un sujeto resulte infectado con HIV-1.

15. El uso de la reivindicación 14ª, que comprende además administrar al sujeto al menos un agente anti-HIV.

16. El uso de la reivindicación 14ª, que comprende además administrar al sujeto la composición farmacéutica al mismo tiempo, o después de, administrar al sujeto al menos un agente anti-HIV.

17. El uso de la reivindicación 14ª, en el que la dosificación de dicho anticuerpo anti-CCR5 varía de 0,1 a 100.000 \mug/kg de peso corporal del sujeto.

18. El uso de la reivindicación 14ª, en el que la dosificación del anticuerpo anti-cCR5 no inhibe la actividad de quimioquinas endógenas en el receptor CCR5 en el sujeto.

19. Un conjugado de anticuerpo anti-CCR5 que comprende un anticuerpo anti-CCR5 que comprende (i) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada cadena ligera el producto de expresión de un plásmido denominado pVK:HuPR0140-VK, depósito ATCC Nº PTA-4097, y (ii) dos cadenas pesadas, comprendiendo cada cadena pesada el producto de expresión de un plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 HG2-VH, depósito ATCC Nº PTA-4098, o un plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 (mut B+D+I)-VH, depósito ATCC Nº PTA-4099, o un fragmento de tal anticuerpo anti-CCR5, que se une a CCR5 en la superficie de una célula humana e inhibe la fusión y entrada de HIV-1, conjugado con al menos un polímero.

20. El conjugado de anticuerpo anti-CCR5 de la reivindicación 19ª, en el que el polímero se selecciona del grupo constituido por polímeros polivinílicos hidrófilos, poli(éteres de alquileno), polioxialquilenos, polimetacrilatos, carbómeros, polisacáridos ramificados, polisacáridos no ramificados, polímeros de azúcar alcoholes, heparina y heparón.

21. El conjugado de anticuerpo anti-CCR5 de la reivindicación 20ª, en el que el polímero es polietilenglicol (PEG) o un derivado del mismo.

22. El conjugado de anticuerpo anti-CCR5 de la reivindicación 21ª, en el que el PEG tiene un peso molecular medio de al menos 20 kD.

23. El conjugado de anticuerpo anti-CCR5 de cualquiera de las reivindicaciones 19ª a 22ª, en el que el peso molecular medio del conjugado es al menos 500 kD.

24. El uso de un conjugado de anticuerpo anti-CCR5 que comprende un anticuerpo anti-CCR5 que comprende (i) dos cadenas ligeras, comprendiendo cada cadena ligera el producto de expresión de un plásmido denominado pVK:HuPR0140-VK, depósito ATCC Nº PTA-4097, y (ii) dos cadenas pesadas, comprendiendo cada cadena pesada el producto de expresión de un plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 HG2-VH, depósito ATCC Nº PTA-4098, o un plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 (mut B+D+I)-VH, depósito ATCC Nº PTA-4099, o un fragmento de tal anticuerpo anti-CCR5, que se une a CCR5 en la superficie de una célula humana e inhibe la fusión y entrada de HIV-1, conjugado con al menos un polímero, para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir infección con HIV-1 de una célula CCR5+ en un sujeto con riesgo de infección con HIV-1 o para tratar una infección con HIV-1 en un sujeto.

25. El uso de la reivindicación 24ª, en el que la composición farmacéutica es para administrar al sujeto con al menos otro agente anti-HIV.

26. El uso de la reivindicación 24ª, en el que la composición farmacéutica es para administrar al sujeto al mismo tiempo, o después de, administrar al sujeto al menos otro agente anti-HIV.

27. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 14ª a 18ª o 24ª a 26ª, en el que la composición farmacéutica es para administrar al sujeto por un método intravenoso, intramuscular o subcutáneo.

28. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 14ª a 18ª o 24ª a 27ª, en el que la composición farmacéutica es para administrar al sujeto continuamente o a intervalos periódicos predeterminados.

29. Una célula hospedante transformada que comprende al menos dos vectores, comprendiendo al menos un vector una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo anti-CCR5, y comprendiendo al menos un vector una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena ligera del anticuerpo anti-CCR5, en el que el anticuerpo anti-CCR5 comprende dos cadenas pesadas que tienen cada una la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NOs: 9 0 12, y dos cadenas ligeras que tienen cada una la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 6.

30. La célula hospedante transformada de la reivindicación 29ª, en la que la célula es una célula de mamífero.

31. La célula hospedante transformada de la reivindicación 30ª, en la que la célula de mamífero es una célula COS, una célula CHO o una célula de mieloma.

32. La célula hospedante transformada de cualquiera de las reivindicaciones 29ª a 31ª, en la que la célula segrega el anticuerpo anti-CCR5.

33. La célula hospedante transformada de cualquiera de las reivindicaciones 29ª a 32ª, en la que el vector que codifica una cadena pesada se denomina pVg4:HuPRO 140 HG2-VH, depósito ATCC Nº PTA-4098.

34. La célula hospedante transformada de cualquiera de las reivindicaciones 29ª a 32ª, en la que el vector que codifica una cadena pesada se denomina pVg4:HuPRO 140 (mut B+D+I)-VH, depósito ATCC Nº PTA-4099.

35. La célula hospedante transformada de cualquiera de las reivindicaciones 29ª a 32ª, en la que el vector que codifica una cadena ligera se denomina pVK:HuPR0140-VK, depósito ATCC Nº PTA-4097.

36. La célula hospedante transformada de cualquiera de las reivindicaciones 29ª a 32ª, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada tiene la secuencia de ácidos nucleicos indicada en SEQ ID NO: 8.

37. La célula hospedante transformada de cualquiera de las reivindicaciones 29ª a 32ª, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada tiene la secuencia de ácido nucleico indicada en SEQ ID NO: 11.

38. La célula hospedante transformada de cualquiera de las reivindicaciones 29ª a 32ª, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena ligera tiene la secuencia de ácido nucleico indicada en SEQ ID NO: 5.

39. Un vector que comprende el ácido nucleico de las reivindicaciones 7ª u 8ª.

40. Un procedimiento para producir un anticuerpo anti-CCR5 que comprende cultivar una célula hospedante que contiene en ella (i) un plásmido denominado pVg4:HuPRO 140-VK, depósito ATCC Nº PTA-4097, y (ii) un plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 HG2-VH, depósito ATCC Nº PTA-4098, o un plásmido denominado pVK:HuPR0140 (mut B+D+I)-VH, depósito ATCC Nº PTA-4099, en condiciones que permitan la producción de un anticuerpo que comprende dos cadenas ligeras, codificadas cada una por el plásmido denominado pVK:HuPR0140-VK, depósito ATCC Nº PTA-4097, y dos cadenas pesadas, codificadas cada una por el plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 HG2-VH, depósito ATCC Nº PTA-4098, o por el plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 (mut B+D+I)-VH, depósito ATCC Nº PTA-4099, para producir por ello un anticuerpo anti-CCR5.

41. Un procedimiento para producir un anticuerpo anti-CCR5 que comprende:

(a) transformar una célula hospedante con (i) un plásmido denominado pVK:HuPR0140-VK, depósito ATCC Nº PTA-4097, y (ii) un plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 HG2-VH, depósito ATCC Nº PTA-4098, o un plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 (mut B+D+I)-VH, depósito ATCC Nº PTA-4099; y

(b) cultivar la célula hospedante transformada en condiciones que permitan la producción de un anticuerpo que comprende dos cadenas ligeras, codificadas cada una por el plásmido denominado pVK:HuPR0140-VK, depósito ATCC Nº PTA-4097, y dos cadenas pesadas, codificadas cada una por el plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 HG2-VH, depósito ATCC Nº PTA-4098, o por el plásmido denominado pVg4:HuPRO 140 (mut B+D+I)-VH, depósito ATCC Nº PTA-4099, para producir por ello un anticuerpo anti-CCR5.

42. El método de las reivindicaciones 40ª o 41ª, que comprende además recuperar el anticuerpo anti-CCR5 producido así.

43. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 40ª a 42ª, en el que la célula hospedante es una célula de mamífero.

44. El procedimiento de la reivindicación 43ª, en el que la célula de mamífero es una célula COS, una célula CHO o una célula de mieloma.

45. Un polipéptido codificado por el ácido nucleico de las reivindicaciones 7ª u 8ª, u obtenible por el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 40ª a 44ª.

46. Un juego para uso en un procedimiento de producción de un anticuerpo ant-CCR5 que comprende:

(a) un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena ligera de un anticuerpo anti-CCR5, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 6; y

(b) un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo anti-CCR5, en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 9, o un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo anti-CCR5, en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 12.