HRP20040446A2 - Method of producing human beta cell lines - Google Patents

Description

Područje izuma

Izum se odnosi na polje biologije, a određenije na polje stanične biologije i stanične terapije.

Dosadašnje spoznaje

Do dijabetesa tipa I dolazi zbog destrukcije imunog mehanizma beta stanica pankreasa, a rezultat je nedostatak produkcije inzulina i hiperglikemija. Stanična terapija koja koristi beta stanice od donora može predstavljati jedan način liječenja pacijenata koji imaju dijabetes. Međutim, treba riješiti dva glavna problema prije dostignuća ovog cilja. Prvo, treba dizajnirati imunosupresivne protokole presađivanja. Nedavni radovi pokazuju da je došlo do napretka u tom polju (Shapiro et al., 2000). Drugi problem koji treba riješiti tiče se malog broja zrelih beta stanica od donora, a koje su na raspolaganju za presađivanje (Weir i Bonner-Weir, 1997). Postoji potreba da se nađu alternativni izvori funkcionalnih zrelih beta stanica. To je problem koji ovaj izum želi riješiti. Tijekom prošlih nekoliko godina predloženo je na osnovu razumijevanje i rekapitulacije razvitka beta stanica koje se zbiva tijekom života embrija i fetusa, da se mogu producirati beta stanice koje se mogu koristiti za staničnu terapiju dijabetesa tipa I. Stoga je učinjen veliki napor i napredak da se definira molekulski mehanizam koji kontrolira prenatalni razvoj pankreasa u glodavaca i definirana je uloga specifične transkripcije i faktora rasta (Edlund, 1998; St Onge et al. 1999; Wells i Melton 1999; Schrfmann, 2000; Grapin-Botton i Melton, 2000; Kim i Hebrok, 2001). Različitim izvorima tkiva potencijalno bogatim s prekursorskim stanicama se također sada testir sposobnost diferencijacije u zrele beta stanice. Takve stanice dobivaju se iz fetalnog ili neonatalnog svinjskog pankreasa (Yoom et al., 1999;, Otonkoski et al., 1999) ili iz dijela humanog odraslog pankreasa obogaćenog stanicama koje tvore kanal za koje se mislilo da sadrže prekursorske stanice (Bonner-Weir, 1997). Do sada su prenatalna humana tkiva pankreasa (14-24 tjedana) korišten bez uspjeha, jer su sva tkiva dobivena od fetusa bila u kasnim stupnjevima razvoja i već su bila previše zrela za upotrebu u različitim testovima (Tuch et al., 1984; Tuch et al., 19864; Sandler et al., 1985; Hayek et al., 1997; Goldrath et al., 1995;. Primjerice, Tuch et al., (1984); Goldrath et al., (1995) i Povlsen et al. (1974) su koristili dio humanog pankreasa od 14 do 24 tjedana razvoja koji je presađen u imunoimkompetentnog miša s ciljem da se slijedi razvitak endokrinog tkiva. Nakon nekoliko tjedana ili mjeseci u miševima primateljima je nađeni su svi tipovi endokrinih stanica nakon uklanjanja humanog tikva (Tuch et al., 1984; Sandler et al., 1985). Međutim, važno je sjetiti se da su između 14 i 24 tjedana razvoja (starost tkiva u vrijeme transplantacije) endokrine stanice već prisutne i povezane u Langerhansove otoke (Bouwens et al., 1997; Stefan et al., 1983; Fukayama et al., 1086; Miettinen et al., 1992). Štoviše, u tim eksperimentima koristeći starija tkiva humanog fetusa, a kad je prije i nakon transplantacije uspoređena prisutnost količine stanica koje eksprimiraju inzulin u presatku, nije detektirano jasno povećanje mase beta stanica (Tuch et al.). Stoga je teško odrediti jesu li humane endokrine stanice koje su bile prisutne nakon nekoliko tjedana ili mjeseci u mišu novostvorene endokrine stanice ili su stanice koje su postojale prije transplantacije, te su opstale.

Ovaj izum rješava gore spomenuti problem prikazujući zrele beta stanice; izumitelji doista prikazuju da se funkcionalne humane beta stanice mogu razviti u NOD/scid miševima od nezrelih humanih embrionalnih pankreasa ne starijih od 10 tjedana razvitka. Točnije, izumitelji prikazuju da kada su humani pankreasi embrija koji ne sadrže stanice koje eksprimiraju inzulin ili ih ima vrlo malo (vidi Sliku 4), presađeni u imunokompetetntne miševe, tkivo pankreasa raste, njegova masa se povećava 200 puta unutar šest mjeseci. Tijekom tog vremena dolazi do diferencijacije endokrinih stanica i apsolutni broj humanih beta stanica se povećava za faktor 5000. Konačno, razvijene endokrine stanice su funkcionalne i mogle su regulirati glikemiju u miševima koji imaju manjak beta stanica glodavca.

Taj model razvitka humanih embrionalnih pankreasa u NOD/scid miševima izgleda da imitira ontogenozu humanog pankreasa do kojeg dolazi in vivo i sada se može koristiti za ispitivanje mehanizma koji kontrolira razvitak humanog pankreasa embrija, što je pitanje koje je dijelom izbjegnuto u prošlosti zbog nedostatka pravog eksperimentalnog sustava. Štoviše, podaci izumitelja pokazuju da humane stanice embrionalnog pankreasa predstavljaju izvor nezrelih stanica koje se proliferiraju i diferenciraju u velikoj količini u beta stanice, a kada su transplantirane u odraslu životinju. To tkivo može stoga biti korisno kao alternativni izvor beta stanica za transplantaciju.

Detaljni opis izuma

Ovaj izum prikazuje metodu regeneracije funkcije pankreasa kod pojedinca, a metoda sadrži:

(a) uvođenje učinkovite količine stanica embrionalnog pankreasa ne starijih od 10 tjedana razvoja, u bubrežnu kapsulu ne pretile životinje koja ima težak oblik dijabetesa kombiniran s imunodeficijencijom (NOD/Scid) a koja nije čovjek, pri čemu je rečena NOD/scid životinja različite vrste od rečene životinje od koje su dobivene rečene stanice embrionalnog pankreasa; te

(b) ostavljanje životinjskih stanica embrionalnog pankreasa se razviju, da se diferenciraju i da obnove barem jednu funkciju pankreasa koje su regulacija glikemije i izlučivanja digestivnih enzima, te

(c) transplantaciju učinkovite količine funkcionalnih stanica pankreasa životinje dobivenih u koraku (b) u rečenog pojedinca.

Termin "pojedinac" je kralježnjak, preferirano sisavac. Sisavci uključuju, ali nisu na njih ograničeni, ljude, glodavce (tj. miševe, štakore, zamorce), životinje s farme, životinje za sport i kućne ljubimce. U preferiranoj cjelini pojedinac je sisavac, a preferiranije čovjek.

U preferiranoj cjelini, životinjske stanice embrionalnog pankreasa su stanice pankreasa humanog embrija. Alternativno, stanice mogu među ostalima biti odabrani od primjerice stanica pankreasa svinja, goveda, koza, ovaca, primata, glodavaca (tj. miš, štakor, zamorac...). Životinjske stanice embrionalnog pankreasa su odabrane od stanica koje nisu starije od 10 tjedana, nisu starije od 9 tjedana, nisu starije od 7 tjedana, nisu starije od 6 tjedana, nisu starije od 5 tjedana, nisu starije od 4 tjedana, nisu starije od 3 tjedna, nisu starije od 1 tjedna. U preferiranoj cjelini životinjske stanice embrionalnog pankreasa stare su 6-9 tjedana razvoja. Prema preferiranoj cjelini, stanica pankreasa embrija životinje iz izuma je humana stanica pankreasa embrija koja nije starija od 9 tjedana, preferiranije stara je između 6 i 9 tjedana.

Ne pretila životinja koja ima težak oblik dijabetesa kombiniran s imunodeficijencijom, (NOD/scid) je odbrana od sljedećih: goveda, svinje, konji, ovce, koze, primati osim ljudi, glodavci kao što su miševi, štakori, zamorci. U preferiranoj cjelini NOD/scid životinja je miš. NOD/scid miševi iz izuma su bilo koliko stari, a preferirano dovoljno stari za izvođenje presađivanja u kapsulu bubrega. Preferirano NOD/scid miševi su od oko 2 do 15 tjedana stari. NOD/scid životinja je životinja kojoj nedostaju T- i B-limfociti i ne mogu generirati humoralnu ili stanicom održavanu imunost.

"Učinkovita količina" je količina dovoljna da kao učinak ima željeni klinički rezultat. Učinkovita količina se može davati u jednom ili više davanja, mada je preferirano da jedno davanje bude dovoljno. Za svrhe ovog izuma, učinkovita količina stanica embrionalnog pankreasa je količina koja je dovoljna da producira diferencirane stanice pankreasa koje mogu uspostaviti jednu ili više funkcija pankreasa. Mišljeno je da do uspostavljanja može doći brzo nakon uvođenje relativno velikog broj stanica pankreasa, primjerice više od 109 stanica. Uz to, također je razmatrano da će se nakon uvođenja manjeg broja stanica pankreasa funkcija pankreasa uspostaviti nakon što se ostavi da stanice in vivo proliferiraju. Stoga, "učinkovita količina" stanica pankreasa se može dobiti ostavljanjem malog broja stanica pankreasa dovoljno vremena da regereiraju cijeli ili dio pankreasa. Preferirano je učinkovita količina dana pojedincu veća od oko 101 stanica pankreasa, preferirano između 102 i 1015 stanica pankreasa ili čak preferiranije između 103 i 1012 stanica pankreasa. Učinkovita količina životinjskih stanica pankreasa transplantiranih u koraku (c) metode iz izuma je preferirano između 103 i 1012 životinjskih stanica pankreasa. Sa stanovišta tretmana, "učinkovita količina" stanica pankreasa je količina koja može poboljšati, ublažiti, stabilizirati, obrnuti, usporiti ili odgoditi razvoj bolesti pankreasa, kao što je dijabetes.

Prema preferiranoj cjelini, životinjske stanice pankreasa embrija korištene u metodama iz ovog izuma se mogu dobiti od heterolognog donora (alograft), primjerice od donora organa ili živog donora. Alternativno autograft se može provesti uklanjanjem dijela pankreasa pojedinca u ranom stupnju razvitka (manje od 10 tjedana) ili reverzijom diferenciranog fenotipa odraslih stanica pankreasa i uvođenje stanica pankreasa koje mogu regenerirati pankreas u istom pojedincu. Za autograft je uklonjeno najmanje 5% pankreasa donora. Za alograftove, uklonjeno je najmanje od 5%, preferirano više od 30%, preferiranije više od 50%, i još preferiranije više od 80% pankreasa. Metode iz ovog izuma obuhvaćaju alograft ili autograft stanica pankreasa. Svaki tip presađivanja ima prednosti. Autograft (kad se stanice pankreasa istog pojedinca koriste od za regeneriranje funkcije pankreasa) se koristi da se izbjegne imunološka reakcija. Presadak uzrokuje reakciji domaćina kada su donor i primatelj različiti pojedinci i donorov imuni sustav povećava odgovor na presađivanje. Tipiziranje tkiva i histokompatibilnost (MHC) smanjuju ozbiljnost pojavljivanja reakcije na presadak u domaćinu. ipak, autologno uvođenje stanica pankreasa će biti posebno korisno u slučajevima kada je pankreas pojedinca bolestan. U takvim slučajevima mala količina autolognih tkiva pankreasa embrija će regenerirati funkciju pankreasa. Alografti su korisni u slučajevima kada pankreas nije na raspolaganju, primjerice kada je pankreas pojedinca bolestan. Različite MHC stanice pankreasa određene kao odgovarajuće, a utvrđeno nakon tipizacije tkiva što je provedena da se nađe odgovarajući donor, se mogu održavati in vitro ili izolirane od donora. Imunosupresivni lijekovi, kao što je ciklosporin se također mogu davati da se smanji reakcija domaćina na presadak. Alografti koji koriste stanice dobivene metodama iz ovog izuma su također korisni jer jedan zdravi donor može dati dovoljno stanica da se regenerira barem djelomično funkcija pankreasa u više primatelja. Kako su stanice pankreasa u ovom izumu sposobne proliferirati se i diferenicrati se vrlo učinkovito, potreban je samo mali broj za uspostavljanje funkcije pankresa. Prema tome, jedan pankreas se može podijeliti za višestruke alografte. Slično, mali broj stanica od pankreasa može biti kultura in vitro te se koristiti za višestruka presađivanja. U jednoj cjelini izuma stanice pankreasa iz izuma se mogu genetski modificirati da bi odgovarale svim ili različitim MHC (takve stanice predstavljaju univerzalne donorske stanice pankreasa). Stanice pankreasa iz izuma označuju stanice embrija ili funkcionalne stanice pankreasa koje su se razvile i diferencirale u NOD-scid životinji.

Pogodne tehnike za izolaciju tkiva pankreasa iz donora su poznate u struci. Primjerice, može se koristiti ekstrakcija stanica pankreasa putem biopsijske igle ili kirurško uklanjanje dijela ili cijelog pankreasa.

Tkivo pankreasa se može koristiti u metodama iz ovog izuma bez daljnjeg tretmana ili modifikacije. Modifikacije su dolje opisane. Za modificirane i nemodificirane stanice je preferirano da se od tkiva dobije jedna stanična suspenzija. Stanične suspenzije se mogu dobiti prema metodama poznatim u struci, primjerice centrifugiranjem i enzimskim tretmanom. Tkivo pankreasa ili stanična suspenzija također može biti zamrznuta i rastaljena prije upotrebe. Preferirano se koriste svježe stanice nakon izolacije i procesuiranja.

Alternativno se stanice pankreasa embrija u ovom izumu mogu kultivirati dugotrajno in vitro da se dobiju stabilne linije pankreas-regenerirajućih stanica. Kako je ovdje korišteno, termin "in vitro kultura" odnosi se na preživljavanje stanica izvan tijela. Preferirano su kulture iz ovog izuma "dugotrajna" kulture koje proliferiraju stabilno in vitro u duljem periodu vremena. Te stabline populacije stanica su sposobne preživjeti i proliferirati in vitro s embrionalnim fenotipom pankreasa (t.j. te stanice će biti stem stanice). Metode kultiviranja različitih tipova stem stanica su poznate u struci. Primjerice. WO 94/16059 opisuje dugotrajnu kulturu (više od 7 mjeseci) neuronskih stanica. Dugotrajne kulture drugih tipova stem stanica su također opisane u ovom izumu. Stanice embrionalnog pankreasa kultivirane in vitro se mogu genetički modificirati da eksprimiraju gene od interesa, kao što je terapeutski gen.

Prema ovo izumu, funkcionalne stanice pankreasa životinje transplantirane u koraku (c) su preferirano uvedene u pankreas rečenog pojedinca. Alternativno takve funkcionalne stanice pankreasa životinje su uključene u kapsule koje se mogu ugraditi i koje mogu biti uvedene u tijelo pojedinca na bilo koje mjesto, preferirano u susjedstvo pankreasa ili mjehura ili jetre ili pod kožu.

Kako je ovdje korišteno, termin "uvođenje" označuje snabdjevanje ili davanje pojedincu. U ovom izumu, funkcionalne stanice pankreasa sposobne za regeneriranje funkcionalnih stanica pankreasa su uvedene u pojedinca. Metode uvođenja stanica u pojedince je dobro poznata stručnjacima i uključuju, ali bez ograničenja, injekciju, intravenoznu ili parenteralno davanje. Može se provesti jednostuko, višestruko ili povremeno davanje. Stanice pankreasa se mogu uvesti u bilo koje od nekoliko različitih mjesta, uključujući ali bez ograničenja abdominalnu šupljinu, bubrega, jetru, arteriju slezene, venu porte ili slezenu. Preferirano se stanice pankreasa deponiraju u pankreas pojedinca.

Termin "pankreas" odnosi se na veliku produljenu žućkastu žljezdu nađenu u kralježnjacima. Pankreas ima endokrine i egzokrine funkcije, produkciju hormona inzulina i glukagona, te uz to izlučivanje enzima za varenje kao što je tripsinogen, kimotripsinogen, prokarboksipeptidaza A i B, elastaza, ribonukleaza, dezoksiribonukleaza, profosfolipaza A, pankreasna lipaza, pankreasna α-aminlaza. Termin "stanice pankreasa" odnosi se na stanice dobivene od pankreasa. U preferiranoj cjelini, funkcija pankreasa prema izumu je reagulacija glikemije.

Ovaj izum također prikazuje metodu u kojoj rečeni pojedinac jeste o inzulinu ovisan dijabetičar. Stoga, izum također razmatra prikaz metode tretmana dijabetesa kod pacijenta koji je čovjek, a koji ima potrebu za takvim tretmanom, a metoda sadrži sljedeće korake:

(a) uvođenje učinkovite količine humanih stanica embrionalnog pankreasa ne starijih od 10 tjedana razvoja, preferirano 6 do 9 tjedana razvoja u bubrežnu kapsulu ne pretile životinje koja ima težak oblik dijabetesa kombiniran s imunodeficijencijom (NOD/Scid), a koja nije čovjek, te

(b) ostavljanje stanica embrionalnog pankreasa da se razviju, da se diferenciraju i da obnove barem jednu funkciju pankreasa, te

(c)transplantaciju učinkovite količine funkcionalnih humanih stanica pankreasa dobivenih u koraku (b) u rečenog pacijenta,

(d) tretman dijabetesa pri čemu je rečeni tretman moguć zbog obnove rečene funkcije pankreasa za regulaciji glikemije.

Prethodno opisana metoda je specifičnije posvećena tretmanu dijabetesa u pacijentu koji je čovjek.

Kako je ovdje korišten termin "regeneracija rečene funkcije pankreasa" odnosi se na rast ili proliferaciju novog tkiva. U ovom izumu regeneracija se odnosi na rast i razvitak funkcionalnog tkiva pankreasa. U većini slučajeva regenerirano tkivo pankreasa će također imati citološke i histološke karakteristike normalnog tkiva pankreasa. Primjerice, za stanice pankreasa uvedene u pojedinca da bi generirale funkcionalno tkivo pankreasa se očekuje da eksprimiraju inzulin i glukagon, i digestivne enzime skupa s markerima od pankreasa kao što je Nkx6.1, Fax6 ili PC1/3. Funkcije pankreasa mogu biti utvrđene mjerenjima i testiranjima poznatim u struci kao što je ekspresija inzulina i glukagona. Prema preferiranoj cjelini ne pretila životinja koja ima težak oblik dijabetesa kombiniran s imunodeficijencijom je miš.

Ovaj izum također prikazuje metodu produkcije funkcionalnih stanica pankreasa životinje, a rečena metoda sadrži sljedeće korake:

(a) uvođenje učinkovite količine životinjskih stanica embrionalnog pankreasa ne starijih od 10 tjedana razvoja, u bubrežnu kapsulu ne pretile životinje koja ima težak oblik dijabetesa kombiniran s imunodeficijencijom (NOD/Scid) a koja nije čovjek, pri čemu je rečena NOD/scid životinja različite vrste od rečene životinje od koje su dobivene rečene stanice embrionalnog pankreasa; te

(b) ostavljanje životinjskih stanica embrionalnog pankreasa se razviju, da se diferenciraju i da obnove barem jednu funkciju pankreasa, odabranu regulacije glikemije i izlučivanja digestivnih enzima, te

(c) sakupljanje životinjskih stanica pankreasa dobivenih u koraku (b), te

(d) moguće in vitro kulitiviranje stanica dobivenih u koraku (c).

Izum obuhvaća funkcionalnu stanicu pankreasa životinje koja se može dobiti ili je dobivena metodom prema izumu. Preferirano je rečene stanica odabrana među alfa stanicama pankreasa, beta stanicama pankreasa. Preferirano je rečena stanica beta stanica pankreasa. Takva beta stanica pankreasa preferirano eksprimira inzulin kao odgovor na glukozu. Štoviše, ovaj izum prikazuje funkcionalnu beta stanicu pankreasa koja eksprimira glukagon kao odgovor na glukozu. Uz to, rečena funkcionalne stanica pankreasa eksprimira i izlučuje digestivne enzime. Rečena stanica je preferirano humana stanica ili stanica štakora.

Stanice pankreasa iz ovog izuma (t.j. stanica pankreasa embrija) se mogu modificirati primjerice upotrebom odgovarajućih uvjeta kultiviranja ili tehnikama genetskog inženjeringa. Ove zadnje uključuju uvođenje transgena u rečenu stanicu integriranu u genom rečene stanice ili prisutne u ektrakromosomskoj replikaciji. U jednoj cjelini metoda produkcije funkcionalne stanice pankreasa iz izuma dalje sadrži korak genetske modifikacije stanica dobivenih u koraku (d) i/ili dalje sadrži preliminarni korak genetske modifikacije rečenih životinjskih stanica pakreasa ne starijih od 10 tjedana. Pod "genetskom modificiranjem" je mišljeno uvođenje najmanje jednog transgena (tj. u molekulu egzogene nukleinske kiseline) u rečenu stanicu, a rečeni transgen je stabilno prenešen u stanice potomstva. Kako se ovdje koristi, transgen znači bilo koju molekulu nukleinske kiseline, preferirano bilo koju genomsku DNA ili RNA, rekombinantnu DNA ili RNA ili cDNA jednostruke ili dvostruke sekvencije.

Preferirano transgen sadrži barem sekvenciju od interesa koja je operativno povezana na promotrosku sekvenciju i tvori ekspresijsku kazetu koja usmjerava ekspresiju gena od interesa u stanice pankreasa. Rečeni transgen ili ekspresijska kazeta je prisutna u linearnom obliku, ali je preferirano rečeni transgen ili DNA kazeta dio fragemnta nukleinske kiseline ili klonirana u i/ili ekspresijski vektor. "Operativno povezan" kako se ovdje koristi uključuje navod funkcionalne veze između promotora i druge sekvencije (tj. sekvencije od interesa) pri čemu promotorska sekvencija inicira i održava transkripciju rečene DNA sekvencije koja odgovara drugoj sekvenciji. "Promotor" ili "promotorska sekvencija" je DNA regulacijska regija koja može vezati RNA polimerazu u stanici i inicirati transkripciju nizvodno (3' smjer) kodirajuće sekvencije. Unutar promotorske sekvencije će se naći transkripcijsko mjesto inicijacije kao i domena vezanja proteina odgovorna za vezanje RNA polimeraze. Eukariotski promotori će često, ali ne uvijek, sadržavati TATA kutije i CAT kutije. Dodatni odgovorni elementi se mogu naći promotorskoj sekvenciji ili u njenom susjedstvu, kao što su aktivirajuće sekvencije ("pojačivači") inhibitori sekvencije ("utišavači") i uzvodne sekvencije. Različiti promotori uključujući neophodne ili na tkivo specifične promotore i inducibilne i konstruktivne promotore se mogu koristiti da pokreću ekspresiju gena od interesa. Preferirano promotor može pokretati ekspresiju gena od interesa barem u stanicama pankreasa ili u stanicama pankreasa u specifičnom stupnju razvoja kao što su stanice pankreasa ne starije od 10 dana ili zrele beta stanice. Preferiranije je da promotor jeste promotor inzulinskog gena a još preferiranije je odabran od promotora štakorskog inzulinskog gena, (Genebank N° GBJ007448), promotora mišjeg inzulinskog gena, (Genebank N° GBX04724), promotora humanog inzulinskog gena, (Genebank N° GBAP001994). Alternativno promotor se može inducirati antibiotikom kao što je tetraciklin. U sljedećoj cjelini, promotor pokreće ekspresiju gena od interesa koji ovisi o temperaturi; u takvom slučaju promotor je preferirano od gena koji kodira na temperaturu osjetljiv mutant od velikog T antigena SV40.

Prema ovom izumu "vektor" je replikon na koji je spojen drugi polinukleotidni segment tako da donese replikaciju i/ili ekspresiju na spojeni segment. Vektor može imati jedno ili više mjesta prepoznavanja restrikcijske endonukleaze, na kom mjestu se DNA sekvencije mogu izrezivati na određeni način bez gubitka suštinske biološke funkcije vektora. Vektori mogu dalje imati mjesta klice (npr. za PCR), transkripcijski i/ili translacijsku inicijaciju i/ili regulacijska mjesta, rekombinantne signale, replikon, izborne markere itd. Primjeri vektora uključuju plazmide, fage, kozmide, fagemid, umjerni kromosom gljivice (YAC), bakterijski umjetni kromosom (BAC), humani umjetni kromosom (HAC), virus, vektor zasnovan na virusu kao što je adenovirusni vektor, lentivirusni vektor i ostale DNA sekvencije koje mogu replicirati ili biti replicirane in vitro ili u stanici domaćina ili izražavati željeni DNA segment na željenom mjestu unutar stanice domaćina. U preferiranoj cjelini vektor je na virusu zasnovani vektor, preferirano na lentivirusu zasnovan vektor kao što je na HIV-1 zasnovan vektor. Takav na lentivirusu zasnovan vektor se preferirano koristi za transfekciju stanice ambrionalnog pankreasa iz izuma.

Rekombinantne DNA tehnologije korištene za konstrukciju ekspresijskog vektora prema izumu su one poznate i uobičajeno korištene od stručnjaka. Standardne tehnike su korištene za kloniranje, izolaciju DNA, pojačavanje i pročišćavanje; enzimske reakcije koje obuhvaćaju DNA ligazu, DNA polimerazu, restrikcijsku endonukleaze se izvode prema uputama proizvođača. Te tehnike i druge se općenito izvode prema Sambrook et al. (1989).

Transgen i vektor prema izumu je uveden u funkcionalne beta stanice pankreasa ili u stanice pankreasa koje nisu starije od 10 tjedana, a upotrebom poznatih tehnika kao što je primjerice transfekcija taloženjem kalcijevim fosfatom, lipofekcija, elektroporacija, toplinski šok, mikroinjekcija u pronukleus, "genski pištolj", upotreba umjetnih virusnih omotača, virusna infekcija. Takav transgen ili vektor je integriran homolognom rekombinacijom u genom domaćina ili slučajno integriran ili je prisutan u vankromosomskom replikonu.

Kako je ovdje korišteno "sekvencija od interesa" znači bilo koju dvostruku ili jednostruku DNA ili RNA molekulu. To može biti genomni DNA fragment kao što je gen(i), inton(i), ekson(i), regulacijska sekvencija(e) ili kombinacije njihovih fragmenata ili rekombinantna DNA molekula kao što je primjerice cDNA gen. Kada sekvnecija od interesa kodira protein od interesa, rečena sekvencija od interesa može biti selekcijski gen, gen izvještavač, terapeutski gen, imortalizirajući gen, transformacijski gen. Takva sekvencija od interesa može sadržavati bilo koji genetski element neophodan za ispravnu ekspresiju tog proteina od interesa u stanici domaćina.

U jednoj cjelini takva "sekvencija od interesa" kodira protein od interesa koji je primjerice od dijagnostičkog ili istraživačkog interesa. Primjeri takvih porteina koji su interesantni u istraživanju su selektivni proteini. Kako je ovdje korišteno "gen za selekciju" označuje gen koji kodira protein ili peptid (i.e. selekcijski marker) koji dozvoljava da se odabere mjesto sinteze molekule i stanice koja je sadrži, često pod određenim uvjetima tj. u prisutnosti selektivnog sredstva. Ti selektivni proteini uključuju ali nisu ograničeni, produkte koji dovode do rezistencije na inače toksične spojeve (npr. antibiotike). Primjerice, geni rezistentni na ampicilin ili neomicin jesu geni koji kodiraju izborni marker iz izuma. Ti izborni markeri mogu biti pozitivi ili negativi (vidi Capecchi et al. US 5 631 153). Prema preferiranoj cjelini, rečeni izborni proteinski marker je pozitivni izborni proteinski marker koji kodira gen odabran iz skupine koju čine na antibiotik rezistentni geni, geni hisD, gen hipoksantin fosforibozil transferaze (HPRT), gen gvanin-fosforibozil-transferaze (Gpt). Rečeni na antibiotik rezistentni gen, na neomicin rezistentni gen, na tetraciklin rezistentni gen, na ampicilin rezistentni gen, na kanamicin rezistentni gen, na fleomicin rezistentni gen, na bleomicin rezistentni gen, na geneticin rezistentni gen, na karbenicilin rezistentni gen, na kloramfenikol rezistentni gen, na puromicin rezistentni gen, gen blasticidin-S-deaminaze. U preferiranoj cjelini rečeni na antibiotik rezistentni gen je na higromicin rezistentni gen, preferirano gen higromicin-B fosfotransferaze (hpt) Escherichie coli. U tom slučaju selektivno sredstvo je higromicin. U sljedećoj preferiranoj cjelini, rečeni na antibiotik rezistentni gen je na neomicin rezistentni gen. U tom slučaju selektivno sredstvo je G418. U sljedećoj preferiranoj cjelini pozitivni izborni proteinski marker iz izuma je His D; u tom slučaju selektivno sredstvo je Histidinol. U sljedećoj cjelini pozitivni izborni proteinski marker iz izuma je Hypoxanthine fosforibozil transferaza (HPRT) ili Hypoxanthine gvanozil fosforibozil transferaza (HGPRT); u tom slučaju selektivno sredstvo je Hypoxanthine. U sljedećoj cjelini pozitivni izborni proteinski marker iz izuma je gvanin-fosforibozil-transferaza (Gpt); u tom slučaju selektivno sredstvo je ksantin. Također je obujam izuma upotreba negativnog proteinskog selektivnog markera. Primjerice, geni koji kodiraju takve proteine su HSV-TK gen; u tom slučaju selektivno sredstvo je Acyclovir-Gancyclovir. Primjerice, geni koji kodiraju takve proteine su Hypoxanthine fosforibozil transferaza (HPRT) ili gvanin-fosforibozil-transferaza (Gpt); u tim slučajevima selektivno sredstvo je 6-Tiogvanin. Primjerice, gen koji kodira takve proteine je citozin deaminaza; u tom slučaju selektivno sredstvo je 5-fluor-citozin. Ostali primjeri negativnih izbornih proteinskih markera su virusni i bakterijski toksini kao što je toksin A difterije (DTA).

Primjeri takvih proteina koji su od interesa za istraživanje su izvještavajući proteini. "Izvještavajući protein" znači bilo koji gen koji kodira produkte (t.j. izvještavajući protein) čija se ekspresija može detektirati. Izvještavajući protein može imati jedno od sljedećih svojstava bez ograničenja: fluorescencija, enzimska aktivnost ili mogućnost specifičnog vezivanja na drugu molekulu (npr. biotin ili epitop kojeg prepoznaje antitijelo). Primjeri izvještavajućih proteina su autofluorescentni proteini kao što je zeleno fluorescirajući protein (GFP), pojačano zeleno fluorescirajući protein (EGFP) crveno fluorescirajući protein (RFP), plavo fluorescirajući protein (BFP), žuto fluorescirajući protein (YFP), i fluorescentne varijante tih proteina. U preferiranoj cjelini, gen od interesa je gen koji kodira GFP. Primjeri izvještavajućih proteina koji imaju enzimsku aktivnost su β-galaktozidaza, β-glukoronidaza, akloacin fosfataza, luciferaza, alkohol dehidrogenza, kloramfenikol-acetil transferaza, peroksidaza.

U sljedećoj cjelini, sekvnecija od interesa je terapeutski gen. "Terapeutski gen" je gen koji ispravlja ili kompenzira deficit osnovnog proteina ili alternativno koji može smanjiti određeni gen ili djelovati na negativni efekt njegovog kodiranog produkta u datom stanju bolesti ili sindromu. Primjerice, terapijski gen iz izuma je transkripcijski faktor ili hormon, faktor rasta koji povećava izlučivanje inzulina u stanicama pankreasa.

U sljedećoj preferiranoj cjelini, sekvencija od interesa je transformirajući gen. "Transformirajući gen" znači gen koji daje stanicama koje ga sadrže sposobnost da imaju transformiran ili kancerogeni fenotip. Transformirane stanice preferirano imaju sljedeće karakteristike: besmrtnost (ili negoraničen rast), gubitak kontaktne inhibicije, neovisnost prema faktorima rasta, tumorigenost, gubitak sidrenja. Primjeri transformiranih gena su stanični geni ras, met, NGL (ex-neu), bcl-X, geni telomeraze ili virusni geni kao što je veliki T antigen SV40 ili njegov mutirani oblik osjetljiv na temperaturu. Prema preferiranoj cjelini gen od interesa je mutant osjetljiv na temperaturu velikog T antigena simian virusa 40 (SV40).

U preferiranoj cjelini sekvencija od interesa je imortalizirajući gen. "Imortalizirajući gen" označuje gen koji daje stanicama koje ga sadrže i koje ga eksprimiraju sposobnost (skoro) neograničenog rasta. Stanice transficirane imortalizirajućim genom su sposobne dijeliti se (skoro) neograničeno, a ne kao normalne stanice koje su programirane da se dijele ograničeni broj puta (primjerice 50 dioba za odrasli fibroblast). Među imortalizirajućim genima jedan može isporučiti myc i myb stanične gene, gene DNA virusa, kao što je veliki T antigen ili na temperaturu osjetljiv mutirani oblik velikog T antigena E1A. Imortalizirajući geni općenito kodiraju protein jezgre koji se vezuje na DNA, izravno ili indirektno preko proteinskih faktora.

Pored imortalizacije stanice pankreasa iz izuma, a uvođenjem transgena koji kodiraju imortalizirajući gen u stanici, ovaj izum također obuhvaća imortalizaciju stanica pankreasa transfekcijom sa spojem odabranim iz skupine koja sadrži prirodni virus, rekombinantni virus ili njegov fragment, na virusu zasnovan vetor koji sadrži imortalizirajući gen. Stoga metoda produkcije funkcionalne stanice pankreasa životinje iz izuma dalje sadrži korak imortalizacije stanica embrionalnog pankreasa ne starijih od 10 tjedna razvoja, i/ili dalje sadrži korak imortalizacije stanica dobivenih u koraku (d). Takav virus se može odabrati među lentivirusima, simian virusom SV40, Epstein-Bahr virusom, virusom Moloney leukemije. Preferirano je stanica iz izuma transficirana na lentalvirusu zasnovanom vektori, preferiranije na HIV-1 zasnovanom vektoru.

Na virusu zasnovan vektor iz izuma, preferiranije na HIV-1 zasnovan vektor iz izuma sadrži ekspresijsku kazetu kao što je prethodno opisano da sadrži gen od interesa operativno vezan na promotor, kao što je promotor štakorskog inzulina ili promotor humanog inzulina. U jednoj cjelini vektor zasnovan na HIV-1 sadrži izvještavajući gen kao gen od interesa, a preferiranije GFP operativno vezan na promotor inzulinskog gena štakora. U sljedećoj cjelini na HIV-1 zasnovani vektor iz izuma sadrži ekspresijsku kazetu koja sadrži onkogen kao gen od interesa, operativno vezan na promotor štakorskog inzulina.

Višestruke trangenične stanice također spadaju u obujam izuma. Štoviše, stanica pankreasa iz izuma može biti imortalizirana gore spomenutim spojem i općenito se može modificirati da eksprimira gen od interesa.

Izolirane funkcionalne stanice pankreasa se mogu kultivirati in vitro prije uvođenja u pojedinca. Pogodni mediji su dobro poznati stručnjacima i mogu obuhvaćati faktore rasta ili druge spojeve koji povećavaju preživljavanje, proliferaciju ili selektivno promoviraju rast određenih podtipova stanica pankreasa kao što su alfa, beta, delta stanice pankreasa.

U sljedećoj cjelini ovog izuma prikazana je stanica pankreasa iz izuma koja je lijek. Točnije, ovaj izum odnosi se na upotrebu stanice pankreasa iz izuma za pripravu lijeka za tretman dijabetesa, hipoglkemije ili patoloških stanja povezanih s disfunkcijom digestivnih enzima. U preferiranoj cjelini izum se odnosi na upotrebu stanice pankreasa iz izuma za pripravu lijeka za tretman dijabetesa. Ovaj izum također prikazuje upotrebu stanice pankreasa iz izuma za staničnu terapiju.

Izum također obuhvaća tretman bolesti ili poboljšanje simptoma povezanih s bolestima, a podvrgavanjem prijenosa gena u populaciju stanica pankreasa ovdje prikazanom metodom. Bolesti povezane s nedostatkom određenog produkta izlučivanja, uključujući ali bez ograničenja hormone, enzime, interferone, faktore rasta ili slično se također mogu tretirati genetski modificiranim stanicama pankreasa.

Također je cilj ovog izuma upotreba stanice pankreasa iz izuma za ispitivanje fiziopatološkog razvoja dijabetesa. Takva stanica in vitro kulitivirana ili presađena u pojedinca kao alograft ili autograft bi bila vrlo korisna za ispitivanje molekularnih, bioloških, biokemijskih, fizioloških i/ili fiziopatoloških mehanizama regulacije glikemije i/ili također ekspresije digestivnih enzima, izlučivanja i regulacije. Za takve primjene imortalizirajuće funkcionalne beta stanice su uveliko pogodne. Doista, ovaj izum dozvoljava generiranje staničnih linija humanih beta stanica.

Ovaj izum također prikazuje metodu produkcije životinjskih stanica pankreasa u različitim stupnjevima razvoja pri čemu rečena metoda sadrži sljedeće korake:

(a) uvođenje učinkovite količine životinjskih stanica embrionalnog pankreasa ne starijih od 10 tjedana razvoja, u bubrežnu kapsulu ne pretile životinje koja ima težak oblik dijabetesa kombiniran s imunodeficijencijom (NOD/Scid) a koja nije čovjek, pri čemu je rečena NOD/scid životinja različite vrste od rečene životinje od koje su dobivene rečene stanice embrionalnog pankreasa; te

(b) ostavljanje životinjskih stanica embrionalnog pankreasa se razviju, da se diferenciraju i da obnove barem jednu funkciju pankreasa, odabranu regulacije glikemije i izlučivanja digestivnih enzima, te

(c) sakupljanje životinjskih stanica pankreasa dobivenih u koraku (b), te

(d) moguće in vitro kulitiviranje stanica dobivenih u koraku (c).

Takve stanice pankreasa dobivene prema metodi iz izuma su korisne za ispitivanje razvitka pankreasa. Takve stanice pankreasa i stanice pankreasa embrija korištene u gornjoj metodi se mogu genetički modificirati. Preferirano su dobivene stanice pankreasa imotralizirane.

Sljedeća cjelina ovog izuma je NOD/scid životinja u koju su unešene stanice embrionalnog pankreasa. Takva NOD/scid životinja sadrži najmanje jednu funkcionalnu stanicu pankreasa iz izuma u bilo kojem stupnju razvoja, koja se izvodi od presađenih stanica embrionalnog pankreasa.

Ovaj izum odnosi se na upotrebu NOD/scid životinje iz izuma za istraživanje i razumijevanje razvitka i funkcioniranja zdravog ili patološkog pankreasa. Takva životinja predstavlja izvrstan model za razumijevanje i ispitivanje razvitka pankreasa, uglavnom razvitka humanog pankreasa. Štoviše, takva životinja bi bila korisna za probiranja sustava koji mogu modulirati razvitak pankreasa ili modulirati regulaciju glikemije, a moduliranjem ili djelovanjem, primjerice, na ekspresiju inzulina ili glukagona ili na ekspresiju bilo kojeg ciljanog gena ili proteina obuhvaćenog u reguliranju glikemije. Takva životinja bi također bila korisna za probiranje spojeva koji mogu modulirati ekspresiju digestivnih enzima. Pod "moduliranjem" se podrazumijeva "povećanje" ili "smanjivanje" ili "poništavanje".

Ako nije drugačije definirano, svi ovdje korišteni tehnički i znanstveni termini imaju isto značenje kao što stručnjak iz područja uobičajeno podrazumijeva.

Dolje prikazane slike i primjeri su dani kao daljnja uputa za stručnjaka koji će izum prakticirati, a nisu prikazani da ograniče izum na bilo koji način.

Kratki opis slika

Slika 1: Razvitak humanog pankreasa u NOD/scid miševima

(A) pankreas nakon 8 tjeana razvitka prije transplantacije. (B-E) pankreasi su presađeni pod bubrežnu kapsulu NOD/scid miševa i analizirani nakon 7 dana (B), 2 mjeseca (C), 6 mjeseci (D), te 9 mjeseci (E).

Slika 2: Rast mase transplantiranih pankreasa

Presaci su uklonjeni pri različitim vremenima nakon transplantacije, fino uklonjeni da se ukloni mast i vagani. Ukupno je analizirano 22 presadaka.

Slika 3: Histološka analiza

Humani pankreasi nakon 8 tjedana razvitka prije transplantacije (A) i jedan mjesec (B) i šest mjeseci (C) nakon transplantacije bojani anti-pan citokeratinoskim antitijelom (pojavljuje se zeleno) ili anti-vimentin antitijelom (pojavljuje se crveno).

Slika 4: Razvitak endokrinog tkiva pankreasa u NOD/scid miševima

Pankreas 8 tjedana razvoja prije transplantacije (A), te 7 dana (B), jedan mjeseca (C), 2 mjeseca (D), 6 mjeseci (E) i 9 mjeseci (F) nakon transplantacije. Imunobojanje inzulina (pojavljuje se zeleno) i glukagona (pojavljuje se crveno). Strelice u (A) predstavljaju 2 stanice koje se boje pozitivno na inzulin i amilazu. U G i H su pokazani predstavnici hibridizacije proinzulinske sonde na izlučivanje humanog pankreasa od 8 tjedana prije presađivanja (G) i nakon 6 mjeseci nakon presađivanja (H).

Slika 5: Rast mase endokrinih stanica u transplanta-cijskom periodu

Apsolutna masa inzulin eksprimirajućih stanica je prikazana u arbitarnim jedinicama. Ukupno je 16 presadaka.

Slika 6: Analiza stanične proliferacije

Dvostruko imunobojanje na BrdU (crveno) i pancitokeratin (zeleno) (A, C) ili BrdU (crveno) i inzulin (zeleno (B, D), na sekciji humanog embrionalnog pankreasa koji je razvijen u scid miševima tijekom 1 mjeseca (A i B) ili tijekom 3 mjeseca (C, D). Miševi su žrtvovani 2 sata nakon BrdU injekcije.

Slika 7: Humane endokrine stanice razvijene u zrelim miševima koje sliče na zrele endokrine stancame.

Dio humanog embrionalnog pankreasa 6 mjeseci nakon transplantacije (A). Inzulin (pojavljuje sezeleno) i Pax 6 (pojavljuje se crveno; (B). Inzulin (pojavljuje se zeleno) i Nkx6.1 (pojavljuje se crveno); (C, D). Inzulin (pojavljuje sezeleno) i Pax 6 (pojavljuje se crveno; (B). Inzulin (pojavljuje se crveno) i PCl (pojavljuje se zeleno); (E. Inzulin (pojavljuje se zeleno) i Pax 6 (pojavljuje se crveno; (B). Inzulin (pojavljuje se zeleno) i citokeratin-19 (pojavljuje se crveno); (F). Citokeratin-19 (pojavljuje se crveno.

Slika 8: Funkcionalni razvitak presatka humanog pankreasa.

(A) Tri mjeseca nakon transplantacije je scid miševima (crvena linija) injektiran aloksan. Miševi kojima nije presađen (plava linija) su također primili aloksan. Dok se glikemija u miševa kojima nije došlo do presađivanja brzo razvila, miševi s presatkom su ostali stabilni. Kada su presaci uklonjen nefraktomijom dana 7 ili dana 43, glikemija se brzo razvila.

(B) Pankreasi miševa prije tretmana aloksanom i na kraju eksperimenta (C) (43 dana nakon aloksana) bojani na inzulin (pojavljuje se crveno) i glukagon (pojavljuje se zeleno), pokazuju da je aloksan razorio glavninu stanice domaćina koje eksprimiraju inzulin (D). Sekcija humanog presatka na kraju eksperimenta (43 dana nakon aloksana) bojana na inzulin (pojavljuje se crveno) i glukagonom (pojavljuje se zeleno), pokazuje da aloksan nema efekt na humane beta stanice koje su se razvile.

Slika 9: Razvitak embrionalnog pankreasa štakora presađenih u scid miševe i traženje uvjeta trandukcije stanica koje eksprimiraju inzulin upotrebom rekombinantnih lentivirusa.

Secirani su E16 pankreasi štakora. U A. su odmah bojani na glukagon (zeleno) i inzulin (crveno). U B. i C. su inficirani lentivirusima koji eksprimiraju GFP pod kontrolom poromotora inzulina presađenim tijekom 7 dana. B. bojanje na inzulin (crveno) i glukagon (zeleno). C. Stanice koje ne eksprimiraju GFP se mogu detektirati pod takvim uvjetima. U D. i E. E16 pankreas je disociran i zatim inficiran lentivirusima koji eksprimiraju GFT pod kontrolom promotora inzulina. D. bojanje na inzulin (crveno) i glukagon (zeleno). E. Stanice koje eksprimiraju GFT se mogu detektirati pod ovim uvjetima.

Slika 10: Ekspresija GFP u stanicama koje eksprimiraju inzulin.

E16 pankreasi su disocirani a zatim inficirani lentivirusima koji eksprimiraju GFP pod kontrolom promotora inzulina presađenog tijekom 7 dana. A. bojanje GFP; B. bojanje na inzulin; C. Paneli A i B su prekriveni. D. bojanje na glukagon (crveno i GFP (zeleno). E. Bojanje na citokeratin (crveno i GFP (zeleno).

Slika 11: Dugotrajna ekspresija GFP u stanicama koje eksprimiraju inzulin.

E16 pankreasi su disocirani a zatim inficirani lentivirusima koji eksprimiraju GFP pod kontrolom poromotora inzulina presađenog tijekom 1 mjeseca. A, D. bojanje na GFP; B, E. bojanje na inzulin; C, F. Paneli A+B i D+E su prekriveni.

Slika 12: Stanice GFR+/INS+ razvijene od inficiranih progenitorskih stanica.

A. Sadržaj inzulina u E16 pankreasima prije (0 dan) ili 7 dana nakon nakon presađivanja (7 dan). B. Trudnom štakoru je kod E16 injektiran BrdU. Na lijevom panelu je tkivo bojano na BtdU (crveno), inzulin (plavo) i glukagon (zeleno). Valja zapaziti da endokrine stanice ne proliferiraju. C. E13 pankreasi su disocirani a zatim inficirani lentivirusima koji eksprimiraju GFP pod kontrolom promotora inzulina presađenog tijekom 7 dana. Lijevo. bojanje na GFP; Sredina. bojanje na inzulin; Desno lijevi i desni paneli su prekriveni.

Primjeri

1 - DIZAJN ISTRAŽIVANJA I METODE

1.1 Humano tkivo

Humani pankreasi su odstranjeni od fragmenata embrionalnog tkiva dobivenih odmah nakon dobrovoljnog pobačaja provedenog nakon 6 i 9 tjedana razvoja (WD) u skladu s francuskom legislativom i uputama naše institucije. Vrijeme tople ishemije je bilo manje od 30 minuta. Gestatacijska starost je određena prema nekoliko kriterija razvoja: trajanje amenorahee, duljina mjerena ultrazvukom, morfologija ruku i nogu. Pankreasi su odstranjeni i smješteni u parafin ili presađeni u ne pretile miševe koji imaju težak oblik dijabetesa kombiniran s imunodeficijencijom (NOD/Scid), kao što je dolje opisano.

1.2 Životinje i transplantacija u NOD/scid miševe

NOD/scid miševi su uzgojeni u izolatorima snabjevenim sa sterilnim filterima, i kontroliranom temperaturom zraka. Kavezi, smještaj i voda za piće su dezinficirani u autoklavu. Hrana je sterilizirana X-zračenjem. Sva rukovanja su provedena u digestoru pod laminarnim protokom. Pankreasi embrija (6-9 tjedana razvitka (WD) su implantirani upotrebom mikroskopa za seciranje pod lijevu bubrežnu kapsulu od 6-8 tjedana starih NOD/scid miševa koji su anestetizirani hipnomidatom (Janssen-Cilag). U različitim vremenima nakon presađivanja (7 dana-9 mjeseci) su miševi žrtvovani i presaci su uklonjeni, vagani, smješteni u 3.7%formalin i položeni u parafin. Za analizu proliferacije stanica miševima je injektiran Brom-deoksiuridin (BruD) (50 mg/kg) 2 sata prije žrtvovanja.

1.3 Imunohistometrija

Sekcije od četiri μm su rezane na želatiziranim staklenim pločama. Za imunobojanje je sekcijama uklonjen parafin u toluenu, rehidrirane su i podvrgnute mikrovalovima u citratnom puferu 0.01 M, pH 6 i permeabilizirane 20 minuta u Tris-puferiranoj fiziološkoj otopini (TBS) koja sadrži 0.1% Tritona. Nespecifična mjesta su blokirana 30 minuta u TBS koji sadrži 3% BSA i 0.1% Tween 20 i sekcije su inkubirane preko noći pri 4 °C s primarnim antitijelima. Sekcije su zatim prane i inkubirane 1h pri sobnoj temperaturi s odgovarajućim sekundarnim antitijelom, označenim s 2 različita fluorokroma. Primarna antitijela su: mišji antihumani inzulin (Sigma/Aldrich 1/1000); anti-svinjski inzulin zamorca (Dako; 1/2000); anti-humani glukagon miša (Sigma/Aldrich 1/2000); anti-humani zečji pan-citokeratin (Dako, 1/500); mišji anti-humani citokeratin 19 (Dako, 1/50); mišju anti-svinjski vimentin (Dako, 1.30); zečja antiprokonvertaza 1/3 (poklon od Dr. Steiner, 1/200); zečji anti-Pax6 (poklon od Dr. S. Saule); zečji anti-štakorski Nkx6.1 (poklon od Dr. Serup); mišji anti BrdU (Amersham). Fluorescentna sekundarna antitijela su bila: fluorescein-anti-zamorca svinjak antitijela (Dako, 1:500); fluorescein-anti-zečja antitijela (Imunotech 1/200); fluorescein-anti-mišja antitijela (Imunotech 1/200); Texas-crvena-antimišja antitijela (Jackson 1/200); Texas-crvena-antizečja antitijela (Jackson 1/200).

1.4 Kvantiziranje površine i statistička analiza

Sve slike su numerirane upotrebom Hamamatsu C5810 tri-CCD kamere. Slike su iste veličine dobivene su uvećavanjem i analizirane s IPLab programom (verzija 3.2.4, Scananalyrics Inc.). Za svako transplantirano tkivo su sekcije uzete u istim intervalima preko presatka i bojane na inzulin. Tri od četiri sekcije u 3-5 perspektive po sekciji su analizirane. Izračunat je porast mase tijekom transplantacijskog perioda kao produkt pozitivno obojene površine za inzulin i odgovarajuće mase presatka.

1.5 In situ hibridizacija

Za in situ hibridizaciu je sekcijama uklojnen parafin, rehidrirane su i permeabilizirane u PBS koji sadrži 1% Triton X-100. Prehibridizacije iz izvedena pri 70 °C u hibridizacijskom puferu (50% formamid, 5 X SSC, 5x Denhatdsova otopina, 250 μg/mL RNA kvasca, 500 μg/mL DNA sperme haringe). RNA sonde su obilježene DIG-UTP in vitro transkripicijom upotrebom DIG-RNA obilježavajućeg paketa (Boehringer Mannheim). Hibridizacija je započeta dodatkom svježe hibridiziranog pufera koji sadrži Ipg/mL sonde i nastavljena je preko noći pri 70 °C. Zatim su izresci prani smanjujućom koncentracijom SSC. Oslobađanje je procesuirano imunohistokemijom. Nespecifična mjesta su blokirana 2% reagensom za blokiranje (Boehringer Mannheim) u Tris 25 mM pH 7.5, NaCl 140 mM, KCl 2.7 mM Tween 20 0.1% kroz 30 minuta pri sobnoj temperaturi. Izresci su zatim inkubirani preko noći pri 4 °C s alkalnim polifosfatom povezanim poliklonalnim anti-DIG antitijelom ovce (razrijeđeno 1:1000, Boehringer Mannheim). Reakcijski produkt je vizualiziran enzimom kataliziranom obojenom reakcijom upotrebom nitro plavog tetrazolija i 5-brom-4-klor-3-indolil-fosfatnog medija (Boehringer Mannheim). Sekcije su inkubirane do obojenog reakcijskog produkta koji nastaje na mjestima hibridizacije. Iscjeci su prani u vodi, smješteni i vizualizirani u Leitz DMRD mikroskopu (Leica). Ovdje korištena sonda odgovara humanom proinzulinu.

1.6 Test indukcije dijabetesa

Da se odredi kapacitet presatka u reguliranju glikemije kod miša, NOD/scid miševima s presatkom i bez je injektiran intravenozno (i.v.) aloksan (Sigma-Aldrich 90 mg/kg tjelesne težine), za koji je poznato da razara beta stanice glodavaca a ne ljudi (Eizirik et al. 1994). Razina glukoze je mjerena u krvi dobivene iz vene repa svaki dan tijekom jednog tjedna upotrebom prenosnog mjerača glukoze (GlucoMen, A. Menarini dijagnostics, Firenca, Italija). Da se potvrdi doprinos presatka normalizaciji razine glukoze u krvi kod domaćina presaci su uklonjeni unilateralnom nefrektomijom u različitim vremenima (7 dana do 42 dana) nakon injekcije aloksana i mjerena je razina glukoze u krvi.

1.7 Životinje i uklanjanje

Kupljeni su skotna štakorice od Janvier breeding center (CERJ, La Genet, Francuska). Jutro kad je otkriven vaginalni sadržaj je označen embrionalni dan 0.5 (E 0.5). Trusni štakori su žrtvovani s CO2 i embriji su sakupljeni i pankreas je uklonjen. Za analizu proliferacije stanica skotnim štakoricama je injektiran BrdU (100 mg/kg) 30 minuta prije žrtvovanja.

1.8 Konstrukcija i priprava HIV-RIP-GFP vektora: konstrukti DNA i produkcija vektora

pTRIP GFP bez promotora su prethodno opisani (Zennou et al., 2000). Fragment 408 bp promotora štakorskog inzuina (RIP408) je dobiven od pBS-RIP-beta globin plazmida (bubreg nabavljen od P. Herrera, (Sanvito et al. 1995)) pomoću PCR upotrebom proširenog sustava (Roche) koji slijedi klice:

MluI RIP send = 5' cgacgcgtGGACACAGCTATCAGTGGGA 3' (SEQ ID No 1)

BamHI RIP antisend = 5' cgggatccTAGGGCTGGGGGTTACT 3' (SEQ ID No 2)

Nastali PCR produkt je podloniran u pGEMT-laki vektor (Promega). MluI-BamHI fragment za zatim insertiran u MluI-BamHI lineariziran pTRIP GFR vektor bez promotora. Da se isključe točke mutacije inducirane s PCR, insertirani RIP408 je kompletno sekvenciran. Vektori za upotrebu su prirpavljeni tranzitornom kotransfekcijom 293T stanica s p8.7 plazmidom (ΔVprΔVifΔVpuΔNef) (Yufferey et al., 1997), pHCMV-G koji kodira VSV kuvertu i pTRIP RIP408-GFP vektor (Yee et al., 1994) kao što je prethodno opisano (Zennou et al., 2000). Supernatantima je dodana DNAza I prije ultracentrifugiranja a zatim je ponovo suspendirano u PBS i zamrznuto (-80 °C) do upotrebe.

1.9 Konstruktija i priprava HIV-RIP-GFP vektora: konstrukti DNA i produkcija vektora

Korišteni su rekombinantni lentivirusi za inficiranje netaknutog ili odstranjenog pankreasa. Za disocijaciju je pankreas inkubiran sa 0.16 mg Dispase I (Roche Bohringer) tijekom 5 do 30 minuta ovisno o veličini tkiva i mehaničkoj disocijaciji. Za infekciju je netaknuto ili disocirano tkivo inkubirano jedan sat pri 37 °C s 200 μL RPMI medijem 1640 koji sadrži penicilin (100 jedinica/mL), steptomicin (100 mg/mL), L-glutamin ( 2 mM) i 10 μL virsunih čestica (12 μg/mL od p24). Da se poveća brzina virsne infekcije, DEAE-dekstran je dodan pri koncetraciji od 10 μg/mL.

1.10 Transplantacija

Scid miševi su čuvani u izolatorima snabdjeveni sterino filtriranim zrakom kontrolirane temperature. Kavezi, ležište i voda za piće su sterilizirani u autoklavu. Hrana je sterilizirana X-zračenjem. Sva rukovanja su povedena u digestoru pod laminarnim protokom. Disocirani embrionalni pankreasi su implantirani upotrebom mikroskopa za seciranje pod lijevu bubrežnu kapsulu kao što je prethodno opisano (Castaing et al., 2001) sa sljedećim modifikacijama. Lijevi bubreg je izvađen i provedeni su mali transverzalni rezovi kroz kapsulu na ventralnoj površini bubrega, blizu unutarnjeg pola. Stvoren je džep pod kapsulom i djelomično je gurnut mali silikonski prsten da se dobije prostor za transplantaciju tkiva (Thomas et al., 1997). Izdvojene stanice su zatim uvedene u cilindar upotrebom 50 μL Hamiltonove injekcije s iglom od 22 gauge i prsten je potpuno smješten u džep tako da kapsula na vrhu bubrežnog parenhima na dnu tvori zatvoreni prostor koji sadrži stanice pankreasa. Ovom metodom su sve stanice na jednom mjestu tako da se razvitak može lako istraživati. U različitim vremenima nakon transplantacije su miševi žrtvovani s CO2 i bubreg je uklonjen i smješten u parafin.

1.11 Imunohistokemija

Sekcije od četiri μm su sakupljene i analizirane imunohistokemijom kao što je opisano (Cras-Meneur et al. 2001; Miralles et al., 1998). Antiserumi su korišteni pri sljedećim razrjeđenjima: mišji anti-humani inzulin (Sigma/Aldrich), 1/2000; mišji anti-humani glukagon (Sigma), 1/2000; mišji anti-humani pancitokeratin (Sigma) 1/2000; mišji anti-BrdU (Amersham) 1/4; zečji anti-humani pancitokeratin (DiaSorin), 1/2000; zečji anti-svinjski inzulin (DiaSorin), 1/2000; te zečji anti-GFP (Clontech), 1/200. Sekundarna fluorescentna antitijela od Kackson Immunoresearch Laboratories su FITC anti-zečja antitijela, 1/200 i Texas crvena anti-mišja antitijela 1/200). Za dvostruko obilježenu imunofluorescenciju antitijela uzgajana u različitim vrstama su primijenjena na sekciju i identificirana upotrebom anti-vrsta antritjela obilježenih različitim fluorkromima. Jednostruko obilježene sekcije inkubirane s neodgovarajućim sekundarnim antitijelima ne pokazuju imunobojanje, potvrđujući specifičnost sekundarnih antiseruma. Fotografije sekcija su snimljene upotrebom fluorescentnog mikroskopa (Leica, Leitz DMRB). Oni su digitalizirani upotrebom Hamamatzsu (Midlesex, NJ) C5810 colled 3CCD kamere

1.12 Sadržaj inzulina

Za detekciju sadržaja inzulina homogenizirane su klice embrionalnog pankreasa ili presađenog pankreasa. Inzulin je ekstrahiran preko noći u 10 mL hladnog zakiseljenog etanola (1.5% HCl, 75% EtOH) pri 20 °C. Ekstrakti su čuvani pri -20 °C do testiranja na inzulin.

Imunoreaktivni inzulin je mjeren radioimunotestom praćenja monojodiranog 125I-obilježenog svinjskog inzulina (Sorin Biomedica, Sallugia, Italija), anti-inzulinska antitijela od zamorca su dobivena od Dr. Van Schravendijk (Brusseles, Belgija) i pročišćeni štakorski inzulin (Novo Nordisk, Boulogne, Francuska) kao standardom. Aktivni ugljen je korišten za odvajanje slobodnog od vezanog hormona. Osjetljivost testa je bila 0.25 ng/mL.

2 - REZULTATI

2.1 Humani embrionalni presaci u NOD scid miševe

U ovom iztraživanju su 48 tkiva pankreasa (6-9 tjedana) presađena u NOD/scid miševe. Miševi su žrvovani u različitm vremenima nakon transplantacije (7 dana - 9 mjeseci) i presaci su uklonjeni. Izolirano je trideset devet presadaka. Među 9 neizoliranih presadaka jedan miš s presatkom je uginuo ali je presadak sačuvan. U 8 slučajeva je miš uginuo zbog nepoznatih razloga i rast presadaka nije analiziran. Slijedilo je procjenjivanje volumena i mase presađenog tkiva. Kao što je prikazano na Slici 1, humano tkivo embrija se razvijalo jako kada je presađeno pod bubrežnu kapsulu scid miševa. Dok tijekom 7-9 tjedana gestacije prije usađivanja volumen embrionalnog pankreasa nije bio veći od 4 mm3 (Sl. 1A), porastao je vremenom u mišu domaćinu i dostigao volumen od nekoliko cm3 nakon 6 mjeseci (Sl. 1B-E). Razvitak mase presađenog tkiva je također praćen. Dok je nakon 1 tjedna masa presatka bila manja od 10 mg, u istom rasponu kao nepresađeno tkivo, rastao je brzo vremenom i dostigao 100 mg nakon 8-12 tjedana te 1000 mg nakon 33-38 tjedana (Sl. 2). Imunohidstokemija upotrebom antitijela anti-citokeratina i anti-vementina je provedena da se slijedi razvitak tijekom perioda presađivanja epitelnih i mezenhimalnih stanica prisutnih u humanom embrionalnom pankreasu prije transplantacije. Kao što je prikazano na Sl. 3A, prije presađivanja se pankreas od 8 tjedana sastojao od epitalnih stanica koje tvore kanal i mezenhimalne stanice. Jedan mjesec i 6 mjeseci nakon transplantacije, tkivo se također sastojalo od epitelnih stanica koje se boje pozitivno na ciokeratin i mezenkinalnih stanica koje se boje na vimentim, pokazujući da se oba tipa stanica razvijaju tijekom presađivanja (Sl. 3B i C).

2.2 Razvitak endokrinog tkiva

Prije transplantacije je detektirano samo nekoliko endokrinih stanica imunohistokemijom koje su se bojale pozitivno na glukagon ili na inzulin i glukagon. Takve stanice su dispergirane u tkivu pankreasa i nisu povezane u Langerhansove otoke (Sl. 4A). Endokrino tkivo se nakon presađivanja počelo razvijati i broj endokrinih stanica je povećan vremenom (Sl. 4B-F). U panelima G i H su pokazani predstavnici hibridizacija na proinzulin prije i nakon transplantacije kroz 6 mjeseci u pankreas od 8 tjedana. Veliko povećanje broja stanica koje eksprimiraju proinzulin mRNA se može jasno vizualizirati. Razvitak na inzulin-pozitivnih stanica je mjeren nakon inumohistokemije. Kao što je pokazano na Sl. 5. apsolutna površina zauzeta stanicama koje eksprimiraju inzulin je bila 300 puta veća nakon 8-12 tjedana u mišu i 500 puta nakon 21-28 tjedana.

2.3 Humane nediferencirane epitelne stanice koje nisu endokrine stanice, proliferirane tijekom perioda presađivanja.

Da se definira je li povećanje apsolutnog broja endokrinih stanica potječe od diferencijacije prekursorksih stanica ili od proliferacije nekoliko endokrinih stanica koje su bile prisutne prije presađivanja, miševima kojima je izvršeno presađivanje je injektiran BrdU 2 sata prije žrtvovanja i provedena je imunohistološka analiza. Kao što je pokazano na Sl. 6, nakon 1 i 3 mjeseca razvitka u mišu stanice koje su pozitivne na citokeratin i BrdU su detektirane često, dok su stanice pozitivne na inzulin i BrdU vrlo rijetko nađene. Ti rezultati vrlo jako ukazuju da povećanje mase endokrinih stanica potječe od diferencijacije prekursorskih stanica a ne od proliferacije rijetkih prethodno prisutnih endokrinih stanica.

2.4 Humane endokrine stanice razvijene u miševima sliče na zrele endokrine stanice.

Da se definira da li humane endokrine stanice koje se razvijaju u NOD/scid miševima eksprimiraju markere poznate da su prisutni u humanim beta stanicama razvijenim in vivo, testirana je serija antitijela imunohistokemijom. Kao što je pokazano na Sl. 7, beta stanice razvijene u NOD/scid miševima eksprimiraju specifične transkripcijske faktore kao što je Nkx6.1 i Pax6 (paneli A, B) kao i PC1/3, enzim neophodan za procesuiranje proinzulina (paneli C, D). ©toviše, endokrine stanice u presacima su često povezane u Langerhansove otoke s jezgrom stanica koje eksprimiraju inzulin okruženih stanicama koje eksprimiraju glukagon (Sl. 4, paneli E, F). Konačno, kao što je prije opisano (Bouwens et al., 1997), prve endokrine stanice nađene u humanom embrionalnom pankreasu boje se pozitivno na citokeratin, humane stanice koje eksprimiraju inzulin koje su razvijene u NOD/scid miševima ne eksprimiraju citokeratin 19 (Sl. 7, paneli E, F).

2.5 Funkcionalni razvitak humanih presadaka pankreasa.

Da se definira da li su humane beta stanice koje se razvijaju u presacima funkcionalne, 15 NOD/scid miševima je presađen humani pankreas embrija. Tri mjeseca nakon toga NOD/scid miševima kojima je ili nije provedeno presađivanje je injektiran aloksan, lijek poznat da je toksičan za beta stanice glodavaca a ne beta stanice ljudi (Eizirik et al., 1994). Prije injekcije aloksana razina glukoze u krvi nije bila statistički različita u transplantiranim i netransplantiranim miševima. Nakon tretmana aloksanom, glikemija je kod svih miševa kojima nije provedeno presađivanje povećana 6g/L. S druge strane, glikemija je ostala stabilna kod 12 od 15 miševa kojima je provedeno presađivanje. Da se pokaže da regulacija glikemije kod miševa kojima je provedeno presađivanje, a dobili su injekciju aloksana, doista potječe od razvitka presatka, provedena je unilateralna nefrektomija da se ukloni presadak u 6 miševa i praćene su razine glukoze u krvi. Kao što je pokazano na Sl. 8A, nakon uklanjanja presatka unilateralnom nefraktomijom 7 ili 42 dana nakon injekcija aloksana miš postaje hiperglikemičan. Pankreasi laboratorijskih glodavaca i presaci su također analizirani na prisutnosti stanica koje eksprimiraju inzulin i glukagon prije injekcije aloksana ili na kraju eksperimenata kada su životijne žrtvovane. Kao što je prikazano na Sl. 8 detektirano je vrlo malo stanica koje eksprimiraju inzulin u pankreasu laboratorisjkog glodavca u NOD/scid miševima kojima je provedeno presađivanje, a injektiran im je aloksan, u usporedbi s NOD/scid miševima koji nisu tretirani aloksanom. S druge strane, velika količina stanica koje produciraju inzulin prisutna je u humanim presacima nakon tretmana aloksanom.

Izumitelji pokazuju da se rani humani embrionalni pankreas može razviti kada je presađen pod bubrežnu kapsulu NOD/scid miševa. Veličina i težina presadaka povećava se značajno a endokrine stanice koje se diferenciraju su organizirane u Langerhansove otoke i pokazuju brojne kriterije zrelosti. Konačno, humana endokrina tkiva pankreasa koja su se razvila mogu povratiti dijabetes u miševima, ukazujući na njegovu fundamentalnost.

U ovom ispitivanju izumitelji su koristili NOD/scid miševe kao primatelje transplantacije. NOD/scid miševi su generirani ukrštanjem scid mutacije od C.B-17-scid/sicd miševa na NOD osnovu. Tim životinjama nedostaju T- i B-limfociti (Schultz et al., 1995) i ne mogu generirati humoralnu ili stanicom održavanu imunost. Kako scid miševi ne odbijaju ksenograft, prethodno su korišteni kao primatelji humanih ili fetalnih hematolimfoidnog tkiva i stanica (Roncarlol et al., 1995). Ne hematopoietilna humana tkiva kao što je ovarijski korteks (Weisman et al., 1999) tiroidea (Martin et al., 1993), koža (Levy et al., 1998) i dišni putevi (Delplahque et al., 2000) su također uspješno transplantirani u taj model. Međutim, mogućnost tih stanica da razviju funkcionalna svojstva i da zamijene fiziološku funkciju je samo rijetko pokazana. Jedan primjer fiziološke funkcije zamjene je prikaz tkiva ovojnice nadbubrežne žljezde koje može nastati transplantacijom goveđih stanica ovojnice nadbubrežne žljezde i može zamjeniti esencijalnu funkciju mišje nadbubrežne žljezde (Thomas et al., 1997). Međutim, u ovom radu je transplantirano tkivo nije humanog nego goveđeg porijekla. Štoviše, tkivo je prošireno iz primarne kulture goveđih stanica ovojnice nadbubrežne žljezde. Donorske stanice su stoga već potpuno diferencirane u vrijeme presađivanja.

U ovom izumu su izumitelji pokazali da se nezreli humani embrionalni pankreas može razviti i primiti funkcionalna svojstva scid miševa.

Presađivanjem nezrelih rudimenata koji sadrže nediferencirane epitelne stanice i mesenhimalne tkivo i skoro ništa stanica koje eksprimiraju inzulin, izumitelji su pokazali da je apsolutna masa stanica koje eksprimiraju inzulin povećana skoro 5000 puta nakon 6 mjeseci u mišu. Činjenica da je bilo prisutno vrlo malo endokrinih stanica prije transplantacije, dok je velika količina endokrinih stanica nađena nekoliko tjedana kasnije, jasno pokazuje da se kasnije formiranje endikrinih stanica dogodilo u ovom modelu.

Opažen porast humanih beta stanica teoretski može potjecati od proliferacije rijetkih prethodno postojećih stanica koje eksprimiraju inzulin ili diferencijacijom stanica prekursora. Smatralo se da tijekom prenatalnog života porast mase beta stanica uglavnom potječe od diferencijacije prekursorskih stanica a ne od proliferacije prethodno postojećih beta stanica. To je potpuno jasno u glodavcima s kojim je proveden veliki broj eksperimenata koji pokazuju da se povećanje mase endokrinih stanica opaženo tijekom fetalnog života ne može objasniti proliferacijom prethodno postojećih endokrinih stanica (Swenne, 1992)). Iako postoji manje podataka, izgleda da je to slučaj i s humanim sustavom u kojem tijekom embrionalnog/fetalnog života stanice koje eksprimiraju inzulin boje rijetke pozitive na Ki67 i stoga rijetko ili ne cikliziraju (Potak et al.), 2000; Bouwens et al., 1997). Podaci izumitelja pokazuju da kada je BruD injektiran u kimerne miševe, u presatku je prisutan veliki broj na citokeratin pozitivnih stanica koje boje pozitivno na BrdU, dok nema ili su vrlo rijetke na inzulin pozitivne stanice. Stoga se može smatrati da su u presacima novonastale beta stanice izvedene od prekursorskih stanica prisutnih u epitelu koji proliferira i diferencira se tijekom presađivanja a ne od proliferacije nekoliko endokrinih stanica prisutnih u rudimentima, a mehanizmom koji ide kao normalni razvoj.

Različiti argumenti ukazuju da su humane beta stanice koje se razvijaju in vivo u NOD/scid miševima zrele. Prvo, te stanice koje eksprimiraju inzulin ne eksprimiraju istovremeno glukagon i stoga su različite od prvih stanica koje eksprimiraju inzulin detektiranih u humanom pankreasu u ranom stupnju razvitka (Polak et al., 2000; Larsson i Hougaard, 1994; De Krijger et al., 1992). Zatim, pokazano je da su stanice koje eksprimiraju inzulin prisutne u pankreasu prije 16 tjedana razvoja eksprimiraju citokeratin 19, dok stanice koje eksprimiraju inzulin nađene u kasnijem stupnju razvoja se boje negativno na taj marker (Bouwens et al., 1997). Podaci izumitelja pokazuju da se humane beta stanica razvijene u NOD/scid miševima boje negativno na citokeratin 19 i stoga sliče na odrasle zrele beta stanice. Nadalje, humane beta stanice koje su se razvile u NOD/scid miševima eksprimiraju prohormon konvertazu PC 1/RC3, enzim koji je neophodan za procesuiranje proinzulina u inzulin (Kaufman et al., 1997; Furuta et al., 1998). Konačno, podaci izumitelja pokazuju da je velikoj količini humanih endokrinih stanica koje su se razvile u NOD/scid miševima nedostaju egzogene beta stanice i stoga su funkcionalne. Te humane endokrine stanice ostaju funkcionalne i mogu regulirati glikemiju kod miševa najmanje 43 dana, što je najdulji testirani period prije uklanjanje presatka.

Izumitelji pokazuju da se novodiferencirane humane beta stanice koje mogu regulirati glikemiju domaćina a kojima nedostaju njegove vlastite beta stanice, mogu se producirati od humanog ranog embrionalnog pankreasa i stoga predstavljaju alternativni izvor tkiva korisnog za generiranje funkcionalnih humanih beta stanica za transplantaciju. Štovište, model miša kojem je presađen humani embrionalni pankreas može sada biti korišten za razvitak humanog pankreasa, tip ispitivanja koji je teško provesti zbog nedostatka humanog pankreasa embrija i odgovarajućeg eksperimantalnog sustava.

2.6 Razvitak štakorskih embrionalnih pankreasa presađenih u Scid miševe i ispitivanje uvjeta za transdukciju stanica koje eksprimiraju inzulin upotrebom rekombinantnih lentivirusa.

Izumitelji su prvo istraživali kapacitet tkiva pankreasa da raste i razvija se kada je presađen u scid miševe. E16,5 pankreasi su uklonjeni i presađeni pod bubrežnu kapsulu scid miševa. Sedam dana nakon presađivanja miševi su žrtvovani i presaci su uklonjeni. Kao što je prethodno pokazano (Rall et al., 1973) kod E16 endokrine stanice prije presađivanja jesu uglavnom stanice koje eksprimiraju glukagon, a u tom stupnju su vrlo rijetke stanice koje eksprimiraju inzulin. Takve stanice koje eksprimiraju inzulin su nađene dispergirane (Sl. 9A). S druge strane, kada je E16 pankreas presađen nakon 7 dana su se razvile stanice koje eksprimiraju inzulin i sada su nađene da tvore Langerhansove otoke (Sl. 9B). Izumitelji su zatim koristili na HIV-1 zasnovani vektor koji sadrži gen za zeleni fluorescentni protein (GFP). GFP je pokretan promotorom štakorskog iznulina (RIP) da dovede do restrikcije ekspresije GFP u beta stanicama. E16 pankreasi su inficirani i presađeni tijekom 7 dana. Kao što je prikazano na Sl. 9C, pri takvim uvjetima su nađene stanice koje ne eksprimiraju GFP. Izumitelji su zatim ponovili eksperimente, ali su disocirali tkivo prije infekcije i presađivanja. Kao što je pokazano na Sl. 9D, pod takvim uvjetima se endokrino tkivo odgovarajuće razvijalo. Štoviše, veliki broj stanica eksprimiraju GFP kada je tkivo disocirano pomoću Dispaze prije infekcije (Sl. 9E). GFP nikada nije detektiran u neinficiranim tkivima (podaci nisu pokazani).

2.7 Dugotrajna ekspresija GFP i stanicama koje eksprimiraju inzulin.

Sljedeći korak je bio definirati tip stanice koja eksprimira GFP. Dvostruka imunohistokemija je provedena upotrebom anti-inzulina, -glukagina i -citokeratina, a da se odredi jesu li stanice koje eksprimiraju GFP beta stanice, alfa stanice ili cjevaste stanice. Kao što je pokazano na Sl. 10. GFP je jasno detektiran u stanicama koje eksprimiraju inzulin. S druge strane, GFP nikada nije detektiran u stanicama koje eksprimiraju glukagon. Konačno, kao što je pokazano na Sl. 11, zadržana ekspresija GFP tijekom više od jednog mjeseca (najdulje analizirano vrijeme) se može postići kada je GFP pokrenut promotorom štakorskog inzulina.

2.8 Beta stanice koje eksrimiraju GFP izvedene od inficiranih progenitora.

Dvije grupe argumenata ukazuju da su beta stanice koje eksprimiraju GFP dobivene od progenitora koji je prvo inficiran s RIP-GFP a zatim diferenciran u beta stanice, a ne infekcijom nekoliko beta stanica prisutnih u E16 koje će zatim proliferirati. Prvo, u modelu razvitka E16 pankreasa presađenog od bubrežnu kapsulu scid miševa, dolazi do diferencijacje beta stanica. Doista, kao što je pokazano na Sl 12A, tijekom 1 tjedna presađivanja, sadržaj inzulina po pankreasu mjeren radio-imuno testom je povećan više od 250 puta. Kao što je pokazano na Sl. 12B, dok je u tom stupnju, prema očekivanju, proliferacije tkiva pankreasa visoka, stanice koje eksprimiraju inzulin ne proliferiraju. Da se dalje pokaže da su stanice inzulin/GFP izvedene od inficiranih stanica progenitora a ne od prethodno prisutnih zrelih beta stanica, infekcija je ponovljena upotrebom disociranog pankreasa pri E13. Kao što je prethodno pokazano, u ovom stupnju je prisutno vrlo malo stanica koje eksprimiraju inzulin koje su potpuno nezrele (Jackerott et al., 1996; Miralles et al., 1998; Pictet i Rutter, 1972). Sada je pokazano da takve nezrele stanice koje eksprimiraju inzulin neće povećavati kasnije zrele beta stanice (Jansen et al., 2000). Kao što je pokazano na Sl. 12C, kada su disocirani E13 pankreasi inficirani s RIP-GFP te transplantirani pod bubrežnu kapsulu scid miševa, beta stanice koje eksprimiraju GFP mogu biti detektirane nakon jednog tjedna, što dalje pokazuje da inzulin/GFP dvostruko pozitivne stanice dobivene od endokrinog progenitora koji je ingiciran kod E13.

Literatura

Becker et al. (1994) J Biol Chem 269: 21234-2123

Bonner-Weir et al. (2000). Proc Natl Acad Sci USA 97: 7999-8004

Buchet et al. (2002) Mol Cell Neurosci 19: 389-401

Bouwens et al. (1997) Diabetologia 40: 398-404

Case et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96: 2988-2993

Castaing et al. (2001) Diabetologia 44: 2066-2076

Cras-Meneur et al. (2001) Diabetes 50: 1571-1579

Csete et al. (1995) Transplantation 59: 263-268

De Krijger et al. (1992) Dev Biol 153: 368-375

De la Tour et al. (2001) Mol Endocrinol 15: 476-483

Delplanque et al. (2000) J Cell Sci 113: 767-178

Edlund (1998) Diabetes 47: 1811-1823

Eizirik at al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 9253-9256

Englund et al. (2000) Neuroreport 11: 3973-3977

Evans et al. (1999) Hum Gene Ther 10: 1479-1489

Flax et al. (1998) Biotechnol 16: 1033-1039

Flotte et al. (2001) Diabetes 50: 515-520

Fukayama et al. (1986) Differentiation 31: 127-133

Gallichan et al. (1998) Hum Gene Ther 9: 2717-2726

Goldrath et al. (1995) Transplantation 59: 1497-1500

Grapin-Botton, Melton (2000) Trends Genet 16: 124-130

Halban et al. (2001) Diabetes 50: 2181-2191

Hayek, Beattie (1997) J Clin Endocrinol Metab 82: 2471-2475

Jackerott et al. (1996) J Histochem Cytochem 44: 8O9-817

Jensen et al. (2000) Diabetes 49:163-176

Ju et al. (1998) Diabetolggia 41: 736-739

Kapturczak et al. (2002) Mol Ther 5: 154-160

Kaufmann et al. (1997) Diabetes 46: 978-982

Kim, Hebrok (2001) Genes Dev 15: 111-127

Larsson, Hougaard (1994) Endocrine 2: 759-765

Leibowitz et al. (1999) Diabetes 48:745-753

Levine etal. (1995) Transplantation proceedings 27: 3410

Levy et al. (1998) Gene Ther 5: 913-922

Martin et al. (1993) J Clin Endocrinol Metab 77: 305-310

May et al. (2000) Nature 406: 82-86

Miettinen, Heikinheimo (1992) Development 114: 833-840

Miralles et al. (1998) Development 125: 1017-1024

Miyoshi et al. (1999) Science 283: 682-686

Otonkoski (1999) Transplantation 68: 1674-1683

Pawliuk et al. (2001) Science 294: 2368-2371

Pictet et al. (1972) Development of the embryonic pancreas

Polak et al. (2000) Diabetes 49: 225-232

Povlsen et al. (1974) Nature 248: 247-249

Roncarolo et al. (1995) Georgetown TX: Landes

Rall. et al. (1973) Proc Natl Acad. Sci USA 70: 3478-3482

Salmon et al. (2000) Mol Ther 2: 404-414

Salton et al. (1991) Mol Cell Biol 11: 2335-2349

Sandler et al. (1985) Diabetes 34: 1113-1119

Sanvito et al. (1995) Biochem Biophys Res Commun 217: 1279-1286

Shapiro et al. (2000) N Engl J Med 343: 230-238

St-Onge et al. (1999) Curr Opin Genet Dev 9: 295-300

Shapiro et al. (2000) N Engl J Med 343: 230-238

Sharfmann (2000) Diabetologia 43: 1083-1092

Shultz et al. (1995) J. Immunol 154: 180-191

Stefan et al. (1983) Diabetes 32: 293-301

Swenne (1992) Diabetologia 35: 193-201

Thomas et al. (1997) Nat Med 3: 978-983

Tuch et al. (1984) Diabetes 33: 1180-1187

Tuch et al. (1986) Diabetes 35: 464-469

Uchida et al. (1998) Proc Natl Acad USA 95: 11939-11944

Verma et al. (1997) Nature 389: 239-242

Weir, Bonner (1997) Diabetes 46: 1247-1256

Weissman et al. (1999) Biol Reprod 60: 1462-1467

Wells, Melton (1999) Annu Rev Cell Dev Biol 15: 393-410

Yee et al. (1999) Cell Transplant 8: 673-689

Zennou et a1. (2000) Cell 101: 173-185

Zufferey et al. (1997) Nat Biotechnol 15:871-875

Claims (33)

1. Metoda regeneracije funkcije pankreasa kod pojedinca, naznačeno time da metoda sadrži: (a) uvođenje učinkovite količine životinjskih stanica pankreasa ambrija ne starijih od 10 tjedana razvoja, u bubrežnu kapsulu ne pretile životinje koja nije čovjek, a koja ima težak oblik dijabetesa kombiniran s imunodeficijencijom (NOD/Scid), pri čemu je rečena NOD/scid životinja različite vrste od rečene životinje od koje su dobivene rečene stanice embrionalnog pankreasa; te (b) ostavljanje životinjskih stanica embrionalnog pankreasa se razviju, da se diferenciraju i da obnove barem jednu funkciju pankreasa, te (c) transplantaciju učinkovite količine životinjskih funkcionalnih stanica pankreasa dobivenih u koraku (b) u rečenog pojedinca.

2. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da pojedinac jeste sisavac.

3. Metoda iz patentnog zahtjeva 2, naznačeno time da sisavac jeste čovjek.

4. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da životinjske embrionalne stanice pankreasa jesu humane embrionalne stanice pankreasa.

5. Metoda iz patentnog zahtjeva 4, naznačeno time da humane embrionalne stanice pankreasa jesu stare od 6 do 9 tjedana razvoja.

6. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da ne pretila životinja koja ima težak oblik dijabetesa kombiniran s imunodeficijencijom jeste miš.

7. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da učinkovita količina životinjskih stanica pankreasa transplantirana u koraku (c) iznosi između oko 103 do oko 1012 životinjskih stanica pankreasa.

8. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da su životinjske stanice pankreasa transplantirane u koraku (c) uvedene u pankreas rečenog pojedinca.

9. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da rečena funkcija pankreasa jeste regulacija glikemije.

10. Metoda iz patentnog zahtjeva 1, naznačeno time da rečeni pojedinac jeste o inzulinu ovisan dijabetičar.

11. Metoda tretmana dijabetesa u pacijentu koji je čovjek koji ima potrebu za tretmanom, naznačeno time da metoda sadrži sljedeće korake: (a) uvođenje učinkovite količine humanih stanica embrionalnog pankreasa ne starijih od 10 tjedana razvoja, u bubežnu kapsulu ne pretile životinje koja nije čovjek, a koja ima težak oblik dijabetesa kombiniran s imunodeficijencijom (NOD/Scid), te (b) ostavljanje stanica embrionalnog pankreasa da se razviju, da se diferenciraju i da obnove barem jednu funkciju pankreasa, te (c) transplantaciju učinkovite količine funkcionalnih humanih stanica pankreasa dobivenih u koraku (b) u rečenog pacijenta, (d) tretman dijabetesa pri čemu je rečeni tretman moguć zbog obnove rečene funkcije pankreasa za regulaciji glikemije.

12. Metoda iz patentnog zahtjeva 11, naznačeno time da ne pretila životinja koja ima težak oblik dijabetesa kombiniran s imunodeficijencijom jeste miš.

13. Metoda produkcije funkcionalne životinjske stanice pankreasa, naznačeno time da metoda sadrži sljedeće korake: (a) uvođenje učinkovite količine stanica embrionalnog pankreasa ne starijih od 10 tjedana razvoja, u bubrežnu kapsulu ne pretile životinje koja nije čovjek, a koja ima težak oblik dijabetesa kombiniran s imunodeficijencijom (NOD/Scid), pri čemu je rečena NOD/scid životinja različite vrste od rečene životinje od koje su dobivene rečene stanice embrionlnog pankreasa; te (b) ostavljanje životinjskih stanica embrionalnog pankreasa se razviju, da se diferenciraju i da obnove barem jednu funkciju pankreasa, te (c) skupljanje životinjskih stanica pankreasa dobivenih u koraku (b), te (d) moguće in vitro kulitiviranje stanica dobivenih u koraku (c).

14. Metoda iz patentnog zahtjeva 13, naznačeno time da rečena funkcija pankreasa jeste regulacija glikemije.

15. Metoda iz patentnog zahtjeva 13, naznačeno time da dalje sadrži korak imortalizacije stanica dobivenih u koraku (d).

16. Metoda iz patentnog zahtjeva 13, naznačeno time da sadrži preliminarni korak imortalizacije rečenih životinjskih stanica embrionalnog pankreasa ne starijih od 10 tjedana razvoja.

17. Metoda iz patentnih zahtjeva 15 i 16, naznačeno time da su stanice imortalizirane sustavom odabranim iz sljedeće skupine: prirodni virus, rekombinantni virus ili njegov fragment, virkusni vektor zasnovan na virusu, a rečeni virus je odabran od sljedećih: lentivirus, simian virus SV40, Epstein-Bahrov virus, virus Moloneyeve leukemije.

18. Metoda iz patentnog zahtjeva 17, naznačeno time da sustav jeste vektor zasnovan na lentivirusu, preferirano vektor zasnovan na HIV-1.

19. Metoda iz patentnog zahtjeva 17, naznačeno time da vektor zasnovan na virusu sadrži ekspresijsku kazetu koja sadrži gen od interesa operativno vezan na promotor štakorskog inzulina.

20. Metoda iz patentnog zahtjeva 19, naznačeno time da gen od interesa jeste izvještavajući gen, preferirano gen koji kodira zeleni fluorescentni protein (GFP).

21. Metoda iz patentnog zahtjeva 19, naznačeno time da gen od interesa jeste onkogen.

22. Metoda prema patentnim zahtjevu 13, naznačeno time da dalje sadrži korak genetske modifikacije stanica dobivenih u koraku (d).

23. Metoda prema patentnim zahtjevu 13, naznačeno time da dalje sadrži preliminarni korak genetske modifikacije rečenih životinjskih stanica pankreasa ne starijih od 10 tjedana razvoja.

24. Funkcionalna životinjska stanica pankreasa, naznačeno time da je dobivena prema patentnom zahtjevu 13 u kojem rečena stanica jeste beta stanica pankreasa.

25. Beta stanica pankreasa iz patentnog zahtjeva 24, naznačeno time da rečena stanica eksprimira inzulin kao odgovor na glukozu.

26. Stanica pankreasa prema patentnim zahtjevima od 24 do 25, naznačeno time da rečena stanica jeste humana stanica.

27. Stanica pankreasa prema patentnim zahtjevima od 24 do 25, naznačeno time da rečena stanica jeste stanica štakora.

28. Stanica pankreasa prema patentnim zahtjevima od 24 do 25, naznačeno time da jeste lijek.

29. Upotreba stanice pankreasa prema patentnim zahtjevima od 24 do 26, naznačeno time da je za pripravu lijeka za tretman dijabetičara.

30. Upotreba stanice pankreasa prema patentnim zahtjevima od 24 do 26, naznačeno time da je za staničnu terapiju.

31. Upotreba stanice pankreasa prema patentnim zahtjevima od 24 do 27, naznačeno time da je za ispitivanje fiziopatološkog razvitka dijabetesa.

32. Metoda produkcije životinjske stanice pankreasa u različitim stupnjevima razvoja, naznačeno time da metoda sadrži sljedeće korake: (a) uvođenje učinkovite količine životinjskih stanica embrionalnog pankreasa ne starijih od 10 tjedana razvoja, u bubrežnu kapsulu ne pretile životinje koja nije čovjek, a koja ima težak oblik dijabetesa kombiniran s imunodeficijencijom (NOD/Scid), pri čemu je rečena NOD/scid životinja različite vrste od rečene životinje od koje su dobivene rečene embrionalne stanice pankreasa; te (b) ostavljanje životinjskih stanica embrionalnog pankreasa se razviju, da se diferenciraju i da obnove barem jednu funkciju pankreasa, te (c) sakupljanje životinjskih stanica pankreasa dobivenih u koraku (b), te (d) moguće in vitro kulitiviranje stanica dobivenih u koraku (c).

33. Upotreba stanica pankreasa dobivenih prema metodi iz patentnog zahtjeva 32, naznačeno time da je za ispitivanje razvitka pankreasa.