KR20040036684A

KR20040036684A - 치료용 결합 분자

Info

Publication number: KR20040036684A
Application number: KR10-2003-7010584A
Authority: KR
Inventors: 그레고리오 아베르자; 프랑크 콜빈거; 헤레라 호세 엠. 카르발리도; 안드라스 아스조디; 요세 더블유. 살다나; 브루스 엠. 홀
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2001-02-12
Filing date: 2002-02-11
Publication date: 2004-04-30
Also published as: WO2002072832A3; CZ20032129A3; JP2004533816A; EP1421191A2; HUP0401560A3; CN100529074C; NO20033549L; PL369516A1; KR100752029B1; NO20033549D0; MXPA03007197A; HUP0401560A2; RU2008100239A; NZ548865A; US20040096901A1; BR0207151A; CA2437963A1; JP2009034108A; RU2405790C2; EP1421191B1

Abstract

본 발명은 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 분자, 예를 들어 서열내에 아미노산 서열 Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH)를 갖는 초가변 영역 CDR1, 아미노산 서열 Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG)를 갖는 초가변 영역 CDR2 및 아미노산 서열 Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT)를 갖는 초가변 영역 CDR3를 포함하는 분자, 예를 들어 서열내에 아미노산 서열 Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln (RASQNIGTSIQ)를 갖는 초가변 영역 CDR1', 아미노산 서열 Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser (SSSESIS)를 갖는 초가변 영역 CDR2' 및 아미노산 서열 Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr (QQSNTWPFT)를 갖는 초가변 영역 CDR3'을 추가로 포함하는 분자, 예를 들어 약제로서 유용한 키메라 또는 인간화 항체를 개시한다.

Description

치료용 결합 분자 {Therapeutic Binding Molecules}

각종 질환의 치료에 있어서 한가지 방법은 병원성 백혈구를 제거 또는 불활성화하고, 병리학적 면역 반응을 불활성화하는 내성을 유도할 수 있도록 하는 것이다.

기관, 세포 및 조직의 이식 거부 반응 및 자가 면역 질환은 주로, 대식세포 및 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포 (APC)에 의해 포획 및 프로세싱되어 항원-MHC 복합체 형태로 제시되는 특이적 항원을 인식할 수 있는 헬퍼 (helper) T-세포에 의해 개시되는 T-세포 매개 면역 반응의 결과인 것으로 생각되며, 즉 헬퍼 T-세포는 특이적 항원을 인식하는 경우에 자극되어 IL-2와 같은 사이토카인을 생산하고, 몇몇 사이토카인 수용체 및 다른 활성화 분자를 발현시키거나 상향조절하며, 증식하게 된다. 이와 같이 활성화된 헬퍼 T-세포 중 일부는 직접 또는 간접적으로 작용하여, 즉 이펙터 (effector) 세포독성 T-세포 또는 B-세포가 선택된 항원을 발현시키는 세포 또는 조직을 파괴하는 것을 돕는다. 면역 반응의 종결 후, 클론상으로 선택된 성숙한 세포들 중 몇몇은 메모리 (memory) 헬퍼 T-세포 및 메모리 세포독성 T-세포로서 남게 되며 이들은 체내에서 순환하다가 항원이 다시 나타나는 경우 이를 빠르게 인식한다. 이러한 반응을 개시하는 항원이 환경적으로 무해한 항원인 경우 결과는 알러지반응이고, 이 항원이 외래 항원이 아니라 자가 항원인 경우 자가면역 질환을 일으킬 수 있으며, 상기 항원이 이식된 조직에서 유래한 항원인 경우 그 결과로 이식 거부반응이 일어날 수 있다.

면역 시스템은 자신을 자신 이외의 것과 구별하도록 개발되었다. 이러한 특성은 매일 병원체와 접촉가능하게 노출된 환경에서 생존할 수 있게끔 한다. 자신 이외의 것에 대한 이러한 특성 및 자신에 대한 내성은 흉선에서, 자가반응성 T-세포의 인식 및 제거를 또한 포함하는 양성 및 음성 선택의 과정을 통한 T-세포 레퍼토리의 발생 동안 일어난다. 이러한 유형의 내성은 주요 내성으로 언급된다. 그러나, 이 자가반응성 세포들의 일부는 이러한 선택적 메카니즘을 벗어나며 자가면역 질환의 발병에 있어서 잠재적인 위험을 나타낸다. 말초를 벗어난 자가반응성 T 세포를 제어하기 위해, 면역 시스템은 자가면역에 대해 보호를 제공하는 말초 조절 메카니즘을 갖는다. 이러한 메카니즘은 말초 내성의 기초를 이룬다.

특이적 mAb에 의해 인식되는 세포 표면 항원은 일반적으로 계속되는 국제 백혈구 타이핑 (International Leukocyte Typing) 워크샵에 의해 지정된 CD (분화 클러스터) 숫자로 나타내고, 본원에서 사용되는 용어 CD45는 세포 표면의 백혈구 공통 항원 CD45를 의미하며, 이 항원에 대한 mAb는 본원에서 "항-CD45"로 표시한다.

백혈구 공통 항원 (LCA) 또는 CD45는 항-림프구 글로불린 (ALG)의 주요 성분이다. CD45는 막횡단 티로신 포스파타제 패밀리에 속하며, 수용체 상호작용에 따라 세포 활성화의 양성 조절자 및 음성 조절자로 작용한다. CD45의 포스파타제 활성은 B 및 T 림프구의 항원 수용체와 관련되는 Src-패밀리 키나제의 활성화에 필요한 것으로 보인다 (Trowbridge IS et al, Annu Rev Immunol. 1994;12:85-116). 따라서, T 세포 활성화에서, CD45는 시그날 1에 대하여 필수적이며 CD45-결핍성 세포는 TCR-매개 활성화 반응에서 중대한 결점을 갖는다.

CD45 항원은 막횡단 당단백질 패밀리를 포함하는 여러 이소폼들로 존재한다. CD45의 다른 이소폼들은 이들의 세포외 도메인 구조에서 차이가 있으며, CD45의 세포외 영역 부분을 코딩하는 3개의 가변성 엑손의 선택적 스플라이싱으로부터 생성된다 (Streuli MF. et al, J. Exp. Med. 1987; 166:1548-1566). CD45의 다양한 이소폼들은 상이한 세포외 도메인을 갖지만, 약 300개의 잔기들로 이루어진 고도로 보존된 상동성 포스파타제 도메인 2개를 갖는 동일한 막횡단 및 세포질 세그먼트를 갖는다. 상이한 이소폼의 조합들은 T 및 B 림프구의 하위집단상에서 차별적으로 발현된다 (Thomas ML. et al, Immunol. Today 1988; 9:320-325). 어떤 모노클로날 항체는 모든 다른 이소폼들에 공통적인 에피토프를 인식하지만, 다른 mAb들은 이들이 인식하는 선택적으로 스플라이싱된 엑손 (A, B 또는 C)에 따라 제한된 (CD45R) 특이성을 갖는다. 예를 들어, 엑손 A의 생성물을 인식하는 모노클로날 항체는 결과적으로 CD45RA로 나타내며, 엑손 B를 포함하는 다양한 이소폼들을 인식하는 모노클로날 항체는 CD45RB로 나타낸다 (Beverley PCL et al, Immunol. Supp. 1988; I:3-5). UCHL1과 같은 항체는, 활성화된 T 세포, 메모리 세포 및 피질 흉선세포의 하위군으로 제한되는 것으로 보이며 B 세포상에서 검출되지 않는 180 kDa 크기의이소폼 CD45RO (가변성 엑손 A, B 또는 C 중 어느 것도 없음)에 선택적으로 결합한다 (Terry LA et al, Immunol. 1988; 64:331-336).

본 발명은 CD45 항원 이소폼 (isoform)에 대한 결합 분자, 예를 들어 모노클로날 항체 (mAb)와 같은 유기 화합물에 관한 것이다.

도 1은 "후보 mAb"에 의한 1차 MLR (혼합 림프구 반응)의 억제가 0.001 내지 10 ㎍/ml의 범위에서 투여량-의존적임을 나타낸다. "농도"는 "후보 mAb"의 농도이다.

도 2는 완전한 발현 벡터의 뉴클레오티드 서열인 서열 15에서 뉴클레오티드 서열인 서열 12 (3921-4274)를 갖는 중쇄를 포함하는 발현 벡터 HCMV-G1 HuAb-VHQ의 플라스미드 맵을 나타낸다.

도 3은 완전한 발현 벡터의 뉴클레오티드 서열인 서열 16에서 뉴클레오티드 서열인 서열 11 (3921-4274)을 갖는 중쇄를 포함하는 발현 벡터 HCMV-G1 HuAb-VHE의 플라스미드 맵을 나타낸다.

도 4는 완전한 발현 벡터의 뉴클레오티드 서열인 서열 17에서 뉴클레오티드 서열인 서열 14 (3964-4284)를 갖는 경쇄를 포함하는 발현 벡터 HCMV-K HuAb-humV1의 플라스미드 맵을 나타낸다.

도 5는 완전한 발현 벡터의 뉴클레오티드 서열인 서열 18에서 뉴클레오티드 서열인 서열 13 (3926-4246)을 갖는 경쇄를 포함하는 발현 벡터 HCMV-K HuAb-humV2의 플라스미드 맵을 나타낸다.

본 발명자들은 CD45RO 및 CD45RB와 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 결합 분자를 발견하였으며, 이는 본원에서 "CD45RO/RB 결합 분자"로 지칭하기도 한다. 본 발명에 따른 이러한 결합 분자는 면역억제를 유도하고, 1차 T 세포 반응을 억제하며, T 세포 내성을 유도할 수 있다. 또한, 본 발명의 결합 분자는 1차 혼합 림프구 반응 (MLR)을 억제한다. 또한, CD45RO/RB 결합 분자로 처리된 배양물로부터 유도된 세포들은 바람직하게는 2차 MLR, 심지어 CD45RO/RB 결합 분자의 부재하의 2차 MLR에서 증식 반응의 감소를 나타낸다. 2차 MLR에서 그러한 증식 반응의 감소는 내성을 유도하는 본 발명의 결합 분자의 능력을 나타낸다. 또한, CD45RO/RB 결합 분자를 인간 PBMC의 주사 후 제노-GVHD를 경험하는 중증 복합 면역결핍증 (SCID) 마우스에게 생체내 투여하여, 순환성 인간 T 세포가 CD45RO/RB 결합 분자로 처리된 마우스에서 여전히 검출될 수 있는 경우에도, 대조군 처리된 마우스에 비해 마우스 생존을 연장시킬 수 있다.

"CD45RO/RB 결합 분자"는 단독으로 또는 다른 분자와 결합하여 CD45 항원의 CD45RB 및 CD45RO 이소폼에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 결합 반응은 예를 들어 형광 현미경법 또는 유동세포계수 (FACS) 분석법, 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA) 또는 방사성면역분석법과 함께 직접 또는 간접 면역형광법과 같은 임의의 종류의 결합 분석법을 비롯한 표준 방법 (정성 분석)에 의해 나타낼 수 있으며, 상기 분자가 특정 CD45 이소폼을 발현시키는 세포와 결합하는 것을 시각화할 수 있다. 또한, 상기 분자의 결합은 이러한 이소폼들을 발현시키는 세포의 기능을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 1차 또는 2차 혼합 림프구 반응 (MLR)의 억제는 예컨대, CD45RO/RB 결합 분자의 존재 또는 부재하에 1차 또는 2차MLR의 억제를 측정하고 1차 MLR 억제에서의 차이를 측정하는 시험관내 분석법 또는 생체분석법으로 측정할 수 있다.

별법으로, 시험관내 기능 조절 효과는 예를 들어 MLR에서 세포 활성화 이후에, 또는 특이적 항원, 예를 들어 파상풍 독소 또는 기타 항원, 또는 폴리클로날 자극제, 예를 들어 피토헤마글루티닌 (PHA) 또는 항-CD3 및 항-CD28 항체 또는 포르볼 에스테르 및 Ca²⁺이오노포어로의 자극 이후에, PBMC 또는 T 세포 또는 CD4⁺T 세포의 증식, 사이토카인의 생산, 세포 표면 분자의 발현 변화를 측정하여 결정할 수도 있다. 자극제로서 동종이형 세포 대신 상기 언급한 바와 같은 가용성 항원 또는 폴리클로날 자극제를 사용하는 것을 제외하고는 MLR에 대해 설명한 것과 유사한 방식으로 배양물을 설정하였다. T 세포 증식은 상기 기술된 바와 같이³H-티미딘 혼입에 의해 측정하는 것이 바람직하다. 사이토카인 생산은 샌드위치 ELISA에 의해 측정하는 것이 바람직하며, 여기서 사이토카인 포획 항체는 96-웰 플레이트의 표면상에 코팅되어 있고, 배양물로부터의 상등액을 가하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하며, 이후 특정 사이토카인에 대해 특이적인 검출용 항체를 호스래디쉬 퍼옥시다제와 같은 효소에 컨쥬게이션된 제2 단계 항체에 이어서 상응하는 기질을 따라 첨가하고, 플레이트 판독기로 흡광도를 측정한다. 세포 표면 분자의 변화는 바람직하게는 표적 세포를 특정 세포 표면의 분자에 대해 특이적인 항체로 염색한 다음 직접 또는 간접 면역형광법에 의해 측정할 수 있다. 항체를 형광색소로 직접 표지하거나 제1 항체에 대해 특이적인 형광 표지된 제2 단계 항체를 사용할 수 있으며, 세포는 유동세포계수기로 분석한다.

본 발명의 결합 분자는 CD45RO 및 CD45RB 모두에 대하여 결합 특이성을 갖는다 ("CD45RB/RO 결합 분자"). 결합 분자는 CD45RO 이소폼들과 바람직하게는 15 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 가장 바람직하게는 5 nM 미만의 해리 상수 (Kd)로 결합한다. 결합 분자는 CD45RB 이소폼들과 바람직하게는 15 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 가장 바람직하게는 5 nM 미만의 Kd로 결합한다.

다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는

1) CD45 분자의 에피토프 A 및 B를 포함하지만 에피토프 C는 포함하지 않고(않거나);

2) CD45 분자의 에피토프 B를 포함하지만 에피토프 A 및 C는 포함하지 않는 CD45 이소폼과 결합하고(하거나);

3) CD45 분자의 에피토프 A, B 또는 C 중 어느 것도 포함하지 않는 이소폼과 결합한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서 본 발명의 결합 분자는

1) CD45 분자의 에피토프 A, B 및 C 모두를 포함하고(하거나)

2) CD45 분자의 에피토프 A를 제외한 에피토프 B 및 C 둘 다

를 포함하는 CD45 이소폼과 결합하지 않는다.

다른 바람직한 실시양태에서 본 발명의 결합 분자는 또한

1) 메모리 및 생체내 동종활성화된 (alloactivated) T 세포를 인식하고(하거나);

2) 예를 들어 PEER 세포와 같은 인간 T 세포상의 그의 표적과 바람직하게는 15 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 가장 바람직하게는 5 nM 미만의 Kd로 결합하고(하거나);

3) 시험관내에서 동종반응성 (alloreactive) T 세포 기능을 바람직하게는 약 5 nM, 보다 바람직하게는 약 1 nM, 가장 바람직하게는 약 0.5 nM 또는 심지어 약 0.1 nM의 IC₅₀으로 억제하고(하거나);

4) 시험관내에서 동종항원-특이적 T 세포를 유도하고(하거나);

5) 유효량으로 투여되는 경우 인간 PBMC의 주입에 의해 SCID 마우스에서 유도된 치명적인 이종발생성 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)을 방지한다.

다른 바람직한 실시양태에서 본 발명의 결합 분자는 문헌 (Aversa et al., Cellular Immunology 158, 314-328 (1994))에 기재된 바와 같이 모노클로날 항체 "A6"와 동일한 에피토프에 결합한다.

상기 설명된 결합 특성 및 생물학적 활성으로 인해, 본 발명의 결합 분자는 의학적 치료 및(또는) 예방에서 특히 유용하다. 본 발명의 결합 분자가 특히 유용한 것으로 알려진 질병으로는 하기에 더 기술된 바와 같이 자가면역질환, 이식거부반응, 건선, 염증성 장질환 및 알러지를 들 수 있다.

본 발명자들은 서열 1의 폴리펩티드 및 서열 2의 폴리펩티드를 포함하는 분자가 CD45RO/RB 결합 분자라는 것을 알아냈다. 또한 본 발명자들은 서열 1의 CD45RO/RB 결합 분자에서 아미노산 서열 Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln (RASQNIGTSIQ)를 갖는 초가변 영역 CDR1', 아미노산 서열 Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser (SSSESIS)를 갖는 초가변 영역 CDR2' 및 아미노산 서열 Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr (QQSNTWPFT)를 갖는 초가변 영역 CDR3'을 발견하였다.

또한, 본 발명자들은 서열 2의 CD45RO/RB 결합 분자에서 아미노산 서열 Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH)를 갖는 초가변 영역 CDR1, 아미노산 서열 Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG)를 갖는 초가변 영역 CDR2 및 아미노산 서열 Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT)를 갖는 초가변 영역 CDR3를 발견하였다.

CDR들은 초가변 영역이라고도 불리우며 본질적으로 항원 결합 특징을 결정하는 3개의 특이적 상보성 결정 영역이다. 이러한 CDR은 가변 영역, 예를 들어 각각 서열 1 또는 서열 2의 부분이며, 이들 CDR은 프레임워크 영역 (FR), 예를 들어 불변 영역과 번갈아 나타난다. 본 발명에 따른 키메라 항체에서 서열 1은 경쇄, 예를 들어 서열 3의 부분이며, 서열 2는 중쇄, 예를 들어 서열 4의 부분이다. 중쇄의 CDR은 결합된 경쇄의 CDR과 함께 본질적으로 본 발명의 분자의 항원 결합 부위를 구성한다. 결합 에너지에 대한 경쇄 가변 영역의 기여는 결합된 중쇄 가변 영역의 기여에 비해 적으며, 단리된 중쇄 가변 영역은 그 자체로 항원 결합 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 이러한 분자를 통상적으로는 단일 도메인 항체라고 부른다.

한 측면에서 본 발명은 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 분자, 예를들어 서열내에 아미노산 서열 Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH)를 갖는 초가변 영역 CDR1, 아미노산 서열 Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG)를 갖는 초가변 영역 CDR2 및 아미노산 서열 Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT)를 갖는 초가변 영역 CDR3를 포함하는 CD45RO/RB 결합 분자; 및 그의 직접적인 등가물을 제공한다.

다른 측면에서 본 발명은 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 분자, 예를 들어

a) 서열내에 아미노산 서열 Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH)를 갖는 초가변 영역 CDR1, 아미노산 서열 Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG)를 갖는 초가변 영역 CDR2 및 아미노산 서열 Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT)를 갖는 초가변 영역 CDR3를 포함하는 제1 도메인; 및

b) 서열내에 아미노산 서열 Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln (RASQNIGTSIQ)를 갖는 초가변 영역 CDR1', 아미노산 서열 Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser (SSSESIS)를 갖는 초가변 영역 CDR2' 및 아미노산 서열 Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr (QQSNTWPFT)를 갖는 초가변 영역 CDR3'을 포함하는 제2 도메인

을 포함하는 CD45RO/RB 결합 분자; 및 그의 직접적인 등가물을 제공한다.

바람직한 실시양태에서 서열내에 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 제1 도메인은 이뮤노글로불린 중쇄이며, 서열내에 초가변 영역 CDR1', CDR2' 및CDR3'을 포함하는 제2 도메인은 이뮤노글로불린 경쇄이다.

다른 측면에서 본 발명은 서열 1의 폴리펩티드 및(또는) 서열 2의 폴리펩티드, 바람직하게는 하나의 도메인내에 서열 1의 폴리펩티드 및 다른 도메인내에 서열 2의 폴리펩티드를 포함하는 CD45RO/RB 결합 분자와 같은 분자, 예를 들어 키메라 모노클로날 항체, 및 또 다른 측면에서는 서열 3의 폴리펩티드 및(또는) 서열 4의 폴리펩티드, 바람직하게는 하나의 도메인내에 서열 3의 폴리펩티드 및 다른 도메인내에 서열 4의 폴리펩티드를 포함하는 CD45RO/RB 결합 분자와 같은 분자, 예를 들어 키메라 모노클로날 항체를 제공한다.

항원 결합 부위가 제1 및 제2 도메인 모두, 또는 각각 서열 1 또는 서열 3의 폴리펩티드 및 각각 서열 2 또는 서열 4의 폴리펩티드를 포함하는 경우, 이들은 동일한 폴리펩티드상에 위치하거나, 바람직하게는 각 도메인이 다른 쇄상에 위치할 수 있는데, 예를 들어 제1 도메인은 중쇄, 예컨대 이뮤노글로불린 중쇄의 부분 또는 그의 단편이고 제2 도메인은 경쇄, 예컨대 이뮤노글로불린 경쇄의 부분 또는 그의 단편이다.

추가로 본 발명자들은 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자가 포유동물, 예를 들어 인간의 체내 환경에서의 CD45RO/RB 결합 분자라는 것을 밝혀냈다. 따라서, 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자는 모노크로날 항체 (mAb)로 지칭할 수 있는데, 이때 결합 활성은 상기 기술된 바와 같이 주로 CDR 영역에 의해 측정하고, 예를 들어 상기 CDR 영역은 결합 특이성이 없는 다른 분자, 예를 들어 실질적으로 인간 기원의 프레임워크, 예컨대 불변 영역과 결합되어 있다.

또 다른 측면에서 본 발명은 문헌 (Aversa et al., Cellular Immunology 158, 314-328 (1994))에 기재된 바와 같은 모노클로날 항체 "A6"가 아닌 CD45RO/RB 결합 분자를 제공한다.

또 다른 측면에서 본 발명은 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전한 인간 모노클로날 항체인, 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자를 제공한다.

CD45RO/RB 결합 분자의 예로는 B-세포 또는 하이브리도마에 의해 생산되는 항체로부터 유도되는 키메라 또는 인간화 항체 및(또는) 그의 임의의 단편, 예를 들어 F(ab')₂및 Fab 단편뿐 아니라, 단쇄 또는 단일 도메인 항체도 포함된다. 단쇄 항체는 일반적으로 10개 내지 30개, 바람직하게는 15개 내지 25개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 링커에 의해 공유 결합된 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 구성된다. 따라서, 그러한 구조는 중쇄 및 경쇄의 불변 영역 부분을 포함하지 않으며, 작은 펩티드 스페이서가 전체 불변 영역 부분보다 항원성이 적은 것으로 믿어진다. 키메라 항체는 중쇄 및 경쇄 모두 또는 이들의 불변 영역이 인간 기원의 것이지만 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 도메인이 인간 이외 (예, 쥐과 동물) 기원의 것인 항체를 의미한다. 인간화 항체는 초가변 영역 (CDR)이 인간 이외 (예, 쥐과 동물) 기원의 것이지만 다른 모든 부분, 예를 들어 불변 영역의 전부 또는 실질적으로 전부 및 가변 영역의 고도로 보존된 부분이 인간 기원의 것인 항체를 의미한다. 그러나, 인간화 항체는 초가변 영역에 인접한 가변 영역의 부분에서 쥐과 동물 서열의 일부 아미노산을 보유할 수 있다.

초가변 영역, 즉 본 발명에 따른 CDR'은 어떤 종류의 프레임워크 영역, 예를 들어 인간 기원의 중쇄 및 경쇄의 불변 영역 부분과 결합될 수 있다. 적합한 프레임워크 영역은 예를 들어 문헌 ("Sequences of proteins of immunological interest", Kabat, E.A. et al, US department of health and human services, Public health service, National Institute of health)에 기재되어 있다. 바람직하게는, 인간 중쇄의 불변 영역 부분은 IgG₁타입 (서브타입 포함)의 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간 경쇄의 불변 영역 부분은 κ또는 λ타입, 보다 바람직하게는 κ타입의 것일 수 있다. 중쇄의 바람직한 불변 영역 부분은 서열 4의 폴리펩티드 (상기 기재된 CDR1', CDR2' 및 CDR3' 서열 부분이 없음)이며, 경쇄의 바람직한 불변 영역 부분은 서열 3의 폴리펩티드 (상기 기재된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 부분이 없음)이다.

또한 본 발명자들은 본 발명에 따른 CDR1', CDR2' 및 CDR3'을 포함하는 아미노산 서열 7 또는 아미노산 서열 8의 경쇄 가변 영역 및 본 발명에 따른 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 서열 9 또는 서열 10의 중쇄 가변 영역을 포함하는 인간화 항체를 발견하였다.

또 다른 측면에서 본 발명은 서열 9 또는 서열 10의 폴리펩티드 및 서열 7 또는 서열 8의 폴리펩티드를 포함하는 인간화 항체를 제공한다.

또 다른 측면에서 본 발명은

- 서열 9의 폴리펩티드 및 서열 7의 폴리펩티드,

- 서열 9의 폴리펩티드 및 서열 8의 폴리펩티드,

- 서열 10의 폴리펩티드 및 서열 7의 폴리펩티드, 또는

- 서열 10의 폴리펩티드 및 서열 8의 폴리펩티드

를 포함하는 인간화 항체를 제공한다.

본 발명에 따른 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 기재된 서열의 폴리펩티드, 예컨대 CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2' 또는 CDR3'의 폴리펩티드, 또는 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 7, 서열 8, 서열 9 또는 서열 10의 폴리펩티드는 예를 들어 상기 폴리펩티드의 기능성 유도체를 포함하여 상기 (폴리)펩티드 (서열)의 직접적인 등가물을 포함한다. 상기 기능성 유도체는 특정 서열의 공유결합 변형을 포함할 수 있고(있거나) 특정 서열의 아미노산 서열 변이체를 포함할 수 있다.

본원에 달리 특정되지 않는다면 "폴리펩티드"는 N-말단의 단부에서 출발하여 C-말단의 단부에서 끝나는 아미노산 서열을 가지며, 펩티드 결합에 의해 서로 연결되는 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 모노클로날 항체, 보다 바람직하게는 키메라 (V-그래프트된) 또는 인간화 (CDR-그래프트된) 모노클로날 항체이다. 인간화 (CDR-그래프트된) 모노클로날 항체는 수용체 항체의 프레임워크 (FR) 서열로 도입된 추가의 돌연변이를 포함할 수도 있고, 포함하지 않을 수도 있다.

본원에 사용된 폴리펩티드의 기능성 유도체는 본 발명에 따른 폴리펩티드와 공통적인 정성적인 생물학적 활성을 갖는 분자, 즉 CD45RO 및 CD45RB에 대한 결합능을 갖는 분자를 포함한다. 기능성 유도체는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 단편및 펩티드 동족체를 포함한다. 단편은 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예를 들어 특정 서열의 서열내 영역을 포함한다. 용어 "유도체"는 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예를 들어 특정 서열의 아미노산 서열 변이체 및 공유결합 변형물을 정의하기 위해 사용된다. 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예를 들어 특정 서열의 기능성 유도체는 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예를 들어 특정 서열의 아미노산 서열과 바람직하게는 약 65％ 이상, 보다 바람직하게는 약 75％ 이상, 보다 더 바람직하게는 약 85％ 이상, 가장 바람직하게는 약 95％ 이상의 전체적인 서열 동일성을 가지며, CD45RO 및 CD45RB와 결합하는 능력을 실질적으로 보유한다.

용어 "공유결합 변형"은 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예를 들어 특정 서열 또는 그의 단편을, 유기 단백질성 물질 또는 비-단백질성 유도체화제로 변형시키는 것, 이종 폴리펩티드 서열에 융합시키는 것 및 번역 이후에 변형시키는 것을 포함한다. 공유결합 변형된 폴리펩티드, 예를 들어 특정 서열의 폴리펩티드는 가교결합에 의해 CD45RO 및 CD45RB와 결합하는 능력을 여전히 보유한다. 공유결합 변형은 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 측기 또는 말단 잔기와 반응시킬 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키거나, 또는 선택된 재조합 숙주 세포에서 기능하는 번역후 변형의 메카니즘을 가동함으로써 도입하는 것이 통상적이다. 어떤 번역후 변형은 발현된 폴리펩티드에 대하여 재조합 숙주 세포가 작용한 결과이다. 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 흔히 번역 이후에 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 탈아미드화된다. 또는, 이러한 잔기들은 온화한 산성 조건하에서 탈아민화된다. 번역후 변형의 다른 것으로는 프롤린 및 라이신의 히드록실화, 세릴, 티로신또는 쓰레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화를 들 수 있다 (예를 들어, 문헌 (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)) 참조). 공유결합 변형으로는 예를 들어 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예를 들어 특정 서열의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질들 및 이들의 아미노산 서열 변이체, 예를 들어 이뮤노어드헤신, 및 이종 시그날 서열과의 N-말단 융합체가 포함된다.

본원에서 천연 폴리펩티드 및 그의 기능성 유도체에 대한 "상동성"은 서열을 정렬시키고 필요하다면 최대 상동성 비율을 얻기 위해 갭을 도입한 이후에 후보 서열 중에서 상응하는 천연 폴리펩티드의 잔기와 동일한 아미노산 잔기의 비율로서 정의되며, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환은 고려하지 않는다. N- 또는 C-말단의 연장형태나 삽입체의 어느 것도 동일성 또는 상동성을 감소시키는 것으로 생각되지 않는다. 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 잘 알려져 있다.

"아미노산(들)"은 예를 들어 D-아미노산을 포함하여 모든 자연 발생적인 L-α-아미노산을 의미한다. 아미노산은 잘 알려진 하나의 문자 표시 또는 3개의 문자 표시로 확인된다.

용어 "아미노산 서열 변이체"는 그의 아미노산 서열이 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예를 들어 특정 서열에 비해 일부 차이를 나타내는 분자를 의미한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예를 들어 특정 서열의 아미노산 서열 변이체는 CD45RO 및 CD45RB와 결합하는 능력을 여전히 갖는다. 치환 변이체는 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예를 들어 특정 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되고 동일한 위치에 다른 아미노산이 삽입된 것을 의미한다. 이러한 치환은 분자내에서 하나의 아미노산만이 치환되는 단일 치환이거나 동일한 분자내에서 2개 이상의 아미노산이 치환되는 다중 치환일 수 있다. 삽입 변이체는 하나 이상의 아미노산이 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예를 들어 특정 서열의 폴리펩티드내에서 특정 위치의 아미노산에 인접하여 삽입된 것을 의미한다. 아미노산에 인접한다는 것은 아미노산의 α-카르복시 또는 α-아미노 관능기에 연결된 것을 의미한다. 결실 변이체는 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예를 들어 특정 서열의 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산이 제거된 것을 의미한다. 통상적으로, 결실 변이체는 분자내 특정 영역에서 결실된 1개 또는 2개의 아미노산을 가질 것이다.

또한 본 발명자들은

- CDR1의 아미노산 서열을 코딩하는 GGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTG,

- CDR2의 아미노산 서열을 코딩하는 TTCTTCTGAGTCTATCTCTGG,

- CDR3의 아미노산 서열을 코딩하는 ACAAAGTAATACCTGGCCATTCACGTT,

- CDR1'의 아미노산 서열을 코딩하는 TTATATTATCCACTG,

- CDR2'의 아미노산 서열을 코딩하는 TTTTAATCCTTACAATCATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAG,

- CDR3'의 아미노산 서열을 코딩하는 AGGACCCTATGCCTGGTTTGACACCTG,

- 서열 1의 폴리펩티드, 즉 본 발명에 따른 mAb 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 서열 5,

- 서열 2의 폴리펩티드, 즉 본 발명에 따른 mAb 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 서열 6,

- 서열 9의 폴리펩티드, 즉 본 발명에 따른 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열 11,

- 서열 10의 폴리펩티드, 즉 본 발명에 따른 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열 12,

- 서열 7의 폴리펩티드, 즉 본 발명에 따른 CDR1', CDR2' 및 CDR3'을 포함하는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열 13, 및

- 서열 8의 폴리펩티드, 즉 본 발명에 따른 CDR1', CDR2' 및 CDR3'을 포함하는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열 14

의 폴리뉴클레오티드 서열을 발견하였다.

또 다른 측면에서 본 발명은 CD45RO/RB 결합 분자, 예를 들어 본 발명에 따른 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및(또는) 바람직하게는 본 발명에 따른 CDR1', CDR2' 및 CDR3'의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

서열 5의 폴리뉴클레오티드 및(또는) 바람직하게는 서열 6의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및

서열 7 또는 서열 8의 폴리펩티드 및 서열 9 또는 서열 10의 폴리펩티드, 예를 들어

- 서열 7의 폴리펩티드 및 서열 9의 폴리펩티드,

- 서열 7의 폴리펩티드 및 서열 10의 폴리펩티드,

- 서열 8의 폴리펩티드 및 서열 9의 폴리펩티드, 또는

- 서열 8의 폴리펩티드 및 서열 10의 폴리펩티드

를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및

서열 11의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 12의 폴리뉴클레오티드 및 서열 13의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 14의 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는

- 서열 11의 폴리뉴클레오티드 및 서열 13의 폴리뉴클레오티드,

- 서열 11의 폴리뉴클레오티드 및 서열 14의 폴리뉴클레오티드,

- 서열 12의 폴리뉴클레오티드 및 서열 13의 폴리뉴클레오티드, 또는

- 서열 12의 폴리뉴클레오티드 및 서열 14의 폴리뉴클레오티드

를 포함하는 폴리뉴클레오티드

를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본원에서 달리 특정하지 않는다면 "폴리뉴클레오티드"는 변형되지 않은 RNA 또는 DNA이거나, 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 포함하며, 이들은 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA, 및 단일-가닥 및 이중-가닥 영역의 혼합물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 아미노산 서열 CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2' 또는 CDR3', 또는 각각 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 7, 서열 8, 서열 9 또는 서열 10을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 각각 서열 5, 서열 6, 서열 11, 서열 12, 서열 13 또는 서열 14의 폴리뉴클레오티드는 이들의 대립유전자 변이체 및(또는) 이들의 상보체를 포함하는데, 예를 들어 서열 5, 서열 6, 서열 11, 서열 12, 서열 13 또는 서열 14의 각 뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 예를 들어 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 7, 서열 8, 서열 9 또는 서열 10과 각각 80％ 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드 (이 폴리펩티드의 기능성 유도체 포함)를 코딩하며; 여기서 예를 들어 상기 기능성 유도체는 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 7, 서열 8, 서열 9 또는 서열 10과 각각 65％ 이상의 상동성을 가지고, 각각 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 7, 서열 8, 서열 9 또는 서열 10의 공유결합 변형물을 포함하며, 각각 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 7, 서열 8, 서열 9 또는 서열 10의 아미노산 서열 변이체를 포함하며; 예컨대 서열 5, 서열 6, 서열 11, 서열 12, 서열 13 또는 서열 14는 각각 유전자 코드의 다의성 (축퇴성)의 결과로서 각각 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 7, 서열 8, 서열 9 또는 서열 10의 폴리펩티드를 코딩하거나, 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 7, 서열 8, 서열 9 또는 서열 10의 각 아미노산 서열과 80％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다.

예를 들어 키메라 또는 인간화 항체인 CD45RO/RB 결합 분자는 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다. 따라서, CD45RO/RB를 코딩하는 하나 이상의 DNA 분자를 작제하여 적절한 조절 서열하에 놓고 적절한 벡터에 의해 발현을 위한 적합한 숙주 (생물)로 전달할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자의 중쇄 및(또는) 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 재조합 방법에 의해 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자를 제조하는데 있어서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공한다.

CD45RO/RB 결합 분자는 예를 들어 본원에 제공된 정보, 예를 들어 초가변 또는 가변 영역의 아미노산 서열 및 이러한 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 지식과 함께 통상의 방법과 유사한 방법에 따라 얻을 수 있다. 가변 도메인 유전자를 작제하는 방법은 예를 들어 EP 239 400에 기술되어 있으며, 요컨대 다음과 같이 요약할 수 있다: 어떤 특이성의 mAb 가변 영역을 코딩하는 유전자를 클로닝할 수 있다. 프레임워크 및 초가변 영역을 코딩하는 DNA 단편을 결정하고, 이 초가변 영역을 코딩하는 DNA 단편을 제거한다. 이중 가닥의 합성 CDR 카세트를 본원에 기재된 CDR 및 CDR' 서열에 따른 DNA 합성법에 의해 제조한다. 이러한 카세트들에 부착성 (sticky) 말단을 제공하여 카세트들이 원하는 인간 기원의 프레임워크의 연결부에서 라이게이션될 수 있도록 한다. 단쇄 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 통상의 방법에 따라 유사하게 제조할 수도 있다. 이와 같이 제조된 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 적절한 발현 벡터로 편리하게 전달할 수 있다.

통상의 방법과 유사한 방법에 따라 적절한 세포주를 찾아낼 수 있다. 예를 들어 적절한 프로모터(들) 및 중쇄 및 경쇄 불변 영역 부분을 포함하는 발현 벡터는 공지되어 있으며, 상업적으로 이용가능하다. 적절한 숙주는 공지되어 있거나, 예를 들어 통상의 방법과 유사한 방법에 따라 찾아낼 수 있으며, 이들로는 예를 들어 세포 배양물 또는 트랜스제닉 (transgenic) 동물을 들 수 있다.

다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 예를 들어 서열 15, 서열 16, 서열 17 또는 서열 18의 발현 벡터를 제공한다.

또 다른 측면에서 본 발명은

- 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 시스템 (이 발현 시스템 또는 그의 부분은 적합한 숙주 세포내에 존재하는 경우 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자를 제조할 수 있음), 및

- 상기 정의된 발현 시스템을 포함하는 단리된 숙주 세포

를 제공한다.

본 발명자들은 시험관내 MLR에 의해 측정하는 경우 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자가 1차 동종면역반응을 투여량 의존적인 방식으로 억제한다는 것을 알아냈다. 이러한 결과에 의해, 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자의 존재하에 동종활성화된 세포는 동종항원에 대한 그의 반응이 감소된다는 것을 알 수 있다. 이로서 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자가 이펙터 동종반응성 T 세포에 대하여 직접적으로 작용하고 그의 기능을 조절할 수 있음을 확인하였다. 또한, 1차 MLR로부터 유도된 T 세포의 기능적 특성은 2차 MLR의 재자극 실험에서 특이적 자극 세포 또는 제3의 자극제를 사용하여 관찰된 기능적 효과의 특이성을 평가함으로써 추가로 연구하였다. 본 발명자들은 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자가 존재하는 1차 MLR로부터 유도된 세포가 2차 배양물에 가해진 항체가 없음에도 불구하고 이후 특이적 자극 세포에 의한 최적 자극에 반응하는 능력이 감소되었음을 알아냈다. 억제의 특이성은 관련없는 제3의 공여체로부터의 자극 세포에 통상적으로 반응하는 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자로 처리된 세포의 능력에 의해 입증되었다. 따라서 1차 MLR 배양물로부터 유도된 T 세포를 사용하는 재자극 실험은 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자로 동종활성화된 세포가 본래의 동종항원에 대하여 저반응성, 즉 내성임을 나타낸다.

또한, 본 발명자들은 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자로 예비처리된 세포의 세포 증식이 외생성 (exogenous) IL-2에 의해 구제될 수 있음을 알아냈다. 이러한 사실은 동종활성 T 세포를 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자로 처리하면 내성 상태가 유도된다는 것을 암시한다. 또한, 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자로 처리된 세포에서 관찰되는 감소된 증식 반응은 T 세포 기능의 감소로 인한 것이었고, 이러한 세포들은 외생성 IL-2에 반응할 수 있었으며, 이는 이들 세포들이 사실상 비반응성인 무력성 상태에 있음을 암시한다. 이러한 반응의 특이성은 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자로 처리된 세포가 대조군 처리된 세포의 수준까지 관련없는 공여체 세포로 정상적으로 증식하는 능력에 의해 나타난다.

또한, 실험은 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자와 CD45RO 및 CD45RB의 결합이 면역화된 공여체 유래의 말초혈 단핵 세포 (PBMC)의 특이적 리콜 (recall) 항원에 대한 메모리 반응을 억제할 수 있음을 암시한다. 따라서, 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자의 CD45RO 및 CD45RB에 대한 결합은 또한 가용성 Ag에 대하여 메모리 반응을 억제하는데 있어서도 효과적이다. 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자가 면역화된 공여체 유래의 PBMC에서 파상풍에 대한 리콜 반응을 억제하는 능력은 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자가 메모리 T 세포의 활성화를 표적화하고 조절할 수 있음을 암시한다. 예를 들어, 상기 데이타는 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자가 동종활성의 활성화된 T 세포를 인식하는 것 이외에도 이들의 기능을 조절하여 T 세포의 무력화를 유도하게 됨을 암시한다. 이러한 특성은 메모리 반응이 질병 증상을 유지하는 역할을 하는 자가면역질환, 알러지 및 만성 거부반응, 및 건선, 염증성 장질환과 같은 질병에서 나타나는 바와 같이 자가항원 및 알러겐, 및 가능하게는 동종항원에 대한 계속적인 면역반응을 치료하는데 있어서 중요할 수 있다. 이는 자가항원에 대한 메모리 반응이 질병을 유지하는데 있어서 중요한 역할을 할 수 있는 자가면역 질환에서와 같은 질병 상황에서 중요한 특징인 것으로 믿어진다.

또한 본 발명자들은 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자가 생체내의 혼합 림프구 반응에서 T 세포 증식 반응을 조절할 수 있음을 알아냈으며, 즉 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자는 생체내 시험에서 상응하는 억제 특성을 갖는 것으로 나타났다.

따라서 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자는 면역억제 및 관용유발 (tolerogenic) 특성을 가질 수 있어서 동종항원, 자가항원, 알러겐 및 박테리아총 항원에 대한 생체내 및 생체외 내성 유도에 있어서 유용할 수 있으며, 예를 들어 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자는 예를 들어 류마티스성 관절염, 자가면역 갑상선염, 그레이브 (Graves) 병, 타입 I 및 타입 II 당뇨병, 다발성경화증, 전신성홍반성루프스, 쇼그렌 (Sjoegren) 증후군, 피부경화증, 자가면역 위염, 사구체신염, 이식거부반응, 예를 들어 기관 및 조직의 동종 및 이종 거부반응, 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 및 건선, 염증성 장질환 및 알러지와 같은 자가면역 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않는 질병의 치료 및 예방에 있어서 유용할 수 있다.

다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자의, 예를 들어 자가면역 질환, 이식거부반응, 건선, 염증성 장질환 및 알러지의 치료를 위한 약제로서의 용도를 제공한다

또 다른 측면에서 본 발명은 자가면역 질환, 이식거부반응, 건선, 염증성 장질환 및 알러지와 관련된 질병의 치료 및 예방을 위한 약물의 제조를 위해 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자를 제공한다.

또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자를 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

제약 조성물은 예를 들어 활성 성분, 예컨대 항-ICOS, 항-CD154, 항-CD134L 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 면역조절 항체, 또는 rCTLA-4 (CD152), rOX40 (CD134) 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 재조합 단백질, 또는 시클로스포린 A, FTY720, RAD, 라파마이신, FK506, 15-데옥시스페르구알린, 스테로이드 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 면역조절 화합물을 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서 본 발명은 자가면역 질환, 이식거부반응, 건선, 염증성 장질환 및 알러지의 치료 및(또는) 예방을 필요로 하는 대상에게 본 발명에 따른 유효량의 CD45RO/RB 결합 분자를 예를 들어 본 발명에 따른 제약 조성물 형태로 투여하는 것을 포함하는, 상기 질병의 치료 및(또는) 예방 방법을 제공한다.

본 발명의 결합 분자로 치료되는 자가면역질환으로는 예를 들어 류마티스성 관절염, 자가면역 갑상선염, 그레이브 병, 타입 I 및 타입 II 당뇨병, 다발성경화증, 전신성홍반성루프스, 쇼그렌 증후군, 피부경화증, 자가면역 위염, 사구체신염, 이식거부반응, 예를 들어 기관 및 조직의 동종 및 이종 거부반응, 및 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)을 들 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 하기 실시예를 참고로 하여 보다 잘 이해될 것이다. 그러나, 이 실시예들이 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 하기 실시예에서 모든 온도는 섭씨 (℃) 온도이다.

"후보 mAb" 또는 "키메라 항체"는 서열 3의 경쇄 및 서열 4의 중쇄를 포함하는 본 발명에 따른 CD45RO/RB 결합 분자이다.

하기 약어들이 사용된다:

ELISA 효소 결합 면역흡착 분석법

FACS 형광 활성화된 세포 분류법

FITC 플루오레세인 이소티오시아네이트

FBS 소 태아 혈청

GVHD 이식편 대 숙주 질환

HCMV 인간 시토메갈로바이러스 프로모터

IgE 이뮤노글로불린 이소타입 E

IgG 이뮤노글로불린 이소타입 G

PBS 포스페이트-완충 염수

PCR 중합효소 연쇄 반응

xGVHD 이종 이식편 대 숙주 질환

실시예 1 : 1차 혼합 림프구 반응

세포

건강한 인간 공여체로부터 혈액 샘플을 얻었다. 말초혈 단핵 세포 (PBMC)는 전체 말초혈로부터의 백혈구를 피콜-하이페이크 (Ficoll-Hypaque)(Pharmacia LKB)상에서 원심분리하여 단리하거나, 백혈구성분채집술 (leukopheresis)에 의해 단리하거나, 또는 혈액형은 알려져 있지만 HLA 타입은 알려져 있지 않은 백혈구연층 (buffy coat)으로부터 단리하였다. 몇몇 MLR 실험에서, PBMC는 40 Gy에서의 복사선처리 이후에 자극 (stimulator) 세포로 직접 사용하였다. 다른 실험에서, CD2 또는 CD3 다이나비즈 (Dynabeads)(Dynal, Oslo, Norway)를 사용하여 PBMC로부터 T 세포를 고갈시켰다. 비즈 및 오염성 세포를 자기장에 의해 제거하였다. T 세포-고갈된 PBMC를 복사선처리 이후에 자극 세포로 사용하였다.

PBMC, CD3⁺T 세포 또는 CD4⁺T 세포를 MLR에서 반응 (responder) 세포로 사용하였다. 다른 공여체들로부터의 세포를 자극 세포로 만들었다. CD3⁺T 세포는 항-CD16 mAb (Zymed, CA), 염소 항-마우스 IgG 다이나비즈, 항-CD14 다이나비즈, CD19 디이나비즈를 사용하여 음성 선택에 의해 정제하였다. 또한, 항-CD8 다이나비즈를 사용하여 CD4⁺T 세포를 정제하였다. 얻어진 세포를 FACScan 또는 FACSCalibur (Becton Dickinson & Co., CA)에 의해 분석하였으며, 얻어진 세포의 순도는 75％를 초과하였다. 세포를 10％ 열-활성화된 FBS, 페니실린, 스트렙토마이신 및 L-글루타민을 보충한 RPMI1640 배지에 현탁시켰다.

시약

또한 키메라 항-CD45R0/RB mAb "후보 mAb" 및 아이소타입 매치된 대조군 키메라 항체를 생성시켰다. KLH (키홀 림펫 헤모시아닌) 또는 재조합 인간 IL-10에 대해 특이적인 마우스 (인간) 대조군 IgG₁항체는 BD 파밍겐 (Pharmingen)(San Diego, CA)사로부터 구입하였다. 항-인간 CD154 mAb 5c8은 문헌 (Lederman et al 1992)에 따른 것이었다.

1차 혼합 림프구 반응

1 ×10⁵개의 PBMC 또는 5 ×10⁴개의 CD3⁺또는 CD4⁺세포의 분획을 1 ×10⁵개의 복사선처리 PBMC 또는 5 ×10⁴개의 T 세포-고갈된 복사선처리 (50 Gy) PBMC와 함께 지시된 mAb의 존재 및 Ab의 부재하에 96-웰 배양 플레이트 (Costar, Cambridge, MA)의 각 웰에서 혼합하였다. 몇몇 실험에서, 후보 mAb 이외에도, Fc 일부에 특이적인 염소 항-마우스 Ig 또는 염소 항-인간 Ig의 F(ab')₂단편 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)을 첨가하여 표적 CD45 분자의 시험관내 가교결합을 최적화하였다. 혼합된 세포를 5％ CO₂하에 37 ℃에서 4 또는 5일 동안 배양하였으며, 세포를 배양시간 중의 마지막 16 내지 20시간 동안³H-티미딘으로 펄싱하여 증식을 측정하였다. 다른 실험은 상기 설명된 것과 유사하였지만, 다음과 같은 점이 달랐다: 1) 사용된 배지는 10％ FBS 및 1％ 인간 혈장을 함유하는 EX-VIVO (Bio-Whittaker)이었고, 2) 항-마우스 총 IgG (5 ㎍/ml)를 2차 가교결합 단계로서 사용하였으며, 3) 자극 세포의 복사선처리는 60 Gy이었다.

1차 MLR을 제2 단계 시약, Fc 일부에 특이적인 염소 항-인간 Ig의 F(ab')₂단편 (10 ㎍/ml)과 함께 "후보 mAb" 또는 대조군 키메라 IgG₁(10 ㎍/ml)의 존재하에 수행하였다. "후보 mAb"에 의한 억제율은 대조군 IgG₁의 존재하에 세포 증식과 비교하여 계산하였다. 결과는 하기 표 1에 나타나 있다.

본 발명에 따른 후보 mAb 10 ㎍/ml에 의한 1차 MLR의 억제
반응	자극제(복사선처리된 PBMC)	억제율 (％)
#211 CD4	#219 CD3	63.51
#220 CD4	#219 CD3 고갈	63.07
#227 CD4	#220 CD3 고갈	65.96
#229 CD4	#219 CD3 고갈	50.76
평균 ±표준편차	60.83 ±6.83^*
대조군 수치와 유의한 차이가 있음 (P < 0.001)

본 발명에 따른 후보 mAb는 표 1로부터 알 수 있는 바와 같이 1차 MLR을 억제한다. 평균 억제 효과는 4개의 다른 공여체들로부터 유도된 CD4⁺T 세포에서 60.83 ±6.83％이었으며, 통계적으로 유의하였다. "후보 mAb"에 의한 1차 MLR의 억제는 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이 "후보 mAb" 0.001 및 10 ㎍/ml의 범위에서투여량-의존적인 것으로 나타났다. "후보 mAb"에 의한 1차 MLR의 억제를 위한 IC₅₀은 하나의 공여체 PBMC를 반응 세포로 사용하는 3가지 별도의 MLR 실험들의 결과로부터 결정하였다. 따라서, 자극제로서 공여체 #229 및 #219로부터의 반응 CD4⁺T 세포 및 T-세포 고갈된 복사선처리 PBMC를 "후보 mAb" 또는 대조군 키메라 Ab의 존재하에 염소 항-인간 Ig의 F(ab')₂단편 10 ㎍/ml와 함께 혼합하였다. 실험을 3회 반복하고, "후보 mAb"의 존재하의 증식율을 대조군 Ab의 존재하에 T 세포 증식과 비교하여 계산하였다. 오리진 (Origin (등록상표) 버전 6.0)을 사용하여 IC₅₀을 결정하였다. 세포 활성 IC₅₀값은 0.87 ±0.35 nM (0.13 ±0.052 ㎍/ml)인 것으로 계산되었다.

실시예 2 : 2차 MLR

"후보 mAb"가 특이적 동종항원에 대한 CD4⁺T 세포의 비반응성을 유도하는지를 평가하기 위해, 2차 MLR을 1차 MLC 이후 임의의 항체의 부재하에 수행하였다. CD4⁺T 세포를 복사선처리된 동종이형 자극 세포 (T 세포-고갈된 PBMC)와 함께 지시된 항체의 존재하에 96-웰 배양 플레이트에서 10일 동안 배양하였다 (1차 MLC). 이후, 세포를 수집하고, 피콜-하이페이크 구배상에 두어 죽은 세포를 제거하고, RPMI로 2회 세척하고, 동일한 자극제, 제3의 자극 세포 또는 IL-2 (50 U/ml)로 다시 자극하였다. 세포를 3일 동안 배양하고, 세포를 배양 중의 마지막 16 내지 20시간 동안³H-티미딘으로 펄싱하여 증식 반응을 측정하였다.

구체적으로, CD4⁺T 세포를 복사선처리된 동종이형 자극 세포 (다른 공여체로부터 취한 T 세포-고갈된 PBMC)와 함께 염소 항-인간 Ig의 "후보 mAb", 대조군 IgG₁키메라 Ab 및 F(ab')₂단편 10 ㎍/ml의 존재하에 배양하였다. 1차 MLR 증식을 5일째 측정하였다. 2차 MLR의 경우, 반응 및 자극 세포를 "후보 mAb"의 존재하에 10일 동안 배양한 다음, 세포를 수획하여 RPMI1640으로 2회 세척하고, 임의의 Ab의 부재하에 특정 자극제, 제3의 자극제 또는 IL-2 (50 U/ml)로 다시 자극하였다. 3일째 세포 증식을 측정하였다. 결과는 하기 표 2에 나타나 있다.

반응 CD4⁺T 세포 공여체 번호	2차 MLR의 억제율 (％)
#221	49.90^*
#220	59.33^*
#227	58.68^*
* 대조군 수치와 유의한 차이가 있음(p=<0.001, t-시험 (SigmaStat 버전 2.03)에 의해 결정).#p=<0.046

증식의 감소가 "후보 mAb"로 처리한 결과에 따른 비반응성으로 인한 것인지를 시험하기 위해, 1차 MLR로부터 유도된 세포를 IL-2 (50 U/ml)의 존재하에 배양하였다. IL-2의 첨가는 1차 MLR에서 "후보 mAb"로 처리된 T 세포의 증식 반응을 IgG₁대조군 Ab의 존재하에 관찰된 것과 유사한 수준으로 구제하였다. 이러한 데이타는 "후보 mAb"로 처리된 T 세포에서 2차 반응의 감소가 특이적 자극 세포에 비반응성으로 되는 반응 T 세포의 기능 변화로 인한 것임을 암시한다.

억제율 (％)은 하기 식에 따라 계산하였다:

[(대조군 Ab에 의한 c.p.m. - "후보 mAb"에 의한 c.p.m.) / 대조군 Ab에 의한 c.p.m.] ×100

SigmaStat (버전 2.03)를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 데이타는 2-웨이 ANOVA 이후 듀넷 (Dunnett) 방법에 의해 분석하였다. 모든 시험 방법에서 0.05 미만의 확률은 유의한 것으로 고려되었다. 몇몇 실험에서는 t-시험을 이용하였다 (SigmaStat 버전 2.03).

실시예 3 : SCDI 마우스에서의 생체내 생존 연구

SCID 마우스에서의 hu-PBL 이식

세포 전달 후 4주 이내에 90％를 초과하는 마우스에서 치명적인 이종 이식편 대 숙주 질환 (xGvHD)을 유도하기에 충분한 양으로 인간 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 SCID 마우스 C.B17/GbmsTac-Prkdc^scidLyst^bg마우스 (Taconic, Germantown, NY)내에 복강내 주입하였다. 이하, 이렇게 처리된 SCID 마우스를 hu-PBL-SCID 마우스로 표시한다.

hu-PBL-SCID 마우스의 Mab-처리

Hu-PBL-SCID 마우스를 "후보 mAb" 또는 마우스 또는 키메라 이소타입 매치된 mAb 대조군으로 0일, PBMC 주입 후 즉시, 3일 및 7일째 처리하고 이후에는 매주 간격으로 처리하였다. Mab를 PBS 100 ㎕ 중에서 체중 1 kg 당 5 mg의 최종 농도로피하로 전달하였다. 모든 대조군 마우스가 죽었을 때 처리를 중단하였다.

처리 결과의 평가

이 연구에서 "후보 mAb"의 효능을 평가하는 주요 기준은 hu-PBL-SCID 마우스의 생존율이었다. Systat (버전 9.01) 소프트웨어로 보조한 로그 (Log)-랭크 시험 (맨텔 (Mantel) 방법)을 이용하는 통계적인 생존율 분석 방법에 의해 결과의 유의성을 평가하였다. 상기 생존율 분석 방법은 비-파라미터 시험으로, 특정 마우스가 여전히 살아있는지 뿐만 아니라 이 마우스가 그의 기관/세포의 시험관내 분석에서의 수행 요건과 같이 처치/질환과는 관련 없는 이유로 인해 희생되었는지를 고려한다. 죽은 마우스로부터 간, 폐, 신장 및 비장의 생검물을 얻어서 추가로 평가하였다. 또한, 마우스의 건강 상태에 대한 간접적인 평가로서 실험의 시작 (세포 전달 전) 및 실험 동안 (2일 마다) hu-PBL-SCID 마우스의 무게를 쟀다. 각 마우스로부터 구한 체중 대 PBMC 전달 후 경과 일수의 수치를 이용하여 선형 회귀 곡선을 생성시키고, 이어서 비-파라미터 맨-휘트니 (Mann-Whitney) 시험을 이용하여 상기 곡선의 기울기 (대조군 대 항-CD45 처리된 마우스)를 비교하였다.

결과

마우스 mAb 대조군으로 처리된 모든 hu-PBL-SCID 마우스는 폐, 간 및 비장에서 인간 백혈구를 침윤시켰으며, 세포 전달 후 약 2주 내지 3주 이내에 사망 (4/4)하였다. 마우스의 사망은 xGvHD의 결과일 수 있다. 대조군 mAb-처리된 마우스는 또한 선형 방식으로 3주 이내에 약 10％ 이상 체중이 줄었다. "후보 mAb"로 처리된 모든 hu-PBL-SCID 마우스는 "후보 mAb"-처리가 3주 후 중단된 경우에도 4주 이상 어떤 분명한 질병 증상 없이 생존 (4/4)하였다. "후보 mAb"-처리된 마우스는 4주 이내에 선형 방식으로 체중이 약 5％까지 증가하였다.

실시예 4 : 본 발명의 항체의 발현

서열 7, 서열 8, 서열 9 또는 서열 10을 포함하는 인간화 항체의 발현

도 2 내지 5에 나타낸 플라스미드 맵에 따른, 각각 인간화 경쇄 가변 영역 humV1 (서열 7), 인간화 경쇄 가변 영역 humV2 (서열 8), 인간화 중쇄 가변 영역 VHE (서열 9) 또는 인간화 중쇄 가변 영역 VHQ (서열 10)의 아미노산 서열을 코딩하는 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 작제하였다. 이 발현 벡터들은 각각 서열 15, 서열 16, 서열 17 또는 서열 18의 DNA (뉴클레오티드) 서열을 갖는다.

인간화 항체 중쇄 및 경쇄 발현 벡터의 작제

VLh 및 VLm 형태의 인간 카파 경쇄 발현 벡터

인간 카파 이소타입의 완전한 인간화 경쇄를 코딩하는 최종 발현 벡터를 작제하기 위해, 완전한 경쇄 가변 영역 (VLh 및 VLm)을 코딩하는 DNA 단편을, HindIII 및 BglII를 사용하여 VLh 및 VLm 함유 PCR-Script 클로닝 벡터 (Stratagene)(VLm 영역)로부터 절단하였다. 이어서 겔-정제된 단편을, 인간화 항-IgE 항체 TESC-21 (Kolbinger et al 1993)의 작제 동안 생성되며 원래는 M. Bendig (MRC Collaborative Centre, London, UK)(Maeda et al. 1991)로부터 수령한 C21-HCMV 카파 발현 벡터의 HindIII 및 BamHI 부위내에 서브클로닝하였다. 라이게이션 생성물을 페놀/클로로포름 추출에 의해 정제하고, 전기천공하였으며 이러한 처리에의해 수용성 (competent)으로 된 에피쿠리안 콜라이 (Epicurian Coli)(등록상표) XL1-Blue 균주 (Cat. N°#200228, Stratagene)내에 도입하였다. 37 ℃에서 밤새 LB/amp 아가 플레이트상에 플레이팅한 다음, 12개의 콜로니를 각각 떠내어 BioRobot 9600 (Qiagen)을 사용하여 3 ml 배양물로부터 플라스미드 DNA를 제조하였다. 이로서, 도면에 추가로 기재된 바와 같이, 각각 인간화 항체 형태 VLh 및 VLm에 대한 경쇄 발현 벡터를 생성시켰다.

VHQ에 대한 인간 감마-1 중쇄 발현 벡터

VHQ 발현 벡터를 작제하기 위해, 단계적 방법을 수행하였다. 먼저, 문헌 (Kolbinger et al 1993 (Protein Eng. 1993 Nov; 6(8):971-80))에 기재된 바와 같은 방법에 따라 PCR에 의해 VHQ의 완전한 가변 영역을 조립하고, 동일한 효소를 사용하여 C21 삽입체가 제거된 C21-HCMV-감마-1 발현 벡터내에 서브클로닝하였다. 이어서 완전한 가변 영역을 포함하는 PCRScript 클론 VHQ의 HindIII/BamHI 단편을 동일한 효소로 절단된 발현 벡터 C21-HCMV-감마-1내에 서브클로닝하였다. 이로서, 인간화 항체 형태 VHQ에 대한 최종 발현 벡터를 생성시켰다.

VHE에 대한 인간 감마-1 중쇄 발현 벡터

인간 감마-1 이소타입의 완전한 인간화 중쇄를 코딩하는 최종 VHE 발현 벡터의 작제는, 가변 영역을 코딩하는 HindIII 및 BamHI 제한 PCR 단편을 인간화 항-IgE 항체 TESC-21 (Kolbinger et al 1993)의 작제 동안 생성되며 원래는 M. Bendig (MRC Collaborative Centre, London, UK)(Maeda et al. 1991)로부터 수령한 C21-HCMV 감마-1 발현 벡터의 HindIII 및 BamHI 부위내에 직접 라이게이션하여 달성하였다.

COS 세포에서의 일시적인 발현

하기 형질감염 프로토콜은 SuperFect (등록상표) 형질감염 시약 (Cat. N°301305, Qiagen)을 사용하여 150 mm 세포 배양 디쉬에서 부착성 COS 세포에 맞게 변형한 것이다. 상기 기재된 4가지 다른 발현 벡터를 세포의 일시적인 형질감염을 위해 사용하였다. 인간화 항체의 발현을 위해, 중쇄 삽입체 (각각 VHE 또는 VHQ)를 포함하는 2개의 클론 각각을 경쇄 (각각 humV1 또는 humV2)를 코딩하는 2개의 클론 각각과 함께 사용하여 중쇄 및 경쇄 발현 벡터의 총 4가지 다른 조합 (VHE/humV1, VHE/humV2, VHQ/humV1 및 VHQ/humV2)으로 세포를 동시형질감염시켰다. 형질감염에 앞서, 플라스미드를 암피실린에 대한 내성 유전자를 코딩하는 영역에서 절단하는 제한 엔도누클레아제 PvuI으로 선형화하였다. 형질감염 전날, 새로운 배양 배지 30 ml 중 4 ×10⁶개의 COS 세포를 150 mm 크기의 세포 배양 디쉬에 시딩 (seeding)하였다. 이러한 세포 밀도로의 시딩은 일반적으로 24시간 후 80％의 전면배양율 (confluency)을 나타내었다. 형질감염 당일, 4가지 다른 조합의 선형 중쇄 및 경쇄 DNA 발현 벡터 (각각 15 ㎍)를 혈청 및 항생제가 없는 총 부피 900 ㎕의 새로운 배지에서 희석시켰다. 이후, SuperFect 형질감염 시약 180 ㎕를 DNA 용액과 함께 완전히 혼합하였다. DNA 혼합물을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하여 결합체를 형성시켰다. 결합체 형성이 일어나는 동안, 배양 배지를 COS 세포 배양물로부터 제거하고, 세포를 PBS로 1회 세척하였다. 이어서 새로운 배양 배지 (10％ FBS 및 항생제 포함) 9 ml를 형질감염 결합체를 포함하는 각 반응 튜브에 가하여 잘 혼합하였다. 최종 시료를 형질감염되는 4개의 배양물 각각으로 즉시 전달하고, 서서히 혼합하였다. 이후, 세포 배양물을 DNA 결합체와 함께 37 ℃ 및 5％ CO₂에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 형질감염 결합체를 포함하는 배지를 제거하고, 새로운 배양 배지 30 ml로 대체하였다. 형질감염으로부터 48시간 후, 배양물 상등액을 수획하였다.

배양물 상등액의 농축

ELISA 및 FACS 분석을 위해, 중쇄 및 경쇄 플라스미드로 형질감염된 COS 세포로부터 수획된 배양물 상등액을 다음과 같이 농축시켰다. 각 상등액 10 ml를 제조자에 의해 설명된 바와 같이 센트리프렙 (Centriprep) YM-50 원심분리 필터 장치 (Cat. N° 4310, Millipore)에 가하였다. 센트리프렙 필터를 실온에서 3,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 그 다음, 남은 상등액 20 ml에 대하여 원심분리를 5분간만 행하여 원심분리 단계를 다시 반복하고 농축 진행을 관찰하였다. 중간의 농축된 상등액 500 ㎕를 회수하고, 새로운 마이크론 (Micron) 원심분리 필터 장치 (Cat. N° 42412, Microcon)로 옮기고, 제조자의 프로토콜을 따라 추가로 농축시켰다. 농축된 상등액을 실온에서 3,000 rpm으로 24분 동안 4회, 6,000 rpm으로 10분 동안 1회, 이어서 5분 동안 3회 원심분리하였으며, 항상 농축 진행을 관찰하였다. 얻어진 농축된 조정 배지의 최종 부피는 원래의 배양 배지의 250 내지 300배 농도에 상응하는 100 내지 120 ㎕이었으며, 사용할 때까지 4 ℃에서 보관하였다. 비교 및 대조를 위해, 형질감염되지 않은 세포로부터의 배양 배지를 상기 기재된 것과 동일한 원심분리 프로토콜을 이용하여 유사하게 농축시켰다.

실시예 5 : ELISA에 의한 재조합 인간 IgG 발현의 측정

배양 상등액에서 발현되는 재조합 인간 항체의 IgG 농도를 측정하기 위해, 샌드위치 ELISA 프로토콜을 개발하고, 표준물로 인간 IgG를 사용하여 최적화하였다. 평면 바닥의 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (Cat. N° 4-39454, Nunc Immunoplate Maxisorp)에, 4 ℃에서 염소 항-인간 IgG (전체 분자, Cat. N° I1011, SIGMA) 100 ㎕를 PBS 중 0.5 ㎍/ml의 최종 농도로 사용하여 밤새 코팅하였다. 이어서, 웰을 세척 완충액 (0.05％ Tween 20을 함유하는 PBS)으로 3회 세척하고, 37 ℃에서 차단 완충액 (PBS 중 0.5％ BSA)으로 1.5시간 동안 차단시켰다. 3회의 세척 사이클 후, 항체 샘플 및 표준 인간 IgG (Cat.No. I4506, SIGMA)를 차단 완충액 중에서 단계적으로 1.5배 희석시켜 제조하였다. 희석된 샘플 또는 표준물 100 ㎕를 코팅된 플레이트에 2회 반복하여 전달하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하고, 이후 차단 완충액 중 1/4,000로 희석시킨 호스래디쉬 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 염소 항-인간 IgG 카파-경쇄 (Cat. N° A-7164, SIGMA) 100 ㎕와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 대조군 웰에는 차단 완충액 또는 농축된 통상의 배양 배지 100 ㎕를 넣었다. 세척 후, 제조자의 지시에 따라 TMB 퍼옥시다제 EIA 기질 기트 (Cat. N° 172-1067, Bio-Rad)를 사용하여 샘플 및 표준 웰에서 결합된 퍼옥시다제의 비색 정량화를 수행하였다. 퍼옥시다제 혼합물을 웰 당 100 ㎕로 가하고, 암조건하에 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 1 M 황산 100 ㎕를 가하여 비색 반응을 중단시키고, 각 웰에서 흡광도를 ELISA 플레이트 판독기 (Model 3350-UV, BioRad)를 사용하여 450 nm에서 판독하였다.

IgG 표준 곡선에 대한 0.998의 상관계수에서, 4가지 다른 배양 농축물에 대하여 다음과 같이 농도가 결정되었다 (약 250 내지 300배 농축됨):

VHE/humV1 상등액 = 8.26 ㎍/ml

VHE/humV2 상등액 = 6.27 ㎍/ml

VHQ/humV1 상등액 = 5.3 ㎍/ml

VHQ/humV2 상등액 = 5.56 ㎍/ml

실시예 6 : FACS 경쟁 분석 (결합 친화도)

인간 T-세포주 PEER은 그의 세포 표면에서 CD45 항원을 발현시켰기 때문에 FACS 분석을 위한 표적 세포로 선택되었다. 인간화 항체 상등액의 결합 친화성을 분석하기 위해, FITC-표지된 키메라 항체를 레퍼런스로 사용하여 경쟁 실험을 수행하고, 정제된 마우스 항체 및 키메라 항체의 억제와 비교하였다. PEER 세포 배양물을 3,000 rpm에서 10초 동안 원심분리하고, 배지를 제거하였다. 세포를 FACS 완충액 (1％ FBS 및 0.1％ 아지드화나트륨 함유 PBS) 중에 재현탁시키고, 96-웰의 둥근-바닥 마이크로타이터 플레이트에 웰 당 1 ×10⁵개의 세포 밀도로 시딩하였다. 플레이트를 원심분리하고, 상등액을 따라냈다. 차단 연구를 위해, 농축된 비형질감염 배지 또는 이소타입 매치된 대조군 항체 (음성 대조군), 비표지된 마우스 항체 또는 키메라 항체 (양성 대조군), 및 다양한 조합의 인간화 항체 (샘플)을 포함하는 농축 상등액 25 ㎕를 먼저 텍스트에서 지시된 농도로 각 웰에 가하였다. 4 ℃에서 1시간 인큐베이션한 다음, PEER 세포를 원심분리에 의해 FACS 완충액 200 ㎕로 세척하였다. 그 다음, 세포를 FITC로 컨쥬게이션된 키메라 항체와 함께 FACS 완충액 25 ㎕ 중에서 4 ℃에서 1시간 동안 20 ㎍/ml의 최종 농도로 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 요오드화프로피듐 2 ㎍/ml를 포함하는 FACS 완충액 300 ㎕ 중에 재현탁시켜 생존 세포의 게이팅 (gating)을 허용하였다. 세포 시료를 유동세포계수기 (FACSCalibur, Becton Dickinson)로 분석하였다.

FACS 분석은 농축된 인간화 항체 배양물 상등액에 의한 형광색소-표지된 키메라 항체의 투여량-의존적 차단을 나타낸다. 키메라 항체 결합에 대한 투여량 의존적 차단은 이소타입 매치된 대조군 항체에서는 관찰되지 않았으며, 이는 다른 인간화 항체 조합에 의한 차단 효과가 에피토프 특이적이며 에피토프 특이성은 인간화 과정 이후에도 보유되는 것으로 보인다는 것을 암시한다.

실시예 7 : CD45RB/RO 결합 분자의 생물학적 활성

이 연구에서, 본 발명자들은 CD45RB/RO 결합 키메라 항체가 폴리클로날상으로 활성화된 1차 인간 T 세포의 배양물 중에 존재하는 경우 (i) 특징적인 Treg 표현형을 갖는 T 세포의 분화를 지지하고, (ii) T 세포 활성화 이후 아폽토시스를 방지하거나 증가시키며, (iii) 재자극 후 하위군-특이적 항원 및 수용체의 발현에 영향을 주는지를 기술하였다.

CD45RB/RO 결합 키메라 항체는 폴리클로날상으로 활성화된 T 세포에서 세포사멸을 증가시킨다.

1차 T 세포 (CD4⁺와 CD8⁺T 하위군의 혼합물)을 CD45RB/RO 결합 키메라 항체의 존재 또는 부재 (= 대조군)하에 항-CD3 + 항-CD28 mAb (각각 200 ng/ml)에 의해 활성화하였다. 2일째에 세척에 의해 과량의 항체를 제거하였다. 7-아미노-악티노마이신 D (7-AAD)를 아폽토시스성 및 괴사성 세포에 의해 수용되는 DNA-염색 염료로 사용하여 활성화 이후 세포 사멸을 측정하였다. 이 결과는 CD45RB/RO 결합 키메라 항체의 존재하의 T 세포의 활성화가 활성화 후 2일째 7-AAD 양성 세포의 비율을 2배 넘게 증가시켰음을 보여준다. 7일째, 7-AAD 양성 세포의 비율은 CD45RB/RO 결합성 키메라 항체-처리된 배양물 및 대조군 배양물에서 또한 유사하였다.

CD45RB/RO 결합 키메라 항체는 T 조절 세포 (Treg) 표현형을 나타내지만 대조군 mAb 처리된 T 세포는 그렇지 않다.

CD25 및 음성 조절성 단백질 CTLA-4 (CD152)의 발현 증가는 Treg 세포의 마커이다. CD45RB/RO 결합 키메라 항체에 의한 1차 및 2차 T 세포 반응의 기능적 억제는 Treg 세포의 유도로 인한 것일 수 있다. 이러한 점을 설명하기 위해, T 세포를 항-CD3 + CD28 mAb에 의해 활성화하고, CD45RB/RO 결합 키메라 항체 또는 항-LPS 대조군 mAb의 존재하에 배양하였다. CTLA-4 및 CD25 발현의 시간 경과는 2차 자극 후 1일 및 3일째 대조군과 CD45RB/RO 결합 키메라 항체-처리된 T 세포 사이의 현저한 차이를 드러냈다.

세포내 CTLA-4 발현은 CD45RB/RO 결합 키메라 항체의 존재하에 유지된다.

실질적인 양의 CTLA-4가 세포내에 존재할 수도 있는 것으로 보고된 바 있다. 따라서, 표면 CTLA-4 염색과 유사하게, 세포내 CTLA-4 발현을 분석하였다. T 세포 배양물들 사이의 차이는 자극 후 4일째에 보통 정도로 나타났다. 그러나, 연장된 배양 후, CD45RB/RO 결합 키메라 항체-처리된 T 세포에서만 세포내 CTLA-4의 수준이 높은 것으로 나타났으며, 대조군 T 세포에서는 그렇지 않았다.

CD45RB/RO 결합 키메라 항체-처리된 T 세포는 CD4 및 CD8에 대하여 이중 양성이 된다.

자극 후, T 세포는 여러 표면 수용체, 예를 들어 CD25, CD152 (CTLA-4), CD154 (CD40-리간드) 및 다른 것들의 발현을 유도 및 상향조절하였다. 이와는 달리, CD4 또는 CD8의 발현 수준은 비교적 일정하게 유지되는 것으로 생각되었다. 본 발명자들은 활성화 이후 CD45RB/RO 결합 키메라 항체-처리된 T 세포에서는 CD4 및 CD8 항원 둘 다가 크게 증가했음을 반복적으로 관찰하였지만 대조군 Ab-처리된 T 세포에서는 그렇지 않았다. CD4/CD8 이중-양성 T 세포 집단의 발생은 CD8⁺하위군에 대한 CD4의 상향조절, 바꾸어 말하면 CD4⁺하위군에 대한 CD8의 상향조절로 인한 것으로 보인다. 이는 대조군 배양물에서 이중 양성 T 세포의 비율이 중간 정도로 낮은 것과는 대조적이다.

CD45RB/RO 결합 키메라 항체-처리된 T 세포에 의한 IL-2 수용체 알파-쇄의 높은 수준의 발현 및 베타-쇄의 매우 낮은 수준의 발현

Treg 세포는 CD25, IL-2 수용체 알파-쇄에 대하여 구성적으로 양성인 것으로알려져 있다. Treg 세포에 대한 삼합체 IL-2 수용체의 다른 서브유닛의 조절은 알려져 있지 않다. 최근, 본 발명자들은 CD45RB/RO 결합 키메라 항체의 존재 또는 부재하에 활성화 및 증식된 T 세포에 대한 IL-2 수용체의 베타-쇄, 예를 들어 CD122의 발현을 비교하였다. 이 결과는 CD45RB/RO 결합 키메라 항체-처리된 T 세포가 대조군 배양물에서의 T 세포에 비해 약 10배 더 낮은 CD122 발현을 나타낸다는 사실을 보여준다. 이러한 차이는 Treg 세포가 증식을 위해 IL-2 이외의 다른 인자를 필요로 한다는 것을 암시할 수 있다.

실시예 8 : 본 발명의 서열 (본 발명의 CDR 서열에는 밑줄이 그어져 있음)

서열 1

키메라 경쇄의 아미노산 서열의 부분

서열 2

키메라 중쇄의 아미노산 서열의 부분

서열 3

키메라 경쇄의 아미노산 서열

서열 4

키메라 중쇄의 아미노산 서열

서열 5

서열 1의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 6

서열 2의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 7

humV2 (humV2 = VLm)으로 나타낸 인간화 경쇄의 아미노산 서열의 부분

서열 8

humV1 (humV1 = VLh)으로 나타낸 인간화 경쇄의 아미노산 서열의 부분

서열 9

VHE로 나타낸 인간화 중쇄의 아미노산 서열의 부분

서열 10

VHQ로 나타낸 인간화 중쇄의 아미노산 서열의 부분

서열 11

아미노산 서열인 서열 9를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 12

아미노산 서열인 서열 10을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 13

아미노산 서열인 서열 7을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 14

아미노산 서열인 서열 8을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 15

발현 벡터 HCMV-G1 HuAb-VHQ의 뉴클레오티드 서열

(3921 내지 4274로부터의 서열 12 (VHQ)를 포함하는 인간화 중쇄 발현 벡터의 완전한 DNA 서열)

서열 16

발현 벡터 HCMV-G1 HuAb-VHE의 뉴클레오티드 서열

(3921 내지 4274로부터의 서열 11 (VHE)를 포함하는 인간화 중쇄 발현 벡터의 완전한 DNA 서열)

서열 17

발현 벡터 HCMV-K HuAb-VL1 hum V1의 뉴클레오티드 서열

(3964 내지 4284로부터의 서열 14 (humV1=VLh)를 포함하는 인간화 경쇄 발현 벡터의 완전한 DNA 서열)

서열 18

발현 벡터 HCMV-K HuAb-VL1 hum V2의 뉴클레오티드 서열

(3926 내지 4246으로부터의 서열 13 (humV2=VLm)을 포함하는 인간화 경쇄 발현 벡터의 완전한 DNA 서열)

Claims

아미노산 서열 Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH)를 갖는 초가변 영역 CDR1,

아미노산 서열 Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG)를 갖는 초가변 영역 CDR2, 및

아미노산 서열 Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT)를 갖는 초가변 영역 CDR3

를 서열 중에 포함하며, 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 분자.
제1항에 있어서,

a) 아미노산 서열 Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH)을 갖는 초가변 영역 CDR1, 아미노산 서열 Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG)를 갖는 초가변 영역 CDR2, 및 아미노산 서열 Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT)를 갖는 초가변 영역을 서열 중에 포함하는 제1 도메인, 및

b) 아미노산 서열 Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln (RASQNIGTSIQ)를 갖는 초가변 영역 CDR1', 아미노산 서열 Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser (SSSESIS)를 갖는 초가변 영역 CDR2', 및 아미노산 서열 Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr (QQSNTWPFT)를 갖는 초가변 영역 CDR3'을 서열 중에 포함하는 제2 도메인

을 포함하는 결합 분자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 키메라 또는 인간화 모노클로날 항체인 결합 분자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 1의 폴리펩티드 및(또는) 서열 2의 폴리펩티드를 포함하는 결합 분자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 3의 폴리펩티드 및(또는) 서열 4의 폴리펩티드를 포함하는 결합 분자.
제4항 또는 제5항에 있어서, 키메라 모노클로날 항체인 결합 분자.
서열 9 또는 서열 10의 폴리펩티드 및 서열 7 또는 서열 8의 폴리펩티드를 포함하는 인간화 항체인 결합 분자.
- 서열 9의 폴리펩티드 및 서열 7의 폴리펩티드,

- 서열 9의 폴리펩티드 및 서열 8의 폴리펩티드,

- 서열 10의 폴리펩티드 및 서열 7의 폴리펩티드, 또는

- 서열 10의 폴리펩티드 및 서열 8의 폴리펩티드

를 포함하는 인간화 항체인 결합 분자.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 결합 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제9항에 있어서, 제2항에 따른 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 코딩하고(하거나) 제2항에 따른 CDR1', CDR2' 및 CDR3'의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
서열 5의 폴리뉴클레오티드 및(또는) 서열 6의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
서열 7 또는 서열 8의 폴리펩티드 및 서열 9 또는 서열 10의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
서열 11 또는 서열 12의 폴리뉴클레오티드 및 서열 13 또는 서열 14의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
발현 시스템 또는 그의 일부가 적합한 숙주 세포내에 존재할 때 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 제조할 수 있는, 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 시스템.
제15항에 따른 발현 시스템을 포함하는 단리된 숙주 세포.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자 또는 인간화 항체의 약제로서의 용도.
제17항에 있어서, 자가면역 질환, 이식거부, 건선, 염증성 장질환 및 알러지의 치료 및(또는) 예방에 있어서의 용도.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자 또는 인간화 항체를 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 포함하는 제약 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 유효량의 결합 분자 또는 인간화 항체를 자가면역 질환, 이식거부, 건선, 염증성 장질환 및 알러지와 관련된 질병의 치료 및(또는) 예방을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 질병의 치료 및(또는) 예방 방법.
CD45RO 및 CD45RB 모두에 대하여 결합 특이성을 갖는 결합 분자의 의학에서의 용도.
제21항에 있어서, 상기 결합 분자가 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전한 인간 모노클로날 항체인 용도.
제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 결합 분자가 15 nM 미만의 해리 상수 (Kd)로 CD45RO 이소폼 (isoform)에 결합하는 것인 용도.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자가 15 nM 미만의 해리 상수 (Kd)로 CD45RB 이소폼에 결합하는 것인 용도.
제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자가

- CD45 분자의 에피토프 A 및 B를 포함하지만 에피토프 C는 포함하지 않고(않거나),

- CD45 분자의 에피토프 B를 포함하지만 에피토프 A 및 C는 포함하지 않는 CD45 이소폼과 결합하고(하거나),

- CD45 분자의 에피토프 A, B 또는 C 중 어느 것도 포함하지 않는 이소폼과 결합하는 것인 용도.
제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자가

- CD45 분자의 에피토프 A, B 및 C를 모두 포함하고(하거나),

- CD45 분자의 에피토프 B 및 C를 둘 다 포함하지만 에피토프 A는 포함하지 않는

CD45 이소폼과 결합하지 않는 것인 용도.
제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자가 PEER 세포상의 그의 표적 에피토프와 15 nM 미만의 Kd로 결합하는 것인 용도.