CZ124699A3 - Protilátka antí-4-ΙΒΒ - Google Patents

Abstract

Toto řešení popisuje neočekávaný výsledek, že dvě monoklonální protilátky anti-4-ΙΒΒ mohou inhibovat primární i sekundární humorální odpověď, a to alespoň naTbuňkách dependentní antigeny in vivo. Takové protilátky poskytují nový přístup k imunosupresivní terapii a terapii nádorů in vivo.

Description

Tento vynález se týká metod a sloučenin pro imunomodulaci.

Podstata techniky

4-1BB je inducibilní T-buněčný receptor, který patří do nadskupiny receptorů nervového růstového faktoru. Tento nový antigen je exprimován na povrchu aktivovaných T-buněk ve slezině a na povrchu buněk thymu. Extracelulární doména tohoto typu I transmembránového proteinu je homologní ke členům z nadskupiny receptorů nervového růstového faktoru.

Cytoplazmatická doména obsahuje sekvence, které jsou homologní k vazebnému místu pro T-buněčnou specifickou tyrosinkinázu p56^lc\

Role 4-1BB in vivo zůstává zatím nejasná, ačkoli se množí důkazy o zapojení tohoto receptorů jako signalizační molekuly pro aktivaci T-buněk. Například zesítění 4-1BB s monoklonální protilátkou 53A2 na anti-CD3 stimulované T-buňky vede ke dvou až desetinásobné proliferací T-buněk (Pollok a kol., J.

Immunol. 151, 1225 (1993)). Dále Zhou a kol. (Immunol. Letters 41, 177-184 (1994)) ukázal, že 4-1BB je exprimován na aktivovaných intestinálních intraepiteliálních T-lymfocytech, a že aktivované intraepiteliální lymfocyty, spuštěné anti-4-ΙΒΒ monoklonální protilátkou, mohou zvýšit hladinu cytotoxicity intraepiteliálních lymfocytů proti anti-CD4 sekrečním hybridomovým buňkám. Zesítění protilátky anti-4-ΙΒΒ rovněž zvyšuje proliferací intraepiteliálních lymfocytů.

Byly identifikovány nejméně dva zástupci ligandů 4-1BB.

»· ·· • · ί • ·

I · · · · ·

Chalupny a kol. (Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 89, 10360-10364 (1992)) použili rozpustného 4-1BB imunoglobulinového konjugovaného proteinu (4-1BB Rg), aby ukázali že 4-1BB se váže na extracelulární matrix protein (EMC). Goodwin a kol.

(Eur. J. Immunol., 32, 2631 (1993)) popsal izolaci cDNA pro ligand pro myší 4-1BB (4-1-BB-L), který patří do skupiny ligandů s homologním aminokyselinovým C-koncem. Tato skupina zahrnuje TNF, lymfotoxin (LT) alfa a beta, CD40-L, CD27-L, CD30-L a Fas-L.

Byl nakloňován lidský analog (hu4-lBB) myšího 4-1BB a lidský analog (hu4-l-BB-L) myšího 4-1-BB-L (Alderson a kol., Eur. J. Immunol. 24, 2219-2227 (1994)). Monoklonální protilátky proti hu4-l-BB a buňkám, do kterých byl transfekcí dodán hu41BB-L, navozovaly u mitogenně kostimulovaných primárních T- . buněk silnou proliferativní odpověď.

Z toho vyplývá, že je zapotřebí vyvinout antagonisty 4-1BB. Zcie uvedený vynález zohledňuje tuto potřebu i další.

Podstata vynálezu

Jedním aspektem vynálezu je způsob suprese primární a sekundární humorální odpovědi na antigen v hostiteli, který zahrnuje podávání účinné dávky protilátky anti-4-ΙΒΒ tomuto hostiteli.

Dalšími aspekty vynálezu jsou sloučeniny, které zahrnují monoklonální protilátky 1D8, 3B8 nebo 3E1.

Dalším aspektem vynálezu je přípravek, který zahrnuje protilátku anti-4-ΙΒΒ, přičemž tato protilátka in vivo inhibuje protilátkovou odpověď na ovčí erytrocyty.

Ο» ·

• · * • · 9 • 9 · 9

9

9 · · ·

9 · 9 • · * t • 9 9 β

999 999 • · ·· ς»

Dalším aspektem vynálezu je způsob blokování na T-buňkách závislé imunitní odpovědi v hostiteli, který zahrnuje podávání účinné dávky protilátky anti-4-ΙΒΒ hostiteli.

Dalším aspektem vynálezu je způsob, který zahrnuje podávání účinné dávky protilátky anti-4-ΙΒΒ hostiteli, čímž zvyšuje lymfocytární zabíjení nádorových buněk v hostiteli.

Dalším aspektem vynálezu je způsob potencování vývoje cytotoxických T-buněk v hostiteli, který zahrnuje podávání účinné dávky protilátky anti-4-ΙΒΒ tomuto hostiteli.

Dalším aspektem vynálezu je způsob terapie hostitele, u kterého se vyskytuje T-buněčné autoimunní onemocnění. Tento způsob zahrnuje podávání účinné dávky protilátky anti-4-ΙΒΒ tomuto hostiteli.

Popis obrázků na výkresech

Na obrázku 1 je graf, který zobrazuje vazbu myšího ligandu 4-1BB na na imobilizovaný 4-1BB.

Na obrázku 2 je graf, který zobrazuje blokování vazby 4-1BB na ligand prostřednictvím monoklonálních protilátek anti-4-lBB (mAb).

Na obrázku 3 je graf, který zobrazuje expresi 4-1BB v aktivovaných T-buňkách jako funkci času po stimulaci. Kolečka představují hladiny mRNA 4-1BB. Čtverečky představují hladiny 4-1BB receptorú na povrchu aktivovaných T-buněk linie DO.11.10.

Na obrázku 4 je graf, který zobrazuje kostimulaci T-buněčné aktivace suboptimálními dávkami anti-CD3 monoklonální protilátky 145.2C11 a monoklonálnich protilátek anti-4-ΙΒΒ.

Na obrázku 5 je graf, který zobrazuje farmakokinetiku anti-4-ΙΒΒ monoklonální protilátky 1D8. Každý symbol označuje j inou myš.

Na obrázku 6 je graf, který zobrazuje inhibici primární a sekundární buněčné odpovědi proti ovčím erytrocytům protilátkami anti-4-ΙΒΒ.

Na obrázku 7 je graf, který zobrazuje inhibici tvorby cytotoxických T-buněk generovanou protilátkami anti-4-ΙΒΒ.

Na obrázku 8 je graf, který zobrazuje regresi tumoru P815, která následovala po terapii monoklonálními protilátkami proti

4-1BB.

Na obrázku 9 je graf, který zobrazuje dlouhodobé přežívání myší s ascitem P815 následující po terapii monoklonálními protilátkami'anti-4-ΙΒΒ.

Na obrázku 10 je graf, který zobrazuje účinek deplece CD4 a CD8 v rejekci nádorových buněk P815, která byla indukována 1D8.

Na obrázku 11 je graf, který zobrazuje terapii myši, které byly intravenózně injekčně podány sarkomové buňky AG104.

Na obrázku 12 (A-C) je zobrazena (A) in vivo inhibice tvorby odpovědi cytotoxických T-buněk během GvHD; (B) akcelerace zabíjení BDFi buněk sleziny, zprostředkovaného cytotoxickými T-buňkami, monoklonálními protilátkami anti-4-ΙΒΒ; (C) vzestup procenta CD8⁺ T-buněk u myší, které

0·

99 9 1

9

0 0 0 9 9 1 podstupují GvHD.

Na obrázku 13 je graf, který zobrazuje zabíjení aktivovaných myších T-buněk imunotoxinem anti-4-lBB-PE40.

Na obrázku 14 je graf, který zobrazuje schopnost protilátek anti-4-ΙΒΒ blokovat rozvoj experimentální autoimunní encefalomyelitidy.

Dále se uvádí popis zvláštních ztělesnění.

Imunosupresivní terapie je obvykle používána pro kontrolu zánětlivých procesů, při terapii nádorových onemocnění a při transplantaci orgánů. Tradiční terapeutické postupy jako je například použití adrenokortikálních hormonů a jejich induktorů, adrenokortikotropního hormonu, chemoterapeutických působků a radiační terapie, mohou vést k nespecifické imunosupresi a imunodeficiencím. To znamená, že je velice zapotřebí alternativních způsobů pro navození imunosuprese. Protilátky vě zde uvedeném vynálezu poskytují příležitost přednostně zasáhnout jednotlivé polypeptidy, například 4-1BB, které jsou exprimovány na T-buňkách.

Termín „4-1BB tak, jak je zde používaný se vztahuje k myšímu buněčnému povrchovému proteinu 4-1BB a k homologním proteinům, které se vyskytují u jiných druhů včetně člověka. Ačkoli je možné očekávat homologii některých aminokyselinových sekvencí u těchto homologních proteinů mezi různými druhy, stupeň homologie může být ještě asi 50 %. To znamená, že homology 4-1BB jsou definovány jako transmembránové proteiny exprimované na aktivovaných T-buňkách, které mají alespoň 50% homologii v aminokyselinové sekvenci s myším 4-1BB. Kromě toho jsou do této definice zahrnuty alely 4-1BB a příslušné • ·

Φ · · ·

I Φ · 1 » · · · φ φ φφφ φ« homology, 4-1ΒΒ a příslušné homology se Zachovalou aminokyselinovou substitucí a dále rozpustné formy 4-1BB a příslušných homologů.

Pojem „humorální odpověď tak, jak je zde používán se vztahuje k imunitní reakci, která může být přenášena prostřednictvím séra a typicky vyplývá z přítomnosti specifických protilátek. Pojmy „primární a „sekundární imunitní odpovědi se vztahují na první expozici hostitele určitým antigenem, respektive na opakovanou expozici antigenem. Typicky je v humorální imunitní odpovědi hlavní třídou protilátek během časné primární odpovědi (to jest první týden) IgM, zatímco IgG je hlavní třídou protilátek v sekundární imunitní odpovědi.

Monoklonální protilátky v tomto vynálezu mohou být z kterékoli skupiny, ale přednostně jsou ze skupiny IgG nebo IgM.

Pro podávání lidem, například jako komponenta prostředku pro terapii in vivo, jsou monoklonální protilátky z tohoto vynálezu podávány v podstatě v čisté formě a přednostně v podstatě ve formě humánní, aby se zabránilo imunogenicitě. „V podstatě humánní forma znamená, že podíl imunoglubulinů v prostředku obvykle obsahuje alespoň 70 % humánních protilátkových sekvencí, přednostně alespoň 80 % a nejlépe 90 až 95 % nebo více humánních protilátkových sekvencí. Ve vztahu k „protilátce je třeba rozumět, že neimunoglubulinové sekvence mohou být podle volby přítomné v molekule, pokud má tato molekula zachovánu schopnost vázat 4-1BB.

Může být žádoucí přenášet antigen vážící úseky (například F(ab')2, variabilní nebo hypervariabilní (komplementaritu určující) úseky) nehumánních monoklonálních protilátek, jako

Ί

9 · ·

9 9 ·

9 9 · · · • · « · · · · # • * · 1 * · · * • · 9 99 9 « ♦

9 9 9 například myších monoklonálních protilátek, ze kterých jsou připraveny humánní 4-1BB homology, na humánní konstantní oblasti (Fc) nebo rámečkové oblasti použitím rekombinantních DNA technik, čímž vzniknou v podstatě humánní molekuly. Tyto metody jsou obvykle dobře známy v oboru a jsou popsány například v US patentu č. 4 816 397, EP publikacích 173 494 a 239 400, které jsou zde uvedeny v odkazech. Alternativně je možné izolovat DNA sekvenci kódující humánní monoklonální protilátku nebo její část, která specificky váže 4-1BB podle screeningu DNA knihovny, z humánních B-buněk podle obecného protokolu, který nastínil Huse a kol., Science 246, 1275-1281 (1989) a který je popsán v WO 90/14430 a zde je uveden v odkazu. Následně se provede klonování a amplifikace sekvencí, které kódují protilátku (nebo vazebný fragmnet) požadované specificity. V ještě jiných ztělesněních mohou být připraveny jednoduché polypeptidové vazebné řetězce, které se váží na 41BB. Tyto jednoduché polypeptidové řetězce mohou být připraveny klonováním a spojováním variabilních úseků těžkých a lehkých řetězců monoklonální protilátky, která se váže na 4-1BB. Metody pro přípravu'jednoduchých polypeptidových vazebných řetězců jsou detailně popsány například v US patentu č. 4 946 778, který je zde uveden v odkazu.

Zde používané pojmy „terapie nebo „léčba zahrnují:

(1) prevenci výskytu nežádoucích symptomů nebo patologických stavů u osob, které jsou ke vzniku těchto symptomů nebo stavů predisponovány, ale u nichž nebyly tyto nežádoucí symptomy nebo patologické stavy dosud diagnostikovány;

(2) inhibici nežádoucích symptomů nebo patologických stavů, to jest zastavení jejich rozvoje; nebo (3) zlepšení nebo zmírnění nežádoucích symptomů nebo patologických stavů, to je kauzální regresí těchto nežádoucích symptomů a patologických stavů.

· «« ♦ • · · · · · • · · * « · · · · 9

9 ·

99 9 9 9 9 1

Množství přípravků z tohoto vynálezu, které dosáhne kteréhokoli z těchto cílů je označen výrazem „účinné množství a je určeno jak pro profylaktické, tak pro terapeutické použití tohoto prostředku.

Protilátky z tohoto vynálezu jsou užitečné v prevenci nebo v terapii nemocí nebo patologických stavů, které mají prospěch z imunosupresivní terapie, mezi které patří, ale nejsou jimi limitovány, zánětlivé onemocnění střeva, mnohočetná skleróza, autoimunní diabetes, revmatoidní artritida, reakce štěpu proti hostiteli, systémový lupus erytematodes, jiná T-buněčná autoimunní onemocnění a nádorová onemocnění.

Monoklonální protilátky a ostatní sloučeniny užitečné v tomto vynálezu mohou být začleněny jako komponenty do farmaceutických přípravků, které obsahují terapeutické nebo profylaktické množství alespoň jedné monoklonální protilátky nebo jejího vazebného fragmentu s farmaceuticky účinným nosičem.

V přípravě farmaceutických přípravků užitečných ve zde přítomných metodách mohou být jako farmaceutické nosiče použity libovolné kompatibilní netoxické substance, vhodné pro dodávání protilátek nebo jejich vazebných fragmentů nebo terapeutických sloučenin, určených v souladu se zde popsanými metodami, pacientovi. Jako nosiče mohou být použity sterilní voda, alkohol, tuky, vosky, inertní pevné látky a dokonce liposomy.

Do farmaceutických přípravků mohou být rovněž začleněna i farmaceuticky přijatelná adjuvancia (pufrovací látky, disperzní látky). Protilátky a farmaceutické přípravky z nich získané jsou zejména vhodné pro parenterální podávání, to jest intravenózní, intraarteriální, intramuskulární nebo subkutánní. Intranazální nebo jiné aerosolové přípravky jsou však také

· vhodné. Koncentrace sloučeniny, jako například protilátky ve formulaci pro podávání, se může pohybovat v širokém rozmezí, například od méně než asi 0,5 %, obvykle nejméně 1 %, až k 15 nebo 20 % i více (uvedeno hmotnostně), a je vybrána primárně na základě objemů tekutiny, viskozity atd., výhradně pro zvláštní zvolený způsob podávání. Současné metody pro přípravu přípravků schopných podávání jsou zřejmé nebo jsou známy pracovníkům kvalifikovaným v oboru a jsou detailněji popsány například v Remington's Pharmaceuticals Science, 17. vyd., Mack Publishing Co., Easton, PA (1985); zde je začleněno v odkazu.

Sloučeniny podle vynálezu užitečné v inhibici imunitní odpovědi na antigen nebo antigeny moho být podávány profylakticky nebo terapeuticky. V podávání, které je určené pro profylaktickou aplikaci, jsou přípravky podávány pacientovi, který je pravděpodobně vystaven expozici určitého antigenu nebo antigenů, jako je tomu například u pacientů, kteří obdželi tkáňový transplantát (včetně transfúze krve nebo séra) nebo dostávají imunogenní sloučeniny, jako jsou například antibiotika.'Podávání sloučenin z tohoto vynálezu se může uskutečnit před expozicí určitému antigenu respektive antigenů nebo v době expozice. Aby se předešlo návratu onemocnění a vzniku následků, může být sloučenina podávána každý den, každý týden nebo v jinak stanovené formě udržovací terapie. Režim podávání rovněž závisí na dávce a její účinnosti, na určeném použití a na celkovém zdravotním stavu pacienta. Ošetřující lékař, dentista nebo jiný zdravotnický pracovník zvolí dávkovači hladiny a model podávání, to znamená cestu a jednotlivé nebo mnohočetné podávání.

V terapeutických aplikacích je sloučenina z tohoto vynálezu podávána pacientovi, u kterého se již projevili nežádoucí symptomy nebo patologie, v dostatečném množství k alespoň částečnému potlačení imunitní odpovědi na antigen respektive antigeny. Adekvátní množství k dosažení tohoto efektu je definováno jako „terapeuticky účinná dávka. Množství účinné pro toto použití bude záviset na použité sloučenině, na způsobu podání, na závažnosti nežádoucích symptomů a patologických stavů a na celkovém zdravotním stavu pacienta. Určení účinného množství sloučeniny z tohoto vynálezu k potlačení imunitní odpovědi na antigen může být determinováno pomocí technik, které jsou dobře známy v oboru. Například pokles antigen specifických imunoglobulinů a tedy účinnost těchto sloučenin, může být monitorována celou řadou metod, které jsou dobře známy v oboru diagnostických procedur in vitro.

Antigen (nebo antigeny), kterým je pacient vystaven, jsou převážně dependentní na T-buňkách. Většina antigenů je dependentních na T-buňkách, to znamená, že požadují T-buňky aby byly schopny vyvolat imunitní odpověď. Antigeny independentní na T-buňkách jsou typicky velké polymerní molekuly s mnohočetnými'opakujicími se antigenními determinantami.

Antigeny T-independentní mají často mitogenní vlastnosti.

Dále mohou být anti-4-ΙΒΒ protilátky z tohoto vynálezu použity v afinitní chromatografii k vyčištění 4-1BB polypeptidů, jako jsou například extracelulární oblasti 4-1BB, rozpustné formy 4-1BB a kondenzace 4-1BB s jinými molekulami, jako jsou například imunoglobuliny. Anti-4-lBB protilátky z tohoto vynálezu mohou být rovněž značeny molekulami jakými jsou například fluorescein, alkalická fosfatáza a podobné, které se pužívají k vizualizaci přítomnosti 4-1BB na buněčných površích. Značené protilátky mohou být použity ke kvantifikaci množství 4-1BB na buňkách. Při jiném provedení mohou být protilátky anti-4-ΙΒΒ z tohoto vynálezu použity v kompetitivních zkouškách

BB BB • « * ♦ • · ·

Β ΒΒΒΒ ♦ · ΒΒΒΒ · *

Β ♦ Β Β

Β Β Β « « Β * · » «Β· ΒΒΒ

Β ·

Β Β » ♦ s ligandy 4-1ΒΒ.

Následující příklady jsou nabídnuty k ilustraci, ale nejsou tímto způsobem limitovány.

Příklady provedení vynálezu

I. Imunizace a screenigové pracovní postupy

Pro imunizaci a screening byl vytvořen kondenzovaný protein, který se skládá z extracelulárních částí myší 4-1BB molekuly a konstantní oblasti humánního imunoglobulinu (Ig) (EP 0 595 659, takto je v úplnosti začleněn v odkazech). 4-lBBIg kondenzovaný protein obsahuje místo štěpení proteázového trombinu mezi 4-1BB a Ig částí molekuly. Pro imunizaci se kondenzovaný protein štěpí trombinem, poté se pasážuje přes proteinovou A kolonu za účelem odstranění nespotřebovaných proteinů a Ig fragmentů. Nevázaný materiál, který je výsledkem této procedury a který obsahuje podle SDSPAGE analýzy více proužků, se použije pro imunizaci.

Použitím imunitních buněk sleziny a buněk myšího myelomu buněčné linie AG8 (Kearney et al., J. Immunol. 123, 1548-1550 (1974)) použitých jako kondenzačního partnera, byly pomocí standardních technik vytvořeny a vyselektovány hybridomy typu krysa-myš. Protilátky byly získány ze dvou oddělených kondenzátů. Monoklonální protilátky 3B8 a 1D8 byly vytvořeny z kondenzátu po dvou injekcích 20 pg proteinu v RIBI adjuvans (RIBI Imunochemical) do nožních polštářků krys kmene SpragueDowley v 0. a 3. den; 10. den dostaly krysy do nožního polštářku třetí injekci 20 pg proteinu ve fosfátovém solném pufrovacím roztoku (PBS) a 13. den byla odstraněna drenážní popliteální lymfatická uzlina a byla provedena kondenzace.

Zbývající monoklonální protilátky byly produkovány v druhé kondenzaci ze slezinných buněk po čtyřech intraperitoneálních injekcích 20 pg proteinu v RIBI v intervalu pěti měsíců. 17. a 3. den před kondenzací byla podána 30 pg intravenózní injekce.

II. Charakteristika anti-4-ΙΒΒ protilátek

Protilátky byly poprvé identifikovány pomocí specifické vazby na 4-1BB kondenzát pomocí standardní ELISA metody. Specificita protilátek byla stanovena na základě dalších kritérií:

(1) vazba na COS buňky exprimující plný řetězec 4-1BB molekuly ale ne na falešně transfektované kontrolní COS buňky;

(2) vazba na DO-11-10 T-buňky hybridomové linie, které byly aktivovány pro expresi 4-1BB (aktivace po dobu 12 hodin 10 ng/ml PMA a 0,5 pg/ml ionomycinu). Izotyp protilátky 3B8 je krysí IgM, kdežto ostatní protilátky jsou všechny izotypu IgG2a, protože byly určeny použitím izotypově specifických peroxidázových reagencií (Zymed) v ELISA s 4-lBBIg proteinem.

III. Purifikace protilátek

Monoklonální protilátka 3B8 (IgM) byla afinitně čištěna na anti-kappa řetězcové koloně (monoklonální protilátka RG7 (ATCC TIB 172)). Monoklonální protilátka byla eluována elučním pufrem Immunopure Ig Elution Buffer (Pierce) a poté dialyzována proti solnému roztoku pufrovanému fosfátem (PBS). RG7-purifikovaný materiál obsahoval nějaké volné řetězce, které byly spolučištěny s intaktní protilátkou. Všechny ostatní protilátky byly purifikovány na proteinu G (Gammabind Plus, Pharmacia). Eluční pufr Immunopure Ig Elution Buffer byl použit k eluování protilátky. Eluovaná protilátka byla před použitím dialyzována proti solnému roztoku pufrovanému fosfátem (PBS).

IV. Inhibice vazby 4-1BB ligandu na 4-1BB protein pomocí monoklonální protilátky

Rozpustný kondenzovaný protein, který se skládá z extracelulární části 4-1BB ligandu na karboxylovém konci a z extracelulární části myšího CD8 na konci s aminoskupinou byl použit jako náhrada ke studiu inhibice vazby ligandu na molekulu 4-1BB. DNA kódující extracelulární doménu myšího 4-1BB ligandu (zbytky 104-309) byla vytvořena polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) použitím protisměrného primerů, který obsahoval BamHI místo (5'-GCGGCGGATCCCCGCACCGAGCCTCGGCCAGCG-3') a stejnosměrného primerů, který obsahoval Xbal místo (5'-CGCTCTAGAGGATAGTTCTCATTCCCATGG-3'). DNA fragment myšího ligandu 4-1BB byl klonován v rámečku do CDM7(B-) vektoru obsahujícího extracelulární doménu CD8 následovanou místem BamHI. Tato molekula je zde zmiňována jako 4-1BB ligand (4-1-BBL). Schopnost monoklonální protilátky anti 4-1BB blokovat vazbu ligandu na 4-1BB molekulu byla vyhodnocena použitím ELISA metody a buněčnými testovacími systémy.

4-1-BBL byl purifikován na anti-CD8 afinitní koloně použitím monoklonální protilátky 53, 6 (ATCC TIB 105), eluován 40% propylenglykolem/60% 50 mM Tris (pH 7,0)/1,25-molárním (NH4)2SO4 a dialyzován proti solnému roztoku pufrovanému fosfátem (PBŠ). Purifikovaný materiál migroval jako predominantní široký proužek o odhadované molekulové hmotnosti 55 000 v redukční SDS-PAGE. Když bylo provedeno hodnocení HPLC gelovou filtrací, byly eluovány 3 píky. Predominantní pík měl odhadovanou molekulovou hmotnost 300 000.

ELISA test inhibice vazby 4-1BBL byl proveden tak, jak je popsáno níže. 4-lBBIg protein byl potažen na ELISA jamkách s 0,1 pg/ml v solném roztoku pufrovaném fosfátem (PBS) přes noc při teplotě 4 °C, blokován ředidlem vzorku (Genetic Systems) a ·

inkubován po dobu jedné hodiny s purifikovanou protilátkou.

Poté byl přidán ligand a směs monoklonální protilátky a ligandu byla inkubována další hodinu. Desky byly omyty a inkubovány s biotinylovanou monoklonální protilátkou 53,6 (anti-CD8), následně s kondenzátem streptavidinu a peroxidázy křenu selského. Inhibice vazby byla indikována kapkou v ELISA signálu. Titrace vazby ligandu na 4-lBBIg je uvedena na obrázku 1. Myší gp30-CD8 kondenzovaná proteinová kontrola neváže 4-1BB, kdežto 4-1BB ligand se specificky váže na 4-1BB ve formách dependentních na dávkách. Schopnost monoklonální protilátky blokovat vazbu ligandu na 4-lBBIg v podobně tvořené ELISA je uvedena na obrázku 2.

V. Aktivace DO-11-10 buněk k expresi 4-1BB proteinu

T-buněčný hybridom DO-11-10 se aktivuje k expresi4-lBB molekuly zpracováním PMA (10 ng/ml) a indomycinu 0,5 pg/ml) v různých časových obdobích. Po této aktivaci se naměří Northern analýzou nebo FACS analýzou exprese 4-1BB mRNA nebo exprese 41BB na buněčném povrchu (obrázek 3). Nezpracované buňky selhávají ve vazbě na 4-1BBL protein. Aktivované buňky vázaly 4-1BBL protein, ale nevázaly podobný kondenzovaný proteinový konstrukt gp39 a Lyta2a (Hollenbaugh a kol., EMBO J. 11 (12) , 4313-4321 (1992)). Protilátky anti-4-ΙΒΒ 1D8 a 3B8 se vážou na buňky DO-11-10 pouze je-li buněčná linie aktivovaná.

Preinkubace těchto monoklonálních protilátek s buňkami DO-11-10 může blokovat následující vazbu 4-1BBL. Vazba 4-1BBL na buňky byla určena použitím monoklonální protilátky anti-CD8 (53,6) kondenzovaného antiséra (Biosource).

V dalších experimentech byla zkoumána schopnost anti-4-ΙΒΒ protilátek podílet se na stimulaci T-buněčné aktivace.

Stimulace zbývajících T-buněk suboptimálními dávkami * · monoklonální protilátky anti-CD3 145,2C11 a 10 pg/ml monoklonálních protilátek anti-4-ΙΒΒ zvýšila proliferaci 2,5až 8-násobně vůči samotnému 145,2C11 (obrázek 4). Byla nalezena nízká korelace mezi vazebnou afinitou nebo schopností blokovat vazbu ligandu a schopností monoklonálních protilátek kostimulovat T-buňky.

VI. Inhibice rozvoje anti-SRBC protilátkové odpovědi anti-4-ΙΒΒ monoklonálními 1D8 a 3B8

Byla hodnocena farmakokinetika monoklonální protilátky anti-4-ΙΒΒ 1D8 po intravenózním podání injekce 250 mg/myš. Vzorky séra byly sbírány od 8. do 42. dne a byly analyzovány na přítomnost monoklonální protilátky anti-4-ΙΒΒ. Výsledky (viz obrázek 5) ukázaly, že poločas. 1D8 byl 7 dní. Tyto výsledky rovněž ukázaly, že u těchto zvířat nedošlo k tvorbě protilátek anti-lD8 (anti-krysíIgG). Poločas 3B8, krysí IgM protilátky byl 6,5 hodiny (není uvedeno v datech).

Skupinám' po pěti myších byl intravenózně podán na T-buňkách dependentní antigen ve formě ovčích erytrocytů (SRBC - sheep red blood cell) a buď 1D8 nebo 3B8. Další injekce s protilátkou byly podávány každý druhý den až do 6. dne.

Vzorky séra se periodicky odebíraly od každé myši až do sedmého týdne a byly testovány na titr protilátek anti-SRBC. Sedmý týden dostaly myši druhou dávku ovčích erytrocytů, ale tentokrát bez dalšího podávání monoklonální protilátky anti-4-ΙΒΒ. Vzorky séra byly odebírány ve dvoutýdenní periodě a byly testovány na přítomnost protilátek proti ovčím erytrocytům. Jak 1D8 tak 3B8 blokovaly primární a sekundární odpověď na antigen ovčích erytrocytů (SRBC) (obrázek 6). Tyto experimenty, zejména výsledky s 3B8 ukazují, že tato léčba vede k dlouhodobé nepřítomnosti odpovědi na antigen.

• ·

VII. Inhibice tvorby cytotoxických T-buněk

Za účelem zjištění, zda exprese 4-1BB je důležitá pro ostatní T-buněčné efektorové funkce, byly měřeny schopnosti protilátky 1D8 a některých protilátek odvozených z druhého kondenzátu ovlivnit tvorbu cytotoxických T-lymfocytů během akutní reakce štěpu proti hostiteli (GvHD). Slezinné T-buňky byly izolovány z myší BDFi (H-2^dtj 10 dní po intravenózní injekci 1 x 10⁷ C57BL/6(H-2^b) slezinných T-buněk. Po 5 dnech vývoje ve tkáňové kultuře s rekombinantním myším IL-2(R&D Systems) při 2 až 10 ng/ml, byly životaschopné T-buňky testovány na cytotoxicitu proti Ia^d (P815) nebo Ia^b (EL4) značených ⁵¹Cr. Výsledky na obrázku 7 ukazují, že slezinné Tbuňky ošetřené kontrolní protilátkou nebo solným roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) zabíjejí efektivně cílové terče, které mají příslušnou MHC třídu haplotypu II (Ia^d) ještě v poměru 3:1. Naproti tomu slezinné T buňky z myší, kterým byla podána protilátka 1D8, nebyly schopny zabíjení, dokud poměr E:T nedosáhl hodnoty 50:1 a dokonce i tehdy bylo zabíjení redukováno na '75 %. Podobných výsledků bylo dosaženo při použití monoklonální protilátky 22B6. Zatímco monoklonální protilátka 3E1 působila kompletní inhibici, monoklonální protilátka 21E5 byla méně účinná v inhibici tvorby/přežívání cytotoxických T-lymfocytů. U EL-4 (Ia^b) nebylo pozorováno zabíjení (není uvedeno v datech). Tato pozorování nemohla být vysvětlena přítomností monoklonální protilátky anti-4-ΙΒΒ v kulturách do té doby než byly do cytotoxických T-lymfocytárních testů přidány takové protilátky, které neblokují zabíjení cytotoxických T-lymfocytů. Mikroskopické zkoumání kultivovaných T-buněk před jejich přidáním k cílovým terčům prokázalo úplný nedostatek aktivovaných buněk, mnoho malých zbytkových životaschopných buněk a velkou část apoptotických nebo mrtvých buněk, které v kontrolních kulturách chyběly.

9 9 • ·

•99 999

9

9·

VIII. Zvýšení tvorby cytotoxických T-lymfocytů během GvHD in vivo

Ze studií popsaných výše vyplývá, že myši s GvHD, které byly ošetřeny monoklonální protilátkou anti-4-ΙΒΒ, neuspěly v doložení aktivity cytotoxických T-lymfocytů proti příslušným cílovým terčům po 5 dnech in vitro kultivace s IL-2 nebo bez IL-2 (není uvedeno v datech), zatímco u kontrolních myší se v přítomnosti IL-2 rozvinula vynikající odpověď cytotoxických T-lymfocytů. Toto pozorování bylo překvapující, protože pozoruhodné zabíjení nádorových buněk cytotoxickými

T-lymfocyty, které byly indukovány 1D8, bylo shodně nalezeno v samostatných modelech tumorů in vivo, a to u metastatických i nemetastatických onemocnění (obrázek 8, 9, 10, a 11). Navíc sleziny odstraněné z myší s GvHD, které byly ošetřeny protilátkoi anti-4-ΙΒΒ, byly 2- až 3krát větší než sleziny normální velikosti, jaké byly nalezeny u kontrolních myší. K objasnění tohoto paradoxního pozorování byly GvHD experimenty opakovány stejně jako předtím, ale tentokrát byla aktivita cytotoxických T-lymfocytů hodnocena okamžitě po chirurgickém odstranění sleziny, čímž se vyloučila IL-2 expanze cytotoxických T-lymfocytů in vitro. Výsledky tohoto experimentu jsou zjevně odlišné od výsledků uvedených výše. Na obrázku 12A je možné vidět, že monoklonální protilátky anti-4-ΙΒΒ, 1D8 a 22B6, o nichž je známo, že se váží na rozdílné oblasti molekuly 4-1BB zvýšily aktivitu cytotoxických T-lymfocytů téměř čtyřnásobně oproti hodnotám, které byly pozorovány u kontrolních GvHD zvířat. Naproti tomu monoklonální protilátka 21E5 neměla zřejmý účinek na tvoření cytotoxických T-lymfocytů zatímco monoklonální protilátka 3E1, která je jedním z nej silnějších blokátorů vazby ligandů, kompletně blokovala tvorbu cytotoxických T-lymfocytů. Silný účinek obou monoklonálních protilátek 1D8 a 22B6 na zvýšený rozvoj aktivity cytotoxických T-lymfocytů je dále demonstrován na obrázku 12B, který ukazuje výrazné snížení celkového počtu životaschopných buněk sleziny odebraných od myší, kterým byly tyto dvě protilátky podávány. Navíc fenotypová analýza buněk sleziny objevila, že u myší, kterým byla podávána monoklonální protilátka 1D8 (obrázek 12C), stouplo procentuální zastoupení CD8⁺ T-buněk až na 30 % z celkového počtu buněk, zatímco u myší s GvHD, které byly injikovány 6E9, izotypy párované nonbindidng kontroly nebo u myší, které nedostávaly žádné protilátky, se procentuální zastoupení CD8⁺ T-buněk pohybovalo v rozmezí 5 až 8 %. Studie mapující epitop protilátek anti-41BB použitím 4-1BB kondenzovaných proteinů, ve kterých byla provedena výměna domény ukázala, že monoklonální protilátka 1D8 byla jedinečná v tom, že se vázala na membránovou proximální oblast extracelulární domény molekuly 4-1BB, aniž by byla zahrnuta do vazby 4-1BB ligandu (není uvedeno v datech).

IX. Potenciace tvorby cytotoxických T-buněk

V těchto 'experimentech byly použity monoklonální protilátky anti-4-ΙΒΒ za účelem potenciace tvorby cytotoxických T-buněk, které potom zabíjejí slabé a neimunogenní nádory, které jsou vysoce metastatické.

Na obrázku 8 jsou zobrazeny výsledky z experimentu, ve kterém skupinám po pěti myších kmene Balb/C byly 0. den subkutánně podány mastocytomové buňky P815 v množství 1 x 10⁵. Kontrolní myši obdžely anti-humánní monoklonální protilátku CD5 10.2. Avšak myši, kterým byly podány monoklonální protilátky (anti-4-ΙΒΒ) buď 1D8 nebo 3E1 rychle odvrhly svoje tumory. Protilátkové injekce jim byly podány intraperitoneálně v 3. den a 6. den v dávce 400 mg/myš.

99· 9··

Na obrázku 9 je zobrazeno dlouhodobé přežívání myší, kterým byl dán tumor P815 a které byly léčeny monoklonální protilátkou 1D8.

Data na obrázku 10 dokládají, že vyčerpání buď CD4 nebo CD8 pozitivních T-buněk u myší, kterým byl dán tumor P815 a monoklonální protilátka 1D8, vede k neschopnosti odvrhnout nádor. Bez toho, že by mělo nastat omezení na nějakou teorii, vedou tyto výsledky k předpokladu, že jak CD4 tak CD8 buňky jsou nutné pro dosažení účinnosti monoklonální protilátky 1D8.

Hodnoty zobrazené na obrázku 11 dokládají, že neimunogenní sarkom AG104 může být usmrcen cytotoxickými T-lymfocyty, které jsou stimulovány monoklonální protilátkou 1D9. V tomto experimentu byly skupinám o .deseti myších kmene Balb/C subkutánně podány nádorové buňky AG104 v množství 1 x 10⁵. Monoklonální látky byly podány subkutánně 3. den a 6. den tak, jak bylo popsáno výše. 60. den přežívalo 70 % myší. Tento výsledek je pozoruhodný, protože tento' nádorový model je velice agresivní.

X. Zabíjení aktivovaných myších T-buněk

V tomto experimentu byl klonováním variabilních oblastí monoklonální protilátky 1D8 vytvořen anti-4-lBB-PE40 imunotoxin, ze kterého byl konstruován jednoduchý řetězec F_v. Tento jednoduchý řetězec Fv byl poté použit k vytvoření imunotoxinu SF_v-PE40 (Siegall a kol., Drug Dev. Res., 34, 210219 (1995)). Tento imunotoxin, jak bylo prokázáno FACS analýzou, se váže pouze na 4-lBB⁺ aktivované buňky. Výsledky na obrázku 13 ukazují, že tento imunotoxin specificky zabijí aktivované 4-lBB⁺ T-buňky způsobem závislým na dávce, zatímco kontrolní imunotoxin toto nedělá.

I · ·· ·

4» · « • ·

XI. Blokování rozvoje experimentální autoimunní encefalomyelitidy

Následující experiment používá myšího modelu T-buněčné autoimunity , například rozvoje experimentální autoimunní (nebo alergické) encefalomyelitidy (viz například Alvord, G.C.Jr., vyd. Experimental Allergic Encephalomyelitis: A Useful Model for Multiple Sclerosis, Liss, NY (1984)).

Myším samicím PL X SJL/Fi bylo 0. den intradermálně injekčně podáno 100 μΐ 1 mg/ml myelinového bazického proteinu z králičího mozku v kompletním Freundově adjuvans. Dále bylo intravenózně injekčně podáno 200 μΐ 1 pg/ml pertussového toxinu v solném roztoku pufrovaném fosfátem (PBS).

Skupině osmi myší bylo 0., 2. a 4. den podáno intravenózní injekcí 200 pg ze solného roztoku pufrovaného fosfátem (PBS), který v 1 mg/ml obsahoval jednu z následujících monoklonálních protilátek (všechny jsou krysího původu a jejich izotyp je IgG2_A) :

(a) kontrolní monoklonální protilátka 6E9 (potkaní antihumánní monoklonální protilátka gp 39);

(b) anti-4-ΙΒΒ monoklonální protilátka 3E1;

(c) anti-4-ΙΒΒ monoklonální protilátka 3H3.

Myši byly zkoumány na nástup experimentální autoimunní encefalomyelitidy na paralýzu ocasu, následnou paralýzu zadních končetin (v tuto chvíli byla zvířata z humánních důvodů utracena).

Schopnost protilátek anti-4-ΙΒΒ blokovat rozvoj experimentální autoimunní encefalomyelitidy je doložena daty zobrazenými na obrázku 14.

I · « • · · • 9 · » · · · · ··· 9 9« • «

9 99

Ačkoli předcházející vynález byl popsán v některých detailech ilustrativním způsobem a příklady za účelem jasného porozumění, je samozřejmé, že v praxi mohou být provedeny určité změny a modifikace, které budou v rozsahu přiložených patentových nároků.

Všechny literární odkazy, které zde byly citovány, jsou začleněny v odkaze ve své celistvosti pro všechny účely.

Pr

Claims (17)

1. Použití protilátky anti-4-ΙΒΒ pro výrobu léčiva k supresi primární a sekundární humorální odpovědi na antigen.

2. Použití protilátky anti-4-ΙΒΒ podle nároku 1, pro výrobu léčiva k supresi primární a sekundární humorální odpovědi na antigen, který je dependentní na T-buňkách.

3. Použití monoklonální protilátky anti-4-ΙΒΒ podle nároku 1, pro výrobu léčiva k supresi primární a sekundární humorální odpovědi na antigen.

4. Použití protilátky anti-4-ΙΒΒ podle nároku 1, pro výrobu léčiva k supresi primární a sekundární humorální odpovědi na antigen, kde 4-1BB je 4-1BB homolog příjemce léčiva.

5. Použití z podstatné části humánní protilátky anti-4-ΙΒΒ podle nároku 1, pro výrobu léčiva k supresi primární a sekundární humorální odpovědi na antigen.

6. Použití protilátky anti-4-ΙΒΒ pro výrobu léčiva k blokování imunitní odpovědi dependentní na T-buňkách.

7. Použití monoklonální protilátky anti-4-lBB podle nároku 6, pro výrobu léčiva k blokování imunitní odpovědi dependentní na T-buňkách.

8. Použití v podstatě humánní protilátky anti-4-ΙΒΒ podle nároku 6, pro výrobu léčiva k blokování imunitní odpovědi dependentní na T-buňkách.

• · 0 0 0 0 • · · · 0 • 0 0 0

000 00 000

9. Použití protilátky anti-4-ΙΒΒ podle nároku 6, pro výrobu léčiva k blokování imunitní odpovědi dependentní na T-buňkách, kde 4-1BB je 4-1BB homolog příjemce léčiva.

·· 0000

10. Prostředek vyznačující se tím, nální protilátku 1D8.

že obsahuje monoklo

11. Prostředek vyznačující se tím, nální protilátku 3E1.

že obsahuje monoklo

12. Prostředek vyznačující se tím, nální protilátku 3H3.

že obsahuje monoklo

13. Prostředek obsahující protilátku anti-4-ΙΒΒ, vyznačující se tím, že protilátka inhibuje in vivo protilátkovou odpověď na ovčí erytrocyty.

14. Prostředek podle nároku 10, vyznačující se tím, že protilátka in vitro inhibuje vazbu ligandu na 4-1-BB.

15. Použití protilátky anti-4-ΙΒΒ podle nároku 1, pro výrobu léčiva ke zvýšení zabíjení nádorových buněk lymfocyty.

16. Použití protilátky anti-4-ΙΒΒ pro výrobu léčiva k potenciaci rozvoje cytotoxických T-buněk.

17. Použití protilátky anti-4-ΙΒΒ pro výrobu léčiva k léčbě Tbuněčného autoimunního onemocnění.