KR20030084992A

KR20030084992A - 감소된 면역원성을 갖는 개질 인터페론 베타

Info

Publication number: KR20030084992A
Application number: KR10-2003-7011997A
Authority: KR
Inventors: 카프랜시스제이; 카터그레이엄; 존스팀; 와킨즈존; 베이커매슈
Original assignee: 메르크 파텐트 게엠베하
Priority date: 2001-03-15
Filing date: 2002-03-15
Publication date: 2003-11-01
Also published as: WO2002074783A2; ZA200307992B; BR0208041A; HUP0303534A2; EP1368377A2; CN1496369A; MXPA03008310A; RU2003129072A; US7615615B2; US20050054052A1; US20090043076A1; JP2004529633A; HUP0303534A3; CA2441095A1; WO2002074783A3; US7381795B2; PL362870A1

Abstract

본 발명은 특히 인간에게 투여될, 특히 치료 용도의 폴리펩티드에 관한 것이다. 폴리펩티드는 개질된 폴리펩티드로써, 개질이 인간 대상에 대한 투여에서 면역 응답성을 나타내는 폴리펩티드에 대한 감소된 경향을 초래한다. 본 발명은 특별히 생체내 사용시 본질적으로 비면역원성이거나 또는 임의의 비개질 대응체보다 덜 면역원성인 단백질을 제공하는 인간 인터페론 베타의 개질에 관한 것이다.

Description

감소된 면역원성을 갖는 개질 인터페론 베타{MODIFIED INTERFERON BETA WITH REDUCED IMMUNOGENICITY}

치료적 단백질의 효능이 치료적 단백질에 대한 원치않는 면역 반응에 의해 제한되는 경우가 많이 있다. 일부 마우스 단일클론 항체들은 여러 인간 질환 설정에 있어서 치료법으로 유망하게 나타났지만, 일부 경우 심각한 정도의 인간 항-쥐과 (antimurine) 항체 (HAMA) 응답성의 유도로 인해 실패하였다 [Schroff, R. W. 등, (1985)Cancer Res.45: 879-885; Shawler, D. L. 등, (1985)J. Immunol.135: 1530-1535]. 단일클론 항체에 대해, HAMA 응답성을 감소시키기 위한 시도로여러 기술이 개발되고 있다 [WO 89/09622; EP 0239400; EP 0438310; WO 91/06667]. 이들 재조합 DNA 접근법으로 인해 일반적으로 최종 항체 구축물 내 마우스 유전 정보는 감소되었지만, 최종 구축물 내 인간 유전 정보는 증가되었다. 그럼에도 불구하고, 생성된 "인간화" 항체는 여러 경우에서 여전히 환자에게서 면역 반응을 유도하였다 [Issacs J. D. (1990)Sem. Immunol.2: 449, 456; Rebello, P. R. 등, (1999)Transplantation 68: 1417-1420].

항체가, 면역 반응을 일으킬 수 있는 치료제로서 투여되는 유일한 폴리펩티드 분자 클래스는 아니다. 인간 유래이고 인간에서 생성되는 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질도 여전히 인간에서 면역 응답성을 유도할 수 있다. 대표적인 예에는 그 중에서도 과립구-대식세포 집락 자극인자 [Wadhwa, M. 등, (1999)Clin. Cancer Res.5: 1353-1361] 및 인터페론 알파 2 [Russo, D. 등, (1996)Bri. J. Haem.94: 300-305; Stein, R. 등, (1988)New Engl. J. Med.318: 1409-1413] 의 치료적 용도가 포함된다.

면역 반응 유도의 주요 요인은 MHC 클래스 II 분자 상으로의 제시를 통해 T 세포의 활성을 자극할 수 있는 펩티드, 소위 "T 세포 에피토프" 의 단백질 내 존재성이다. 상기 잠재적인 T 세포 에피토프는 통상 MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 능력을 갖는 임의의 아미노산 잔기 서열로 정의된다. 상기 T 세포 에피토프는 MHC 결합의 성립으로 측정될 수 있다. 함축적으로는, "T 세포 에피토프" 는 MHC 분자에 결합하는 경우 T 세포 수용체 (TCR) 에 의해 인식될 수 있고, 최소한 원칙적으로 TCR 의 관여에 의해 상기 T 세포의 활성화를 유도하여 T 세포 응답성을 자극할 수 있는 에피토프를 의미한다. 그러나, 보통은 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 것으로 발견된 특정 펩티드들은, 상기 펩티드가 최종 단백질이 투여되는 유기체 내에서 "자가" 로 인식되기 때문에 단백질 서열 내에 보유될 수 있는 것으로 이해된다.

특정한 상기 T 세포 에피토프 펩티드는 세포 내에서 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 분해 도중 방출되고, 이어서 주 조직적합 복합체 (major histocompatability complex, MHC) 의 분자에 의해 제시되어 T 세포의 활성화를 유발시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다. MHC 클래스 II 에 의해 제시되는 펩티드에 있어서, T 세포의 상기 활성화는 이어서, 예를 들어 B 세포의 직접적 자극에 의한 항체 응답성을 일으켜서 상기 항체를 생산하도록 할 수 있다.

MHC 클래스 II 분자는 헬퍼 T 세포의 선별 및 활성화에 중요한 역할을 담당하는 매우 다형성인 단백질군이다. 인간 백혈구 항원군 DR (HLA-DR) 가 상기 단백질군의 주요 이종형 (isotype) 이며, 본 발명에서 주로 초점을 맞추고 있다. 그러나, 이종형 HLA-DQ 및 HLA-DP 도 유사한 기능을 수행하므로, 본 발명은 상기물에도 대등하게 적용가능하다. MHC 클래스 II DR 분자는 세포막을 통해 이들의 C 말단에서 삽입되는 알파 및 베타 사슬로 이루어진다. 각각의 이종이합체 (hetero-dimer) 는 펩티드에 결합하는 길이 9 내지 20 개 아미노산의 리간드 결합 도메인을 보유하지만, 결합 그루브 (groove) 는 최대 11 개 아미노산을 수용할 수 있다. 리간드 결합 도메인은 알파 사슬의 1 내지 85 개 아미노산 및 베타 사슬의 1 내지 94 개 아미노산으로 구성된다. 최근에 DQ 분자는 상동 구조를 갖는 것으로 나타났고, DP 군의 단백질도 또한 매우 유사한 것으로 추정된다. 인간에서는 DR 이종형에 대해서는 대략 70 개의 상이한 동종이형 (allotype) 이 공지되어 있고, DQ 에 대해서는 30 개의 상이한 동종이형이 있으며, DP 에 대해서는 47 개의 상이한 동종이형이 공지되어 있다. 각 개인은 2 내지 4 개의 DR 대립유전자 (allele), 2 개의 DQ 및 2 개의 DP 대립유전자를 갖는다. 여러 DR 분자의 구조가 밝혀져 있고, 상기 구조는 펩티드의 소수성 잔기 (포켓 잔기) 가 관여되는 여러 소수성 포켓을 갖는 개방말단 펩티드 결합 그루브를 나타낸다 [Brown 등,Nature(1993)364: 33; Stern 등, (1994)Nature 368: 215]. 클래스 II 분자의 상이한 동종이형을 나타내는 다형성(polymorphism) 은 펩티드 결합 그루브 내에서 펩티드에 대한 상이한 결합 표면의 상당한 다양성에 기여하며, 집단 수준에서는 외래 단백질을 인식하고 병원성 유기체에 대해 면역 반응을 유발하는 능력에 대해 최대 유연성을 보장한다.

상이한 지리학적 인구집단 및 인종군 내 별개의 "패밀리"에 따라 리간드 결합 도메인 내에 상당한 다형성이 존재한다. 상기 다형성은 펩티드 결합 도메인의 결합 특징에 영향을 미쳐서, DR 분자의 상이한 "패밀리" 는 상이한 서열 특성을 갖는 펩티드에 대해 특이성을 가질 것이지만, 일부 중복이 있을 수 있다. 상기 특이성이 Th-세포 에피토프가 유도된 것과 동일한 단백질 상에 존재하는 B 세포 에피토프에 대한 항체 응답성을 유도하는 데 궁극적으로 관여하는 Th-세포 에피토프의 인식 (클래스 II T 세포 응답성) 을 결정한다. 따라서, 개인에서의 단백질에 대한 면역 응답성은, 개인의 HLA-DR 동종이형의 펩티드 결합 특이성의 기능인 T 세포에피토프 인식에 의해 크게 영향을 받는다. 그러므로, 세계 인구집단 차원에서 단백질 또는 펩티드 내의 T 세포 에피토프의 동정을 위해서는, 가능한 한 다양한 HLA-DR 동종이형 세트의 결합 특성을 고려하여, 가능한 한 높은 백분율의 세계 인구를 포함하는 것이 바람직하다.

INFβ와 같은 치료적 단백질에 대한 면역 응답성은 MHC 클래스 II 펩티드 제시 경로를 통해 진행된다. 여기에서, 외인성 단백질이 포획되고, DR, DQ 또는 DP 유형의 MHC 클래스 II 분자와의 연합된 제시를 위해 처리된다. MHC 클래스 II 분자는 그 중에서도 대식세포 및 수지상 세포와 같은 전문적인 항원 제시 세포 (APC) 에 의해 발현된다. CD4 분자와 같은 특정한 기타 공수용체 (coreceptor) 의 교차 결합과 함께, T 세포 표면 상의 동족 (cognate) T 세포 수용체에 의한 MHC 클래스 II 펩티드 복합체의 참여는 T 세포에서의 활성화 상태를 유도할 수 있다. 활성화는 B 세포와 같은 기타 임파구를 추가 활성화시키는 싸이토카인을 방출시켜, 항체를 생산시키거나 완전 세포성 면역 응답성으로서 T 킬러 세포를 활성화시킨다.

APC 표면 상의 제시를 위해 주어진 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 펩티드의 능력은 여러 요인, 가장 중요하게는 그 일차 서열에 의존한다. 이는, 그 단백분해 절단에 대한 경향 및 MHC 클래스 II 분자 상의 펩티드 결합 틈 (cleft) 내에서의 결합에 대한 그 친화도 두가지 모두에 영향을 미칠 것이다. APC 표면 상의 MHC 클래스 II/펩티드 복합체는 노출된 펩티드 잔기 및 MHC 클래스 II 분자 모두에 의해 제공되는 결정기를 인식할 수 있는 특정 T 세포 수용체 (TCR) 에 결합면을 제시한다.

당 분야에는, MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 합성 펩티드를 동정하는 절차가 있다 (예, W098/52976 및 WO00/34317). 상기 펩티드는 모든 상황에서, 특히 생체 내에서, 진행 경로 또는 기타 현상으로 인해 T 세포 에피토프로 작용하지 못할 수 있다. T 세포 에피토프 동정이 에피토프 제거의 제 1 단계이다. 단백질로부터의 잠재적인 T 세포 에피토프의 동정 및 제거에 대해서는 이미 개시되어 있다. 당 분야에서, 통상 실험적으로 결정된 T 세포 에피토프에서 인식된 서열 모티브를 스캐닝 (scanning) 하는 컴퓨터 수단에 의해 T 세포 에피토프의 검출이 가능하도록 하는 방법, 또는 이와는 달리 컴퓨터 기술을 사용하여 MHC 클래스 II-결합 펩티드 및 특히 DR-결합 펩티드를 예측하는 방법이 제공되었다.

W098/52976 및 WO00/34317 은 인간 MHC 클래스 II DR 동종이형의 하위 세트에 결합할 수 있는 잠재성을 가진 폴리펩티드 서열을 동정하기 위한 컴퓨터 분석 접근법을 교시하고 있다. 상기 교시에서, 예측된 T 세포 에피토프는 비인간 및 인간 유래 두가지의 치료적 항체 또는 비항체 단백질의 일차 서열 내에서의 적절한 아미노산 치환을 이용하여 제거된다.

인간 또는 실험 동물 대상체의 말초 혈액 시료로부터의 T 세포 클론에 결합할 수 있는, 합성 펩티드와 조합된 재조합 MHC 분자의 가용성 복합체를 개발하기 위한 기타 기술이 당 분야에서 사용되어 왔다 [Kern, F. 등, (1998)Nature Medicine 4: 975-978; Kwok, W. W. 등, (2001)TRENDS in Immunology 22: 583-588]. T 세포와 결합하거나 또는 자극할 수 있는 개질된 능력을 가진 분자에 대해 스크리닝된 전체 INFβ 단백질 또는 INFβ유도 합성 펩티드 또는 그의 개질 분자의 이용과 같은 예를 포함하는 상기 및 다른 개념이 에피토프 동정 전략에서 개발될 수 있다.

상기에 서술된 바와 같이, 그리고 그 결과로서, 원칙적으로 치료적으로 유용하지만 원래는 면역원성인 주어진 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 T 세포 에피토프를 동정하고, 제거하거나 또는 최소한 감소시키는 것이 바람직할 것이다.

상기 치료적으로 유용한 분자들 중 하나는 INFβ이다. 상기 분자는 중요한 생물학적 및 면역학적 활성을 가진 166 아미노산 잔기의 단일쇄 당단백질이다. 단백질은 인간에서 항바이러스, 항증식 및 면역조절제 (immunomodulating agent) 로서 중요한 치료적 잠재성을 갖는다. 재조합 INFβ의 시판되는 원이 다수 있으며, 이에는 AVONEXO(Biogen, Inc. (Cambridge, MA, USA) 제조); Rebif(Serono Internationa (Geneva, Switzerland) 제조) 및 Betaseron(Chiron Corporation (Emeryville, CA, USA) 제조) 가 포함된다. AVONEXO및 Rebif의 아미노산 서열은 천연 인간 INFβ의 것과 동일하며, 두 제품이 모두 당화되어 있다. 대조적으로, Betaseron은E. coli발현 숙주로부터 제조되며, 시스테인 17 가 세린 잔기로 돌연변이된 INFβ의 돌연변이 형태이다. 이는 분자량이 18500 인 165 개 아미노산의 비당화 단백질이다.

완전한 인간 INFβ 단백질은 분자량이 22500 인 166 개 아미노산의 단일 폴리펩티드이며, 적혈구 및 대식세포를 포함하는 각종 유형의 세포에 의해 생산된다.

인간 INFβ (1 문자 코드로 표시됨) 의 아미노산 서열은 하기와 같다:

다른 이들은 Runkel 등 [Runkel, L 등 (2000)Biochemistry39: 2538-2551] 에 의해 기재된 일련의 알라닌 스캐닝 돌연변이 및 Betaseron을 포함하는 돌연변이 및 비당화 형태와 같은 개질 INFβ를 포함하는 INFβ분자를 제공했다. 다른 예들에는 US,4,588,585 및 US,6,127,332 에 기재된 것이 포함되나, 상기 교시들 중 어느 것도 단백질의 면역원적 특성에 대한 T 세포 에피토프의 중요성을 인식하지 못했고, 본 발명의 주제에 따른 특이적이며 제어되는 방식으로 상기 특성에 직접 영향을 미치는 것에 대해서는 인식하지 못했다.

그러나, 증강된 특성을 갖는 INFβ유사체에 대한 지속적인 요구가 존재한다. 요망되는 증강에는 상기 치료물의 발현 및 정제에 대한 대안적인 방법 및 양식 뿐만 아니라, 특히 단백질의 생물학적 특성의 개선이 포함된다. 특히 인간 대상체에 투여될 경우 생체 내 특성의 증강에 대한 요구가 존재한다. 이와 관련하여, 인간 대상체에서 면역 응답성을 유도할 잠재성이 감소되거나 없는 INFβ를 제공하는 것이 크게 요망된다.

본 발명은 치료용으로, 특히 인간에게 투여되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 폴리펩티드는 개질된 폴리펩티드로써, 개질은 인간 대상체에 대한 투여 상의 면역 응답성을 나타내는 폴리펩티드에 대한 감소된 성향을 초래한다. 본 발명은 특히 생체내 사용되는 경우 임의의 비개질 대응체에 비해 덜 면역원성이거나 또는 본질적으로 비면역원성인 INFβ 단백질 변이체를 초래하는 인간 인터페론 및 구체적으로는 인간 인터페론 베타 (INFβ) 의 개질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 감소된 면역원성을 가진 개질 INFβ변이체를 생성할 수 있는 수단으로 유도된 T 세포 에피토프 펩티드에 관한 것이다.

발명의 개요 및 설명

본 발명은 인간 인터페론 베타 1a 형 (본원에서 "INFβ" 로 명명됨) 의 개질형태를 제공하며, 여기에서 면역 특성은 잠재적인 T 세포 에피토프들 갯수의 감소 또는 제거에 의해 개질된다.

본 발명은 MHC 클래스 II 결합 잠재능에 의해 잠재적인 T 세포 에피토프인 INFβ일차 서열 내에서 동정된다. 본 개시는 특히 166 개의 아미노산 잔기들인 인간 INFβ단백질에 관한 것이다. 본 발명은 원칙적으로 생물학적 활성을 최대한 유지하면서, 본 발명에 따라 분자의 일차 서열 내에서 특정 아미노산 치환, 부가 또는 결실에 의해 변경되는 특정 위치들을 개시한다. 면역원성의 손실이 생물학적 활성의 동시 손실에 의해서만 달성될 수 있는 경우, 단백질의 아미노산 서열 내의 추가 변경에 의해 상기 활성을 회복하는 것이 가능하다.

또한 본 발명은 상기 개질 분자의 제조방법을 개시하며, 무엇보다도 면역원적 부위를 감소시키거나 또는 제거하기 위한 변경에 필요한 상기 T 세포 에피토프 동정 방법을 개시한다.

본 발명에 따른 단백질은 인간 대상체 내에서 증가된 순환 시간을 나타낼 것으로 예측되며, INFβ 에 대한 다수의 적응증에 대한 경우에서와 같이 만성 또는 재발성 질병 상황에서 특히 유리할 것이다. 본 발명은 생체 내에서 증강된 특성을 나타내는 것으로 예측되는 INFβ 단백질의 개질된 형태를 제공한다. 본 발명은 인간에서 면역원성인 INFβ1 차 서열의 주요 부분을 개시하며, 상기 부위의 면역원성 효과를 제거하거나 또는 감소시키는 상기 서열의 개질을 제공한다. 한 구현예에서, 상기 면역원성 영역을 포함하는 합성 펩티드는 모든 분자에 대한 관용원성 응답성을 개선시키기 위한 약제학적 조성물에 제공될 수 있다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 개질된 INFβ분자는 약제학적 조성물에 사용될 수 있다.

요약하면, 본 발명은 하기에 관한 것이다:

인간 인터페론 베타 (INFβ) 의 생물학적 활성을 가지며, 생체내에 사용되는 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자보다 덜 면역원성이거나 또는 본질적으로 비면역원성인 개질 분자;

상기 면역원성의 상기 소실이 본래의 비개질 분자로부터 유도되는 하나 이상의 T 세포 에피토프의 제거에 의해 달성되는 해당 특정 분자;

면역원성의 상기 소실이, 상기 분자로부터 유도되는 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 동종이형 수의 저감에 의해 달성되는 해당 특정 분자;

하나의 T 세포 에피토프가 제거되는 해당 특정 분자;

상기 본래 존재하는 T 세포 에피토프가 MHC 클래스 II 상에 존재함으로써 T 세포를 자극하거나 또는 결합하는 능력을 나타내는 펩티드 서열 또는 MHC 클래스 II 리간드인 해당 특정 분자;

상기 펩티드 서열이 도 1 에 도시된 군으로부터 선택되는 해당 특정 분자;

본래 존재하는 임의의 T 세포 에피토프 중 1 - 9 개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 한 아미노산 잔기가 변경된 해당 특정 분자;

아미노산 잔기의 변경이 특정 위치(들)에서의 다른 아미노산 잔기(들)에 의한 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 치환, 부가 또는 결실인 해당 특정 분자;

하나 이상의 아미노산 잔기 치환이 도 2 에 나타낸 바와 같이 수행되는해당 특정 분자;

하나 이상의 아미노산 잔기 치환이, 도 3 에 나타낸 바와 같이 수행되어 상기 분자로부터 유도된 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 갯수가 감소되는 해당 특정 분자;

하나 이상의 아미노산 잔기 치환이 도 4 에 나타낸 바와 같이 수행되는 해당 특정 분자;

필요한 경우, 일반적으로 특정 아미노산(들)의 치환, 부가 또는 결실에 의한 부가적인 추가의 변경이 상기 분자의 생물학적 활성을 보존하도록 수행되는 해당 특정 분자;

야생형 INFβ서열로부터 유도된 서열 (a)및/또는 (b)의 연속적인 잔기의 스트링으로부터 하나 이상의 잔기에서 변경이 수행되는 해당 특정 분자;

상기 임의의 서열 (a) 또는 (b) 로부터의 13 - 15 개의 연속 잔기를 함유하는 펩티드 분자.

상기 임의의 서열 (a) 또는 (b) 로부터의 9 개 이상의 연속 잔기를 함유하는 펩티드 분자.

상기 서열 (a) 또는 (b) 로부터 유도된 임의의 펩티드와 90% 이상의 아미노산 상동성을 갖는 상기 펩티드 분자;

상기 서열 (a) 또는 (b) 로부터 유도된 임의의 펩티드와 80% 이상의 아미노산 상동성을 갖는 상기 펩티드 분자;

MHC 클래스 II 에 결합할 수 있는 상기 펩티드 서열;

하나 이상의 아미노산 치환이 상기 서열 (a) 내 특이적인 임의의 아미노산에 상응하는 위치에서 수행되는 해당 특정 INFβ분자;

하나 이상의 아미노산 치환이 상기 서열 (b) 내 특이적인 임의의 아미노산에 상응하는 위치에서 수행되는 해당 특정 INFβ분자;

하나 이상의 아미노산 치환이 상기 서열 (a) 또는 (b) 내 특이적인 임의의 아미노산에 상응하는 위치에서 수행되는 해당 특정 INFβ분자;

하기 서열로 이루어진, 감소된 면역원성을 갖는 개질 인간 인터페론 베타 (INFβ):

(서열 중, X⁰는 C, S 이며; X¹는 F, A 이며; X²는 L, A 이며; X³는 I, A 이며; X⁴는 Y, N 이며; X⁵는 M, A 이며; X⁶는 L, A 이며; X⁷는 I, T 이며; X⁸는 F, H 이며; X⁹는 I, A 이며; X¹⁰은 F, A 이며;

여기서, 동시에 X¹= F, X²= L, X³= I, X⁴= Y, X⁵= M, X⁶= L, X⁷= I, X⁸= F, X⁹= I 및 X¹⁰= F 인 것은 제외된다 (상기 제외된 것은 면역원적으로 비개질된공지된 INFb 변이체로 기재되었다));

하기 서열로 이루어지는 감소된 면역원성을 갖는 개질된 인간 인터페론 베타 (INFβ):

(서열 중, X⁰는 C, S 이며; X¹는 Y, A 이며; X²는 Y, A 이며; X³는 I, A 이며; X⁴는 L, A 이며; X⁵는 Y, S 이며; X⁶는 L, A 이며; X⁷는 Y, H, A 이며; 여기서 동시에 X¹= Y, X²= Y, X³= I, X⁴= L, X⁵= Y, X⁶= L 및 X⁷= Y 인 것은 제외된다 (상기 제외된 것은 면역원적으로 비개질된 공지된 INFb 변이체로 기재되었다)).

잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖고, 비개질 INFβ의 1 차 서열로부터 제작된 9 - 15 개의 연속 아미노산 잔기로 이루어지는 INF 베타 분자로써, 펩티드에 의한 자극에 의해 스코어링된 세포 증식값을, 수용자 펩티드에서가 아닌, 대조군 세포에서 스코어링된 세포 증식값으로 나누어 (상기 세포 증식은 임의의 적합한 수단으로 측정된다) 구하는 세포 증식의 생물학적 검정에서의 자극 지수가 1.8 이상, 바람직하게는 1.8 - 2, 더욱 바람직하게는 > 2 인 9 - 15 개의 연속 아미노산 잔기로 이루어지는 IFN 베타 분자.

MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 임의의 상기 펩티드 또는 개질 펩티드를함유하는 약제학적 조성물;

상기 및 하기에 정의된 임의의 특이적으로 개질된 분자를 코딩하는 DNA 서열 또는 분자;

INFβ의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자를 함유하는 약제학적 조성물;

임의로는 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 상기 및/또는 청구범위에서 정의된 약제학적 조성물;

하기 단계를 포함하는, 상기 인용된 청구범위의 임의의 청구항에서 정의된 바와 같은 INFβ의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자의 제조 방법: (i) 폴리펩티드 또는 그의 일부의 아미노산 서열의 결정 단계; (ii) 시험관내 또는 전산 기술 또는 생물학적 검정을 이용해, 펩티드의 MHC 분자에 대한 결합의 결정을 포함하는 임의의 방법에 의한 단백질의 아미노산 서열 내 하나 이상의 잠재적인 T 세포 에피토프의 동정 단계; (iii) 시험관내 또는 전산 기술 또는 생물학적 검정을 이용하여, 동정되는 펩티드의 MHC 분자로의 결합에 의해 결정된 바와 같은 T 세포 에피토프의 활성을 본질적으로 감소시키거나 또는 제거하는 방식으로 개질된 잠재적인 T 세포 에피토프 내에 하나 이상의 아미노산을 가진 신규한 서열 변이체의 고안 단계; (iv) 재조합 DNA 기술에 의한 상기 서열 변이체의 구축 및 요망되는 특성을 가진 하나 이상의 변이체를 동정하기 위한 시험 단계; 및 (v) 단계 (ii) - (iv) 의 임의 반복 단계;

단계 (iii) 이 본래 존재하는 임의의 T 세포 에피토프의 1 - 9 개의 아미노산 잔기의 치환, 부가 또는 결실에 의해 수행되는 해당 특정 방법;

변경이 동종 단백질 서열을 이용하고/이용하거나 전산적 모델링 기술로 수행되는 해당 특정 방법;

단계 (ii) 가 하기 단계로 수행되는 해당 특정 방법: (a) 공지된 아미노산 잔기 서열을 갖는 펩티드의 영역 선별 단계; (b) 후속적으로, 예정된 단일 크기의, 선별된 영역으로부터의 3 개 이상의 아미노산 잔기로 이루어지는 중복 아미노산 잔기 절편의 샘플링 단계; (c) 상기 샘플링된 아미노산 잔기 절편에 존재하는 각각의 소수성 아미노산 잔기 측쇄에 대해 정해진 값을 합하는, 각각의 상기 샘플링된 절편에 대한 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어의 계산 단계; 및 (d) 펩티드의 치료적 유용성을 본질적으로 감소시키지 않고 펩티드에 대한 전체적인 MHC 클래스 II 결합 스코어를 변화시키기 위해, 상기 절편에 대해 계산된 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어를 기준으로, 개질에 적합한 하나 이상의 상기 절편의 동정 단계; 여기서, 단계 (c) 가 바람직하게는 하기에 의해 12 - 6 반 데르 발스 (van der Waal's) 리간드-단백질 에너지 반발 항 및 리간드 배치 에너지 항을 포함하도록 변형된 봄 스코어링 함수를 사용하여 수행된다: (1) MHC 클래스 II 분자 모델을 근거로 하는 첫번째 데이타 베이스의 제공; (2) 상기 MHC 클래스 II 분자 모델에 대해 허용된 펩티드 골격을 근거로 하는 두번째 데이타 베이스의 제공; (3) 상기 첫번째 데이타 베이스로부터의 모델의 선택; (4) 상기 두번째 데이타 베이스로부터 허용되는 펩티드 골격의 선택; (5) 각각의 샘플링된 절편에 존재하는 아미노산 잔기 측쇄의 동정; (6) 각각의 샘플링된 절편에 존재하는 모든 측쇄에 대한 결합 친화성의 결정; 및 각각의 상기 모델 및 각각의 상기 골격에 대한 (1) 내지 (5) 의 반복.

잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 가지며, 도 1 에 도시된 군으로부터 선택되는, 비개질 INFβ로부터 제조되는 13 머 T 세포 에피토프 펩티드, 및 생체내 사용시 동일한 생물학적 활성을 가지면서, 면역원성이 없거나 또는 임의의 비개질 분자보다 덜 면역원성인 INFβ 제조를 위한 그의 용도;

상기 기재된 바와 같은 13 머 T 세포 에피토프 펩티드의 9 개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드 서열, 및 생체내 사용시 인간 인터페론 β와 동일한 생물학적 활성을 가지면서, 면역원성이 없거나 또는 임의의 비개질 분자보다 덜 면역원성인 INFβ 제조를 위한 그의 용도;

상기 정의된 임의의 서열 (a) 또는 (b) 로부터 선택되는, 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 가지며, 비개질 INFβ로부터 제조되는 13 머 T 세포 에피토프 펩티드, 및 생체내 사용시 인간 인터페론 β 와 동일한 생물학적 활성을 가지면서, 면역원성이 없거나 또는 임의의 비개질 분자보다 덜 면역원성인 인간 인터페론 β 제조를 위한 그의 용도;

상기 정의된 임의의 (a) 또는 (b) 의 기로부터 유도되는 13 머 T 세포 에피토프 펩티드의 9 개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드 서열, 및 생체내 사용시 인간 인터페론 β 와 동일한 생물학적 활성을 가지면서, 면역원성이 없거나 또는 임의의 비개질 분자보다 덜 면역원성인 인간 인터페론 β 제조를 위한 그의 용도.

"T 세포 에피토프" 라는 용어는 본 발명의 이해에 따라 MHC 클래스 II 에 결합할 수 있고, T 세포를 자극하고/하거나 또한 MHC 클래스 II 와 조합되어 T 세포와 결합할 수 있는 (반드시 측정가능한 정도로 활성화시킬 필요는 없음) 아미노산 서열을 의미한다.

본원 및 첨부되는 청구범위에서 사용되는 "펩티드" 라는 용어는, 2 개 이상의 아미노산을 포함하는 화합물이다. 아미노산은, (본원에서 하기에 정의되는) 펩티드 결합에 의해 함께 연결된다. 펩티드의 생물학적 생산에 관여하는 20 개의 상이한 천연 발생 아미노산이 존재하며, 이들의 임의의 갯수를 임의의 순서로 연결하여 펩티드 사슬 또는 고리를 형성할 수 있다. 펩티드의 생물학적 생산에 사용되는 천연 발생 아미노산은 모두 L 배치를 갖는다. 합성 펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 2 가지 상이한 배치의 아미노산의 다양한 조합을 이용하는 통상적 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 펩티드는 소수의 아미노산 단위만을 함유한다. 짧은 펩티드, 예컨대 10 개 미만의 아미노산 단위를 갖는 것들을 때로 "올리고펩티드" 로 부른다. 기타 펩티드는 다수의 아미노산 잔기, 예컨대 100 개 전후인 것이 포함되며, "폴리펩티드" 로 명명된다. 통상적으로, "폴리펩티드" 는 3 개 이상의 아미노산을 함유하는 임의의 펩티드 사슬로 간주될 수 있는 반면, "올리고펩티드" 는 통상적으로 "짧은" 폴리펩티드의 특정 유형으로 간주된다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리펩티드" 에 대한 모든 언급은 올리고펩티드도 포함하는 것으로 이해된다. 또한, "펩티드" 에 대한 모든 언급은 폴리펩티드, 올리고펩티드, 및 단백질을 포함한다. 각각의 상이한 아미노산 배열은 상이한 폴리펩티드 또는 단백질을 형성한다. 형성될 수 있는 폴리펩티드의 갯수 - 따라서 상이한 단백질의 갯수는 실제로 무한하다.

"알파 탄소 (Cα)" 는 펩티드 사슬 내에 있는 탄소-수소 (CH) 성분의 탄소 원자이다. "측쇄" 는 펩티드의 크기에 비해 상당히 다양할 수 있는 물리적 크기를 갖는, 단순하거나 복잡한 기 또는 부분을 구성할 수 있는 Cα에 대한 펜던트 기이다.

본 발명은 여기 개시된 것과 같은 일차 아미노산 서열들과 실질적으로 동일한 임의의 INFβ분자에 적용될 수 있으며, 따라서 유전공학적 수단 또는 기타 방법에 의해 유도된 INFβ 분자를 포함하고, 166 개 이상 또는 이하의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다.

기타 포유류 원으로부터 동정되는 것과 같은 INFβ 단백질들은 본 개시의 다수의 펩티드 서열을 공통적으로 갖고, 개시된 서열목록의 것들과 실질적으로 동일한 서열을 갖는 다수의 펩티드를 공통적으로 갖는다. 따라서, 이러한 펩티드 서열들은 균등하게 본 발명의 범주에 속하는 것이다.

본 발명에서는 자가 유기체 내로 도입된 가용성 단백질이 면역반응을 촉발시켜 상기 가용성 단백질에 결합하는 숙주 항체들의 발생을 일으킬 수 있다는 실질적인 문제를 극복하는 것이 고려되었다. 다른 것들 중 이 현상의 두드러진 예는, 인터페론 알파 2 (INFα2) 의 임상적 사용이다. INFα2 가 내생적으로 생산됨에도 불구하고, 상당한 비율의 INFα2 처리 인간 환자들이 항체를 생성한다 [Russo, D. 등 (1996)ibid; Stein, R. 등 (1988)ibid]. INFβ의 임상적 사용이 또한, 인간에게서 적어도 상동인 1 차 구조의 분자가 내생적으로 제조된다는 사실에도 불구하고, INFβ에 대한 면역 응답성의 발생이 초래된다는 것도 공지되었다[Kivisakk, P. 등 (2000)Eur. J. Neurol.7: 27 - 34; Myhr, K.M. 등 (2000)Neurology 55: 1569 - 1572]. 본 발명은 인간 숙주에게 투여시 면역 응답성을 나타내는 성향이 변경된 INFβ 단백질을 제공하고자 하는 것이다. 여기 기재된 방법에 따라, 본 발명자들은 상기 자가 단백질에 대해 면역 응답성을 일으키는 중요한 T 세포 에피토프를 함유하는 INFβ 분자의 영역을 발견하여, 여기에 개시하였다.

개질 INFβ 를 수득하는 본 발명의 일반 방법은 하기 단계를 포함한다:

(a) 폴리펩티드 또는 이의 일부의 아미노산 서열의 결정;

(b) 시험관 내 또는 전산 기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드와 MHC 분자의 결합 측정을 포함하는 임의 방법에 의한, 단백질의 아미노산 서열 내의 1 개 이상의 잠재적인 T 세포 에피토프의 동정;

(c) 시험관 내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 검정을 이용하는 펩티드와 MHC 분자의 결합에 의해 측정되는 T 세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소 또는 제거시키는 방식으로 개질된, 동정된 잠재적 T 세포 에피토프 내에 1 개 이상의 아미노산을 갖는 신규 서열 변이체의 고안. 상기 서열 변이체는 서열 변이에 의한 새로운 잠재적 T 세포 에피토프의 생성을 회피하는 방식으로 생성되는데, 새로운 잠재적 T 세포 에피토프가 다시 T 세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 방식으로 개질되지 않는 한, 그렇게 된다; 및

(d) 재조합 DNA 기술에 의한 상기 서열 변이체의 구축, 및 널리 공지된 재조합 기술에 따라 목적하는 특성을 갖는 1 개 이상의 변이체를 동정하기 위한 상기변이체의 시험.

단계 (b) 에 따른 잠재적인 T 세포 에피토프의 동정은 선행 기술에 미리 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 적합한 방법은 WO 98/59244; WO 98/52976; WO 00/34317 에 개시되어 있으며, 바람직하게는 MHC 클래스 II 분자에 대한 INFβ-유래 펩티드의 결합 성향을 확인하는 데 사용될 수 있다.

계산에 의한 T 세포 에피토프 동정에 매우 효과적인 또다른 방법이 본 발명에 따른 바람직한 구현예인 실시예 1에 기재되어 있다.

실제로, 여러 변이체 INFβ 단백질이 제조되고, 목적하는 면역 및 기능적 특징에 대해 평가될 것이다. 변이체 단백질은 가장 바람직하게는 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 것이지만, INFβ 단편의 화학적 합성을 포함하는 기타 방법도 포함될 수 있다. 화학적 합성은, 예를 들어, 본 발명의 특별한 구현예를 포함하는, 본원에서 개시된 R1 또는 R2 서열 원소와 같이 짧은 INFβ의 제조에 특히 유용하다.

166 개의 아미노산 잔기들의 인간 INFβa 단백질 서열에 관한, 상기 방법의 단계 (b) 에 따른 분석 결과를 도 1 에 나타내었다. 본 발명의 개질 분자에 관한, 상기 방법의 단계 (c) 및 (d) 에 따른 고안 및 구조의 결과를 도 2 및 도 3 에 나타내었다.

본 발명은, 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환이 단백질로부터 하나 이상의 잠재적인 T 세포 에피토프의 활성의 실질적인 감소 또는 제거를 일으키는 위치에서 이루어진 INFβ 유사체에 관한 것이다. 도 1 에 나타낸 임의의 잠재적인 MHC 클래스 II 리간드 내의 특정 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환은 인간 숙주에 대해 치료제로서 투여된 경우 감소된 면역원성 잠재성을 갖는 INFβ 분자를 생성한다.

가장 바람직하게는 아미노산 개질 (예로서, 치환) 이 모 분자의 가장 면역원성인 영역 내에서 수행되는 INFβ 분자가 제공된다. 본 발명자들은 본원에서 인간에서 INFβ 분자의 가장 면역원성인 영역이 하기 아미노산 서열을 각각 포함하는 R1 및 R2 의 두 영역에 한정된다는 것을 발견하였다;및. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에는, 도 1 에 도시된 MHC 클래스 II 리간드에 대한 INFβ분자 및 임의의 상기 서열 원 R1 또는 R2 전체 또는 최소 9 개의 아미노산 잔기에서의 일렬로 배열한 INFβ분자를, 결합이 제거되도록 변경시키거나 또는 펩티드가 결합할 수 있는 MHC 동종이형체의 수를 감소시키도록 변형하는 것이 포함된다.

본 발명의 바람직한 구현예는 도 4 의 특정 치환들을 포함한다. 특히 바람직하게는 도 4 로부터의 치환의 조합을 포함하는 개질 INFβ 분자들을 제공한다. 각각의 면역원성 영역 R1 및 R2 내에서의 다중 (1 초과) 개질을 포함하는 조합이 바람직하며, 동일 분자 내의 R1 및 R2 모두에 대한 개질을 함유하는 조합이 특히 바람직하지만, 이러한 선호는 바람직한 것으로 고려되는 치환의 조합을 한정하고자 하는 것은 아니다.

T 세포 에피토프의 제거를 위해, 아미노산 치환은 바람직하게는 T 세포 에피토프의 활성의 제거 또는 실질적인 감소를 달성할 것으로 예측되는 펩티드 서열 내에 적절한 위치에서 이루어진다. 실질적으로 적절한 위치는 바람직하게는 MHC 클래스 II 결합 그루브 내에 제공되는 포켓들 중 하나 내로의 아미노산 잔기의 결합에 해당할 것이다.

펩티드의 소위 P1 또는 P1 고정 위치에서의 틈(cleft)의 제 1 포켓 내로의 결합을 변경하는 것이 가장 바람직하다. 펩티드의 P1 고정 잔기와 MHC 클래스 II 결합 그루브의 제 1 포켓간의 결합 상호작용의 성질은 전체 펩티드에 대한 전체 결합 친화도의 주요 결정인자로서 인식된다. 펩티드의 이 위치에서의 적절한 치환은 포켓 내에 보다 덜 용이하게 수용되는 잔기일 것이며, 예로서 보다 친수성 잔기로의 치환이다. MHC 결합 틈 내의 다른 포켓 영역 내에서의 결합에 균등한 위치에서의 펩티드 중의 아미노산 잔기들도 고려되며, 본 발명의 범주에 속한다.

잠재적인 T 세포 에피토프 내의 단일 아미노산 치환은 에피토프가 제거될 수 있는 가장 바람직한 경로인 것으로 이해된다. 단일 에피토프 내의 치환의 조합이 고려될 수 있으며, 예로서 개별적으로 정의된 에피토프들이 서로 중복되는 곳이 특히 적절할 수 있다. 또한, 아미노산 치환은 소정의 에피토프 내에서 단독으로 또는 단일한 에피토프 내에서 조합되어, MHC 클래스 II 결합 그루브에 대한 "포켓 잔기들"에 대등한 위치가 아닌, 펩티드 서열 내의 임의의 지점에서 이루어질 수 있다. 치환은 상동성 구조를 참조하여, 또는 당 기술분야에서 알려진 전산 기술을 사용하여 생성되는 구조적 방법으로 이루어질 수 있으며, 본 발명에 따른 분자의공지된 구조적 특징들에 근거할 수 있다. 이러한 모든 치환은 본 발명의 범주에 속하는 것이다.

열거된 펩티드 내에서 이루어진 치환(들)과 조합하여 이루어지는 경우, 특히 상기 나타낸 펩티드 내에서의 치환 외의 아미노산 치환이 고려될 수 있다. 예로서, 변이체 분자의 구조 또는 생물학적 활성을 보존하도록 하는 변화가 고려될 수 있다. 이러한 보상적 변화 및 개시된 펩티드들 중의 임의의 변화와 조합된, 요망되는 활성을 갖는 변이체를 생성하는 INFβ 폴리펩티드로부터의 특정 아미노산 잔기들의 결실 또는 부가를 포함하는 변화들은 본 발명의 범주에 속한다.

본 발명이 개질 INFβ에 관한 것인 한, 상기 개질 INFβ 단백질 또는 개질 INFβ 단백질의 단편을 함유하는 조성물 및 관련 조성물은 본 발명의 범주에 속하는 것으로 생각되어야 한다. 다른 측면에서, 본 발명은 개질 INFβ 실체를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 측면에서, 본 발명은 개질 INFβ 단백질을 사용하는 인간의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 측면에서, 서열 R1 또는 R2 로서 본원에 개시된 서열과 서열 상동성 또는 부분 상동성을 가진 펩티드 또는 유도 분자를 함유하는 약제학적 제제를 사용하는 치료 처리 방법에 관한 것이다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 상세히 설명되나, 이에 한정되지 않는다. 실시예들은 하기 도면들을 참고한다:

도 1은 잠재적인 인간 MHC 클래스 II 결합 활성을 가진 인간 INFβ 에서의 펩티드 서열의 표를 제공한다. 펩티드는 13 머이고, 아미노산은 단일 문자 코드를 사용하여 구분된다.

도 2는 인간 INFβ의 T 세포 에피토프의 제거를 유도하는 아미노산 치환을 상술하는 표를 제공한다. WT = 야생형 잔기.

도 3은 하나 이상의 MHC 동종이형에 대한 잠재적인 T 세포 에피토프의 제거를 유도하는 추가적인 치환을 상술하는 표를 제공한다.

도 4는 인간 INFβ에서의 바람직한 치환의 표를 제공한다. WT = 야생형 잔기; # = 위치; MUT = 요망되는 잔기. 표는 각각의 치환이 위치하는 에피토프 영역 (R1 또는 R2) 을 나타낸다.

도 5는 실시예 2 의 자연 인간 시험관내 T 세포 검정을 이용해 분석된 INFβ 15 머 펩티드 서열의 표를 제공한다. INFβ서열 내 N 말단 펩티드 잔기의 펩티드 ID# 가 나타나 있다.

도 6은 IFNβ펩티드를 사용한 자극에 대해 응답성인 6 명의 개인으로부터의 누적 자극 지수를 나타낸다. 패널 6a 는 1 μM 농도 펩티드를 이용한 자극 결과를 나타낸다. 패널 6b 는 10 μM 농도 펩티드를 이용한 자극 결과를 나타낸다. 스크린된 20 명 중 6 명의 공여자가 INFβ서열로부터의 하나 이상의 펩티드를 사용한 자극에 응답성이었다. 개별적인 펩티드에 대한 응답성은 2 개의 구분되는 영역 R1 및 R2 로 구분된다. 대조군 펩티드 C32 (DRBI 제한) 및 C49 (DP 제한) 는 비교를 위해 포함된다. 각각의 막대 내의 크로스 햇칭은 개별적인 공여자로부터의 분포를 나타낸다. SI = 자극 지수.

도 7은 INFβ 합성 펩티드에 대한 공여자 특이적 자극 응답성을 나타낸다.

패널 7a- 7f 는 1 μM (흰 막대) 및 10 μM (검은 막대) 의 최종 펩티드 농도에서의 펩티드에 대한 개별적인 공여자 응답성을 나타낸다. 대조군 펩티드 C32 (DRB1 제한) 및 C49 (DP 제한) 로부터의 데이타는 비교를 위해 각각의 패널에 포함된다. 양성 자극 지수에 대한 역치 = 2.

도 8은 INFβ내 면역원성 영역을 나타내며, 자연 인간 T 세포를 자극할 수 있는 상기 영역으로부터의 펩티드 서열을 기재한다.

도 9는 자연 인간 T 세포의 시험관내 증식을 촉진할 수 있는 INFβ펩티드를 나타내는 표를 제공한다. 2 명의 공여자에 대해, 응답성은 각각의 에피토프 영역 R1 또는 R2 로부터의 다중 중복 펩티드로 기록된다. 에피토프 영역 R1 또는 R2 에 대한 개인의 합성 펩티드 맵핑에 대한 응답성은 6 명의 공여자로부터 기록되었다.

도 10은 2 개의 개질 INFβ 분자의 항증식 효과의 대표적인 데이타를 제공한다. 검정은 실시예 4 의 방법에 따라 수행되었다. 각각의 패널 a) 및 b) 에서, 대조군 처리의 항증식 효과를 기록했다. 대조군에는 비개질 INFβ-Fc 융합 = WT-FcINFb 가 포함되었다; 표준 INFβ제제 = R&D IFNb 및 INF 을 함유하지 않는 배지 = Media Con. 패널 a) 는 Leu 57 Ala (INFβBIOV7) 개질 INFβ 에 대한 데이타를 나타낸다. 패널 b) 는 Phe 67 His (INFβ-BIOV12) 개질 INFβ에 대한 데이타를 나타낸다.

실시예 1

단백질 또는 폴리펩티드의 전체 구조를 결정하는데 중요한 역할을 하는 여러 요인들이 있다. 첫번째로, 펩티드 결합, 즉 사슬 중의 아미노산을 함께 연결하는 결합은 공유 결합이다. 상기 결합은 평면 구조로, 본질적으로 치환 아미드이다. "아미드" 는 -CONH- 그룹을 포함하는 유기 화합물의 임의 기이다.

인접한 아미노산의 Cα를 연결하는 평면 펩티드 결합은 하기 도시한 바와 같이 나타낼 수 있다:

O=C 및 C-N 원자가 비교적 고정된 평면 상에 놓이므로, 상기 축에 대해서는 자유 회전이 일어나지 않는다. 따라서, 점선으로 도식적으로 묘사된 평면은 때때로 "아미드" 또는 "펩티드 평면" 으로 불리며, 여기에 펩티드 골격의 산소 (O), 탄소 (C), 질소 (N), 및 수소 (H) 원자가 놓인다. 상기 아미드 평면의 반대 중심에는 Cα원자가 위치한다. 펩티드 또는 아미드 평면에서 O=C 및 C-N 원자에 대해 실질적으로 회전이 없으므로, 폴리펩티드 사슬은 Cα원자를 연결하는 일련의 평면 펩티드 결합을 포함한다.

폴리펩티드 또는 단백질의 전체 구조 또는 배치를 정의하는데 중요한 역할을 하는 제 2 요인은 공통 Cα결합에 대한 각각의 아미드 평면의 회전각이다. "회전각" 및 "비틀기 (torsion) 각" 이라는 용어는 이후 동일한 용어로 간주된다. O, C, N, 및 H 원자가 아미드 평면에 존재한다고 가정하면 (일부 배치에 대해 상기 원자의 평면성이 약간 변경될 수 있지만, 통상적으로 타당한 가정임), 상기 회전각은 N 및 R 폴리펩티드의 골격 배치, 즉 주위 잔기 사이에서 존재하는 구조를 정의한다. 상기 2 각은 φ및 ψ로 공지되어 있다. 따라서 한 세트의 각 φ₁, ψ₁(여기서 아래첨자 i 는 폴리펩티드 사슬의 특정 잔기를 나타냄) 는 폴리펩티드의 2 차 구조를 효과적으로 정의한다. φ, ψ각을 정의하는데 사용되는 관례, 즉 아미드 평면이 0 도 각을 형성하는 참조점 및 어느 각이 φ이고 어느 각이 ψ인식에 대한 정의는, 주어진 폴리펩티드에 대하여 문헌에 정의되어 있다. 예컨대, 본원에 참고문헌으로 도입된 [Ramachandran 등. Adv. Prot. CheM. 23: 283-437 (1968), 페이지 285-94] 를 참고.

본 발명의 방법은 임의 단백질에 적용될 수 있으며, 부분적으로 인간에서 MHC 클래스 II 분자 결합 그루브의 일차 포켓 1 고정 위치는 특정 아미노산 측쇄에 대해 잘 고안된 특이성을 갖는다는 발견에 근거한다. 상기 포켓의 특이성은 MHC 클래스 II 분자의 베타 사슬의 86 번 위치에서 아미노산의 정체성에 의해 결정된다. 상기 부위는 포켓 1 의 저부에 위치하며, 상기 포켓에 의해 조절될 수 있는 측쇄의 크기를 결정한다 [Marshall, K. W., J. Immunol., 152: 4946-4956 (1994)]. 상기 잔기가 글리신이라면, 모든 소수성 지방족 및 방향족 아미노산 (소수성 지방족원: 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌 및 방향족원: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판) 은 포켓 내에 조절될 수 있고, 방향족 측쇄가 바람직하다. 상기 포켓 잔기가 발린이라면, 상기 아미노산의 측쇄는 포켓 내로 돌출하여, 소수성 지방족 측쇄만이 조절될 수 있도록, 조절될 수 있는 펩티드 측쇄의 크기를 제한한다. 따라서, 아미노산 잔기 서열에서, 소수성 지방족 또는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산이 발견된다면, MHC 클래스 II 에 제한된 T 세포 에피토프가 존재할 가능성이 있다. 그러나, 측쇄가 소수성 지방족이라면, 방향족 측쇄보다 대략 2 배 더 T 세포 에피토프와 연합될 가능성이 있다 (전체 집단에 대해 포켓 1 유형의 대략 균일한 분포를 가정함).

본 발명을 구현하는 전산적 방법은 하기와 같이 T 세포 에피토프를 포함할 가능성이 있는 펩티드 영역을 프로파일링한다:

(1) 소정의 길이의 펩티드 절편의 일차 서열을 스캐닝하고, 존재하는 모든 소수성 지방족 및 방향족 측쇄를 확인한다. (2) 소수성 지방족 측쇄에 방향족 측쇄보다 더 높은 값; 바람직하게는 방향족 측쇄에 지정된 약 2 배의 값, 예컨대, 소수성 지방족 측쇄에 대한 값 2 및 방향족 측쇄에 대한 값 1 을 지정한다. (3) 존재하는 것들에 대해 결정된 값을 펩티드 내의 소정의 균일한 길이인 각각의 겹치는 아미노산 잔기 절편 (윈도우) 에 대해 합산하고, 특정 절편 (윈도우) 에 대한 전체 값을 절편의 중간 위치에 있는 단일 아미노산 잔기 (윈도우) 에, 바람직하게는 샘플링된 절편의 정중앙 근처의 잔기 (윈도우) 에 부여한다. 상기 절차를 각각의 샘플링된 겹치는 아미노산 잔기 절편 (윈도우) 에 대해 반복한다. 따라서, 펩티드의 각 아미노산 잔기에는 특정 절편 (윈도우) 에 존재할 T 세포 에피토프의 가능성에 관련된 값이 부여된다. (4) 상기 단계 3 에서 계산 및 부여된 값을 평가되는 전체 아미노산 잔기 서열의 아미노산 축에 대해 플롯팅할 수 있다. (5) 소정의 값, 예컨대 값 1 의 값을 갖는 서열의 모든 부분은, T 세포 에피토프를 포함하는 것으로 간주될 수 있고, 필요하다면 개질될 수 있다.

본 발명의 상기 특정 측면은 T 세포 에피토프를 포함할 것 같은 펩티드 영역을 나타낼 수 있는 일반적인 방법을 제공한다. 상기 영역에서의 펩티드 개질은 MHC 클래스 II 결합 특징을 개질시킬 수 있는 잠재성을 갖는다.

본 발명의 또다른 측면에 따라, MHC 클래스 II 대립유전자의 모델과 펩티드의 상호작용을 고려한 보다 복잡한 컴퓨터적 방법을 이용하여, T 세포 에피토프가 보다 정확히 예측될 수 있다. 상기 특정 측면에 따른 펩티드 내에 존재하는 T 세포 에피토프의 컴퓨터적 예측에는 모든 공지된 MHC 클래스 II 분자의 구조를 기반으로 하는 42 개 이상의 MHC 클래스 II 대립유전자 모델의 구축 및 T 세포 에피토프의 컴퓨터적 동정에 있어서 상기 모델의 이용 방법, 상대적인 펩티드 골격 알파 탄소 (Cα) 위치에 있어서 공지된 변화를 가능케 하기 위한 각각의 모델에 대한 펩티드 골격 라이브러리의 구축, 펩티드 및 MHC 클래스 II 분자 사이의 상호작용에 결정적인 위치에서 각각의 20 개 아미노산 대안물에 대한 각 모델의 각각의 골격 잔교 (dock) 에 대한 아미노산 측쇄 배치의 라이브러리 구축, 및 특정 MHC 클래스 II 분자와 도킹된 특정 펩티드에 대한 최적 골격 및 측쇄 배치, 및 상기 상호작용의 결합 스코어 변화를 선택하기 위한 스코어링 기능을 갖는 상기 골격 및 측쇄 배치 라이브러리의 용도가 포함된다.

MHC 클래스 II 분자의 모델은 Brookhaven 단백질 데이타 뱅크 ("PDB") 에서 찾을 수 있는 여러 유사한 구조로부터 상동성 모델링을 통해 유도할 수 있다. 이들은 에너지 최소화를 위한 CHARMm 력 필드와 함께 시뮬레이션된 어닐링 기능을 도입한 반자동 상동성 모델링 소프트웨어 (Molecular Simulations Inc., San Diego, Ca. 에서 구입가능) 를 이용하여 수행될 수 있다 (Modeller, Sali A. & Blundell TL., 1993. J. Mol Biol 234: 779-815). 대안적인 모델링 방법도 또한 이용할 수 있다.

본 발명의 방법은 MHC 클래스 II 분자의 작은 세트에 대한 결합 그루브 내 각각의 위치에서 대안적인 각각의 아미노산의 실험적으로 유도된 결합 데이타의 라이브러리를 이용하는 다른 컴퓨터적인 방법 (Marshall, K. W., 등, Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids, 1(3): 157-162) (1995) 또는 그루브 내에서 특정 유형의 결합 포켓의 결합 특징을 정의하기 위해, 다시 MHC 클래스 II 분자의 비교적 작은 서브세트를 이용한 후 상기 포켓 라이브러리의 포켓 유형을 추가적인 '버츄얼' MHC 클래스 II 분자를 인공적으로 생성시키기 위해 '혼합 및 매칭' 시키는 유사한 실험적 결합 데이타를 이용하는 또다른 컴퓨터적인 방법 (Sturniolo T., 등, Nat. Biotech, 17(6): 555-561 (1999)) 과 매우 상이하다. 두 가지 선행 방법 모두, 분석의 복잡성 및 다수의 펩티드 변이체를 합성해야 한다는 필요성으로 인해, 단지 소수의 MHC 클래스 II 분자만이 실험적으로 스캐닝될 수 있다는 주요 단점을 갖는다. 따라서, 첫번째 선행 방법은 소수의 MHC 클래스 II 분자만을 예측할 수 있다. 두번째 선행 방법은 또한 한 분자 내의 유사한 아미노산이 배열된 포켓이 상이한 클래스 II 대립유전자와 함께 있는 경우 동일한 결합 특징을 갖는다고 가정하고, 포켓 라이브러리 내에 포함되는 포켓을 포함하는 MHC 클래스 II 분자만이 '가상적으로' 생성될 수 있다는 추가 단점을 갖는다. 본원에 기재된 모델링 접근법을 이용하여, 임의 수 및 유형의 MHC 클래스 II 분자의 구조를 유추할 수 있고, 따라서 전체 집단을 대표하도록 대조유전자를 특이적으로 선택할 수 있다. 또한, 스캐닝되는 MHC 클래스 II 분자의 수가 복잡한 실험을 통해 추가적인 데이타를 생성시킨 것보다 더 많은 모델을 만들어서 증가될 수 있다.

골격 라이브러리의 이용은 특정한 MHC 클래스 II 분자로 도킹되는 경우, 스캐닝되는 다양한 펩티드의 Cα원자의 위치에서의 변화를 허용한다. 이는 다시, 특히 포켓에서의 아미노산 결합의 스캐닝을 위해 단순화한 펩티드 골격의 이용에 의존하는 상기 기재된 대안적인 컴퓨터적 선행 기술의 방법과 대조적이다. 이러한 단순화된 골격은 '실제' 펩티드에서 발견되는 골격 배치의 대표물이 아닐 수 있어, 펩티드 결합의 예측이 부정확해진다. 본 발명의 골격 라이브러리는 단백질 데이타 뱅크 내에서 발견되는 MHC 클래스 II 분자에 결합한 모든 펩티드의 골격을 포개고, 결합 그루브 내에 위치하는 11 개 아미노산 각각의 Cα원자 사이의 제곱 평균 (RMS) 편차를 확인함으로써 생성된다. 상기 라이브러리는 소수의 적합하고 이용가능한 마우스 및 인간 구조 (현재 13 개) 에서 유도될 수 있지만, 더욱 큰 다양성을 가능케하기 위해, 각각의 C"-α위치에 대한 RMS 수를 50% 증가시킨다. 이어서 각각의 아미노산의 평균 Cα위치를 결정하고, 그 반경이 그 지점에서의 RMS 편차 + 50% 가 되는 상기 지점 근처로 구를 그린다. 상기 구가 허용되는 모든 Cα위치를 나타낸다.

최소의 RMS 편차를 갖는 Cα로 작업시 (결합 그루브의 11 개 잔기의 위치 2에 해당하는, 상기 언급된 포켓 1 의 아미노산의 것), 구는 3 차원적으로 격자형이며, 격자 내의 각각의 정점이 상기 아미노산의 Cα의 가능한 위치로서 사용된다. 수반되는 아미노산에 대한 펩티드 결합에 해당되는, 수반되는 아미드 평면은 각각의 상기 Cα들에 그래프트되며, φ및 Ψ각은 수반되는 Cα의 위치를 정하기 위해, 설정된 간격으로 단계적으로 회전된다. 수반되는 Cα가 상기 Cα 에 대해 '허용되는 위치의 구' 내에 속하는 경우, 디펩티드의 방위가 허용되지만, 구의 외부에 속하는 경우 디펩티드는 거부된다. 이어서, 상기 절차를, 모든 9 개의 수반하는 Cα들이 선행 Cα들의 가능한 모든 순열로부터 배치될 때까지 각각의 수반하는 Cα위치에 대해 펩티드가 포켓 1 Cα'시드 (seed)' 로부터 성장하도록 반복한다. 이어서 상기 절차를 단일 Cα선행 포켓 1 에 대해 1 번 더 반복하여, 결합 그루브 내에 위치하는 골격 Cα위치의 라이브러리를 생성시킨다.

생성되는 골격의 수는 여러 요인에 의존적이다: '허용된 위치의 구' 의 크기; 포켓 1 위치에서 '일차 구' 의 격자의 세밀함; 수반되는 Cα의 위치를 정하는데 사용되는 Φ및 Ψ각의 단계적 회전의 세밀함. 상기 절차를 이용하여, 커다란 골격 라이브러리가 생성될 수 있다. 골격 라이브러리가 커질수록, MHC 클래스 II 분자의 결합 그루브 내의 특정 펩티드에 대한 최적 피트 (fit) 가 발견될 가능성이 높아질 것이다. 결합 도메인의 아미노산과의 충돌로 인해, 모든 골격이 모든 MHC 클래스 II 분자 모델의 도킹에 적합하지는 않을 것이므로, 각각의 대립유전자에 대해, 상기 대립유전자가 조절될 수 있는 골격을 포함하는 라이브러리의 서브세트를 생성한다. MHC 클래스 II 분자 모델과 함께 골격 라이브러리의 이용은 각각의 허용되는 골격에 도킹된 각각의 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합 그루브의 각 위치에서 각각의 아미노산에 대해 허용된 측쇄 배치로 구성되는 방대한 데이타베이스를 생성시킨다. 상기 데이타 세트는 MHC 클래스 II 분자가 골격에 도킹되고, 아미노산 측쇄가 목적하는 위치에서 골격상에 그래프트되는 단순한 입체 오버랩 함수를 이용하여 생성된다. 측쇄의 각각의 회전가능한 결합은 설정된 간격으로 단계적으로 회전되며, 원자의 생성된 위치는 언급된 결합에 근거한다. 상기 원자와 결합 그루브의 측쇄 원자의 상호작용이 주지되며, 위치는 하기 기준에 따라 허용되거나 거부된다: 배치된 모든 원자의 오버랩의 합계는 소정 값을 초과하지 말아야 한다. 따라서, 배치 탐색의 엄격성 (stringency) 은 결합의 단계적 회전에 사용되는 간격 및 총 오버랩에 대한 소정 한계의 함수이다. 상기 후자의 값은 특정 포켓이 고정된 것으로 공지된 경우 작을 수 있지만, 엄격성은 포켓 측쇄의 위치가 비교적 유동적인 것으로 공지된 경우 완화될 수 있다. 따라서, 결합 그루브의 포켓 내에서 유연성의 변동을 모방할 수 있다. 이어서 각각의 MHC 클래스 II 분자와 도킹된 경우, 상기 배치 탐색을 각 골격의 매 위치마다 각각의 아미노산에 대해 반복하여 측쇄 배치의 방대한 데이타베이스를 생성시킨다.

상술된 골격/측쇄 배치의 거대 데이타베이스를 스캐닝하여 실험적으로 유도되어야 하는 펩티드 리간드 배치와 함께 MHC 클래스 II 분자 모델 사이의 결합 에너지를 추정하기 위해, 적합한 수학적 표현을 사용한다. 따라서, 하기 계산에 9 내지 20 개 아미노산 길이 (길이는 각각의 스캐닝에 대해 일정하게 유지됨) 의 각각의 가능한 펩티드를 적용시켜, 잠재적인 T 세포 에피토프에 대해 단백질을 스캐닝한다: 상기 분자에 대해 허용되는 펩티드 골격과 함께 MHC 클래스 II 분자를 선택하고, 목적하는 펩티드 서열에 해당하는 측쇄를 그 위에 그래프트한다. 골격 상의 특정 위치에서 특정 측쇄에 대한 원자 정체성 및 원자간 거리 데이타를 상기 아미노산에 허용되는 각각의 배치에 대해 수집한다 (상술한 데이타베이스로부터 수득됨). 이를 골격을 따라 각각의 측쇄에 대해 반복하고, 스코어링 함수를 이용하여 펩티드 스코어를 유도한다. 상기 골격에 대한 최적 스코어를 간직하고, 선택된 모델에 대해 허용된 각각의 골격에 대해 절차를 반복한다. 허용된 모든 골격에 대한 스코어를 비교하고, 최고 스코어를 상기 MHC 클래스 II 모델에서 목적하는 펩티드에 대한 펩티드 스코어로 간주한다. 이어서 상기 절차를 스캐닝되는 단백질에서 유도되는 가능한 모든 펩티드로 각각의 모델에 대해 반복하고, 모델에 대비한 펩티드 스코어를 나타낸다.

본 발명에 있어서, 결합 친화성 계산에 제시되는 각각의 리간드는 상술한 바와 같은 펩티드 또는 단백질에서 선택되는 아미노산 절편이다. 따라서, 상기 리간드는 공지된 서열의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에서 유도되는 약 9 내지 20 개 아미노산 길이의 아미노산 연장물에서 선택된다. "아미노산" 및 "잔기" 라는 용어는 이후 동일한 용어로 간주된다.

골격 라이브러리로부터 골격 상에 그래프트될 것으로 조사된 펩티드의 연속 아미노산 형태인 리간드를, 펩티드 골격의 C"-α원자의 좌표를 통해 MHC 클래스 II 분자 모델 라이브러리로부터의 MHC 클래스 II 분자의 결합 틈 내에 위치시키고, 각각의 측쇄에 허용되는 배치를 허용되는 배치의 데이타베이스로부터 선택한다. 관련된 원자 정체성 및 원자간 거리를 또한 상기 데이타베이스로부터 검색하고, 펩티드 결합 스코어를 계산하는데 사용한다. MHC 클래스 II 결합 포켓에 대한 높은 결합 친화성을 갖는 리간드를 위치 지정 돌연변이화에 대한 후보물로 지정한다. 지정된 리간드 (즉 관심 단백질 내임) 의 아미노산 치환을 수행한 후, 스코어링 함수를 이용해서 재시험하여, 결합 친화성을 소정 역치값 미만으로 감소시키는 변화를 결정한다. 이어서, 상기 변화를 관심 단백질 내로 도입하여 T 세포 에피토프를 제거시킬 수 있다.

펩티드 리간드 및 MHC 클래스 II 분자의 결합 그루브 사이의 결합에는 하기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 비공유 상호작용이 관여된다: 수소 결합, 정전기적 상호작용, 소수성 (친유성) 상호작용 및 반 데르 발스 상호작용. 이들은 하기에 상세히 설명되는 바와 같은 펩티드 스코어링 함수에 포함된다.

수소 결합은 극성 또는 대전된 기 사이에 형성될 수 있는 비공유 결합이고, 2 개의 다른 원자에 의해 공유되는 수소 원자로 구성된다는 것이 이해되어야 한다. 수소 공여자의 수소는 양전하를 갖는 반면, 수소 수용자는 부분적인 음전하를 갖는다. 펩티드/단백질 상호작용을 위해, 수소 결합 공여자는 수소가 부착된 질소, 또는 산소 또는 질소에 부착된 수소일 수 있다. 수소 결합 수용자 원자는 수소에 부착되지 않은 산소, 수소가 부작되지 않고 1 또는 2 개 연결을 갖는 질소, 또는 1 개 연결만을 갖는 황일 수 있다. 특정 원자, 예컨대 수소에 부착된 산소 또는 이민 질소 (예, C=NH) 는 수소 수용자 및 공여자 둘 다 될 수 있다. 수소 결합 에너지는 3 내지 7 Kcal/몰 범위이고, 반 데르 발스 결합보다 훨씬 더 강하지만, 공유 결합보다는 약하다. 수소 결합은 또한 매우 방향성이 있고, 공여자 원자, 수소 원자 및 수용자 원자가 함께 선형이 될때 가장 강하다. 정전기적 결합은 반대로 하전된 이온쌍 사이에서 형성되며, 상호작용의 강도는 쿨롱의 법칙에 따라 원자간 거리의 제곱에 반비례한다. 이온쌍 사이의 최적 거리는 약 2.8Å 이다. 단백질/펩티드 상호작용에서, 정전기적 결합은 아르기닌, 히스티딘 또는 라이신 및 아스파르테이트 또는 글루타메이트 사이에 형성될 수 있다. 결합의 강도는 이온화기의 pKa 및 매질의 유전 상수에 의존할 것이지만, 이들은 대략 수소 결합의 강도와 유사하다.

친유성 상호작용은 단백질 및 펩티드 리간드 사이에 일어나는 친화적인 소수성-소수성 접촉이다. 통상적으로, 이들은 용매에 노출되지 않게 결합 그루브의 포켓 내에 묻혀있는 펩티드의 소수성 아미노산 측쇄 사이에 일어날 것이다. 소수성 잔기의 용매로의 노출은, 주위 용매 분자가 서로 우리 모양의 포접 구조를 형성하도록 수소 결합이 유도되므로 매우 불리하다. 생성되는 엔트로피의 감소도 매우 불리하다. 친유성 원자는 극성이나 수소 수용자가 아닌 황이거나 극성이 아닌 탄소 원자일 수 있다.

반 데르 발스 결합은 3 - 4Å 떨어진 원자 사이에서 발견되는 비특이적 힘이다. 이들은 수소 및 정전기적 결합보다 약하고 덜 특이적이다. 원자 주위의 전하 분포는 시간에 따라 변화하며, 어떤 경우에도 전하 분포는 비대칭이다. 상기 일시적인 전하의 비대층은 주위 원자에서도 유사한 비대칭을 유도한다. 원자 사이에 생성된 인력은 반 데르 발스 접촉 거리에서 최대에 이르지만, 약 1Å 내지 약2Å 에서 급격히 감소한다. 반대로, 원자가 상기 접촉 거리 미만으로 분리되면, 원자의 외부 전자 구름이 겹치면서 증가되는 강한 척력이 우세해진다. 인력이 정전기적 및 수소 결합에 비해 비교적 약하지만 (약 0.6 Kcal/몰), 척력은 특히 펩티드 리간드가 단백질에 성공적으로 결합할 수 있는지 여부를 결정하는데 매우 중요할 수 있다.

하나의 구현예에서, Boehm 스코어링 함수 (SCORE1 접근법) 를 사용하여 결합 상수를 추정한다 (Boehm, H. J., J. Comput Aided Mol. Des., 8(3): 243-256 (1994), 본원에 그 전문이 도입됨). 또다른 구현예에서, 스코어링 함수 (SCORE2 접근법) 를 사용하여, T 세포 에피토프를 포함하는 리간드의 지표로서 결합 친화성을 추정한다 (Boehm, H. J., J. Comput Aided Mol. Des., 12(4): 309-323 (1998) 본원에 그 전문이 도입됨). 그러나, 상기 참고문헌에 기재된 바와 같은 Boehm 스코어링 함수는 리간드가 단백질에 성공적으로 결합할 수 있음이 이미 공지되어 있고, 단백질/리간드 복합체의 구조가 해석되었으며, 해석된 구조가 단백질 데이타 뱅크 ("PDB") 에 존재하는, 단백질에 대한 리간드의 결합 친화성을 추정하는데 사용된다. 따라서, 스코어링 함수는 공지된 긍정적 결합 데이타의 덕에 개발되었다. 긍정적 및 부정적 결합자들 사이의 구별을 위해, 반발 항이 공식에 부가되어야 한다. 또한, 상기 Boehm 함수의 에너지 항에 근거한 영역을 이용하기보다 한쌍씩 (pairwise) 친유성 상호작용을 계산하여, 보다 만족스러운 결합 에너지의 추정이 얻어진다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 결합 에너지는 개질 Boehm 스코어링 함수를 이용하여 추정된다. 개질 Boehm 스코어링 함수에서, 단백질 및 리간드사이의 결합 에너지 (ΔG_bind) 는 하기 변수를 고려하여 추정된다: 리간드의 전체적인 이행 (translational) 및 회전 엔트로피의 소실로 인한 결합 에너지의 감소 (ΔG₀); 1 개 이상의 파트너가 중성인 이상적인 수소 결합의 분포 (ΔG_hb); 비교란 이온 상호작용의 분포 (ΔG_ionic); 친유성 리간드 원자 및 친유성 수용자 원자 사이의 친유성 상호작용 (ΔG_lipo); 리간드의 내부 자유도 동결, 즉 각각의 C-C 결합에 대한 회전 자유의 감소로 인한 결합 에너지의 소실 (ΔG_rot); 단백질 및 리간드 사이의 상호작용 에너지 (E_VdW). 상기 용어를 고려하여수학식 1을 얻는다:

[수학식 1]

(ΔG_bind) = (ΔG₀) + (ΔG_hb×N_hb) + (ΔG_ionic×N_ionic) + (ΔG_lipo×N_lipo) + (ΔG_rot+ N_rot) + (E_VdW).

여기서, N 은 특정 항에 대해 자격을 부여하는 상호작용의 수이고, 하나의 구현예에서, ΔG₀, ΔG_hb, ΔG_ionic, ΔG_lipo및 ΔG_rot은 각각 하기 값을 갖는 상수이다: 5.4, -4.7, -4.7, -0.17, 및 1.4.

항 N_hb는 하기수학식 2에 따라 계산된다:

[수학식 2]

N_hb= Σ_h-bondsf (ΔR, Δα) × f (N_neighb) × f_pcs

f (ΔR, Δα) 는 이상적인 상황에 대한 수소 결합의 큰 편차를 설명하는 페널티 함수이며,수학식 3에 따라 계산된다:

[수학식 3]

f (ΔR, Δ-α) = f1 (ΔR) × f2 (Δα)

여기서, ΔR ≤TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 1 이거나

ΔR ≤0.4 + TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 1 - (ΔR - TOL)/0.4 이거나

ΔR > 0.4 + TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 0 이고,

또한: Δα < 30°인 경우, f2 (Δα) = 1 이거나

Δα ≤ 80°인 경우, f2 (Δα) = 1 - (Δα-30)/50 이거나

Δα > 80°인 경우, f2 (Δα) = 0 이다.

TOL 은 수소 결합 길이 = 0.25Å 에서의 관용 편차이다.

ΔR 은 이상값 = 1.9Å 로부터 H-O/N 수소 결합 길이의 편차이다.

Δα는 그 이상값 180°로부터 수소 결합각 ∠_N/O-H..O/N의 편차이다.

f(N_neighb) 는 단백질 표면의 오목 및 볼록한 부분을 구별하므로, 단백질 표면에서 발견되는 것보다 포켓에서 발견되는 극성 상호작용에 더 큰 무게를 부여한다. 상기 함수는 하기수학식 4에 따라 계산된다:

[수학식 4]

f(N_neighb) = (N_neighb/N_neighb,0)^α(여기서 α = 0.5 임).

N_neighb는 임의의 주어진 단백질 원자에 대해 5Å 보다 더 가까운 비수소 단백질 원자의 수이다.

N_neighb.0는 상수 = 25 이다.

f_pcs는 수소 결합 당 극성 접촉 표면적을 허용하는 함수이므로, 강한 및 약한 수소 결합 사이를 구분하며, 그 값은 하기 기준에 따라 결정된다:

A_polar/N_HB< 10Å²인 경우 f_pcs= β이거나

A_polar/N_HB> 10Å²인 경우 f_pcs= 1 이다.

A_polar는 극성 단백질-리간드 접촉 표면의 크기이다.

N_HB는 수소 결합의 수이다.

β는 그 값이 1.2 인 상수이다.

개질 Boehm 스코어링 함수의 실행을 위해, 이온성 상호작용의 분포로부터, 동일한 기하 의존성이 가정되었으므로, ΔG_ionic이 상술된 수소 결합으로부터와 유사한 방식으로 계산된다.

항 N_lipo는 하기수학식 5에 따라 계산된다:

[수학식 5]

N_lipo= Σ_1Lf(r_1L)

f(r_1L) 은 모든 친유성 리간드 원자, l 및 모든 친유성 단백질 원자, L 에 대해 하기 기준으로 계산된다:

r_1L≤ R1 인 경우 f(r_1L) =1,

R2 < r_lL> R1 인 경우 f(r_1L) = (r_1L-R1)/ (R2-R1),

r_1L≥ R2 인 경우 f(r_1L) = 0

여기서, R1 = r_l ^vdw+ r_L ^vdw+ 0. 5 이고

R2 = R1 + 3.0 이고

r_l ^vdw은 원자 l 의 반 데르 발스 반경이고

r_L ^vdw은 원자 L 의 반 데르 발스 반경이다.

항 N_rot는 아미노산 측쇄의 회전가능한 결합의 수이며, 비환식 sp³-sp³및 sp³-sp²결합의 수로 고려된다. 말단 -CH₃또는 -NH₃의 회전은 고려되지 않는다.

최종 항 E_VdW는 하기수학식 6에 따라 계산된다:

[수학식 6]

E_VdW= ε₁ε₂((r₁ ^vdw+ r₂ ^vdw)¹²/r¹²- (r₁ ^vdw+ r₂ ^vdw)⁶/r⁶).

여기서, ε₁및 ε₂는 원자 정체성에 근거하는 상수이며,

r₁ ^vdw+ r₂ ^vdw는 반 데르 발스 원자 반경이고,

r 은 원자 쌍 사이의 거리이다.

수학식 6 에 대해, 하나의 구현예에서, 상수 ε₁및 ε₂는 하기 주어진 원자 값이다: 각각 C: 0.245, N: 0.283, O: 0.316, S: 0.316 (즉, 각각 탄소, 질소, 산소 및 황 원자에 대한 것). 수학식 5 및 6 에 대해, 반 데르 발스 반경은 하기 주어진 원자 값이다: C: 1.85, N: 1.75, O: 1.60, S: 2.00Å.

상기 수학식에서 주어진 모든 소정의 값 및 상수는 특히 본원에서 수행되는 계산의 유형에 따라 단백질 리간드 상호작용의 현재 이해의 제약 내에서 결정되는 것임이 이해되어야 한다. 따라서, 상기 스코어링 함수가 더욱 개선됨에 따라, 상기 값 및 상수는 리간드에 대한 단백질의 결합 에너지 추정에 대해서 목적하는 결과를 주는 임의의 적합한 수치값으로 변화될 수 있고, 따라서 본 발명의 범위 내에 속한다. 상술한 바와 같이, 스코어링 함수는 측쇄 배치, 원자 정체성 및 원자간 거리의 데이타베이스에서 추출되는 데이타에 적용된다. 본 발명의 설명을 위해, 상기 데이타베이스에 포함되는 MHC 클래스 II 분자의 수는 42 모델 + 4 개의 해석된 구조이다. 상기 설명으로부터, 본 발명의 컴퓨터적 방법의 구축의 계수적 성질이, 신규 모델이 쉽게 추가되고, 펩티드 골격 라이브러리 및 측쇄 배치 탐색 함수로 스캐닝될 수 있어, 상술한 바와 같은 펩티드 스코어링 함수에 의해 처리될 수 있는 부가적인 데이타 세트를 생성시킬 수 있음을 의미하는 것이 자명하다. 이는, 데이타가 존재하는 대립 유전자의 보다 정확한 모델을 생성하는데 이용가능하다면, 스캐닝된 MHC 클래스 II 분자의 목록이 쉽게 증가되거나 구조 및 관련 데이타가 대체될 수 있게 한다. 본 발명의 예측 방법은 다양한 MHC 클래스 II 분자에 대한 친화성이 미리 실험적으로 결정된 다수의 펩티드를 포함하는 데이타 세트에 대해 보정될 수 있다. 계산된 데이타 대 실험적 데이타를 비교함으로써, 모든 실험적으로 결정된 T 세포 에피토프가 정확히 예측될 수 있는 것으로 공지된 한계값이 결정될 수 있다. 상기 스코어링 함수가 이용가능한 일부 복잡한 방법론에 비해 비교적 간단하지만, 계산은 극히 신속히 수행됨이 이해되어야 한다. 또한, 그 목적이 선택된 MHC 클래스 II 단백질의 결합 그루브 내에 도킹된 각각의 펩티드에 대한 자체 실제 결합 에너지를 계산하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 기본적인 목적은 선택된 단백질의 일차 서열 (즉, 아미노산 서열) 을 근거로 T 세포 에피토프의 위치 예측에 도움을 주는 상대적인 결합 에너지 데이타를 수득하는 것이다. 상대적으로 높은 결합 에너지 또는 상기 선택된 역치값 초과의 결합 에너지는 리간드 중 T 세포 에피토프의 존재를 제시할 것이다. 이어서, 리간드를 1 차 이상의 아미노산 치환에 적용시켜 결합 에너지를 재계산한다. 신속한 계산 성질로 인해, 상기 펩티드 서열의 조작은 비용효과적으로 이용가능한 컴퓨터 하드웨어 상의 프로그램의 사용자 인터페이스 내에서 쌍방향으로 수행될 수 있다. 따라서, 컴퓨터 하드웨어에 대한 거대한 투자가 요구되지는 않는다. 당업자에게는, 동일한 목적을 위해 다른 이용가능한 소프트웨어를 이용할 수 있음이 자명할 것이다. 특히, 단백질 결합 부위 내로 리간드를 도킹시킬 수 있는 보다 복잡한 소프트웨어를 에너지 최소화와 함께 이용할 수 있다. 도킹 소프트웨어의 예에는 하기가 있다: DOCK(Kuntz 등, J. Mol. Biol., 161: 269-288 (1982)), LUDI (Boehm, H. J., J. Comput Aided Mol. Des., 8: 623-632 (1994)) 및 FLEXX (Rarey M., 등, ISMB, 3: 300-308 (1995)). 분자 모델링 및 조작 소프트웨어의 예에는 하기가 포함된다: AMBER (Tripos) 및 CHARMm (Molecular Simulations Inc.). 상기 컴퓨터적 방법의 이용은 필요한 계산을 수행하는데 걸리는 처리 시간의 길이로 인해, 본 발명의 방법의 효율을 상당히 제한할 것이다. 그러나, 상기 방법이 본 발명의 방법을 통해 '긍정적 결합자' 로 발견되는 펩티드에 대한 보다 정확한 결합 에너지의 계산을 얻기 위한 '2 차 스크린' 으로 사용될 수 있다. 복잡한 분자 기계적 또는 분자 역학적 계산을 위한 가공 시간의 제한은 상기 계산을 가능하게 하는 소프트웨어의 고안 및 컴퓨터 하드웨어의 현재 기술 한계 둘 다에 의해 정의되는 것이다. 미래에는, 보다 효율적인 코드의 기록 및 지속적인 컴퓨터 프로세서의 속도 증가로 인해, 보다 제어가능한 시간틀 내에서 상기 계산이 이루어질 것임을 예견할 수 있다. 폴딩된 단백질 구조 내에서 일어나는 다양한 상호작용의 고려 및 거대분자에 적용되는 에너지 함수에 대한 추가 정보는 하기 문헌에서 찾아볼 수 있고: [Brooks, B. R., 등, J. Comput. Chem., 4: 187-217 (1983)], 일반적인 단백질-리간드 상호작용에 관한 추가 정보는 하기 문헌에서 찾아볼 수 있으며: [Dauber-Osguthorpe 등, Proteins 4(1): 31-47 (1988)], 이들은 본원에 그 전문이 참고문헌으로 도입된다. 유용한 배경 정보는 또한, 예를 들어 하기 문헌에서 찾아볼 수 있다 [Fasman, G. D. 편저,Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Plenum Press, New York, ISBN: 0-306 4313-9].

실시예 2

MHC, 펩티드 및 T 세포 수용체 (TCR) 간의 상호작용은 T 세포 인식의 항원 특이성에 대한 구조적인 기초를 제공한다. T 세포 증식 검정은 MHC 에 대한 펩티드의 결합 및 TCR 에 의한 MHC/펩티드 복합체의 인식을 시험한다. 본 실시예의 시험관내 T 세포 증식 검정은 항원 제공 세포 (APCs) 및 T 세포를 함유하는 말초혈단핵세포 (PBMCs)의 자극을 포함한다. 자극은 합성 펩티드 항원을 사용하여 시험관 내에서 수행하고, 일부 실험에서는 전체 단백질 항원을 사용하였다. 자극된 T 세포 증식은³H-티미딘 (³H-Thy) 을 사용하여 측정하고, 혼입된³H-Thy의 존재는 세척된 고정 세포들의 신틸레이션 계수를 사용하여 평가하였다.

12 시간 이하 동안 보관된 인간 혈액으로부터의 백혈구 연층 (buffy coat)을 국립혈액원 (Addenbrooks Hospital, Cambridge, UK) 으로부터 입수하였다. 피콜-패이크 (Ficoll-paque) 를 Amersham Pharmacia Biotech (Amersham,UK) 로부터 입수하였다. 일차 인간 림프구 배양용의, L-글루타민, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 10 ㎍/㎖ 젠토마이신 및 0.1 % 인간 혈청 알부민을 함유하는, 무혈청 AIM V 배지를 Gibco-BRL (Paisley, UK) 로부터 입수하였다. 합성 펩티드를 Eurosequence (Groningen, 네덜란드) 및 Babraham Technix (Cambridge, UK) 로부터 입수하였다. 백혈구 연층을 온화하게 원심분리하여 적혈구 및 백혈구를 혈장 및 혈소판으로부터 분리하였다. 최상부 층을 (혈장 및 혈소판 함유) 제거하여 폐기하였다. 15 ㎖ 피콜-패이크 (Amersham Parmacia, Amersham UK) 상에 도말하기 전에 적혈구 및 백혈구를 인산 완충 식염수 (PBS) 중에서 1:1 로 희석하였다. 제조자의 권장 조건에 따라 원심분리를 수행하고, 혈청 + PBS/피콜 패이크 계면으로부터 PBMCs 를 수확하였다. PBMCs 를 PBS 와 혼합하고 (1:1), 원심분리에 의해 수합하였다. 상청액을 제거하여 폐기하고, PBMC 펠렛을 50 ㎖ PBS 에 재현탁하였다. 세포들을 다시 원심분리에 의해 펠렛화하고, PBS 상청액을 폐기하였다. 50 ㎖ AIM V 배지를 사용하여 세포들을 재현탁하고, 이 시점에서 계수하고 트립판 블루 염료 배제 (exclusion) 를 이용하여 생존성 (viability) 을 평가하였다. 세포들을 다시 원심분리에 의해 수합하고, 상청액은 폐기하였다. 세포들을 저온 저장을 위해 3 ×10⁷/㎖ 의 밀도로 재현탁하였다. 저장 배지는 90 % (v/v) 의 가열 비활성화된 AB 인간 혈청 (Sigma, Poole, UK) 및 10 % (v/v) DMSO (Sigma, Poole, UK) 이었다. 세포들을 조절된 동결 용기 (Sigma) 로 옮겨, -70 ℃ 에서 하룻밤동안 두었다. 사용시, 세포들을 10 ㎖ 의 예비가온된 AIM V 배지로 옮기기 전에 37 ℃ 수조에서 신속하게 해동시켰다.

PBMC 를 96 웰의 편평 바닥 플레이트 중에서 2 ×10⁵PBMC/웰 의 밀도로 단백질 및 펩티드 항원으로 자극하였다.³H-Thy (Amersham-Pharmacia, Amersham, UK) 로 펄스하기 (pulsing) 전에, PBMC 를 37 ℃ 에서 7 일 동안 인큐베이션하였다. 본 발명의 연구에서, INFβ의 전체 서열에 뻗어있는, 3aa 증분으로 중복된 합성 펩티드 (15 량체) 가 생성되었다. 펩티드 확인 번호 (ID#) 및 서열을 도 5 에 제공하였다. 각 펩티드를 20 명의 순수 공여자로부터 분리한 PBMC 에 대해 개별적으로 스크리닝하였다. 면역원성인 것으로 이미 나타난 두 개의 대조군 펩티드 및 강한 비-회상 (non-recall) 항원 KLH 를 각 공여자 검정에 사용하였다.

이 연구에 사용된 대조군 항원들은 하기와 같았다:

펩티드	서열
C-32	비오틴-PKYVKQNTLKLAT독감 헤마글루티닌 307-319
C-49	KVVDQIKKISKPVQH클라미디아 HSP 60 펩티드
KLH	키홀 삿갓조개 헤모시아닌 (Keyhole Limpet Hemocyanin)으로부터의 전체 단백질

펩티드를 DMSO 에 10 mM 의 최종 농도로 용해시키고, 이들 스톡 (stock) 용액들을 AIM V 배지 중에서 1/500 으로 희석하였다 (최종 농도 20 μM). 펩티드를 편평 바닥 96 웰 플레이트에 첨가하여 100 ㎕ 중 2 및 20 μM 의 최종 농도로 만들었다. 트립판 블루 염료 배제로, 해동된 PBMC 의 생존성을 평가하고, 그 후 세포들을 2 ×10⁶세포/㎖ 의 밀도로 재현탁하고, 100 ㎕ (2 ×10⁵PBMC/웰) 을 펩티드가 담긴 각 웰로 옮겼다. 3 벌의 웰 배양물을 각 펩티드 농도에서 검정하였다. 플레이트를 37 ℃, 5 % CO₂의 습한 분위기에서 7 일 동안 인큐베이션하였다. 세포들을 필터 매트 상에서 수확하기 전에 18~21 시간 동안 1 μCi³H-Thy/웰 로 펄스시켰다. 발락 (Wallac) 마이크로플레이트 베타 탑 플레이트 계수기 (Perkin Elmer) 를 사용하여 CPM 값을 결정하였다. 결과를, 하기 계산식을 사용하여 결정되는 자극 지수로서 결정하였다:

T 세포 증식 분석을 사용하여 INFβ 서열 중의 T 세포 에피토프를 맵핑 (mapping) 하여 2 개의 면역원성 영역 R1 및 R2 를 동정하였다. 펩티드에 대해 응답성인 6 명의 공여자 중에서의 T 세포 증식에 의해 이를 결정하였다. 영역 1 및 2 는 특정 개인들에서 T 세포 증식을 유도하였다. 반응성인 개인들에 대한 누적 반응 데이타를 도 6 에 나타내었으며, 개별적인 반응자들로부터의 데이타를 도 7 에 나타냈다. 개별적인 펩티드/공여자 반응성과 함께 R1 및 R2 를 표시한, INF에 대한 에피토프 데이타를 도 8 및 도 9 에 나타내었다.

실시예 3

통상적인 재조합 DNA 기술을 사용하여 다수의 개질 INFβ분자를 만들었다. 야생형 INFβ유전자를 대조군 시약 및 이로부터 부위-유도 돌연변이 유발에 의해 개질된 유전자를 유도할 주형으로서 모두 사용하였다. 야생형 및 개질 유전자를 진핵성 발현 벡터 내로 삽입하여, 재조합 INFβ단백질이 인간 면역글로불린 불변 영역 도메인을 갖는 융합 단백질로서 발현되었다. 재조합 단백질을 일시적으로 형질감염된 인간 배 (embryonic) 신장 세포로부터 제조하고, 실시예 4 에 상세히 설명한 것과 같이 검정하였다.

인간 배 신장 세포로부터 발현을 수득하게 위해, 야생형 인간 IFNβ유전자를 ATCC (ATCC 접근 번호 31902) 로부터 입수하여, 벡터 pd-Cs [Lo 등, (1998),Protein Engineering11: 495] 로 PCR 클로닝했다. pd-Cs 벡터는 인간 면역글로불린 불변 영역 도메인을 포함하는 융합 단백질의 발현을 지시한다. 야생형 IFNβ유전자를 포함하는 pd-Cs 벡터는 pd-Cs IFNβWT 로 명명했다.

개질 IFNβ를 생산하는 단일 또는 다중 코돈 돌연변이는 pd-Cs IFNβWT 를 주형으로 사용하는 돌연변이 PCR 로 수행했다. 중복 PCR 을 2 개의 돌연변이된 인터페론 서열 절반의 조합에 이용했다. 503 bp 의 PCR 생성물은 XmaI 및 BamHI 으로 절단하여, Qiagen 겔 추출 키트를 사용하여 정제하고, XmaI 및 BamHI 를 사용해 IFNβ서열이 제거된 조제 pd-Cs 로 이동시켰다. 양성 클론을 선별하고, IFNβ서열을 서열 분석으로 확인했다.

돌연변이화는 특이적인 돌연변이 (미스-매치) 프라이머 및 pdCs IFNβWT 주형 DNA 를 조합하여 플랭킹 프라이머 (flanking primer) OL 575 및 OL 576 을 개별 반응에서 사용하여 수행했다.

반응들은 Expand HI Fidelity PCR 시약 (Roche, GmbH)을 사용하여 수행하고, 반응 조건은 하기 사이클에 의해 특정하였다:

94 ℃/2' + 25 사이클 @ 94 ℃/30", 60 ℃/30", 72 ℃/30" + 72 ℃/10'

프라이머 OL 575 및 OL 576 에 의해 유발된 반응에서 15 사이클의 PCR 을 사용하여 상기와 같은 PCR 에 의해 개별 반응에서의 생성물을 합했다.

PCR 생성물들을 상업적으로 구입가능한 키트 시스템 (Qiagen 겔 추출 키트) 을 사용하여 겔 정제하였다. 목적하는 클론들을 BamH1 및 Xma1 으로 절단하고,정제된 생성물을 제조된 pd-Cs 벡터 내로 결찰시켰다.E. coliXL1-Blue 세포 (Strategene Europe) 를 사용하고, 공급자에 의해 권장된 배양 조건에서 클로닝을 수행하였다. 서열 확인은 OL 575 및 OL 576 을 서열분석 프라이머로서 사용하여 전체 최종 벡터 제제 상에서 수행하였다.

개질 INFβ-1a 인간 IgFC 융합 단백질의 발현은 HEK293 인간 배 신장 세포주를 발현 숙주로서 사용하여 달성하였다. 형질감염 (transfection) 을 위한 전체 DNA 를 고순도 QIAGEN midi-prep system 을 사용하고, 공급자 (QIAGEN, Crawley, UK) 에 의해 제공된 지시사항에 따라 제조하였다. DNA 를 사용 전에 필터 멸균하고, A₂₆₀의 측정에 의해 정량하였다. 농도를 0.5~1.0 ㎍/㎕ 으로 조정하였다.

일시적 발현을 위해, HEK293 을 10% FBS 및 250 ㎍/㎖ 제네티신으로 보강된 DMEM L-글루타맥스 배지를 사용하여 배양하였다 (Invitrogen, Paisley, UK). 형질감염 전에, 세포들을 트립신 처리에 의해 수합하고, PBS 를 사용하여 세척하였다. 2 사이클의 세척 후, 세포들을 4 ×10⁵세포/㎖ 의 밀도로 신선한 배지 내에 취하고, 양호한 세포 접착을 보장하도록 폴리-L-라이신으로 예비처리된 다중 웰 디쉬(dish) 내에 도말하였다. 전형적으로, 2 ×10⁵세포들을 48 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 상기 플레이트를 37 ℃/5 % CO₂에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다.

형질감염 전에, 상기 배지를 각 웰에 넣고 형질감염 믹스를 첨가하였다.형질감염을 리포펙타민(lipofectamine) 시약을 사용하고 공급자 (Invitrogen, Paisley, UK)에 의해 제공된 지시사항을 따라 수행하였다. 간략하게는, 각 발현 벡터 구축을 위하여 웰 당 리포펙타민, OPTI-MEM (Invitrogen, Paisley, UK) 및 0.8 ㎍ DNA을 함유하는 형질감염 믹스를 제조하였다. 형질감염 믹스를 세포에 첨가하고, 세포들을 4~6 시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 0.5 ㎖ 의 신선한 배지로 대체하고, 세포들을 37 ℃/5 % CO₂에서 인큐베이션하였다. 항-Fc ELISA 및 다우디 (Daudi) 세포 증식 분석의 두가지 분석을 위해 48 시간 후에 시료를 취하였다. 상기 배지를 7 일 후에 수확하여, 상기와 같은 추가의 분석을 위해 4 ℃ 에 저장하였다.

INFβ융합단백질의 인간 면역글로불린 불변 영역 도메인을 탐지하기 위해, ELISA 시스템을 사용하고, 상기 배지를 INFβ의 존재성에 대하여 검정하였다. 이 검정을 위해, 마우스 항-인간 IgG Fc 제제 (Sigma, Poole, UK) 를 포획 시약으로서 사용하였다. INFβ-HuFc 융합을, 기준 인간 IgG 제제 (Sigma) 의 일련의 희석물들을 사용하여 만든 표준 곡선을 참조하여 정량하였다. 결합 INFβ-Fc 융합 또는 기준 단백질을, 항-인간 IgG 과산화효소 접합물 (Sigma) 및 Sigma OPD 색측정 기질을 사용하여 탐지하였다.

HEK293 조건화된 배지 중의 INFβ의 양의 측정 후, 상기 조건화된 배지를, 실시예 4 에 상세히 기재된 것과 같은 항-증식 검정을 사용하여 개질 INFβ의 기능적 활성을 시험하는데 바로 사용하였다.

실시예 4

본 발명의 개질 인터페론 분자들을 그들의 인간 B 세포 림프종계 Daudi 의 성장 저해 능력에 대해 시험하였다. 상기 방법은 대략적으로 이미 [Mark, D.F. 등 (1984)Proc. Natl. AcaD. Sci. USA 81: 5662 ~ 5666]에 기재된 것과 같고, 시험 인터페론을 사용한 다우디 세포의 배양에 관한 것이다. 상기 시험 분자의 항-증식 효과는 증식 세포들의 존재시 색상이 변화하게 되는 가용성 염료 물질을 사용하여 측정하였다. 유도된 색상 변화는 분광광도계에서 측정하고, 임의의 항증식 효과는 비처리된 대조군 세포 및 표준 인터페론 제제로 처리된 세포에서 기록된 색상 변화를 참조하여 계산하였다.

간략하게는, Daudi 세포들 (ATCC #CCL-213) 을 100 유닛/㎖ 페니실린/100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민 및 20 % 태아 소 혈청 (FBS)으로 보강된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 모든 배지 및 보강물은 Gibco (Paisley, UK)로부터 입수하였다. 분석 전날, 세포들을 신선한 배지 내에 0.9 ×10⁶/㎖ 의 밀도로 넣고, 다음날 10 % (v/v) FBS 를 함유하는 것을 제외하고는 상기와 같은 신선한 배지 내에 넣었다. 세포 밀도는 2 ×10⁵세포/㎖ 로 조정하였다.

시험군 및 대조군 인터페론 제제들을 10 % FBS 를 함유하는 RPMI 내로 희석하였다. 희석은 96 웰 편평 바닥 플레이트들 내에서, 100 ㎕/웰을 함유하도록 이루어졌으며, 모든 샘플들은 3 벌씩으로 하였다. 전형적으로 각 플레이트에 걸쳐 2 배 희석물 (doubling dilution series) 들을 배치하였다. 양성 대조구 웰들도20000 pg/㎖ 의 인터페론 표준품 (R&D Systems, Ab ingdon, UK) 의 출발 농도를 사용하여 3 벌 포함되었다. 100 ㎕ 배지만을 (인터페론 없음) 함유하는 대조구 웰들도 포함되었다. 100 ㎕ 의 세포들을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37 ℃, 5 % CO₂에서 72 시간 동안 인큐베이션 하였다.

증식은 Aqueous One System 및 공급자의 권장 프로토콜 (Promega, Southampton, UK) 을 사용하여 평가했다. 간략하게는, 40 ㎕ 의 Aqueous One 시약을 모든 웰에 첨가하고, 기질을 혼합했다. 플레이트를 37 ℃ 에서 한 시간 동안 인큐베이션한 후, 광흡수 측정을 위해 플레이트 판독 기기로 옮겼다. 판독은 490 nm 에서 실시하였다. X 축을 따라, 첨가된 인터페론 표준품의 농도들에 대해, 490 nm 에서의 평균 흡수를 Y 축으로 하여 플롯팅하였다. 실시예 3 에 기재된 것과 같은 ELISA 기술을 사용하여 인터페론 농도를 결정하였다. 각각의 돌연변이에 대해서, 흡수 대 농도의 곡선으로부터 세포 성장의 50% 저해 달성에 필요한 INFβ 1a 농도 ED₅₀값을 측정하였다.

다수의 개질 INFβ-1a 분자에 대한 상기 방법에 따른 분석 결과를 도 10 에 나타내었다. 결과는 INFβ서열 내에서의 아미노산 치환의 존재시 보유된 항-증식 성질을 나타낸다.

Claims

인간 인터페론 베타 (INFβ) 의 생물학적 활성을 가지며, 생체내에 사용되는 경우 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자보다 덜 면역원성이거나 또는 실질적으로 비면역원성인 개질 분자.
제 1 항에 있어서, 면역원성의 상기 소실이 본래의 비개질 분자로부터 유도되는 하나 이상의 T 세포 에피토프의 제거 및/또는 상기 분자로부터 유도되는 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 동종이형 수의 저감에 의해 달성되는 분자.
제 2 항에 있어서, T 세포 에피토프 하나가 제거되는 분자.
제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 본래 존재하는 T 세포 에피토프가 MHC 클래스 II 상에 존재함으로써 T 세포를 자극하거나 또는 결합하는 능력을 나타내는 펩티드 서열 또는 MHC 클래스 II 리간드인 분자.
제 4 항에 있어서, 상기 리간드 또는 펩티드 서열이 13 머 또는 15 머 펩티드인 분자.
제 5 항에 있어서, 상기 펩티드 서열이 도 1 에 도시된 군으로부터 선택되는분자.
제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 본래 존재하는 임의의 T 세포 에피토프 중 1 - 9 개의 아미노산 잔기가 변경된 분자.
제 7 항에 있어서, 1 개의 아미노산 잔기가 변경된 분자.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 아미노산 잔기의 변경이 특정 위치(들)에서의 다른 아미노산 잔기(들)에 의한 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 치환인 분자.
제 9 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 잔기 치환이 도 2 에 나타낸 바와 같이 수행되는 분자.
제 10 항에 있어서, 추가적으로 하나 이상의 아미노산 잔기 치환이, 도 3 에 나타낸 바와 같이 수행되어 상기 분자로부터 유도된 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 갯수가 감소되는 분자.
제 9 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 도 3 에 나타낸 바와 같이 수행되는 분자.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 아미노산 잔기의 변경이 특정 위치(들)에 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 결실인 분자.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 아미노산 잔기의 변경이 본래 존재하는 것에 대해 특정 위치(들)에서의 아미노산(들)의 부가인 분자.
제 7 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자의 생물학적 활성을 복구하기 위해 부가적으로 추가 변경이 수행되는 분자.
제 15 항에 있어서, 부가적인 추가 변경이 특정 아미노산(들)의 치환, 부가 또는 결실인 분자.
제 7 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변경이 동종 단백질 서열에 관련하여 수행되는 개질 분자.
제 7 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변경이 전산 모델링 기술로 수행되는 개질 분자.
제 7 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변경이 INFβ 유도 펩티드 또는 INFβ 단백질에 의해 T 세포의 자극 또는 결합에 관련하여 수행되는 개질 분자.
인간 인터페론 베타 (INFβ) 의 생물학적 활성을 갖고, 본질적으로 비면역원성이거나 또는 비개질 분자보다 덜 면역원성이며, 생체내 사용되는 경우 인간 INFβ의 생물학적 활성을 갖는, 하기 방법에 의해 1 차 서열에서의 하나 이상의 아미노산의 변경에 의해 수득되는 개질 분자: (i) MHC 클래스 II 상에 존재함으로써 T 세포를 자극하거나 또는 결합하는 능력을 나타내는 펩티드 서열 또는 MHC 클래스 II 리간드인, 본래 비개질 분자로부터 유도되는 하나 이상의 T 세포 에피토프의 제거 및/또는 (ii) 상기 분자로부터 유도되는 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 동종이형 갯수의 감소로서, 상기 변경 분자가 INFβ야생형으로부터 유도되는 상기 1 차 서열의 연속적인 아미노산 잔기의 하기 스트링 내 하나 이상의 위치에서의 변경을 포함하는 감소:

.
제 21 항에 있어서, 상기 변경이 1 - 9 개의 아미노산 잔기 치환인 분자.
제 21 항에 있어서, 상기 치환이 스트링 R1 및 R2 로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기에서 수행되는 분자.
제 21 항에 있어서, 상기 치환이 스트링 R1 으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기에서 수행되는 분자.
제 21 항에 있어서, 상기 치환이 스트링 R2 로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기에서 수행되는 분자.
제 20 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 스트링 R1 또는 R2 외부에서 추가적으로 하나 이상의 아미노산 잔기 치환이 수행되는 분자.
제 20 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 분자에서 하나 이상의 하기 위치의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 분자: 50, 57, 59, 60, 62, 63, 66, 67, 69, 70, 125, 126, 129, 130, 132, 133, 138.
제 26 항에 있어서, 상기 치환이 50, 57, 59, 60, 62, 63, 66, 67, 69 또는 70 으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에서 수행되는 분자.
제 26 항에 있어서, 상기 치환이 125, 126, 129, 130, 132, 133 또는 138 로부터 선택되는 하나 이상의 위치에서 수행되는 분자.
제 26 항에 있어서, 상기 치환이 위치 57 및 67 에서 수행되는 분자.
제 29 항에 있어서, 상기 치환이 L57A 및 F67H 인 분자.
제 30 항에 있어서, 추가적인 치환이 군 50, 59, 60, 62, 63, 66, 69, 70, 125, 126, 129, 130, 132, 133, 138 로부터 선택되는 하나 이상의 위치에서 수행되는 분자.
제 27 항에 있어서, 상기 치환이 F50A, L57A, I59A, Y60N, M62A, L63A, I66T, F67H, I69A, F70A 로부터 선택되는 분자.
제 28 항에 있어서, 상기 치환이 Y125A, Y126A, I129A, L130A, Y132S, L133A, Y138H, Y138A 로부터 선택되는 분자.
제 31 항에 있어서, 상기 추가적인 치환이 군 F50A, I59A, Y60N, M62A, L63A, I66T, I69A, F70A, Y125A, Y126A, I129A, L130A, Y132S, L133A, Y138H, Y138A 로부터 선택되는 분자.
인간 인터페론 베타 (INFβ) 의 생물학적 활성을 가지며, 본질적으로 생체내사용시 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 비개질 분자보다 덜 면역원성이거나 또는 비면역원성인, 하기 방법에 의한 1 차 서열에서의 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 수득되는 개질 분자: (i) MHC 클래스 II 상에 존재함으로써 T 세포를 자극하거나 또는 결합하는 능력을 나타내는 펩티드 서열 또는 MHC 클래스 II 리간드인, 본래 비개질 분자로부터 유도된 하나 이상의 T 세포 에피토프의 제거 및/또는 (ii) 상기 분자로부터 유도된 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 갯수 감소 (상기 치환은 하기로부터 선택되는 하나 이상의 군에 상응하는 야생형 분자 INFβ에서의 하나 이상의 위치에서 수행된다:

(i) L57A, F67H,

(ii) F50A, L57A, I59A, Y60N, M62A, L63A, I66T, F67H, I69A, F70A 및

(iii) Y125A, Y126A, I129A, L130A, Y132S, L133A, Y138H, Y138A

(iv) 서열 R1 내의 임의의 위치, 및

(v) 서열 R2 내의 임의의 위치).
제 35 항에 있어서, 서열 R1 내에서의 하나 이상의 하기 치환이 이루어진 분자: F50A, L57A, I59A, Y60N, M62A, L63A, I66T, F67H, I69A, F70A.
제 35 항에 있어서, 서열 R2 내에서의 하나 이상의 하기 치환이 이루어진 분자: Y125A, Y126A, I129A, L130A, Y132S, L133A, Y138H, Y138A.
하기 서열로 이루어진, 감소된 면역원성을 갖는 개질 인간 인터페론 베타 (INFβ):

(서열 중, X⁰는 C, S 이며;

X¹는 F, A 이며;

X²는 L, A 이며;

X³는 I, A 이며;

X⁴는 Y, N 이며;

X⁵는 M, A 이며;

X⁶는 L, A 이며;

X⁷는 I, T 이며;

X⁸는 F, H 이며;

X⁹는 I, A 이며;

X¹⁰은 F, A 이며;

여기서, 동시에 X¹= F, X²= L, X³= I, X⁴= Y, X⁵= M, X⁶= L, X⁷= I, X⁸= F, X⁹= I 및 X¹⁰= F 인 것은 제외된다).
하기 서열로 이루어지는 감소된 면역원성을 갖는 개질된 인간 인터페론 베타 (INFβ):

(서열 중, X⁰는 C, S 이며;

X¹는 Y, A 이며;

X²는 Y, A 이며;

X³는 I, A 이며;

X⁴는 L, A 이며;

X⁵는 Y, S 이며;

X⁶는 L, A 이며

X⁷는 Y, H, A 이며;

여기서 동시에 X¹= Y, X²= Y, X³= I, X⁴= L, X⁵= Y, X⁶= L 및 X⁷= Y 인 것은 제외된다).
제 38 항에 있어서, 제 39 항에 따른 치환을 추가로 포함하는 개질 INFβ 서열.
제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 치환이 수행된 개질 INFβ서열.
제 41 항에 있어서, 추가 치환이 부분 서열 R1 및/또는 R2 (R1 및 R2 는 제 20 항에 기재된 바와 같이 정의된다) 내의 하나 이상의 위치에서 수행된 개질 INFβ서열.
제 1 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항의 개질 INFβ를 코딩하는 DNA 서열.
임의로는 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 제 1 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에서 정의된 INFβ의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자를 함유하는 약제학적 조성물.
하기 단계를 포함하는, 상기 제 1 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에서 정의된 INFβ의 생물학적 활성을 갖는 개질 분자의 제조 방법:

(i) 폴리펩티드 또는 그의 일부의 아미노산 서열의 결정 단계;

(ii) 시험관내 또는 전산 기술 또는 생물학적 검정을 사용 하의 펩티드의 MHC 분자에 대한 결합의 결정을 포함하는 임의의 방법에 의한 단백질의 아미노산 서열 내 하나 이상의 잠재적인 T 세포 에피토프의 동정 단계;

(iii) 시험관내 또는 전산 기술 또는 생물학적 검정을 사용하여 펩티드의 MHC 분자로의 결합에 의해, 또는 펩티드-MHC 복합체의 T 세포로의 결합에 의해 결정된 바와 같은 T 세포 에피토프의 활성을 본질적으로 감소시키거나 또는 제거하는 방식으로 개질된, 동정된 잠재적인 T 세포 에피토프 내에 하나 이상의 아미노산을 가진 신규한 서열 변이체의 고안 단계;

(iv) 재조합 DNA 기술에 의한 상기 서열 변이체의 구축 및 요망되는 특성을 가진 하나 이상의 변이체를 동정하기 위한 상기 변이체의 시험 단계; 및

(v) 단계 (ii) - (iv) 의 임의 반복 단계.
제 45 항에 있어서, 단계 (iii) 이 본래 존재하는 임의의 T 세포 에피토프의 1 - 9 개의 아미노산의 치환, 부가 또는 결실에 의해 수행되는 방법.
제 45 항에 있어서, 변경이 동종 단백질 서열 및/또는 전산적 모델링 기술로 수행되는 방법.
제 45 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii) 가 하기 단계로 수행되는 방법: (a) 공지된 아미노산 잔기 서열을 갖는 펩티드의 영역 선별 단계; (b) 후속적으로, 예정된 단일 크기의, 선별된 영역으로부터의 3 개 이상의 아미노산 잔기로 이루어지는 중복 아미노산 잔기 절편의 샘플링 단계; (c) 상기 샘플링된 아미노산 잔기 절편에 존재하는 각각의 소수성 아미노산 잔기 측쇄에 대해 정해지는 값을 합하는 각각의 상기 샘플링된 절편에 대한 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어의 계산 단계; 및 (d) 펩티드의 치료적 유용성을 본질적으로 감소시키지 않고, 펩티드에 대한 전체적인 MHC 클래스 II 결합 스코어를 변화시키기 위해, 상기 절편에 대해 계산된 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어를 기준으로 하는, 개질에 적합한 하나 이상의 상기 절편의 동정 단계.
제 48 항에 있어서, 단계 (c) 가 하기에 의해 12 - 6 반 데르 발스 (van der Waal's) 리간드-단백질 에너지 반발 항 및 리간드 배치 에너지 항을 포함하도록 변형된 봄 스코어링 함수를 사용하여 수행되는 방법: (1) MHC 클래스 II 분자 모델을 근거로 하는 첫번째 데이타의 제공; (2) 상기 MHC 클래스 II 분자 모델에 대해 허용된 펩티드 골격을 근거로 하는 두번째 데이타의 제공; (3) 상기 첫번째 데이타베이스로부터의 모델의 선택; (4) 상기 두번째 데이타베이스로부터 허용되는 펩티드 골격의 선택; (5) 각각의 샘플링된 절편에 존재하는 아미노산 잔기 측쇄의 동정; (6) 각각의 샘플링된 절편에 존재하는 모든 측쇄에 대한 결합 친화성의 결정; 및각각의 상기 모델 및 각각의 상기 골격에 대한 단계 (1) 내지 (5) 의 반복.
잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 13 개의 연속 아미노산 잔기로 이루어지며, 비개질 INFβ의 1 차 서열로부터 생성되며, 도 1 에 도시된 군으로부터 선택되는 펩티드 분자.
잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖는 12 개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어지며, 비개질 INFβ의 1 차 서열로부터 생성되며, 제 20 항에 기재된 바와 같은 부분 서열 R1 또는 R2 의 임의의 군으로부터 선택되는 펩티드 분자.
제 51 항에 있어서, 도 8 로부터 선택되는 펩티드 분자.
제 50 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 기재된 T 세포 에피토프 펩티드로부터 선택되는 9 개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드 서열.
잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖고, 비개질 INFβ의 1 차 서열로부터 제작된 9 - 15 개의 연속 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드 분자로서, 펩티드에 의한 자극에 의해 스코어링된 세포 증식값을, 수용자 펩티드에서가 아닌, 대조군 세포에서 스코어링된 세포 증식값으로 나누어 (상기 세포 증식은 임의의 적합한 수단으로 측정된다) 구하는, 세포 증식의 생물학적 검정에서의 자극 지수가 1.8 이상, 바람직하게는 2 이상인 펩티드 분자.
생체내 사용시 생물학적 활성이 동일하거나 또는 허용되는 정도로 감소된, 본질적으로 면역원성이 없거나 또는 임의의 비개질 분자보다 면역원성이 덜한 INFβ제조를 위한, 제 50 항 내지 제 54 항 중 한 항에 따른 펩티드의 용도.
생체내에서 INFβ에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 환자에게 백신접종하기 위한, 제 20 항의 임의의 서열 R1 또는 R2 로부터 유도된 펩티드 또는 펩티드 서열의 용도.
임의로는 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께, 제 20 항의 임의의 R1 또는 R2 로부터 유도된 합성 펩티드 서열을 함유하는 약제학적 조성물.