KR20020096367A

KR20020096367A - 관절염 예방 또는 치료제 및 그것의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20020096367A
Application number: KR1020010034773A
Authority: KR
Inventors: 전장수; 허태린
Original assignee: 주식회사 티지 바이오텍
Priority date: 2001-06-19
Filing date: 2001-06-19
Publication date: 2002-12-31
Also published as: WO2002102367A1; US20040176289A1

Abstract

본 발명은 관절염 예방 또는 치료제 및 그것의 스크리닝 방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 세포외 신호 조절 단백질 키나제-1 및 -2 (extracellular signal regulated protein kinase-1 and -2; 이하 "ERK-1/-2" 라고 한다) 또는 그것의 직접적인 상위 신호전달 분자인 MEK-1 및 -2 (MAP kinase kinase-1/-2) 활성억제제를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료제, 및 ERK-1/-2 또는 그것의 직접적인 상위 신호전달 분자인 MEK-1/-2 활성억제제의 탐색을 통한 관절염 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 관절염의 발생과 진행에 결정적인 역할을 하는 ERK-1/-2 또는 그것의 직접적인 상위 신호전달 분자인 MEK-1/-2의 활성을 억제함으로써 근본적으로 관절염을 치료 또는 예방할 수 있으며, 상기 ERK-1/-2 또는 MEK-1/-2의 활성억제제의 탐색을 통하여 관절염의 예방 또는 치료제를 효과적으로 스크리닝할 수 있다.

Description

관절염 예방 또는 치료제 및 그것의 스크리닝 방법{Pharmaceutical composition for the prevention and treatment of arthritis having effect of essential treatment and a method for screening it}

본 발명은 관절염 예방 또는 치료제 및 그것의 스크리닝 방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 세포외 신호조절 단백질 키나제-1 및 -2(extracellular signal regulated protein kinase-1/-2; 이하 "ERK-1/-2" 라고 한다) 또는 그것의 직접적인 상위 신호전달 분자인 MEK-1 및 -2(MAP kinase-1/-2) 활성억제제를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료제, 및 ERK-1/-2 또는 그것의 직접적인 상위 신호전달 분자인 MEK 활성억제제의 탐색을 통한 관절염 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

퇴행성관절염은 관절을 구성하는 연골세포(chondrocytes)에 노화 등의 퇴행이 발생하여 연골세포에서 관절의 기질물질들인 유형 Ⅱ 콜라겐(type-Ⅱ collagen) 및 프로테오글리칸(proteoglycan) 등의 합성이 저해됨과 동시에 인터루킨-1β( interleukin-1β; 이하 "IL-1β"라고 한다) 및 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α; 이하 "TNF-α"라고 한다) 등의 염증성 사이토카인(cytokine)이 생성됨에 따라 관절기질을 분해하는 기질 금속 단백질 분해효소(matrix metalloproteinase; 이하 "MMP"라고 한다)의 합성 및 활성이 관절세포에서 증가됨으로 인해 관절조직이 파괴됨으로써 유발되는 질병이다. 또한 관절염은 염증성 사이토카인에 의한 일산화질소(NO)의 생성과 생성된 일산화질소에 의한 자가증폭적인사이토카인의 생성으로 더욱 많은 MMP의 합성이 유발되게 되어 관절기질의 분해가 촉진됨으로써 더욱 악화된다. 이와 동시에 염증성 사이토카인은 지질대사산물인 프로스타글란딘 E2(prostagladin E2; 이하 "PGE2"라고 한다)의 생성을 증가시켜 관절염에서 염증반응을 유발시킨다.

현재 임상적으로 사용되고 있는 퇴행성관절염의 치료는 약물치료제(진통제, 스테로이드제, 비스테로이드계 항염제 등)나 연골보호제(히알루론산, 글루코사민, 콘드로이틴 등)를 이용하거나 수술적 처치(관절경 수술, 경골 근위부 절골술, 관절 부분 치환술, 슬관절 전치환술 등)에 의한다. 그러나 이들 방법은 연골세포 퇴행이나 MMP의 활성 및 합성의 제어 등의 근본적인 원인 제거와는 직접적인 연관성이 없다. 즉 약물치료제의 경우는 통증이나 염증반응 자체를 비특이적으로 완화시키는 효과만을 가지며 연골보호제는 단지 연골세포에 영양을 공급해 주거나 충격을 완화시킴으로써 관절을 보호해 주는 역할을 할 뿐이다. 더구나 이러한 약물들은 체중증가, 고혈압 유발, 소화성 궤양 유발 등의 부작용도 나타내기 때문에 선택에 신중을 기하여야 한다. 최근에는 세포공학(cell therapy) 및 조직공학(tissue engineering) 기술을 이용하여 퇴행성 관절 자체를 대체하고자 하는 방법이 시도되고 있으나 세포 및 조직공학에 필요한 대량의 연골세포를 증식시키는 과정에서 연골세포의 특성을 소실하는 탈분화(de-differentiation) 현상이 일어나기 때문에 적용하기에 어려움이 있다.

지금까지 연골세포의 탈분화나 노화 등에 의해 연골기질의 합성이 감소되는분자적 조절기구는 밝혀진 바 없다. 즉 IL-1β 및 TNF-α 등 염증성 사이토카인에 의한 관절기질 분해효소 MMP의 생성과 이에 의한 연골조직의 분해 과정은 잘 알려져 있으나 사이토카인의 생성기작, 유전자 발현 및 단백질 활성 조절 등의 분자적 조절기구에 대해서는 대부분 알려져 있지 않다. 또한 현재 퇴행성관절염 치료에 응용되고 있는 약물 및 수술적 치료는 일시적인 통증이나 염증의 완화를 위한 것으로 근본적인 치료법이 될 수 없고 히알루론산, 글루코사민, 콘드로이틴 등의 물질도 단순한 연골세포 보호제일 뿐 궁극적인 연골 퇴행 및 이로 인한 관절염에 대한 저해제나 치료제는 아니다.

따라서 관절염을 궁극적으로 치료하기 위해서는 연골세포의 퇴행에 결정적인 요인으로 작용하는 MMP의 발현 및 활성 증가, 연골세포에서 관절기질물질의 생성 감소를 일으키는 기작, 염증반응을 일으키는데 관여하는 연골세포내 신호전달 과정, 유전자 발현조절 및 관련된 조절단백질의 특성과 작용에 대한 규명이 선행되어야 한다.

이에, 본 발명자들은 단백질 인산화효소의 하나인 ERK-1/-2의 활성화에 의해 연골세포의 탈분화와 퇴행이 촉진되고, 동시에 관절연골조직을 분해하는 단백질 분해효소인 MMP의 발현도 증가되며, 일산화질소의 생성촉진과 관절염의 증상인 염증반응에 관여하는 PGE2의 생성을 촉진시키는 사이클로옥시제나제(cyclooxygenase-2; 이하 "cox-2"라고 한다)의 발현이 함께 증가되어 결국 관절염이 발생되고 진행됨을 확인하여 ERK-1/-2의 활성 억제제가 관절염의 발생 및 진행을 효과적으로 억제하여관절염을 근본적으로 치료할 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 근본적인 치료 또는 예방 효과를 지닌 관절염 예방 또는 치료제 및 그것의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 연골세포의 분화 및 퇴행과정을 연구하기 위한 세포배양 시스템을 나타내는 모식도이고,

도 2의A는 미세배양에 의한 연골세포의 분화를 나타내는 그림이고,

도 2의B는 단층계대배양에 의한 연골세포의 탈분화를 나타내는 그림이며,

도 2의C는 탈분화된 연골세포의 재분화를 나타내는 전기영동 사진이고,

M : 단층 계대배양(monolayer culture),

A : 알지네이트 젤 비드(alginate gel bead)를 이용한 배양

도 3의A는미세배양에 의한 연골세포의 분화과정에서 ERK-1/-2의 활성변화를 나타내는 전기영동 사진이고,

도 3의B는 MEK-1/-2 활성억제제에 의한 ERK-1/-2 활성의 억제를 나타내는 전기영동 사진이고,

도 3의C는 ERK-1/-2 활성억제에 의한 연골세포분화 촉진을 나타내는 그래프이고,

도 4의A는 연골세포의 탈분화과정에서 ERK-1/-2의 활성이 증가하는 것을 나타내는 전기영동 사진이며,

NB : 노던 블랏(Northern blot) 분석,

WB : 웨스턴 블랏(Western blot) 분석

도 4의B는 ERK-1/-2 활성억제제를 이용하여 ERK-1/-2의 활성을 억제하면 유형 Ⅱ 콜라겐의 합성이 증가함을 나타내는 전기영동 사진이고,

NB : 노던 블랏 분석, WB : 웨스턴 블랏 분석

도 4의C는 ERK-1/-2 활성억제제가 농도 의존적으로 유형 Ⅱ 콜라겐의 합성을 증가시키는 것을 나타내는 전기영동 사진이고,

NB : 노던 블랏 분석, WB : 웨스턴 블랏 분석

도 4의D는 ERK-1/-2 활성억제제가 농도 의존적으로 프로테오글리칸의 합성을 증가시키는 것을 나타내는 그래프이며,

도 5는 ERK-1/-2의 활성저해가 유형 Ⅱ 콜라겐 합성의 증가와 활성형 ERK-1/-2의 감소를 유도함을 나타내는 면역형광 사진이며,

A: P0와 P2 단계에서의 유형 Ⅱ 콜라겐과 활성형 ERK-1/-2의 분포양상,

B: P0와 P4 단계에서의 활성형 ERK-1/-2의 분포양상

도 6은 NO 공여체인 SNP(S-nitroso-N-acetyl penicillamine)의 처리에 의한 연골세포에서 NO 생성을 나타내는 도표이고,

A: SNP의 농도의존적인 NO 생성,

B: SNP 처리 시간 의존적인 NO 생성

도 7은 SNP에 의한 연골세포의 탈분화를 나타내는 사진이며,

A: SNP에 의한 유형 II 콜라겐의 발현감소,

B: SNP에 의한 프로테오글리칸의 합성감소

도 8은 ERK-1/-2의 활성저해가 SNP에 의한 연골세포의 탈분화를 차단함을 나타내는 사진이며,

A: SNP에 처리시간에 따른 ERK-1/-2 활성화,

B: SNP 농도에 의존적인 ERK-1/-2 활성화,

C: ERK-1/-2 활성저해에 의한 유형 II 콜라겐의 발현 회복,

D: ERK-1/-2 활성저해에 의한 프로테오글리칸의 발현 회복

도 9는 염증성 사이토카인인 인터루킨1-β가 MMP-9의 활성을 유도함을 나타내는 전기영동 사진이고,

도 10의 A는 인터루킨1-β에 의한 ERK-1/-2의 활성화를 나타내는 전기영동 사진이고, B는 ERK-1/-2 활성의 억제가 인터루킨1-β에 의한 MMP-9의 활성화를 저해함을 나타내는 전기영동 사진이고,

도 11은 인터루킨1-β에 의한 연골세포에서 NO 생성이 ERK-1/-2 활성 저해에 의해 억제됨을 보여주는 그래프이며,

도 12는 인터루킨1-β에 의한 cox-2(cyclooxygenase-2)의 발현이 ERK-1/-2 활성저해에 의해 차단됨을 나타내는 그림이며,

도 13는 연골세포의 분화 및 퇴행과정에서 ERK-1/-2의 역할을 나타내는 모식도이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ERK-1/-2 또는 그것의 직접적인 상위 신호전달 분자인 MEK-1/-2 활성억제제를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료제을 제공한다.

또한, 본 발명은 ERK-1/-2 또는 그것의 직접적인 상위 신호 전달물질인 MEK-1/-2의 활성억제제의 탐색을 통한 관절염의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상기의 순서에 따라 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 본 발명은 ERK-1/-2 또는 그것의 직접적인 상위 신호전달분자인 MEK의 활성억제제를 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 또는 치료제를 제공한다.

본 발명의 ERK-1/-2의 활성억제제 또는 MEK-1/-2의 활성억제제에는 2-(2-아미노-3-메톡시페놀)-4H-1-벤조피란-4-온(2-(2-amino-3-methoxyphenol)-4H-1-benzopyran-4-one) 및 1,4-디아미노-2,3-디시아노-1,4-비스(2-아미노페닐씨오)부타디엔(1,4- diamino -2,3-dicyano-1,4-bis(2-aminophenylthio)butadiene) 등이 있다. 그러나, 상기에서 기술한 화합물이외에도 모든 ERK-1/-2 또는 MEK-1/-2의 활성억제제가 본 발명의 범주에 속하게 됨은 당업자에게 있어서 당연한 것이다.ERK-1/-2는 MEK-1/-2에 의해서 활성화되기 때문에 MEK-1/-2의 활성을 억제하면 ERK-1/-2의 활성이 곧바로 억제되므로 MEK-1/-2는 ERK-1/-2의 직접적인 상위 신호전달분자가 된다.

본 발명의 ERK-1/-2 또는 MEK-1/-2의 활성억제제를 포함하는 관절염 예방 또는 치료제가 어떻게 관절염을 근본적으로 예방 또는 치료할 수 있는가를 살펴보면 다음과 같다.

먼저, 본 발명자들은 ERK-1/-2 또는 MEK의 활성의 저해가 연골세포로의 분화에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, 계배의 간충직 세포가 다층 세포배양으로 유지될 경우 배양 3일째부터 연골세포로의 분화가 시작되었는데, 연골세포의 분화는 웨스턴 블라팅 분석에 의해 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현을 확인함으로써 증명하였다(도 3참조). 연골세포의 분화과정에서 ERK-1/-2의 발현에는 차이가 없었으나 ERK-1/-2의 활성은 유형 Ⅱ 콜라겐 발현과는 반대로 현저히 감소하였다. 간충직 세포에 ERK-1/-2의 상위 신호전달자인 MEK의 활성을 2-(2-아미노-3-메톡시페놀)-4H-1-벤조피란-4-온으로 저해하였을 경우 ERK-1/-2의 활성이 농도 의존적으로 감소하였고, 이때 연골세포에서 프로테오글리칸의 합성을 알시안 블루(alcian blue) 염색으로 확인하였을 때 그 합성이 현저히 증가하였으며 또한 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현도 현저히 증가하였다. 따라서 ERK-1/-2 또는 MEK의 활성의 억제가 간충직 세포에서연골세포로 분화하는데 필요하다는 것을 확인하였고, ERK-1/-2 또는 MEK의 활성을 인위적으로 억제함으로써 연골세포의 분화를 촉진할 수 있다는 것을 증명하였다.

또한, 본 발명자들은 ERK-1/-2 또는 MEK의 활성이 단층계대배양에 의한 연골세포의 탈분화 과정에 미치는 영향을 조사하였다. 웨스턴 블라팅과 노던 블라팅으로 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현을 분석한 결과 그 발현정도는 P0에서 가장 높았고, P1에서 감소하기 시작하였으며, P3 이후에는 거의 나타나지 않았다(도 4의A참조). 한편 ERK-1/-2의 활성도는 P0에서 매우 낮았으나, 연이은 단층 계대배양에 의해 ERK-1/-2의 활성은 현저히 증가하였으며 이는 ERK-1/-2 또는 MEK의 활성의 발현과는 관련이 없었다. 따라서 ERK-1/-2의 활성 또는 MEK의 활성은 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현과 반비례한다는 것을 알 수 있었고 이는 탈분화 과정에서 ERK-1/-2 활성 또는 MEK의 활성이 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.

또한, 본 발명자들은 ERK-1/-2 또는 MEK의 활성과 탈분화와의 연관성을 알기 위해 계대배양 중인 세포들에 ERK-1/-2 또는 MEK의 활성억제제를 처리한 후 콜라겐 및 프로테오글리칸의 합성 정도를 조사하였다. 그 결과, ERK-1/-2 또는 MEK의 활성억제제의 처리에 의해 ERK-1/-2의 활성이 차단됨을 확인하였으며(도 4의B참조) 그 정도는 처리된 화합물의 농도에 의존적이었다(도 4의C참조). ERK-1/-2 활성 또는 MEK의 활성이 저해된 P0 세포에서는 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현이 현저히 증가되었고 또한 P2 세포에서는 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현저해가 반전되는 결과를 나타내었다(도 4의B참조). 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현과 더불어 ERK-1/-2또는 MEK의 활성의 저해는 프로테오글리칸의 합성을 증가시켰는데, 알시안 블루 염색법으로 확인한 결과 P0에서 2.6배, P2에서 6.4배 만큼 증가시켰다(도 4의D참조). 따라서 탈분화된 연골세포에서 ERK-1/-2 또는 MEK의 활성저해는 유형 Ⅱ 콜라겐과 프로테오글리칸의 합성을 유도함을 증명하였다.

관절염에서 연골 기질분자의 파괴는 연골세포에서 염증성 사이토카인에 의한 NO의 생성을 수반하고 생성된 NO는 궁극적으로 연골기질을 파괴하는 효소의 생성을 유도하고 또한 연골세포의 탈분화를 유도한다. 본 발명자들은 연골세포에서 SNP 처리에 의해 직접적으로 NO 생성을 유도하면 유형 II 콜라겐 및 프로테오글리칸의 발현을 저해하여 탈분화를 유도함을 확인하였다(도 7참조). 연골세포에서 NO의 생성은 SNP의 농도 및 시간에 비례적으로 ERK-1/-2 활성화를 유도하였고 활성저해제에 의한 ERK-1/-2 활성의 인위적인 억제는 NO에 의한 연골세포의 탈분화를 차단함을 밝혔다(도 8참조). 따라서 연골세포에서 ERK-1/-2활성의 억제는 계대배양 및 NO에 의한 탈분화를 차단하여 관절염에 수반되는 탈분화를 억제하여 연골조직을 유지하게 함을 증명하였다.

연골세포에 의한 연골 기질분자의 파괴는 염증성 사이토카인에 의한 MMP의 발현 및 활성화에 기인하므로, 먼저 본 발명자들은 ERK-1/-2 활성과 MMP 발현과의 상관관계를 조사하였다. 그 결과, 연골세포에 염증성 IL 1-β를 처리하였을 경우 농도 의존적으로 MMP-9의 발현이 현저히 증가함을 확인하였다(도 9참조). 또한 연골세포에 IL1-β를 처리하면 ERK-1/-2의 활성이 초기에 일시적으로 증가하며, 이러한 ERK-1/-2의 활성을 ERK-1/-2 활성억제제를 사용하여 억제하면 MMP-9의 발현이 차단됨을 확인하였다(도 10의A및도 10의B참조). 따라서 연골세포에서 ERK-1/-2의 활성억제 또는 그것의 직접적인 상위 신호전달분자인 MEK의 활성 억제는 연골기질분자의 합성을 증대시켜 연골조직의 형성과 유지를 증대시키고, 연골세포에서 MMP의 발현 및 활성화를 억제함으로서 연골기질분자의 분해를 저해하여 연골조직을 유지하게 함을 증명하였다.

또한, 연골세포에서 IL1-β는 농도 의존적으로 NO의 생성을 촉진하므로, 본 발명자들은 ERK-1/-2 활성저해와 NO 생성 억제와의 상관관계를 조사하였다. 그 결과, IL1-β에 의한 NO 생성은 ERK-1/-2 활성억제제에 의한 ERK-1/-2 활성의 차단으로 완전히 저해됨을 확인하였다(도 11참조). 관절염은 염증성 사이토카인에 의한 NO의 생성과 생성된 NO에 의한 자가증폭적인 사이토카인의 생성으로 더욱 많은 MMP의 합성이 유발됨으로서 악화된다. 따라서 ERK-1/-2 활성억제 또는 그것의 직접적인 상위신호전달분자인 MEK 활성 억제제에 의한 NO 생성의 억제는 염증성 사이토카인에 의한 연골퇴행을 근본적으로 막아줌으로써 관절염의 진행억제와 치료에 유용하다.

또한, 본 발명자들은 ERK-1/-2 활성 저해와 cox-2 발현과의 상관관계를 조사하였다. 그 결과, 연골세포에 IL1-β를 처리하면 농도 의존적으로 cox-2의 발현이 증가하고 IL1-β에 의한 cox-2의 발현 증가는 ERK-1/-2 활성억제제에 의한 ERK-1/-2 활성의 저해로 완전히 차단됨을 확인하였다(도 12참조). 염증성 사이토카인은 지질대사산물인 프로스타글란딘의 한 종류인 PGE2를 생성시켜 염증반응을 유발한다. PGE2는 cox-2에 의해 생성되기 때문에 ERK-1/-2 활성 차단에 의한 cox-2의 발현 저해는 염증반응의 유발을 억제한다. 따라서 ERK-1/-2 또는 그것의 직접적인 상위신호전달 분자인 MEK 활성 억제제에 의한 cox-2의 발현 저해는 관절에서의 염증 억제에 유용하다.

한편, 본 발명의 ERK-1/-2 또는 그것의 직접적인 상위 신호전달분자인 MEK 활성억제제를 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 또는 치료제는 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 관절염 예방 또는 치료제는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

또한, 본 발명의 관절염 예방 또는 치료제는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

상기 관절염 예방 또는 치료제는 주사제의 경우는 0.001-100 ㎎/㎏, 경구 투여제의 경우는 0.01-150 ㎎/㎏이고 하루 1-3 회 투여될 수 있다.

본 발명의 관절염 예방 또는 치료제의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분활 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 관절염 예방 또는 치료제의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수 뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 이러한 점을 고려하여 본 발명의 관절염 예방 또는 치료제의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

또한, 본 발명은 ERK-1/-2의 활성억제제 또는 그것의 상위 신호전달분자인 MEK의 활성억제제의 탐색을 통한 관절염의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기에서 상세히 살펴 본 바와 같이, ERK-1/-2 또는 그것의 직접적인 상위 신호전달분자인 MEK의 활성이 억제되면 연골기질을 분해하는 MMP의 발현 및 활성이 억제되고 MMP의 합성을 촉진시키는데 관여하여 연골퇴행을 악화시키는 작용을 하는 NO의 생성이 저해되고 관절염의 증상인 염증반응에 관여하는 PGE2의 생성을 촉진시키는 cox-2의 발현이 억제됨으로써, ERK-1/-2 또는 MEK의 활성억제제의 탐색을 통하여 관절염의 예방 또는 치료제를 스크리닝할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 연골세포의 분화 및 탈분화

<1-1> 연골세포의 분화

간충직세포가 연골세포로 분화되는 것을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 계배기(Hamburger-Hamilton stage 24-25 chicken embryo) 병아리의 사지 말단(limb bud) 간충직세포를 사용하여 미세배양(microass culture)하에서 연골세포로 분화하는 과정을 관찰하였다(도 1 왼쪽). 구체적으로, 간충직세포들을 10%의 우태아 혈청이 포함된 햄스 배양액(Ham's F-12 medium, GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA)에 2 x 10⁷세포/㎖ 정도로 부유시키고 배양접시에 한 스팟(spot)당 15 ㎕씩 분주하여37℃에서 2시간 동안 배양하여 세포들을 배양접시에 부착시킨 후 10%의 우태아 혈청과 스트렙토마이신(50 ㎍/㎖), 페니실린(50 units/㎖) 등이 포함된 햄스 배양액에서 필요에 따라 여러 약제를 첨가하거나 첨가하지 않고 배양하였다. 그 결과, 연골세포의 분화는 계배의 간충직세포를 5일 동안 미세배양 하였을 경우 연골세포의 특성인 유형 Ⅱ 콜라겐의 합성이 배양 3일째부터 나타나는 것을 항체를 이용한 웨스턴 블라팅법으로 확인함으로써 증명하였고, 또한 황화형 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)의 축적도 유사한 유형으로 증가함을 알시안 블루(alcian blue) 염색을 통해 확인하여 연골세포의 특성이 배양 3일째부터 나타나기 시작하여 5일째에 완전히 연골세포로 분화됨을 확인하였다(도 2A).

<1-2> 연골세포의 탈분화

연골세포의 탈분화를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 출생 2-4주된 토끼의 관절연골세포를 연속적으로 단층 계대배양 하였다(도 1 오른쪽). 구체적으로, 무균적으로 얇게 베어낸 토끼 관절 조각들을 0.2%의 유형 Ⅱ 콜라게나제(colagenase type Ⅱ, Sigma)를 포함하는 인산완충액에서 6시간 동안 반응시킨 후 순간적으로 원심분리하여 단일 세포(single cells)들을 획득하였다. 상기 세포들을 10%의 우태아 혈청, 50 ㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 50 units/㎖의 페니실린이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA) 배지에 현탁시킨 후 배양접시에 5 x 10⁴세포/cm²의 농도로 분주하여 37℃에서 배양하였다. 배양액은 2일마다 교환해 주었으며 배양 5일 후에 세포들이 배양접시에 꽉 차도록 자란 것을 확인하여 이 시기의 세포들을 P0로 규정하였다. 상기 세포들을 다시 배양접시당 5 x 10⁴세포/cm²의 밀도로 계대배양(subculture)하였으며, 세포들이 배양접시에 꽉 차도록 자랄 때마다 계속적으로 계대배양하였고 이를 각각 P1, P2 등으로 규정하였다. 계대배양은 P6 단계에 이를 때까지 계속하여 실시하였다. 그 결과, 토끼 관절의 연골세포를 P0에서부터 P6까지 단층 계대배양 할 경우 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현이 P1에서부터 감소하기 시작하여 P3부터는 전혀 나타나지 않음을 항체를 이용한 웨스턴 블라팅으로 확인하였고, 황화형 글라이코사미노글라이칸(glycosaminoglycan)의 축적도 유사한 유형으로 계대배양을 진행할수록 감소함을 알시안 블루(alcian blue) 염색을 통하여 확인하였다. 또한 연골세포의 모양이 특징적인 둥근 형태에서 퇴행된 연골세포의 특징인 섬유아세포 모양을 나타냄을 확인하여 연골세포의 탈분화 및 퇴행을 증명하였다(도 2B).

<실시예 2> ERK-1/-2 활성의 저해에 의한 연골세포 분화촉진

본 발명자들은 ERK-1/-2 활성의 저해가 연골세포로의 분화에 미치는 영향을 확인하였다. 구체적으로 간충직세포의 미세배양에 의한 연골세포 분화과정 (도 2A및실시예 1-1참조)에서 ERK-1/-2의 활성변화와 ERK-1/-2 활성저해가 분화에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, 계배의 간충직 세포가 다층 세포배양으로 유지될 경우 배양 3일째부터 연골세포로의 분화가 시작되었는데, 연골세포의 분화는 웨스턴 블라팅 분석에 의해 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현을 확인함으로써 증명하였다(도 3A). 연골세포의 분화과정에서 ERK-1/-2의 발현에는 차이가 없었으나 ERK-1/-2의 활성은 유형 Ⅱ 콜라겐 발현과는 반대로 현저히 감소하였다(도 3A). 간충직 세포에 ERK-1/-2의 상위 신호전달자인 MEK-1 및 MEK-2의 활성을 2-(2-아미노-3-메톡시페놀)-4H-1-벤조피란-4-온(PD98059)으로 저해하였을 경우 ERK-1/-2의 활성이 농도 의존적으로 감소하였고(도 3B), 이때 연골세포에서 프로테오글리칸의 합성을 알시안 블루(alcian blue) 염색으로 확인하였을 때 그 합성이 현저히 증가하였으며(도 3C) 또한 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현도 현저히 증가하였다(도 3A). 따라서 ERK-1/-2의 활성 감소가 간충직 세포에서 연골세포로 분화하는데 필요하다는 것을 확인하였고, ERK-1/-2 활성을 인위적으로 억제함으로써 연골세포의 분화를 촉진할 수 있다는 것을 증명하였다.

<실시예 3> ERK-1/-2의 활성화에 의한 연골세포의 탈분화

<3-1> ERK-1/-2 활성화와 연골세포의 탈분화

ERK-1/-2의 활성이 연골세포의 탈분화 과정에 미치는 영향을 조사하기 위해 토끼 관절의 연골세포를 5 x 10⁴세포/cm²의 밀도로 배양접시에서 배양하였다. 세포들은 2일째에 증식하기 시작하였으며 5일째에 포화상태에 도달되어 이 단계의 세포를 P0로 규정하였다. 이 시기의 세포들은 둥글고 다각형인 전형적인 연골세포의 형태를 유지하였으나 P6까지의 연속적인 분주를 통해 납작하고 섬유아세포 같은 형태가 유발되었다(도 2B). 웨스턴 블라팅과 노던 블라팅으로 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현을 분석한 결과 그 발현정도는 P0에서 가장 높았고, P1에서 감소하기 시작하였으며, P3 이후에는 거의 나타나지 않았다(도 4A). 한편 ERK-1/-2의 활성도는 P0에서 매우 낮았으나, 연이은 단층 계대배양에 의해 ERK-1/-2의 활성은 현저히 증가하였으며 이는 ERK-1/-2의 발현과는 관련이 없었다(도 5A). 따라서 ERK-1/-2의 활성은 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현과 반비례한다는 것을 알 수 있었고 이는 탈분화 과정에서 ERK-1/-2 활성이 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.

<3-2> ERK-1/-2 활성 저해에 의한 탈분화 억제

ERK-1/-2 활성과 탈분화와의 연관성을 알기 위해 계대배양 중인 세포들에 ERK-1/-2 활성억제제인 2-(2-아미노-3-메톡시페놀)-4H-1-벤조피란-4-온(PD98059)을 처리한 후 콜라겐 및 프로테오글리칸의 합성 정도를 조사하였다. 구체적으로, 각 패시지의 계대배양 중 관절연골세포에 20 μM의 ERK-1/-2 활성억제제인 2-(2-아미노-3-메톡시페놀)-4H-1-벤조피란-4-온(PD98059)을 첨가하여 2일 동안 배양하고 탈분화정도를 콜라겐 및 프로테오글리칸의 합성에 미치는 영향을 조사하여 확인하였다. 그 결과, ERK-1/-2 활성억제제의 처리에 의해 ERK-1/-2의 활성이 차단됨을 확인하였으며(도 5B) 그 정도는 처리된 화합물의 농도에 의존적이었다(도 5C). ERK-1/-2 활성이 저해된 P0 세포에서는 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현이 현저히 증가되었고 또한 P2 세포에서는 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현저해가 반전되는 결과를 나타내었다(도 5B). 유형 Ⅱ 콜라겐의 발현과 더불어 ERK-1/-2의 활성 저해는 프로테오글리칸의합성을 증가시켰는데, 알시안 블루 염색법으로 확인한 결과 P0에서 2.6배, P2에서 6.4배 만큼 증가시켰다(도 5D). 따라서 탈분화된 연골세포에서 ERK-1/-2의 활성저해는 유형 Ⅱ 콜라겐과 프로테오글리칸의 합성을 유도함을 증명하였다.

<3-3> ERK-1/-2 활성억제에 의한 탈분화 유형 II 콜라겐의 발현과 분포

ERK-1/-2 활성억제에 의한 탈분화 억제를 상세히 규명하기 위하여 콜라겐 발현을 면역염색법으로 규명하였다. 구체적으로, 패시지 0 및 2의 관절연골세포에 20 μM의 ERK-1/-2 활성억제제인 2-(2-아미노-3-메톡시페놀)-4H-1-벤조피란-4-온(PD98059)을 첨가하여 2일 동안 배양하고, 세포를 3% 파라포말알데히드 (paraformaldehyde)로 10분간 고정하고, 0.2% 트리톤 X-100(Triton X-100)으로 세포막의 일부를 파괴한 다음, 항-유형 II 콜라겐 항체 (10 μg/ml)를 첨가하여 1시간 배양하였다. 이들 세포에 형광물질인 TRITC가 첨부된 2차항체를 첨가하여 1시간 배양한 후 형광현미경으로 유형 II 콜라겐의 분포를 확인하였다.

그 결과, 대부분의 P0 연골세포들은 유형 Ⅱ 콜라겐을 발현하였으나 그 발현 정도는 이질적이었다(도 6). ERK-1/-2 활성억제제를 처리하여 ERK-1/-2의 활성을 저해한 경우 유형 Ⅱ 콜라겐을 많이 발현하는 세포의 수가 현저히 증가되었다. 유형 Ⅱ 콜라겐의 존재에 의해 나타나는 형광의 정도는 대부분의 P2 세포에서 매우 많이 감소하였으며, ERK-1/-2의 활성을 저해시킨 경우 유형 Ⅱ 콜라겐을 높게 발현하는 세포의 수가 현저히 증가되는 것을 확인하였다(도 5). 따라서 ERK-1/-2의 활성 저해는 더 많은 세포에서, 더 많은 콜라겐 및 프로테오글리칸의 합성을 유도하여 연골조직의 유지에 기여함을 증명하였다.

<실시예 4> ERK-1/-2 활성저해에 의한 NO에 의해 유도된 연골세포 탈분화 억제

<4-1>연골세포에서 NO의 생성

연골세포에서 NO의 생성이 연골세포의 탈분화에 미치는 영향을 조사하기 위해 NO 공여체인 SNP(S-nitroso-N-acetyl penicillamine)를 처리하여 인위적으로 NO 생성을 유도하였다. 그 결과 연골세포에서 SNP의 처리는 SNP의 농도 및 처리시간에 비례하여 NO의 생성이 증가함을 확인하였다(도 6참조).

<4-2> NO 생성에 의한 연골세포의 탈분화

연골세포에서 SNP 처리에 의해 직접적으로 NO 생성을 유도하면 NO 농도 및 처리시간에 비례하여 유형Ⅱ 콜라겐(도 7A참조) 및 프로테오글리칸(도 7B참조)의 발현이 저해됨을 웨스턴 및 노던 블라팅으로 확인하였다. 즉 유형Ⅱ 콜라겐의 발현은 SNP를 24시간 처리할 경우 0.1 mM에서부터 발현이 감소하기 시작하여 1 mM에서 완전히 중지되었으며, 1 mM SNP를 처리할 경우 12시간째부터 감소하기 시작하여 24시간째 유형Ⅱ 콜라겐의 발현이 완전히 중지됨을 확인하였다(도 7A참조). 또한 프로테오글리칸의 합성 역시 SNP의 농도에 의존적으로 감소함을 확인하여(도 7B참조), SNP에 의한 NO의 생성이 연골세포의 탈분화를 유도함을 확인하였다.

<4-3> ERK-1/-2 활성저해에 의한 NO에 의해 유도된 연골세포의 탈분화의 억제

ERK-1/-2 활성이 NO에 의해 유도된 연골세포의 탈분화에 미치는 영향을 조사하기 위해 먼저 SNP 처리에 의한 연골세포에서 ERK-1/-2의 활성변화를 확인하였다. 그 결과, 1 mM SNP를 연골세포에 처리하면 3시간째부터 ERK-1/-2 활성이 증가하기 시작하여 12시간째 최고에 달하고 36시간째부터 감소하기 시작하였다(도 8A참조). SNP에 의한 ERK-1/-2 활성의 증가는 0.5 mM SNP에서부터 나타났고 SNP 농도가 증가할수록 ERK-1/-2활성이 더 많이 증가함을 확인하였다(도 8B참조). SNP에 의한 ERK-1/-2활성의 증가는 20 μM의 ERK-1/-2 활성억제제인 2-(2-아미노-3-메톡시페놀)-4H-1-벤조피란-4-온(PD98059)을 첨가하면 완전히 차단됨을 확인하였다. 저해제에 의한 ERK-1/-2활성의 차단은 SNP에 의한 유형 II 콜라겐의 발현감소를 동시에 차단함을 확인하였고(도 8C참조), 또한 SNP에 의해 유도된 프로테오글리칸의 합성감소 역시 차단됨을 확인하였다(도 8D참조). 따라서 활성저해제에 의한 ERK-1/-2 활성의 인위적인 억제는 NO에 의한 연골세포의 탈분화를 차단함을 확실히 증명하여 연골세포에서 ERK-1/-2활성의 억제는 NO에 의한 탈분화를 차단하여 관절염에 수반되는 탈분화를 억제하여 연골조직을 유지하게 함을 증명하였다.

<실시예 5> ERK-1/-2 활성저해에 의한 MMP 발현억제

연골세포에 의한 연골 기질분자의 파괴는 염증성 사이토카인에 의한 MMP의 발현 및 활성화에 기인하므로, 본 발명자들은 ERK-1/-2 활성과 MMP 발현과의 상관관계를 MMP-9의 활성화를 젤라틴 자이모그래피(gelatin zamography)로 확인하였다.구체적으로, 관절연골세포에 인터루킨(IL) 1-β(10 ng/㎖)를 시간별 혹은 IL 1-β의 농도별로 24시간 처리하고 배양 상등액을 취하여 2% 젤라틴을 함유하는 젤에 전기영동하여 MMP를 분리하였다. 분리한 젤을 MMP의 활성을 유도하는 조건에서 37℃에서 12시간 배양하여 MMP-9에 의한 젤라틴 분해를 유도하고 남아있는 젤라틴을 염색하여 MMP-9에 의한 젤라틴 분해정도를 확인하여 MMP-9의 활성도를 조사하였다.

그 결과,도 9에 나타난 바와 같이 연골세포에 염증성 사이토카인인 인터루킨(IL) 1-β(10 ng/㎖)를 24시간 처리하였을 경우 농도 의존적으로 MMP-9의 발현이 현저히 증가함을 확인하였다. 연골세포에 IL1-β를 처리하면 ERK-1/-2의 활성이 초기에 일시적으로 증가하며(도 10의A), 이러한 ERK-1/-2의 활성을 10 uM의 2-(2-아미노-3-메톡시페놀)-4H-1-벤조피란-4-온(PD98059)을 사용하여 억제하면 MMP-9의 발현이 차단됨을 확인하였다(도 10의B). 따라서 연골세포에서 ERK-1/-2의 활성억제는 연골기질분자의 합성을 증대시켜 연골조직의 형성과 유지를 증대시키고, 연골세포에서 MMP의 발현 및 활성화를 억제함으로서 연골기질분자의 분해를 저해하여 연골조직을 유지하게 함을 증명하였다.

<실시예 6> ERK-1/-2 활성 저해에 의한 NO 생성 억제

연골세포에서 IL1-β는 농도 의존적으로 NO의 생성을 촉진하므로, 본 발명자들은 ERK-1/-2 활성저해와 NO 생성 억제와의 상관관계를 조사하였다. 구체적으로, 연골세포에 다양한 농도의 IL1-β를 24시간 처리한 후 세포배양액으로 분비된 NO의 반응산물인 니트라이트(Nitrite)의 농도를 분광법으로 측정하여 NO의 생성을 정량하였다.

그 결과, IL1-β에 의한 NO 생성은 5 uM의 2-(2-아미노-3-메톡시페놀)-4H-1-벤조피란-4-온(PD98059)에 의한 ERK-1/-2 활성의 차단으로 완전히 저해됨을 확인하였다(도 11). 관절염은 염증성 사이토카인에 의한 NO의 생성과 생성된 NO에 의한 자가증폭적인 사이토카인의 생성으로 더욱 많은 MMP의 합성이 유발됨으로서 악화된다. 따라서 ERK-1/-2 활성 차단에 의한 NO 생성의 억제제는 염증성 사이토카인에 의한 연골퇴행을 근본적으로 막아줌으로써 관절염의 진행억제와 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

<실시예 7> ERK-1/-2 활성 저해에 의한 cox-2 발현 억제

본 발명자들은 ERK-1/-2 활성 저해와 cox-2 발현과의 상관관계를 조사하였다. 구체적으로, 연골세포에 다양한 농도의 IL1-β를 24시간 처리한 후 세포내에 발현되는 cox-2 단백질의 양을 웨스턴블라팅으로 확인하였다

그 결과, 연골세포에 IL1-β를 처리하면 농도 의존적으로 사이클로옥시제나제(cyclooxygenase-2; cox-2)의 발현이 증가하고 IL1-β에 의한 cox-2의 발현 증가는 2-(2-아미노-3-메톡시페놀)-4H-1-벤조피란-4-온(PD98059)에 의한 ERK-1/-2 활성의 저해로 완전히 차단됨을 확인하였다(도 12). 염증성 사이토카인은 지질대사산물인 프로스타글란딘의 한 종류인 PGE2를 생성시켜 염증반응을 유발한다. PGE2는 cox-2에 의해 생성되기 때문에 ERK-1/-2 활성 차단에 의한 cox-2의 발현 저해는 염증반응의 유발을 억제한다. 따라서 ERK-1/-2 활성 차단에 의한 cox-2의 발현 저해제는 관절에서의 염증 억제제로 유용하게 사용될 수 있다.

<실시예 8> 랫트에 대한 비경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원체 부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 실험군당 2마리씩의 동물에 본 발명의 2-(2-아미노-3-메톡시페놀)-4H-1-벤조피란-4-온(PD98059)을 0.5% 메틸셀룰로오즈 용액에 현탁하여 50, 30, 및 10 mg/㎏/15 ㎖의 용량으로 단회 비경구투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화 등을 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액 생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 그 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며 체중변화, 혈액검사, 혈액 생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 본 발명의 2-(2-아미노-3-메톡시페놀)-4H-1-벤조피란-4-온(PD98059)은 랫트에서 50 ㎎/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 비경구투여 최소치사량(LD₅₀)은 50 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

<실시예 9> 관절염 예방 또는 치료제의 스크리닝

ERK-1/-2의 활성화는 그 상위 신호전달분자인 MEK에 의한 인산화를 필요로 한다. 따라서 ERK-1/-2의 활성화 정도는 인산화형 ERK-1/-2에 선택적으로 반응하는 항체를 이용하여 웨스턴 블라팅으로 확인할 수 있음을 본 발명자들은도 3B, 도4B, 도 8C등에서 증명하였다.

ERK-1/-2 또는 MEK의 활성이 억제되면 연골기질의 합성을 증대시키고 또한 연골기질을 분해하는 MMP의 발현 및 활성이 억제되며, MMP의 합성을 촉진시키는데 관여하여 연골퇴행을 악화시키는 작용을 하는 NO의 생성이 저해되고 관절염의 증상인 염증반응에 관여하는 PGE2의 생성을 촉진시키는 cox-2의 발현이 억제됨으로써 ERK-1/-2 또는 MEK의 활성저해제는 관절염의 예방 또는 치료제로 사용될 수 있음을 확인하였다. 따라서 ERK-1/-2 또는 MEK의 활성억제제의 탐색을 통하여 관절염의 예방 또는 치료제를 효과적으로 스크리닝 할 수 있음을 증명하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, ERK-1/-2 또는 MEK-1/-2의 활성이 억제되면 연골기질의 합성을 증대시키고 또한 연골기질을 분해하는 MMP의 발현 및 활성이 억제되면, MMP의 합성을 촉진시키는데 관여하여 연골퇴행을 악화시키는 작용을 하는 NO의 생성이 저해되고 관절염의 증상인 염증반응에 관여하는 PGE2의 생성을 촉진시키는 cox-2의 발현이 억제됨으로써, 본 발명의 관절염 예방 또는 치료제 및 그것의 스크리닝 방법에 의하면 관절염의 근본적인 치료효과를 얻을 수 있으며, ERK-1/-2 또는 MEK의 활성억제제의 탐색을 통하여 관절염의 예방 또는 치료제를 효과적으로 스크리닝 할 수 있다

Claims

세포외 신호 조절 단백질 키나제-1/-2(extracellular signal regulated protein kinase; 이하 "ERK-1/-2" 라고 함) 또는 ERK-1/-2의 직접적인 상위신호 전달 분자인 MEK(MAP kinase kinase) 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료제.
제 1항에 있어서, ERK는 ERK-1, ERK-2 및 이와 아마노산 서열에 있어서 95%의 상동성을 지니는 ERK 변이체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료제.
제 1항에 있어서, MEK는 MEK-1, MEK-2 및 이와 아미노산 서열에 있어서 95%의 상동성을 MEK 변이체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료제.
제 1항에 있어서, ERK 또는 ERK의 직접적인 상위 신호전달 분자인 MEK의 활성억제제는 2-(2-아미노-3-메톡시페놀)-4H-1-벤조피란-4-온(2-(2-amino-3-met hoxyphenol)-4H-1-benzopyran-4-one) (PD98059)와 1,4-디아미노-2,3-디시아노-1,4-비스(2-아미노페닐씨오)부타디엔(1,4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(2-aminophenylthio) butadiene)(U-0126)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료제.
제 4항에 있어서, ERK 또는 ERK의 직접적인 상위 신호전달 분자인 MEK의 활성억제제는 2-(2-아미노-3-메톡시페놀)-4H-1-벤조피란-4-온인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료제.
ERK 또는 ERK의 상위 신호전달분자인 MEK 억제제를 탐색하는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
제 6항에 있어서, ERK는 ERK-1, ERK-2 및 이와 아마노산 서열에 있어서 95%의 상동성을 지니는 ERK 변이체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 6항에 있어서, MEK는 MEK-1, MEK-2 및 이와 아미노산 서열에 있어서 95%의 상동성을 MEK 변이체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.