KR20020092886A - 재조합 아데노바이러스 - Google Patents

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KR20020092886A
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Abstract

본 발명은 향성이 변화된 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다. 상기 아데노바이러스에서 파이버 테일, 파이버 샤프트(shaft) 및 삼향체화 모티프를 함유하는 파이버 놉(knob)을 포함하는 본래의 펜톤 파이버는 세포 결합 구조를 포함하는 본래의 놉 및 본래의 삼량체화 모티프가 제거되고 새로운 세포결합 리간드 및 외부 삼량체화 모티프가 바이러스 파이버내로 도입된다는 점에서 변화된다. 추가로, 본 발명은 생체내 또는 시험관내 방법으로 사람 질환을 치료하기 위한 재조합 아데노바이러스 및 재조합 아데노바이러스 파이버를 아데노바이러스 지놈내로 레스큐시키는(rescuing) 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 아데노바이러스{RECOMBINANT ADENOVIRUS}
임상학적인 유전자 치료법은 1989년에 소개되었다. 이 시기의 목적은 건실한 유전자를 환자의 결함 세포내로 시험관내에서 도입시키고 처리된 세포를 환자에게 다시 주입함으로써 면역계에서의 유전자 결함을 교정하는 것이었다. 이러한 시기 이후, 유전자 치료를 위한 가능한 지침은 극적으로 증가하였다. 이것이 소개된 지 10년이 지난 오늘날, 예컨대, 혈관 질환, 암, 염증성 질환 및 HIV와 같은 감염성 질환을 치료하기 위한 유전자 치료법의 사용이 고찰될 수 있다.
그러나 현재 유전자 치료법은 사람 의학에 있어서 유용한 방법이 아니다. 한가지 주요한 이유는 유전자 치료법이 유전자-캐리어내 운반될 유전자의 팩키징, 또는 벡터를 필요로 한다는 것이며, 이들은 환자내로 주입될 수 있고 의도하는 세포에만 유전자를 표적화시킬 것이다. 이러한 벡터는 지금까지 유용하지 않다.
아데노바이러스(Ad)는 엔벨로프가 없고, 60 내지 85 nm의 직경을 가진 규칙적인 이십면체 모양을 가진 DNA 바이러스이다. 세포결합은 이십면체의 모서리에서 비리온에 앵커링된(anchored) 파이버 단백질을 통해 일어난다. 파이버 단백질은 온전한 비리온의 조립 및 방출을 위해 필수적인 것은 아니다. 비리온의 조립은 감염된 세포의 핵내에서 일어난다.
파이버 폴리펩티드의 동종삼량체인 파이버 단백질은 기능적으로 상이한 3가지 부분을 포함하고 있다: 비리온의 펜톤 염기에 비공유적으로 N-말단 앵커링되어 있고 추가로 핵 국부화 시그널을 함유하는 파이버; Ad3에서 6번, Ad2 및 Ad5에서 22번 반복된 약 15개의 아미노산 파이버 샤프트[참조: Chrobozek J, Ruigrok RWH and Cusack S: Adenovirus Fiber,Current Topics in Microbiology and Immunology, 1995, p 163-200]; 세포성 Ad-수용체에 결합하는 리간드를 포함하는 C-말단의 구상 도메인인 놉(상기 참고문헌내의 검토를 참조). 각각의 샤프트 반복단위는 β-시트를 형성하는 2개의 3-아미노산 영역 및 본래의 연장된 파이버 샤프트의 턴(turn)을 구성하는 2개의 아미노산 영역을 가진다. 삼량체화된 세포결합 도메인의 결정 구조는 결정되었고 그 밖의 역평행 β-샌드위치와 상이한 독특한 위상학을 나타내었다[참조: Di Xia, Henry LJ, Gerard RD and Deisenhofer J: Crystal structure of the receptor-binding domain of adenovirus type 5 fiber protein at 1.7 Å resolution,Structure2: 1259-1270, 1994.]. 비리온의 펜톤 염기에 대한 파이버의 결합은 또한 무세포계에서 일어날 수 있다. 즉, 파이버는파이버가 없는 비리온에 결합할 수 있다[참조: Bouding M-L and Boulanger P: Assembly of Adenovirus Penton Base and Fiber,Virology, 116: 589-604, 1982].
파이버는 펜톤 염기에 결합하는 능력 및 핵으로 수송되는 능력이 남아있는 한 구조적 변형을 허용할 수 있는 것으로 생각된다. 바이러스의 결합 특성을 변화시키기 위해 Ad 파이버를 변형시키는 몇몇 시도가 수행되었다. 짧은 펩티드 리간드는 놉의 C-말단에 첨가되었고[참조: Michael SI, Hoy JS, Curie DT and Engles JT: Addition of a short peptide ligand to the adenovirus fiber protein.Gene Therapy 2: 660-8, 1995.] 옥타펩티드는 놉 "루프"중 하나 내로 도입되었다. Ad 펜톤내로 FLAG 테트라-아미노산 모티프를 도입시킴으로써, Ad에 의해 정상적으로 감염되지 않은 세포에 대해 Ad를 표적화할 수 있음이 밝혀졌다. 이것은 하나의 특이성이 FLAG 펩티드에 대한 것이고 다른 하나의 특이성이 새로운 표적 세포에 대한 것인 2-특이적인 항체를 사용하여 표적화함으로써 수행되었다[참조: Wickham TJ, Segal DM, Roelvink PW, Carrion ME, Lizonova A, Lee GM and Kovesdi I: Targeted Adenovirus Gene Transfer to Endothelial and Smooth Muscle Cells by Using Bispecific Antibodies.J. Virol., 70: 6831-6838, 1996.]. 그러므로 사람 유전자 치료의 목적을 위해 매우 유용한 폭넓은 범위의 사람 세포에 대해 Ad를 표적화시킬 수 있다고 생각된다. 이러한 이유 및 Ad가 유전자 치료학적 적용을 위해 광범위하게 사용된다는 이유로[참조: Trapnell BC and Gorziglia: Gene therapy using adenoviral vectors,Current Opinion in Biotechnology, 5: 617-625, 1994.], 사람 유전자 치료를 위해 유용할 수 있는 재조합 재표적화된 Ad-바이러스를 생성시키는 방법이 개발되었다.
따라서 본 발명의 목적은 향성이 변화된 재조합 아데노바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 사람 질환을 치료하기 위한 재조합 아데노바이러스이다.
본 발명의 추가적인 목적은 재조합 아데노바이러스 파이버를 아데노바이러스 지놈내로 레스큐시키는 방법이다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 재조합 아데노바이러스에 의해 수득되며 청구항에 청구되는 바와 같이 바이러스 파이버를 레스큐시키기 위한 방법이다.
본 발명에 따라 향성이 변화된 재조합 아데노바이러스가 제공된다. 상기 아데노바이러스는 파이버 테일, 파이버 샤프트 및 삼량체화 모티프를 포함하는 파이버 놉을 포함하는 본래의 펜톤 파이버가 세포결합 구조를 포함하는 본래의 놉 및 본래의 삼량체화 모티프가 제거되고 새로운 세포결합 리간드 및 외부 삼량체화 모티프가 바이러스 파이버내로 도입된다는 점에서 변화됨을 특징으로 한다.
구조적 변형은 DNA 기술에 의해 유전자 수준에서 수행되거나 화학적 또는 면역학적 수단에 의해 바이러스 수준에서 수행된다.
본 발명의 또 다른 일면에 따라 상기 확인된 바와 같이 아데노바이러스는 생체내 또는 시험관내 방법으로 사람 질환을 치료하기 위해 사용된다.
본 발명의 추가 일면은 재조합 아데노바이러스 파이버를 아데노바이러스 지놈내로 레스큐시키는 방법이며 하기 단계를 포함한다:
a) (Spe1 부위에서부터 지놈의 말단까지의) 9kb 단편을 서브클로닝하는 단계,
b) Sac1 부위와 Kpn1 부위 사이의 3kb 단편을 추가로 서브클로닝하는 단계,
c) Nde1 부위와 Mun1 부위 사이의 파이버유전자를 결실시키고 결실된 서열을 Xho1 부위를 함유하는 서열 목록의 SEQ ID NO: 13으로 대체시키는 단계;
d) 단계 c)의 작제물의 Nde1 부위와 Xho1 부위 사이에 재조합 파이버를 연결시키는 단계;
e) 대장균에서 상동 재조합을 사용하여 Nhe1으로 절단된 9kb 단편내로 단계 d)의 작제물을 재도입시키는 단계;
f) 단계 e)의 재조합 9kb 단편을 단리시키고 코스미드 클로닝에 의해 지놈의 시작부위에서부터 Spe1 부위까지의 27kb 단편에 9kb 단편을 연결시킴으로써 아데노바이러스 지놈을 재생성시키는 단계.
본 발명은 향성이 변화된 새로운 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 상기 재조합 아데노바이러스는 본래의 놉(knob) 구조를 제거하고 이를 새로운 세포결합 리간드 및 외부 삼량체화 모티프로 대체시킴으로써 작제된다. 본 발명은 또한 사람 질환을 치료하기 위한 새로운 아데노바이러스에 관한 것이다. 또한 본 발명에는 재조합 아데노바이러스 파이버를 아데노바이러스 지놈내로 레스큐시키는(rescuing) 방법이 포함된다.
도면의 간단한 설명
도 1: 본 발명에서 수행된 본래의 파이버에 대한 변형의 요약.
도 2: 재조합 아데노바이러스 파이버.
도 3: 재조합 파이버 유전자를 Ad 지놈내로 레스큐시키는 방법.
도 4a: 트랜스펙션된 세포상에, 및 이차 배양물에 CPE/플라크를 생성시킬 수 있는 Ad 지놈내로 레스큐된 재조합 파이버.
도 4b: 트랜스펙션된 세포상에, 및 이차 배양물에 CPE/플라크를 생성시킬 수 있는 Ad 지놈내로 레스큐된 재조합 파이버.
본 발명에서 Ad의 재표적화는 새로운 세포결합 리간드를 파이버내로 도입시킴으로써 달성된다(도 1). 임의의 세포결합 펩티드가 사용될 수 있는데, 예컨대, 모노클로날 항체 또는 단일 사슬 단편 또는 Fab로서의 이의 단편, T 세포 수용체 또는 이의 단편, RGD와 같은 인테그린 결합 펩티드 또는 표피 성장 인자와 같은 성장 인자가 사용될 수 있다.
지금까지 적용된 리간드에는 표피 성장 인자(EGF), 아미노산 모티프 RGD, HLA-A1과 결합된 MAGE-1 펩티드와 반응하는 클로닝된 T-세포 수용체의 단일 사슬 단편(scTCR)[참조: vd Bruggen P, Traversaari C, Chomez P, Lurquin D, De Plaen E, vd Eynde B, Knuth A and Boon T: A Gene encoding an Antigen Recognized by Cytolytic T Lymphocytes on a Human Melanoma,Science13 December 1991, 1643-1647.], 사람 신장 암종 세포상의 단백질 항원과 반응하는 것으로 밝혀진 높은 선택도를 갖는 모노클로날 항체 G250의 단일 사슬 단편(scFv)[참조: Oosterwijk E, Ruiter DJ, Hoedemaeker PhJ, et al: Monoclonal antibody G250 recognizes a determinant present in renal-cell carcinoma and absent from normal kidney.Int J Cancer38: 489-94, 1986.]이 포함된다. G250은 광범위하게 평가되었고 임상학적 시도에 적용되고 있다(상기 참고문헌 참조).
Ad 벡터는 허용된 세포에 대해 복제가능하거나 복제불능이도록 제조될 수 있다. 종양 치료를 위해, 복제가능 Ad는 복제되어 종양내에서 확산될 수 있다는 잠재적인 장점을 가진다[참조: Miller R and Curiel DT: Towards the use of replicative adenoviral vectors for cancer gene therapy,Gene Therapy3: 557-559]. 이것은 이론적으로는 복제불능인 벡터를 사용하여 수득할 수 있는 것 이상의 선택된 이펙터 메카니즘의 증가를 초래할 수 있다. 또한, 감염성 바이러스는 감염된 세포에 해가 될 수 있는 항바이러스 면역반응의 유발에 의해서 뿐만 아니라 감염된 세포에서의 세포병원성 효과에 의해 항종양 효과에 기여할 수 있다.
재조합 파이버의 작제, 발현 및 평가
변화된 결합-특이성을 가진 기능적인 Ad 파이버를 작제하기 위한 보편적인 방법을 개발하여 재표적화된 Ad를 작제할 수 있도록 하는 것이 목적이다.
아데노바이러스 파이버 펩티드는 활성 바이러스 입자를 생성하기 위해 필수적으로 보유하고 있어야 하는 몇가지 생물학적 기능을 지니고 있다. 하기 파이버 특징들은 기능적인 재조합 파이버 펩티드의 작제에 있어서 매우 중요한 것으로 생각되는 것들이다.
●평행 동종삼량체를 형성하는 능력. 이러한 기능은 야생형 파이버 놉의 N-말단 아미노산 서열에 의해 수행되며 파이버가 펜톤 염기에 결합하여 기능적인 세포결합 놉을 형성할 수 있기 위해 필수적이다.
●펜톤 캡소머를 형성하기 위해 펜톤 염기에 결합하는 능력. 이러한 기능은 야생형 파이버 테일에 의해 수행된다.
●세포를 표적화하기 위해 부착할 수 있도록 해주는 세포결합 리간드를 발현시키는 능력. 이러한 기능은 야생형 파이버 놉에 의해 수행된다.
●아데노바이러스가 감염된 세포의 핵내에서 조립되기 때문에, 감염된 세포의 핵내로 수송되는 능력은 바이러스 형성을 위해 필수적이다. 아마도 전적인 것은 아니지만, 핵 국부화 시그널은 주로 야생형 파이버 테일에 의해 수행된다.
제 1 단계에서 재조합 파이버가 작제되고 커플링된 전사/번역 시스템에서 무세포 발현된 후에 시험관내에서 평가된다. SDS-PAGE 및 자동방사선사진법에 의한 분석은 오픈 리딩 프레인의 존재를 밝히고 번역된 생성물의 크기에 대한 정보를 수득하기 위해 수행된다. 다음 단계에서 재조합 파이버는 바큘로바이러스내로 클로닝되어 파이버의 기능적인 연구를 가능하도록 해주는 곤충 세포에서 발현된다. 이러한 연구에는 삼량체화된 파이버와만 반응하는 것으로 밝혀진 모노클로날 항체 2A6.36으로 면역염색시킴으로써 평가된 바와 같이 삼량체를 형성하는 능력[참조: Shin Hong J and Engler JA: The amino terminus of the adenovirus fiber protein encodes the nuclear localization signal,Virology185: 758-767, 1991], 상응하는 수용체를 발현시키는 세포에 결합하는 능력에 의해 밝혀진 바와 같이 기능적인 리간드의 발현 및 용액중이나 비리온상의 펜톤-염기에 결합하는 능력이 포함된다.
재조합 파이버는 PCR[참조: Clackson T, Gssow D and Jones PT: General application of PCR to gene cloning and manipulation, in PCR, A Practical Approach, Eds McPherson MJ, Quirke P and Taylor GR, IRL Press, Oxford, p 187, 1992], 예컨대, PCR-연결-PCR[참조: Alvaro Ali S, Steinkasserer A: PCR-ligation-PCR Mutagenesis: A Protocol for Creating Gene Fusion and Mutations,BioTechniques18: 746-750, 1995] 및 중첩 신장에 의한 스플라이싱(SOE)[참조:Horton RM and Pease LR: Recombination and mutagenesis of DNA sequences using PCR, in McPherson MJ (ed), Directed Mutagenesis, IRL Press 1991, p 217.]에 기초한 방법론을 사용하여 작제된다. 클로닝은 표준 방법에 따라 수행된다. 재조합 파이버는 퍼킨 엘머 ABI 프리즘(Perkin Elmer ABI Prism)을 사용하여 서열분석되며 포유류 세포 및 곤충 세포에서 발현되고 파이버 테일, 삼량체 파이버 및 새로운 세포결합 리간드에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 염색된다. 하기 파라미터는 면역염색 후에 평가된다:
●삼량체화
●핵 수송
●새로운 세포결합 리간드의 발현.
마지막으로, 재조합 파이버는 하기 설명하는 새롭게 고안된 방법에 의해 Ad 지놈내로 레스큐되며 재조합 바이러스 입자가 생성된다.
본 발명을 하기 실시예에 제한됨이 없이 추가로 설명할 것이다.
실시예 1:
파이버 펩티드는 놉이 파이버의 샤프트 부분으로 끝나는 TLWT 모티프 다음에 도입된 외부 삼량체화 모티프로 대체되는 경우 제조된다. 외부 삼량체화 모티프의 도입 이후 목적은 2가지 이다: a) 본래의 삼량체화 시그널을 함유하는 놉 뿐만 아니라 파이버의 세포결합 부분을 제거하는 것, 및 b) 동시에 필수 삼량체화 시그널을 제공하는 것. 2가지 상이한 아미노산 모티프, 즉, 사람 "폐 표면 단백질 D"로부터의 36 아미노산 "넥 영역 펩티드(Neck Region Peptide)" = NRP(서열 목록에서 SEQ ID NO: 1)[참조: Hoppe H-J, Barlow PN and Reid KBM: A parallel three stranded - helicalbundle at the nucleation site of collagen triple-helix formation.FEBS Letters344: 191-195 (1994).] 및 위치 1 및 위치 4의 류신 잔기가 이소류신으로 대체된 31 aa "지퍼(Zipper)" 모티프 = pII(서열 목록에서 SEQ ID NO: 2)[참조: Harbury PB, Tao Zhang, Kim PS and Alber T: A Switch Between Two-, Three-, and Four-Stranded Coiled Coils in GCN4 Leucine Zipper Mutants.Science262: 1401-1407, 1993.]가 사용되고 있다.
이러한 삼량체화 모티프를 위한 DNA 서열을 계획하에 합성하고, 클로닝하고 서열분석하였다.
놉의 세포결합 기능을 대체시키기 위해 외부 삼량체화 아미노산 모티프에 추가적으로 새로운 세포결합 리간드를 파이버내에 도입시켰다.
재조합 파이버의 핵 수송의 효능을 강화시키기 위해 일부 경우에 있어서 외부 핵 국부화 서열을 파이버에 첨가하였다.
추가적인 구체예에서 파이버는 감염된 세포의 세포질에서 파이버의 생존을 증가시킴으로써, 핵내로의 수송 및 바이러스 조립을 향상시키는 서열을 추가로 포함한다. 이러한 서열은 예컨대, 야생형 놉 또는 SEQ ID NO: 10 내지 12에 존재하는 서열이다.
하기 타입의 파이버를 상기 언급한 방법을 사용하여 작제하였다(도 2 참조). 야생형 파이버의 서열을 SEQ ID NO: 14로서 서열 목록에 제시하였다.
타입 A
삼량체화 모티프가 파이버 놉의 4개의 제 1 아미노산을 구성하는 TLWT 모티프 다음에 파이버 샤프트의 파이버 유전자 다운스트림 또는 임의의 샤프트 반복단위의 제 2 턴(turn)(턴 b)의 다운스트림에 있는 파이버 유전자와 융합되고, 나머지 샤프트 반복단위는 제거된다. 새로운 세포결합 리간드는 삼량체화 시그널과 세포결합 리간드 사이에 첨가될 아미노산 링커 모티프를 가진 삼량체화 시그널의 다운스트림에 도입된다.
타입 B
타입 A와 유사하되, 삼량체화 시그널의 바로 업스트림에 도입된 링커 모티프를 가지고 있다.
타입 C
삼량체화 모티프가 제 1 샤프트 반복단위 다음에 도입되고 다음에 샤프트 반복단위 17 내지 21에 도입된다. 새로운 세포결합 리간드가 삼량체화 시그널과 세포결합 리간드 사이에 첨가될 아미노산 링커 모티프를 가진 삼량체화 시그널의 다운스트림에 도입된다.
타입 D
세포결합 리간드가 파이버 샤프트의 제한 부위 Nhe1과 Hpa1 사이에 도입되고, 리간드의 업스트림과 다운스트림 둘 모두에 첨가될 아미노산 링커를 가지고 있다.
타입 D/Δ
이것은 타입 D의 세포결합 리간드의 파이버 샤프트 다운스트림이 제거된 타입 D의 변이체이다. 타입 D 및 (D/Δ)는 정상적인 놉을 사용하여 작제되며 놉은 타입 A 및 B에서와 같이 외부 삼량체화 시그널로 대체된다.
타입 E
이것은 타입 A와 유사하되, 외부 삼량체화 모티프의 바로 업스트림에 남게 될 놉의 일부분을 가지고 있다.
하기 아미노산 모티프를 상기 파이버 작제물에서 링커로서 사용하였다.
●SEQ ID NO: 3, 슈도모나스 외독소로부터 유도됨.
●SEQ ID NO: 4, 조직 프로트롬빈 활성인자로부터 유도됨.
●SEQ ID NO: 5, 마우스 면역글로불린의 힌지 영역으로부터 유도됨.
●SEQ ID NO: 6, 스태필로코쿠스 단백질 A로부터 유도됨.
●SEQ ID NO: 7, 사람 IgG3의 힌지 영역으로부터 유도됨.
●SEQ ID NO: 8, 사람 Ad5의 샤프트 반복단위 번호 17로부터 유도됨.
재조합 파이버를 바큘로바이러스내로 클로닝하고 Sf9 세포에서 발현시키고/시키거나 벡터 pSecTag 내로 클로닝하고 분비된 단백질로서 COS 세포에서 발현시켰다. 발현을 모노클로날 항체 4D2.5(안티 Ad5 파이버) 및 2A6.36(안티 삼량체화된 Ad5 파이버)로 면역염색시킴으로써 모니터링하였다. 발현 및 삼량체화는 길이 및 삼량체화 모티프와 상관없이 모든 재조합 파이버에서 명백하였다.
작제되었고, 삼량체를 형성하고 새로운 세포결합 리간드를 발현시킬 수 있는 것으로 밝혀진 다양한 파이버를 표 1에 나타내었다. 결과는 고안된 기술이 새로운세포결합 리간드를 발현시키는 삼량체화 파이버를 생성시킬 수 있음을 보여준다. 그러므로 이러한 파이버를 사용하여 기능적인 바이러스를 제조하는 것이 가능할 것이다.
표 I. 상이한 재조합 파이버의 면역염색으로부터의 결과
표 1에 사용된 약어:
2A6: 삼량체화된 파이버에 대한 항체
4D2: 파이버에 대한 항체
a-EGF: 표피 성장 인자에 대한 항체
a-Id: G250에 대해 특이적인 안티 이디오타입 항체
a-Ig: 마우스 면역글로불린에 대한 항체
Cβ: MAGE1/HLA A1에 대한 T 세포 수용체의 β 사슬로부터의 불변 도메인. SEQ ID NO: 11.
CH2: 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 2
EGF: 표피 성장 인자
G250: 신장 암종에 대해 특이적인 모노클로날 항체
H: G250으로부터의 중쇄 가변 서열(SEQ ID NO: 15)
IgG3: 사람 IgG3의 힌지 영역으로부터 유도된 아미노산 링커, SEQ ID NO: 7
J: 면역글로불린 결합 사슬 서열
K: 모노클로날 항체 G250으로부터의 경쇄 가변 서열(SEQ ID NO: 16)
RGD: 아미노산 서열 아르기닌-글리신-아스파르트산
Vα : MAGE1/HLA A1에 대한 T 세포 수용체의 α 사슬로부터의 가변 도메인. SEQ ID NO: 10
Vβ : MAGE1/HLA A1에 대한 T 세포 수용체의 β 사슬로부터의 가변 도메인. SEQ ID NO: 12
실시예 2:
재조합 파이버의 핵 국부화(표 2 및 표 3)
핵 국부화를 관련 바큘로바이러스 클론으로 감염시킨 지 24시간 후에 Sf9 세포중의 파이버를 면역염색시킴으로써 평가하였다. 일부 결과를 하기 표 2에 제시하였다. 일부 재조합 파이버가 파이버 테일에 핵 어드레싱 시그널이 존재함에도 불구하고 Sf9 세포에서 현저하게 손상된 핵 국부화를 나타냄이 이들 실험으로부터 명백하였다.
표 2
Sf9 세포에서 본래 및 선택된 재조합 파이버의 핵 국부화
또한 재조합 및 본래의 파이버를 COS 세포에서 발현시키고 벡터 pcDNA 3.1내로 클로닝한 후에 세포질에서의 발현을 위해 표적화하였다. 이 경우에 파이버 테일에 본래의 핵 국부화 시그널의 존재로 인해, 파이버가 핵에서 검출될 것으로 예상되었다. 그러나, 핵 국부화는 지금까지 야생형 파이버 및 단일-사슬 T-세포 수용체를 가진 파이버, 즉, 가장 효과적인 바이러스를 생성시키는 파이버에서만 검출되었다(하기 참조).
파이버의 핵 국부화가 바이러스 조립을 위해 결정적이기 때문에, 외부 핵 국부화 시그널(NLS)을 첨가함으로써 핵 어드레싱의 효능을 향상시키기 위한 시도를수행하였으며, 이 경우에 SV40 거대 T-항원 NLS는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 9를 가진다[참조: Fisher-Fantuzzi L and Vesco C: Cell-Dependent Efficiency of Reiterated Nuclear Signals in a Mutant Simian Virus 40 Oncoprotein Targeted to the Nucleus.Mol Cell Biol, 8: 5495-5503, 1988]. 외부 NLS 서열을 RGD 모티프의 바로 업스트림에 첨가하였다. 외부 NLS의 존재가 핵 국부화를 극적정으로 향상시켰음이 밝혀졌으며 이 경우에 이를 조사하였다. 실제로, 상기 언급한 바와 같이 외부 NLS가 결여된 파이버 작제물은 트랜스펙션된 세포에서 검출할 수 없었다(표 3).
표 3
세포질에서의 발현에 대해 표적화시킨 후에 COS 세포에서 본래 및 선택된 재조합 파이버의 핵 국부화
약어는 표 1을 참조.
상기 제공된 증거는 재조합 파이버가 온전한 테일 영역의 존재에도 불구하고 핵내로 불충분하게 수송되고(하기 참조) 이것이 파이버 작제물에 외부 NLS를 혼입시킴으로써 교정될 수 있다는 가설을 뒷받침한다.
실시예 3:
재조합 파이버를 비리온내로 레스큐시키는 방법
Ad 지놈내의 야생형 파이버를 하기 방법에 의해 재조합 파이버로 교체하였다(도 3 참조).
Pac1-Pac1 단편으로서 전장 Ad5 지놈을 함유하는 플라스미드 pTG3602[참조: Chartier C, Degryse E, Gantzer M, DieterlA, Pavirani A and Mehtali M: Efficient generation of Recombinant Adenovirus Vectors by Homologous Recombination i Escherichia Coli,J Virol, 70: 4805-4810, 1996]를 출발 물질로서 사용하였다. Spe1과 Pac1 사이에 있고 야생형 파이버 유전자를 포함하는 지놈의 약 9kb 단편을 pBluescript로 별도로 클로닝하였다. 이 단편으로부터 Sac1과 Kpn1 사이의 약 3kb 단편을 추가로 서브클로닝하였다. 파이버의 Nde1 부위의 N-말단 누클레오티드 업스트림을 제외한, 파이버의 종결 코돈 이후 염기 38에서 시작하는, Nde1 부위와 Mun1 부위 사이의 본래의 파이버 유전자의 결실부위를 3kb 단편내에 생성시켰다. 결실된 서열을 Nde1 및 Mun1 부위, 및 파이버 종결 코돈과 Mun1 부위 사이의 야생형 지놈 서열을 반환시켜주는 SEQ ID NO: 13으로 대체시켰다. 첨가된 서열 SEQ ID NO: 13에 추가하여, 재조합 파이버가 Nde1과 Xho1 사이의 파이버-결실된 3kb 단편(3kb 파이버 셔틀)내로 연결되도록 해주는 Xho1 부위를 포함하고 있다.
재조합 파이버를 가진 3kb 파이버 셔틀을 대장균에서의 상동 재조합을 사용하여 Nhe1으로 절단된 9kb 단편내로 재도입시켰다(이전 단락의 참고문헌 참조). 생성된 재조합 9kb 단편을 최종적으로 Spe1 및 Pac1을 사용하여 벡터로부터 잘라내고 코스미드 클로닝에 의해 단리된 27kb 단편에 결합시켰다.
예상된 특성의 삽입서열의 존재를 PCR에 의해 모든 코스미드 클론에서 확인하였다. 코스미드 클론을 또한 Hind III로 제한효소 처리하고 예상된 크기의 제한 단편의 존재를 겔상에서 확인하였다.
재조합 Ad 지놈을 Pac1으로 제한효소 처리한 후에 단리하여 적절한 세포를 트랜스펙션시키기 위해 사용하였다. 플라크의 발생을 트랜스펙션된 세포 배양물의 현미경 검사에 의해 결정하였다.
상층액을 일차로 트랜스펙션된 배양물로부터 수집하여 이차 배양물을 감염시키기 위해 사용하였다. 세포병원성 효과 및 플라크의 발생을 현미경법에 의해 모니터링하였다.
바이러스내로 성공적으로 레스큐된 특정 파이버 작제물을 도 4a 및 4b에 도시하였다.
결론:
사람 질환의 치료를 위해 유용한 유전자 치료법을 위해서는 특정 세포 또는 특정 조직을 표적화시키는 능력을 가진 주입가능한 벡터가 필요하다[참조: Miller N and Vile R: Targeted vectors for gene therapy.FASEB J, 9: 190-199, 1995].
본 발명은 새로운 세포결합 리간드를 가진 놉이 없는 삼량체화-가능 파이버를 생성시키고 바이러스내로 레스큐시키고 외래 리간드의 삽입을 허용하는 파이버-샤프트내에서의 위치를 확인할 수 있는 방법을 설명하였다. 재조합 파이버의 세포내 트래픽킹(trafficking)의 중요성을 또한 확인하였다. 고안된 기술을 사용하여제조된 재조합 바이러스는 사람 의학에서 고도로 유용할 것이다. 표적화된 유전자-치료를 위한 사실상 무제한의 기회가 본원에 기술된 기술의 조합 및 파지-디스플레이에 의한 세포결합 리간드의 확인에 의해 개발될 수 있다.
지금까지 사람 scTCR을 가진 삼량체화-가능 파이버는 기능적인 바이러스내로 레스큐되어 왔고 레스큐되고 있다. 단일 사슬 항체가 거대하고 고도로 복잡한 펩티드이기 때문에 그 밖의 scAb 및 세포결합 리간드, 예컨대, 파지-디스플레이에 의한 펩티드 라이브러리로부터 확인된 펩티드가 동일한 기술을 사용하여 Ad-파이버내로 혼입되고 바이러스내로 레스큐될 수 있다고 생각된다.
본 발명에 의해 재표적화시켜 제조된 Ad는 사람 유전자 치료에 적용될 수 있다.
종양 질환의 경우에, 하기 선택항목이 존재한다:
I. 종양내로 트랜스유전자를 도입시키기 위한 벡터의 사용, 예컨대
●항종양유전자
●"자살" 유전자
●면역 조절 물질 또는 종양 항원에 대한 유전자
●안티 혈관유전 인자에 대한 유전자
II. 감염성 바이러스의 사용. 이것은 종양내에서 바이러스가 세포에서 세포로 확산될 수 있어서, 종양상의 초기 히트(hit)를 증대시킬 수 있는 비복제 벡터의 사용에 더하여 추가된 값을 가진다. 종양 세포 파괴는 벡터내로 조작된 세포-파괴 메카니즘 뿐만 아니라 바이러스 감염 그 자체와 관련된 세포 파괴 및 바이러스 감염된 세포에 대한 몸의 면역 반응의 공격에 의해 일어날 수 있다. 이러한 원리는 이미 유전자를 p53 돌연변이체 종양 세포에서만 복제하도록 조작되어 제조된 아데노바이러스를 직접 종양 내부에 주입함으로써 사람에게서 시험되었다. 거대한 "헤드-앤드-넥(head-and-neck)" 종양상에서의 이러한 제한된 시도로부터의 경험은 처리된 종양 11 중 2의 완전한 복귀(그렇지 않은 경우 종양은 임의 형태의 공지된 치료에 내성임)와 더불어 어느 정도 고무적인 것이었다.

Claims (23)

  1. 파이버 테일, 파이버 샤프트(shaft) 및 삼량체화 모티프를 포함하는 파이버 놉(knob)을 포함하는 본래의 펜톤 파이버가 세포결합 구조와 본래의 삼량체화 모티프를 함유하는 본래의 놉이 제거되고 새로운 세포결합 리간드 및 외부 삼량체화 모티프가 바이러스 파이버내로 도입되었다는 점에서 변화된, 향성이 변화된 재조합 아데노바이러스.
  2. 제 1항에 있어서, 구조적 변형이 DNA 기술에 의해 유전자 수준에서 수행되거나 화학적 또는 면역학적 수단에 의해 바이러스 수준에서 수행됨을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  3. 제 1항에 있어서, 복제가능하거나 복제불능함을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  4. 제 1항에 있어서, 새로운 세포결합 리간드가 파이버 샤프트 반복단위의 다운스트림에 도입됨을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  5. 제 1항에 있어서, 새로운 세포결합 리간드가 파이버 샤프트 반복단위의 다운스트림에 도입됨을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  6. 제 4항에 있어서, 새로운 세포결합 리간드가 파이버 샤프트내의 제한 부위 Nhe1과 Hpa1 사이에 도입됨을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  7. 제 4항에 있어서, 아미노산 링커가 세포결합 리간드의 업스트림 및 다운스트림에 도입됨을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  8. 제 4항에 있어서, 제한 부위 Hpa1의 다운스트림의 샤프트 반복단위가 제거됨을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  9. 제 1항에 있어서, 아미노산 링커 모티프가 파이버 샤프트와 삼량체화 모티프 사이 및/또는 삼량체화 모티프와 세포결합 리간드 사이에 링커로서 첨가됨을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  10. 제 9항에 있어서, 아미노산 링커 모티프가 슈도모나스 외독소로부터 유도된 SEQ ID NO: 3; 조직 프로트롬빈 활성인자로부터 유도된 SEQ ID NO: 4; 마우스 면역글로불린의 힌지 영역으로부터 유도된 SEQ ID NO: 5; 스태필로코쿠스 단백질 A로부터 유도된 SEQ ID NO: 6; 사람 IgG3의 힌지 영역으로부터 유도된 SEQ ID NO: 7; 사람 Ad5의 샤프트 반복단위 17로부터 유도된 SEQ ID NO: 8 중 어느 하나임을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 새로운 세포결합 리간드가 임의의 세포결합 펩티드임을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  12. 제 11항에 있어서, 세포결합 리간드가 모노클로날 항체 또는 단일 사슬 단편 또는 Fab로서의 이의 단편, T 세포 수용체 또는 이의 단편, RGD와 같은 인테그린 결합 펩티드 또는 표피 성장 인자와 같은 성장 인자임을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  13. 제 12항에 있어서, 서열 SEQ ID NO: 10 내지 SEQ ID NO: 12 중 어느 하나를 포함함을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  14. 제 12항에 있어서, 단일 사슬 단편이 SEQ ID NO: 15를 갖는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 16을 갖는 경쇄 가변 영역을 가진 모노클로날 항체 G250의 단일 사슬 단편임을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  15. 제 1항에 있어서, 외부 삼량체화 모티프가 α-헬릭스 코일링된 코일 모티프이거나 기능적으로 삼량체화된 파이버를 만들 수 있는 임의의 그 밖의 펩티드임을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  16. 제 15항에 있어서, 외부 삼량체화 모티프가 사람 폐 표면활성 단백질 D의 넥(neck) 영역 펩티드인 SEQ ID NO: 1이거나 위치 1 및 위치 4의 류신 잔기가 이소류신 잔기로 대체된 31 아미노산 "지퍼(Zipper)" 모티프인 SEQ ID NO: 2임을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 외부 핵 국부화 시그널(NLS)이 파이버내에 도입됨을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  18. 제 17항에 있어서, NLS가 SV40의 거대 T 항원 NLS임을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  19. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 파이버가 감염된 세포의 세포질에서의 파이버의 생존을 증가시킴으로써 핵내로의 운반 및 바이러스 조립을 향상시키는 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  20. 제 19항에 있어서, 서열이 야생형 놉에 존재함을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  21. 제 20항에 있어서, 서열이 SEQ ID NO: 10 내지 SEQ ID NO: 12에 기재된 바와 같음을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내 또는 생체외 방법으로 사람 질환을 치료하는 데에 사용됨을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  23. I. a) (Spe1 부위에서부터 지놈의 말단까지의) 9 kb 단편을 서브클로닝하는 단계,
    b) Sac1 부위와 Kpn1 부위 사이에 있는 3 kb 단편을 추가로 서브클로닝하는 단계,
    c) Nde1 부위와 Mun1 부위 사이에 있는 본래의 펜톤 파이버를 엔코딩하는 본래의 파이버 유전자를 결실시키고 결실된 서열을 Xho1 부위를 포함하는 서열 SEQ ID NO: 13으로 대체시키는 단계,
    d) 단계 c)의 작제물의 Nde1 부위와 Xho1 부위 사이에 재조합 파이버 유전자를 연결시키는 단계,
    e) 대장균내에서 상동 재조합을 사용하여 Nhe1으로 절단된 9 kb 단편내로 단계 d)의 작제물을 재도입시키는 단계,
    f) 단계 e)의 재조합 9 kb 단편을 단리시키고 코스미드 클로닝에 의해 지놈의 시작부위로부터 Spe1 부위까지의 27 kb 단편에 9 kb 단편을 연결시킴으로써 아데노바이러스 지놈을 재생성시키는 단계에 의해 아데노바이러스 지놈내로 재조합 아데노바이러스 파이버를 레스큐(rescue)시키고;
    II. 단계 f)에서 수득된 아데노바이러스를 사용하여 세포를 트랜스펙션시킴으로써 세포가 재조합 아데노바이러스를 발현시킬 수 있도록 하는 것을 포함하여, 향성이 변화된 재조합 아데노바이러스를 생성시키는 방법.
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