JP2003508057A

JP2003508057A - 改変アデノウイルスファイバーおよび用途

Info

Publication number: JP2003508057A
Application number: JP2001520889A
Authority: JP
Inventors: ファン・ラーイジ、マルク・ヨハン; キュザック、スティーブン; ルグラン、バレリー; レスナー、フィリップ; メータリ、マジド
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1999-08-27
Filing date: 2000-08-25
Publication date: 2003-03-04
Also published as: US20040038205A1; CA2348158A1; WO2001016344A1; US6740511B1; EP1124977A1; AU779892B2; AU7016900A

Abstract

(57)【要約】本発明は、改変されたアデノウイルスファイバーに関し、このファイバーは、プリーツシートＡからプリーツシートＢにまで達し、かつループＡＢを含んでいる該ファイバーの領域内に存在する１または２以上の残基に少なくとも１つの突然変異を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】

本発明は、特に、アデノウイルスに対する天然型細胞受容体の認識とそれへの
結合に関与する領域に突然変異を持つアデノウイルスファイバーに関する。本発
明はまた、このようなファイバーを、場合によりリガンドと一緒に、その表面に
有するアデノウイルス粒子にも関し、このリガンドは、改変された、またはさら
に標的化された宿主特異性を該粒子に付与する。本発明は、遺伝子治療の分野で
使用することができるベクターの開発の分野において最も顕著な価値がある。

【０００２】

【背景技術】

アデノウイルスベクターは多くの遺伝子治療用途に広く使用されている。これ
らは多くの動物種で実証されていて、相対的に非病原性で非組込み性であり、分
裂中と休止の両方の細胞中で複製する。また、これらは広い宿主スペクトルを有
し、例えば、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞、肝細胞、神経細胞および滑膜細胞(s
inoviocyte) といった非常に多数の細胞種に感染することができる (Bramson et
al., 1995, Curr. Op. Biotech. 6, 590-595)。

【０００３】アデノウイルスゲノムは、ウイルスタンパク質をコードする遺伝子の両末端に
２つの逆方向反復配列領域 (逆方向末端反復配列の意味でITR と呼ばれる) を含
む、約36 kb の二本鎖線状DNA 分子からなる。その初期遺伝子は、アデノウイル
スゲノム中に分散している４つの領域 (E1からE4; E は初期(early) の意味) に
分かれ、それぞれ固有のプロモーターを持つ６つの転写単位を含んでいる。その
後期遺伝子 (L1からL5; L は後期(late)の意味) は、部分的には初期転写単位を
カバーするが、大部分は主要後期プロモーター(MLP) から転写される。

【０００４】アデノウイルスは多くの研究の主題となっており、多数の科学チームが、複製
欠損性のアデノウイルスベクター、即ち、これらのアデノウイルスベクターがそ
れに感染した細胞中で***または増殖できないようにゲノムが操作されたアデノ
ウイルスベクター、を開発している。欠損性アデノウイルスベクターは、特に、
少なくともE1領域を欠失させることにより得られる (例えば、欠損性アデノウイ
ルスベクターの、特に特許出願WO 94/28152 およびWO 94/12649 を参照) 。

【０００５】より最近、アデノウイルス粒子の別の用途が、特に遺伝子治療プロトコルの実
施分野において報告された。即ち、特許出願WO 95/21259 は、アデノウイルス粒子と核酸、より具体的には
裸の核酸との組合わせに基づく、核酸を細胞に導入する方法を記載している。こ
の方法は、エンドサイトーシス後に細胞核に分子を輸送するというアデノウイル
ス粒子の能力に主に基づいている。Curielら (1992, Hum. Gene Ther., 3: 147-
154)およびWagnerら (1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 6099-6103)は、プラ
スミドと不活性化したアデノウイルス粒子との組合わせにより、エンドソームを
リソソームとの融合前に溶解することができ、従って、プラスミドは分解を免れ
ることができることを、それぞれ示した。この巧妙な考案により、プラスミドの
トランスフェクションの効率はin vitroで 100〜1000倍も増大させることができ
る。好ましくは、細胞トランスフェクションをアデノウイルスプロセスから独立
させ、かつトランスフェクションの標的化を可能にするように選んだリガンドの
使用を実際に伴わせるため、アデノウイルス感染を中和する抗体を生成複合体に
付加することができる (Michael et al., 1993, J. Biol. Chem., 268: 6866-68
69) 。これらの刊行物および特許出願の内容を、それらの全体を参照のため本出
願に援用する。

【０００６】アデノウイルスの感染サイクルは、２つの必須工程に基づいている。初期段階
が複製開始に先行し、この段階はウイルスDNA の複製および転写を調節する初期
タンパク質の産生を可能にする。ゲノムの複製の後に後期段階が続き、その間に
ウイルス粒子の基本を構成する構造タンパク質が合成される。新たなビリオンの
組立てが核で起こる。まず、ウイルスタンパク質が二十面体構造の中空キャプシ
ドを形成するように集合し、このキャプシドの中に新たに形成されたゲノムが包
み込まれる。放出されたアデノウイルスは、他の許容細胞に感染することができ
る。

【０００７】感染中に、キャプシドの表面に存在するアデノウイルス粒子のファイバーとペ
ントンベースはビリオンの細胞付着およびその内在化(internalization) に重大
な役割を果たす (Wickham et al., 1993, Cell, 73, 309-319)。まず、アデノウ
イルスが、その三量体形態のファイバーを介して、許容細胞の表面に存在する細
胞受容体(CAR) に結合する (Philipson et al., 1968, J. Virol. 2, 1064-1075
; Defer et al., 1990, J. Virol. 64, 3661-3673)。ウイルス粒子はその後、ペ
ントンベースのα_vβ₃およびα_vβ₅細胞インテグリンへの結合のために、エン
ドサイトーシスにより内在化される (Mathias et al., 1994, J. Virol. 68, 68
11-6814)。

【０００８】アデノウイルスファイバーは、下記の３つの別個のドメインからなる (Chrobo
czek et al., 1995, Current Top. Microbiol. Immunol. 199, 165-200) ： (a) そのＮ末端端部にあるのはテイル (尾部) であり、その配列は、あるアデ
ノウイルス血清型から別のものまでに (アデノウイルス血清型が違っていても)
非常に保存されている。このドメインはペントンベースと相互作用し、キャプシ
ド内の分子の固定を確保する； (b) 中心部にあるのはシャフト (軸部) である。これは、ある数のプリーツシ
ート反復配列からなる棒状構造であり、プリーツシート反復配列の数は考慮する
血清型に応じて変化する； (c) そのＣ末端端部にあるのはKnob (ノブ) であり、これは三量体化シグナル
を含む丸い球形構造を有し(Hong and Engler, 1996, J. Virol. 70, 7071-7078; Novelli and Boulanger, 1991, J. Biol. Chem. 266, 9299-9303; Novelli and
Boulanger, 1991, Virology 185, 365-376)、許容細胞への結合を担う (Henry
et al., 1994, J. Virol. 68, 5239-5246; Louis et al., 1994, J. Virol. 68,
4104-4106) 。

【０００９】アデノウイルスウイルス粒子の天然ファイバーをその天然の指向性を改変し、
このファイバーの結合特異性をこれが別の細胞受容体を認識するように変化させ
ることについて、既にいくつかのチームが報告している。

【００１０】 WO 94/10323 には、シャフトの22の反復配列単位の１つの末端に挿入された、
ある抗原 (ScFv型の) に特異的な抗体の断片の配列を含むように、ファイバーが
突然変異された、５型(Ad5) アデノウイルス粒子が記載されている。この突然変
異体は、アデノウイルス粒子の感染の改変された特異性を持ち、標的抗原を示す
細胞に付着することができる。

【００１１】米国特許5,543,328 には、Knobドメインが腫瘍壊死因子(TNF) 配列またはApoE
ペプチドの配列で置換されていて、改変されたアデノウイルス粒子の付着を、肝
細胞の表面に存在する、それぞれTNF の細胞受容体またはLDL (低密度リポタン
パク質) 受容体を発現する細胞の方に向け直すようにされている、キメラアデノ
ウイルスファイバーが記載されている。

【００１２】 WO 95/26412 には、Ｃ末端端部にリガンドを組み込むことにより改変されたフ
ァイバーが記載されている。 WO 96/26281 には、天然ファイバーの一部、特にknobの一部を、別の血清型の
アデノウイルスファイバーの対応部分で置換し、場合によりＣ末端端部にビトロ
ネクチン特異的RGD ペプチドを挿入することにより得られたキメラファイバーが
記載されている。

【００１３】さらに、フランス特許出願FR 2758821 (97 01005) は、アデノウイルスのそれ
ぞれ一次受容体および補因子としての、クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体抗原
およびフィブロネクチンのIII モジュールの役割を実証している。同一の方法で
、Tomko ら (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 3352-3356) 、 Bergelsonら (
1997, Science 275, 1320-1323) およびRoelvinkら (1998, J. Virol. 72, 7909
-7915)は、各種アデノウイルス血清型のファイバーの別の受容体を報告している
。これは、46 kDaの表面分子、CAR (コックスサッキーおよびアデノウイルス受
容体) である。

【００１４】最後に、Xia ら (1994, Structure 2, 1259-1270) は、アデノウイルスknobの
結晶学的三次元構造を実証した。各単量体は、ＡないしＤおよびＧないしＪと呼
ばれる、８つの逆平行βプリーツシートと、８〜55残基の６個の主要ループとを
含んでいる。例えば、ループＣＤは、プリーツシートＣをプリーツシートＤに連
結している。小さなプリーツシートＥおよびＦは、プリーツシートＤとＧとの間
に位置するループＤＧの一部を構成すると考えられることが示されている。因み
に、下の表１は、配列番号１ (SEQ ID NO: 1) に示した、Ad5 ファイバーのアミ
ノ酸配列の各構造部分の位置を示し、＋１はMet 開始残基を表す。一般に、プリ
ーツシートは組織化された緻密な構造を形成しているのに対し、ループはよりフ
レキシブルである。これらの用語は、タンパク質生化学の分野では慣用されてお
り、基本書に定義されている (例えば、Stryer, Biochemistry, 第２版, ２章,
11〜39頁, Freeman and Company, San Francicsoを参照) 。

【００１５】

【表１】

【００１６】Ａ、Ｂ、ＣおよびＪの４つのβプリーツシートは、ウイルス粒子の方向を向い
たＶプリーツシートを構成する。残りの４つ (Ｄ、Ｇ、ＨおよびＩ) は、細胞受
容体の方を向いていると推定される、Ｒプリーツシートを形成する。Ｖプリーツ
シートは、該構造の三量体化に重要な役割を果たすようであり、一方、Ｒプリー
ツシートは受容体との相互作用に関与すると考えられている。

【００１７】

【発明の開示】

本発明は、特に下記性質を有するウイルス粒子の産生を可能にする、アデノウ
イルスファイバーの新規な突然変異体を提供する： (i) 該突然変異ファイバーを含むアデノウイルス粒子は、天然型細胞受容体に
実質的に付着しない、即ち、このような突然変異ファイバーを保有するアデノウ
イルス粒子の宿主特異性は、野生型、即ち、非突然変異ファイバーを有するアデ
ノウイルス粒子の宿主特異性に比べて、低減しており、さらには阻害されている
こともある； (ii)該突然変異ファイバーを含むアデノウイルス粒子が或るアンチリガンドに
特異的なリガンドをさらに含む時に、非突然変異アデノウイルス粒子に比べて、
該改変粒子に、該アンチリガンドを表面に保有する１または２以上の特定の細胞
種に対する新規な指向性を付与することができる。

【００１８】「突然変異ファイバーが天然型細胞受容体に実質的に付着しない」という表現
は、このファイバーが、天然型細胞受容体へのその結合能力が低下または消失す
るように改変されていることを意味する。

【００１９】このような性質は、当分野の技術を用いて、特に野生型アデノウイルスファイ
バーの全部または一部からなる競合相手の存在下で実施される、改変ファイバー
を保有するウイルスに対する感染競合実験 (この測定法に関する詳細は、本出願
の実験部分を参照) により、対応するアデノウイルス粒子の感染力または細胞結
合を試験することにより証明することができる。天然の特異性が低下しているこ
とはまた、標識ウイルス (例えば、Roelvink et al., 1996, J. Virol. 70, 761
4-7612の方法に従って³Hチミジンで標識した) の存在下に実施される細胞付着試
験、または許容細胞もしくはリガンドが標的とする表面分子を発現する細胞の感
染力の試験 (後述の実施例を参照) によって評価することもできる。

【００２０】有利には、「突然変異ファイバーが天然型細胞受容体に実質的に付着しない」
とは、後述する実施例に開示した競合実験で測定した残留感染率が、ほぼ０〜60
％、好ましくは０〜40％、そして特に好ましくは０〜20％である時である。また
、本発明の有利な１態様によれば、突然変異アデノウイルスファイバーの三量体
化とそのペントンベースへの結合の性質は、影響を受けない。これらの性質は、
後述する実施例で用いた方法に従って容易に証明される。

【００２１】本発明は、特に、投与すべきアデノウイルスの治療用量の低減と、治療すべき
細胞へのベクター感染の標的化を可能にする性質を持つ、新規産物を提供すると
いう利点がある。この特異性は、細胞障害性遺伝子を発現することができるアデ
ノウイルスベクターを使用する場合には、健全な非標的化細胞への細胞障害性作
用の伝播を避けるために、特に不可欠である。また、本発明の開示内容は、組換
えウイルス性または非ウイルス性ベクターの投与による治療方法を開発するため
の他の標的化系の開発も可能にする。

【００２２】まず、本発明は、アデノウイルスの改変されたファイバーに関し、このファイ
バーは、プリーツシートＡからプリーツシートＢに達し、かつループＡＢを含ん
でいる該ファイバーの領域内の１または２以上の残基に少なくとも１つの突然変
異を含む。より具体的には、この突然変異は、ループＡＢ内の１または２以上の
残基に生じていることが好ましい。

【００２３】本発明の目的にとって、「残基」と「アミノ酸」の用語は同義である。「プリ
ーツシート」および「ループ」の用語は、Xia et al. 1994, Structure 2, 1259
-1270 に準じて定義される。

【００２４】「核酸配列」の用語は、合成または単離された天然の、線状または環状、二本
鎖または一本鎖の、DNA および／またはRNA および／またはPNA (これらは特定
のヌクレオチド系列の呼称である) の断片を指すものであり、修飾されていても
、そうでなくてもよく、サイズを制限せずに核酸のある断片または領域を規定す
ることを可能にする。１好適態様によれば、これは、cDNA (相補的DNA)、ゲノム
DNA 、プラスミドDNA 、RNA およびウイルスゲノムよりなる群から選ばれた核酸
である。

【００２５】アミノ酸配列の「一部」または「部分」とは、少なくとも６、好ましくは10、
より好ましくは15、さらにより好ましくは20、そして最も好ましくは30の連続ア
ミノ酸を含み、および／または該部分の誘導元である配列と同じ生物学的活性、
特にウイルスの標的細胞を認識して、それに結合する能力を有する、アミノ酸配
列を意味するものである。

【００２６】核酸配列の「一部」または「部分」とは、少なくとも18、好ましくは30、より
好ましくは45、さらにより好ましくは60、そして最も好ましくは90の連続ヌクレ
オチドを含み、および／または該部分の誘導元である核酸配列がコードするアミ
ノ酸配列と同じ生物学的活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を意味
するものである。

【００２７】本発明に係るファイバーは、ヒト、イヌ、トリ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタ
またはサル起源のアデノウイルスに由来するものでもよく、あるいは異種起源の
断片、即ち、アデノウイルスファイバーに由来しないか、非アデノウイルスファ
イバーに由来する断片を包含する、多様な起源の断片を含むハイブリッドでもよ
い。

【００２８】ヒトアデノウイルスに関しては、血清型Ｃ、特に２型または５型アデノウイル
ス (Ad2 またはAd5)のファイバーを使用することが好ましい。Ad2 のファイバー
は580 のアミノ酸(aa)を含み、その配列はHerisse ら (1981, Nucleic Acid Res
. 9, 4023-4042、参考として本出願に援用する) に開示されている。Ad5 のそれ
は、ChrobocaekおよびJacrot (1987, Virology, 161, 549-554) により決定され
、582 のアミノ酸 (配列番号１; SEQ ID NO: 1を参照) を有する。本出願の提示
を簡潔にするため、Ad5 に関する位置だけを示す。しかし、他の起源のアデノウ
イルスファイバーの配列に基づいて、各種のプリーツシートおよびループの等価
の (対応する) 位置を同定することは当業者の技術範囲内である。

【００２９】本発明のファイバーが動物起源のものである場合、ウシアデノウイルス、特に
BAV-3 株のものを使用することが好ましい。後者は多くの研究の主題となってお
り、ファイバーの配列は国際出願WO 95/16048(その内容を参考として援用する)
に開示されている。

【００３０】もちろん、本発明のファイバーは、本発明に述べた改変の他に、本出願で提案
したファイバーの特徴に影響しない限り、天然配列に関して他の改変を有してい
てもよい。また、例えば、GenBank といったデータベース上で入手可能なアデノ
ウイルスファイバー配列を同定することや、後述するように各種プリーツシート
およびループの等価の位置を同定することは、当業者の技術範囲内である。情報
として、例えば、ヒト血清型のアデノウイルスファイバー配列のGenBank 参照番
号を挙げると、血清型 2 (#AAA92223), 3 (#CAA26029), 5 (#M18369), 31 (#CAA
54050)または41 (#X17016)である。上記刊行物およびGenBank 参照番号の内容の
全体を、参考として本出願に援用する。

【００３１】本発明はまた、例えば、特許出願WO 98/44121 に記載されているような、他の
突然変異をさらに含む、本発明に係る改変されたファイバーにも関する。より具
体的には、本発明に係るこの種のファイバーは、下記位置にさらに１または２以
上の突然変異を含むことを特徴とする：ａ) ループＣＤ、ＤＧ、ＧＨ、ＨＩ、および／もしくはＩＪならびに／またはｂ) プリーツシートＣ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉおよび／もしくはＪ。

【００３２】本発明の目的にとって、「突然変異」なる用語は、１または２以上の残基の欠
失、置換または付加、あるいはこれらの可能性の組合わせを意味する。本発明の第一の態様によれば、本発明に係るアデノウイルスファイバーは、配
列番号１(SEQ ID NO: 1)に示した配列の全部または一部を含む５型アデノウイル
ス(Ad5) のファイバーに由来し、SEQ ID NO: 1の残基400 から428 の間、より詳
しくは残基404 から418 の間、好ましくは残基404 から408 の間、の領域の１ま
たは２以上の残基の突然変異により改変されていることを特徴とする。特に好ま
しくは、かかるアデノウイルスファイバーは、上述した(i) および(ii)の性質を
有する。

【００３３】好ましくは、本発明は、突然変異残基が404 位置のトレオニン残基、406 位置
のアラニン残基、および408 位置のセリン残基から選ばれることを特徴とする、
５型アデノウイルスのファイバーに関する。

【００３４】これらの残基は、天然ファイバーにおけるそれらの空間的な位置のため、問題
のアデノウイルスに対する天然型細胞受容体を認識して、これと直接的または間
接的に相互作用することができる。

【００３５】本発明のある特定の場合によると、生じた突然変異は少なくとも１つのアミノ
酸の置換である。この点について、５型アデノウイルスのファイバーの下記の例
を挙げることができる： −408 位置のセリン残基が、少なくとも２つのカルボキシル基を有する残基、
特にアスパラギン酸およびグルタミン酸よりなる群から選ばれた残基で置換され
る、および／または −404 位置のトレオニン残基がグリシン残基で置換される、および／または −406 位置のアラニン残基がリシン残基で置換される。

【００３６】ファイバーの標的化領域に、特に屈曲、好ましくはαα型の屈曲を形成する複
数のアミノ酸に、複数の置換を導入することも可能である。本発明によると、アデノウイルスファイバーの三次元構造をひどくは改変しな
いことが好ましい。従って、屈曲を形成するアミノ酸は、Xia ら (1994) に挙げ
られているものといった、類似の構造を形成する残基で置換されよう。

【００３７】本発明のファイバーは、欠失により改変することもできる。除去される領域は
、露出ドメイン、特にループＡＢの全部または一部に関係することができる。有利な１態様によると、少なくとも１つの改変が、あるループおよび／または
プリーツシートの少なくとも３つの連続残基の欠失である場合、欠失した残基を
、第１のアデノウイルスにより認識されるもの以外の細胞受容体と相互作用する
ことができる、第２のアデノウイルスのファイバーに由来する、等価 (対応) の
ループおよび／またはプリーツシートの残基で置換することができる。これは、
本発明に係るファイバーの構造を維持することを可能にすると同時に、それに、
第２のアデノウイルスのものに対応する宿主特異性を付与する。Xia ら (1994)
に示されているように、２型および５型アデノウイルスの感染は３型および７型
アデノウイルスの感染とは異なる。従って、上記したものの中の少なくとも３連
続残基を欠失したAd5 またはAd2 ファイバーの欠失残基を、Ad3 またはAd7 ファ
イバーの等価の領域に由来する残基で置換して、該ファイバーのAd5 受容体を結
合させる能力を低下させ、これにAd3 またはAd7 の細胞受容体への新規な特異性
を付与するようにすることができる。

【００３８】本発明はまた、上に示したように、天然型細胞受容体に結合する能力が実質的
に低下しているが、それでも三量体化することができるファイバーに関する。こ
のような性質は、特に、本出願の実験部分に記載されている方法を用いて決定さ
れる。

【００３９】同様に有利な１態様によると、本発明に係るファイバーはリガンドも含んでい
る。本発明の目的にとって、「リガンド」とは、非突然変異アデノウイルスファ
イバーの天然型細胞受容体以外の細胞アンチリガンドを、好ましくは高い親和性
で認識し、結合させることができる任意の物質の意味である。このアンチリガン
ドは、標的化が望まれる細胞 (細胞表面マーカー、受容体、組織適合性抗原によ
り与えられた抗原性ペプチド等) の表面で発現または露出されることができ、こ
の発現または露出は、自然に起こるか、または該標的をその表面でかかるアンチ
リガンドを発現または露出させる目的で改変した後に起こる。本発明が追求する
目標によると、リガンドは、抗体もしくは抗体断片、脂質、糖脂質、ホルモン、
ポリペプチド、ポリマー (例、PEG 、ポリリシン、PEI 等) または糖でよい。「
抗体」の用語は、特に、モノクローナル抗体、抗体断片 (例えば、Fab 断片) お
よび単鎖抗体 (scFv) を意味する。これらの名称および略号は免疫学の分野で慣
用のものである。

【００４０】本発明の関係では、より具体的には、腫瘍細胞、感染細胞、特定の細胞種また
は特定の表面マーカーを保有する細胞のカテゴリーを標的化することが有利であ
る場合がある。例えば、標的化する宿主細胞がHIV ウイルス（ヒト免疫不全ウイ
ルス）に感染した細胞である場合、リガンドは、フジン(fusin) 、CD4 受容体も
しくは露出ウイルス性タンパク質 (エンベロープ糖タンパク質) に対する抗体の
断片、または残基37から42にわたるHIV ウイルスTAT タンパク質の部分 (Fawell
et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 664-668)とすることができる
。該宿主細胞が腫瘍細胞である場合、選択するのは、腫瘍特異的抗原を認識する
リガンド (例えば、乳がんの場合はMUC-1 タンパク質、またはHPV パピローマウ
イルスE6もしくはE7タンパク質の或るエピトープ) であるか、または過発現(ove
rexpression)されるリガンド (IL-2受容体はある種のリンパ腫瘍において過発現
される) に関係しよう。Ｔリンパ球の標的化を意図する場合、Ｔ細胞受容体リガ
ンドを使用することができる。また、トランスフェリンは肝の標的化にとって良
好な候補である。

【００４１】一般に、本発明に関係して使用できるリガンドは、文献に広く記載されており
、標準的な方法を用いてクローニングすることができる。また、これらを化学的
に合成して、本発明に係るファイバーに結合させることも可能である。これに関
連して、ガラクトシル残基の結合は、アシアロ糖タンパク質(asialoglycoprotei
n)受容体との相互作用により、肝特異性に寄与するはずである。しかし、好まし
い態様は、このリガンドを、本発明に係るファイバーのＣ末端に挿入するか、ま
たは改変の少なくとも１つが少なくとも３連続残基の欠失である場合には、欠失
残基の置換物として挿入することである。

【００４２】本発明の別の課題は、上述した改変されたファイバーのプリーツシートＡから
プリーツシートＢに達し、かつループＡＢを含んでいる領域を含むことを特徴と
する、ペプチド断片に関する。このようなペプチド断片は、特に下記の性質を有
する： (i) このペプチド断片を、ある異種アデノウイルスファイバーのプリーツシー
トＡからプリーツシートＢに達し、かつループＡＢを含んでいる領域の代わりに
組込んだ時に、該突然変異ファイバーを含むアデノウイルス粒子は、天然型細胞
受容体に実質的に付着しない； (ii)上の(i) に従った該突然変異ファイバーを含むアデノウイルス粒子がある
アンチリガンドに特異的なリガンドをさらに含む時に、このような突然変異ファ
イバーを含まないアデノウイルス粒子に比べて、該改変粒子に、該アンチリガン
ドを表面に保有する１または２以上の特定の細胞種に対する新規な指向性を付与
することができる。

【００４３】本発明は、より具体的には、配列番号１(SEQ ID NO: 1)に示した配列の全部ま
たは一部を含み、残基400 から428 の間の領域の１または２以上の残基に少なく
とも１つの突然変異を含む、５型アデノウイルス(Ad5) のファイバーの残基388
から残基592 までに達する配列であることを特徴とする、かかるペプチド断片に
関する。

【００４４】本発明はまた、表面に本発明に係る突然変異ファイバーを含み、場合により上
記のようなリガンドを含む、アデノウイルス粒子にも関する。好ましい場合によ
れば、このアデノウイルス粒子は、機能性の天然ファイバーを欠失している。本
発明の突然変異ファイバーは、アデノウイルスゲノムそれ自体により発現させる
ことができ、特に、該アデノウイルス粒子がかかるゲノムを含んでいるか、また
は後述するものといった、相補細胞系によりトランスで与えられる場合にはそう
である。ある特定の態様によると、本発明のアデノウイルス粒子は、上に示した
通りであり、該リガンドが、該ファイバー以外のアデノウイルスキャプシドタン
パク質、特にヘキソンまたはペントンに挿入されている。

【００４５】本発明の特定の場合によると、本発明の該アデノウイルス粒子は「中空」であ
る、即ち、これは核酸を含んでいない。このようなウイルス粒子の使用は、特に
、後述するWO 95/21259 に例示されている。これに対して、このアデノウイルス
粒子がアデノウイルスゲノムを含んでいる場合には、好ましくはアデノウイルス
性ウイルス (即ち、アデノウイルス) が挙げられよう。また、該ゲノムも改変さ
れている特定の場合には、より特別には、組換えアデノウイルス性ウイルス (即
ち、組換えアデノウイルス) が挙げられよう。

【００４６】このような場合については、後でより詳しく説明する。本発明は従って、この
ようなアデノウイルスおよび組換えアデノウイルスにも関する。本発明によれば、該リガンドは、該アデノウイルス粒子に化学的に結合させる
ことができる。しかし、より好ましいのは、リガンドをコードする配列を、アデ
ノウイルスゲノム中、好ましくは本発明に係る改変ファイバーをコードする配列
中に、より具体的には、リーディングフレームを保存するためにフレーム内で挿
入した変異体である。この挿入は、任意の部位で行うことができる。しかし、好
ましい挿入部位は、Ｃ末端端部の停止コドンの上流の部位、または欠失残基の代
わりの部位である。他のアデノウイルス配列、特にヘキソンまたはペントンとい
った他のキャプシドタンパク質をコードする配列、へのリガンドの配列の導入を
考えることも可能である。

【００４７】有利には、本発明は、複製欠損性、即ち、宿主細胞中で自律複製できない、組
換えアデノウイルスに関する。この欠損は、アデノウイルスゲノム中の１または
２以上の必須ウイルス遺伝子、特にE1領域の全部または一部、の突然変異または
欠失により得られる。クローニング能力を増大させるため、E3領域の欠失も考慮
することができる。しかし、宿主の免疫応答を調節するために、gp19k タンパク
質をコードする配列 (Gooding and Wood, 1990, Critical Reviews of Immunolo
gy 10, 53-71) は保存することが有利であるかもしれない。もちろん、本発明に
係るアデノウイルスのゲノムは、他の領域、特にE2、E4および／またはL1〜L5領
域に影響するさらなる欠失または突然変異を含むこともできる (例えば、WO 94/
28152 もしくはWO 94/12649 またはEnsinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328
-339、E2のDBP 遺伝子の熱感受性突然変異を記載、を参照) 。

【００４８】１好適態様によると、本発明の組換えアデノウイルスは、宿主細胞中でのその
発現に必要なエレメントの制御下に置かれた、関心ある(of interest) １または
２以上の遺伝子を含む。その遺伝子は、任意の起源のゲノム、cDNA（相補的DNA)
またはハイブリッド (１もしくは２以上のイントロンを欠失したミニ遺伝子) の
ものでよい。その遺伝子は、分子生物学の慣用技術を用いて、または化学合成に
より得ることができる。それは、アンチセンスRNA 、リボザイムまたはmRNA (こ
れはその後に関心あるポリペプチドに翻訳される) をコードすることができる。
このポリペプチドは、細胞質型でも膜結合型でもよく、あるいは宿主細胞により
分泌されるものでもよい。さらに、それは、天然に見られるポリペプチド、多様
な起源の配列の融合から生ずるキメラポリペプチド、または天然配列に関して突
然変異された改善および／もしくは改変された性質を有するポリペプチド、の全
部または一部でよい。

【００４９】本発明の関係では、下記ポリペプチドをコードする遺伝子を使用することが有
利であるかもしれない： −サイトカインまたはリンホカイン (インターフェロンα、βおよびγ、イン
ターロイキン、ならびに特にIL-2、IL-6、IL-10 もしくはIL12、腫瘍壊死因子 (
TNF)、コロニー刺激因子 (GM-CSF, C-CSF, M-CSF 、等) ； −細胞または核内受容体、特に病原性生物体 (ウイルス、細菌または寄生虫)
、好ましくはHIV ウイルスにより認識されるもの、またはそれらのリガンド； −遺伝病に関与するタンパク質 (VII 因子、VIII因子、IX因子、ジストロフィ
ンもしくはミニジストロフィン、インスリン、CFTR (嚢胞性繊維症膜貫通調節)
タンパク質、成長ホルモン (hGH)) ； −酵素 (ウレアーゼ、レニン、トロンビン、等) ； −酵素インヒビター (α1-アンチトリプシン、アンチトロンビンIII 、ウイル
スプロテアーゼインヒビター、等) ； −腫瘍またはがんの開始または進行を少なくとも部分的に阻害することができ
る、抗腫瘍作用のあるポリペプチド (抗体、細胞***もしくは形質導入に作用す
るインヒビター、がん抑制遺伝子発現産物、例えば、p53 もしくはRb、免疫系を
刺激するタンパク質、等) ； −クラスＩもしくはII主要組織適合遺伝子複合体タンパク質または対応する遺
伝子の発現に作用する調節タンパク質； −ウイルス、細菌もしくは寄生虫感染またはその発生を阻害することができる
ポリペプチド (免疫原性を有する抗原性ポリペプチド、抗原性エピトープ、抗体
、競合により天然タンパク質の作用を阻害しうるトランスドミナント(transdomi
nant) 変異体、等) ； −毒素 (単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼ (TK-HSV-1) 、リシン、コ
レラ毒素、ジフテリア毒素、等) またはイムノトキシン；ならびに −マーカー (β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、等) 。

【００５０】このリストは制限ではなく、他の遺伝子も使用できることは指摘しておくべき
である。さらに、本発明に係る組換えアデノウイルスは、感染した細胞の選択または同
定を可能にする選択遺伝子をさらに含むことができる。G418抗生物質に対する耐
性を付与するneo 遺伝子 (ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼをコードす
る) 、dhfr (ジヒドロ葉酸レダクターゼ) 遺伝子、 CAT (クロラムフェニコール
・アセチルトランスフェラーゼ) 遺伝子、 pac (ピューロマイシン・アセチルト
ランスフェラーゼ) 遺伝子または gpt (キサンチングアニン・ホスホリボシルト
ランスフェラーゼ) 遺伝子を挙げることができる。一般に、選択遺伝子は当業者
には知られている。

【００５１】「宿主細胞中での関心ある遺伝子の発現に必要なエレメント」という表現は、
そのRNA への転写とmRNAのタンパク質への翻訳を可能にするエレメントの組を意
味するものである。とりわけ、プロモーターは特に重要である。本発明の関係で
は、プロモーターは、真核またはさらにはウイルス起源の任意の遺伝子から誘導
することができ、構成的でも調節性でもよい。さらに、それは、プロモーター活
性の向上、転写阻害領域の抑制、構成的プロモーターを調節性にするか、その逆
、制限部位の導入、等の目的で改変することができる。あるいは、それは発現さ
せる遺伝子の天然プロモーターとすることができる。例示として、 CMV (サイト
メガロウイルス) 、 RSV (ラウス肉腫ウイルス) 、HSV-1 ウイルスTK遺伝子、SV
40ウイルス (シミアンウイルス40) 初期、およびMLP アデノウイルス・ウイルス
プロモーター、またはネズミもしくはヒト PGK (ホスホグリセリン酸キナーゼ)
、α1-アンチトリプシン (肝特異的) および免疫グロブリン (リンパ球特異的)
遺伝子の真核プロモーターを挙げることができる。

【００５２】もちろん、本発明で用いる関心ある遺伝子は、発現に必要な追加エレメント (
イントロン配列、シグナル配列、核局在化配列、転写終結配列、IRESもしくは他
のタイプの転写開始部位、等) または宿主細胞内でのその存続に必要な追加エレ
メントをさらに含むことができる。このようなエレメントは当業者には既知であ
る。

【００５３】本発明はまた本発明に係るファイバーもしくはペプチド断片をコードするDNA
断片、ならびにかかるファイバーもしくはかかる断片を発現させるためのベクタ
ーにも関する。起源がプラスミドとウイルスのいずれ、組込み性(integrating)
と非組込み性のいずれであろうと、任意の種類のベクターをこの目的に使用する
ことができる。このようなベクターは市販されているか、または文献に記載され
ている。また、当業者は本発明に係るDNA 断片の発現に必要な調節性エレメント
を調整することができる。本発明のある特定の場合によると、該ベクターは、適
当な培養条件下で、本発明に係るアデノウイルス粒子、即ち、上述したアデノウ
イルスまたは組換えアデノウイルスを産生することができるアデノウイルスベク
ターであろう。

【００５４】本発明はまた、本発明に係るアデノウイルス粒子の製造方法にも関し、この方
法では、 −本発明に係る改変ファイバーをコードするアデノウイルスゲノムを適当な細
胞系、例えば、293 細胞系、にトランスフェクションし、 −該トランスフェクションした細胞系を、前記アデノウイルスまたは前記組換
えアデノウイルスの産生を可能にするように適当な条件下で培養し、そして −細胞溶解液を密度勾配、特に、例えば、塩化セシウム勾配で精製することに
より中空粒子を回収する。

【００５５】中空粒子は、例えば、1.3 g/mlの塩化セシウムで沈降するのに対し、組換えア
デノウイルス (Adゲノムを含む粒子) それ自体は1.34 g/ml で沈降する (D'Hall
ivin, 1995, Cur. Top. Microbiol. Immunol. 199, 47-66) 。

【００５６】別の方法によると、改変された包膜(encapisidation)配列を有し、本発明に係
る改変されたファイバーをコードするDNA 断片をさらに含むアデノウイルスゲノ
ムを適当な細胞中にトランスフェクションした後に中空粒子を得ることができる
。包膜領域の改変は、粒子内のアデノウイルスゲノムの包膜現象を減少させ、さ
らには消失させることも可能にする (Grable and Hearing, 1992, J. Virol. 66
, 723-731)。培養に続く産生段階は上述したものと同一である。

【００５７】本発明はまた、本発明に係るアデノウイルスまたは組換えアデノウイルスの製
造方法にも関し、それによれば、 −組換え体でもそうでなくてもよく、また複製欠損していてもそうでなくても
よい、該アデノウイルスのゲノムを適当な細胞系にトランスフェクションし、 −該トランスフェクションした細胞系を前記アデノウイルスまたは前記組換え
アデノウイルス (アデノウイルス粒子ということもできる) の産生を可能にする
ように適当な条件下で培養し、そして −該アデノウイルスまたは該組換えアデノウイルスを該トランスフェクション
した細胞系の培養液から回収し、場合により該アデノウイルスを精製する。

【００５８】細胞系の選択は、適切な場合には、本発明に係るアデノウイルスの欠損機能に
依存する。欠損機能をトランスで与えることができる相補細胞系が特に使用され
よう。293 (ATCC CRL 1573) 細胞系またはPERC6 (ECACC 96022940)細胞系は、E1
機能を補完するのに最も特に適している (それぞれ、Graham et al., 1977, J.
Gen. Virol. 36, 59-72 またはWO 97/00326)。E1とE2またはE4との二重欠損に対
しては、とりわけフランス特許出願FR 2737222 (96 04413) に記載の細胞系を使
用することができる。任意の宿主細中で本発明に係る欠損アデノウイルスを補完
するために補助ウイルスを使用したり、またはエレメントが互いに依存性である
相補細胞と補助ウイルスとを用いる混合系を使用することも可能である。欠損ア
デノウイルスの増殖手段は当業者には公知であり、例えば、Graham及びPrevec,
1991 (Methods in Molecular Biology, vol.7, p.190-128, E.J. Murey編、The
Human Press Inc.) を参照できる。アデノウイルスゲノムは、好ましくは連結ま
たは相同的組換えにより、in vitroで大腸菌 (E. coli)中に再構成することが好
ましい (例えば、フランス特許FR 2727689 (94 14470) を参照) 。精製プロセス
は現状技術に記載されている。密度勾配遠心分離法を挙げることができる。

【００５９】別の方法によると、アデノウイルスキャプシドタンパク質、ペプチドまたは糖
タンパク質のカルボキシまたはアミノ末端端部を脂質と会合させることにより、
人工的に「中空」アデノウイルスウイルス粒子を構築することも可能である。特
に本発明のペプチド断片を取り込んだ、このような改変された脂質を、次にリポ
ソームに導入することができる。このような方法は、表面にインフルエンザウイ
ルス糖タンパク質を保有するリポソームの場合について、Tikchonenko et al.,1
988, Gene 63, 321-330 に記載されている。

【００６０】本発明はまた、その発現を可能にするエレメントの制御下に置かれている、本
発明に係るファイバーをコードするDNA 断片を、ゲノムに組込まれた形態または
エピソーム形態のいずれかで含む細胞系にも関する。この細胞系は、E1、E2、E4
およびL1〜L5領域によりコードされる機能から選ばれた１または２以上のアデノ
ウイルス機能を補完する細胞から誘導することができる。これは、好ましくは、
293 細胞系またはPERC6 細胞系から誘導する。このような細胞系は、そのゲノム
がファイバーをコードする配列の全部または一部を欠失している (非機能性ファ
イバーを産生するか、ファイバーを産生しないように) アデノウイルス、特に組
換えアデノウイルスを製造するのに使用することができる。

【００６１】この理由から、本発明はまた、下記を特徴とする、ファイバーをコードする配
列の全部または一部を欠失しているアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルス
粒子を産生する方法にも関する： −該ゲノムを上記の細胞系にトランスフェクションし、 −該トランスフェクションした細胞系を該アデノウイルス粒子の産生を可能に
するように適当な条件下で培養し、そして −該アデノウイルス粒子を該トランスフェクションした細胞系の培養液から回
収し、場合により該アデノウイルス粒子を精製する。

【００６２】本発明はまた、本発明に係るアデノウイルスで感染させることができるか、ま
たは本発明に係る方法を用いて得ることができる宿主細胞もカバーする。これは
有利には哺乳動物細胞であり、特にヒト細胞である。これは初代細胞または腫瘍
細胞でよく、また任意の起源、例えば、造血 (全能性幹細胞、白血球、リンパ球
、単球もしくはマクロファージ、等) 、筋、鼻、肺、気管、肝、上皮または繊維
芽起源のものでよい。

【００６３】本発明の課題はまた、治療剤または予防剤として、本発明に係る方法を用いて
得ることができる、本発明に係る宿主細胞、アデノウイルス粒子またはアデノウ
イルス、特に組換えアデノウイルスを、製薬学の観点から許容される担体と組合
わせて含有する組成物でもある。本発明に係る組成物は、特に、遺伝病 (血友病
、嚢胞性繊維症、糖尿病またはデュシェンヌ、ベッカー等の筋障害) 、がん、例
えば、がん遺伝子もしくはウイルスにより誘発されるもの、Ｂ型もしくはＣ型肝
炎またはエイズ (HIV 感染により発症する後天性免疫不全症候群) のようなウイ
ルス性疾患、ならびにヘルペスウイルスにより引き起こされるウイルス感染のよ
うな反復ウイルス性疾患といった病気の予防または治療処置に向けられる。

【００６４】本発明に係る組成物は常法により製造することができる。具体的には、治療有
効量の治療剤または予防剤を、製薬学的観点から許容される担体と混合する。こ
のような担体は患者に無毒である。それは注射液、等張溶液（そのpHはin vivo
使用に適合性) 、ぶどう糖、グリセリン、マンニット等の溶液とすることができ
る。本発明に係る組成物は、局所もしくは全身に、またはエーロゾルにより、特
に胃内、皮下、心臓内、筋肉内、静脈内、腹腔内、腫瘍内、肺内、鼻内もしくは
気管内経路から投与することができる。投与は１回だけ行うこともでき、また或
る遅延期間の後に１回以上の反復投与を行うこともできる。適当な投与経路およ
び用量は、例えば、処置すべき個人もしくは疾患、または導入すべき関心ある遺
伝子といった各種パラメータに応じて変動する。具体的には、本発明にかかるウ
イルス粒子は、 10⁴〜10¹⁴ pfu (プラーク形成単位) 、有利には 10⁵〜10¹³ pfu
、そして好ましくは 10⁶〜10¹² pfuの用量の剤形で処方することができる。処方
組成物は製薬学的観点から許容されるアジュバント (佐剤) または賦形剤も含有
しうる。

【００６５】本発明に係る組成物は、選択した投与経路に応じて、固体または半固体製剤の
形態、具体的にはガス剤、錠剤、 (マイクロ) カプセル剤、散剤、ゼラチンカプ
セル剤、顆粒剤、クリーム剤、溶液剤、座剤、またはエーロゾル剤の形態で処方
することもできる。

【００６６】本発明の薬剤組成物では、組成物は当業者には公知の慣用の製薬用担体を用い
て処方することができる。このような担体は、特に、ゼラチン、でんぷん、乳糖、ステアリン酸マグネシ
ウム、タルク、しょ糖もしくはアラビアゴム、または類似物などの製薬用ビヒク
ルを含む。

【００６７】組成物を希釈剤と混合し、得られた混合物を軟質または硬質ゼラチンカプセル
に注入することによりゼラチンカプセル剤の製剤を得ることも可能である。シロップ剤またはエリキシル剤の形態の製剤は、甘味剤、防腐剤、ならびにさ
らに香料や適当な着色剤と一緒に、本組成物を含有することができる。

【００６８】水分散性の散剤または顆粒剤は、分散剤もしくは湿潤剤、または懸濁剤、なら
びに香味増強剤もしくは甘味剤との混合物として本組成物を含有することができ
る。

【００６９】直腸投与に対しては、直腸温度で融解する結合剤、例えば、カカオバターまた
はポリエチレングリコールを用いて調製された座剤を使用する。本組成物は、場合により１種または２種以上の添加担体と一緒に、マイクロカ
プセルの形態で処方することもできる。

【００７０】本発明の課題はまた、裸の核酸から選ばれた少なくとも１種の化合物または少
なくとも１種のカチオン性化合物と組合わせた核酸をさらに含むことを特徴とす
る組成物でもある。

【００７１】そのin vivo 使用に関して、本発明に係るアデノウイルス粒子は、合成または
天然化合物と複合体化することもできる。このようなアデノウイルス粒子および
それらの使用は、例えば、O'Riordan et al., 1999, Human Gene Therapy, 10,
1349-1358 または特許出願WO 98/44143 に説明されている。これらの文書の内容
を参照として本出願に援用する。

【００７２】最後に、本発明は、ヒトまたは動物の身体の処置 (治療) を目的とする医薬品
を製造するため、本発明に係るペプチド断片、アデノウイルス粒子、アデノウイ
ルスもしくは宿主細胞、または本発明に係る方法を用いて得ることができるアデ
ノウイルスを使用することに関する。第１の可能性によれば、この医薬品は直接
in vivo 投与することができる (例えば、静脈内注射で、接近可能な腫瘍に、エ
ーロゾル剤により肺に、等) 。また、患者から細胞を取り出し (骨髄幹細胞、抹
消血リンパ球、筋細胞等) 、それらを当分野の技術に従ってin vitroでトランス
フェクションまたは感染処理してから患者に再投与するというex vivo 手法を採
用することもできる。

【００７３】本発明は、本発明に係るアデノウイルスまたは宿主細胞の治療学的に有効量を
、かかる治療を必要とする患者に投与することからなる治療方法にも及ぶ。

【００７４】

【実施例】

以下の実施例の目的は、本発明の各種課題を例示することであり、従って、そ
れらは本質的に決して制限をなすものではない。

【００７５】以下に述べる構築物は、Maniatisら (1989, Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)に詳述されている遺伝子
工学および分子クローニングの一般的技術に従って、または市販キットを使用し
た場合には製造業者の推奨に従って調製される。細菌プラスミドを用いたクロー
ニング工程は、E. coli 5K株 (Hubacek and Glover, 1970, J. Mol. Biol. 50,
111-127)またはBJ 5183 株 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580)で実
施することが好ましい。後者の菌株は、相同的組換え工程に対して使用すること
が好ましい。NM522 株 (Strategene) は、M13 ファージベクターの増殖に適して
いる。PCR 増幅法は当業者には既知である (例えば、PCR Protocol - A guide t
o methods and applications, 1990, Innis, Gelfand, Sninsky and White 編,
Academic Press Inc.を参照) 。制限部位の修復については、使用した方法は、
E. coli DNA ポリメラーゼＩのラージ断片 (Klenow) を用いて、突出 5' 末端を
満たすことである。Ad5 ヌクレオチド配列は、Genebankデータバンクにおいて参
照番号 M73260 として使用されているものである。

【００７６】細胞生物学に関しては、細胞のトランスフェクションは、当業者に既知の標準
的な方法に従って行われる。りん酸カルシウム法 (Maniatisら、上掲) を挙げる
ことができるが、DEAEデキストラン法、浸透圧ショックに基づくエレクトロポレ
ーション (電気穿孔) 法、カチオン性脂質の使用に基づく微量注入法などの任意
の他のプロトコルも使用できる。培養条件に関しては、慣用のものである。以下
の実施例では、293 ヒト細胞系 (ATCC CRL 1573)ならびにSwiss 3T3 (ATCC CCL
92) 、NR6 (Wells et al., 1990, Science 247, 962-964)および NR6-hEGFR (Sc
hneider et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 333-336) マウス細胞
系を使用する。他の細胞系も使用できることはいうまでもない。

【００７７】

【実施例１】GRP (ガストリン放出ペプチド) の受容体を発現する細胞に宿主指向性を有する
アデノウイルスの構築Ａ. GRP リガンドをコードする配列 (ファイバー-GRP) の挿入プラスミドpTG6593 は、EcoRI-SmaI断片 (ヌクレオチド(nt) 30049〜33093)の
形態の、Ad5 ファイバーをコードする完全遺伝子の導入より、p poly II (Lathe
et al, 1987, Gene 57, 193-201) から誘導する。HindIII-SmaI断片 (nt 31994
〜33093)を単離し、M13TG130 (Kieny et al., 1983, Gene 26, 91-99) 中にクロ
ーニングし、これらの同一酵素で切断(digestion) して、M13TG6526 を得る。後
者を、オリゴヌクレオチド oTG7000 (配列番号２)(Sculptor in vitro 突然変異
誘発キット、Amersham) を用いて位置指定突然変異誘発を受けさせ、配列 PSASA
SASAPGS の12アミノ酸のスペーサーをコードするリンカーを導入する。こうして
得られた突然変異ベクター、M13TG6527 を、GRP ペプチドの10残基 (GNHWAVGHLM
; Michael et al., 1995, Gene Ther. 2, 660-668)をコードする配列の導入を可
能にする第２の突然変異誘発を受けさせる。オリゴヌクレオチド oTG7001 (配列
番号３) をこのために使用する。突然変異ファージM13TG6528 からHindIII-SmaI
断片を単離し、相同的組換え法 (Chartier et al, 1996, J. Virol. 70, 4805-4
810)を用いて、nt 27081〜35935 にわたるAd5 アデノウイルス遺伝子断片を有し
、MunI (nt 32825) で線状化されたプラスミドpTG6590 に導入する。pTG8599 と
呼ばれる上記ベクターから、SpeI-ScaI 断片 (スペーサーとGRP ペプチドの導入
により改変された、Ad5 ゲノムのnt 27082〜35935 を有する) を単離した後、事
前に同じこれらの酵素で切断した、pTG6591 の等価の断片に抗して交換させる。
因みに、pTG6591 は21562 から35935 までの位置の野生型アデノウイルス配列を
含む。pTG4600 が得られ、それからBstEII断片を単離する (nt 24843〜35233)。
Ad5 ゲノムを含むプラスミド pTG3602 (国際出願WO 96/17070 に詳述) を用いた
相同的組換え後に、ベクターpTG4601 が生成する。

【００７８】 ClaIで線状化されたプラスミドpTG4061 と、Ad2 MLP プロモーターおよびSV40
ウイルスポリアデニル化シグナルの制御下にβ−ガラクトシダーゼをコードする
LacZ遺伝子を含むBsrGI-PstI断片との間の相同的組換えにより、LacZ遺伝子の発
現を可能にするカセットを、E1アデノウイルス領域の代わりに導入する。E1領域
(nt 459〜3328) がLacZ発現カセットで置換されているウイルスゲノムDNA (nt
１〜6241) の5'末端を含むベクターpTG8526 から、この断片を単離する。その構
築は当業者の技術範囲内である。得られた最終ベクターをpTG4628 と呼ぶ。

【００７９】対応するウイルスAdTG4601およびAdTG4628は、PacI切断によりこれらのプラス
ミド配列から放出されたアデノウイルス断片を293 細胞系にトランスフェクショ
ンすることにより得られる。因みに、AdTG4601は、ファイバー遺伝子がその3'末
端にスペーサーとそれに続くGRP ペプチドとを含んでいる完全Ad5 ゲノムを有し
ている。組換えウイルスAdTG4628も、MLP アデノウイルスプロモーターの制御下
にLacZリポーター遺伝子を発現するカセットを有している。

【００８０】Ｂ. ファイバー-GRPを有するウイルスの指向性の検討アデノウイルスファイバー中のGRP ペプチドの存在により、GRP の受容体をそ
の表面で発現する細胞を標的化することが可能となる。該受容体をコードするメ
ッセージの発現を、ノーザンブロットにより293 細胞およびSwiss 3T3 マウス細
胞 (Zachary et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7616-7620) にお
いて検討する。常法を用いて³²Ｐ同位体により標識した、GRP 受容体をコードす
る配列に相補的な２つのDNA 断片の混合物をプローブとして用いる。因みに、こ
れらの断片は、オリゴヌクレオチドoTG10776 (配列番号４) およびoTG10781 (配
列番号５) (Battey et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 395-399;
Corjay et al., 1991, J. Biol. Chem. 266, 18771-18779) を用いた全細胞RNA
上での逆PCR により製造される。検出されたmRNAの強度は、293 細胞の場合より
Swiss-3T3 細胞の場合の方がずっと大きく、これはマウス細胞系によるGRP 受容
体の過発現を示している。

【００８１】これら２つの細胞種について競合実験を行う。競合相手は、E. coli 中で産生
されるAd5 ファイバーknob (ノブ) からなり、そのアデノウイルス細胞受容体結
合特性は既に示されている (Henry et al., 1994, J. Virol. 68, 5239-5246)。
単層の細胞を、２％ウシ胎仔血清(FCS) 加 DMEM 培地 (Gibco BRL)中で、PBS の
存在下または増大する濃度の組換えAd5 knob (0.1 から100 μg/ml) の存在下で
、30分間予備インキュベーションする。次に、そのファイバーがGRP ペプチドを
含んでいるウイルスAdTG4628を、0.001 感染単位／細胞の感染多重度で、37℃で
24時間添加する。対照として、同じ実験条件に従って、天然ファイバー遺伝子を
有する組換えウイルスAdLacZ (Stratford-Perricaudet et al., 1992, J. Clin.
Invest. 90, 626-630) を使用する。細胞を次いで固定し、LacZ遺伝子の発現を
評価する (Sanes et al., 1986, EMBO J. 5, 3133-3142) 。青い細胞の数がウイ
ルス感染の効率の指標である。競合阻害は、非感染対照(PBS) に対する着色細胞
の数の減少をもたらす。

【００８２】 100 μg/mlの濃度の組換えAd5 knobの添加は、ウイルスAdLacZおよびAdTG4628
による293 細胞の感染を強力に阻害する (95および98％の阻害度) 。これは、競
合相手の存在によりアデノウイルスファイバーとその天然型細胞受容体との相互
作用が妨げられることを示唆している。一方、Swiss-3T3 細胞に対しては、上記
２つのウイルスは異なる挙動を示す。100 μg/mlの濃度の競合相手の存在下でウ
イルスAdTG4628の感染は一部しか阻害されないのに対し、同じ実験条件下で、天
然ファイバーを有するウイルスAdLacZの感染は完全に阻害される。これらの結果
は、AdTG4628によるSwiss-3T3 細胞の感染は、部分的には別個の受容体、恐らく
この細胞が過発現するGRP 受容体、により媒介されることを示唆している。結論
として、ファイバーのＣ末端端部へのGRP リガンドの付加は、ファイバー−天然
型細胞受容体の相互作用とは無関係に、GRP 受容体を発現する細胞の感染を促進
させる。

【００８３】

【実施例２】ムチンを発現する腫瘍細胞に対する指向性を有するアデノウイルスの構築構築：ファイバーのＣ末端に、米国特許5,591,593 に記載のようにして、EPPT
ペプチドを挿入。この改変は、腫瘍細胞上で過発現されるムチンへの結合を付与
する。

【００８４】 oTG11992: 配列番号12 のm13TG6527 による突然変異誘発でm13TG6572 を得る。pTG4213 による相同的組
換えでpTG4278 を得る。

【００８５】

【実施例３】α₄β₁インテグリンを発現する腫瘍細胞に対する指向性を有するアデノウイルスの構築構築：ファイバーのＣ末端に、米国特許5,628,979 に記載のようにして、LDV
ペプチドを挿入。この改変は、腫瘍細胞上で過発現されるα₄β₁インテグリンへ
の結合を付与する。

【００８６】 oTG 1192: 配列番号13 のm3TG6527による突然変異誘発でM13TG13265を得る。

【００８７】

【実施例４】EGF (上皮増殖因子) 受容体を発現する細胞に対する宿主指向性を有するアデノ
ウイルスの構築本実施例は、そのＣ末端端部にEGF 配列を有する有するファイバーについて述
べる。このために、オリゴヌクレオチドoTG11065 (配列番号６) およびoTG11066
(配列番号７) を使用して、プラスミドM13TG6527 由来のHindIII-XbaI断片を増
幅する。オリゴヌクレオチドoTG11067 (配列番号８) およびoTG11068 (配列番号
９) により、M13TG6527 からXhoI-SmaI 断片 (停止コドンからnt 33093までの範
囲) を発生させることができる。ATCCから得られるEGF の相補的DNA (#59957)を
、オリゴヌクレオチドoTG11069 (配列番号10) およびoTG11070 (配列番号11) を
用いてXhoI-XbaI 断片の形態で増幅する。適当な酵素で切断したこれら３種の断
片を次いで再連結して、ファイバーのＣ末端端部に融合したEGF を含むHindIII-
SmaI断片を得る。実施例１に記載したのと同じ相同的組換えの操作を用いて、こ
の断片をそのゲノム構造内で再配置する。

【００８８】但し、クローニング工程は、慣用の突然変異誘発法を用いて、標的化領域内に
ユニークなBstBI 部位を導入することにより単純化することができる。pTG4609
が得られる。BstBI で線状化したpTG4609 と上記のHindIII-SmaI断片との間の相
同的組換えにより、野生型E1領域を有するプラスミドpTG4225 が生成する。これ
に対応する、LacZ発現カセットを有するプラスミドpTG4226 は、BstBI で切断し
たpTG4213 との相同的組換えにより得られる。ウイルスAdTG4225およびAdTG4226
は、適当な細胞系、例えば、EGF の受容体を過発現する細胞系のトランスフェク
ションにより、常法に従って得ることができる。

【００８９】これらのウイルスの感染の特異性を試験するため、NR6 マウス繊維芽細胞およ
びヒトEGF の受容体を発現するNr6-hEGFR 細胞を使用することができる。組換え
Ad5 knobまたはEGF との競合により、ウイルス感染の媒介におけるEGF または天
然型細胞受容体の関与を評価することができる。

【００９０】

【実施例５】天然型細胞受容体への結合を消失するようなファイバーknobの改変Ａ. ファイバー配列の改変アデノウイルスファイバーの領域ＡＢ (アミノ酸 404〜418)の下記突然変異を
、その天然型受容体を結合させるファイバーの能力を消失させるために実施した
。リガンドの付加は対応するアデノウイルスの指向性の改変を可能にしよう。

【００９１】 −ループＡＢ内で、408 位置のセリンを、オリゴoTG12499 (配列番号14) を用
いて血清型３のグルタミン酸残基で置換； −ループＡＢ内で、406 位置のアラニンを、オリゴoTG12498 (配列番号15) を
用いて血清型３のリシン残基で置換； −ループＡＢ内で、404 位置のトレオニンを、オリゴoTG12740 (配列番号16)
を用いて血清型３のグリシン残基で置換。

【００９２】突然変異誘発は、ベクターM13TG6526 またはM13TG6528 上で実施することがで
きる。第１のベクターは野生型HindIII-SmaI断片を有し、第２のベクターはGRP
配列の挿入より改変された同じ断片を有する。アデノウイルスゲノムを有するプ
ラスミドを、プラスミド pTG4225 (野生型E1) および pTG4226 (E1領域の代わり
にLacZ) について既述したようにして再構成することができる (プラスミド pTG
4609または pTG4213による相同的組換えにより) 。293 細胞、野生型ファイバー
を発現する293 細胞 (Legrand et al., 1999, J. Virol. 73, 907-919)または問
題のリガンドを結合させる受容体を過発現する細胞のトランスフェクションによ
りウイルスを発生させる。このような細胞は、対応する相補的DNA のトランスフ
ェクションにより発生させることができる。アデノウイルスの天然型細胞受容体
を天然には発現しない細胞、例えば、Daudi 細胞系 (ATCC CCL 213) を使用する
のが好ましい。

【００９３】

【表２】

【００９４】Ｂ. 改変ファイバーのウイルス粒子への取込みと対応アデノウイルスのエントリーにおけるその使用の検討突然変異ウイルスが実際にそのキャプシド内に改変ファイバータンパク質を有
していることを確認するため、293 細胞内での増幅後に精製したウイルスを、変
性条件下で10％アクリルアミドゲル (SDS-PAGE) 上にローディングする。硝酸銀
染色により各種タンパク質が検出される。別の方法として、Ad5 ファイバーknob
に抗して指向される血清 (Henry et al., 上掲) を用いてウェスタンブロットを
実施することによりファイバーを特異的に出現させる。予想されたサイズを持つ
強いシグナルは、ウイルスが関心ある（目的）タンパク質を化学量論量で取り込
んでいることを示している。三量体ファイバーだけがペントンベースを結合させ
ることができ (Novelli and Boulanger, 1991,上掲) 、粒子に取り込まれること
ができることを考慮すると、上記実験でのタンパク質の検出は、改変ファイバー
がなお三量体を形成できることを示している。

【００９５】改変ファイバーの使用により対応突然変異ウイルスのエントリーが可能になる
ことは、実施例１Ｂで上述したように組換えknobを用いた競合実験を実施するこ
とによって検討できる。飽和濃度の野生型ペプチドの存在下での効率的な感染は
、天然型一次受容体への結合とは無関係の感染を意味する。これは、改変ファイ
バーのその受容体に対する親和性が著しく低減していることを示唆する。

【００９６】

【実施例６】ファイバーの上記改変の１つと組合わせた、ファイバー以外のキャプシドタンパク質へのリガンドの挿入本実施例は、ヘキソンキャプシドタンパク質へのEGF リガンドの挿入を説明す
る。もちろん、対応するアデノウイルスは、天然型細胞受容体へのその付着能力
を消失しているものが好ましい。例えば、そのゲノムは、改変ファイバー遺伝子
を含むか、またはファイバー配列の少なくとも一部を欠失したものでよい。

【００９７】ヘキソンをコードするAd5 ゲノムの領域 (nt 18842〜21700)をカバーする相同
的組換え用の導入プラスミドを構築する。Ad5 のHindIII-XhoI断片 (nt 18836〜
24816)を、同じこれらの酵素で切断したpBSK+ (Stratagene)中にクローニングし
て、プラスミドpTG4224 を得る。PCR を用いたキメラ断片：ヘキソン(nt19043〜
19647)-XbaI-EGF-BsrGI-ヘキソン(nt19699〜20312)を作成することにより、ヘキ
ソンのL1超可変ループ中に、EGF ペプチドをコードする配列を導入する。nt 190
43〜19647 断片は、オリゴヌクレオチドoTg11102 (配列番号17) およびoTG11103
(配列番号18) によるプラスミドpTG3602 を用いたPCR 増幅により得られる。nt
19699〜20312 断片は、オリゴヌクレオチドoTg11104 (配列番号19) およびoTG1
1105 (配列番号20) を用いて、同じDNA から増幅される。EGF を、オリゴヌクレ
オチドoTg11106 (配列番号21) およびoTG11107 (配列番号22) によりcDNAを用い
てクローニングすると、EGF コーディング配列をヘキソンと共にフレーム内に入
れることが可能になる。PCR 産物を適当な酵素で切断した後、再連結させる。そ
の後、キメラ断片を、NdeI (nt 19549) で線状化したプラスミドpTG4224 中に相
同的組換えにより挿入して、pTG4229 を得ることができる。改変されたヘキソン
をコードする配列をHindIII-XhoI切断により得て、これを相同的組換えによりそ
のゲノム構造内で再配置することができる。SgfIで線状化したベクターpTG3602
、pTG4607 もしくはpTG4629 、またはファイバー配列を欠失した (上記pTG4607
のような) もしくは改変ファイバーを発現するアデノウイルスゲノムを有するベ
クターを使用することもできる。

【００９８】機能性の天然ファイバーを産生することができないアデノウイルスゲノムは、
開始コドンに影響するが、残りのアデノウイルスORF(オープンリーディングフレ
ーム) には及ばない欠失により得られる。下記を実施する：欠失のアデノウイル
ス断片5' (nt 30564〜31041)を、プライマーoTG7171 およびoTG7275(配列番号23
および24) を用いてPCR により増幅する。3'に位置する断片 (nt 31129〜33099)
の増幅は、プライマーoTG7276 およびoTG7049(配列番号25および26) を用いる。
PCR 断片をXhoIで切断し、連結してから、NdeIで線状化したベクターpTG6591 中
に相同的組換えにより導入して、pTG4602 を得る。その後、これから単離された
BstEII断片に、SpeIで切断したベクターpTG3602 との相同的組換えを受けさせる
。pTG4607 が得られる。ベクターpTG4629 はpTG4607 に等しいが、E1の代わり
に LacZ発現カセットも有している。

【００９９】対応するウイルスは、293 細胞、または野生型ファイバーを発現する293 細胞
(Legrand et al., 1999, 上掲) またはEGF の受容体を過発現する細胞のトラン
スフェクション後に得ることができる。競合相手としてEGF を用いて、感染の特
異性の検討を既述のようにして実施してもよい。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/075 Ｃ１２Ｎ 7/00 ４Ｈ０４５Ｃ１２Ｎ 5/10 15/00 ＺＮＡＡ 7/00 5/00 Ｂ (72)発明者キュザック、スティーブンフランス国、38170セシネ、ルトゥ・ドゥ・サン・ニジエ、653 (72)発明者ルグラン、バレリーフランス国、67100ストラスブール、リュー・ドゥ・リボビレ、33 (72)発明者レスナー、フィリップフランス国、67000ストラスブール、リュー・ユーマン、８ (72)発明者メータリ、マジドオランダ国、1083ＣＪアムステルダム、ロファルト17 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA02 DA03 GA11 GA18 HA01 HA17 4B065 AA93X AA95Y AB01 AC20 BA02 CA44 4C084 AA13 CA01 NA14 ZB26 4C085 AA21 BA77 4C088 AD30 NA14 ZB26 4H045 AA10 BA10 CA01 EA20 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アデノウイルスの改変されたファイバーであって、プリーツ
シートＡからプリーツシートＢにまで達し、かつループＡＢを含んでいる該ファ
イバーの領域内の１または２以上の残基に少なくとも１つの突然変異を含む、ア
デノウイルスのファイバー。
【請求項２】ループＡＢ内の１または２以上の残基に少なくとも１つの突
然変異を含むことを特徴とする、請求項１記載アデノウイルスのファイバー。
【請求項３】ウイルス粒子に含有させた時に、下記特性を有する該ウイル
ス粒子の産生を可能にすることを特徴とする、請求項１または２記載のアデノウ
イルスのファイバー： (i) 該アデノウイルス粒子が天然型細胞受容体に実質的に付着しない； (ii)該アデノウイルス粒子が或るアンチリガンドに特異的なリガンドをさらに
含む時に、該改変粒子が、該アンチリガンドを表面に有する１または２以上の特
定の細胞種(cell type) に対する新規な指向性(tropism) を有する。
【請求項４】配列番号１(SEQ ID NO: 1)に示した配列の全部または一部を
含む５型アデノウイルス(Ad5) のファイバーに由来すること、及び残基400 から
428 の間の領域の１または２以上の残基に少なくとも１つの突然変異を含むこと
を特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のアデノウイルスのファイバー。
【請求項５】 SEQ ID NO: 1の残基404 から418 の間の領域の１または２以
上の残基に少なくとも１つの突然変異を含むことを特徴とする、請求項４記載の
５型アデノウイルスのファイバー。
【請求項６】 SEQ ID NO: 1の残基404 から408 の間の領域の１または２以
上の残基に少なくとも１つの突然変異を含むことを特徴とする、請求項５記載の
５型アデノウイルスのファイバー。
【請求項７】前記残基が404 位置のトレオニン残基、406 位置のアラニン
残基、および408 位置のセリン残基から選ばれることを特徴とする、請求項６記
載の５型アデノウイルスのファイバー。
【請求項８】 408 位置のセリン残基の、少なくとも２つのカルボキシル基
を有するアミノ酸残基による置換、を含むことを特徴とする請求項７記載の５型
アデノウイルスのファイバー。
【請求項９】前記アミノ酸残基が、アスパラギン酸およびグルタミン酸よ
りなる群から選ばれることを特徴とする、請求項８記載の５型アデノウイルスの
ファイバー。
【請求項１０】 404 位置のトレオニン残基のグリシン残基による置換およ
び／または406 位置のアラニン残基のリシン残基による置換を含むことを特徴と
する、請求項７記載の５型アデノウイルスのファイバー。
【請求項１１】少なくとも１つの突然変異が、該領域のループおよび／ま
たはプリーツシートの少なくとも３つの連続残基の欠失であることを特徴とする
、請求項１〜10のいずれかに記載のアデノウイルスのファイバー。
【請求項１２】前記欠失残基が、前記第１のアデノウイルスにより認識さ
れるもの以外の細胞受容体と相互作用することができる、異種の第２のアデノウ
イルスのファイバーに由来する、等価のループおよび／またはプリーツシートの
残基で置換されていることを特徴とする、請求項11記載のアデノウイルスのファ
イバー。
【請求項１３】下記位置にさらに１または２以上の突然変異を含むことを
特徴とする、請求項１〜12のいずれかに記載のアデノウイルスのファイバー： (i) ループＣＤ、ＤＧ、ＧＨ、ＨＩ、および／もしくはＩＪならびに／または (ii)プリーツシートＣ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉおよび／もしくはＪ。
【請求項１４】非突然変異ファイバーの天然型細胞受容体以外の細胞アン
チリガンドを認識することができるリガンドをさらに含むことを特徴とする、請
求項１〜13のいずれかに記載のアデノウイルスのファイバー。
【請求項１５】該リガンドが、抗体もしくは抗体断片、ペプチド、脂質、
糖脂質、ホルモン、ポリマーまたは糖よりなる群から選ばれることを特徴とする
、請求項14記載のアデノウイルスのファイバー。
【請求項１６】該リガンドがファイバーのＣ末端端部に挿入されているこ
とを特徴とする、請求項14または15記載のアデノウイルスのファイバー。
【請求項１７】該リガンドが欠失残基の置換物として挿入されていること
を特徴とする、請求項14または15記載のアデノウイルスのファイバー。
【請求項１８】請求項１〜17のいずれか１項に記載のファイバーのプリー
ツシートＡからプリーツシートＢに達し、かつループＡＢを含んでいる領域を含
むことを特徴とする、ペプチド断片。
【請求項１９】請求項４〜17のいずれか１項に記載のファイバーの残基38
8 から残基592 までに達する配列であることを特徴とする、請求項18記載のペプ
チド断片。
【請求項２０】請求項１〜17のいずれかに記載のアデノウイルスのファイ
バーまたは請求項18および19のいずれかに記載のペプチド断片をコードするDNA
断片または発現ベクター。
【請求項２１】該細胞系中でのその発現を可能にするエレメントの制御下
に置かれた、請求項20記載のDNA 断片を、ゲノムに組込まれた形態またはエピソ
ーム形態のいずれかで含むことを特徴とする細胞系(cell line) 。
【請求項２２】Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４およびＬ１〜Ｌ５領域によりコードされ
る機能から選ばれた１または２以上の機能が欠損しているアデノウイルスを補完
することもできることを特徴とする、請求項21記載の細胞系。
【請求項２３】 293 細胞系を用いて産生されることを特徴とする、請求項
21または22記載の細胞系。
【請求項２４】 PERC6 細胞系を用いて産生されることを特徴とする、請求
項21または22記載の細胞系。
【請求項２５】天然の機能性ファイバーが欠失していて、請求項１〜17の
いずれかに記載のファイバーを含んでいることを特徴とする、アデノウイルス粒
子。
【請求項２６】天然の機能性ファイバーが欠失していて、請求項１〜17の
いずれかに記載のファイバーと、該粒子の天然型細胞受容体以外の細胞アンチリ
ガンドを認識することができるリガンド、とを含んでいることを特徴とする、ア
デノウイルス粒子。
【請求項２７】前記リガンドが、ファイバー以外のアデノウイルスキャプ
シドタンパク質、特にヘキソンまたはペントンに挿入されていることを特徴とす
る、請求項26記載のアデノウイルス粒子。
【請求項２８】中空(empty) であることを特徴とする、請求項25〜27のい
ずれかに記載のアデノウイルス粒子。
【請求項２９】アデノウイルスゲノムを含むことを特徴とする、請求項25
〜27のいずれかに記載のアデノウイルス粒子。
【請求項３０】前記アデノウイルスゲノムが複製欠損組換えアデノウイル
スゲノムであることを特徴とする、請求項29記載のアデノウイルス粒子。
【請求項３１】下記を特徴とする、請求項29記載のアデノウイルス粒子の
製造方法： (i) 前記複製欠損組換えアデノウイルスゲノムを適当な細胞系にトランスフ
ェクションし、 (ii) 前記トランスフェクションした細胞系を前記アデノウイルス粒子の産生
を可能にするように適当な条件下で培養し、そして (iii) 前記アデノウイルスを前記トランスフェクションした細胞系の培養液か
ら回収し、場合により前記アデノウイルス粒子を精製する。
【請求項３２】下記を特徴とする、ファイバーをコードする配列の全部ま
たは一部が欠失したアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルス粒子の製造方法
： −前記ゲノムを請求項21〜24のいずれかに記載の細胞系にトランスフェクショ
ンし、 −前記トランスフェクションした細胞系を前記アデノウイルス粒子の産生を可
能にするように適当な条件下で培養し、そして −前記アデノウイルス粒子を前記トランスフェクションした細胞系の培養液か
ら回収し、場合により前記アデノウイルス粒子を精製する。
【請求項３３】請求項25〜30のいずれかに記載のアデノウイルス粒子、ま
たは請求項31または32記載の方法を用いて得ることができるアデノウイルス粒子
を、製薬学の観点から許容される担体と一緒に含有する組成物。
【請求項３４】裸の核酸から選ばれた少なくとも１種の化合物または少な
くとも１種のカチオン性化合物と組合わせた核酸をさらに含むことを特徴とする
、請求項33記載の組成物。
【請求項３５】ヒトまたは動物の身体の処置を目的とする医薬品を製造す
るための、請求項25〜30のいずれかに記載のアデノウイルス粒子、または請求項
31または32記載の方法を用いて得ることができるアデノウイルス粒子の使用。