KR20020092159A - 리버스-턴 유사체 및 이와 관련된 방법 - Google Patents

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Abstract

생물학적 활성 펩티드 및 단백질의 리버스-턴 영역의 2차 구조와 유사한 입체형태적으로 구속된 화합물이 기재되어 있다. 이러한 리버스-턴 유사체들은 세포 유착 매개된 질환, 예를 들면 다발성경화증, 아테롬성동맥경화증, 천식 및 염증성 장 질환을 치료하는데 유용하다.

Description

리버스-턴 유사체 및 이와 관련된 방법{Reverse-turn mimetics and methods relating thereto}
세포 유착은 살아있는 생물체의 생존능력에 있어 중요하다. 함께 유착되어 다세포 조직을 이루고, 배 발생을 지시한다. 이는 상처 치유, 감염의 일소, 및 혈액 응고에 있어 중요한 역할을 한다. 인테그린은 이러한 모든 기능과 밀접하게 관련된 세포 표면 단백질의 부류이다. 이들은 적혈구를 제외한 거의 모든 유형의 사람 세포에서 발견되었다. 인테그린 기능의 비정상은 염증성 질환, 심장 발작, 뇌졸중, 및 암을 포함하는 각종 질환의 원인이 된다.
인테그린은, 서로 비공유적으로 결합된 α 및 β 아단위의 이종이량체로 이루어진다. 이들 세포 표면 수용체는 세포막을 통해 세포질에까지 이른다. 15개 이상의 상이한 α 및 9개 이상의 상이한 β가 공지되어 있다. 그러나, 대부분의α 단백질은 단지 하나의 β와 결합되기 때문에, 약 21개의 공지된 인테그린 수용체가 존재한다. 세포 표면상에 두 개의 아단위의 두부가 서로 접촉하여 세포외 단백질 리간드에 대한 결합 표면을 형성하므로, 다른 세포 또는 세포외 매트릭스에 결합될 수 있다. 이들 수용체의 친화성은 세포 내부 또는 외부로 부터의 시그날에 의해 조절될 수 있다. 예를 들면, 상해 또는 감염 부위로의 백혈구의 집중은 일련의 유착 상호작용과 관련이 있다. 내피와 백혈구 셀렉틴과 탄수화물 사이의 약한 상호작용은 혈관벽을 따라 백혈구의 일시적 유착과 롤링을 매개한다. 다양한 케모킨과 염증 부위에서 방출된 다른 유발 인자는 정지상태로 부터 고 친화성 상태로 인테그린을 활성화하는 시그날로서 작용한다. 이후, 이들 활성화된 인테그린은 내피 세포의 표면상의 이들의 동족 리간드와 결합하여, 백혈구의 강한 유착과 편평화를 초래한다. 이어서, 백혈구는 내피를 통해 아래의 조직으로 이동한다.
인테그린 α4β1는 주로 혈관 세포 유착 분자-1(VCAM-1) 또는 제3형 연결 절편(IIICS)을 포함하는 피브로넥틴의 선택적으로 스플라이싱된 변형체에의 결합을 통해 세포 유착을 매개한다. 염증에 관련된 각종 세포, 예를 들면 호중구를 제외한 림프구, 단구, 호염기구 및 호산구는 α4β1을 발현한다. α4아단위에 대한 모노클로날 항체는, 류마티스 관절염[Barbadillo et al.Springer Semin Immunopathol16: 427-36, 1995; Issekutz et al.Immunology88: 569-76, 1996], 급성 결장염[Podolsky et al.J Clin Invest92: 372-80, 1993], 다발성 경화증[Yednock et al.Nature356: 63-6, 1992], 천식[Abraham et al.J. Clin.Invest.93: 776-87, 1994; US 5,871,734] 및 당뇨병[Tsukamoto et al.Cell Immunol165: 193-201, 1995]의 동물 모델에서 α4-함유 인테그린이 잠재적 치료 표적으로서 유효함을 입증하는데 사용되었다. 보다 최근에, 저분자량의 펩티딜 유도체가 α4β1의 경쟁적 억제제로서 생성되었으며, 양에서 알레르기성 기도 반응을 억제한다는 것이 밝혀졌다[Lin et al.J Med Chem42: 920-34, 1999].
α4β1에의 결합과 관련된 IIICS중의 주요 서열은 25개 잔기의 펩티드 CS1이고, 이 서열내에서 최소로 인식된 모티프는 트리펩티드, LDV이다. 유사한 서열, IDS는 VCAM-1이 α4β1에 결합하는데 관여한다. VCAM-1의 N-말단의 두 개의 도메인 단편의 X-선 결정 구조는, IDS 서열이 두 개의 베타-쇄를 연결하는 노출된 루프의 일부임을 보여준다[Jones et al.Nature373: 539-44, 1995; Wang et al.Proc Natl Acad Sci U S A92: 5714-8, 1995]. 리버스-턴 입체 형태를 취하는 사이클릭 펩티드 및 이의 유도체가 α4β1에 결합하는 VCAM-1의 억제제임이 입증되었다[WO 96/00581; WO 96/06108; Doyle et al.Int J Pept Protein Res47: 427-36, 1996]. 또한, 수 많은 유효하고 선택적(α4β1에 대해)인 사이클릭 펩티드계 억제제가 발견되었다[Jackson et al.J Med Chem40: 3359-68, 1997]. 몇몇 비-펩티딜 베타-턴 유사체도 또한 낮은 마이크로몰 범위의 IC50으로써 α4β1에 결합한다는 것이 보고되었다[Souers et al.Bioorg Med Chem Lett8: 2297-302, 1998]. 다수의 페닐알라닌 및 티로신 유도체도 또한 α4β1의 억제제로서 개시되었다[WO 99/06390; WO99/06431; WO 99/06433; WO 99/06434; WO 99/06435; WO 99/06436; WO 99/06437; WO 98/54207; WO 99/10312; WO 99/10313; WO 98/53814; WO 98/53817; WO 98/58902]. 그러나, 유효하고 경구적으로 이용가능한 저분자량의 억제제는 공지되지 않았다.
관련 인테그린, α4β7는 림프구의 표면에 발현되어, VCAM-1, 피브로넥틴 및 점막 어드레신 세포 유착 분자-1(MAdCAM-1: Mucosal Addressin Cell Adhesion Molecule 1)에 결합한다. 인테그린 α4β7및 MAdCAM은 혈액, 소화관, 및 림프양 조직 사이의 림프구의 서브세트의 재순환을 매개한다. VCAM-1 및 피브로넥틴 CS-1과 유사하게, α4β7의 인식에 중요한 MAdCAM-1의 CD 루프상에 존재하는 트리펩티드 서열, LDT이 존재한다[Tan et al.Structure 6: 793-801, 1998]. 최근의 연구에 따르면, α4β7도 또한 천식[Lobb et al.Ann N Y Acad Sci796: 113-23, 1996), 염증성 장 질환[Fong et al.Immunol Res16: 299-311, 1997], 및 당뇨병[Yang et al.Diabetes46: 1542-7, 1997]과 같은 질환에 관여한다는 것이 밝혀졌다. 또한, α4인테그린은 자궁경부암종 및 전립선 암종을 하향-조절하는 것으로 보이는 반면, 이들은 전이성 흑색종을 상향-조절[Sanders et al.Cancer Invest16: 329-44, 1998]하는 것으로 보이므로, α4β1및 α4β7의 억제제가 항암제로서 유용하리라 여겨진다.
리버스-턴은 3 부류의 단백질 2차 구조중 하나를 포함하며, 3개(감마-턴), 4개(베타-턴), 또는 보다 많은(루프) 아미노산 측쇄를 서로 고정된 공간 관계로 나타낸다. 턴이 분자 인식 현상에서 중요하다는 것이 입증되었으며[Rose et al.Advances in Protein Chemistry 37: 1-109, 1985], 이들의 소분자 유사체에 대한 새로운 연구 분야에 관심을 갖게 되었다[Hanessian et al.Tetrahedron53: 12789-12854, 1997]. 다수의 유사체가, 생리학적으로 관련있는 측쇄를 모두 나타낼 수 없는 외부의 턴-유사체[참조: Freidinger et al.Science210: 656-8, 1980] 또는 입체형태상 이동가능한 작은 사이클릭 펩티드 유도체[참조: Viles et al.Eur J Biochem242: 352-62, 1996]을 갖는다. 그러나, 생물학적 활성 단백질 또는 펩티드에서 발견된 리버스-턴의 2차 구조와 거의 유사한 비-펩티드 화합물이 개발되었다. 예를 들면, 미국 특허 제5,475,085호, 제5,670,155호 및 제5,672,681호( Kahn) 및 공개된 PCT WO94/03494(Kahn)은 모두, 리버스-턴의 3차원적 구조와 유사한, 입체형태적으로 구속된 비펩티드 화합물을 기술하고 있다. 보다 최근에 공개된 PCT WO97/15577(Kahn) 및 PCT WO98/49168(Kahn et al.)은 또 다른 고도로 구속된 바이사이클릭 헤테로사이클을 리버스-턴으로서 기술하고 있다. 그럼에도 불구하고, 어떠한 주형도 모든 유형의 턴을 모사할 수 없기 때문에, 당업계에서는 또 다른 리버스-턴 주형 및 이의 사용 방법이 요구되고 있다.
입체형태적으로 구속된 리버스-턴 유사체의 합성 및 동정에 있어 상당한 진보가 이루어졌으나, 여전히 당업계에서는 펩티드의 2차 구조와 유사한 소분자가 요구되고 있다. 또한, 당업계에서는 이러한 유사체의 라이브러리를 합성하고, 생물학적 표적에 대한 라이브러리 구성원을 스크리닝하여 생물활성의 라이브러리 구성원을 동정하기 위한 기술이 요구되고 있다. 더우기, 당업계에서는 염증성 질환,심혈관 질환 및 일부 암을 치료하는데 사용하기 위한, 작고 경구로 이용되는 인테그린 억제제가 요구되고 있다. 특히, 류마티스 관절염, 천식, 당뇨병, 및 염증성 장 질환의 치료에 사용하기 위한 α4β1및 α4β7의 억제제가 요구되고 있다. 본 발명은 이들 요구를 실현시키고, 관련된 추가적 이점을 제공한다.
발명의 개요
요약하면, 본 발명은 생물학적 활성 펩티드 및 단백질의 리버스-턴 영역의 2차 구조와 유사한 입체형태적으로 구속된 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 화합물을 함유하는 라이브러리 뿐만 아니라 이의 합성 및 스크리닝에 대해서도 기술한다. 게다가, 본 발명은 세포 유착-매개된 질환의 치료를 위한 리버스-턴 유사체의 용도를 기술한다.
본 발명의 화합물은 화학식 I의 화합물이다:
상기식에서,
Y는 -CH(R5)-A-N(R1)-, -A-N(R1)-CH(R')-, -A-N(R1)-C(=O)-, -A-C(=O)-N(R1)-, -A-CH(R1)-O- 및 -A-CH(R1)-N(R')-이고,
A는 -(CHR')n-이고,
B는 -(CHR")m-이고,
n은 0, 1 또는 2이고,
m은 1, 2 또는 3이고,
바이사이클릭 환 위의 임의의 2개의 인접한 CH 그룹 또는 인접한 NH 그룹과 CH 그룹은 임의로 이중 결합을 형성할 수 있고,
R', R", R1, R2, R3, R4및 R5는 다음 상세한 설명에서 정의되는 바와 같다.
Y가 -CH(R5)-A-N(R1)-인 태양에 있어서, 본 발명의 화합물은 화학식 I'의 화합물이다:
상기식에서,
A 및 B는 위에서 정의한 바와 같고,
R1, R2, R3, R4및 R5는 다음 상세한 설명에서 정의하는 바와 같다.
Y가 -A-N(R1)-CH(R')-인 태양에 있어서, 본 발명의 화합물은 화학식 I''의 화합물이다:
상기식에서,
A 및 B는 위에서 정의한 바와 같고,
R', R1, R2, R3및 R4는 다음 상세한 설명에서 정의하는 바와 같다.
Y가 -A-N(R1)-C(=O)-인 태양에 있어서, 본 발명의 화합물은 화학식 I'''의 화합물이다:
상기식에서,
A 및 B는 위에서 정의한 바와 같고,
R1, R2, R3및 R4는 다음 상세한 설명에서 정의하는 바와 같다.
Y가 -A-C(=O)-N(R1)-인 태양에 있어서, 본 발명의 화합물은 화학식 I''''의 화합물이다:
상기식에서,
A 및 B는 위에서 정의한 바와 같고,
R1, R2, R3및 R4는 다음 상세한 설명에서 정의하는 바와 같다.
Y가 -A-CH(R1)-O-인 태양에 있어서, 본 발명의 화합물은 다음 화학식 I'''''의 화합물이다:
상기식에서,
A 및 B는 위에서 정의한 바와 같고,
R1, R2, R3및 R4는 다음 상세한 설명에서 정의하는 바와 같다.
Y가 -A-CH(R1)-N(R')-인 태양에 있어서, 본 발명의 화합물은 화학식 I''''''의 화합물이다:
상기식에서,
A 및 B는 위에서 정의한 바와 같고,
R', R1, R2, R3및 R4는 다음 상세한 설명에서 정의하는 바와 같다.
본 발명은 또한 위의 화학식 I의 화합물을 함유하는 라이브러리 뿐만 아니라 이러한 라이브러리를 합성하는 방법 및 이를 스크리닝하여 생물학적 활성 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 화합물을 세포 유착-매개된 질환을 치료하는데 사용하는 방법도 기술되어 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 본 발명의 화합물을 함유하는 조성물도 또한 기술되어 있다.
본 발명의 이러한 양태 및 또 다른 양태는 첨부된 도면 및 후술되는 상세한 설명을 참조함으로써 명백해질 것이다. 이를 위하여, 특정 공정, 화합물 및/또는 조성물을 보다 상세히 기재하고 있는 각종 참고문헌이 본원에 제시되어 있고 전문이 참고로 인용된다.
본 발명은 일반적으로 세포 유착-매개된 질환의 억제제를 포함하는 리버스-턴 유사체(reverse-turn mimetics) 및 리버스-턴 유사체의 화학적 라이브러리에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 대표적인 리버스-턴 유사체의 δ 및 μ 아편 수용체에 대한 방사선리간드 결합 억제%를 농도 함수로서 나타내고 있다.
도 2 내지 도 9는 본 발명의 리버스-턴 유사체의 합성을 위한 대표적인 반응식을 나타내고 있다.
본 발명은 리버스-턴 유사체 및 이를 함유하는 화학적 라이브러리에 관한 것이다. 본 발명의 리버스-턴 유사체는 진단제, 예방제 및/또는 치료제로서의 용도(이에 제한되지 않음)를 포함하여 생물활성제로서 유용하다. 본 발명의 리버스-턴 유사체 라이브러리는 이러한 생물활성제의 동정에 유용하다. 본 발명을 수행함에 있어서, 라이브러리는 개개의 리버스-턴 유사체(본원에서는 "구성원"이라고도 함)를 수십개 내지 수백개 내지 수천개(또는 그 이상) 함유할 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에 있어서, 리버스-턴 유사체는 화학식 I의 구조를 갖는다:
화학식 I
상기식에서,
Y는 -CH(R5)-A-N(R1)-, -A-N(R1)-CH(R')-, -A-N(R1)-C(=O)-, -A-C(=O)-N(R1)-,-A-CH(R1)-O- 및 -A-CH(R1)-N(R')-이고,
A는 -(CHR')n-이고,
B는 -(CHR")m-이고,
n은 0, 1 또는 2이고,
m은 1, 2 또는 3이고,
바이사이클릭 환 위의 임의의 2개의 인접한 CH 그룹 또는 인접한 NH 그룹과 CH 그룹은 임의로 이중 결합을 형성할 수 있고,
R', R", R1, R2, R3, R4및 R5는 다음에 정의되는 바와 같다.
위의 화학식 I' 내지 화학식 I''''''에서, 융합된 바이사이클릭 환 위의 탄소원자에 대한 각종 R 그룹의 결합을 나타내는 직선은 이들 R 그룹이 해당 면의 평면 위 또는 아래에 위치할 수 있음을 나타낸다. 본 발명의 리버스-턴 유사체를 천연 아미노산(즉, "L-아미노산")의 리버스-턴과 유사하게 하고자 한다면, R 그룹은 일반적으로 화학식 I에서 해당 면의 평면 아래에 위치할 것이다(즉,"R"). 그러나, 본 발명의 리버스-턴 유사체를 하나 이상의 D-아미노산을 함유하는 리버스-턴과 유사하게 하고자 한다면, 상응하는 R 그룹(들)은 화학식 I에서 해당 면의 평면의 위에 위치할 것이다(즉, "R").
하나의 양태에 있어서, R1및 R4는 동일하거나 상이하고, 화합물의 잔여부분을 나타내고, R', R", R2, R3및 R5는 동일하거나 상이하고 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기들 및 이의 유도체들로부터 선택된다. R' 및 R"에 관하여, R' 및 R"는 각각 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기들 및 이의 유도체들로부터 선택되는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, m이 2인 경우, B는 -CHR"CHR"- 잔기이다. 이러한 경우, R"는 둘 다 독립적으로 선택되고 동일하거나 상이할 수 있다. 따라서, R"가 하나는 수소이고 또 다른 하나는 메틸인 경우, B는 -CH2CH(CH3)-일 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 "화합물의 잔여부분"은 리버스-턴 유사체의 R1및/또는 R4위치에 공유적으로 결합하는 모든 잔기, 제제, 화합물, 지지체(support), 분자, 링커(linker), 아미노산, 펩티드 또는 단백질을 의미한다. 이 용어는 아미노산 측쇄 잔기 및 이의 유도체도 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "아미노산 측쇄 잔기"는 표 1에 기재한 천연 아미노산 측쇄 잔기(이에 제한되지 않음)를 포함하는 천연 단백질에 존재하는 모든 아미노산 측쇄 잔기를 나타낸다. 본 발명의 다른 천연 아미노산 측쇄 잔기는 3,5-디브로모티로신, 3,5-디요오도티로신, 하이드록시리신, γ-카복시글루타메이트, 포스포티로신 및 포스포세린의 측쇄 잔기(이에 제한되지 않음)를 포함한다. 추가로, 글리코실화 트레오닌, 세린 및 아스파라긴(이에 제한되지 않음)을 포함하여 글리코실화된 아미노산 측쇄가 또한 본 발명의 수행에 사용될 수 있다.
천연 아미노산 측쇄 잔기 이외에, 또한 본 발명의 아미노산 측쇄 잔기는 이의 각종 유도체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 아미노산 측쇄 잔기의 "유도체"는 천연 아미노산 측쇄 잔기에 대한 변형체 및/또는 변이체를포함한다. 예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신 및 페닐알라닌의 아미노산 측쇄 잔기는 일반적으로 저급 알킬, 아릴 또는 아르알킬 잔기로 분류될 수 있다. 아미노산 측쇄 잔기의 유도체에는 다른 직쇄 또는 측쇄, 환식 또는 비환식, 치환되거나 비치환된, 포화되거나 불포화된 저급 알킬, 아릴 또는 아르알킬 잔기가 포함된다.
본 명세서에 사용된 "저급 알킬 잔기"는 탄소원자를 1 내지 12개 함유하고 "저급 아릴 잔기"는 탄소원자를 6 내지 12개 함유하고 "저급 아르알킬 잔기"는 탄소원자를 7 내지 12개 함유한다. 따라서, 하나의 태양에 있어서, 아미노산 측쇄 유도체는 C1-12알킬, C6-12아릴 및 C7-12아르알킬로부터 선택되고, 보다 바람직한 태양에 있어서는 C1-7알킬, C6-10아릴 및 C7-11아르알킬로부터 선택된다.
본 발명의 아미노산 측쇄 잔기의 유도체는 저급 알킬, 아릴 및 아르알킬 잔기의 치환된 유도체도 추가로 포함하는데, 여기서, 치환체는 하나 이상의 다음 잔기들(이들로 제한되지 않음)로부터 선택된다: -OH, -OR, -COOH, -COOR, -CONH2, -NH2, -NHR, -NRR, -SH, -SR, -SO2R, -SO2H, -SOR(여기서, R은 각각 독립적으로 직쇄 또는 측쇄, 환식 또는 비환식, 치환되거나 비치환된, 포화되거나 불포화된 저급 알킬, 아릴 및 아르알킬 잔기로부터 선택된다) 및 할로겐(F, Cl, Br 및 I 포함). 또한, 본 발명의 환식 저급 알킬, 아릴 및 아르알킬 잔기는 나프탈렌 뿐만 아니라, 복소환식 화합물, 예를 들면 티오펜, 피롤, 푸란, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 피라졸, 3-피롤린, 피롤리딘, 피리딘, 피리미딘, 푸린, 퀴놀린, 이소퀴놀린 및 카바졸을 포함한다. 아미노산 측쇄 잔기의 유도체는 또한 알킬 및 아르알킬 포스포네이트 및 실란(이들로 제한되지 않음)을 포함하여 저급 알킬 및 아르알킬 잔기의 알킬부분의 헤테로알킬 유도체를 포함한다.
대표적인 R1및 R4잔기는 구체적으로 -OH, -OR, -COR, -COOR, -CONH2, -CONR, -CONRR, -NH2, -NHR, -NRR, -SO2R 및 -COSR(여기서, R은 각각 위에서 정의한 바와 같다)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
또 다른 태양에 있어서, R1, R2, R3, R4또는 R5는 아미노산 측쇄 잔기 또는 이의 유도체(또는 R1및 R4인 경우의 화합물의 잔여부분)인 이외에, 또 다른 잔기 또는 화합물에 대한 당해 화합물의 연결을 용이하게 하는 링커일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 진단 또는 스크리닝 분석에 사용하기 위해, 비오틴과 같은 하나 이상의 공지된 화합물에 연결시킬 수 있다. 또한, R1, R2, R3, R4또는 R5는 고체 지지체(예: 고체 상 펩티드 합성에 사용되는 지지체)에 화합물을 연결시키는 링커일 수 있거나, 지지체 자체일 수 있다. 이러한 태양에서, 또 다른 잔기 또는 화합물에, 또는 고체 지지체에 대한 결합은 R1또는 R4위치가 바람직하고, R4위치가 보다 바람직하다.
Y가 -CH(R5)-A-N(R1)-인 태양에 있어서, 리버스-턴 유사체는 화학식 I'의 화합물이다:
화학식 I'
상기식에서,
A, B, R1, R2, R3, R4및 R5는 위에서 정의한 바와 같다.
바람직한 태양에 있어서, R1및 R4는 화합물의 잔여부분을 나타내고, R2, R3및 R5는 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기로부터 선택된다.
화학식 I'의 보다 구체적인 태양에 있어서, A가 -(CH2)n-이고 B가 -(CH2)m-인 리버스-턴 유사체는 화학식 Ia'의 화합물이다.
상기식에서,
n, m, R1, R2, R3, R4및 R5는 위에서 정의한 바와 같다. 바람직한 태양에 있어서, R1및 R4는 당해 화합물의 잔여부분을 나타내고, R2, R3및 R5는 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기로 부터 선택된다.
화학식 I'의 보다 더욱 구체적인 태양에 있어서, A가 -(CH2)n-이고 B가 -(CH2)m-이고, n은 0이고, m은 1인, 리버스-턴 유사체는 화학식 Ib'의 화합물이다.
상기식에서,
R1, R2, R3, R4및 R5는 위에서 정의한 바와 같다. 바람직한 태양에 있어서, R1및 R2는 당해 화합물의 잔여부분을 나타내고, R2, R3및 R5는 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기로 부터 선택된다. 또 다른 바람직한 태양에서, R1은 ROC(O)-, RSO2- 및 RNHC(O)- (여기서, R은 위에서 정의한 바와 같다)중에서 선택된다. 보다 바람직한 태양에서, R1은 ROC(O)-, RSO2및 RNHC(O)- 중에서 선택되고, R은 치환되거나 비치환된 저급 아릴 및 저급 아르알킬 잔기중에서 선택된다. 또 다른 구체적 태양에서, R2및 R5는 COOH 또는 COOR(여기서, R은 위에서 정의한 바와 같다)로 치환된 저급 알킬 잔기중에서 독립적으로 선택된다. 또 다른 구체적 태양에서, R3은 치환되거나 비치환된 저급 아릴 및 저급 아르알킬 잔기중에서 선택된다.
Y가 -A-N(R1)-CH(R')-인 태양에 있어서, 당해 리버스-턴 유사체는 화학식I''의 화합물을 포함한다:
화학식 I''
상기식에서,
A, B, R1, R2, R3, R4및 R'는 위에서 정의한 바와 같다.
바람직한 태양에 있어서, R1및 R4는 화합물의 잔여부분을 나타내고, R2, R3및 R'는 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기로부터 선택된다.
바이사이클릭 환 위의 2개의 인접한 CH 그룹들이 이중 결합을 형성하는 화학식 I''의 태양에 있어서, 본 발명의 리버스-턴 유사체는 화학식 Ia''의 화합물을 포함한다:
상기식에서,
A, B, R1, R2, R3, R4및 R'는 위에서 정의한 바와 같다.
바람직한 태양에 있어서, R1및 R4는 화합물의 잔여부분을 나타내고, R2및 R3은 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기로부터 선택되며, R'는 수소이다.
화학식 Ia''의 화합물의 보다 구체적인 태양에 있어서, A는 -(CH2)n-이고, B는 -(CH2)m-이며, R'는 수소인, 리버스-턴 유사체는 화학식 Ib''의 화합물이다:
상기식에서,
n, m, R1, R2, R3및 R4는 위에서 정의한 바와 같다.
Y가 -A-N(R1)-C(=O)-인 태양에 있어서, 리버스-턴 유사체는 화학식 I'''의 화합물이다:
화학식 I'''
상기식에서,
A, B, R1, R2, R3및 R4는 위에서 정의한 바와 같다.
바람직한 양태에 있어서, R1및 R4는 화합물의 잔여부분을 나타내고, R2및 R3은 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기로부터 선택된다.
화학식 I'''의 화합물의 보다 구체적인 태양에 있어서, A는 -(CH2)n-이고, B는 -(CH2)m-인, 리버스-턴 유사체는 화학식 Ia'''의 화합물이다:
상기식에서,
n, m, R1, R2, R3및 R4는 위에서 정의한 바와 같다.
Y가 -A-C(=O)-N(R1)-인 태양에 있어서, 리버스-턴 유사체는 화학식 I''''의 화합물이다.
화학식 I''''
상기식에서,
R1, R2, R3및 R4는 위에서 정의한 바와 같다.
바람직한 태양에 있어서, R1및 R4는 화합물의 잔여부분을 나타내고, R2및 R3은 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기로부터 선택된다.
화학식 I''''의 화합물의 보다 구체적인 태양에 있어서, A는 -(CH2)n-이고, B는 -(CH2)m-인, 리버스-턴 유사체는 화학식 Ia''''의 화합물이다:
상기식에서,
n, m, R1, R2, R3및 R4는 위에서 정의한 바와 같다.
Y가 -A-CH(R1)-O-인 태양에 있어서, 리버스-턴 유사체는 화학식 I'''''의 화합물이다:
화학식 I'''''
상기식에서,
R1, R2, R3및 R4는 위에서 정의한 바와 같다.
바람직한 태양에 있어서, R1및 R4는 화합물의 잔여부분을 나타내고, R2및 R3은 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기로부터 선택된다.
화학식 I'''''의 화합물의 보다 구체적인 태양에 있어서, A는 -(CH2)n-이고 B는 -(CH2)m-인, 리버스-턴 유사체는 화학식 Ia'''''의 화합물이다:
상기식에서,
n, m, R1, R2, R3및 R4는 위에서 정의한 바와 같다.
Y가 -A-CH(R1)-N(R')-이고, 바이사이클릭 환 위의 인접한 NH 및 CH 그룹이 이중 결합을 형성하는 태양에 있어서, 본 발명의 리버스-턴 유사체는 화학식 Ia''''''의 화합물을 포함한다:
상기식에서,
A, B, R1, R2, R3및 R4는 위에서 정의한 바와 같다.
바람직한 태양에 있어서, R1및 R4는 화합물의 잔여부분을 나타내고, R2및 R3은 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기로부터 선택된다.
화학식 Ia''''''의 화합물의 보다 구체적인 태양에 있어서, A는 -(CH2)n-이고, B는 -(CH2)m-인, 리버스-턴 유사체는 화학식 Ib''''''의 화합물이다:
상기식에서,
n, m, R1, R2, R3및 R4는 위에서 정의한 바와 같다.
화학식 I의 바람직한 태양에서, R1은 ROC(O)-, RSO2및 RNHC(O)- (여기서, R은 위에서 정의한 바와 같다)중에서 선택된다. 보다 구체적인 태양에서, R1은 ROC(O)-, RSO2및 RNHC(O)- 중에서 선택되고, R은 치환되거나 비치환된 저급 아릴 및 저급 아르알킬 잔기중에서 선택된다.
화학식 I의 구체적 태양에서, R2및 R5는 COOH 또는 COOR(여기서, R은 위에서 정의한 바와 같다)로 치환된 저급 알킬 잔기중에서 독립적으로 선택된다. 화학식I의 또 다른 구체적 태양에서, R2및 R5은 독립적으로 H 및 RC(O)NH-(여기서, R은 위에서 정의한 바와 같다)중에서 선택된다.
화학식 I의 또 다른 구체적 태양에서, R3은 치환되거나 비치환된 저급 아릴 및 저급 아르알킬 잔기중에서 선택된다.
화학식 I의 또 다른 구체적 태양에서, R3은 치환되거나 비치환된 저급 아릴 및 저급 아르알킬(복소환식 포함) 잔기중에서 선택된다.
본 발명의 리버스-턴 유사체는 적합한 출발 성분 분자(이후 "성분 단편"이라 칭한다)를 사용하여 제조할 수 있다. 요약하면, 화학식 I'의 리버스-턴 유사체의 합성에 있어서, 제1 성분 단편과 제2 성분 단편을 커플링시켜 합해진 제1-제2 중간체를 형성시키고, 제3 성분 단편과 제4 성분 단편을 커플링시켜 합해진 제3-제4 중간체를 형성시키고(또는, 시판되는 경우, 단일 제3 중간체를 사용할 수 있다), 이어서, 합해진 제1-제2 중간체와 제3-제4 중간체(또는 제3 중간체)를 커플링시켜 제1-제2-제3-제4 중간체(또는 제1-제2-제3 중간체)를 수득하고, 이를 폐환시켜 본 발명의 리버스-턴 유사체를 수득한다. 또는, 개개의 성분 단편들을 용액중에서 단계적으로, 또는 고체 상 펩티드 합성시 통상적으로 수행되는 고체 상 합성에 의해 순차적으로 커플링시켜 화학식 I'의 리버스-턴 유사체를 제조할 수 있다.
본 명세서에서, "제1 성분 단편"은 화학식 1의 구조를 갖는다:
상기식에서,
R4및 B는 위에서 정의한 바와 같고,
R은 펩티드 합성시 사용하기에 적합한 보호 그룹이다.
적합한 R 그룹은 알킬 그룹을 포함하고, 바람직한 태양에 있어서, R은 메틸 그룹이다. 이러한 제1 성분 단편은 CH(OR)2-(CH2)m-CHO와 H2N-R4를 반응시키는 환원적 아민화 또는 CH(OR)2-(CH2)m-Br로부터의 치환에 의해 용이하게 합성될 수 있다. 달리, R 그룹중 하나는 링커 및 수지일 수 있다. 펩티드 합성에 통상적으로 사용되고 왕(Wang) 링커(4-하이드록시메틸페녹시부티레이트)를 함유하는 것과 같은 폴리스티렌 수지가 적합하다.
본 발명의 "제2 성분 단편"은 화학식 2a 또는 화학식 2b의 구조를 갖는다:
상기식에서,
R3은 위에서 정의한 바와 같고,
P는 펩티드 합성시 사용하기에 적합한 아미노 보호 그룹이고,
X는 활성화된 카복실산 그룹의 이탈 그룹이다.
바람직한 보호 그룹은 3급-부틸 디메틸실릴(TBDMS), BOC, FMOC 및 Alloc(알릴옥시카보닐)을 포함한다. N-보호된 아미노산은 시판되고 있다. 예를 들면, FMOC 아미노산은 여러 공급원으로부터 시판되고 있다. 이들 화합물이 본 발명의 제2 성분 단편으로 전환됨은, N-보호된 아미노산의 카복실산 그룹의 활성화로 용이하게 달성될 수 있다. 적합한 활성화된 카복실산 그룹은 X가 클로라이드 또는 브로마이드와 같은 할라이드인 산 할라이드, X가 아세틸과 같은 아실 그룹인 산 무수물, 반응성 에스테르(예: N-하이드록시 벤조트리아졸 에스테르, N-하이드록시석신이미드 에스테르 및 펜타플루오로페닐 에스테르), 및 다른 활성화된 중간체(예: 디사이클로헥실카보디이미드(DCC) 또는 디이소프로필카보디이미드(DIC)와 같은 카보디이미드를 사용하는 커플링 반응중에 형성된 활성 중간체)를 포함한다.
제2 성분 단편으로서 작용하는 아미노산의 아지도 유도체의 경우, 이러한 화합물은 문헌[참조: Zaloom et al., J. Org. Chem. 46:5173-76, 1981]에 기재된 반응에 의해 상응하는 아미노산으로부터 제조될 수 있다.
본 발명의 "제3 성분 단편"은 화학식 3a 또는 화학식 3b의 구조를 갖는다:
상기식에서,
R2및 R5는 위에서 정의한 바와 같고,
P는 메틸 또는 3급-부틸 그룹과 같은 카복실산 보호 그룹이다.
본 발명의 "제4 성분 단편"은 화학식 4의 구조를 갖는다:
R1-NH2
상기식에서,
R1은 위에서 정의한 바와 같다.
적합한 제4 성분 단편은 여러 공급원으로부터 시판되고 있다. 또한, 제4 성분 단편은 1급 아민의 합성에 통상적으로 이용되는 표준 유기 합성 기술에 의해 쉽게 제조될 수 있다.
보다 구체적으로, 제1 성분 단편을 제2 성분 단편과 반응시켜 합해진 제1-제2 중간체를 수득한 다음, 합해진 제1-제2 중간체를 제3 성분 단편 및 제4 성분 단편과 순차적으로 반응시키거나 합해진 제3-제4 중간체와 반응시켜 합해진 제1-제2-제3-제4 중간체를 수득한 후, 수득한 중간체를 폐환시켜 리버스-턴 유사체를 수득하는 방법으로 본 발명의 화학식 I'의 리버스-턴 유사체를 합성한다.
화학식 I'의 리버스-턴 유사체는 일반적으로 아래의 기술로 합성될 수 있다. 아래에 도시한 바와 같이, 제1 성분 단편(1)을 제2 성분 단편(2)에 커플링시키고, N-탈보호화한 후, 합해진 제1-제2 중간체(1-2)를 수득한다:
리버스-턴 유사체의 합성은 수렴적일 수 있는데, 이 경우, 아래에 도시한 바와 같이 제3 성분 단편(3)과 제4 성분 단편(4)을 커플링시키고 O-탈보호화한 후, 합해진 제3-제4 중간체(3-4)를 수득하는 방법으로 합해진 제3-제4 중간체(3-4)를제조한다.
화학식 I에서 n이 1 또는 2인 경우, 아래의 중간체(3-4')는 다음과 같이 제조될 수 있다:
위의 반응식에서,
A는 -(CHR')n-이다.
이어서, 중간체(3-4')를 다음 반응에서 중간체(3-4) 대신에 사용하여 본 발명의 화학식 I'의 리버스-턴 유사체를 수득한다. 또한, 화학식 I에서 n이 1, 2 또는 3, 인 경우, 중간체(3-4')는 아래와 같이 아실화 또는 설폰화된 후 O-탈보호된 베타-,감마- 또는 델타-아미노산 유도체로 부터 제조될 수 있다:
아래에 도시한 바와 같이, 합해진 중간체(1-2)와 중간체(3-4)의 커플링으로 중간체(1-2-3-4)가 형성되고, 이를 폐환시키는 경우 리버스-턴 유사체(I')가 수득된다:
본 발명의 대표적인 성분 단편의 합성법은 실시예 1에 기재되어 있다. 대표적인 합해진 제1-제2 중간체와 제3-제4 중간체의 합성법은 실시예 2와 실시예 3에 각각 기재되어 있다. 이들 중간체들을 커플링시켜 대표적인 합해진 제1-제2-제3-제4 중간체를 형성시키는 방법은 실시예 4에 기재되어 있다. 이 중간체를 폐환시켜 대표적인 리버스-턴 유사체를 형성시키는 방법은 실시예 5에 기재되어 있다.
바람직한 양태에 있어서, 화학식 Ia'의 리버스-턴 유사체는 도 2에 도시된반응식에 따라서 용액중에서 제조될 수 있다. 또 다른 바람직한 태양에서, 화학식 Ia'의 리버스-턴 유사체는 도 8에 도시되고 실시예 8에 기재된 반응식에 따라 고체상에서 제조될 수 있다. 보다 바람직한 태양에서, 화학식 Ia'의 리버스-턴 유사체는 도 9에 도시된 되고 실시예 10에 기재된 반응식에 따라 고체상에서 제조될 수 있다.
화학식 I'' 내지 화학식 I''''''의 리버스-턴 유사체는 위에서 기술한 모듈식 성분 합성법과 유사한 기술로 제조할 수 있는데, 단 성분 단편에 따라서 적당히 변형될 수 있다. 보다 구체적으로, 화학식 I'' 내지 화학식 I''''''의 리버스-턴 유사체는 도 3 내지 도 7에 도시된 반응식에 따라 제조될 수 있다. 특히, 화학식 Ib'', 화학식 Ia''', 화학식 Ia'''', 화학식 Ia''''' 및 화학식 Ib''''''의 리버스-턴 유사체는 도 3, 도 4, 도 5, 도 6 및 도 7에 각각 도시된 대표적인 반응식에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 본 발명의 리버스-턴 유사체들을 함유하는 라이브러리들이 기재되어 있다. 일단 조합되면, 본 발명의 라이브러리를 스크리닝하여 생물활성을 갖는 개개의 구성원을 동정한다. 생물활성의 구성원에 대한 이러한 라이브러리의 스크리닝은, 예를 들면 라이브러리 구성원의 결합 활성을 평가하거나 라이브러리 구성원이 기능 분석에 미치는 효과를 평가하는 것을 포함한다. 통상적으로, 스크리닝은 라이브러리 구성원(또는 라이브러리 구성원의 아그룹)을, 예를 들면, 항체, 효소, 수용체 또는 세포주와 같은 목적하는 표적과 접촉시킴으로써 달성된다. 목적하는 표적과 상호작용할 수 있는 라이브러리 구성원을본 명세서에서는 "생물활성의 라이브러리 구성원" 또는 "생물활성의 유사체"라고 칭한다. 예를 들면, 생물활성의 유사체는 항체 또는 수용체에 결합할 수 있거나 효소를 억제할 수 있거나, 예를 들면 세포주와 관련된 기능성 반응을 유도하거나 길항시킬 수 있는 라이브러리 구성원일 수 있다. 즉, 본 발명의 라이브러리의 스크리닝은 어느 라이브러리 구성원이 하나 이상의 목적하는 생물학적 표적과 상호작용할 수 있는지를 결정한다. 또한, 상호작용이 일어나는 경우, 생물활성의 유사체(들)는 라이브러리 구성원으로부터 동정될 수 있다. 라이브러리로부터의 단일(또는 제한된 수의) 생물활성의 유사체(들)의 동정을 통해, 그 자체가 생물학적으로 활성이어서 진단제, 예방제 또는 치료제로서 유용하고, 더우기 당해 분야에서 주요 화합물의 동정을 상당히 진보시키는 데 사용될 수 있는 리버스-턴 유사체가 수득된다.
본 발명의 라이브러리의 펩티드 유사체의 합성은 본 발명의 제1, 제2 및 제3 성분 단편과 함께 공지된 펩티드 합성 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 보다 구체적으로, 임의의 아미노산 서열이 입체형태적으로 구속된 리버스-턴 유사체의 R1, R2, R3, R4또는 R5잔기중의 하나로서 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 서열이 R1또는 R4잔기로서 첨가될 수 있다. 이를 위하여, 당해 유사체를 공지된 기술에 의해 고체 지지체(예: 링커로서 4-하이드록시메틸페녹시부티레이트를 이용하는 폴리스티렌)상에서 합성[참조: John M. Stewart and Janis D. Young,Solid Phase Peptide Synthesis, 1984, Pierce Chemical Comp., Rockford, Illinois;Atherton, E., Shepard, R.C.Solid Phase Pepetide Synthesis: A Practical Approach; IRL: Oxford, 1989] 하거나 또는 알콜 부착에 의해 실릴-연결된 수지상에서 합성[참조: Randolph et al., J. Am Chem. Soc. 117:5712-14, 1995] 할 수 있다.
또한, 용액 및 고체 상 합성 기술 둘 모두를 조합한 기술을 사용하여 본 발명의 펩티드 유사체를 합성할 수 있다. 예를 들면, 고체 지지체를 사용하여, 입체형태적으로 구속된 리버스-턴이 서열에 첨가되는 지점까지 선형 펩티드 서열을 합성할 수 있다. 용액 합성 기술에 의해 이미 합성된 적합한 입체형태적으로 구속된 리버스-턴 유사체를 고체 상 합성에서 다음 "아미노산"으로서 첨가할 수 있다(즉, 둘 이상의 반응성 부위를 갖는 입체형태적으로 구속된 리버스-턴 유사체를 선형 펩티드에 첨가될 다음 아미노산으로서 사용할 수 있다). 입체형태적으로 구속된 리버스-턴 유사체를 서열에 도입한 경우, 추가의 아미노산을 첨가하여 고체 지지체에 결합된 펩티드를 완성시킬 수 있다. 또한, 선형 N-말단 및 C-말단 보호된 펩티드 서열을 고체 지지체 상에서 합성하고 지지체로부터 제거한 다음, 공지된 용액 커플링 기술을 사용하여 용액중에서 입체형태적으로 구속된 리버스-턴 유사체에 커플링시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 라이브러리를 작제하는 방법이 기재되어 있다. 전통적인 조합 화학 기술 및 병렬 합성 기술[참조:The Combinatorial IndexBunin, Academic Press, New York, 1998; Gallop et al.,J. Med. Chem.37:1233-1251, 1994]에 따라 기본적인 분자 골격에 시약들을 순차적으로 결합시킴으로써 다수의 화합물이 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들면, 상기 기술된 합성법은 니콜라우(Nicolaou)와 공동작업자의 지향 분류 (directed sorting) 기술[참조: Nicolaou, Xiao et al.Angew. Chem. Int. Ed. 34: 2289-2291, 1995]을 사용하여 수행할 수 있다. 현재, 이러한 기술을 위한 장비가 IRORI(La Jolla, CA)로 부터 시판되고 있다. 또한, 위에서 기재한 합성을, 48- 또는 98-웰 플레이트 포맷(여기서, 각각의 웰은 용매 및 시약의 배출을 위한 프릿화된 출구를 갖는다) 을 사용하여 병렬 합성법으로 수행한다[참조:A Practical Guide to Combinatorial ChemistryCzarnik and DeWitt, Eds., American Chemical Society, Washington, D.C., 1997]. 현재, 제조원[Robbins (Sunnyvale, CA), Charybdis (Carlsbad, CA) 및 Bohdan (Chicago, IL)]이 이러한 기술에 적합한 장비를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 생물활성에 대해 라이브러리를 스크리닝하고 생물활성의 라이브러리 구성원을 분리하는 방법이 기재되어 있다. 본 발명의 라이브러리를 각종 기술 및 방법에 의해 생물활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 일반적으로, 스크리닝 분석은, (1) 라이브러리를 수용체와 같은 목적하는 생물학적 표적과 접촉시키고 라이브러리의 유사체와 표적간에 결합이 일어나도록 하고, (2) 비색 분석법[참조: Lam et al., Nature 354:82-84, 1991 or Griminski et al., Biotechnology 12:1008-1011, 1994]과 같은 적절한 분석법에 의해 결합 현상을 검출하는 방법으로 수행할 수 있다. 바람직한 태양에 있어서, 라이브러리 구성원은 용액중에 존재하고 표적은 고체 상에 고정된다. 또한, 라이브러리도 고체 상에 고정될 수 있으며, 용액중에서 이를 표적과 접촉시켜 프로빙할 수 있다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 리버스-턴 유사체는 진단제, 예방제 및 치료제와 같은 생물활성제로서 유용하다. 대표적인 리버스-턴 유사체의 아편 수용체 결합 활성은 실시예 9에 제시되어 있다. 당해 실시예에서, 본 발명의 리버스-턴 유사체는 방사선표지된 엔케팔린 유도체가 δ 및 μ 아편 수용체에 결합하는 것을 효과적으로 억제하는 것으로 밝혀졌다. 당해 데이타로 부터, 이들 리버스-턴 유사체가 수용체 길항제로서 및 잠재적인 진통제로서 유용함이 입증된다. 또 다른 태양에서, 대표적인 리버스-턴 유사체의 인테그린 결합 활성은 실시예 11에 제시되어 있다. 이러한 실시예에서, 리버스-턴 유사체가 라모스(Ramos) 세포로 부터 CS1 펩티드를 효과적으로 대체함이 밝혀졌다. 따라서, 당해 데이타는, 리버스-턴 유사체가 α4β1인테그린을 길항시킬 수 있으며 잠재적 소염제로서 작용할 수 있다는 것을 보여준다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제중에 본 발명의 화합물의 치료학적 유효량을 포함하는 저장 또는 투여용 약제학적 조성물을 포함한다. 세포 유착의 억제제를 이용한 치료법이 각종 염증 상태, 특히 류마트스 관절염, 염증성 장 질환 및 천식의 치료 및 예방에 필요하다. 당업자는 소염 치료를 필요로 하는 상황을 쉽게 알 수 있다. 또한, 세포 유착의 억제제를 이용한 치료법이 과량의 인테그린-매개된 세포 유착이 원인 요소인 모든 병리상태, 예를 들면 아테롬성동맥경화증에 필요하다.
본 발명의 화합물의 "치료학적 유효량"은 투여 경로, 치료될 온혈동물의 유형, 및 고려되는 특정 동물의 신체적 특성에 따라 결정될 것이다. 이들 요인 및 상기 양을 결정하는데 있어서의 이들의 관계가 의학 분야의 당업자에게 익히 공지되어 있다. 상기 양 및 투여 방법은 최적 효능을 달성하도록 조절될 수 있으나, 체중, 음식물, 및 진행중인 약물치료과 같은 요인, 및 주지된 바와 같이 의약 분야의 당업자가 인식할 수 있는 기타 요인에 따라 결정될 것이다.
본 발명의 화합물의 "치료학적 유효량"은 목적하는 효과 및 치료학적 징후에 따라 크게 달라질 수 있다. 통상적으로, 투여량은 약 0.01mg/kg(체중) 내지 100mg/kg(체중), 바람직하게는 약 0.01mg/kg(체중) 내지 10mg/kg(체중)일 것이다.
희석제를 포함하여, 치료적 용도의 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제 분야에 익히 공지되어 있고, 예를 들면 문헌[Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (Gennaro Ed. 1985)]에 기재되어 있다. 예를 들면, 생리학적 pH의 멸균 염수 및 포스페이트-완충 염수가 사용될 수 있다. 보존제, 안정화제, 염료, 및 방향제가 당해 약제학적 조성물중에 제공될 수 있다. 예를 들면, 나트륨 벤조에이트, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산의 에스테르가 보존제로서 첨가될 수 있다. 또한, 산화방지제 및 현탁제가 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은, 과도한 인테그린-매개된 세포 유착이 원인 요소인 모든 병리상태를 예방 및 치료하는데 유용하다. 특히, 본 발명의 화합물은 염증 및 관련 병리상태의 예방 및 치료를 위한 약제로서 유용하다. 본 발명의 방법을 수행하는데 있어, 치료학적 유효량의 본 발명의 화합물을 함유하는 조성물이 이를 필요로하는 온혈동물에 투여된다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은, 류마티스 관절염, 아테롬성동맥경화증, 알쯔하이머병, AIDS 치매, ARDS, 천식, 알레르기, 염증성 장 질환, CNS 염증, 아토피성 피부염, I형 당뇨병, 뇌염, 심근허혈, 다발성 경화증, 수막염, 신장염, 재발협착증, 망막염, 건선, 뇌졸중 및 종양 전이중에서 선택된 질환으로 진단되었거나 이러한 질환이 발병할 위험이 있는 온혈동물에게 투여될 수 있다.
다발성 경화증(MS)은 중추신경계를 점차 약화시키는 자가면역 질환이다. 현재, 정확한 항원 유발 면역 반응은 알려지지 않았다. 그러나, 대식구가 뇌의 신경섬유를 둘러싸는 지방성 수초를 공격하여 이를 파괴하기 시작하는 것으로 보인다. MS의 동물 모델(실험적 알레르기성 뇌척수염)에서, α4β1에 대한 쥐의 모노클로날 항체가 백혈구가 내피에 유착하는 것을 차단하고, 중추신경계의 염증을 방지하여, 결구 동물의 마비를 차단한다[참조: Yednock, Cannon et al.Nature 356: 63-6, 1992].
본 발명의 화합물은 2 이상의 화합물의 배합물로서 단독으로 사용되거나, 다른 공지된 염증 억제제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 코르티코스테로이드, 비-스테로이드계 소염제, COX-2 억제제, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제 또는 리폭시게나제 억제제와 함께 치료학적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 정제, 캡슐제(각각 서방성 제형 또는 시한-방출성 제형 포함), 환제, 산제, 과립제, 엘릭서르, 팅크제, 현탁제, 시럽제, 및 유제와 같은 경구형으로 투여될 수 있다. 마찬가지로, 이들은 정맥내(거환제 또는 주입제), 복강내, 피하, 비내, 직장내 또는 근육내 투여형으로 투여될 수 있으며, 사용되는 이들 모든 투여형은 약제 분야의 당업자에게 익히 공지되어 있다. 당해 화합물은 경구 또는 비경구적은 물론 안내 또는 국소적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 화합물은 흡입에 의해 투여될 수 있으므로, 압축 팩 또는 분무기로 부터 에어로졸 분무 형태로 투여될 수 있다. 또한, 당해 화합물은 제형화될 수 있는 산제로서 투여될 수 있으며, 산제 조성물은 취입형 산제 흡입 장치를 이용하여 흡입할 수 있다. 바람직한 흡입용 투여 시스템은, 적합한 추진제, 예를 들면 플루오르화탄소 또는 탄화수소중에 본 발명의 화합물의 현탁액 또는 용액으로서 제형화될 수 있는 계량된 투여량 흡입 에어로졸이다. 또 다른 바람직한 투여 시스템은, 추가적 부형제를 포함하거나 포함하지 않는 본 발명의 화합물의 무수 산제로서 제형화될 수 있는 무수 산제 흡입 에어로졸이다.
본 발명의 화합물은, 활성 성분을 지속적으로 방출할 수 있도록 제형화된 데포(depot) 주사제 또는 임플란트 제제의 형태로 투여될 수 있다. 당해 활성 성분은 펠릿 또는 작은 원통형으로 압축되고, 데포 주사제 또는 임플란트로서 피하 또는 근육내에 이식될 수 있다. 임플란트는 생물분해성 중합체 또는 합성 실리콘, 예를 들면 실라스틱(Silastic), 실리콘 고무, 또는 다우-코닝 코포레이션에서 제조된 기타 중합체와 같은 불활성 물질을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 리포좀 전달 시스템, 예를 들면 소형 단일층판의 소낭, 대형 단일층판의 소낭 및 다층판의 소낭의 형태로 투여될 수 있다. 리포좀은 각종 인지질, 예를 들면 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린으로 형성될 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물은, 화합물 분자가 커플링된 개개의 담체로서 모노클로날 항체를 이용하여 투여할 수 있다. 또한, 인테그린 억제제는 표적가능한 약물 담체로서 가용성 중합체와 커플링될 수 있다. 이러한 중합체에는 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 폴리하이드록시-프로필-메타크릴아미드-페놀, 폴리하이드록시에틸-아스파르타르니드-페놀, 또는 팔미토일 잔기로 치환된 폴리에틸렌옥시드-폴리리신이 포함된다. 또한, 인테그린 억제제는, 약물의 조절 방출을 달성하는데 유용한 생물분해성 부류의 중합체, 예를 들면 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산과 폴리글리콜산과의 공중합체, 폴리엡실론 카프로락톤, 폴리하이드록시 부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리아세탈, 폴리디하이드로피란, 폴리시아노아크릴레이트, 및 하이드로겔의 가교된 또는 양쪽친매성 블록 공중합체와 커플링될 수 있다.
투여량 및 투여 방법을 조절하여 최적 효능을 달성할 수 있으나, 체중 및 진행중인 약물 치료와 같은 요인 및 의약 분야의 당업자가 인식할 수 있는 기타 요인에 따라 결정될 것이다. 매일 마다 비경구로, 예를 들면 정맥내로 투여되는 경우, 주사용 약제학적 조성물은 액체 용제 또는 현탁제, 주사전의 액체로 용액 또는 현탁액에 적합한 고체형, 또는 유제로서 종래의 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 활성 화합물의 경구 투여에 적합한 정제는 다음과 같이 제조될 수 있다:
양(mg)
활성 성분 25.0 50.0 100.0
미세결정성 셀룰로즈 37.25 100.0 200.0
개질된 식용 옥수수 전분 37.25 4.25 8.5
마그네슘 스테아레이트 0.50 0.75 1.5
활성 성분, 셀룰로즈, 및 옥수수 전분 부분을 모두 혼합하고, 10% 옥수수 전분 페이스트로 과립화시킨다. 생성된 과립를 체질하고, 건조시키고, 옥수수 전분과 마그네슘 스테아레이트의 잔류물과 혼합시킨다. 이어서, 생성된 과립을 압축하여, 정제당 활성 성분을 각각 25.0, 50.0 및 100.0mg 함유하는 정제를 수득한다.
상기 활성 화합물의 정맥내 투여형은 다음과 같이 제조될 수 있다:
활성 화합물 0.5 내지 10.0mg
나트륨 시트레이트 5 내지 50mg
시트르산 1 내지 15mg
염화나트륨 1 내지 8mg
주사용 수(USP) 1ml에 이르는 충분량
상기 양을 이용하여, 활성 화합물을, 주사용 수(USP; 참조: page 1636 of United States Pharmacopoeia/National Formulary for 1995, published by United States Pharmacopoeia Convention, Inc., Rockville, Maryland, copyright 1994]중에 미리 제조한 염화나트륨, 시트르산, 및 나트륨 시트레이트의 용액에 실온에서 용해시킨다.
다음 실시예는 비제한적으로 예시를 위해서 제공된다.
실시예 1
성분 단편의 합성
본 실시예에는, 합해져서 본 발명의 리버스-턴 유사체를 형성할 수 있는 대표적인 성분 단편의 합성법이 기재되어 있다.
A. 대표적인 제1 성분 단편
다음 화학식 1의 제1 성분 단편을 사용한다:
화학식 1
상기식에서,
R4는 위에서 정의한 바와 같고,
R은 펩티드 합성에 사용하기에 적합한 보호 그룹이다.
적합한 R 그룹은 알킬 그룹을 포함하고, 바람직한 태양에 있어서, R은 메틸 그룹이다.
일반적으로, 제1 성분 단편은 2-할로에탄알의 디알킬아세탈을 사용한 아민의 n-알킬화에 의해 제조된다. 펜에틸아민과 2-브로모에탄알의 디메틸아세탈로부터의 대표적인 제1 성분 단편의 합성은 아래에 대략적으로 도시되어있다
이 공정에서, 브로마이드 24ml(3.43ml, 20.3mmol)와 펜에틸아민 2.8ml(2.71g, 22.3mmol)를 환류 응축기가 장착된 150ml 아르곤 충전된 환저 플라스크 속의 새로이 증류된 THF 40ml에 가한다. 반응물을 24시간 동안 온화한 환류하에 가열한 후, 휘발성 성분을 감압하에 제거하고, 잔사를 디클로로메탄 200ml에 용해시킨다. 유기층을 2x100ml 포화 수성 중탄산나트륨과 포화 수성 염화나트륨으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시킨다. 휘발성 물질을 감압하에 제거하고 잔사를 고진공하에 3시간 동안 건조시켜 제1 성분 단편(1a)(m=1)을 연한 갈색 오일로서 3.5g(83%) 수득하고, 이를 추가로 정제하지 않고 사용한다.
B. 대표적인 제2 성분 단편
본 발명의 대표적인 제2 성분 단편은, 아래 화학식 2a 또는 화학식 2b로 나타낸 바와 같이, 활성화된 카복실산 그룹을 갖는 반응성 N-보호된 아미노산 또는 아미노산의 아지도 유도체이다:
화학식 2a
화학식 2b
상기식에서,
R3은 위에서 정의한 바와 같고,
P는 펩티드 합성에 사용하기에 적합한 아미노 보호 그룹이고,
X는 활성화된 카복실산 그룹의 이탈 그룹이다.
바람직한 보호 그룹은 3급-부틸 디메틸실릴(TBDMS), BOC, FMOC 및 Alloc(알릴옥시카보닐)이다. N-보호된 아미노산은 시판되고 있다. 예를 들면, FMOC 아미노산은 여러 공급원으로부터 시판되고 있다. 이들 화합물을 본 발명의 제2 성분 단편으로 전환하는 것은 N-보호된 아미노산의 카복실산 그룹의 활성화로 쉽게 달성될 수 있다. 적합한 활성화된 카복실산 그룹은, X가 클로라이드 또는 브로마이드와 같은 할라이드인 산 할라이드, X가 아세틸과 같은 아실 그룹인 산 무수물, N-하이드록시석신이미드 에스테르 및 p-니트로페닐 에스테르와 같은 반응성 에스테르, 및 디사이클로헥실카보디이미드(DCC)와 같은 카보디이미드를 사용한 커플링 반응중에 형성된 활성 중간체와 같은 기타 활성화된 중간체를 포함한다. 유사하게, 상응하는 아지도 유도체는 공지된 기술로 제조될 수 있다. 바람직한 태양에 있어서, X는 HATU (0-(7-아자벤조트리아놀-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트) 커플링시에는 하이드록실이거나, 규소-매개된 커플링시에는 불소이다.
C. 대표적인 제3 성분 단편
본 발명의 대표적인 제3 성분 단편은 아래의 화학식 3a 또는 화학식 3b의α,β-불포화 카복실산 또는 이의 유도체이다:
화학식 3a
화학식 3b
상기식에서,
R2와 R5는 위에서 정의한 바와 같고,
P는 메틸 또는 3급-부틸 그룹과 같은 카복실산 보호 그룹이다.
이러한 제3 성분 단편은 시판되고 있거나, 시판되고 있는 알데히드와 적합한 포스포루실라이드로부터 아래 반응식에 따라서 합성될 수 있다:
[참조: Wadsworth and Emmons, Org. Syn. 45:44, 1965]
D. 대표적인 제4 성분 단편
본 발명의 대표적인 제4 성분 단편은 아래 화학식 4의 1급 아민이다:
화학식 4
R1-NH2
상기식에서,
R1은 위에서 정의한 바와 같다.
적합한 제4 성분 단편은 여러 공급원으로부터 시판되고 있다. 또한, 제4 성분 단편은 1급 아민의 합성에 통상적으로 사용되는 표준 유기 합성 기술로 쉽게 제조될 수 있다.
실시예 2
합해진 제1-제2 중간체: 제1 성분 단편과 제2 성분 단편의 커플링
본 발명의 리버스-턴 유사체를 제조하기 위한 성분 단편들의 커플링은 일반적으로 아미드 결합의 형성을 포함한다. 단편들을 연결하는 아미드 결합은 표준 합성 펩티드 기술에 의해 형성될 수 있고, 액상 또는 고체 상 합성에 의해 수행될 수 있다.
제1 성분 단편과 제2 성분 단편의 커플링은 탈보호 후 아래의 화학식 1-2의 합해진 제1-제2 중간체를 제공한다:
상기식에서,
R, R3및 R4는 위에서 정의한 바와 같다(본 실시예에서, 화학식 I'에서 R"는 수소이다).
합해진 제1-제2 중간체는 제1 성분 단편(1)의 아민과 제2 성분 단편(2)의 활성화된 카복실산 그룹 간의 아미드 결합 형성 후 N-탈보호에 의해 제조된다. 대표적인 합해진 제1-제2 중간체의 합성은 아래에 개략적으로 도시되어 있다.
이 공정에서, 25ml 아르곤 충전된 환저 플라스크 속의 새로이 증류된 벤젠 10ml중 실시예 1A에서 기술된 바와 같이 제조된 제1 성분 단편(1a) 650mg(3.17mmol) 및 FMOC-글리신 클로라이드(2a) 1g(3.17mmol)에 시안화은(AgCN) 937mg(7mmol)을 가하고, 생성된 반응 혼합물을 48시간 동안 격렬하게 교반한다. 반응물을 25ml w/에틸 아세테이트로 희석시키고 셀라이트 플러그(Celite plug)을 통해 여과한다. 휘발성 물질을 감압하에 제거하고, 잔사를 섬광 등급 실리카 겔 상에서 20:80 에틸 아세테이트:헥산을 이동상으로서 사용하여 크로마토그래피하여 비결정형 고체 1.1g(71%)을 수득한다.
아세토니트릴 5ml 중의 비결정형 고체 400mg(0.82mmol)에 디에틸아민(DEA) 1ml를 적가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한다. 휘발성 물질을 감압하에 제거하고, 잔사를 섬광 등급 실리카 겔 상에서 암모니아로 포화된5% 메탄올과 95% 디클로로메탄을 이동상으로서 사용하여 크로마토그래피하여 합해진 제1-제2 중간체(1-2a) 207mg(95%)을 진한 무색 오일로서 수득한다.
실시예 3
합해진 제3-제4 중간체: 제3 성분 단편과 제4 성분 단편의 커플링
제3 성분 단편과 제4 성분 단편을 커플링시켜 합해진 제3-제4 중간체를 수득한다. 합해진 제3-제4 성분 단편은 제3 성분 단편(3)의 α,β- 불포화 카보닐 그룹에 제4 성분 단편(4)의 아민 그룹의 공액 첨가로 인해 형성된 아민 결합에 의해 생성된다.
제3 성분 단편과 제4 성분 단편의 커플링은 탈보호 후 아래의 화학식 3-4의 합해진 제3-제4 중간체를 제공한다:
상기식에서,
R1, R2및 R5는 위에서 정의한 바와 같다(본 실시예에서, 화학식 I'에서 n은 0이다).
합해진 제3-제4 중간체는, 제4 성분 단편(4)의 1차 아미노 그룹과 제3 성분 단편(3)의 α,β-불포화 카보닐 그룹 간의 아민 결합 형성 후 O-탈보호에 의해 제조된다. 대표적인 합해진 제3-제4 중간체의 합성은 아래에 개략적으로 도시되어 있다.
이 공정에서, 아르곤 충전된 250ml 환저 플라스크 속의 새로이 증류된 테트라하이드로푸란(THF) 40ml중에 현탁된 티라민 5g에 현탁액을 용해시키기에 충분한 메탄올을 가한다. 생성된 용액에 3급-부틸아크릴레이트 5.3ml(4.67g, 36.4mmol)를 5분에 걸쳐 적가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. 추가의 3급-부틸아크릴레이트 2ml를 가하여 잔여 출발 물질을 소모시키고, 반응물을 추가로 4시간 동안 교반한다. 휘발성 물질을 감압하에 제거하고, 잔사를 섬광 등급 실리카 겔 상에서 95:5 디클로로메탄:암모니아 포화된 메탄올:NH3/MeOH를 이동상으로서 사용하여 크로마토그래피하여 무색 오일로서 에스테르 6.6g(68%)을 수득하고,이는 밤새 냉동시키는 경우 고화된다. 20ml 디클로로메탄 중의 에스테르 1g(3.77mmol) 용액에 0℃에서 차가운 트리플루오로아세트산(TFA) 80ml를 가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온으로 가온하면서 24시간 동안 교반한다. 휘발성 물질을 감압하에 제거하여 투명한 오일 950mg을 수득한다. 최종 생성물을 95:5 디클로로메탄:메탄올에 용해시키고, 중성 알루미나 패드를 통해서 서서히 여과한다. 휘발성 물질을 여액으로부터 제거하여 비결정형 고체로서 화학식 3-4a의 중간체 750mg을 수득한다.
실시예 4
합해진 제1-제2-제3-제4 중간체: 합해진 제1-제2 중간체와 제3-제4 중간체의 커플링
합해진 제1-제2 중간체와 합해진 제3-제4 중간체를 커플링시켜 합해진 제1-제2-제3-제4 중간체를 수득한다. 합해진 제1-제2-제3-제4 중간체는 합해진 제1-제2 중간체(1-2)의 아민 그룹과 합해진 제3-제4 중간체(3-4)의 카복실산 그룹과의 커플링에 의해 형성된 아미드 결합에 의해 생성된다. 합해진 제1-제2-제3-제4 중간체는 화학식 1-2-3-4의 구조를 갖는다:
상기식에서,
R, R1, R2, R3, R4및 R5는 위에서 정의한 바와 같다.
대표적인 합해진 제1-제2-제3-제4 중간체의 합성은 아래에 개략적으로 도시되어 있다.
이 공정에서, 화학식 3-4a의 화합물 212mg(1.0mmol), 화학식 1-2a의 화합물 270mg(1.01mmol) 및 1-하이드록시벤조트리아졸 수화물(HOBT) 136mg(1.01mmol)을 디메틸포름아미드(DMF) 10ml중에 용해시키고 0℃로 냉각시킨다. 이 용액에 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드(EDC) 290mg(1.52mmol, 1.5eq)을 가하고, 생성된 반응 혼합물을 24시간에 걸쳐 교반하고 실온으로 가온한다. DMF를 감압하에 제거하고, 잔사를 에틸 아세테이트 200ml에 재용해시킨다. 에틸 아세테이트 층을포화 수성 중탄산나트륨과 물로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시킨다. 휘발성 물질을 감압하에 제거하고, 잔사를 섬광 등급 실리카 겔 상에서 95:5 디클로로메탄:암모니아 포화된 메탄올을 용출제로서 사용하여 크로마토그래피하여 진한 무색 오일로서 중간체(1-2-3-4a) 310mg(0.68mmol, 67%)을 수득한다.
실시예 5
대표적인 리버스-턴 유사체의 합성: 합해진 제1-제2-제3-제4 중간체의 폐환
합해진 제1-제2-제3-제4 중간체를 폐환시켜 본 발명의 리버스-턴 유사체를 수득한다. 합해진 제1-제2-제3-제4 중간체(1-2-3-4)를, 캄포르설폰산(CSA) 또는, 바람직한 태양에 있어서, TMSOTF(0℃)로 처리하여 폐환시켜 화학식 Ia의 리버스-턴 유사체를 수득한다:
화학식 Ia
상기식에서,
R1, R2, R3, R4및 R5는 위에서 정의한 바와 같다.
대표적인 본 발명의 리버스-턴 유사체의 합성은 아래에 개략적으로 도시되어 있다.
이 공정에서, 환류 응축기가 장착된 100ml 환저 플라스크 속에서, 캄포르설폰산(CSA) 0.5g(2.4mmol)을 새로이 증류된 톨루엔 3 내지 15ml와 공비시키고 3시간 동안 40℃에서 진공하에 건조시킨다. 이어서, 새로이 증류된 톨루엔 20ml를 가하고 CSA 용액을 가열하여 격렬히 환류시킨다. 이러한 환류하의 CSA 용액에 새로이 증류된 톨루엔 20ml 중의 중간체(1-2-3-4a) 50mg(0.11mmol) 용액을 시린지 펌프를 사용하여 1시간에 걸쳐 가한다. 생성된 반응 혼합물을 12시간 동안 환류시키고, 실온으로 냉각시킨 후, 에틸 아세테이트 200ml로 희석시킨다. 유기 층을 포화 수성 중탄산나트륨 2 내지 75ml와 포화 수성 염화나트륨 75ml로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시킨다. 휘발성 물질을 감압하에 제거하여 글라신(glassine) 고체로서 화합물(Ia) 22mg을 수득한다. 조 생성물을 50/50 디이소프로필 에테르:헥산으로 연마하여 비극성 불순물을 제거한다. 이어서, 고체를 디클로로메탄중에 용해시키고, 여과하여 극성 불순물을 제거한다. 증발시 잔사를 진공하에 24시간 동안 건조시킨다.
실시예 6
대표적인 리버스-턴 유사체 염의 합성
본 발명의 리버스-턴 유사체는 질소 염기이고, 따라서, 각종 산으로 처리함으로써 상응하는 염으로 전환될 수 있다. 본 실시예에서는, 대표적인 리버스-턴 유사체의 염의 제조방법을 기재한다.
실시예 5에 기술된 바와 같이 제조한 리버스-턴 유사체(Ia)의 2,4-디니트로벤조산 염은 리버스-턴 유사체를 수성 메탄올 중의 산으로 처리함으로써 수득된다. 이 공정에서, 화합물(Ia) 5mg(12.7μmol)을 80/20 메탄올:물 3㎖에 용해시키고, 0℃로 냉각시킨다. 이 용액에 2,4-디니트로벤조산 2.70mg(12.7μmol, 1.0eq)을 가하고, 생성된 용액을 균질해질 때까지 교반한다. 휘발성 물질을 감압하에 제거하고, 잔사를 진공하에 24시간 동안 건조시킨다. 잔사를 온수에 용해시키고, 여과하여 불용성 불순물을 제거한다. 이어서, 당해 용액을 동결건조하여 염(5)을 수득한다.
실시예 7
대표적인 리버스-턴 유사체의 합성
본 실시예는 본 발명의 또 다른 대표적인 리버스-턴 유사체의 합성을 예시한다.
화학식 6의 화합물의 합성
실온에서, THF(50ml) 중의 N-벤질글리신 에틸 에스테르(1.93g, 10mmol)의 교반된 용액에 Boc-Ala-OH(1.9g, 10mmol)을 가한 후, HOBt(1.62g, 12mmol)와 EDCI(2.3g, 12mmol)를 가한다. 생성된 용액을 실온에서 5시간 동안 교반한다. EtOAc(100ml)로 희석시킨 후, 용액을 1N HCl(50ml), 포화 NaHCO3(50ml) 및 염수(50ml)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), SiO2의 짧은 패드를 통과시킨 후, 농축시켜 정량적인 수율의 오일을 수득한다. TLC는 생성물의 순도가 다음 반응에 추가의 정제없이 사용되기에 충분함을 보여준다. TLC Rf0.6(헥산:EtOAc = 5:5);1H NMR(CDCl3){스펙트럼은 로테이머들의 2:1 혼합물로서 주어진다} δ 1.24(two t, 3H, J=6.5Hz), 1.35 및 1.36(two d, 3H, J=6.5Hz), 1.42 및 1.43(two s, 9H), 3.80(dd,1H, J=18Hz), 4.15(q, 2H, J=6.5Hz), 4.40(dd, 1H), 4.65(ABq, 2H, J=16.5Hz), 4.80(m, 1H), 5.40(two d, 1H, J=8Hz, NH), 7.1-7.3(m, 5H, 페닐); MS ES+ 365.1(M+H+).
화학식 7의 화합물의 합성
THF/H2O(50/50ml) 중의 조 에틸 에스테르(6) 3.8g의 교반된 용액에 LiOH·H2O(1g)를 실온에서 가한다. 실온에서 30분 동안 교반한 후, 용액을 Et2O(50ml)로 세척하고, 수성 상을 6N HCl(pH 2)로 산성화하고, EtOAc(3x100ml)로 추출한다. 합한 유기 추출물을 건조시키고(MgSO4), SiO2의 짧은 패드를 통과시키고, 농축시켜 정량적인 수율의 발포체를 수득한다. 생성물을 추가의 정제없이 다음 반응에 사용한다.1H NMR(CDCl3){로테이머들의 혼합물} δ 1.33(two d, 3H, J=7Hz), 1.41(two s, 9H), 3.8-4.8(set of m, 5H), 5.70(two d, 1H, J=8Hz, NH), 7.2-7.6(m, 5H, 페닐).
화학식 8의 화합물의 합성
디클로로메탄(100ml) 중의 산(7) 3.4g과 시아노메틸렌 트리페닐포스포란(4.1g, 12mmol)의 교반된 용액에 DIEA(5ml, 30mmol), DMAP(250mg, 2mmol) 및 EDCI(2.9g, 15mmol)를 실온에서 순차적으로 가한다. 12시간 동안 교반한 후, 용액을 농축시키고 생성된 잔사를 1N HCl(100ml)에 용해시켜 EtOAc(3x100ml)로 추출한다. 합해진 추출물을 포화 NaHCO3(100ml)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), SiO2의 짧은 패드를 통과시켜 농축시킨다. 조 생성물을 섬광 크로마토그래피(헥산:EtOAc=50:50 내지 30:70 내지 20:80)로 정제하여 발포성 고체(4.40g, 71%)를 수득한다. TLC Rf0.5(EtOAc);1H NMR(CDCl3){로테이머들의 혼합물} δ 1.28(two d, 3H, J=6.5Hz), 1.44(two s, 9H), 4.2-4.7(set of m, 5H), 5.5(two d, 1H, J=8Hz, NH), 7.2(m, 5H), 7.5-7.8(m, 15H); MS ES+ m/z 520.3, 620.3(M+H+).
화학식 9의 화합물의 합성
디클로로메탄(5ml) 중의 포스포란(9)(310mg, 0.5mmol)의 교반된 용액에 -78℃에서 15분 동안 용액이 청록색이 될 때까지 O3를 발포시킨다; TLC는 출발 물질이 완전히 소모되었음을 보여준다. Ar를 발포시켜 과량의 오존을 당해 용액으로부터 제거하고, N-벤질글리신 에틸 에스테르(100ml)를 가하고, 용액을 -78℃에서 30분 동안 교반한다. 농축시킨 후, 잔사를 EtOAc(50ml)에 용해시키고, 1N HCl(20ml), 포화 NaHCO3(20ml) 및 염수(20ml)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 재농축시킨다. 조 생성물을 섬광 크로마토그래피(헥산:EtOAc = 90:10 내지 80:20 내지 70:30 내지 60:40)로 정제하여 오일(105mg, 39%)을 수득한다. TLC Rf0.42(헥산:EtOAc = 60:40);1H NMR(CDCl3){스펙트럼은 로테이머들의 1:1 혼합물로서 주어진다} δ 1.25(two t, 3H, J=7Hz), 1.31 및 1.38(two d, 3H, J=7Hz), 1.41 및 1.43(two s, 9H), 3.8-4.8(set of m, 11H), 5.5(two d, 1H, NH), 7.2-7.4(m, 5H). MS ES+ m/z 440.3, 540.3(M+H+).
화학식 10의 화합물의 합성:
디클로로메탄 0.5ml 중의 케토아미드(9)(0.18mmol) 100mg 용액을 TFA 0.5ml로 실온에서 30분 동안 처리한다. 농축시킨 후, 잔사를 MeOH(2ml)에 용해시키고, ZnCl2(6mg)와 NaBH3CN(15mg)으로 실온에서 밤새(13시간) 처리한다. 농축시킨 후, 잔사를 포화 NaHCO3(20ml)에 용해시키고, EtOAc(2x20ml)로 추출한다. 합한 유기 추출물을 건조시키고(MgSO4), 오일로 농축시키고, 예비 TLC(헥산:EtOAc = 60:40)로 정제하여 유리질 고체(52mg, 77%)를 수득한다. (엔아민은 본 발명의 방법에 의해 환원되지 않음을 입증한다.) TLC Rf0.58(EtOAc);1H NMR(CDCl3) δ 1.41(d, 3H, J=6.5Hz, CHCH3), 3.93(ABq, 2H, J=18Hz, Gly 중의 CH2), 4.46 및 4.75(ABq, 1H 각각, J=14.5Hz, CH2Ph), 4.76(ABq, 2H, J=14Hz, CH2Ph), 5.22(q, 1H, J=7Hz, CHCH3), 6.83(s, 1H, =CH), 7.33(m, 10H, 페닐);13C NMR (CDCl3) δ 16.63, 49.59, 49.66, 49.84, 50.98, 111.92, 119.16, 128.07, 128.22, 128.29, 128.52, 128.94, 128.97, 134.78, 134.43, 157.96, 160.67, 165.33. MS ES+ m/z 376.3 (M+H+).
화학식 11의 화합물의 합성:
MeOH(2ml) 중의 화학식 10의 화합물 25mg(0.066mmol)과 PtO2(5mg) 용액을 H2대기(20atm)하에 10일 동안 교반한다. 농축시킨 후, 잔사를 예비 TLC(헥산:EtOAc=60:40 내지 50:50)로 정제하여 출발 물질(10mg)과 함께 담황색 오일(14mg, 56%)을 수득한다. TLC Rf0.49(EtOAc);1H NMR(CDCl3) δ 1.14(d, 1.5H, J=7Hz, CHCH3), 1.52(d, 1.5H, J=7Hz, CHCH3), 3.2-4.8(set of m, 10H), 7.33(m, 10H, 페닐); MS ES+ m/z 378(M+H+). RP-HPLC 분석 : C-18; A: 0.1% TFA(aq); B 0.1% TFA(CH3CN); 구배: 0-90%/40'; 254nm tR 24.1' 및 24.7'은 2:1 비를 나타낸다.
실시예 8
대표적인 리버스-턴 유사체의 합성
본 실시예는 본 발명의 리버스-턴 유사체의 합성 방법을 추가로 예시한다. 구체적으로, [4.4.0] 바이사이클릭 리버스-턴 유사체의 제조는 용액상(방법 A) 및 고체상(방법 B 및 C)에서 수행한다. 대표적인 유사체의 구조는 표 2에 제시되어 있다. 이들 리버스-턴 유사체의 고체상 합성은 이러한 구성원들을 함유하는 라이브러리들이 용이하게 제조될 수 있음을 입증한다.
방법 A 용액상 합성은 방법 B의 고체상 합성과 유사하고 도 2에 도시된 바와 거의 동일하게 수행한다. 당해 화합물은 후술되는 방법 C에서와 같이 정제한다.
방법 B의 고체상 합성법은 도 8에 도시되어 있다. 도면을 참고하여, 시판되는 아미노메틸 수지를 DMF 중의 과량의 4-브로모-2-부텐산과 DIC(디이소프로필카브디이미드)와 반응시켜 4-브로모-2-부텐아미드 수지를 수득한다. 브로모 그룹을 DMSO중의 1차 아민으로 치환시켜, 상응하는 4-알킬아미노-2-부텐아미드 수지를 수득한다. 표준 펩티드 커플링 공정을 고체 상에서 수행하여 N-알킬옥시카보닐-α-알킬-β-알라닐-α-알킬글리실-N'-알킬아미노-2-부텐아미드 수지를 수득한다. 수지의 오스뮴 테트라옥사이드 촉매된 퍼요오데이트 산화 후, 생성된 모노사이클릭 생성물을 디클로로메탄 중에서 촉매량의 TFA로 처리하여 리버스-턴 유사체를 수득한다. 조 생성물은 역상 HPLC 분석에서 하나의 주요 피크를 나타낸다.
방법 C의 고체상 합성법은 방법 B와 유사하고, 실시예 11에 기술되어 있으며 도 9에 도시되어 있다. 선택된 화합물을, EtOAc와 MeOH의 적절한 배합물을 사용하여 실리카 겔상에서 섬광 크로마토그래피 또는 예비 TLC로 정제한다.
당해 유사체는 다음과 같은 특징을 갖는다: 분석용 C18역상 HPLC는 표준 기술(이동상 : 물과 아세토니트릴중의 0.1% 구배)를 사용하여 수행한다. 이들 방법에 의해, 고체상에서 합성된 조 생성물은 80% 초과의 순도를 나타내고, 모든 정제된 화합물은 95% 초과의 순도를 나타낸다. 전기분무 질량 분광측정을 표준 기술을사용하여 수행한다. (M+H+) 이온의 관찰치는 표 2의 각 화합물에 대해 주어진다.1H NMR은 정제된 유사체에 대해 수행되고 스펙트럼은 COSY와 ROESY 실험을 조합하여 수득한다. 모든 스펙트럼은 아래에 제시되는 구조와 일치하며, 제I형 또는 제II형의 β턴 구조와 유사한 입체형태를 나타낸다.
* -SO2-는 상기 화합물의 R1측쇄중의 -OC(O)-을 대체한다.
실시예 9
대표적인 리버스-턴 유사체의 아편계물질 수용체 결합에 있어서의 활성
본 실시예에서는, 대표적인 리버스-턴 유사체의 델타(δ) 및 뮤(μ) 아편계물질 수용체에 대한 결합 활성, 및 비-선택적 아편계물질 수용체의 제법을 기술한다. 화합물 5, 화학식 Ia의 리버스-턴 유사체의 2,4-디니트로벤조산 염(실시예 6에 기술된 바와 같이 제조됨), 및 실시예 8에서 기술된 바와 같이 제조된 각종 리버스-턴 유사체의 결합 친화성을 이들 경쟁적 방사선리간드 결합 분석으로 평가한다.
A. 아편제 (δ) 결합 활성
본 방법에서, 수컷 기니아 피그의 전뇌로부터 막을 준비하고 2nM [3H]DPDPE(D-pen3, D-pen5) 엔케팔린으로 1시간 동안 4℃에서 평형시킨 후, 시험 물질을 가하고 4시간 동안 25℃에서 항온처리한다. 0.3μM 날트린돌의 존재하에 비 특이적 결합을 측정한다. 결합된3[H]DPDPE를 유리 섬유 필터매트(filtermat)를 통한 신속한 여과로 유리 방사선리간드로부터 분리시킨 후, 3회 세척한다. 이어서, 필터매트를 LKB 베타플레이트에서 계수하여 특이적으로 결합된 [3H]DPDPE를 측정한다[참조: Mosberg et al., "Structural Requirements for δ Opiate Receptor Binding," Molec. Pharmacol. 31:599-602, 1987].
참조 화합물이 결합된 [3H]DPDPE(2nM)에 미치는 효과
화합물 IC50(nM) Ki(nM) 힐 계수
DAMGO 4,800 1,200 1.08
DPDPE 5.5 1.3 0.86
날트린돌 0.63 0.20 0.53
U-50488 53,000 16,000 0.73
당해 분석에서, 방사선리간드 [3H]DPDPE는 Kd가 0.65nM이고, Bmax가 12.6fmol/mg(단백질)이고 60%의 특이성 결합을 갖는 것으로 측정된다. 10μM 농도에서, 화합물(5)는 방사선리간드 결합을 60% 수준으로 억제하는 것으로 밝혀졌고 Ki는 1.7±0.3μM이고 IC50은 6.9±1.2μM이다. 이러한 결과는 방사선리간드 결합의 억제율(%)을 리버스-턴 유사체(5) 농도의 함수로 나타낸 도 1(○)에 제시되어 있다. 또한, 10μM 농도에서, 리버스-턴 유사체(16)은 방사선리간드 결합을 92% 수준으로 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과로 부터, 리버스-턴 유사체들 (5) 및 (16), 특히 본 발명의 리버스-턴 유사체가 일반적으로 δ 아편 수용체에 대한 결합을 효과적으로 억제하고, 진통 활성을 보유한다는 것이 입증된다.
B. 아편제 (μ) 결합 활성
본 방법에서는, 수컷 기니아 피그의 전뇌로부터 막을 준비하고 2nM [3H]DAMGO(D-Ala2, N-메틸-phe4, gly-ol5)-엔케팔린과 함께 2시간 동안 25℃에서 항온처리한다. 0.5μM DAMGO의 존재하에 비-특이적 결합을 측정한다. 결합된 [3H]DAMGO를 유리 섬유 필터매트를 통한 신속한 여과로 유리 방사선리간드로부터 분리한 후, 3회 세척한다. 이어서, 필터매트를 LKB 베타플레이트에서 계수하여 특이적으로 결합된 [3H]DAMGO를 측정한다[참조: Patricia et al., "Pharmacological profiles of fentanyl analogs at μ, δ and κ opiate receptors," Eur. J. Pharmacol. 213:219-225, 1992].
참조 화합물이 결합된 [3H]DAMGO(2nM)에 미치는 효과
화합물 IC50(nM) Ki(nM) 힐(Hill) 계수
DAMGO 6.5 0.59 0.92
DPDPE 4.0 0.37 1.32
펜타닐 14 1.2 0.99
날록손 9.3 0.76 1.09
날트린돌 27 2.5 0.98
노르비날토르피민 280 26 1.13
U-50488 6.1 0.59 0.70
당해 분석에서, 방사선리간드 [3H]DAMGO는 Kd가 0.27nM이고, Bmax가 8.7pmol/mg(단백질)이고, 70%의 특이적 결합을 갖는 것으로 측정된다. 10μM 농도에서, 화합물(5)은 방사선리간드 결합을 64% 수준으로 억제하는 것으로 밝혀졌고,Ki= 0.64±0.08μM이고 IC50= 5.4±0.7μM을 나타낸다. 이러한 결과는 방사선리간드 결합 억제율(%)을 리버스-턴 유사체(5) 농도의 함수로 나타낸 도 1(●)에 도시되어 있다. 또한, 10μM 농도에서, 리버스-턴 유사체(16)는 방사선리간드 결합을 98% 수준으로 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과로 부터, 리버스-턴 유사체들 (5) 및 (16), 특히 본 발명의 리버스-턴 유사체가 일반적으로 μ 아편 수용체에 대한 결합을 효과적으로 억제하고 진통 활성을 보유한다는 것이 입증되었다.
C. 아편(비-선택적) 결합 활성
본 방법[참조: Childers et al.Eur. J. Pharmacol. 55: 11, 1979]에서, 래트의 뇌 피질로 부터 막을 준비하고, [3H]날록손(1 nM) 및 β-턴 유사체(30μM 내지 0.3nM)과 함께 40분간 22℃에서 항온처리한다. 항온처리 후, 막을 유리 섬유 필터(Filtermat A,. Wallac)를 통해 진공하에 신속히 여과한다. 이어서, 필터를 세포 수거기(Tomtec)를 사용하여 빙냉 완충제로 수 차례 세척한다. 결합된 방사능을 고체 섬광체(MultiLex B/HS, Wallac)를 사용하여 신틸레이션 계수기(Betaplate, Wallac)로 측정한다. 동일한 실험에서, 당해 실험을 유효하게 하기 위하여, 참조 화합물(날록손)을 8개 농축물(x2)에서 시험하여 경쟁 곡선을 수득한다.
수용체에 대한 특이적 방사선리간드 결합은 전체 결합과 과량의 비표지된 리간드의 존재하에 측정된 비특이적 결합간의 차이로서 정의된다. 결과는 β-턴 유사체의 존재하에 수득된 대조용 특이적 결합율(%)로서 표현된다. IC50값 및 힐 계수(nH)를 경쟁 곡선의 비-선형 회귀 분석으로 측정한다. 이들 파라미터는 힐 평형 곡선 맞추기를 통해 수득된다. 억제 상수(Ki)는 Chen Prusoff 등식 [Ki = IC50/(1+L/Kd), 여기서, L은 당해 분석중의 방사선리간드의 농도이고, Kd는 수용체에 대한 방사선리간드의 친화성이다]으로 부터 계산한다.
이러한 분석에서, 방사선리간드, [3H]날록손은 IC50값이 2.5nM인 것으로 측정되었다. 실시예 8에 기술된 바와 같이 제조되고 정제된 리버스-턴 유사체는 1μM 농도에서 99% 이하의 특이적 결합을 나타낸다. 화합물 (29) 및 (30)은 각각 IC50값이 80 및 27nM인 것으로 측정되었다. 이들 결과로 부터, 유사체 (29) 및 (30), 특히 본 발명의 리버스-턴 유사체가 일반적으로 아편계물질 수용체(비-선택적)에 대한 결합을 효과적으로 억제하고 진통 활성을 보유한다는 것이 입증되었다.
실시예 10
대표적인 리버스-턴 유사체의 진통 활성에 대한 생체내 활성
당해 실시예에서는, 대표적인 리버스-턴 유사체의 진통제로서의 생체내 활성을 보여준다. 실시예 6에서 기술된 바와 같이 제조된 화합물 (5) (이후 "시험 화합물"이라 칭한다)을 마우스 꼬리 플릭(flick) 분석[참조: PanLabs, Pharmascreen Test No. 10402A]에 사용한다. 당해 분석에서, 마우스 그룹에서 방사열 통증 자극에 대한 꼬리 플릭 반응을 유도하는 데 걸리는 시간을 통증 한계 반응으로서 측정한다.
각각 체중이 22(±2)g인 수컷 ICR 마우스의 5개 그룹(3개의 시험 그룹 + 1개의 염수 대조 그룹 + 1개의 모르핀 양성 대조 그룹)을 사용한다. 이들 동물들을 각각 미리 선택하고, 방사열의 집속 빔을 동물 꼬리의 중간 배면에 집중시킨 후 6 내지 7.5초 이내에 꼬리 플릭 반응을 유도한다. 특정량의 시험 화합물(즉, 10, 30 및 100μg)을 6% DMSA를 함유하는 염수 5μl에 용해시키고 각각의 동물에게 대뇌내(ICV) 투여한다. 염수만으로 이루어진 용액을 음성 대조군으로서 사용하고 모르핀을 동물당 10μg/5μl의 양으로 ICV 주사하는 것은 양성 대조군으로 사용한다.
ICV 주사한 지 1분 후, 마우스 그룹들을 꼬리 플릭 반응에 대해 측정하는데, 이때 최대 컷-오프 시간은 15초이다. 각각의 처리 그룹에 대한 평균 반응 시간을 전처리("0시간") 및 1분 후처리("1분")를 비교하기 위해 계산한다. 50%를 초과하는 연장 1분 후처리("연장율(%)")는 상당히 활성인 것으로 생각된다. 이 실험의 결과는 표 5에 제시되어 있으며, 이는 시험 화합물이 상당한 진통 활성(즉, 모르핀 효능의 대략 10% 내지 15%)을 가짐을 입증한다.
생체내 꼬리 플릭 분석
화합물 투여량/5㎕ 0 1분 연장율(%)
염수 0 6.9 6.7 --
6.9 7.5 --
6.1 6.2 --
6.5 6.3 --
평균 = 6.6 평균 = 6.7 2%
모르핀 10㎍ 7.5 >15 --
6.3 >15 --
7.2 >15 --
6.8 >15 --
평균 = 7.0 평균 >15 100%
시험 화합물 100㎍ 6.5 >15 --
6.3 >15 --
6.5 >15 --
6.8 >15 --
평균 = 6.5 평균 >15 100%
30㎍ 6.5 >15 --
6.7 7.2 --
7.2 6.3 --
6.3 >15 --
평균 = 6.7 평균 >15 63%
10㎍ 6.5 7.5 --
7.2 7.5 --
6.9 6.7 --
6.2 6.8 --
평균 = 6.7 평균 7.1 6%
실시예 11
대표적 리버스-턴 유사체의 합성
당해 실시예는 본 발명의 리버스-턴 유사체의 합성법을 추가로 예시한다. 구체적으로, [4.4.0] 바이사이클릭 리버스-턴 유사체의 제조는 실시예 8의 방법 B에 대한 대안적인 방법으로 고체상에서 수행한다. 당해 방법은 도 9에 도시되어 있다.
2-브로모-1-에톡시-에틸-1-옥시-연결된 수지 (27)의 합성
일반적으로, 수지(ArgogelOH 또는 하이드록시메틸 폴리스티렌)의 배치를, 8당량의 브로모알킬알데히드 및 2당량의 피리디늄 p-톨루엔설포네이트(PPTS)의 존재하에서 4시간 동안 1,2-디클로로에탄(DEC)중에 환류시킨다. 일례로서, 하이드록시메틸 폴리스티렌(10.0g, 0.7mmol OH/g, 7mmol) 및 PPTS 3.5g(14mmol)을 DCE 200ml중에 현탁시킨다. 이어서, DCE(100ml)중의 2-브로모디에톡시에탄 8.5ml(약 56mmol) 용액을 교반하에 가하고, 반응 혼합물을 환류하에 가열한다(약 80℃). 4시간 후, 수지를 여과하고, 디메틸포름아미드(DMF) 100ml, 디메틸설폭시드(DMSO) 50ml, DMF 100ml, 디클로로메탄(DCM) 200ml, 1,4-디옥산 50ml, 및 최종적으로 메탄올 100ml로 세척한다. 건조 후, 수지(27) 11.73g을 수득한다. 브롬 분석은 정량적 하중을 나타낸다.
화학식 Ia'의 대표적 화합물의 합성
수지를 보유하기 위한 폴리프로필렌 프릿이 각각 구비된 적당한 크기의 플라스틱 1회용 주사기 속에서 반응을 수행한다. 각 단계 후, 수지 배치를 DMF(3x) 및 DCM(3x)으로 세척한다. 전형적으로, DMF중에 예비-팽윤된 수지(27)의 샘플 0.03mmol(예: 0.6mmol Br/g가 가해진 폴리스티렌 수지 50mg)을 DMSO중의 아민 R4-NH2의 2.0M 용액(2mmol) 1ml로 60℃에서 16 내지 24시간 동안 처리한다.
다음, 당해 수지를, 클로르아닐 시험이 음성이 될 때까지(전형적으로 1 내지 2시간), DMF(1ml)중의 HATU(34mg, 0.09mmol) 및 DIEA(0.032ml, 0.18mmol)의 존재하에서 0.09mmol의 Fmoc 아미노산(FmocNH-CHR3-COOH)과 반응시킨다. 이어서, Fmoc 보호를 25%(v/v) 피페리딘/DMF 용액(2ml)으로 20분에 걸쳐 처리하여 제거한다.
당해 수지를, 카이저(Kaiser) 시험이 음성이 될 때까지(전형적으로 1 시간), DMF(1ml)중의 DIC(0.014ml, 0.09mmol), HoBt(14mg, 0.09mmol) 및 DMF(1ml)의 존재하에서 0.09mmol의 Fmoc 베타-아미노산(FmocNH-CHR5-CHR2-COOH)과 반응시킨다. 이어서, 당해 수지를 25%(v/v) 피페리딘/DMF 용액(2ml)으로 20분에 걸쳐 다시 처리한다.
최종적으로, 수지-결합된 서열을 1시간 동안(카이저 시험 음성) DCM(1ml)중의 DIEA(0.106ml, 0.6mmol)의 존재하에 설포닐 클로라이드(R1SO2Cl, 0.3mmol)와 반응시켜 종결시킨다. 달리, 클로로포르메이트 R1OCOCl 또는 이소시아네이트 R1NCO(후자는 DIEA의 존재를 요구하지 않는다)를 설포닐 클로라이드 대신 사용하여 R1잔기를 도입한다.
세척된 건조된 수지를 DCM중에 팽윤시키고, 배수시키고, 포름산(96%) 1ml로 밤새 실온에서 처리한다. 다수의 경우에, 폐환을 완성하기 위하여는 최대 60℃까지 승온시키거나 반응 시간을 연장시킬 필요가 있다(조건에 대하여는 아래의 표 2참조). 상청액을 수집하고, 세척액(포름산 2x0.5ml)과 합한다. 포름산의 증발 후 수득된 잔사를 아세토니트릴/물 50:50 혼합물중에 재용해시키고, 냉동시키고, 동결건조시킨다.
표 6은 상기 방법에 의해 합성된 본 발명의 대표적 화합물을 나타낸다.
실시예 12
세포 유착 분석에서 대표적 리버스-턴 유사체의 활성
α4β1인테그린에 대한 CS1 펩티드의 결합을 길항시키는 실시예 1의 화합물의 능력를 측정하는 분석을 수행한다. 본원에 참조로 인용된 문헌[Vanderslice, P. et al., J. Immunol., 1997, 1710-1718]에 기재된 방법의 변형을 이용한다.
요약하면, 비오티닐화 CS1 펩티드의 용액(포스페이트 완충 염수(PBS)1mg/100ml) 100μL/웰을 NeutrAvidin 플레이트(Pierce)에서 1시간 동안 실온에서 항온처리한다. 이어서, 당해 플레이트를 증류수로 3회 세척하고, 차단 완충제(PBS중의 3% BSA) 200μL으로 4시간 이상 동안 처리한다. 차단된 플레이트를 상기와 같이 세척한다. 수거된 라모스 세포(107/ml)를 10μL의 칼세인 AM/ml을 함유하는 PBS중에 재현탁시키고, 암실에서 30분간 항온처리한다. 이러한 현탁액을 45ml PBS로 희석시키고, 세포를 원심분리 및 흡기로 수거한다. 세포를 결합 완충제(~ 5x105/ml)중에 재현탁시킨다. 세포 용해를 모니터링하는 경우, 에티듐 동종이량체를 당해 완충제에 가하여 5μM의 최종 농도를 수득한다. 시험될 화합물 또는 대조 펩티드 용액(10μL)을 적당한 웰에 가한 후, 세포 현탁액 90μL을 가한다. 당해 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 항온처리한다. 에티듐 동종이량체를 가한 경우, 535/617에서의 형광성을 수세전에 측정한다. 달리, 당해 플레이트를 3회 세척하고, 용해 완충제 50μL를 각 웰에 가하고, 당해 플레이트를 암실에서 10분간 흔들고, 형광성을 485nm 여기 및 535nm 방출에서 모니터링한다.
실시예 11에서 제조된 화합물은 이러한 분석에서 활성을 나타낸다. 이러한 경우, 본 발명의 화합물은 세포 유착을 효과적으로 억제하고 소염제로서의 활성을 보유한다.
비록 본 발명의 구체적 태양이 예시를 목적으로 본원에 기술되었지만, 본 발명의 취지 및 범위를 벗어남이 없이 다양하게 변화될 수 있음은 명백하다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구의 범위를 제외하고는 제한되지 않는다.

Claims (23)

  1. 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물을 포함하는 조성물을 세포유착 매개된 질환 치료를 필요로 하는 온혈동물에게 투여함을 특징으로 하여, 세포 유착-매개된 질환을 치료하는 방법.
    화학식 I
    상기식에서,
    Y는 -CH(R5)-A-N(R1)-, -A-N(R1)-CH(R')-, -A-N(R1)-C(=O)-, -A-C(=O)-N(R1)-, -A-CH(R1)-O- 및 -A-CH(R1)-N-(R')-이고,
    A는 -(CHR')n-(여기서, n은 0, 1 또는 2이다)이고,
    B는 -(CHR")m-(여기서, m은 1, 2 또는 3이다)이고,
    R', R", R2, R3및 R5는 동일하거나 상이하고 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기 또는 이의 유도체, 링커 및 고형 지지체로부터 선택되고,
    R1및 R4는 화합물의 잔여부분을 나타내며,
    바이사이클릭 융합 환 위의 2개의 인접한 CH 그룹 또는 인접한 NH와 CH 그룹은 임의로 이중 결합을 형성할 수 있다.
  2. 제1항에 있어서, 화합물이 Y가 -CH(R5)-A-N(R1)-인 화학식 I'의 구조를 갖는것을 특징으로 하는 방법.
    화학식 I'
    상기식에서,
    A, B, 및 R1내지 R5는 제1항에서 정의한 바와 같다.
  3. 제2항에 있어서, 화합물이 A가 -(CH2)n-이고, B는 -(CH2)m-인 화학식 Ia'의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
    화학식 Ia'
    상기식에서,
    R1내지 R5, 및 n 및 m은 제1항에서 정의한 바와 같다.
  4. 제3항에 있어서, 화합물이 n은 0이고, m은 1인 화학식 Ib'의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
    화학식 Ib'
    상기식에서,
    R1내지 R5는 제1항에서 정의한 바와 같다.
  5. 제1항에 있어서, 화합물이 Y가 -A-N(R1)-CH(R')-인 화학식 I''의 구조를 갖는 것을 특징으로하는 방법.
    화학식 I''
    상기식에서,
    A, B, R' 및 R1내지 R4는 제1항에서 정의한 바와 같다.
  6. 제5항에 있어서, 화합물이, 융합된 바이사이클릭 환 위의 2개의 인접한 CH 그룹들이 이중 결합을 형성하는 화학식 Ia''의 구조를 갖는 것을 특징으로하는 방법.
    화학식 Ia''
    상기식에서,
    A, B, R' 및 R1내지 R4는 제1항에서 정의한 바와 같다.
  7. 제6항에 있어서, 화합물이 A는 -(CH2)n-이고, B는 -(CH2)m-이며, R'는 수소인화학식 Ib''의 구조를 갖는 것을 특징으로하는 방법.
    화학식 Ib''
    상기식에서,
    n, m, 및 R1내지 R4는 제1항에서 정의한 바와 같다.
  8. 제1항에 있어서, 화합물이 Y가 -A-N(R1)-C(=O)-인 화학식 I'''의 구조를 갖는 것을 특징으로하는 방법.
    화학식 I'''
    상기식에서,
    A, B, 및 R1내지 R4는 제1항에서 정의한 바와 같다.
  9. 제8항에 있어서, 화합물이 A는 -(CH2)n-이고, B는 -(CH2)m-인 화학식 Ia'''의 구조를 갖는 것을 특징으로하는 방법.
    화학식 Ia'''
    상기식에서,
    n, m 및 R1내지 R4는 제1항에서 정의한 바와 같다.
  10. 제1항에 있어서, 화합물이 Y가 -A-C(=O)-N(R1)-인 화학식 I''''의 구조를 갖는 것을 특징으로하는 방법.
    화학식 I''''
    상기식에서,
    A, B, 및 R1내지 R4는 제1항에서 정의한 바와 같다.
  11. 제10항에 있어서, 화합물이 A는 -(CH2)n-이고, B는 -(CH2)m-인 화학식 Ia''''의 구조를 갖는 것을 특징으로하는 방법.
    화학식 Ia''''
    상기식에서,
    n, m, 및 R1내지 R4는 제1항에서 정의한 바와 같다.
  12. 제1항에 있어서, 화합물이 Y가 -A-CH(R1)-O-인 화학식 I'''''의 구조를 갖는 것을 특징으로하는 방법.
    화학식 I'''''
    상기식에서,
    A, B, 및 R1내지 R4는 제1항에서 정의한 바와 같다.
  13. 제12항에 있어서, 화합물이 A는 -(CH2)n-이고, B는 -(CH2)m-인 화학식 Ia'''''의 구조를 갖는 것을 특징으로하는 방법.
    화학식 Ia'''''
    상기식에서,
    n, m 및 R1내지 R4는 제1항에서 정의한 바와 같다.
  14. 제1항에 있어서, 화합물이 Y가 -A-CH(R1)-N(R')-인 화학식 I''''''의 구조를 갖는 것을 특징으로하는 방법.
    화학식 I''''''
    상기식에서,
    A, B, R' 및 R1내지 R4는 제1항에서 정의한 바와 같다.
  15. 제14항에 있어서, 화합물이, 융합된 바이사이클릭 환 위의 인접한 2개의 NH와 CH 그룹들이 이중 결합을 형성하는 화학식 Ia''''''의 구조를 갖는 것을 특징으로하는 방법.
    화학식 Ia''''''
    상기식에서,
    A, B, 및 R1내지 R4는 제1항에서 정의한 바와 같다.
  16. 제15항에 있어서, A는 -(CH2)n-이고, B는 -(CH2)m-인 화학식 Ib''''''의 구조를 갖는 것을 특징으로하는 방법.
    화학식 Ib''''''
    상기식에서,
    n, m 및 R1내지 R4는 제1항에서 정의한 바와 같다.
  17. 제1항에 있어서, 화합물이 α4β1인테그린 또는 α4β7인테그린의 억제제인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 세포 유착-매개된 질환이 류마티스 관절염, 알쯔하이머병, AIDS 치매, ARDS, 천식, 알레르기, 염증성 장 질환, CNS 염증, 아토피성 피부염, 뇌염, 다발성 경화증, 수막염, 신장염, I형 당뇨병, 아테롬성동맥경화증, 심근허혈, 재발협착증, 뇌졸중, 종양 전이, 망막염 또는 건선인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 세포 유착-매개된 질환이 아테롬성동맥경화증, 천식, 염증성 장 질환, 또는 다발성경화증인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 세포 유착-매개된 질환이 아테롬성동맥경화증인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 세포 유착-매개된 질환이 천식인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제18항에 있어서, 세포 유착-매개된 질환이 염증성 장 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제18항에 있어서, 세포 유착-매개된 질환이 다발성경화증인 것을 특징으로 하는 방법.
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