JPH07108224B2 - バチルス・ブレビスを用いる遺伝子の発現方法 - Google Patents
バチルス・ブレビスを用いる遺伝子の発現方法Info
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- JPH07108224B2 JPH07108224B2 JP61047273A JP4727386A JPH07108224B2 JP H07108224 B2 JPH07108224 B2 JP H07108224B2 JP 61047273 A JP61047273 A JP 61047273A JP 4727386 A JP4727386 A JP 4727386A JP H07108224 B2 JPH07108224 B2 JP H07108224B2
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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Description
【発明の詳細な説明】 この発明は、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）
を用いる遺伝子の発現方法に関する。
を用いる遺伝子の発現方法に関する。
原核生物を用いて組換えDNA技術により遺伝子を発現せ
しめようとする際、宿主の選択とその宿主に適したベク
ターの選択が重要であると思われる。バチルス・ブレビ
スは菌体外に多量の蛋白質を生産しまたそのプロテアー
ゼ活性も極めて低いものであるが、組換えDNA技術によ
る遺伝子を発現させるための宿主とするための試みはな
されていなかった。
しめようとする際、宿主の選択とその宿主に適したベク
ターの選択が重要であると思われる。バチルス・ブレビ
スは菌体外に多量の蛋白質を生産しまたそのプロテアー
ゼ活性も極めて低いものであるが、組換えDNA技術によ
る遺伝子を発現させるための宿主とするための試みはな
されていなかった。
本発明者らは、上記のように又他に宿主として勝れた性
質を有するバチルス・ブレビスを宿主とすることに着目
し、バチルス・ブレビスを宿主とする際に適したベクタ
ーを開発すべく研究を行った。その結果、下記の塩基配
列もしくはプロモーター活性を有するその一部からなる
塩基配列（ａ）ACATAATGGACAGGTGAATAACGAACCACGAAAAAA
ACTTTAAATTTTTTTCGAAGGCGCCGCAACTTTTGATTCGCTCAGGCGTT
TAATAGGATGTCACACGAAAAACGGGGAATTGTGTAAAAAAGATTCACGA
ATTCTAGCAGTTGTGTTACACTAGTGATTGTTGCATTTTACACAATACTG
AATATACTAGAGATTTTTAACACAAAAAGCGAGGCTTTCCTGCGAAAGGA
GGTGACACGCGCTTGCAGGATTCGGGCTTTAAAAAGAAAGATAGATTAAC
AACAAATATTCCCCAAGAACAATTTGTTTATACTAGAGGAGGAGAACACA
AGGTTATGAAAAAGGTCGTTAACAGTGTATTGGCTAGTGCACTCGCACTT
ACTGTTGCTCCAATGGCTTTCGCAGCAGAAGAAGCAGCAACTACTACA
G、塩基配列（ａ）の下流にバチルス・ブレビスの細胞
内でリボソーム結合部位として機能する塩基配列
（ｂ），塩基配列（ｂ）の下流にバチルス・ブレビスの
細胞内で翻訳開始コドンとして機能する塩基配列（ｃ）
及び塩基配列（ｃ）に直接接続されている発現させるべ
き遺伝子（ｄ）を有しバチルス・ブレビスの細胞内で複
製できるプラスミドを、バチルス・ブレビスの細胞内に
導入することにより、バチルス・ブレビスを用いて、構
造遺伝子をよく発現せしめうることを知った。
質を有するバチルス・ブレビスを宿主とすることに着目
し、バチルス・ブレビスを宿主とする際に適したベクタ
ーを開発すべく研究を行った。その結果、下記の塩基配
列もしくはプロモーター活性を有するその一部からなる
塩基配列（ａ）ACATAATGGACAGGTGAATAACGAACCACGAAAAAA
ACTTTAAATTTTTTTCGAAGGCGCCGCAACTTTTGATTCGCTCAGGCGTT
TAATAGGATGTCACACGAAAAACGGGGAATTGTGTAAAAAAGATTCACGA
ATTCTAGCAGTTGTGTTACACTAGTGATTGTTGCATTTTACACAATACTG
AATATACTAGAGATTTTTAACACAAAAAGCGAGGCTTTCCTGCGAAAGGA
GGTGACACGCGCTTGCAGGATTCGGGCTTTAAAAAGAAAGATAGATTAAC
AACAAATATTCCCCAAGAACAATTTGTTTATACTAGAGGAGGAGAACACA
AGGTTATGAAAAAGGTCGTTAACAGTGTATTGGCTAGTGCACTCGCACTT
ACTGTTGCTCCAATGGCTTTCGCAGCAGAAGAAGCAGCAACTACTACA
G、塩基配列（ａ）の下流にバチルス・ブレビスの細胞
内でリボソーム結合部位として機能する塩基配列
（ｂ），塩基配列（ｂ）の下流にバチルス・ブレビスの
細胞内で翻訳開始コドンとして機能する塩基配列（ｃ）
及び塩基配列（ｃ）に直接接続されている発現させるべ
き遺伝子（ｄ）を有しバチルス・ブレビスの細胞内で複
製できるプラスミドを、バチルス・ブレビスの細胞内に
導入することにより、バチルス・ブレビスを用いて、構
造遺伝子をよく発現せしめうることを知った。
塩基配列（ａ）は転写プロモーターとしての機能を有す
る。
る。
前記塩基配列におけるプロモーター活性を有するその一
部からなる塩基配列としては、具体的には以下の例があ
る。
部からなる塩基配列としては、具体的には以下の例があ
る。
（１）GCAACT及びその17塩基下流にTTTAATを有する塩基
配列、（２）TTCACG及びその17塩基下流にTACACTを有す
る塩基配列及び（３）TATACT及びその17塩基下流にAAAG
CGを有する塩基配列から選ばれる少なくとも一種を含む
塩基配列 このようなプロモーターの支配下にこのプロモーターに
とって異種の構造遺伝子を発現させるには、プロモータ
ー配列と構造遺伝子との間にリボソーム結合部位（塩基
配列（ｂ））と翻訳開始コドン（塩基配列（ｃ））が配
置されるように接続する。リボソーム結合部位と翻訳開
始コドンがプロモーター配列と構造遺伝子（ｄ）との間
に配置するには、リボソーム結合部位及び翻訳開始コド
ンがもともと配置されているようなベクターを用いて、
これに構造遺伝子を挿入する。この際、リボソーム結合
部位と翻訳開始コドンを有する構造遺伝子をベクターに
挿入してもよい。ベクターがリボソーム結合部位と翻訳
開始コドンのいずれをも又はいずれかを有しない場合に
は、リボソーム結合部位又は翻訳開始コドンを有する構
造遺伝子をベクターに挿入するかリボソーム結合部位又
は翻訳開始コドンを別に挿入しなければならない。ま
た、ベクターはシグナルペプチドに対応するDNA配列を
有するものを用いてもよい。
配列、（２）TTCACG及びその17塩基下流にTACACTを有す
る塩基配列及び（３）TATACT及びその17塩基下流にAAAG
CGを有する塩基配列から選ばれる少なくとも一種を含む
塩基配列 このようなプロモーターの支配下にこのプロモーターに
とって異種の構造遺伝子を発現させるには、プロモータ
ー配列と構造遺伝子との間にリボソーム結合部位（塩基
配列（ｂ））と翻訳開始コドン（塩基配列（ｃ））が配
置されるように接続する。リボソーム結合部位と翻訳開
始コドンがプロモーター配列と構造遺伝子（ｄ）との間
に配置するには、リボソーム結合部位及び翻訳開始コド
ンがもともと配置されているようなベクターを用いて、
これに構造遺伝子を挿入する。この際、リボソーム結合
部位と翻訳開始コドンを有する構造遺伝子をベクターに
挿入してもよい。ベクターがリボソーム結合部位と翻訳
開始コドンのいずれをも又はいずれかを有しない場合に
は、リボソーム結合部位又は翻訳開始コドンを有する構
造遺伝子をベクターに挿入するかリボソーム結合部位又
は翻訳開始コドンを別に挿入しなければならない。ま
た、ベクターはシグナルペプチドに対応するDNA配列を
有するものを用いてもよい。
構造遺伝子は、更に固有のプロモーター配列を有するも
のであっても支障はない。また、構造遺伝子として、シ
グナルペプチドに対応するDNA配列を有するものを用い
てもよい。
のであっても支障はない。また、構造遺伝子として、シ
グナルペプチドに対応するDNA配列を有するものを用い
てもよい。
バチルス・ブレビスとしては、特に特定の株を用いる必
要はない。バチルス・ブレビスの内の好適な例として、
バチルス・ブレビス47FERM−P7224及び同481FERM−P753
1がある。
要はない。バチルス・ブレビスの内の好適な例として、
バチルス・ブレビス47FERM−P7224及び同481FERM−P753
1がある。
本発明のプラスミドベクターに構造遺伝子を挿入してバ
チルス・ブレビスの細胞内に導入すれば、これら微生物
は、蛋白質等の有用物質を多量に生産するように形質転
換される。
チルス・ブレビスの細胞内に導入すれば、これら微生物
は、蛋白質等の有用物質を多量に生産するように形質転
換される。
ベクター内に構造遺伝子を挿入する方法及び得られた組
換えDNAを用いてバチルス・ブレビスを形質転換する方
法は従来用いられている方法がそのまま適用できる。こ
こで構造遺伝子の例としては真核生物由来のものおよび
原核生物由来のもののいずれも使用することが可能であ
る。たとえばヒト遺伝子（たとえばインターフェロン、
インシュリンなど）、微生物の酵素蛋白遺伝子（たとえ
ばトリプトファナーゼ、アスパラギン酸アンモニアリア
ーゼなど）などがある。
換えDNAを用いてバチルス・ブレビスを形質転換する方
法は従来用いられている方法がそのまま適用できる。こ
こで構造遺伝子の例としては真核生物由来のものおよび
原核生物由来のもののいずれも使用することが可能であ
る。たとえばヒト遺伝子（たとえばインターフェロン、
インシュリンなど）、微生物の酵素蛋白遺伝子（たとえ
ばトリプトファナーゼ、アスパラギン酸アンモニアリア
ーゼなど）などがある。
次に、本発明を実施例により説明する。
実施例１ （１） バチルス・ブレビス47細胞表層蛋白質遺伝子の
５′側プロモーター領域のクローン化 上記表層蛋白質（分子量15万の蛋白質，以下150K蛋白質
と記す）の遺伝子の断片（これは150K蛋白質遺伝子のプ
ロモーター領域を含まないものとして塚越らによってク
ローニングされた;J.Bacteriol.158,1054−1060（198
4））をプローブとしてバチルス・ブレビス47（FERM−P
7224）の染色体DNAについてサウザン・ブロット法（J.M
ol.Biol.98,503−517（1975））を用いて解析した結
果、本遺伝子及びその周辺の制限地図（第１図）を得
た。更にバチルス・ブレビス47から抽出したRNAを用い
てS1マップ法（J.Biol.Chem.256,11905〜11910（198
1））を行い、本遺伝子の転写方向およびその転写開始
位置を第１図に示すように決定した。
５′側プロモーター領域のクローン化 上記表層蛋白質（分子量15万の蛋白質，以下150K蛋白質
と記す）の遺伝子の断片（これは150K蛋白質遺伝子のプ
ロモーター領域を含まないものとして塚越らによってク
ローニングされた;J.Bacteriol.158,1054−1060（198
4））をプローブとしてバチルス・ブレビス47（FERM−P
7224）の染色体DNAについてサウザン・ブロット法（J.M
ol.Biol.98,503−517（1975））を用いて解析した結
果、本遺伝子及びその周辺の制限地図（第１図）を得
た。更にバチルス・ブレビス47から抽出したRNAを用い
てS1マップ法（J.Biol.Chem.256,11905〜11910（198
1））を行い、本遺伝子の転写方向およびその転写開始
位置を第１図に示すように決定した。
そこでバチルス・ブレビス47のDNAを制限酵素Bcl Iで切
断し、アガロースゲル電気泳動により9Kb断片（第１図
に示すDNAのほぼ全長）を分離し、そのDNAを更にBgl II
で切断しアガロースゲル電気泳動により、第１図中斜線
で示した領域の3.1KbDNA断片を濃縮分離した。次に、プ
ラスミドpHW1DNA（J.Bacteriol,150,804〜814（198
2））を制限酵素Hind IIIで切断し、DNAポリメラーゼに
より平滑末端化した後BamH Iリンカーを付加したもの
と、上記の3.1KbDNA断片をT4リガーゼで連結し、そのDN
Aを枯草菌RM141（rM mM arg 15 leug8 hisA1 recE
4）の形質転換（Mol.Gen.Genet.,168,111〜115（197
9））に用いた。エリスロマイシン（10μg/ml）を含む
再生寒天培地上に生育した形質転換株の中から、別途調
製した150K蛋白質に対する抗体とプロティンＡ・ホース
ラディッシュ・パーオキシダーゼ・コンジュゲート（Ｅ
−Ｙラボラトリーズ）を用いるところのエンザイム・イ
ムノ・アッセイ法（Gene16,149（1981））により上記抗
体と反応するコロニーを検出した。反応したコロニーか
らプラスミドpCWP1（第２図）を分離し前述の3.1Kb断片
が挿入されていること（第２図中太線で示す部分）を確
認した。
断し、アガロースゲル電気泳動により9Kb断片（第１図
に示すDNAのほぼ全長）を分離し、そのDNAを更にBgl II
で切断しアガロースゲル電気泳動により、第１図中斜線
で示した領域の3.1KbDNA断片を濃縮分離した。次に、プ
ラスミドpHW1DNA（J.Bacteriol,150,804〜814（198
2））を制限酵素Hind IIIで切断し、DNAポリメラーゼに
より平滑末端化した後BamH Iリンカーを付加したもの
と、上記の3.1KbDNA断片をT4リガーゼで連結し、そのDN
Aを枯草菌RM141（rM mM arg 15 leug8 hisA1 recE
4）の形質転換（Mol.Gen.Genet.,168,111〜115（197
9））に用いた。エリスロマイシン（10μg/ml）を含む
再生寒天培地上に生育した形質転換株の中から、別途調
製した150K蛋白質に対する抗体とプロティンＡ・ホース
ラディッシュ・パーオキシダーゼ・コンジュゲート（Ｅ
−Ｙラボラトリーズ）を用いるところのエンザイム・イ
ムノ・アッセイ法（Gene16,149（1981））により上記抗
体と反応するコロニーを検出した。反応したコロニーか
らプラスミドpCWP1（第２図）を分離し前述の3.1Kb断片
が挿入されていること（第２図中太線で示す部分）を確
認した。
（２） クローン化されたDNA断片の解析とプロモータ
ーの強さ クローン化されたDNA断片の塩基配列をマキサム・ギル
バート法（Methods Enzymol.65,449〜560（1980））に
より決定するとともに、バチルス・ブレビス47から抽出
したRNAを用いたS1マップ法（J.Biol−Chem.256,11905
〜11910（1981）により転写開始位置を決定した。その
結果Bcl I部位側から約2Kb離れた部位から始まりBgl II
部位へ向うオープン・リディング・フレーム及びその上
流に位置する４個の転写開始部位（P1,P2,P3,P4）を見
出した（第３図）。
ーの強さ クローン化されたDNA断片の塩基配列をマキサム・ギル
バート法（Methods Enzymol.65,449〜560（1980））に
より決定するとともに、バチルス・ブレビス47から抽出
したRNAを用いたS1マップ法（J.Biol−Chem.256,11905
〜11910（1981）により転写開始位置を決定した。その
結果Bcl I部位側から約2Kb離れた部位から始まりBgl II
部位へ向うオープン・リディング・フレーム及びその上
流に位置する４個の転写開始部位（P1,P2,P3,P4）を見
出した（第３図）。
これら４個の転写開始部位のそれぞれの上流に見出され
た−10領域および−35領域の塩基配列を第１表に示し
た。
た−10領域および−35領域の塩基配列を第１表に示し
た。
SIマップ法の解析の結果から、P2,P3およびP4における
転写開始はコンセンサス配列と類似した配列を有するP1
あるいはバチルス・リケニホルミスのα−アミラーゼの
プロモーター（Paml）と比べてはるかに強いことが明ら
かになった（第２表）。
転写開始はコンセンサス配列と類似した配列を有するP1
あるいはバチルス・リケニホルミスのα−アミラーゼの
プロモーター（Paml）と比べてはるかに強いことが明ら
かになった（第２表）。
（３） バチルス・ブレビス47におけるプロモーター活
性測定ベクターの作製 バチルス・リケニホルミス584株（Arch.Biochem.Biophy
s.155,290〜298（1973））よりクローン化されたα−ア
ミラーゼ遺伝子をバチルス・ブレビス47で安定に保持さ
れるプラスミドベクターpHY481（Appl.Env.Microbiol.4
9,1076〜1079（1985））に導入しpHY483（第４図）を得
た。本アミラーゼ遺伝子の全塩基配列はバチルス・リケ
ニホルミスFDO2株のα−アミラーゼ遺伝子の５′側領域
の塩基配列（J.Bacteriol.158,369〜372（1984））とほ
ぼ一致し、−10及び−35領域の配列，リボソーム結合部
位の配列（SD配列）また上流の遺伝子からの転写を終止
させていると思われるインバーテッド・リピート配列の
存在などの特徴は完全に一致することが確認された。本
遺伝子を用いて以下のようにプロモーター活性測定用の
ベクターを作製した。
性測定ベクターの作製 バチルス・リケニホルミス584株（Arch.Biochem.Biophy
s.155,290〜298（1973））よりクローン化されたα−ア
ミラーゼ遺伝子をバチルス・ブレビス47で安定に保持さ
れるプラスミドベクターpHY481（Appl.Env.Microbiol.4
9,1076〜1079（1985））に導入しpHY483（第４図）を得
た。本アミラーゼ遺伝子の全塩基配列はバチルス・リケ
ニホルミスFDO2株のα−アミラーゼ遺伝子の５′側領域
の塩基配列（J.Bacteriol.158,369〜372（1984））とほ
ぼ一致し、−10及び−35領域の配列，リボソーム結合部
位の配列（SD配列）また上流の遺伝子からの転写を終止
させていると思われるインバーテッド・リピート配列の
存在などの特徴は完全に一致することが確認された。本
遺伝子を用いて以下のようにプロモーター活性測定用の
ベクターを作製した。
まずpHY483をBamH Iで切断し、切断点からα−アミラー
ゼ遺伝子のSD配列直前までをヌクレアーゼBal31を用い
て取り除き、BamH Iリンカーを付加した後環状化してpH
Y483△Ｐを得た。またpHY483をPst Iで切断し同様にし
て切断点からBamH I部位下流270b（インバーテッド・リ
ピート配列の直前）までを取り除きBgl IIリンカーを付
加した後環状化しpHY483△Ｎを得た。次にpHY483△Ｐ
DNAをBamH Iで切断し、DNAポリメラーゼで平滑末端とし
Bgl IIリンカーを付加した後Sal Iで切断し、アミラー
ゼ遺伝子５′側領域を含むBgl II−Sal I1.1kb断片をア
ガロースゲル電気泳動により分離した。またpHY483△Ｎ
DNAをBgl II,Sal Iで切断し、アミラーゼ遺伝子の
５′側領域を含まない4.7kb断片を同様にして分離し
た。両DNAをT4リガーゼで連結し、バチルス・ブレビス4
7を形質転換し得られた形質転換株からpHY4833を得た。
pHY4833はアミラーゼ遺伝子上流のインバーテッド・リ
ピート及びSD配列を保持し、−35及び−10領域を欠失し
ている（第５図）。
ゼ遺伝子のSD配列直前までをヌクレアーゼBal31を用い
て取り除き、BamH Iリンカーを付加した後環状化してpH
Y483△Ｐを得た。またpHY483をPst Iで切断し同様にし
て切断点からBamH I部位下流270b（インバーテッド・リ
ピート配列の直前）までを取り除きBgl IIリンカーを付
加した後環状化しpHY483△Ｎを得た。次にpHY483△Ｐ
DNAをBamH Iで切断し、DNAポリメラーゼで平滑末端とし
Bgl IIリンカーを付加した後Sal Iで切断し、アミラー
ゼ遺伝子５′側領域を含むBgl II−Sal I1.1kb断片をア
ガロースゲル電気泳動により分離した。またpHY483△Ｎ
DNAをBgl II,Sal Iで切断し、アミラーゼ遺伝子の
５′側領域を含まない4.7kb断片を同様にして分離し
た。両DNAをT4リガーゼで連結し、バチルス・ブレビス4
7を形質転換し得られた形質転換株からpHY4833を得た。
pHY4833はアミラーゼ遺伝子上流のインバーテッド・リ
ピート及びSD配列を保持し、−35及び−10領域を欠失し
ている（第５図）。
（４−１） バチルス・ブレビス47を宿主とし、pHY483
3を用いた細胞表層蛋白質遺伝子５′側領域のプロモー
ター活性 細胞表層蛋白質遺伝子の５′側領域から、Alu I−Alu16
00b断片（図3,ヌクレオテド116から715まで，転写開始
部位P1,P2,P3,P4及びそれぞれの−10,−35領域を含
む）,Alu I−Rsa I165b断片（第３図，ヌクレオテド116
から280まで、転写開始部位P1とその−10,−35領域を含
む）,Rsa I−Alu I1435b断片（第３図，ヌクレオチド28
1から715まで，転写開始部位P2,P3,P4及びそれぞれの−
10,−35領域を含む）を分離し、それぞれBamH Ilinker
を付加後、pHY4833のBgl II部位に挿入し、pTA1,3,2を
得た（第６図）。
3を用いた細胞表層蛋白質遺伝子５′側領域のプロモー
ター活性 細胞表層蛋白質遺伝子の５′側領域から、Alu I−Alu16
00b断片（図3,ヌクレオテド116から715まで，転写開始
部位P1,P2,P3,P4及びそれぞれの−10,−35領域を含
む）,Alu I−Rsa I165b断片（第３図，ヌクレオテド116
から280まで、転写開始部位P1とその−10,−35領域を含
む）,Rsa I−Alu I1435b断片（第３図，ヌクレオチド28
1から715まで，転写開始部位P2,P3,P4及びそれぞれの−
10,−35領域を含む）を分離し、それぞれBamH Ilinker
を付加後、pHY4833のBgl II部位に挿入し、pTA1,3,2を
得た（第６図）。
pHY4833,pTA3,pTA2,pTA1をそれぞれ導入したバチルス・
ブレビス47をT3倍地（可溶性デンプン２％,MgCl2・6H2O
0.1％，イーストエキス0.4％，ポリペプトン２％，肉
エキス0.5％，ウラシル0.01％,pH7）に植え、37℃で振
盪培養を行い１日後、３日後の菌体外アミラーゼ生産量
を可溶性デンプンを基質として、斉藤の方法（Arch.Bio
chem.Biophys.155,290〜298（1973））を用いて測定し
た（第３表）。
ブレビス47をT3倍地（可溶性デンプン２％,MgCl2・6H2O
0.1％，イーストエキス0.4％，ポリペプトン２％，肉
エキス0.5％，ウラシル0.01％,pH7）に植え、37℃で振
盪培養を行い１日後、３日後の菌体外アミラーゼ生産量
を可溶性デンプンを基質として、斉藤の方法（Arch.Bio
chem.Biophys.155,290〜298（1973））を用いて測定し
た（第３表）。
（４−２） バチルス・ブレビス47を宿主とし、pHY483
3を用いた細胞表層蛋白質遺伝子５′側領域のプロモー
ター活性の測定 細胞表層蛋白質遺伝子の５′側領域から第７図に示した
各種の制限酵素断片あるいはBa131ヌクレアーゼ処理に
よるDNA鎖の短縮後、合成リンカーを付加した断片を調
製し、前節で作製したプロモーター活性測定ベクターpH
Y4833のBgl II部位へ挿入し、pTA1〜pTA8を得た。これ
らのプラスミドを導入したバチルス・ブレビス47をT3培
地（可溶性デンプン２％,MgCl2・6H2O 0.1％，イース
トエキス0.4％，ポリペプトン２％，肉エキス0.5％，ウ
ラシル0.01％,pH7）に植え、37℃で振盪培養を行い、菌
体外アミラーゼ量を可溶性デンプンを基質とした斉藤の
方法（Arch.Biochem.Biophys.155,290〜298（1973））
により測定した（第４表）。
3を用いた細胞表層蛋白質遺伝子５′側領域のプロモー
ター活性の測定 細胞表層蛋白質遺伝子の５′側領域から第７図に示した
各種の制限酵素断片あるいはBa131ヌクレアーゼ処理に
よるDNA鎖の短縮後、合成リンカーを付加した断片を調
製し、前節で作製したプロモーター活性測定ベクターpH
Y4833のBgl II部位へ挿入し、pTA1〜pTA8を得た。これ
らのプラスミドを導入したバチルス・ブレビス47をT3培
地（可溶性デンプン２％,MgCl2・6H2O 0.1％，イース
トエキス0.4％，ポリペプトン２％，肉エキス0.5％，ウ
ラシル0.01％,pH7）に植え、37℃で振盪培養を行い、菌
体外アミラーゼ量を可溶性デンプンを基質とした斉藤の
方法（Arch.Biochem.Biophys.155,290〜298（1973））
により測定した（第４表）。
この結果からバチルス・ブレビス47においては、コンセ
ンサス配列と類似した−10,−35配列を持つ転写開始部
位P1からの転写開始頻度は非常に低く、コンセンサス配
列に類似しない−10,−35配列を持つ転写開始部位P2,P
3,P4からの転写開始の頻度の方がはるかに高いことが結
論された。特に、P3からの転写開始の頻度は高く、P3の
みを持つ断片を挿入したプラスミドpTA7を導入したバチ
ルス・ブレビス47におけるα−アミラーゼ生産量は、断
片を挿入していないpHY4833あるいはP1のみを持つ断片
を挿入したプラスミドpTA3の場合と較べて50倍以上に達
した。なお菌体内のアミラーゼ量は菌体外の10％以下で
ある。
ンサス配列と類似した−10,−35配列を持つ転写開始部
位P1からの転写開始頻度は非常に低く、コンセンサス配
列に類似しない−10,−35配列を持つ転写開始部位P2,P
3,P4からの転写開始の頻度の方がはるかに高いことが結
論された。特に、P3からの転写開始の頻度は高く、P3の
みを持つ断片を挿入したプラスミドpTA7を導入したバチ
ルス・ブレビス47におけるα−アミラーゼ生産量は、断
片を挿入していないpHY4833あるいはP1のみを持つ断片
を挿入したプラスミドpTA3の場合と較べて50倍以上に達
した。なお菌体内のアミラーゼ量は菌体外の10％以下で
ある。
pTA2を有するバチルス・ブレビス47は工業技術院微生物
工業技術研究所にFERM Ｐ−8504として寄託されてい
る。
工業技術研究所にFERM Ｐ−8504として寄託されてい
る。
第１図は、15万蛋白質遺伝子及びその周辺の制限地図で
ある。 は3.1Kb DNA断片領域である。 第２図は、プラスミドpCWP1の制限地図である。 は、3.1Kb DNA断片領域である。 第３図は、バチルス・ブレビス47細胞表層蛋白質遺伝子
の５′側領域の塩基配列及び転写開始の位置（矢印で示
す）及び見出されたオープンリーデングフレームに対応
するアミノ酸配列を示す。 がプロモーター領域であり、 は推定される翻訳開始コドンである。 第４図は、プラスミドpHY483の制限地図である。 第５図は、プロモーター検出用ベクターpHY4833の造成
経過の説明図である。 は欠失領域である。 第６図は、プロモーター検出用ベクターpHY4833に挿入
された細胞表層蛋白質遺伝子の５′側領域断片を示す。 第７図は、プロモーター検出用ベクターpHY4833に挿入
された細胞表層蛋白質遺伝子の５′側領域断片を示す。
なお、図中のヌクレオチド番号は第３図に対応する。
ある。 は3.1Kb DNA断片領域である。 第２図は、プラスミドpCWP1の制限地図である。 は、3.1Kb DNA断片領域である。 第３図は、バチルス・ブレビス47細胞表層蛋白質遺伝子
の５′側領域の塩基配列及び転写開始の位置（矢印で示
す）及び見出されたオープンリーデングフレームに対応
するアミノ酸配列を示す。 がプロモーター領域であり、 は推定される翻訳開始コドンである。 第４図は、プラスミドpHY483の制限地図である。 第５図は、プロモーター検出用ベクターpHY4833の造成
経過の説明図である。 は欠失領域である。 第６図は、プロモーター検出用ベクターpHY4833に挿入
された細胞表層蛋白質遺伝子の５′側領域断片を示す。 第７図は、プロモーター検出用ベクターpHY4833に挿入
された細胞表層蛋白質遺伝子の５′側領域断片を示す。
なお、図中のヌクレオチド番号は第３図に対応する。
Claims (2)
- 【請求項１】下記の塩基配列もしくはプロモーター活性
を有するその一部からなる塩基配列（ａ）、塩基配列
（ａ）の下流にバチルス・ブレビスの細胞内でリボソー
ム結合部位として機能する塩基配列（ｂ）、塩基配列
（ｂ）の下流にバチルス・ブレビスの細胞内で翻訳開始
コドンとして機能する塩基配列（ｃ）及び塩基配列
（ｃ）に直接接続されている発現させるべき遺伝子
（ｄ）を有しバチルス・ブレビスの細胞内で複製できる
プラスミドを、バチルス・ブレビスの細胞内に導入する
ことを特徴とする、バチルス・ブレビスを用いる遺伝子
の発現方法。 ACATAATGGACAGGTGAATAACGAACCACGAAAAAAACTTTAAATTTTTT
TCGAAGGCGCCGCAACTTTTGATTCGCTCAGGCGTTTAATAGGATGTCAC
ACGAAAAACGGGGAATTGTGTAAAAAAGATTCACGAATTCTAGCAGTTGT
GTTACACTAGTGATTGTTGCATTTTACACAATACTGAATATACTAGAGAT
TTTTAACACAAAAAGCGAGGCTTTCCTGCGAAAGGAGGTGACACGCGCTT
GCAGGATTCGGGCTTTAAAAAGAAAGATAGATTAACAACAAATATTCCCC
AAGAACAATTTGTTTATACTAGAGGAGGAGAACACAAGGTTATGAAAAAG
GTCGTTAACAGTGTATTGGCTAGTGCACTCGCACTTACTGTTGCTCCAAT
GGCTTTCGCAGCAGAAGAAGCAGCAACTACTACAG - 【請求項２】塩基配列（ａ）において、プロモーター活
性を有する一部の塩基配列が（１）GCAACT及びその17塩
基下流にTTTAATを有する塩基配列、（２）TTCACG及びそ
の17塩基下流にTACACTを有する塩基配列及び（３）TATA
CT及びその17塩基下流にAAAGCGを有する塩基配列から選
ばれる少なくとも一種を含む塩基配列である特許請求の
範囲第１項記載の方法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61047273A JPH07108224B2 (ja) | 1985-11-07 | 1986-03-06 | バチルス・ブレビスを用いる遺伝子の発現方法 |
| SE8604636A SE469560B (sv) | 1985-11-07 | 1986-10-30 | Foerfarande foer uttryckande av gener medelst bacillus brevis |
| CH4424/86A CH671032A5 (ja) | 1985-11-07 | 1986-11-06 | |
| FR8615552A FR2589880B1 (fr) | 1985-11-07 | 1986-11-07 | Procede pour l'expression de genes par bacillus brevis |
| US06/928,125 US4994380A (en) | 1985-11-07 | 1986-11-07 | Process for expressing genes by Bacillus brevis |
| DE19863638033 DE3638033A1 (de) | 1985-11-07 | 1986-11-07 | Verfahren zum exprimieren von genen durch bacillus brevis |
| DK533386A DK533386A (da) | 1985-11-07 | 1986-11-07 | Fremgangsmaade til ekspression af gener ved hjaelp af bacillus brevis |
| GB8626680A GB2182664B (en) | 1985-11-07 | 1986-11-07 | A process for expressing genes by bacillus brevis |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60-248036 | 1985-11-07 | ||
| JP24803685 | 1985-11-07 | ||
| JP61047273A JPH07108224B2 (ja) | 1985-11-07 | 1986-03-06 | バチルス・ブレビスを用いる遺伝子の発現方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62201583A JPS62201583A (ja) | 1987-09-05 |
| JPH07108224B2 true JPH07108224B2 (ja) | 1995-11-22 |
Family
ID=26387443
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61047273A Expired - Lifetime JPH07108224B2 (ja) | 1985-11-07 | 1986-03-06 | バチルス・ブレビスを用いる遺伝子の発現方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4994380A (ja) |
| JP (1) | JPH07108224B2 (ja) |
| CH (1) | CH671032A5 (ja) |
| DE (1) | DE3638033A1 (ja) |
| DK (1) | DK533386A (ja) |
| FR (1) | FR2589880B1 (ja) |
| GB (1) | GB2182664B (ja) |
| SE (1) | SE469560B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| EP0326046A3 (en) * | 1988-01-25 | 1990-06-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Production of human epidermal growth factor |
| AU6046294A (en) * | 1993-02-22 | 1994-09-14 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Process for producing human growth hormone |
| GB9400650D0 (en) * | 1994-01-14 | 1994-03-09 | Smithkline Beecham Biolog | Expression of surface lazer proteins |
| US5955310A (en) * | 1998-02-26 | 1999-09-21 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Methods for producing a polypeptide in a bacillus cell |
| JP3406244B2 (ja) * | 1999-04-30 | 2003-05-12 | 伊藤ハム株式会社 | 新規な融合蛋白質からの組み換えインスリンの製造方法 |
| JP3753945B2 (ja) | 2001-02-14 | 2006-03-08 | ヒゲタ醤油株式会社 | 大腸菌とブレビバチルス属細菌間のプラスミドシャトルベクター |
| GB201505305D0 (en) | 2015-03-27 | 2015-05-13 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various tumors |
| PT3388075T (pt) | 2015-03-27 | 2023-08-18 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novos péptidos e combinações de péptidos para uso em imunoterapia contra vários tumores |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1206108A (en) * | 1981-03-06 | 1986-06-17 | Shuichi Aiba | Process for transforming microorganism by means of plasmid introduction |
| SE8204810L (sv) * | 1982-08-23 | 1984-02-24 | Pharmacia Fine Chemicals Ab | Hybrid-dna-molekyl, transformerad mikroorganism och sett att framstella protein a |
| IT1156317B (it) * | 1982-09-08 | 1987-02-04 | Anic Spa | Vettori plasmidici ad espressione in bacillus subtilis e procedimento per la loro preparazione |
| GB8308483D0 (en) * | 1983-03-28 | 1983-05-05 | Health Lab Service Board | Secretion of gene products |
| US4663280A (en) * | 1983-05-19 | 1987-05-05 | Public Health Research Institute Of The City Of New York | Expression and secretion vectors and method of constructing vectors |
| JPS6027388A (ja) * | 1983-07-22 | 1985-02-12 | Green Cross Corp:The | プラスミツド |
| JPS6058073A (ja) * | 1983-09-09 | 1985-04-04 | Juzo Udaka | Ｄｎａ、それを含むプラスミドおよび該プラスミドを含む細菌細胞 |
| JPS6058074A (ja) * | 1983-09-09 | 1985-04-04 | Juzo Udaka | バチルス・ブレビスを形質転換する方法 |
| JPS60137291A (ja) * | 1983-12-26 | 1985-07-20 | Takeda Chem Ind Ltd | 発現ベクター |
| DE3484346D1 (de) * | 1983-12-28 | 1991-05-02 | Agency Ind Science Techn | Dns-basensequenz enthaltende regionen einbegriffen in der herstellung und sekretion eines proteins, rekombinante dns das ganze oder einen teil der dns-basensequenz enthaltend und verfahren zur herstellung von proteinen unter verwendung der rekombinanten dns. |
| EP0151760A1 (en) * | 1984-01-06 | 1985-08-21 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel DNA and use thereof |
| JPS60188073A (ja) * | 1984-03-09 | 1985-09-25 | Juzo Udaka | バチルス・ブレビスを宿主とするプラスミド |
-
1986
- 1986-03-06 JP JP61047273A patent/JPH07108224B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-30 SE SE8604636A patent/SE469560B/sv not_active IP Right Cessation
- 1986-11-06 CH CH4424/86A patent/CH671032A5/de not_active IP Right Cessation
- 1986-11-07 DK DK533386A patent/DK533386A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-11-07 DE DE19863638033 patent/DE3638033A1/de active Granted
- 1986-11-07 GB GB8626680A patent/GB2182664B/en not_active Expired
- 1986-11-07 FR FR8615552A patent/FR2589880B1/fr not_active Expired
- 1986-11-07 US US06/928,125 patent/US4994380A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ．，１９８４〔１５８〕Ｐ．１０５４−１０６０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| SE8604636D0 (sv) | 1986-10-30 |
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| FR2589880A1 (fr) | 1987-05-15 |
| JPS62201583A (ja) | 1987-09-05 |
| GB2182664A (en) | 1987-05-20 |
| SE8604636L (sv) | 1987-05-08 |
| SE469560B (sv) | 1993-07-26 |
| GB8626680D0 (en) | 1986-12-10 |
| DE3638033A1 (de) | 1987-05-21 |
| DE3638033C2 (ja) | 1989-09-28 |
| US4994380A (en) | 1991-02-19 |
| GB2182664B (en) | 1989-10-04 |
| DK533386A (da) | 1987-05-08 |
| CH671032A5 (ja) | 1989-07-31 |
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