KR20010112252A

KR20010112252A - 피부통과 비침습성 예방접종

Info

Publication number: KR20010112252A
Application number: KR1020017009479A
Authority: KR
Inventors: 세벡그레고르; 쇼프라암라
Original assignee: 케에베 그레고르; 이데아 악티엔게젤샤프트
Priority date: 1999-01-27
Filing date: 2000-01-26
Publication date: 2001-12-20
Also published as: HU225170B1; EP1031346B1; EP1146858A1; DE69901377T2; WO2000044349A1; BR0007749A; AR037312A1; CA2360692C; CN1230151C; HK1030363A1; ATE216875T1; US7867480B1; DK1031346T3; JP2002535350A; HUP0200315A2; AU2798800A; MXPA01007657A; EP1031346A1; CA2360692A1; KR20070094662A

Abstract

본 발명은 예방적 또는 치료적 접종을 위해서 초가변성 운반체와 결합된 항원의 비침습성 피부통과 투여용 백신에 관한 것으로서,

상기 백신은 (a)침투제인 피부통과 운반체, (b)시토킨 또는 항-시토킨 활성을 특이적으로 유도하거나 또는 활성 자체를 발휘하는 화합물; 및 (c)항원, 알레르기 유발원, 항원의 혼합물 및/또는 알레르기 유발원의 혼합물을 포함하고, 본 발명은 방어적 또는 치료적 면역 반응을 얻기위한 포유류에 접종하는 방법에 관한 것이다.

Description

피부통과 비침습성 예방접종{NON-INVASIVE VACCINATION THROUGH THE SKIN}

본 발명은 예방적 또는 치료적 예방접종을 위해서 초가변성 운반체(ultradeformable carrier)가 결합된 항원의 비침습성 피부통과 투여를 위한 신규한 백신에 관한 것이다. 상기 백신은 (a)응고되는 경향이 있는 적어도 두가지의 다른 형태의 물질 또는 물질의 두가지의 다른 형태의 하나 또는 몇개의 층의 막형상 코팅제에 의해서 둘러싸인 작은 유체 방울의 형태로 수성용매내에 현탁 또는 분산되고, 상기 물질들 또는 물질의 형태는 바람직하게 수성 액체 매질에서 적어도 10의 용해도 차이가 나고, 상기 물질들 또는 물질의 형태로 이루어진 이형-응고물의 평균직경 또는 더 가용성인 물질들 또는 물질의 형태의 단일 응고물의 평균직경은 덜 가용성인 물질 또는 물질의 형태의 단일 응고물의 평균직경보다 더 작으며, 및/또는 더 가용성인 성분은 침투 소적을 용해시키는 경향이 있으며, 그 같은 성분의 함량은 소적을 용해시키는데 요구되는 농도의 99㏖%에 이르고, 또는 용해되지 않는 소적내 포화농도의 99㏖%에 상응하거나 더 높으며, 막형상 코팅제로 둘러싸인 소적의 탄성 가변성 에너지는 적어도 5배 더 낮고, 바람직하게는 적어도 10배 더 낮으며, 이상적으로는 적혈구 또는 유체 지방족 사슬을 갖는 인지질 이중층보다 10배 낮은, 침투제인 피부통과 운반체; (b)시토킨 또는 항-시토킨 활성을 특이적으로 분비 또는 특이적으로 유도하고, 그 자체의 활성을 발휘하는 화합물; 및 (c)항원또는 알레르기 유발원으로 이루어져 있다. 본 발명은 또한 포유류의 해당하는 치료적 또는 예방적 접종방법에 관한 것이다.

몇개의 문헌이 본 명세서내에서 인용되었다. 여기서 인용된 각 문헌(제조자의 명세서, 지시 등을 포함)은 참고문으로 통합되었으며; 인용된 특정의 문헌은 본 발명의 실제 종래 기술로 언급되는 것은 아니다. 또한 참고문으로 통합된 것은 이데아 악티엔게젤샤프트(IDEA AG)의 명칭으로 출원되어 함께 계류중인 출원의 기술문의 명칭이 "Transnasal transport/immunization with highly adaptable carriers"인 것이다.

피부는 가장 접근가능하지만, 각질층이 존재하기때문에 몸으로 유입되는 것이 어렵다. 피부의 각질층은 혈관벽을 닮아서 진화적으로 최적화된 장벽이고, 이는 이완, 조임 및 후에 세포를 겹치게하며, 각질층에서 기본적인 세포-타일 모티프는 20-30번 반복된다. 또한 피부에서 세포내 접촉은 지방 혼합물로 밀집하게 채워서 잘 조직화하여 밀봉한다. 그러므로 각질층은 감염으로부터 생물체를 보호할 뿐만아니라 피부를 통한 항원의 효과적인 침투를 차단시킨다. 사실상 피부접촉을 통하여 성공적인 면역화 및 예방접종을 방해하므로 알레르기의 관점에서 유익하다.

시판되는 피부통과 전달 장치에서 가장 큰 약제는 350Da보다 작으며(Cevc, G. Drug delivery across the skin, Exp. Opin. Invest. Drugs(1997) 6: 1887-1937), 특정의 분자는 피부에서 작은 자기-밀봉 공극을 가로지를 수 있다. 후자는 친수성인 경우에 통상 1㎚미만의 너비를 가지며, 소수성인 경우는 더 좁다. 그러므로 연충과 같은 생물체가 기관에 구멍을 뚫는 생화학적 기작을 사용하여 피부를투과하여 인체로 접근할 수 있다. 자연적으로 발생하는 미세 상해 및 측로(가령 모지선 단위)가 피부에서 또한 이용될 수 있다. 그러나 이들은 피부 표면의 0.1% 내지 0.5%로 덮혀 있어서, 결과적으로 피부통과 전달에서는 기여하지 않을 뿐만아니라 세균이 국소감염을 위한 경로로 사용된다(Strange, P., Skov, L. Lisby, S., Nielsen, P.L., Baadsgard, O. Staphylococcal enterotoxin B applied on intact normal and intact atopic skin induces dermatoma. Arch. Dermatol.(1996) 132:27-33).

피부에 노출된 몇가지 합텐은 피부 면역반응을 일으킨다. 이는 국소적으로 부착된 합텐으로부터 충분히 작은 분자가 적당한 양으로 피부로 들어가는 방법을 확인한 것이다. 그리고 먼저 상기 합텐은 기관을 자극하고, 마지막을 과민성을 일으켜서 피부염을 일으킨다(Kondo, S., Sauder, D.N. Epidermal Cytokines in allergic contact dermatitis. J.Am. Acad. Dermatol. (1995) 33: 786-800; Nasir, A., Gaspari, A. A. Contact Dermatitis. Clinical perspectives and basic mechanisms. Clin. Rev. Allergy and Immunol.(1996) 14: 151-184). 상기 문제는 피부 투과 개선제와 같은 피부 자극제와 조합된 약품 또는 저분자량의 화학약품이 중요하다(Cevc, 1997, op.cit.). 큰 분자는 장벽을 통과하는데 한계가 있기때문에 피부에서 알레르기를 일으킬 수 없다. 높은 면역원성 오브알부민(Wang, L.-F., Lin, J.-Y., Hsieh, K.-H., Lin, R.-H. Epicutaneous exposure of protein antigen induces a predominant Th2-like response with IgE production in mice.J. Immunol. (1996) 156:4079-4082) 또는 콜레라 독소(Glenn, G.M., Rao, M.Matyas, (1998) 391:851; Glenn, G.M., Scharton-Karsten T, Vasell R, Mallet C.P., Hale T.L. and Alving C.R. Transcutaneous Immunization with Cholera toxin Protects Mice Against Lethal Mucosal Toxin Challenge. J. Immunol(1998)161:3211-3214)에 대한 Th2 반응은 다량의 단백질이 피부외층에 노출된 후에만 가능하고 매우 약하다. 또한, 피부로부터 각질층의 제거는 피부외층 처리된 C57BL/6 쥐의 각각 96% 또는 43%로 사람의 암배아성 항원 또는 사람의 GM-CSF 유전자를 코딩하는 아데노바이러스에 대항하는 검출가능한 양의 특이적 항체를 제조하는데 전제조건이다(Deng, H., Qun, L., Khavari, P.A. Sustainable cutaneous gene delivery. Nature Biotechnology(1997) 15: 1388-1390).

상기에 언급되거나 또는 피부외층에 사용되는 항원에 대한 보호는 최근에 보고되어 있지 않다. 디프테리아 또는 파상풍균 독소에 대항하는 항체 및 소혈청 알부민은 콜레라 독소로 조합된 BALB/c 쥐의 피부에 항원을 가함에 의해서 생성되며(Glenn et al., 1998, op.cit), 보조제없이 매우 약한 면역반응을 일으킨다. 콜레라 독소(CT)를 포함한 후에도, 디프테리아 및 파상풍균 항원에 대한 평균의 특이적 항체 역가는 약 50배 및 70배 내지 4000배 사이이고(각각의 데이타값을 포함하는 것에 의존함), 콜레라 독소에 의해서 나오는 것보다는 적다(Glenn et al., 1998, op.cit.). 상응하는 절대 역가는 14±17 및 8±16이고; 항-BSA 역가는 대략 11±11이다(개시되어 있는 도면으로 부터 계산된 것과 같은 평균값+/-표준편차). 낮은 역가에서 치료적 또는 예방적인 효과가 개시되어 있지 않으며, 간단한 비침습성 접종에 대한 경로도 잘 알려져 있지 않다. 같은 그룹에 의해 공개된 최근의 연구(Glenn et al., 1998b)는 피부통과 접종에 의해 얻어질 수 있는 방어에 대한 결론을 허용하지 않는 경비 면역반응후 CT에 대항하는 방어를 입증하였다.

상기 공보에서는 피부를 통과하는 단백질의 전달이 기술되어 있으며, 역가에 의해서 판단되는 바와 같이 상기 언급된 것보다 더 효과적인 크기의 몇개의 차수에서 기계적 민감성 및 감수성, 자기-조절하는 운반체(트랜스퍼좀)을 언급하고 있다(for a review, see Cevc, 1997, op.cit.). 항원에 있어서, 이는 피하 단백질 주입에 의해서 일어나는 것에 상응하는 항체 역가를 유도하며: BSA의 경우에, IgG 절대 역가는 각 경우에 약 200이고(Paul, A., Cevc, G. non-invasive administration of protein antigens. Epicutaneous immunization with the bovine serum albumin. Vaccine Res.(1995) 4: 145-164), 및 간극 결합 단백질에 대해서 역가가 15,000 내지 100,000사이로 측정된다(Paul, A., Cevc, G., Bachhawat, B.K. transdermal immunization with large proteins by means of ultradeformable drug carriers. Eur. J. immunol.(1995) 25:3521-3524; Paul, A., Cevc, G., Bachhawat, B.K. Transdermal immunization with an integral membrane component, gap junction protein, by means of ultradeformable drug carriers, Transfersomes. vaccine (1997) 16: 188-195). 그러나 방어 면역 반응의 발생은 상기 공보에서 입증되지 않았다.

오늘날 공지되어 있는 바와 같이, Th1 또는 Th2 세포의 활성은 면역 반응에서 중요한 역할을 한다: Th1 세포는 주로 세포-매개 면역인 식세포-매개 숙주 방어를 촉진할 뿐만아니라, 쥐에서 항원특이성 IgG2a를 제조한다. 반면에, Th2 세포는식세포 비의존성 숙주-반응, IgG1, IgE 및 IgA 면역글로불린 생성을 유지하는 경향이 있다.

면역반응의 Th1 또는 Th2, 즉 Th 세포 아형으로의 분화는 시토킨에 의존할 뿐만아니라, 다른 조절분자의 활성에 의존하다(Luger, T.A., Schwarz, T. The role of cytokines and neuro-endocrine hormones in cutaneous immunity and inflammation. Allergy(1995) 50: 292-302; Lohoff, M., Gessner, M., Bogdan, C., Roellinghoff, M. The Th1/Th2 paradigm and experimental murine Leishmaniasis. Int. Arch Allergy Immunol. (1998) 115:191-202.); 항원을 나타내는 세포의 성질 및 사용된 항원의 양은 또한 중요한 역할을 한다. 시토킨은 대부분의 진핵세포에 의해서 일시적으로 생성되고, 특이적 세포-표면 수용체를 통해서 작용한다. 실제로, 피부내 모든 세포는 적당한 자극후에 (글리코)단백질 인자를 분비하거나 또는 그들 수용체를 발현시킨다. 대부분의 시토킨은 다능성을 가지며, 서로를 유도하거나 또는 상대 수용체의 발현에 영향을 준다. 이는 시토킨이 소위 시토킨 캐스케이드의 구성안에서 상승적, 첨가적 또는 길항적 형태로 작용하도록 하는 것이다(Luger & Schwarz, 1995; op. cit.).

피부 항원 사용후 면역 활성에서 다른 세포의 역할이 완전히 이해되지는 않았다(Luger & Schwarz, 1995; op. cit.; Lohoff et al., 1998, op. cit.). 두개저 피부영역에 위치하는 랑게르한스 세포는 면역 전달에 주된 역할을 하는 것으로 사료된다. 먼저 상기 세포는 항원과 결합하여, 처리되고, 표피에서 림프관으로 이동하고, 또한 분해된 항원을 가지고, 인접하는 배출 림프절로 간다. 상기 과정동안에 랑게르한스 세포는 표현적 및 기능적 선택 사항을 가지고, 항원을 높은 표피맥을 통해서 림프절로 들어가는 네이티브의 CD4⁺T 세포로 제공하는 (림프) 수상돌기 세포로 분화시킨다. 반면에, 피부내 세포를 나타내는 항원의 기타 두가지 주된 형태인 대식세포 및 B 림파구는 먼저 항원이 존재하도록 활성화를 요구하고, T 세포를 자극한다. 항체는 혈관 표피 세포에 의해서 T 세포에 제공되고, 아마도 피부의 기본세포에 의해서 제공될 것이다.

예를 들면 케라틴 세포는 IL-1α, GM-CSF 및 TNFα를 포함하는 전염증성(proinflammatory) 시토킨을 과다하게 생성함에 의해서 국부 염증을 일으킨다(Pastore, S., Fanales-Belaso, E., Abbanesi, C., Chinni, L.M., Giannetti, A., Girolomoni, G. Granulocyte macrophage colony stimulating factor is overproduced by keratinocytes in atopic dermatitis: Implications for sustained dendritic cell activation in the skin. J. Clin. Invest.(1997) 99:3009-3017). 시토킨에서 유도되는 케라틴 세포는 세포를 제공하는 항원으로 랑게르한스 세포를 성숙화시키는데 중요하다(Nasir & Gaspari, 1996, op. cit.). 전자의 세포가 항원 제공에서 직접 참여하는 정도(Kondo & Sauder, 1995, op. cit.)는 알려져 있지 않지만, 케라틴 세포에 의해서 IL-10, 비기능성 IL-12 및 TGFβ와 같은 저해 시토킨의 제조는 알려져 있다(Nasir & Gaspari, 1996, op. cit.).

피부에서 섬유아세포 풀은 또한 항원처리에 포함되는 세포 서브세트를 포함한다. 예를들면 섬유아세포의 한 서브세트는 경피증내 염증자리에서 시토킨에 의해서 선택적으로 강화된다(Fries, K.M., Blieden, T., Looney, R. J., Sempowski, G.D., Silvera. M.R., Willis, R.A., Phipps, R.P. Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis. Clin. Immunol. Immunopathol.(1994) 72:283-292).

피부외층 항원 사용은 구강 또는 코를 통한 종래의 투여 경로들 보다 다른 면역 반응을 일으킨다는 것이 이미 보고되어 있다. 예를들면 피부에서 피부외층 오브알부민을 반복되게 노출시킨후에, 항-오브알부민 IgE-s가 우세하다(Wang et al., 1996, op.cit.). 피부에서 모델 항원으로 소의 혈청 알부민을 사용하여 매우 강한 IgA 제조가 이미 관찰되었지만(Paul et al., 1997, op.cit.), 최근에 나온 피부외층 항원 제공과 생성된 면역 반응 사이의 내부 의존성에 있어서는 일치하지 않는다.

많은 다른 세포가 피부로 전달되는 거대분자에 대항하여 면역 반응을 일으키는데 참여한다. 상기에서 언급한 바와 같이, 상기의 접근방법은 방어 면역 반응을 일으키는 방법을 유도하지는 못했다. 이는 항원 주입과 같은 종래의 방법은 직접적으로 방어 면역 반응을 분화하는 정도로 피부에 항원을 가함에 의해서 얻어지는 면역 반응을 절단한다고 주장하지 않았다는 사실에 기인할 수 있다. 예를들면, 상처 또는 기타 형태의 피부 섭동과 같이 화학적 자극제를 포함하는 항원 주입은 피부로부터 다양한 시토킨을 분비한다는 것이 알려져 있다(이는 몸에서 중기관일 뿐만아니라, 몸의 면역 시스템의 주된 부분을 차지한다). 이는 미세한 동조를 방지하는 것 이외의 피부의 면역반응의 강도를 최대화하고, 또한 사용되는 항원의 성질에 민감하다. 더 큰 충격 백신 전달은 상기 효과로부터 유리하다.

초가변성 운반체에 의해서 피부를 통한 물질 전달은 피부에 영향을 주지 않으면서 높은-충격 전달 접근에 반대되는 것이다. 이는 세포의 형태를 조절하는 각질 세포들 사이의 실제 채널을 통해서 감수성의 초가변성 몸체, 소위 트랜스퍼좀^TM(Cevc, 1997, op.cit.)이 각질층을 투과한다는 사실에 기인하는 것으로 사료된다(Schaetzlein, A., Cevc, G. Non-uniform cellular packing of the stratum corneum and permeability barrier function of intact skin: a high-resolution confocal laser scanning microscopy study using highly deformable vesicles(Transfersomes). Br. J. Dermatol.(1998) 138: 583-592). 트랜스퍼좀은 처리되는 동안 약한 접촉부위에서 세포간 지방 및 피부에서 세포를 당기는 것이 제시되었다. 이와같이 발생된 통로는 대략 평균 너비가 20-30nm인 것으로 보인다. 이들은 피부 표면의 몇 퍼센트(~4%)를 덮으며(Schaetzlein & Cevc, 1998, op. cit.), 인접 표면의 끌어당김은 포함하지 않는다. 초가변성 운반체를 갖는 항원 투여후 또는 보조제로 콜레라 독소를 사용함에 의해서(Glenn et al. 1998a, b, op.cit.) 측정되는 항-BSA 역가들(Paul & Cevc, 1995, op.cit.)사이의 정량적인 차이로 설명될 수 있으며, 이는 보통 측로 면적보다 크다(~0.1%).

운반체에 의해서 열려진 피부에서 실제 채널은 기관을 크게 섭동시키지 않고 장벽을 통과한 것과 결합된 물질 뿐만아니라 운반체가 충분히 넓어지는 것으로 보인다. 그러나, 초가변성 운반체에 의해서 피부를 통한 반복된 인슐린 전달은 단백질에 대항하는 항체를 유도하지 않는다(Cevc, G., Gebauer, D., Schaetzlein, A. Blume, G. Ultraflexible Vesicles, Transfersomes, Have an Extreamly Low Permeation Resistance and Transport Therapeutic Amounts of Insulin Across the Intact Mammalian Skin. Biochim. Biophys. Acta (1998) 1368: 201-215).

그러므로 본 발명을 통한 기술적인 문제는 의학적으로 유용한 피부통과 면역반응의 성공적으로 유도할 수 있는 방법을 세우는 것이다. 상기 기술적 문제에 대한 해결책은 청구범위에서 특징화된 구체예를 제공함에 의해서 이루어질 수 있다.

따라서, 본 발명은 하기로 이루어진 피부통과용 백신에 관한 것이다:

(a)수성 용매에 응고되는 경향이 있는 적어도 두개의 다른 물질 또는 물질의 두가지 다른 형태의 하나 이상의 층의 막형 코팅제로 둘러싸인 미세 유체 방울의 형태로 현탁 또는 분산되고, 상기 물질들 또는 물질의 형태는 바람직하게 수성 액체 매질내에서 적어도 용해도 10의 차이가 나고, 더 가용성인 물질 또는 물질의 형태의 단일- 응집물의 평균 직경 또는 상기 물질 또는 상기 물질의 형태로 이루어진 이형-응집물의 평균직경은 덜 가용성의 물질의 단일-응집물의 평균 직경보다 작으며, 및/또는 더 가용성인 성분은 침투 소적을 용해시키는 경향이 있으며, 그 같은 성분의 함량은 소적을 용해시키는데 요구되는 농도의 99mol%에 이르고, 또는 용해되지 않는 소적에서 포화 농도의 99mol%에 상응하거나 더 높으며, 및/또는 막-형상 코팅제로 들러싸인 소적의 탄성 변형 에너지는 적어도 5배 낮으며, 더 바람직하게는 적어도 10배 낮으며, 이상적으로는 유체 지방족 사슬을 갖는 인지질 이중층 또는 적혈구 세포의 것보다 더 10배 낮은, 침투제인 피부통과 운반체;

(b)시토킨 또는 항-시토킨 활성을 갖는 분자를 특이적으로 분비 또는 특이적으로 유도하거나 또는 목적하는 의학적으로 유용한 면역 반응을 일으키는 활성을 발휘하는 화합물; 및

(c)항원, 알레르기 유발원, 항원의 혼합물 및/또는 알레르기 유발원의 혼합물.

99% 미만의 상기 인용된 값에 있어서, 전자의 상대 농도의 50% 미만의 값이 종종 사용된다고 알려져 있다. 유익하게도, 40% 미만의 상대농도 또는 30% 미만의 상대농도가 선택되며, 2미만으로 상기에 언급된 값을 초과하는 더 가용성 성분의 상대 농도에 의해서 용해될 수 없는 소적이 바람직하다.

본 발명에 있어서, "병원성 물질(pathogen)"이라는 용어는 몸안에 또는 몸에 존재하며 병적인 상태를 유도 또는 촉진하는 상태이고, 원칙적으로 방어, 치료 또는 보조 면역 요법으로 다룰 수 있다. 상기는 세포외 박테리아로 고름-형성 구균(cocci)으로 가령 스타필로코커스(Staphylococcus) 및 스트렙토코커스(Streptococcus), 그람음성균으로 가령 메닌고코커스(Meningococcus) 및 고노코커스종(Gonococcusspecies), 네이스세리아종(species ofNeisseria), 장내균을 포함하는 그람음성균으로 이. 콜리(E.coli), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 슈도모나스(Pseudomonas), 디프테리아(Diptheria), 보르데텔라 페르투스시스(Bordetella Pertussis) 및 그람양성균(예를들면 바실러스 페스티스(Bacillus pestis, BCG), 특히 혐기성 균으로 가령 클로스트리듐(Clostridium)종(예를들면, 클로스트리듐 테타니(Clostridiumtetani), 클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 노비(Clostridium novyi), 클로스트리듐 셉티쿰(Clostridium septicum)); 숙주내에서 생존 및 복제할 수 있는 많은 박테리아 및 모든 바이러스; 전자의 그룹은 마이코박테리아(mycobacteria)(예를들면 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) 및 리스테리아 모노시토겐스(Listeria monocytogenes)를 포함하고, 레트로- 및 아데노바이러스로 이에 한정되는 것은 아니지만, 헵파티티스(hepatitis) 바이러스, (사람의) 면역결핍 바이러스, 헤르페스(herpes) 바이러스, 스몰팍스(small-pox), (chicken-pox), 인플루엔자(influenza), 홍역, 유행성 이하선염, 소아마비 바이러스, 시토메가로바이러스(cytomegalovirus), 리노바이러스(rhinovirus) 등, 숙주내 성장하는 다양한 균류; 기생충으로 동물기생충(원생생물 및 연충) 및 외부기생충(진드기, 진드기)을 포함한다. 또한 병원성 물질은 부르셀라종(Brucellaspecies)(예를들면 비. 멜리텐시스(B. melitensis), 비. 아보르투스(B. abortus), 비.수이스(B. suis), 비.카니스(B. canis), 비. 네오토마에(B. neotomae), 비. 오비스(B. ovis), 콜레라 병원성 물질(예를들면 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 헤모필루스종(Haemophilus) 등으로(헤모필루스 악티노마이세템코미탄스(Haemophilus actinomycetemcomitans), 헤모필루스 플레우롭네우모니애(Haemophilus pleuropneumoniae) 병을 유발하는 파라티푸스, 플라그, 광견병, 파상풍 및 풍진을 포함한다. 또한 본 발명에서의 병원성 물질은 이에 한정되는 것은 아니지만, 진핵세포 또는 종양, 자기-면역 질병 및 미생물의 감염에 의한 것이 아닌 동물 또는 사람 몸의 병적인 상태를 포함한다. 특히 특정 병원성 물질의 일부, 다양한 미생물 독소는 포린형 성질을 가지며, 결과적으로 점막층을 통과할 수 있고, 침투제 막의 가요성을 증가시킬 수 있다.

"분비" 또는 "유도"를 조합하는 "특이성"이라는 용어는 상기 화합물이 시토킨 분비 또는 유도의 수용체-매개 자극에 의해서 시토킨을 분비할 수 있는 세포와 반응하는 것을 언급한다. 상기 특이적 분비 또는 유도는 예를들면 내피 주입에 의해서 얻어질 수 있는 비특이적 분비 또는 유도와 대조되는 것이다.

"알레르기 유발원"이라는 용어는 본 발명에서 알레르기 유발원에 노출된 몸체의 목적하지 않는 면역 반응을 일으키는 동물 또는 식물원과 같은 외인성 또는 이종의 물질을 개시하는 것이다. 알레르기를 일으키는 미생물 또는 그의 일부(예를들면 진드기), 식물의 일부(예를들면 꽃가루) 또는 동물(예를들면 머리카락 또는 피부파편)을 포함할 뿐만아니라, 상기 그룹에 속하는 무기물질을 포함한다. 한편, 사람의 면역 시스템에 적당하지 않게 처리되거나 또는 노출되는 사람 몸의 일부는 자기-면역반응을 일으키고, 상기 물질에 대한 알레르기 반응을 일으킬 수 있다. 협의의 해석으로, 이러한 기술이 개시되는 경우, 알레르기 유발원은 물질, 그룹 또는 피부를 통해서 비침습성이 실시되는지의 여부에 관계없이 면역학적 치료에 의해서 감소 또는 제거될 수 있는 몸체에서 즉시 과민성 반응을 일으키는 물질의 배열을 이루는 것이다.

본 발명에서 "치료적 백신"이라는 용어는 질병이 이미 발생되었으면 병적인 상황을 개선하기위해서 또는 질병을 예방하기 위한 목적으로 일종의 치료적인 면역화를 개시하는 것이다. 상기 접종은 본 발명의 백신의 단일 또는 반복된 투여를 포함한다. 치료적 백신은 병적인 상황을 방지하거나 및/또는 치료적 상황을 개선할 것이다. 예방제로 사용되는 경우, 대개 방어적 면역 시스템을 일으킨다.

면역화는 면역반응이 치료적이거나 비치료적인 것에 관계없이 면역 반응을 일으키는 종류를 나타내는 것이다.

"항체" 또는 "면역글로불린"은 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM을 나타내고, 모든 아형으로 가령 IgA1 및 IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4를 포함한다. "그들의 유도체"라는 것은 화학적, 생화학적 및 그밖의 수득가능한 유도체로 가령 유전자조작된 항체 유도체를 포함한다. 절편은 내인성, 이형성, (반)합성적 또는 재조합의 형태에 관계없이 예를들면 단일사슬 절편, Fc-, Fab-, F(ab')₂및 Ig-s의 일부를 포함한다. 본 발명은 두개 이상의 상기에 인용된 항체, 유도체 또는 절편의 복합물로 이루어진다.

"항원"은 천연의 형태 또는 절편화 또는 유도체화에서 병원성 물질 또는 알레르기 유발원의 일부이다. 대개, 항원은 거대 분자 또는 그의 절편, 특정의 합텐 성분(예를들면 단일 탄수화물, 복합 탄수화물, 폴리사카라이드, 데옥시리보뉴클레산)을 나타내고, 요약하면, 몸의 항체에 의해서 인식되는 특정의 분자는 몸체에 투여되는 경우 항체 유발을 일으킬 수 있다.

"항원의 혼합물 및/또는 알레르기 유발원의 혼합물"이라는 용어는 본 발명에서 적어도 두개의 항원 또는 알레르기 유발원의 조합물을 의미하는 것이다. 또한 항원 및 알레르기 유발원의 혼합물은 적어도 하나의 항원 및 적어도 알레르기 유발원으로 이루어지며, 본 발명에서 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 "시토킨"이라는 용어는 시토킨으로 가령 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 및 아형으로 가령 IL-1α및 IL-1β, 종양괴사인자(TNF), 형질전환성장인자(TGF-β 및 -α), 타입 I 및 II 인터페론(IFN-α1, IFN-α2, IFN-ω, IFN-β, IFN-γ), 이동저해인자, MIF, c-kit 리간드, 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF), 단핵세포 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 화학역동물(chemokines) 뿐만아니라 상기 분자의 모든 기능적인 유도체를 포함한다.

특히 자연 면역을 매개하는 시토킨은 타입 I 인터페론(IFN-α및 IFN-β), 종양괴사인자(TNF), 인터루킨-1(IL-1α및 IL-1β), 인터루킨-6(IL-6) 및 백혈구 유도 및 활성 화학역동인자를 포함한다. 상기 방법은 항증식증(예를들면 IFN-s), 전염증성(예를들면 TNF, IL-1) 또는 공동자극성(예를들면 IL-6) 작용에 의존한다. 림프구 활성, 성장 및 분화를 매개하는 시토킨은 인터루킨 2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4) 및 형질전환성장인자(TGF)를 포함한다. 결과적으로 상기 시토킨은 표적 성장에 영향을 줄뿐만아니라 더욱이 기타 시토킨의 활성 및 제조에 영향을 주며, 상기세포는 치료적인 작용을 한다.

면역-매개 염증을 매개하고, 세포-매개 반응에 크게 의존하는 시토킨은 인터페론-감마(IFN-γ), 림프구독소(TNF-β), 인터루킨-10(IL-10), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-12(IL-12) 및 이동저해인자가 있다. 백혈구 성장 및 분화는 인터루킨-3(IL-3), c-키트 리간드, 과립구-대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF), 대식세포 또는 과립구 콜로니 자극 인자(M-CSF 또는 G-CSF) 및 인터루킨-7(IL-7)에 의해서 영향을 받는다.

여기서 사용되는 "면역보조제"는 특히 특정 형태의 항원 특이성 면역 반응을 증가시키는 예방적 처치 및 세포-매개 면역을 유지함에 의한 치료적 처치의 경우에 세포성 또는 호르몬형태의 목적하는 면역반응을 유지, 자극, 활성 또는 조절할 수 있는 물질을 나타낸다. 상기는 적당한 시토킨, 그들의 혼합물 또는 길항제의 첨가에 의해서 이루어지고, 피부에서 화학적 자극을 일으키고, 상기는 직접 또는 간접적으로 피부 또는 주변 조직으로부터 시토킨을 분비시키고, 상기 작용을 일으키는 조직내 분자의 생합성을 활성화 또는 촉진시키며, 최종의 생성물은 사용된 항원의 예방적 및/또는 치료적 작용에 의해서 접종의 성공을 증가시켰다. 유용한 시토킨 풀에 간접적으로 기여하는 면역보조제의 부류가 알레르기 유발원을 갖는 화학적 역가로 가령 특정의 알레르기 유발원 (금속) 이온, 이에 한정되는 것은 아니지만, LiCl, HgCl₂, 몰리브덴, 산, 염기 및 기타 자극 화합물로 디시클로헥실메탄-4,4'-디이소시아네이트, 디트로카브(디에틸디티오카바메이트), 2,4-디니트로클로로벤젠, 이소프리노신, 이소포론디이소시아네이트, 레바미솔, (페닐)옥사졸론 등, 스완소닌, 시조프란, 프탈산 무수물, 티모펜틴, (지방) 알콜, (지방) 아민, (지방) 에테르, 리신 또는 기타 적당한 양쪽 친매성, 많은 계면활성제 및 화학적 피부 투과 개선제 뿐만아니라 그의 유도체 또는 조합물; 또한 미생물로부터 유도된 (저분자량) 절편 또는 유도체로 리포폴리사카라이드(가령 LPS), 코드-인자(트레할로스-디마이콜레이트) 및 막에 부착된 기타 폴리사카라이드, 충분한 양이 사용되는 경우 아세틸무라밀-알라닐-이소글루타민, 및 미생물의 거대한 절편으로 박테리아 엑소- 및 엔도 독성, 또는 장독소, 가령 콜레라독소 및 이. 콜리의 열불안정 독소(HLT) 및 그들의 거대분자 절편으로, 가령 A-사슬 유도체, ADP-리보실레이트 활성을 포함하는 것, 고가능성 면역보조제 LT 홀로독소 등, 세포벽구조, 독성약화 박테리아로 가령 BCG 등을 포함한다. 예를들면 클로스트리디알 독소, 엠. 투베르쿨로시스의 정제된 단백질 유도체, LT-R192G, 스트렙토코커스 피로게네스의 피브로넥틴-결합 단백질 I, 그룹 B 네이세리아 메닌기티디스(GBOMP)의 외부막 단백질, 다양한 기타 펩티도글리칸 등을 포함한다. 즉 면역보조제는 항원의 제공을 변형할 수 있는 분자, 항원 특이성 림파구의 증식을 활성화 또는 증가시키거나 또는 피부에서 면역 반응에서 뿐만아니라 기타 면역성분 조직에서 우세한 조절 기작을 방해하는 물질을 포함한다. (ADP-리보실레이트 박테리아 장독소의 점막 보조 활성은 본 실시예에 잘 개시되어 있다). 한편, 시토킨 또는 기타 면역보조제의 (상대) 농도를 변화시키는 분자로 가령 항-면역보조제 항체 또는 면역 보조제의 기타 작용제 또는 길항제는 본 발명에서 면역보조제이다. 이는 림파구에 영향을 주는 분자이고, 가령 다양한 셀렉틴(LECAMS, 예를들면 다양한 CD62-s), GlyCAM-1, MadCAM-1, VCAM-1, ICAM-1, 히알루로네이트 등 및 기타 화학역동제로 가령 RANTES 또는 MCP-1을 포함한다. 내인성의 면역보조제는 히스타민, 전이인자, 투프신 등을 포함한다. 상기에 언급된 바와 같이, 면역보조제는 너무 낮게 비침습성 면역화후에 목적하는 효과를 유지하기위해서는 충분하지 않으며, 때때로 너무 높으면 본 연구에서 사용되는 보조제의기능적인 정의는 포티오리가 충분하고, 몸에서 시토킨의 농도 및 분포 패턴의 조절은 목적하는 치료적 또는 예방적 면역 반응을 일으킨다. 명확하게 하기위해서, 섬세한 실험으로 측정될 수 있고, 특이적 시토킨 수준이 측정된다.

"면역보조제 조작"이라는 용어는 피부의 비화학적 처치를 의미하며, 가령 피부 문지름, 압축, 가열, 전기적 또는 기계적인 노출로, 예를들면 초음파, 자기장등, 또는 피부에서 비-면역원의 배합물의 주입을 포함하며, 단 상기 처치는 피부 또는 기타 주변 면역 활성 조직으로부터 면역보조제 화합물의 분비 또는 목적하는 접종으로 길항제의 작용의 농도/기간을 감소시켜야 한다. 그러나, "면역보조제 조작"이라는 용어는 본 발명에 따르면 피부를 면역조절제 및/또는 시토킨 및/또는 시토킨 분비 인자로 특히 히스타민으로 전처리하는 것을 나타낸다.

"면역원"이라는 용어는 면역원 운반체에 결합된 합텐 또는 항원을 나타내며, 운반체에 결합되거나 또는 결합되지 않으며, 면역 반응을 유도할 수 있다.

"면역-내성"은 항원에 대한 목적하지 않는 면역 반응을 감소시키는 것을 의미한다.

항체에 관련된 Th1(T-헵퍼 세포 타입 I)은 IgG2a, IgG2b 및 IgG3를 포함한다.

항체에 관련된 Th2(T-헬퍼 세포 타입 II)는 IgG1, IgG4 및 IgE의 부류를 포함한다.

본 발명에 관련된 "물질의 두가지 형태"라는 용어는 같은 물질의 두가지의 이온화된 상태 또는 염으로, 상기 물질의 두가지 다른 착화합물을 의미한다.

"비침습성 투여" 또는 "비침습성 전달"이라는 용어는 본래의 피부를 통해서 본 발명에서의 생물학적 용도에서 본래 장벽을 통해서 사용되거나 또는 전달되는 것을 의미한다.

"침투"는 장벽을 통해서 상대적으로 다량의 양을 비-확산적으로 이동하는 것을 의미한다. 상기 방법은 장벽에서 한정된 공극으로 침투제를 적응시키는데 의존하고 공극 너비 또는 채널 개방과 같은 장벽 저항성에서 침투가 감소되지만; 그러나 상기 방법은 장벽을 가로지르는 침투제 농도 구배에 의존하는 것은 아니다.

"투과"는 반-투과성 장벽을 통한 확산 운동을 언급하는 것이다. 상기에 대한 주된 예로는 장벽을 통한 투과종 농도 구배의 영향하에서 분자 또는 분자 응집체의 전달이 있다.

결과적으로 침투제는 단일 분자 또는 분자의 배열의 단위체가 너무 크면 장벽을 통과할 수 없지만, 장벽의 한정된 통과(공극)의 형태 및/또는 직경에 적합한 침투제에 의해서 장벽을 통과할 수 있다. 상기 적합성은 예를들면 두번째로 큰 공극 직경을 갖는 침투제가 공극크기를 작게하지 않고 이중층을 통과한다는 것을 알 수 있다. 한편 투과제는 피부와 같은 반투과성 장벽을 통해서 투과할 수 있는 것이다. 외부장에서 침투제는 사용되는 장 및 침투제 크기에 비례하는 구동력을 일으키며, 자연적으로 발생하는 것이다. 본래의 차단되지 않은 피부가 각질층을 통과하는 물농도구배로부터 배향되는 것으로 사료되는 힘은 피부를 포함하는 장벽을 통한 침투제 형태를 나타내며, 상기 힘이 충분히 강하면 침투제를 변형시키고, 장벽에서의 통로를 충분히 넓혀서 크기 제한의 문제를 해결한다.

상기 복합체 가변성, 목적하는 침투제 성분 또는 선택된 제제의 작용기작 및 목록에 의한 침투제에 관련된 추가적인 정의에 있어서, 이는 등록 또는 계류중인 특허 (DE 41 07 152, PCT/EP91/01596, PCT/EP96/04526, DE 44 47 287)에 언급되어 있다. 너무 크기때문에 장벽을 통과할 수 없는 항원(거대)분자 및/또는 면역보조제를 갖춘 침투제 및 그의 제조방법에 관한 상세한 정보는 PCT/EP98/06750에서 알 수 있다.

전형적으로 운반체를 형성하는 응고물질중에서 덜 용해되는 것은 지질 또는 지질형 물질, 특히 극성 지질이 있고, 반면에 현탁액내 더 잘 용해되고, 소적 적합성이 증가되는 물질은 계면활성제를 포함하고, 계면활성제형 성질을 갖는다. 전형적으로 전자의 성분은 생물학적 공급원 또는 상응하는 합성 지질 또는 그의 특정 변형체로부터의 지질 또는 지질형 물질이고, 상기 지질은 종종 하기 화학식 1의 구조를 갖는 순수한 인지질의 부류에 속한다:

(상기 화학식 1에서, R₁및 R₂는 지방족 사슬로, 전형적으로 C_10-20-아실, 또는 -알킬, 또는 부분적으로 불포화된 지방산 잔기, 특히 올레오일-, 팔미토엘로일-, 에라이도일-, 리놀레일-, 리놀레닐-, 리놀레노일-, 아라키도일-, 바시닐-, 라우로일-, 미리스토일-, 팔미토일- 및 스테아로일 사슬이 있고, R₃은 수소, 2-트리메틸아미노-1-에틸, 2-아미노-1-에틸, C_1-4-알킬, 카르복시로 치환된 C_1-5-알킬, 히드록시로 치환된 C_2-5-알킬, 카르복시 및 히드록시로 치환된 C_2-5-알킬, 또는 카르복시 및 아미노기로 치환된 C_2-5-알킬, 이노시톨, 스핀고신, 또는 상기 물질의 염이 있고, 상기 지질은 황- 또는 탄수화물을 포함하는 지방의 글리세리드, 이소프레노이드 지방, 스테로이드, 스테린 또는 스테롤, 또는 지방을 형성하는 기타 이중층, 특히 반 양성화된 유체 지방산을 포함하며, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 포스파티딜세린, 스핀고미엘린 또는 기타 스핀고포스포리피드, 글리코스핀고리피드(세레브로사이드, 세라마이드폴리헥소사이드, 설파티드, 스핀고플라스마로겐), 간글리오사이드, 또는 기타 당지질 또는 합성 지질, 특히 상응하는 시핀고신 유도체 또는 기타 당지질의 그룹으로부터 선택되고, 두개의 유사하거나 또는 다른 사슬은 주사슬에 대해 에스테르화할 수 있거나(디아실 및 디알케노일 화합물에서) 또는 에테르 결합을 갖는 주사슬(디알킬-지방에서)에 부착될 수 있다.

보통 사용되는 계면활성제는 비이온성, 양쪽이온성, 양이온성 또는 음이온성, 특히 지방산 또는 -알콜, 알킬-트리/디/메틸-암모늄염, 알킬설페이트염, 콜레이트의 일가염, 데옥시콜레이트, 글리코콜레이트, 글리코데옥시콜레이트, 타우로데옥시콜레이트, 타우로콜레이트 등, 아실- 또는 알카노일-디메틸-아미녹사이드, 특히 도데실- 디메틸-아미녹시드, 알킬- 또는 알카노일-N-메틸글루카미드, N-알킬-N,N-디메틸글리신, 3-(아실디메틸암모니오)-알칸설포네이트, N-아실-설포베타인, 폴리에틸렌-글리콜-옥틸페닐 에테르, 특히 노나에틸렌-글리콜-옥틸페닐 에테르, 폴리에틸렌-아실 에테르, 특히 노나에틸렌-도데실 에테르, 폴리에틸렌-글리콜-이소아실에테르, 특히 옥타에틸렌-글리콜-이소트리데실 에테르, 폴리에틸렌-아실 에테르, 특히 옥타에틸렌도데실 에테르, 폴리에틸렌-글리콜-소르비탄-아실 에스테르, 가령 폴리에틸렌글리콜-20-모노라우레이트(Tween 20) 또는 폴리에틸렌글리콜-20-소르비탄-모노올레이트(Tween 80), 폴리히드록시에틸렌-아실 에테르, 특히 폴리히드록시에틸렌-라우릴, -미리스토일, -세틸스테아릴, 또는 -올레오일 에테르, 가령 폴리히드록시에틸렌-4 또는 6 또는 8 또는 10 또는 12 등, -라우릴 에테르(Brij계) 또는 상응하는 에스테르로, 예를들면 폴리히드록시에틸렌 8-스테아레이트(Myrj 45), 미리스테이트-, -라우레이트, 리놀레이트-, 리놀레네이트-, 팔미톨레에이트-, 또는 -올레이트형, 또는 폴리에톡실화 캐스터오일 40, 소르비탄-모노알킬레이트(예를들면 Arlacel 또는 Span), 특히 소르비탄-모노라우레이트, -미리스테이트, -리놀레에이트, -리놀레네이트-, 팔리미톨레에이트-, 또는 -올레에이트, 아실- 또는 알카노일-N-메틸글루카미드, 특히 데카노일- 또는 도데카노일-N-메틸글루카미드, 알킬-설페이트(염), 예를들면 라우릴-, 미리스토일-, 팔미토일-, 올레오일-, 팔미톨레오일-, 리놀레닐-, 리놀레오일-, 박시닐-, 또는 에라이도일-설페이트, 소듐 디옥시콜레이트, 소듐 글리코데옥시콜레이트, 소듐 올레이트, 소듐 타우레이트, 지방산염, 바람직하게는 상기에 기술된 바와 같은 지방산 사슬로, 리소포스포리피드, 가령 n-옥타데실렌(=올레오일)-글리세로포스파티드사, -포스포릴글리세롤, 또는 -포스포릴세린, n-아실, 예를들면 라우릴, 미리스토일, 팔미토일, 올레오일-, 팔리톨레오일-, 에라이딜-, 박시닐-, 리놀레일-, 리놀레닐-글리세로-포스파티드산, -포스포릴글리세롤 또는 -포스포릴세린 또는 상응하는 짧은 이중결합사슬 인지질로 가령 도데실-포스파티딜 콜린 또는 계면활성 폴리펩티드가 있다. 그러나 기타 양쪽성 원자를 갖는 극성 지질의 복합물은 운반제의 코팅제에서 계면활성제의 역할을 하고, 다른 이온화 또는 극성 지방의 염 상태는 그들의 성질에 있어서 크게 구별된다. 그러므로 막에서 함께 혼합된 같은 (극성) 지질의 두개의 다른 생리화학적 상태들은 상기 연구의 조건을 만족시키는 높은 가변성 운반체를 제조할 것으로 사료된다.

지질 현탁액에서 일반적인 정보는 'Liposomes'(Gregoriadis, G., Hrsg., CRC Press, Boca Raton, Fl., Vols 1-3, 1987)를 다루는 핸드북 및 'Liposomes as drug carriers'(Gregoriadis, G., Hrsg., John Wiley & Sons, New York, 1988) 또는 실험 메뉴얼인 'Liposomes, A Practical Approach'(New, R., Oxford-Press, 1989)에 개시되어 있다. 생체-적합성 면역침투제를 제조하는데 사용될 수 있는 인지질의 성질은 'Phospholipids Handbook'(Cevc, G., ed., Dekker, New York, 1995)에 개시되어 있다.

배합물의 pH값은 제조직후 또는 사용직전에 조절하는 것이 편리할 수 있다. 상기 조절은 생리학적 적합성을 손상시키지 않고 초기 pH의 조건하에서 개개의 시스템 성분 및/또는 약물 운반체의 악화를 방지할 수 있다. 침투제 현탁액을 중화하기위해서, 3 내지 12사이의 pH 값, 종종 5 내지 9의 pH값, 특히 6 내지 8의 pH 값을 갖는 완충액을 제조하는데 생체적합성 산 또는 염기를 사용할 수 있다. 생리학적으로 허용가능한 산은 예를들면 희석된 수성 용액의 무기산으로 가령 염산, 황산, 또는 인산, 또는 유기산으로 가령 카르복시알칸산으로 예를들면 아세트산이 있다. 생리학적으로 허용가능한 염기로 예를들면 희석된 수산화나트륨, 적당하게 이온화된 인산등이 있다.

필요하다면, 면역원 현탁액은 사용전에 희석되거나 또는 농축될 수 있다(예를들면 초원심분리 또는 초-여과); 첨가제는 또한 이때 또는 그 전에 현탁액으로 첨가된다. 상기 첨가제는 종종 배합물에서 주위 응력에 대한 민감성을 감소시키는 물질중에서 선택될 수 있고, 예를들면 살생제, 항산화제, 목적하지 않는 효소작용의 길항제, 냉동보존제, 증점제 등을 포함한다. 그러나 시스템을 조작한 후에, 운반체 특징을 확인하고, 필요하다면 재조절한다.

본 발명에 있어서, 여기에 기술되어 있는 초가변성 지방응고제와 결합된 거대분자 항원(면역 침투제)은 상기 침투제의 평균직경이 평균 공극/채널 직경을 초과하더라도 인공의 공극 장벽 뿐만아니라 피부를 가로지르고, 상기 면역-침투제는 치료적 또는 예방적 면역 반응을 나타내고, 단 상기 면역-침투제는 시토킨 활성을 나타내거나 또는 피부로부터 시토킨의 분비를 유도하거나 및/또는 몸에서 기타 면역성분 기관을 분비하는 화합물과 결합되어야 한다. 선택적으로 상기 화합물은 시토킨의 활성에 반대로 작용한다. 상기 후자는 각각의 다른 경로를 차단함에 의해서 Th1 또는 Th2 의존성 면역 반응으로 면역 반응이 유익하게 연결된다. 본 발명에서 기술된 항원 운반체는 처리전 및 처리되는 동안에 충분히 안정성을 유지한다. 또한 생성된 면역반응은 사용되는 투여량에 직접적으로 비례하지 않으며, 이는 항원의 양이 변화될 수 있다는 것을 의미한다. 상기 양은 적당한 효과를 내도록 선택된다. 항원의 적정양 또는 범위는 본 명세서에 개시된 내용을 고려하여 당분야의 통상의 지식을 가진 자는 선택할 수 있다.

본 발명의 백신에서 운반체로 사용되는 적어도 이성분 면역-응고제는 높은 가변성에서 우수하고, 높은 가요성 막을 갖는 운반체의 형태를 갖는다. 비록 상기 운반체가 면역 시험전에 사용되어 질 수 있다고 하더라도, 이전에 가정된 운반체인 면역보조제는 시토킨 활성을 갖는 화합물을 포함하거나 또는 거기에 적당한 길항제로, 바람직하게는 IL-4, IL-10, TGF-β, IL-5, IL-6, IL-9 및 IL-13을 포함하는 것 또는 T-세포 수용체의 예비자극후, IL-1을 포함할 필요성이 제거되지 않아서, 목적하는 방어 면역 반응을 이룰수 있다고 기대되지 않는다. 상기에 의하면, IL-12, IFN-γ 및 림프독(LT 또는 TNF-β)은 Th1 반응을 촉진하고, 세포-매개 면역반응을 유익하게 하며, 바이러스 및 기타 기생충병을 치료하거나 또는 면역-내성을 촉진하는 것을 포함한다. 예를들면 IFNγ, IL-12 및 항 IL-4의 조합물 또는 단순하게 IL-12의 첨가는 Th2 반응을 Th1형태로 역전시킬 것으로 기대된다. 넓은 의미로는 전자에서 면역반응 초기에 IL-12 및 IL-4의 상대량을 증가시키는 것은 침투제 매개 면역화의 경우에 Th1 반응을 촉진시키는데 유용하다고 제시된 반면에, IL-2는 NK 및 B 세포 성장을 유지하여 항체의 합성을 자극하고, 일반적으로 T-세포 의존성 면역 반응의 크기에 영향을 준다. 이와 같이 항체 역가가 항원 및 선택적으로 면역보조제가 조합된 적당한 운반체를 사용하여 유도될 수 있다는 것이 종래에 입증된 반면에, 얻어진 면역반응은 방어적이라는 것을 입증하지는 못했다.

본 발명의 특정 잇점은 본 발명에서 기술된 침투제의 전달은 피부내에서 시토킨 조성물의 필수적인 방해를 이끌어내지 않는다는 사실에 있다. 즉, 피부를 통한 상기 운반체의 전달은 시토킨의 필수적인 분비를 유도하지 않을 것이다. 그러므로 상기 시토킨을 방출하는데 적당한 피부내 세포 또는 기타 기관으로부터 시토킨을 특이적으로 유도 또는 분비하는 화합물이 본 발명의 백신으로 포함됨에 의해서 목적하는 면역 반응을 유발시키는 것이 현재 연구되고 있다. 이와 같이 목적하는 면역 반응의 동조가 가능하다. 선택적으로 시토킨의 활성을 갖거나 또는 발휘하는 화합물은 본 발명의 백신으로 포함될 수 있다. 또한, 시토킨 활성의 길항제는 상기 시토킨의 작용을 특이적으로 저해하는데 사용될 수 있다. 상기 구체예에서, 면역 반응은 유익하게 Th1 또는 Th2 경로로 직접 이어진다. 상기 화합물은 항원성질에 의존하여 시토킨을 특이적으로 유도 또는 분비시키는 것이 중요하다. 이와같이 본 발명에 따르면, 이들은 면역 반응을 비특이적이고, 넓게 유지하는 보조제와는 구별된다.

그러므로 결론적으로 본 발명의 백신의 사용은 제공된 항원에 대해서 목적하는 면역 반응을 미세하게 동조하는 성질이 제공된다. 상기 면역 반응은 예를들면 보조제에 의해서 유발되는 비특이적 면역반응에 의해서 향상될 수 있다. 면역반응을 미세하게 동조시키는 선택은 특히 오직 백신의 주입만을 사용하는 종래기술보다 특히 유용하여 이의 주입 방법은 피부에서 상대 시토킨 농도를 비특이적으로 방해하기 때문이다.

상기에 언급된 것을 고려하여, 피부의 세포 및 주변 면역시스템으로 (운반체에 의해서) 적당한 형태의 면역제공의 기초를 제공할 뿐만아니라, 인체에 항원-중화 항체를 우세하게 발생시키는 면역처리를 보충하여 세포-매개 면역 반응을 일으키거나 또는 세포-매개 면역의 특이적 촉진에서 또는 항원에 대항하는 점차적인 내성을 일으킨다.

본 발명에 따르면, 비침습성 피부통과 접종은 면역-침투제(항원 운반체) 조성물에 의해서 크게 영향을 받는다는 것을 알았다. 다른 순도의 항원을 사용하면, 예기치 못하게 매우 다른 면역 반응을 일으킨다. 상기는 유사한 전체 역가를 갖는 생물체가 다른 최종 항원 이소타입 패턴에 의해서 방어의 분화수준을 나타낸다는 관찰을 반영하였다.

또한, 종래 뿐만아니라, 저분자량 면역 보조제, 모노포스포릴 리피드 A는 이미 알려져 있는 측정된 항체역가에서 더 작은 표준편차에 의해서 더 강한 피부외층 면역화의 결과를 낸다. 또한 면역 운반체에서 면역보조제를 사용하여, 쥐에서 얻어진 것과는 반대로, IgG2b의 분비가 증가되고, IgG2a는 덜 강하지만, IgA제조를 향상시키지는 못했다. IgG1의 존재에서, Th1-형 면역글로불린은 적어도 쥐에 있어서, 파상풍균 독소에 대항하는 방어에서 필수적이며, 지방 A의 역할 또는 박테리아의 항원이 먼저 알려져 있다. 미래에 의학적 및 상업적인 용도에 있어서, 본 발명에 개시된 기술을 사용하여 양호한 방어 결과를 나타내지 않는 높은 (특이성) 항체 역가가 중요하며, 충분한 방어를 제공하고, 상대량의 항체 이소타입이 요구되고, 이는 우세하게 면역 반응의 Th1- 또는 Th2-형을 제공할 것이다.

소망하는 목표를 이루는데 적당한 기본적인 배합물이 당분야에 공지되어 있다: 예를들면 더 상세한 보충적인 정보가 DE 41 07 152, PCT/EP91/01596, PCT/EP96/04526, DE 44 47 287에 기술되어 있다. 본 발명의 백신은 예방적 또는 치료적인 접종에 유용하지는 않지만, 사람 및 가축용 의약품에서 세포외 및 세포내 박테리아, 바이러스 및 기생충을 포함하는 미생물에 대항하는 면역을 얻기위해서 및 알레르기를 치료하기위해서 사용될 수 있다.

상기에 언급된 침투제와 조합하여, 면역활성 물질과 같은 항원이 전자와 함께 물리적 또는 화학적 복합물의 형태로 장벽을 가로질러 전달된다.

피부에 남아있는 시토킨의 풀로부터 잇점을 위해서, 특히 접종의 유용한 방법은 면역원이 상기에 정의된 바와 같은 면역보조제 조작에 의해서 기관이 전처리된 후에 피부에 도포된다.

특히 상기 언급된 국부 면역 반응으로부터 부가적인 알레르기 유발원 투여의 과정을 최적화하기위한 패치평가에 해독을 이용하고, 치료적 또는 예방적 접종에 우수한 영향을 준다. 상기의 접근 방식은 사용된 알레르기 유발원에 대해 피험물의 면역-내성을 향상시키는데 사용될 수 있는 것으로 사료된다.

1차 면역화가 침습적으로 사용된다면, 전형적으로 피하주입 또는 기타 적당한 피부 장벽 천공/분해 방법을 사용함에 의해서, 높은 IgM의 수준을 얻을 것으로 사료되지만, 연속적으로 추가투여 면역화는 본 발명에 기술된 바와 같이 비침습성으로 실시될 수 있다.

마지막으로, 높은 변형성 침투제에 근거한 면역원 및 접종을 개선하는데 사용될 수 있는 몇가지 최적화 방법이 제시되었다. 잘-정의된 장벽에서 다양한 공극을 통과하는 면역원과 조합된 침투액의 흐름이 장벽을 통과하는 적당한 구동력 또는 압력 작용에 의해서 결정되며, 그리고 상기 데이타는 배합물 또는 사용방법을 최적화하는데 사용되는 특징적인 곡선에 의해서 개시되었다. 그의 핵심은 장벽을 통과하는 작용인 적당한 구동력 또는 압력의 함수로서 잘 정의된 장벽에서 공극을 통해서 면역침투제의 흐름의 측정에 있으며, 특징적인 곡선에 의해서 생성된 데이타 분석은 다른 데이타 세트와의 비교에 근거하여 배합물 또는 사용을 최적화하는데 사용될 수 있다. 상기는 Cevc et.al.(1998, op.cit.)에 의한 예에서 기술된 바와 같이 공지된 피부 침투 능력의 면역원이 없는 침투 현탁액을 포함하는 결과와의 비교를 포함한다. 보충적으로, 바람직하고, 구체적인 다양한 면역조절제 또는 면역조절 과정이 Th1- 또는 Th2-관련된 시토킨 제조에 있어서 시험되고, 그리고 상기 결과가 최종의 치료적 또는 예방적 사용을 위해서 적당하게 선택되어 사용된다.

접종은 전형적으로 실내온도에서 실시되지만, 그러나 다소 높은 온도가 또한 적당할 수 있다. 이들은 방과 피부 또는 기타 장벽 온도 사이가 견고한 합성 물질로 이루어진 배합물임을 알 수 있다.

제조온도는 통상 0 내지 95℃범위에서 선택된다. 바람직하게 작업 온도는 특정의 중요한 배합성분이 조성 또는 물리적 상태에서 비가역적으로 변화될 수 있는 온도 보다 낮은 모든 환경에서 10-70℃이고, 더 바람직한 온도는 15℃ 내지 45℃사이이다. 피부 온도는 통상 32℃이다. 그러나 동결되거나 또는 비휘발성 성분, 냉동- 또는 열안정성 배합물 등을 포함하는 시스템에 대해서 기타 온도 변화가 가능하다.

개개의 시스템 성분의 무결성 및 목적하는 성질을 유지하고 싶다면, 운반체 배합물은 항원과 결합되거나 또는 결합되지 않고 냉장(예를들면 4℃)에서 보관할 수 있다. 비활성 대기, 예를들면 질소하에서 제조 및 저장은 가능하며, 때때로 적당하다. 면역원 배합물의 반감기는 작은 수의 이중결합을 갖는 물질을 사용함에 의해서, 즉 낮은 불포화도에 의해서, 항산화제, 킬레이트제 및 기타 안정화제의 첨가에 의해서, 또는 동결건조 또는 건조 혼합물로부터 특별히 또는 원위치에서 면역-침투제를 제조함에 의해서 연장될 수 있다.

본 발명에 따른 백신의 바람직한 구체예에서, 시토킨 또는 항-시토킨 활성 및 항원을 갖는 분자를 특별히 분비 또는 특별히 유도하는 화합물은 침투제와 결합된다.

본 발명에 따른 추가적인 바람직한 구체예에서, 덜 가용성인 반-응고 분자는 극성 지질이고, 더 가용성인 성분은 계면활성제 또는 계면활성제형 분자 또는 본 발명의 목적을 위해서 충분히 용해될 수 있는 극성 지질의 형태이다.

본 발명에 따른 백신의 추가적인 바람직한 구체예에서, 침투제의 평균직경은 30nm 내지 500nm사이이고, 바람직하게는 40nm 내지 250nm사이이며, 더 바람직하게는 50nm 내지 200nm사이이고, 특히 바람직하게는 60nm 내지 150nm사이이다.

하나의 추가적인 바람직한 구체예에서 본 발명은 백신에 관한 것으로서, 사람 또는 동물의 피부에 사용하기위한 배합물에서 소적의 전체 중량은 전체 질량의 0.01중량%(w-%) 내지 40w-%이고, 특히 0.1w-% 내지 30w-%이고, 더 바람직하게는 5w-% 내지 20w-% 사이이다.

본 발명에 따른 백신의 또 다른 바람직한 구체예에서, 전체 항원농도는 전체 침투제 질량의 0.001w-% 내지 40w-% 사이이고, 특히 0.01w-% 내지 30w-% 사이이며, 더 바람직하게는 0.1w-% 내지 20w-%사이이고, 더욱 바람직하게는 0.5w-% 내지 10w-% 사이이다.

본 발명에 따른 백신의 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 배합물은 추가적으로 (da)저분자량의 화학적 자극제 및/또는 (db)그의 병원성 물질 또는 절편 또는 유도체로부터의 저분자량 화합물로 이루어진다.

본 발명에 따른 백신의 또 다른 바람직한 구체예에서, 시토킨 활성을 발휘하는 화합물은 IL-4, IL-3, IL-2, TGF, IL-6, IL-7, TNF, IL-1α및/또는 IL-1β, 타입 I 인터페론, 바람직하게는 IFN-α 또는 IFN-β, IL-12, IFN-γ, TNF-β, IL-5 또는 IL-10이 있다.

본 발명에 따른 백신의 바람직한 구체예에서, 항-시토킨 활성을 나타내는 화합물은 항-시토킨 항체 또는 상응하는 활성 절편, 그의 유도체 또는 유사체가 있다.

상기에서 "그의 활성 절편 또는 유도체"라는 용어는 상기에 인용된 활성이 사용되는 물질에 의해서 필수적으로 유지되거나 또는 유사한 것을 의미한다.

본 발명에 따른 백신의 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 항원은 병원성 물질로부터 유도된다.

본 발명에 따른 백신의 특히 바람직한 구체예에서, 상기 병원성 물질은 세포외 박테리아로 고름-형성 구균(cocci)으로 가령 스타필로코커스(Staphylococcus)및 스트렙토코커스(Streptococcus), 그람음성균으로 가령 메닌고코커스(Meningococcus) 및 고노코커스종(Gonococcusspecies), 네이스세리아종(species ofNeisseria), 장내균을 포함하는 그람음성균으로 이. 콜리(E.coli), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 슈도모나스(Pseudomonas), 디프테리아(Diptheria), 보르데텔라 페르투스시스(Bordetella Pertussis) 및 그람양성균(예를들면 바실러스 페스티스(Bacillus pestis, BCG), 특히 혐기성미생물로, 클로스트리듐종으로 (예를들면, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 노비(Clostridium novyi), 클로스트리듐 셉티쿰(Clostridium septicum)); 숙주내에서 생존 및 복제할 수 있는 박테리아 및 바이러스; 마이코박테리아(mycobacteria)(예를들면 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) 및 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes)를 포함하고, 레트로- 및 아데노바이러스로, 헵파티티스(hepatitis) 바이러스, (사람의) 면역결핍 바이러스, 헤르페스(herpes) 바이러스, 스몰팍스(small-pox)(chicken-pox), 인플루엔자(influenza), 홍역, 유행성 이하선염, 소아마비 바이러스, 시토메가로바이러스(cytomegalovirus), 리노바이러스(rhinovirus) 등, 숙주내 성장하는 균류(fungi); 기생충으로 동물기생충(원생생물 및 연충) 및 외부기생충(진드기, 진드기)을 포함하며, 또는 부르셀라종(Brucellaspecies)(예를들면 비. 멜리텐시스(B. melitensis), 비. 아보르투스(B. abortus), 비.수이스(B. suis), 비.카니스(B. canis), 비. 네오토마에(B. neotomae), 비. 오비스(B. ovis), 콜레라 병원성 물질(예를들면 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 헤모필루스종(Haemophilus) 등으로 헤모필루스 악티노마이세템코미탄스(Haemophilus actinomycetemcomitans), 헤모필루스 플레우롭네우모니애(Haemophilus pleuropneumoniae), 병을 유발하는 파라티푸스, 플라그, 광견병, 파상풍 및 풍진을 포함하며, 다양한 종양, 자기-면역 질병을 일으키고, 병원성 물질의 감염에 의한 것이 아닌 동물 또는 사람 몸의 기타 병적인 상태에 관련된 병원성 물질으로 이루어진 그룹에서 선택된다.

본 발명에 따른 백신의 바람직한 구체예에서, 알레르기 유발원은 알레르기 유발원, 진드기, 꽃가루, 동물의 털 또는 피부 파편에 인체가 노출되어 급성 과민성 반응을 이끄는 미생물, 동물 또는 식물로부터 유도되는 이종성 또는 외인성의 것이며, 무기물질을 만들거나 및/또는 자극하는 사람의 그룹, 또는 인체 면역 시스템에 적당하지 않게 처리되거나 또는 노출되는 인체의 성분을 포함한다.

본 발명에 따른 추가적인 바람직한 구체예에서, 사용된 시토킨 활성을 나타내는 각 화합물의 농도는 선택된 항원 및 면역보조제로 상응하는 시험에서 이루어진 적정 농도는 배합물의 피하주입 또는 시험관내에서 시험을 실시함에 의해서 1000배 미만, 바람직하게는 100배 미만, 종종은 50배 미만, 더 바람직하게는 20배 미만으로 더 높은 것이 선택된다.

본 발명에 따른 백신의 다른 바람직한 구체예에서, 병원성 물질 추출물 또는 화합물은 병원성 물질의 면역 활성막의 일부와 동일하거나 또는 유사한 리포폴리사카라이드, 코드-인자(트레할로스-디마이콜레이트), 무라밀 디펩티드 또는 기타 (폴리)사카라이드 또는 (폴리)펩티드; 세균성 엑소- 또는 엔도톡신을 포함하는 병원성물질, 바람직하게는 콜레라 독소 또는 이. 콜리의 열불안정 독소(HLT), A-사슬 유도체, ADP-리보실레이트 활성을 갖는 성분, 펩티도글리칸, 클로스트리디알 독소, 또는 엠. 투베르쿨로시스의 정제된 단백질 유도체, LT-R192G, 스트렙토코커스 피로게네스의 피브로넥틴-결합 단백질 I 또는 그룹 B 네이스세리아 메닌기티디스(GBOMP)의 외막 단백질; 또는 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 같은 박테리아 또는 바이러스 핵산을 포함한다.

본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 상기 리포폴리사카라이드는 지방 A 또는 그의 유도체 및 변형체로 가령 모노포스포릴 지방 A, 또는 그의 유사물로, 가령 사카로스의 지방 유도체가 있다.

본 발명에 따른 백신의 특히 바람직한 구체예에서, 병원성 물질으로부터 유도되는 병원성 물질 화합물의 농도는 유사한 항원을 사용하는 상응하는 주입 배합물로 사용하는 것보다는 10배 미만 내지 1000배 미만으로 더 많으며, 피부외층 투여 면역 보조제 농도는 0.5 내지 100, 또는 1 내지 50 사이, 더 바람직하게는 2 내지 25 사이의 주입되는 면역보조제 농도와 구별된다.

본 발명에 따른 백신의 특히 바람직한 구체예에서, 저분자량의 자극제는 알레르기 유발원 금속이온, 산, 염기, 자극 유체, (지방-) 알콜, (지방-) 아민, (지방-) 에테르, (지방-) 설포네이트, -포스포네이트 등, 또는 적당한 용매 또는 양쪽성 이온 또는 계면활성제형 분자의 그룹으로부터, 종종 피부 투과를 개선하는 물질 뿐만아니라 그의 유도체 또는 조합물로 이루어진 부류에서 선택된다.

본 발명에 따른 백신의 바람직한 구체예에서, 저분자량 자극제의 농도는 같거나 상응하는 피험물에서의 독립적인 실험에서, 상기 자극제를 시험하기위해서 사용되는 통상의 방법 및 기준에 의해서 평가되는 바와 같이 국부적인 자극때문에 허용될 수 없는 농도 미만에서 적어도 2의 인자, 종종 5의 인자, 바람직하게는 10 이상의 인자에서 선택된다.

본 발명에 따른 백신의 특히 바람직한 구체예에서, 상기 알레르기 유발원은 흡입성 알레르기 유발원으로 다양한 꽃가루, 포자, 동물 털, 피부, 가죽, 천연 및 합성 직물의 파편, 밀, (집)먼지로, 진드기; 음식 및 약물 알레르기 유발원; 접촉 알레르기 유발원; 주입, 침습 및 축적소 알레르기 유발원으로 다양한 (위장-거주) 벌레, 에치노코시(echinococci), 선모충 등, 이식물질의 일부등의 부류를 포함한다.

본 발명에 따른 백신의 바람직한 구체예에서, 사용된 항원의 투여량은 면역화 방법에서 주입되는 투여량과 0.1 내지 100의 차이를 보이지만, 종종 0.5 내지 50 사이의 범위, 더 바람직하게는 1 내지 20 사이, 이상적으로는 주입에 사용되는 것보다 10배 이상으로 적다.

본 발명에 따른 백신의 또 다른 바람직한 구체예에서, 사용된 침투제의 투여량은 0.1mg/㎠ 내지 15mg/㎠ 사이, 종종 0.5mg/㎠ 내지 10mg/㎠ 사이, 바람직하게는 1mg/㎠ 내지 5mg/㎠ 사이이다. 또한 목적을 위해서 보호된 인체 영역을 사용하여(가령 가슴 또는 등 영역, 팔, 목의 측면으로 예를들면 귀의 뒤쪽, 머리영역) 면역원 투여량을 조절하기위해서 다른 투여 면적을 사용하는 것이 유익하다.

본 발명에 따른 백신의 다른 바람직한 구체예에서, 상기 항원은 순수하고 정제된 항원이다. 본 발명의 백신에서 높게 정제된 항원의 사용은 방어 면역반응을 발생시키는데 특히 유익하다.

본 발명은 또한 병에 담거나 또는 포장된 형태로 적어도 하나의 백신으로 이루어진 키트에 관한 것이다.

본 발명에 따른 바람직한 구체예에서, 상기 키트는 상기에 기술된 적어도 하나의 주입가능한 항원 투여량으로 이루어져 있다.

본 발명은 또한 상기에 기술된 백신으로 포유류에 접종하여 포유류에서 방어 면역 반응을 발생시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방법의 또 다른 바람직한 구체예에서, 다른 치료영역은 사용된 면역원 투여량 및 치료적 접종을 조절하도록 선택된다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예에서, 항원이 없는 침투제의 현탁액은 투여 하루전, 바람직하게는 피부에 생성된 배합물의 투여 360분전에, 더 바람직하게는 60분전에 및 더욱 바람직하게는 30분전에 항원과 결합되도록 한다.

본 발명에 따른 방법의 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 백신은 면역보조제 조작에 의해서 기관을 전처리한 후에 피부에 사용되고, 상기 조작은 예를들면 피부 마찰, 압착, 가열, 전기 또는 기계에 노출로, 예를들면 초음파장 등, 또는 피부에 면역원이 아닌 배합물을 주입하는 것을 포함하며, 단 특정의 처치는 목적하는 접종에 대한 길항작용의 농도/기간을 감소시키거나 또는 피부 또는 주변의 면역-활성 조직으로부터 면역보조제 성분을 분비해야 한다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예에서, 면역원이 흡장되지 않는 패치에 가해진다. 상기 구체예는 또한 침투제 현탁액에서 피부외층 투여된 면역원에 대한 피부반응을 평가하는데 사용될 수 있고, 전자는 적어도 알레르기 유발원이고, 생성된 피부의 붉어짐, 자극 등에서 볼 수 있는 바와 같이 급성의 국부적인 과민성 반응을 일으킨다.

본 발명에 따른 방법의 또 다른 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 백신이 투여된다.

본 발명의 방법의 구체예는 본 발명의 백신의 반복적인 투여를 포함한다. 반복된 투여는 경구 투여와 같이 피부에 한번 이상의 투여 또는 피부에 반복된 투여를 포함한다. 상기에서, 본 발명의 키트는 본 발명의 백신으로 이루어진 하나 이상의 용기 또는 앰플로 이루어진 것을 유익하게 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 특히 바람직한 구체예에서, 상기 백신이 추가로 투여된다.

본 발명에 따른 방법의 가장 바람직한 구체예에서, 1차 면역화가 피하 주사 또는 다른 적당한 피부 장벽 천공/파괴 방법을 사용하여 침습적으로 사용되고, 연속적으로 적어도 한번의 추가투여 면역화가 비침습적으로 실시된다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 백신이 알레르기 유발원이 아닌 항원이 사용되는 경우 2배 내지 10배, 바람직하게는 2배 내지 7배, 더 바람직하게는 5배 미만, 더욱 바람직하게는 3배미만으로 가하고, 또는 알레르기 유발원인 경우에 목적하는 면역-내성을 이루는데 요구되거나 또는 감염을 막는데 요구되는 양이 사용되고, 적당한 평가 방법에 따라 측정될 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 특히 바람직한 구체예에서, 연속적인 접종들사이의 시간 간격은 2주 내지 5년 사이, 종종 1달 내지 3년 사이, 더 자주는 2달 내지 1.5년사이로 선택된다. 또한 바람직한 구체예에서, 반복된 면역원 투여는 치료적 백신의 최종 효과를 최대화한다. 비-알레르기 유발원이 사용되는 경우 2번 내지 10번, 종종 2번 내지 7번, 전형적으로 5번미만, 더 바람직하게는 3번 미만의 면역화를 사용하는 것이 제시되었고, 알레르기 유발원의 경우, 상기에서 기술된 것과 같이 측정하거나 또는 다른 적당한 평가 방법에 의해서 목적하는 면역-내성을 이루는데 요구되는 수이다. 연속된 접종들 사이에서 시간간격은 피험자가 첫번째 접종으로 면역화되는 경우에 바람직하게 2주 내지 5년, 종종은 1달 내지 3년미만, 더 바람직하게는 2달 내지 1.5년 사이이다. 쥐와 같은 설치류 및 토끼가 2주 간격으로 면역화되고, 원숭이 및 종종 사람과 같은 영장류는 3-6달 간격으로 추가접종이 요구된다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예에서, 잘 정의된 장벽에서 다양한 공극을 통해서 면역원을 운반하는 침투제의 흐름이 장벽을 가로지르는 적당한 구동력 또는 압력의 함수로 측정되고, 상기 데이타는 배합물을 최적화하고 또는 추가적인 사용을 최적화하는 특징적인 곡선에 의해서 편리하게 개시되었다.

본 발명은 최종적으로 방어 또는 관용원(tolerogenic)의 면역 반응을 유발하는 백신을 제조하는데 피부통과 운반체, 시토킨 또는 항-시토킨 활성을 특이적으로 분비 또는 특이적으로 유도하거나 또는 활성을 발휘하는 화합물, 및 항원 또는 알레르기 유발원, 및 선택적으로 미생물 또는 절편 또는 그의 유도체로부터의 추출물또는 화합물 및/또는 저분자량의 화학적 자극제의 용도에 관한 것이다.

도 1은 매우 불안정한 트랜스퍼좀(transfersome)이 보통 혼합형 지방 미셀로 분해되기 때문에, 응고물 크기(안정성) 효과를 설명하기위해서 TT를 가진 혼합된 미셀 또는 트랜스퍼좀으로 피부외층으로 면역화된 동물의 생존데이타를 나타내고;

도 2는 TT를 운반하는 초가변성 지방 운반체(트랜스퍼좀) 및 종래의 지방 운반체(리포좀)에 대한 면역반응들을 비교하고, 피부에 가하고, 혈청에서 해당하는 특정 항체 농도에 대한 정보(흡수도로 표시됨)가 오른쪽에 제공되며;

도 3은 트랜스퍼좀에 의한 피부외층 면역화에 있어서 항원 투여량의 증가효과를 나타내고, 상기 결과는 흡수도 변화, 항체 역가 또는 동물 생존율과 함께 상응하는 특정 항체 이소타입 데이타로 표현되며;

도 4는 동물의 생존율의 시간 의존성에 대한 정보를 포함하고 트랜스퍼좀내 파상풍균 독소로 피부외층 면역화의 결과에 있어서 항원 순도의 효과를 나타내고;

도 5는 동물의 생존율, 혈청농도(흡수도로), 특정 항체 역가 및 항체 분포 패턴값을 포함하여 트랜스퍼좀내 TT에 의해서 반복되는 침습성(피하) 및 비침습성(피부외층) 면역화의 결과를 비교하며;

도 6은 피부를 통한 트랜스퍼좀 매개 TT 전달에 의한 면역반응에 있어서 피부전처리 효과(비특이성 면역화)를 나타내며;

도 7은 트랜스퍼좀내 TT를 갖는 피부를 통해서 전달되는 비교적 저분자량의 면역자극제, 모노포스포릴 리피드 A(LA)의 보조제 효과를 나타내며;

도 8은 트랜스퍼좀에 의해서 TT와 함께 피부를 통해서 전달되는 시토킨, 인터루킨-12(IL-12)의 면역-보조 효과를 입증하고;

도 9는 다양한 시토킨에 의해서 피부를 통한 침습되지 않는 트랜스퍼좀으로 전달되는 TT항원에 대항하는 쥐의 반응의 면역-조절을 나타내고;

도 10은 특정의 항체 생성을 유지하기위해서 운반체가 콜레라 독소(CT)를 포함하는 경우 트랜스퍼좀내 TT에 의해서 피부에 치료된 쥐의 면역반응자극 및 파상풍균 독소에 의한 치명적인 면역화에 대해서 동물의 방어에 대한 실험적 증가를 나타내고;

도 11은 면역-보조제로서 이.콜리(E.coli)로부터 열불안정 독소을 사용하며;

도 12는 트랜스퍼좀과 피부통과항원을 조합하여 히스타민으로 미리 처리된 국소 피부의 면역-조절 효과를 나타내고;

도 13은 피부외층 접종된 숙주의 생존율 및 항-파상풍균 역가에 대한 피하 초회항원자극 효과를 나타내며; 및

도 14는 항원으로 사용되는 콜레라 독소 및 파상풍 독소로 이가 접종한 효과를 나타낸다.

실시예는 본원 발명을 설명하기위한 것으로 한정하는 것은 아니다.

일반적인 실험 설치 및 시료 제조

스위스 알비노종(Swiss albino strain)의 쥐가 국립 영양연구소로부터 얻어진다(인도, 하이데라바드). 이들은 첫번째 면역화 시점에서 8-12주된 것이고, 보통은 4 내지 6개의 그룹으로 서스펜션 우리에 보관된다. 상기 동물들은 음식 및 물이 방치되어 있어 자유롭게 접근가능하다. 면역화되기 하루전날 쥐의 등에서 접종영역을 조심스럽게 면도한다. 항원이 피부표면상에 매우 정밀 피펫으로 투여하고, 부분적으로 건조시킨다. 면역원이 마멸되는 것을 방지하기위해서, 상기 동물들은 개개의 우리로 넣고, 피부외층으로 물질을 투여한 후 18시간을 유지한다.

면역화를 포함하는 조작을 하는 동안 시험동물의 스트레스 없애고, 조용하게 하기위해서 일반적인 마취를 실시한다. 상기 목적을 위해서 복막안으로 케타베트(Ketavet) 및 롬펀(Rompun)의 혼합물(쥐당 0.0071%의 롬펀(bayer, Leverkusen, Germany) 및 14.3㎎/㎖ 케타베트(Parke-Davis, Rochester, N.Y)를 포함하는 등장의 NaCl용액 0.3㎖)이 사용된다. 이는 상기 동물들을 대략 2시간동안 잠들게 한다.

면역원

이번 연구에서 연구된 초가변성 면역-운반체 또는 면역-침투제(면역-트랜스퍼좀)는 (올리고)이중층 운반체의 형태를 갖는다. 상기는 생체적합성 (포스포)지방으로 가령 포스파티딜콜린, 및 (생물)계면활성제로 가령 소듐 콜레이트 또는 폴리소르베이트(Tween 80)를 포함하며, 높은 응고물 가변성을 유지하는 다른 조성물이 가능하다. 추가의 성분은 요구에 따라 다변성의 면역보조제 활성을 갖는 모노포스포릴 리피드 A 및 항원이 있다.

종래의 운반체인 리포좀은 콩 포스파티딜콜린(SPC; Nattermann Phospholipids, Rhone-Poulene Rorer, Cologne, Germany)으로 이루어지고, 하기에기술된 바와 같이 제조된다. SPC에 대해 0.04mol%의 보조제인 모노포스포릴 리피드 A(MLA)를 포함하거나 또는 포함하지 않는 유기지방용액은 먼저 진공하에서 건조된다(10Pa, 한밤). 생성된 지방막이 인산완충액(pH=6.5)내에서 파상풍 독소(2.0㎎/㎖; Accurate antibodies, NY, USA)의 용액으로 수화되어, 10wt-%의 지방 현탁액을 수득한다. 지방 운반체의 원 현탁액이 800㎚, 400㎚ 및 200㎚의 공극을 갖는 일련의 폴리카보네이트막으로 추출되어 최종의 운반체 크기 분포를 얻는다.

높은 가변성 운반체인 트랜스퍼좀이 상기에 기술된 바와 같이 제조된다(Paul et al., 1995 op.cit.). 요약하면, 에탄올 SPC 용액이 소듐 콜레이트(Merck, Darmstadt, Germany)(3.75/1㏖/㏖) 및 필요에 따라 보조제와 함께 혼합된다. 상기 혼합물이 10mM 인산염 완충액(pH=6.5)에서 분산된다. 상기는 용액내 존재하는 파상풍 독소로 실시하여 현탁액 1㎖당 0.25㎎ 내지 2.0㎎사이의 단백질이 제공된다. 그리고 운반체 현탁액이 동결되고, 해동되는 것을 세번 반복한다. 연속적으로 상기 배합물을 가압하에서 미세공극 필터(200nm; Poretics, CA)를 통과시킨다. 운반체 제조의 재생성을 확인하기위해서 400nm에서 광학밀도가 각 제조에 대해서 측정되고, 대략 일정한 것이 확인되었다.

계면활성제 대 지방의 비율을 변화시킴에 의해서, 소포가 있는 응고물의 가변성은 계면활성제의 농도가 높기때문에 막이 불안정해지는 농도 미만으로 조절되고, 미셀형태가 된다. 트랜스퍼좀보다 적어도 10배 미만의 가요성 막을 가지며 리포좀으로 알려져 있으며, 계면활성제가 첨가되지 않은 지방 운반체가 음성 대조군으로 사용된다.

전체 지방 농도는 다른 언급이 없는한 10w-% 이다. 항원농도는 필수적이지는 않지만 1㎎/㎖이다. 살균제를 포함하는 완충액은 벌키상을 제공한다. 다른 적당한 조성성분에 대해서, 전문가는 우리의 실험으로부터 다른 공보 및 특허가 명확하게 언급된다.

면역화는 항원이 없는 초가변성 운반체를 포함하는 다른 배합물로 실시되고; 그리고 상기 운반체는 파상풍 독소(지방 A를 포함 또는 포함하지 않음) 및 유리 면역원을 포함한다. 각 배합물은 다른 언급이 없는 한 6마리의 쥐에 실시된다.

피하 면역화의 경우에, 40㎍의 면역원이 쥐 한마리에 대해서 주입된다. 비침습성 투여를 위해서, 다른 운반체와 조합되는 1㎍ 내지 80㎍사이의 파상풍 독소가 쥐의 등 상부의 피부로 투여된다. 모든 주입되지 않은 배합물이 정밀 피펫으로 도포되고, 건조시킨다. 상기 기간동안 쥐들은 도포된 물질이 벗겨지는 것을 최소화하기위해서 각 우리에 분리되어서 방치되어 쥐의 등이 다른 것들에 의해서 벗겨지는 것을 방지한다. 동물들을 매 2주마다 즉 14일 및 28일마다 추가접종하고, 전체 면역 도식도는 세개의 투여량으로 이루어지고, 1차와 2번의 추가접종으로 이루어진다.

동물이 7, 21, 35일에 생활환경을 바꿔서 기른다. 수집된 혈액이 먼저 응고된다. 미세 원심분리기에서 간단하게 원심분리한후, 혈청을 분리하고, 30분동안 56℃에서 보충물을 없애고, -20℃에서 저장하여, 전체 항원농도 및 특이 항체 이소타입이 측정된다.

흡수성 측정은 표준 UV-vis 분광기를 사용하여 실시된다.

ELISA에 의해서 혈청내 파상풍 독소(TT) 특이 항체의 측정. 항-파상풍 항체의 수준이 이중으로 종래의 방법인 ELISA에 의해서 측정된다. 간단하게, ELISA 플레이트(Maxisorp: NUNC, Germany)가 37℃에서 3시간동안 코팅제 완충액(Na₂CO₃/NaHCO₃, pH=9.6)내 분획량(10㎍의 TT/㎖를 포함하는 100㎕)으로 피복된다. 웰이 세척 완충액의 200㎕/웰로 세번 세척하고, 37℃에서 3시간동안 세척액(1000㎖에 대해 8g의 NaCl, 1.45g의 Na₂HPO₄·2H₂O, 0.2g 의 KH₂PO₄, 0.2g의 KCl 및 0.05%의 Tween-20)내 2% 밀크로 차단한다. 세척완충액 200㎖/웰로 한번 세척한 후에, 상기 플레이트가 시험 혈청의 다양한 희석액(1/50 내지 1/6400)을 가지고 배양한다. 4℃에서 한밤동안 배양한 후에, 상기 플레이트를 200㎕/웰의 세척 완충액으로 세번 세척하고, 100㎕의 2차 항체로 배양한다. IgG, IgA 또는 IgM의 정량을 측정하는 경우, 적당한 항-Ig에 결합된 호스래디시퍼옥시다아제(hrp)가 사용된다. 37℃에서 3시간 배양한 후에, 상기 플레이트를 200㎕/웰의 세척 완충액으로 세번 세척하고, 색상은 hrp기질로서 o-페닐디아민을 사용하여 현상한다. ㎖당 0.4㎕의 H₂O₂를 갖는 인산염-시트르산염 완충액(pH 4.5)내 o-페닐 디아민의 0.4㎎/㎖가 상기 목적을 위해서 사용된다. 2분후에, 상기 반응은 2N의 H₂SO₄를 첨가함에 의해서 정지시킨다. 흡수도는 492nm에서 측정된다.

다양한 이소타입을 검출하는데 사용되는 방법이 또한 ELISA법에 근거한다. 이는 ICN ImmunoBiologicals에서 얻어지는 IgG1(1:1000), IgG2a(1:1000),IgG2b(1:1000) 및 IgG3(1:200)에 대해 특이성을 갖는 퍼옥시다아제로 라벨되고, 친화정제된 2차 항체에 의존한다. 또한 2차 항체는 호스래디시퍼옥시다아제에 연결된 IgA(1:1000) 및 IgM(1:1000)을 포함한다(Sigma, Neu-Ulm, Germany). 해당하는 라벨된 항-쥐 IgE가 PharMingen(San Diego, CA)에서 구입되었다. 상기 항원은 다시 시험 플레이트에서 흡수되도록 하고, 과량의 항원이 세척되어진 후에 시험 혈청과 배양된다. 연속적으로 100㎕의 적정 특이성 2차 항체용액이 6개의 다른 플레아트중 하나에 첨가되고, 항-IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM 각각을 측정한다. 상기 플레이트가 37℃에서 3시간동안 배양되고, 상기에서 기술된 바와 같이 처리된다.

생체내에서 항원(파상풍 독소)으로 면역성 검사. 35일에 시험동물이 파상풍 독소의 피하로 LD₅₀의 50배를 주입하여 면역성을 검사한다(LD₅₀의 실제 값은 각 실험에서 고정되어 있고, 16중량의 동물의 그룹이 독성을 양을 증가시킴에 의해서 피하로 면역성을 검사하고, 생존자의 수를 측정한다). 접종된 동물에서 급성 TT 독성을 측정하기위해서, 상기 시험 쥐의 임상적인 상태가 첫번째 면역성 검사후에 4일동안 기록된다.

면역체가 생기지 않은 쥐는 24시간후에 마비의 증세를 보이고, 36시간후에는 사망했다. 4일동안 마비 또는 이상증세를 보이지 않는 동물은 파상풍에 대해서 면역을 형성한 것으로 생각된다.

장기간의 면역은 적어도 반년동안 LD₅₀의 50배에 해당하는 독소의 투여량으로매달 모든 면역화된 쥐에 면역성 검사를 실시하였다.

실시예 1-2:

응고물 크기(안정성) 효과

높은 가변성 운반체(트랜스퍼좀^TM:IDEA)

콩으로부터 87.4㎎의 포스파티딜콜린(SPC)

12.6㎎의 소듐 콜레이트(NaChol)

SPC에 대해 0.04mol-%의 모노포스포릴 리피드 A(MLA, LA)

0.9㎖의 인산염 완충액, 10mM, pH 6.5

0.1㎖의 에탄올

(혼합형 지질) 미셀:

콩으로부터 65mg의 포스파티딜콜린(SPC)

35mg의 소듐 콜레이트(NaChol)

SPC에 대해서 0.04mol-% 모노포스포릴 리피드 A(MLA)

0.9ml의 인산염 완충액, 10mM, pH 6.5

0.1ml의 에탄올

쥐당 40㎍(20㎕) 또는 80㎍(20㎕)의 투여량으로 파상풍 독소(2mg/mL; Accurate Antibodies)가 사용되고, 면역화 사용면적: 쥐의 상부 등에서 40㎍ 또는 80㎍의 TT에 대해 1㎠ 또는 2㎠.

다양하고, 피부외층 투여 배합물의 면역학적 성질에 있어서 배합물의 안정성효과를 시험하기위해서, 두종류의 응고물이 제조되었다: 상대적으로 큰 운반체(100nm 내지 200nm사이의 직경) 및 상대적으로 작은 미셀(50nm 미만의 직경). 상기 후자가 부최적 조건하에서(지방 분해 또는 부적당한 응고 조성물때문에) 후자가 전자로부터 나올것으로 기대되어 후자가 선택된다.

492nm에서 혈청 흡수도를 반영하는 바와 같이 항체 역가는 도 1에 개시되어 있다. 이들은 혼합형 지방 미셀이 같은 양의 TT를 갖는 초가변성 혼합형 지방 운반체(Tfs)보다 덜 효과적인 항원 운반체라는 것을 보여준다. 덜 효과적인 분해제를 포함하는 혼합형 미셀(피부 투과능력이 떨어짐)은 덜 효과적인 면역반응 매개체이다.

동물 방어 데이타는 도 1의 하단에서 볼 수 있는 바와 같은 유사한 경향을 볼 수 있다.

실시예 3-4:

응고물 가변성 효과

종래의 지방 운반체(리포좀):

콩으로부터 100㎎의 포스파티딜콜린(SPC)

SPC에 대해 0.4mol-%의 모노포스포릴 지방 A(MLA)

0.5㎖의 인산 완충액, 10mM, pH 6.5

2mg/mL 파상풍 독소(Accurate Antibodies)

높은 가변성 운반체(트랜스퍼좀^TM)

콩으로부터 87.4mg의 포스파티딜콜린(SPC)

12.6mg의 소듐 콜레이트(NaChol)

SPC에 대해서 0.04mol-% 모노포스포릴 리피드 A(MLA)

0.9ml의 인산염 완충액, 10mM, pH 6.5

0.1ml의 에탄올

40㎍ 또는 80㎍ TT/쥐/면역화의 투여량으로 파상풍 독소가 사용됨:

사용면적: 상부 등에 40㎍ 또는 80㎍ TT/쥐/면역화에 대한 1㎠ 또는 2㎠.

종래의 운반체로 얻어지는 결과는 높은 가변성 운반체로 측정한 데이타와는 구별된다: 장벽의 좁은 공극을 통과할 수 없는 단순 리포좀은 실제 항체 역가를 나타내지 않는다. 역으로, 더 용이하게 장벽내 좁은 공극을 통해서 각각 이동되는 것이 개시되어 있는 높은 가요성 및 가변성을 갖는 운반체는 혈청 흡수도 측정의 결과에 따라 피부에 사용되는 경우 항체의 적당량이 발생한다(비교 도 2)

실시예 5-10

항원 투여량 효과

높은 가변성 운반체:

콩으로부터 86.3mg의 포스파티딜콜린(SPC)

13.7mg의 소듐 콜레이트(NaChol)

SPC에 대해 0.04mol-% 모노포스포릴 리피드 A(MLA)

0.9mL의 인산염 완충액, 10mM, pH 6.5

0.1mL의 에탄올

파상풍 독소(TT: Accurate Antibodies, New York, USA) 농도:

없음, 0.25mg/mL, 0.5mg/mL, 1mg/mL, 2mg/mL가 0㎍, 10㎍, 20㎍, 40㎍ 또는 80㎍ TT/쥐/면역화를 일으킨다.

사용면적: 상부 등에서 0㎍, 10㎍, 20㎍, 40㎍에 대해서는 1㎠ 및 80㎍ TT/쥐/면역화에 대해서는 2㎠

상기 실험의 결과는 도 3에 개시되어 있다. TT 투여량이 증가되면 초가변성 운반체에서 피부외층 투여된 파상풍 독소에 대한 면역 반응이 증가되는 것을 분명하게 볼 수 있다. 상기는 혈청 흡수도(20㎍/면역화의 투여량 미만), 특이 항체 역가(40㎍/면역화의 투여량미만) 및 생존율 데이타(80㎍/면역화미만의 투여량에 대해서 포화되지 않음)를 반영한다.

IgG1(반응 포화에 대해서 강한 지시) 및 IgG2b(아마도, 면역화당 40㎍ 내지 80㎍ 사이에서 포화)를 제외하고 덜 명확한 이소타입 분포 패턴이 발견되었다. IgM은 IgG1의 것과 유사한 투여 의존성을 보인다. IgG2a에 대해서 얻어진 그림은 혼란스럽다.

실시예 11-13

항원 순도 효과

높은 가변성 운반체:

실시예 5-10에 기술된 바와 같다(불순한 TT로 처리된 그룹은 면역보조제 지방 A를 넣지 않는다는 것은 제외한다.)

파상풍 독소: 80㎍ TT/쥐/면역화에 상응하는 2mg/ml

사용면적: 상부 등에서 2㎠

항원 순도는 독소가 피부에 비침습적으로 도포되는 경우 파상풍 독소에 대항하는 쥐의 방어 수준에 큰 영향을 준다.(항원이 주입되어 얻어진 유사한 결과가 개시되지 않았다)

상기에서 언급된 것과 같이, 시험관내에서 성장한 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)의 배양에서 배지 여과물이 불순한 항원으로 사용된다. 부분적으로 정제된 항원을 얻기위해서, 상기 여과물이 10kDa 절단막을 통과하고, pH 6.5의 인산염 완충액으로 철저히 세척하고, 공정에서, 상기 배양 여과물은 15배로 농축한다. 정제된 유독소가 Accurate Antibodies NY, USA에서 구입한다.

스위스 알비노 쥐(n=6)가 불순한 항원, 모노포스포릴 리피드 A가 보충된 부분적으로 정제된 항원 또는 모노포스포릴 리피드 A가 첨가된 정제된 항원의 동일한 정상 투여량으로 면역화된다. 상기 항원은 항상 유사한 트랜스퍼좀과 결합되어 있다. 상기 후자에 대한 조성물 및 제조방법은 이전의 실시예에 기술된 것과 같다. 상기 상세한 면역화 도식도 및 생육시간 및 면역학 시험 뿐만아니라 분석방법은 상기에 언급된 것과 유사하다.

상기 결과가 도 4에 개시되어 있다. 상기는 TT에 대항하는 면역 반응의 강도 뿐만아니라 정량을 측정하는데 항원의 순도가 중요한 역할을 하는 것이 입증되었다. 또한 도 4에 개시되어 있는 데이타는 특정 항체 역가의 흡수도가 치료적 효과를 신뢰할 수 없으며, 즉 피부외층 접종의 예방적 효과가 있다고 지적되었다. 상기는 충분하게 순수한 항원이 사용된다면 Th2-형 IgG1 성분과 비교하여 Th1-형IgG2b의 실질량만을 포함하는 특정 항체 이소타입에서 큰 차이가 있다(12페이지 참조).

실시예 14-15

피부외층 및 피하 투여의 비교

높은 가변성 운반체, 트랜스퍼좀^TM(IDEA):

실시예 5-10에서 기술된 것과 같다.

파상풍 독소의 투여량:

피부외층 면역화당 80㎍의 TT

(2㎠의 사용면적 및 2mg의 TT/mL를 사용)

피하 주입당 40㎍ TT(2mg TT/mL를 사용)

실시예 1-4에서 기술된 것과 같은 실험방법을 사용하여 항체-특이성 혈청 역가, 파상풍 독소에 대항하는 동물 방어의 수준 및 다른 특이 항체 이소타입의 상대 발생성이 측정되었다.

상기 결과가 도 5에 개시되어 있다. 면역 의존성의 증가는 침습성 및 비침습성 항원 투여후에 혈청 흡수도에서 필적하며, 후자의 경우에 역가는 1차 면역화 후의 6으로 낮고, 2차 추가 접종후 8로 다소 낮다. 마찬가지로, Th2-를 나타내는 IgG1의 TT-특이성 수준은 상기 실험의 양쪽 팔에서 유사하고, 다른 항체의 서브타입에 대한 특이적 해독, 특히 IgG2a 및 IgG2b에 대한 초기 시점에서 항원 주입후 각각 25 및 3으로 나타난다. 그러나, 주입된 파상풍 독소의 치명적인 투여량으로한 연속적인 면역성 시험에서 생존한 시험 쥐에서와 유사하게, 적어도 일련의 실험의 구성안에서 항원 투여 경로에 무관하다.

실시예 16-17:

보조제 피부 처리(선-주입) 효과

높은 가변성 운반체, 트랜스퍼좀^TM(IDEA):

콩으로부터 89.3mg의 포스파티딜콜린(SPC)

10.7mg의 소듐 콜레이트(NaChol)

SPC에 대해 0.04mol-% 모노포스포릴 리피드 A(MLA)

0.9mL 인산염 완충액, 10mM, pH 6.5

0.1mL 에탄올

파상풍 독소: 불순한 항원을 사용하는 그룹당 6마리의 스위스 알비노쥐의 80㎍ TT/쥐/면역화에 상응하는 2mg/mL

사용면적: 상부 등에서 2㎠

피부를 가로질러 트랜스퍼좀과 결합된 거대분자의 피부통과 운반은 매우 온화한 것으로 보이며; 항원이 적은 양으로 사용되거나 불순하다면 Th2-형 면역 반응에 대한 면역 시스템을 활성화 시키는 것은 어렵다. 상황을 변화시키기위해서, 상기 피부가 초가변성 운반체에 의해서 실제 비-침습성 항원 투여전에 기관으로부터 상응하는 전달 분자의 분비를 촉진시킬 수 있다. 이런 목적으로 우리는 0.1mL의 식염수를 사용자리에 먼저 주입하거나, 유사한 조성물의 생분해성 물질로부터 제조된 비항원 운반체를 사용하기 하루전에 항원을 운반하는 운반체로서 미리 주입한다. 추가적인 대조군으로 불완전한 프로인드(Freund)의 보조제가 또한 피부상에 면역-운반체의 사용 24시간전에 다른 동물에 주입한다.

결과를 설명하는 예는 도 6에 개시되어 있다. 상기는 대조군으로 제공된 피부에 운반체 배합물이외의 주입에 의해서 전처리된 쥐에서 개선된 방어에 있어서 특히 높은 특이성 항체 역가를 나타낸다. 불완전한 프로인드 보조제의 효과는 매우 약하다.

혈청 흡수도 또는 특이 항체 역가 및 동물 생존율, 즉 방어 접종 효과는 서로 관련이 없다.

실시예 18-21:

저분자량 보조제(지방 A) 효과

높은 가변성 면역-조절된 TT-트랜스퍼좀^TM(IDEA):

콩으로부터 86.3mg의 포스파티딜콜린(SPC)

13.7mg의 소듐 콜레이트(NaChol)

SPC에 대한 0.04mol% 모노포스포릴 리피드 A(LA)

0.9mL의 인산염 완충액, 10mM, pH 6.5

0.1mL 에탄올

높은 가변성 표준 면역-운반체, TT-트랜스퍼좀^TM(IDEA):

첨가되는 LA가 없다는 것이외에는 상기에서와 같다.

파상풍 독소: 40㎍ 또는 80㎍ TT/면역화에 상응하는 20㎕ 또는 40㎕를 갖는 2mg/mL

사용면적: 상부 등에 각각 1㎠ 또는 2㎠

우리는 면역 활성, 전형적인 면역 가능한 분자는 항원의 목적하는 면역학적 작용을 이루기위해서 장벽을 통하여 TT 운반체에 의해서 몸으로 항원이 제공되는 시점에서 피부에서 존재해야하는 것으로 생각된다. 상기 결론을 입증하기위해서, 우리는 공지되어 있는 면역 자극제로는 예를들면 인체에서 TNF의 발생을 나타내는 것이 알려져 있는 모노포스포릴 리피드 A(LA)가 있거나 또는 없는 트랜스퍼좀에 의해서 TT의 비침습성 면역제공의 결과를 비교하였다. 두개의 다른 항원 투여량이 사용된다. 몇가지 경우에, 실제 역가 및 측정가능한 예방가능한 면역 반응(부분적인 면역)에 도달된다.

혈청의 흡수도가 증가될 것으로 기대된다(비교 도 7). 역으로, LA의 효과는 사용되는 투여량이 더 높은 것보다도 더 낮은 것이 좋다는 것을 볼 수 있다. 이는 실험적인 변수에 기인하는 것이며, 전형적인 면역 데이타에 대한 비선형성의 투여량 대 활성곡선을 반응하는 것이다. 예를들면 보조제는 낮은 투여범위에서 더 효과적이며, 반면에 높은 투여조건에서 상기 시스템은 준-포화되고, 보조제에 대한 약간의 가능성이 실험 설치의 범위내에서 면역 반응을 추가적으로 향상시킨다. 50배의 LD₅₀으로 치명적인 면역시험에 대항하는 완전한 동물 방어가 LA만으로 조합된 더 높은 TT 투여량으로 일련의 시험에서 이루어졌다.

또한 Th1-시토킨 IgG2b는 LA가 없는 그룹과 비교하여 LA그룹을 갖는 것에서 더 높게 관찰된다. 상기의 차이점은 높은 투여량보다는 4의 인자에 의한 낮은 투여량에 대해서 더 알려져 있고, 오직 요소가 2에서 관찰된다. Th2-시토킨 IgG1은 우세하게 존재하며, LA그룹을 갖는 낮은 투여량에서 IgG2B에서 상당히 기여하는 것은 예외이다.

실시예 22-23:

고분자량 보조제, IL-12 시토킨 효과

높은 가변성 운반체, 트랜스퍼좀^TM(IDEA):

실시예 5-10에 기술된 것 + 면역원 현탁액 ml당 0.01mg IL-12

파상풍 독소, 80㎍ TT/쥐/면역화에 상응하는 2mg/mL

(실시예 9-11에서 기술된 것과 것이 부분적으로 정제)

사용면적: 스위스 알비노 쥐의 상부 등에 2㎠

파상풍 독소로 비침습성 피부외층 접종의 결과에 있어서 시토킨의 효과를 연구하기위해서, 0.4㎍ IL-12/쥐와 모노포스포릴 리피드 A의 조합물이 사용된다. 80㎍의 IL-12가 파상풍 독소 및 모노포스포릴 리피드 A를 갖는 트랜스퍼좀과 조합하여 쥐에 투여된다. 파상풍 독소에 대한 면역화, 성장 간격 또는 최종 면역시험에 대한 상세한 설명은 상기에서 언급된 것과 같다.

일련의 실험의 결과가 도 8에 개시되어 있다. 피부외층 TT 투여에 따른 면역제공의 과정동안 피부에서 프로(pro) Th2 시토킨의 존재는 접종에 있어서 긍정적인 영향을 준다는 결과를 얻었다. 이는 혈청 흡수도, 특이적 항체 역가 뿐만아니라 시험 동물 생존 가능성에서 알 수 있다.

실시예 22-23에서 얻어진 효과는 면역원 배합물로 IL-12 이외의 시토킨을 첨가함에 의해서 입증되었다. 상기 결과는 도 9에 개시되어 있다.

실시예 24-25:

고분자량 보조제(IFN-γ 및 GM-CSF + IL-4) 효과

높은 가변성 운반체, 트랜스퍼좀^TM(IDEA):

실시예 5-8에서 기술된 것 + 면역원 현탁액의 mL당 0.05mg IFN-γ 및 0.004mg GM-CSF 및 0.004mg IL-4

파상풍 독소, 80㎍ TT/쥐/면역화에 상응하는 2mg/mL(불순물)

사용면적: 스위스 알비노 쥐의 상부 등에 2㎠

실시예 22-23에서 기술된 효과는 다른 시토킨 혼합물로 확인되었다. 상기 결과는 도 10에 개시되었다.

실시예 28-29:

추가접종 효과(면역 반응의 성숙)

대부분의 이전의 실시예에서, 면역화의 시간과정동안 흡수도가 측정될때마다 일치하는 패턴이 관찰되었다. 1차 면역화에서 얻어진 반응과 비교하여 면역 반응은 각 추가접종에서 증가되었다(도 3, 4, 5, 6, 7, 8 참조). 1차 반응은 우세한 IgM이 특징이고, 제1 추가접종후 IgG가 점차적으로 나타나고, 제2 추가접종 후에IgG의 최대량이 나타나며, 동시에 IgM은 사라진다. 이러한 이소타입의 형태는 면역반응에서 친화도 성숙을 나타낸다. 상기 과정동안, 특이 항체의 혼합물의 평균 친화도가 반복되는 면역화에서 증가된다.

다양한 피부외층 접종 실험의 결과는 비침습성 2차(추가접종) 면역화와 침습성 1차 접종이 조합함에 의해서 유익하다는 것을 제시하였다.

실시예 30-72:

시험관내에서 트랜스퍼좀에 의해서 피부로부터 시토킨의 방출

높은 가변성 운반체(트랜스퍼좀형 C):

콩으로부터 87.4mg의 포스파티딜콜린(SPC)

12.6mg의 소듐 콜레이트(NaChol)

0.9mL의 인산염 완충액, 50mM, pH 7.3

그의 2.5㎕

높은 가변성 운반체(트랜스퍼좀형 T):

콩으로부터 50mg의 포스파티딜콜린(SPC)

50mg의 폴리소르베이트(Tween 80)

0.9mL의 인산염 완충액, 50mM, pH 6.5

그의 2.5㎕

양성 대조군 A:

2.5㎕의 5% 소듐 도데실설페이트(SDS)

양성 대조군 B:

100㎕의 리포폴리사카라이드(LPS; 10⁵U/ml)

음성 대조군:

2.5㎕의 인산염 완충된 식염수(PBS)

모든 생성물은 희석되지 않고 시험되었다.

세포형태: 보통의 사람 케라틴세포, 완전한 각질층을 갖는 다층의 피막조직이 사용된다: 생체내에서 사람과 크게 닮은 조직구조를 밝힌다.

방법: 케라틴 세포가 화학적으로 정의되고, 보충된 배지내 0.63㎠의 폴리카보네이트 필터 삽입물에서 접종되고, 공기-액체의 계면에서 17일동안 배양된다.

시험 측정: 각 시험 생성물의 주어진 정량이 마이크로피펫으로 넣고, 작은 멸균장치를 사용하여 8개의 재구성된 피막조직의 각질층의 표면에 편편하게 핀다. 상기 배양물이 24시간동안 37℃, 5% CO₂에서 배양한다. 4개의 복제 배양물(이중으로 배양된 LPS 처리된 세포는 제외됨)이 0.5mL의 PBS로 세척되고, 3시간동안 37℃, 5% CO₂에서 300㎕의 0.5mg/ml MTT에서 배양된다.

조직에 있는 배지내 염증성 매개체의 분비(IL1α, IL2, IL4, IL8, IL10, IFN-γ 및 TNF-α)이 ELISA 키트(R&D systems UK; Quantikine)를 사용하여 정량화되고, 면역-조절제의 각 형태의 특이성을 정량화 한다.

	IL1-α(pg/mL)평균 +/- SD	IL8 (pg/mL)평균 +/- SD	TNF-α(pg/mL)
음성 대조군(PBS, n=2)	5.1+/-0.5	<31	검출되지 않음
양성 대조군 A(SDS 5%, n=2)	314.2+/-6.1	147.5+/-32	검출되지 않음
양성 대조군 B(LPS, n=1)	32.0	5161	113.4
트랜스퍼좀 C(02-05,n=2)	12.3+/-0.9	68.3+/-16.8	검출되지 않음
트랜스퍼좀 T(TT0009/175, n=2)	11.7+/-1.2	50.8+/-14.0	검출되지 않음
트랜스퍼좀 O(TT0017/15, n=2)	185.5+/-170.1	58.4+/-27.0	검출되지 않음

트랜스퍼좀 O에서 관찰되는 상대적으로 큰 표준편차는 생성물이 재구성된 피막의 각질층에서 균일하게 분산되는 것이 어렵다는 사실에 의해서 설명될 수 있다.

TNF-α수준은 세포가 LPS를 포함하는 양성 대조군과 접촉하는 경우 113.43pg/ml의 수준으로 증가되고, 이는 인정된 면역보조제이다.

트랜스퍼좀으로 세포배양후 IL8 농도는 2로 검출되는 하한을 초과하고, 한가지 경우는 그렇지 않고, 다른 경우에는 95%의 신뢰도를 나타내며, 어떤 상황에서도 167배 이상의 값을 제공하는 면역보조제 LPS를 포함하는 양성 대조군에서 증가되는 것과 비교하여 무시할 수 있다.

비특이성 자극제인 SDS는 시험관내에서 피부세포로부터 다량의 IL-1α를 배딩 매질(bathing medium)로 방출시킨다. 높은 농도에서 자극을 일으키는 올레산을 포함하는 트랜스퍼좀 O로 배양된 세포로부터 다량이 방출되지만, 후자의 시험 시스템에서 얻어진 결과에서 큰 표준 편차에 의해서 막이 형성되는 것이 저해된다.

A형 및 B형의 다른 시험된 트랜스퍼좀에 대한 IL-1α농도가 배경수준의 대략 2배로 변화된다. 상기 차이점은 음성 대조군과 비교하여 통계적으로 중요하지만,실제로 무시할 수 있고, LPS를 포함하는 양성 대조군에서 관찰된 증가는 60배이상이다.

IFN-γ, IL-2, IL-4 또는 IL-10은 측정가능한 수준으로 증가되지 않으며, 이는 다른 시험조건하에서 시토킨의 방출이 부족한 것을 의미한다.

상기 언급된 발견으로부터 트랜스퍼좀은 피부세포로부터 상기 분자의 발생을 유도하거나 또는 시토킨을 분비하지 않는다. 이는 항원 또는 알레르기 유발원이 운반체와 함께 피부를 가로질러 운반되는 경우 면역보조제/조절제를 사용하는 것이 요구되는 것을 설명하며, 치료적 또는 예방적 면역 반응을 발휘한다.

실시예 73-82:

특이적 면역 보조제로서 세균벽 성분, 콜레라 독소:

높은 가변성 운반체, 트랜스퍼좀^TM:

콩으로부터 86.3mg의 포스파티딜콜린(SPC)

13.7mg의 소듐 콜레이트(NaChol)

0.9mL의 인산염 완충액, 10mM, pH 6.5

콜레라 독소(CT; Sigma, Neu-Ulm), 10㎍/면역화 + 필요하다면 파상풍 독소(TT, 순수; Accurate Antibodies) 2mg/ml,

0㎍ TT/쥐/면역화(음성 대조군), 1㎍ TT/쥐, 5㎍ TT/쥐, 10㎍ TT/쥐, 20㎍ TT/쥐, 40㎍ TT/쥐(CT사용의 경우에) 및 80㎍ TT/쥐(CT 없음)에 상응하는 투여량이 4-6마리의 스위스 알비노 쥐의 상부 등에 2㎠ 미만의 면적으로 피부외층에 사용된다. 20㎍ TT/쥐/면역화가 양성 대조군에서 상응하는 자리에 피하로 주입된다. 면역화되지 않은 쥐는 다른 음성 대조군으로 사용된다.

피부외층 항원 투여의 방어 효과는 콜레라 독소가 파상풍 독소와 조합되어 시험 배합물로 포함되는 경우는 우수하다. 상기 면역보조제가 없는 배합물은 열등한 방어를 나타내고, 4마리중 1마리(25%)가 파상풍 독소로 면역시험후에 마비를 일으켰다.

도 10에 개시되어 있는 결과는 과량의 20㎍/면역화의 항원 투여량은 완전한 방어를 유지하지만, 다른 시험 보조제 또는 보조제 처리(이전의 실시예를 참조)의 경우는 아니라는 것을 나타낸다. 더 낮은 항원 투여량은 정량적으로 유사한 효과를 나타내지만, 모든 시험쥐의 생존을 보장할 수 없지만, 5㎍ TT/면역화 처리된 시험군은 예외이다. (상기는 1㎍/면역화 내지 15㎍/면역화사이의 TT 투여량은 전이영역에 속한다는 것을 의미한다). 기타 투여량의 콜레라 독소는 동등하거나 그 이상으로 유익하다.

실시예 83-85

이.콜리로부터 열불안정 독소(HLT)가 면역-보조제를 갖는다

높은 가변성 운반체, 트랜스퍼좀^TM:

콩으로부터 86.3mg의 포스파티딜콜린(SPC)

13.7mg의 소듐 콜레이트(NaChol)

0.9mL의 인산염 완충액, 10mM, pH 6.5

열불안정 독소(HLT; SIGMA, Neu-Ulm), 1mg/ml + 필요하다면 파상풍 독소(TT, 순수; Accurate Antibodies) 2mg/ml

다양한 상대 보조제/항원 농도가 피부통과 접종을 위해서 대부분 통상 사용되는 ADP 리보실레이트 효소 중 하나의 효과를 시험하기위해서 사용된다. 트랜스퍼좀은 이전의 실시예에서 기술된 바와 같이 제조된다. 다른 실험에 대한 상세한 설명(동물 사육; 항원투여; 역가 측정)은 이후에 기술하였다.

피하주입을 위해서 20㎍ TT/쥐/피부외층 면역화 및 1 내지 2㎍ HLT/쥐/피부외층 면역화 및 0.5㎍ TT를 갖는 양성 대조군에 상응하는 부피 투여량이 스위스 알비노 쥐를 면역화하는데 사용된다. 상기 결과가 도 11에서 설명하였다.

항-TT 역가는 피부에서 HLT가 보조제 없이 항원의 피부외층 주입 또는 트랜스퍼좀내 보조제 없이 TT의 투여와 비교하여 보조제로 사용되는 경우 증가되는 것을 발견하였다. 파상풍 독소로 치명적인 면역반응에 대항하는 체액 반응 및 방어가 투여량에 의존하는 것이 알려져 있으며, 항-TT 역가가 높아지고, HLT의 투여량이 더 높아지면 생존율이 개선된다. 상기 측정된 결과(데이타를 개시하지 않음)는 유용한 HLT 투여량이 100ng/투여량에서 시작하여, 일련의 실험에서 사용되는 실험 조건하에서 더 높은 실질적으로 유용한 투여량은 대략 100배이상임을 제시하였다. 이는 피부외층에 투여된 트랜스퍼좀과 결합되어 사용되어야 하는 보조제 투여량에 대한 상한은 차수에 상응하고, 종래의 침습성 면역화에서 사용된 것보다 대부분 10배 이상이어야 하며, 우리의 의견으로는 실제의 하한은 전형적인 피하투여 보다 더 작은 크기의 1-2차이다. 유사한 관계가 또한 기타 관련된 면역-보조제에 대해서도제시된다.

실시예 86-87:

히스타민으로 국소 예비처리

높은 가변성 운반체, 트랜스퍼좀^TM:

콩으로부터 86.3mg의 포스파티딜콜린(SPC)

13.7mg의 소듐 콜레이트(NaChol)

0.9mL의 인산염 완충액, 10mM, pH 6.5

파상풍 독소 (TT, 순수; Accurate Antibodies) 2mg/ml

인산염 완충액내 1mg/ml의 히스타민 용액, 10mM, pH 6.5

면역-반응 조절에 대한 선택적인 수단의 효과를 시험하기위해서, 피부에서 트랜스퍼좀내 항원 투여 15분전 또는 피부외층 면역화 직후의 자리에 용액내 10㎍의 히스타민을 주입한다. 이는 피부로부터 시토킨 방출을 유도하고, 및/또는 비침습성 피부통과 면역화에 있어서 약간의 양성 효과를 갖는 것이 기대된다. 상기 가설을 시험하기위해서, 트랜스퍼좀이 상기 실시예에서 기술된 바와 같이 제조되고, 상기에 기술된 바와 같은 스위스 알비노 쥐로 실시된다(히스타민으로 전처리한 것은 예외)

도 12는 상기 언급된 작업 가설을 확인하다. 상기 결과는 파상풍 독소로 면역반응에 대항하는 방어수준을 이루기위해서 히스타민 주입과 피부외층 면역화사이의 기간에 대한 조건 및 양호한 체액 반응을 보인다. 이와 같이 보조제 없이 피부에서 트랜스퍼좀내 TT로 측정된 결과 비교에서는 히스타민 주입은 동물 면역반응을 추가접종하는데 도움을 준다는 것을 볼 수 있다.

실시예 88-89

1차 및 추가접종 면역화를 위한 다른 투여경로

높은 가변성 운반체, 트랜스퍼좀^TM:

콩으로부터 86.3mg의 포스파티딜콜린(SPC)

13.7mg의 소듐 콜레이트(NaChol)

0.9mL 인산염 완충액, 10mM, pH 6.5

콜레라 독소(CT; SIGMA, Neu-Ulm), 0-1㎍/면역화

파상풍 독소(TT, 순수; Accurate Antibodies) 2mg/ml

운반체 제조 및 동물 실험의 상세한 설명이 이전의 실시예에서 발견할 수 있다.

20㎍ TT 단독 또는 0.5㎍ TT + 1㎍ CT에 상응하는 부피 투여량은 1차 면역화를 위해서 피하로 투여되지만, 추가 면역화에 대해서는 피부외층으로 도포된다. 상기 조합은 이미 언급한 바와 같이 실질적으로 접종의 효과를 증대시킨다.

항-TT 역가는 파상풍 독소에 대한 면역반응에 대항하여 100% 방어를 수득하는데 충분하다(도 13). 피부에서 보조제가 없는 TT-Tfs로 실시되는 이전의 실시예로부터 데이타를 비교하면 조합된 피하/피부외층 접종방법이 유용하다는 것을 입증하였다.

그러므로 상기 데이타는 피부에 도포된 항원을 가진 트랜스퍼좀^TM이 상기 보충물을 침습성 항원 투여에 제공되는 것을 제시하며, 특히 2차 면역화를 위해서 중요하다.

실시예 90:

항원으로 파상풍 독소 및 콜레라 독소로 2회 접종

높은 가변성 운반체, 트랜스퍼좀^TM:

콩으로부터 86.3mg의 포스파티딜콜린(SPC)

13.7mg의 소듐 콜레이트(NaChol)

0.9mL의 인산염 완충액, 10mM, pH 6.5

콜레라 독소(CT, SIGMA, Neu-Ulm), 10㎍/면역화

파상풍 독소(TT, 순수; Accurate Antibodies) 2mg/ml

콜레라 독소는 항-TT 반응을 향상시키기위해서 보조제로서 사용될뿐만아니라(상기 실시예를 참조), 그 자체가 항원이다. 결과적으로 상기 보조제는 특정의 농도로 사용되는 경우 2차 항원의 역할을 한다. 상기 보조제 및 면역성은 선형으로 보정할 수 없지만, 그러나 접종의 최적화를 위한 가능성을 제시한다(또한 부반응 및 알레르기를 유도). 쥐에서 시험된 트랜스퍼좀내 CT와의 연구로, 우리는 사용시 50ng미만 내지 적어도 10㎍ 사이의 CT 투여량은 상기에서 기술된 목적을 위해서 유용하다는 것을 발견하였다.

피부에서 시험 배합물의 다른 부피로 처리된 쥐에서 항콜레라 독소 항체(10㎍ TT 및 10㎍ CT에 상응하는 것)는 CT항원의 지표이다. 상기는 하나 이상의 항원을 포함하는 트랜스퍼좀^TM에 근거한 적어도 2가의 백신을 제조하기위한 초가변성 운반체로 확인된다.

도 14는 같은 운반체내 TT 및 CT로 이미 면역화된 쥐로 측정된 TT 및 CT 역가를 나타낸다.

Claims

(a)응고되는 경향이 있는 적어도 두개의 다른 물질 또는 물질의 두가지 다른 형태의 하나 이상의 층의 막형 코팅제로 둘러싸인 미세 유체 방울의 형태로 수성 용매내에 현탁 또는 분산되고, 상기 물질들 또는 물질의 형태는 바람직하게 수성 액체 매질내에서 적어도 용해도 10의 차이가 나고, 더 가용성인 물질들 또는 물질의 형태의 단일-응집물의 평균 직경 또는 상기 물질들 또는 상기 물질의 형태로 이루어진 이형-응집물의 평균직경은 덜 가용성의 물질 또는 물질의 형태의 단일-응집물의 평균 직경보다 작으며, 및/또는 더 가용성인 성분은 침투 소적을 용해시키는 경향이 있으며, 그 같은 성분의 함량은 소적을 용해시키는데 요구되는 농도의 99mol%에 이르고, 또는 용해되지 않는 소적에서 포화 농도의 99mol%에 상응하거나 더 높으며, 및/또는 막-형상 코팅제로 둘러싸인 소적의 탄성 변형 에너지는 적어도 5배 낮으며, 더 바람직하게는 적어도 10배 낮으며, 이상적으로는 유체 지방족 사슬을 갖는 인지질 이중층 또는 적혈구 세포의 것보다 10배 낮은, 침투제인 피부통과 운반체;

(b)시토킨 또는 항-시토킨 활성을 특이적으로 분비 또는 특이적으로 유도하거나 또는 활성을 발휘하는 화합물; 및

(c)항원, 알레르기 유발원, 항원의 혼합물 및/또는 알레르기 유발원의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 피부통과용 백신.
제 1 항에 있어서,

상기 시토킨 또는 항-시토킨 활성 및 항원을 나타내거나 또는 유도하는 화합물이 침투제와 결합하는 것을 특징으로 하는 피부통과용 백신.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

덜 가용성인 자기-응고 분자는 극성 지질이고, 더 가용성인 성분은 계면활성제 또는 계면활성제형 분자 또는 본 발명의 목적에 맞게 충분히 용해성이 있는 극성 지질의 형태인 것을 특징으로 하는 피부통과용 백신.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 침투제의 평균 직경은 30nm 내지 500nm, 바람직하게는 40nm 내지 250nm, 더 바람직하게는 50nm 내지 200nm, 특히 바람직하게는 60nm 내지 150nm 사이인 것을 특징으로 하는 피부통과용 백신.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,

사람 또는 동물의 피부에 사용되는 배합물에서 소적의 전체 중량은 전체 질량의 0.01중량%(w-%) 내지 40중량%, 특히 0.1w-% 내지 30w-% 및 더욱 바람직하게는 5w-% 내지 20w-%사이인 것을 특징으로 하는 피부통과용 백신.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

전체 항원 농도는 전체 침투제 질량의 0.001 내지 40w-%사이이고, 특히 0.01w-% 내지 30w-% 사이, 바람직하게는 0.1w-% 내지 20w-% 사이, 더욱 바람직하게는 0.5w-% 내지 10w-% 사이인 것을 특징으로 하는 피부통과용 백신.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,

(da)저분자량 화학적 자극제; 및/또는

(db)병원성 물질 또는 그의 절편 또는 유도체로부터의 추출물 또는 화합물을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부통과용 백신.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 시토킨 활성을 발휘하는 화합물은 IL-4, IL-3, IL-2, TGF, IL-6, IL-7, TNF, IL-1α및/또는 IL-1β, IL-12, IFN-γ, TNF-β, IL-5 또는 IL-10, 타입 I 인터페론, 바람직하게는 IFN-α또는 IFN-β인 것을 특징으로 하는 피부통과용 백신.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 항-시토킨 활성을 나타내는 화합물은 항-시토킨 항체 또는 상응하는 그의 활성 절편, 유도체 또는 유사체인 것을 특징으로 하는 피부통과용 백신.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 항원은 병원성 물질에서 유도되는 것을 특징으로 하는 피부통과용 백신.
제 10 항에 있어서,

상기 병원성 물질은 세포외 박테리아로 고름-형성 구균(cocci)으로 가령 스타필로코커스(Staphylococcus) 및 스트렙토코커스(Streptococcus), 그람음성균으로 가령 메닌고코커스(Meningococcus) 및 고노코커스종(Gonococcusspecies), 네이스세리아종(species ofNeisseria), 장내균을 포함하는 그람음성균으로 이. 콜리(E.coli), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 슈도모나스(Pseudomonas), 디프테리아(Diptheria), 보르데텔라 페르투스시스(Bordetella Pertussis) 및 그람양성균(예를들면 바실러스 페스티스(Bacillus pestis, BCG), 특히 혐기성미생물로, 클로스트리듐종으로 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 노비(Clostridium novyi), 클로스트리듐 셉티쿰(Clostridium septicum)); 숙주내에서 생존 및 복제할 수 있는 박테리아 및 바이러스; 마이코박테리아(mycobacteria)(예를들면 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) 및 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes)를 포함하고, 레트로- 및 아데노바이러스로, 헵파티티스(hepatitis) 바이러스, (사람의) 면역결핍 바이러스, 헤르페스(herpes) 바이러스, 스몰팍스(small-pox)(chicken-pox), 인플루엔자(influenza), 홍역, 유행성 이하선염, 소아마비 바이러스, 시토메가로바이러스(cytomegalovirus), 리노바이러스(rhinovirus) 등, 숙주내 성장하는균류(fungi); 기생충으로 동물기생충(원생생물 및 연충) 및 외부기생충(진드기, 진드기), 또는 부르셀라종(Brucellaspecies)(예를들면 비. 멜리텐시스(B. melitensis), 비. 아보르투스(B. abortus), 비.수이스(B. suis), 비.카니스(B. canis), 비. 네오토마에(B. neotomae), 비. 오비스(B. ovis), 콜레라 병원성 물질(예를들면 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 헤모필루스종(Haemophilus) 등으로 헤모필루스 악티노마이세템코미탄스(Haemophilus actinomycetemcomitans), 헤모필루스 플레우롭네우모니애(Haemophilus pleuropneumoniae) 뿐만아니라 병을 유발하는 파라티푸스, 플라그, 광견병, 파상풍 및 풍진을 포함하며, 여러 종양을 일으키는 병원성 물질, 자기-면역 질병 및 병원성 물질의 감염에 의한 것이 아닌 동물 또는 사람 몸의 병적인 상태와 관련된 병원성 물질을 포함하는 것에서 선택되어지는 것을 특징으로 하는 피부통과용 백신.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 알레르기 유발원은 미생물, 동물 또는 식물로부터 유도되는 이종성 또는 외인성의 것이며, 사람에 의해서 만들어진 그룹 및/또는 자극적인 무기물질 또는 몸의 면역 시스템에 적당하지 않게 처리되거나 또는 노출되는 인체의 일부 또는 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부통과용 백신.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,

사용된 시토킨 활성을 나타내는 각 화합물의 농도는 선택된 항원 투여량 및면역보조제를 가지고 상응하는 시험을 실시하여 이루어진 적정한 농도보다 1000배 더 높은 것이 선택되고, 배합물을 주입함에 의해서 실시되거나 또는 시험관내에서 시험을 실시하며, 바람직하게는 100배미만, 종종은 50배 미만, 더 바람직하게는 20배 미만으로 더 높은 것을 특징으로 하는 피부통과용 백신.
제 7 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 병원성 물질 추출액 또는 화합물은 리포폴리사카라이드, 코드-인자(트레할로스-디마이콜레이트) 및 무라밀 디펩티드, 또는 병원성 물질의 면역학적으로 활성인 막의 일부와 동일하거나 또는 유사한 다른 (폴리)사카라이드 또는 (폴리)펩티드; 박테리아 엑소- 및 엔도 독성을 포함하는 병원성 물질의 추출물, 바람직하게는 콜레라 독소 및 이. 콜리의 열불안정 독소, A-사슬 유도체, ADP-리보실레이트 활성을 포함하는 성분, 펩티도글리칸, 클로스트리디알 독소, 또는 엠. 투베르쿨로시스의 정제된 단백질 유도체, LT-R192G, 스트렙토코커스 피로게네스의 피브로넥틴-결합 단백질 I 또는 그룹 B 네이세리아 메닌기티디스(GBOMP)의 외부막 단백질; 또는 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 같은 박테리아 또는 바이러스 핵산인 것을 특징으로 하는 피부통과용 백신.
제 14 항에 있어서,

상기 리포폴리사카라이드는 리피드 A 또는 그의 유도체 및 변형체로, 가령 모노포스포릴 리피드 A, 또는 그의 유사체로, 가령 사카로스의 지방 유도체인 것을특징으로 하는 피부통과용 백신.
제 7 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,

병원성 물질에서 유도되는 병원성 물질 화합물은 유사한 항원을 사용하는 상응하는 주입 배합물을 사용한 것보다 10배 미만 내지 1000배미만 사이로 더 크고, 피부외층 투여 면역보조제 농도는 0.5 내지 100 사이의 인자, 바람직하게는 1 내지 50사이의 인자, 더욱 바람직하게는 2 내지 25 사이의 인자로 주입된 면역보조제 농도가 구별되는 것을 특징으로 하는 피부통과용 백신.
제 7 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 저분자량 자극제는 알레르기 유발원 금속이온, 산, 염기, 자극유체, (지방-)알콜, (지방-)아민, (지방-)에테르, (지방-) 설포네이트, -포스포네이트 등, 또는 기타 적당한 용매 또는 양쪽성 용매, 또는 피부 투과를 개선할 수 있는 계면활성제형 분자의 그룹 뿐만아니라 그의 유도체 또는 조합물로 이루어진 부류에서 선택되는 것을 특징으로 하는 피부통과용 백신.
제 7 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 저분자량 자극제의 농도는 같거나 상응하는 피험물에 있어서의 각 시험에서 자극제를 시험하기위해서 사용되는 통상의 표준방법으로 평가하여 국부적인 자극 때문에 허용되지 않는 농도 미만으로 적어도 2의 인자, 바람직하게는 5의 인자, 더 바람직하게는 10 이상인 것에서 선택되는 것을 특징으로 하는 피부통과용 백신.
제 7 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 알레르기 유발원은 흡입성 알레르기 유발원으로, 이에 한정되는 것은 아니지만, 다양한 꽃가루, 포자, 동물 털, 피부, 가죽, 천연 및 합성 직물의 파편, 밀, (집)먼지로, 진드기; 음식 및 약물 알레르기 유발원; 접촉 알레르기 유발원; 주입, 침습 및 축적소 알레르기 유발원으로 다양한 (위장-거주) 벌레, 에치노코시(echinococci), 선모충 등, 이식물질의 일부 등의 부류를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부통과용 백신.
제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,

사용된 항원의 투여량은 면역화 방법에서 주입되는 투여량과는 0.1 내지 100인자 정도 구별되고, 더 바람직하게는 0.5 내지 50 사이의 인자, 특히 1 내지 20 사이의 인자, 이상적으로는 주입에 사용된 것보다 10배이상 더 적은 것을 특징으로 하는 피부통과용 백신.
제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 사용된 침투제 투여량은 0.1mg/㎠ 내지 15mg/㎠, 바람직하게는 0.5mg/㎠ 내지 10mg/㎠, 더 바람직하게는 1mg/㎠ 내지 5mg/㎠ 사이인 것을 특징으로 하는피부통과용 백신.
제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 항원은 순수하거나 또는 정제된 항원인 것을 특징으로 하는 피부통과용 백신.
병에 담거나 또는 포장된 형태로 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 백신을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 23 항에 있어서,

제 11 항에 따른 특이적 항원 또는 제 12 항에 따른 특이적 알레르기 유발원의 적어도 하나의 주사제의 형태로 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 백신으로 포유류를 접종하는 것을 특징으로 하는 포유류에서 방어 면역 반응을 발생시키는 방법.
제 25 항에 있어서,

면역원 투여량 및 치료적 접종의 결과를 조절하도록 다른 치료 영역이 선택되는 것을 특징으로 하는 포유류에서 방어 면역 반응을 발생시키는 방법.
제 25 항 또는 제 26 항에 있어서,

항원이 없는 침투제의 현탁액은 투여 하루전, 바람직하게는 피부에 생성된 배합물을 투여하기 360분전, 더 바람직하게는 60분전, 더욱 바람직하게는 30분전에 항원과 결합시키는 것을 특징으로 하는 포유류에서 방어 면역 반응을 발생시키는 방법.
제 25 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,

제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 백신이 면역보조제 조작에 의해서 기관을 전처리한 후에 피부에 가하고, 상기 조작은 피부 마찰, 압착, 가열, 전기 또는 기계적 노출로 가령 초음파장 등을 포함하거나, 또는 피부에 면역원이 아닌 배합물(예를들면 히스타민)을 주입하고, 단 상기 치료는 피부 또는 기타 주변 면역-활성 조직으로부터 면역보조제 화합물을 분비시키거나 또는 목적하는 접종에 대한 길항제의 작용의 농도/기간을 감소시켜야 하는 것을 특징으로 하는 포유류에서 방어 면역 반응을 발생시키는 방법.
제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,

면역원은 비흡장성 패치에 첨가되는 것을 특징으로 하는 포유류에서 방어 면역 반응을 발생시키는 방법.
제 25 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,

적어도 하나의 백신이 투여되는 것을 특징으로 하는 포유류에서 방어 면역 반응을 발생시키는 방법.
제 30 항에 있어서,

상기 백신이 추가접종으로 투여되는 것을 특징으로 하는 포유류에서 방어 면역 반응을 발생시키는 방법.
제 31 항에 있어서,

상기 1차 면역화가 피하주사 또는 기타 적당한 피부 장벽의 천공/파괴방법을 사용하여 침습성으로 실시되고, 연속적으로 적어도 한번의 추가 면역화가 비침습성으로 실시되는 것을 특징으로 하는 포유류에서 방어 면역 반응을 발생시키는 방법.
제 25 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 백신은 알레르기 유발원이 없는 것이 사용되는 경우에 2 내지 10, 바람직하게는 2 내지 7, 더 바람직하게는 5 미만, 더욱 바람직하게는 3배 미만으로 가해지고, 알레르기 유발원이 있는 경우에는 적당한 평가 방법에 따라 측정하여 목적하는 면역-내성을 이루는데 요구되거나 또는 감염을 막는데 요구되는 양이 사용되는 것을 특징으로 하는 포유류에서 방어 면역 반응을 발생시키는 방법.
제 33 항에 있어서,

연속되는 접종들사이의 시간 간격은 2주 내지 5년, 종종 1달 내지 3년미만, 바람직하게는 2달 내지 1.5년 사이인 것이 선택되는 것을 특징으로 하는 포유류에서 방어 면역 반응을 발생시키는 방법.
제 25 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,

잘 정의된 장벽에서 다양한 공극을 통해서 면역원을 운반하는 침투제의 흐름은 장벽을 가로지르는 압력 작용 또는 적당한 구동력의 함수로서 측정되고, 상기 데이타는 배합물 또는 사용방법을 최적화하는데 사용되는 특징적인 곡선에 의해서 기술되는 것을 특징으로 하는 포유류에서 방어 면역 반응을 발생시키는 방법.
방어 또는 관용원(tolerogenic) 면역 반응을 유도하는 백신을 제조하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 따라 정의된 것과 같은 피부통과 운반체, 시토킨 또는 항-시토킨 활성을 특이적으로 유도하거나 또는 활성을 발휘하는 화합물, 항원 또는 알레르기 유발원과, 선택적으로 미생물 또는 그의 절편 또는 유도체로부터 추출물 또는 화합물 및/또는 저분자량의 화학적 자극제의 용도.