KR20010082208A

KR20010082208A - 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소

Info

Publication number: KR20010082208A
Application number: KR1020017003743A
Authority: KR
Inventors: 페트릭엠. 에프 데륵스; 수잔엠. 마드리드
Original assignee: 부쳐-랄슨 에이.; 대니스코 에이/에스
Priority date: 1998-09-30
Filing date: 1999-09-30
Publication date: 2001-08-29
Also published as: GB0103639D0; AU764169B2; US6607904B2; US6638737B1; NZ510037A; AU5993299A; EP1117806A1; CA2340789A1; JP2002525120A; BR9914146A; GB2357769A; GB9821198D0; GB2357769B; CN1321195A; WO2000018934A1; US20020150969A1

Abstract

본 발명은 숙주 세포에서 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소를 과발현하고 따라서 분비된 폴리펩티드의 수율을 증가시킴을 포함하는, 숙주 세포에서 분비가능한 폴리펩티드를 생성하는 방법을 제공한다.

Description

펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소{PEPTIDYL PROLYL CIS-TRANS ISOMERASES}

대부분의 단백질 과생성 전략(protein over-production strategies)에서, 매우 고수준의 전사를 지시할 수 있는 강한 프로모터(promoters)가 이종 단백질 및 동종 단백질을 암호하는 유전자를 과-발현하기위해 사용된다. 단백질 분비의 제한은 번역 수준 및 번역-후(post-translational) 수준에서 병목현상(bottlenecks)에 기인하기 쉽다(Tsuchiya, K. 등(1992) Applied Microbiology and Biotechnology 38:109-114). 단백질의 기능을 발휘하기위해 적절한 폴딩(folding)이 필요하다. 과발현된 이종 단백질들은 부적절하게 폴딩되어 그 다음 분비 경로를 통해 단백질 수송도중 분해될 수 있다. 따라서, 단백질 분비를 증가시키기위해 폴딩 결함의 수정이 바람직하다.

단백질의 폴딩은 두개의 이성질화 군, 즉 이황화 결합 형성을 촉진하는 단백질 이황화 이성질화 효소 및 Xaa-프롤린 결합의 이성질화를 촉진하는 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소를 포함하는 다수의 인자들에 의해 촉진된다.

S. 세레비지아에(S. cerevisiae)에서 단백질 이황화 이성질화 효소의 과발현은 인간 혈소판-유래 성장인자(platelet-derived growth factor)의 분비를 증가시킨다(Robinson 등, 1994). 그러나, A. 나이거(A. niger) 단백질 이황화 이성질화 효소의 과생성은 헨 에그 화이트 라이소자임(hen egg white lysozyme(HEWL)) 또는 글루코아밀라아제의 분비를 증가시키지 않는다(Ngiam C., Jeenes, D.J.J., Punt, P.J., van den Hondel, C.A.M.J.J., Archer, D.A.(1998); Characterisation of a foldase, PDIA, in the protein secretory pathway ofAspergillus niger; 제출됨).

단백질 폴딩에서 가장 느린 단계중 하나는 Xaa-프롤린 결합의 시스-트란스 이성질화이다. 이 이성질화는 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소가 존재하는 경우 현저히 촉진된다. 다른 생물체에서 시클로필린 군의 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소는 시험관에서 폴다아제(foldase) 활성을 갖는 것으로 나타났다(Schonbrunner E.R., Mayer S., Tropschung M., Fischer G., Takahashi N., Schmid, F.(1991); Catalysis of protein folding by cyclophilins from different species. J Biol Chem 266: 3630-3635). 이러한 이성질화 효소는 면역-억제제 시클로스포린 A에 의해 억제된다. 그러나 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소의과발현에 의한 이종 단백질의 분비에 대한 영향은 이 기술분야에서 알려져 있지 않다.

E.R.(소포체)내에서 단백질 활성은 4개 아미노산의 카르복시 말단 확장에 의해 이 구획으로 표적된다. A. 나이거(A. niger)에서 HDEL 및 KDEL은 E.R. 유지 신호(retention signal)로서 작용하는 것으로 보고되었다(Jeenes D.J.등, (1997) Gene 193:151-156).

본 발명은 새로운 효소에 관한 것이다. 보다 상세하게 본 발명은 새로운 시클로필린-성(cyclophilin-like) 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소에 관한 것이다.

본 발명의 제 1견지에 있어서, 숙주 세포에서 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소를 과발현하고 따라서 분비되는 폴리펩티드의 수율을 증가시킴을 포함하는, 숙주 세포에서 분비가능한 폴리펩티드를 생성하는 방법이 제공된다.

본 발명의 제 2견지에 있어서, 본 발명은 N-말단에 신호 서열 및 C-말단에 소포체 유지 신호, 그리고 20.7kDa의 분자량 및 6.27의 감소된 등전점(isoelectric point)을 가지며, 폴리펩티드에서 프롤린 잔기의 N 말단부상에 펩티드 결합의 시스-트란스 이성질화를 촉진하는 능력을 갖는 것으로 특징되는 폴다아제 활성을 소유하는 폴리펩티드에 관한 것이다.

제 3견지에 있어서, 본 발명은 저, 중간 또는 고 스트링전시(stringency)의 조건하에서 SEQ ID No. 1로 부터 유래된 17 염기 올리고뉴클레오티드와 하이브리드가능한 핵산으로 암호화되며, 폴리펩티드에서 프롤린 잔기의 N 말단부상에 펩티드 결합의 시스-트란스 이성질화를 촉진하는 능력을 갖는 것으로 특징되는 폴다아제 활성을 소유하는 폴리펩티드에 관한 것이다.

제 4견지에 있어서, 본 발명은 저, 중간 또는 고 스트링전시(stringency)의 조건하에서 SEQ ID No. 2로 부터 유래된 20 염기 올리고뉴클레오티드와 하이브리드 가능한 핵산으로 암호화되며, 폴리펩티드에서 프롤린 잔기의 N 말단부상에 펩티드 결합의 시스-트란스 이성질화를 촉진하는 능력을 갖는 것으로 특징되는 폴다아제 활성을 소유하는 폴리펩티드에 관한 것이다.

제 5견지에 있어서, 본 발명은 SEQ ID No. 2와 최소 40% 일치하며, 폴리펩티드에서 프롤린 잔기의 N 말단부상에 펩티드 결합의 시스-트란스 이성질화를 촉진하는 능력을 갖는 것으로 특징되는 폴다아제 활성을 소유하는 폴리펩티드에 관한 것이다.

[도명의 간단한 설명]

도 1은 A. 나이거(A. niger) cypB를 암호하는 플라스미드 pPD23의 제한 지도이다.

도 2는 오르피노미세스(Orpinomyces), M. 무스쿨루스(M. musculus) 및 H. 사피엔스(H. sapiens)의 펩티딜 시스-트란스 이성질화 효소를 갖는cypB 유전자의 배열을 나타낸다.

도 3은cypB 유전자 및 오르피노미세스(Orpinomyces) PPI 유전자 사이 최적화된 배열을 나타낸다.

도 4는lipA유전자를 암호하는 pLIP4를 나타낸다.

도 5는 ppd23d13을 나타낸다.

도 6은 ppd23d14를 나타낸다.

도 7은 ppd38d3을 나타낸다.

본 발명은 숙주 세포로 부터 분비되는 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 펩티딜-프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소의 과발현에 관한 것이다. 세포에서 PPI의 수준을 증가시키는 것이 그 세포로 부터 폴리펩티드의 분비를 촉진시키는데 효과적임을 발견하였다. PPI는 이들의 잘못된 폴딩의 수준을 감소시킴으로써 ER에서 폴리펩티드 생성물의 유지 및 이들의 후속적인 분해를 억제하는 것으로 여겨진다. 따라서, 본 발명은 특히 세포로부터 분비되는 폴리펩티드의 수율을 증가시키는데 적절하다.

본 명세서에 사용된, 용어 "펩티딜-프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소" 폴리펩티드(PPI)는 폴리펩티드에서 프롤린 잔기의 N 말단부상에 펩티드 결합의 시스-트란스 이성질화를 촉진할 수 있는 효소를 칭한다. PPIs는 도처에 편재해 있으며 여러 예가 이 기술분야에 알려져 있다. 예로서 시클로필린(cyclophilin)(참조, 예를 들어 Bergsma 등(1991) J. Bio. Chem. 266:23204-23214), 파불린(parvulin), SurA(Rouviere 및 Gross, (1996) Genes Dev. 10:3170-3182) 및 FK506 결합 단백질 FKBP52가 포함된다. PPI는 폴리펩티드에서 펩티딜-프롤릴 결합의 시스-트란스 이성질화를 책임지며, 따라서 올바른 폴딩을 촉진한다. 본 발명은 PPI 활성을 갖는 어떠한 폴리펩티드도 포함한다. 이것은 셰퍼론(chaperone) 폴리펩티드 또는 PPI 활성을 갖는 이들의 단편을 포함한다(Wang & Tsou, (1998) FEBS lett. 425:382-384). 바람직하게, 본 발명은 시클로필린군의 PPI 폴리펩티드에 관한 것이다.

이득적으로, 숙주 세포는 이종 유전자 생성물을 발현하는 형질전환된 숙주 세포이다. 특히 이종 유전자 생성물이 과발현되는 경우, 그 결과물인 폴리펩티드는 잘못된 폴딩을 이루는 경향이 있으며 따라서 상기 제 4견지에서와 같이 ER에서 분해되는 것이 증가한다. 이러한 환경하에서, 따라서 본 발명에 따른 PPI의 과발현은 매우 이득적이다.

그러나, 본 발명은 또한 숙주 세포에서 동종 폴리펩티드의 생성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 천연 생물학적 공정에 의해 또는 유전자 전사를 상향 조절할 수 있는 약제의 투여로 동종 폴리펩티드의 전사가 증가되어, 그 결과 세포 활성이 증가되는 경우 유용하다. 더욱이, 세포는 예를 들어 내생적(endogenous) 프로모터에 활성적인 전사 인자를 암호하는 발현 시스템과 같은 내생적 유전자를 상향조절할 수 있는 발현 시스템으로 형질전환될 수 있다.

이와 유사하게, PPI 발현의 상향 조절은 내생적 PPI의 발현을 증가시킴으로써 또는 상승된 수준으로 PPI 생성이 가능한 암호 서열로 숙주 세포를 형질도입시킴으로써 이루어질 수 있다. 이득적으로, 숙주 세포는 PPI-암호 서열로 형질전환된다.

따라서 바람직한 구체화로, 본 발명은 분비가능한 폴리펩티드를 암호하는 제1 암호 서열 및 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소를 암호하는 제2 암호 서열로 세포를 공형질감염(cotransfecting)함을 포함하는, 숙주 세포에서 분비가능한 폴리펩티드를 생성하는 방법에 관한 것이다.

이득적으로, 본 발명은

a) 본 발명에 따른 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소를 발현하는 암호 서열로 세포를 형질전환하는 단계;

b) 원하는 폴리펩티드를 발현하는 암호 서열로 상기 세포를 형질전환하는 단계; 및

c) 상기 폴리펩티드를 생성하기 위해 상기 세포를 배양하는 단계;

를 포함하는 숙주 세포에서 분비가능한 폴리펩티드를 발현시키는 방법에 관한 것이다.

본 명세서에 사용된, 형질감염 및 형질전환은 동등한 것으로 여겨지며, 그리고 바이러스성 형질도입, 일렉트로포레이션(electroporation) 및 통상적인 형질감염 기술을 포함하는 어떠한 형태의 DNA의 세포로의 삽입을 포함한다. 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소 및 원하는 폴리펩티드를 암호하는 암호 서열은 벡터로 또는 독립적으로 본래의 DNA로서 세포에 삽입될 수 있다. 벡터의 사용이 바람직하다. 상기 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소 및 원하는 폴리펩티드가 별도의 벡터에 존재하는 경우, 상기 별도의 벡터중 하나가 다른 벡터가 삽입되기전에 숙주 세포에 삽입될 수 있다. 증가된 수준의 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소가 상기 원하는 폴리펩티드의 발현도중에 상기 숙주 세포내에서 획득되어지는한 삽입 순서는 중요하지 않다.

이득적으로, 상기 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소 및 원하는 폴리펩티드는 동일한 벡터에 존재한다.

바람직하게, 숙주 세포는 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소를 발현하는 암호 서열이 상기 숙주 세포 및 지놈(genome)내에 삽입되는 것으로 구성될 수 있다. 이것은 상기 암호 서열로 세포를 형질전환하는 통합 발현 벡터를 사용하여 달성될 수 있다.

상기한 바와 같이, 바람직하게 상기 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소를 발현하는 암호 서열이 적절한 벡터에 편입된다. 본 명세서에 사용된, 벡터(또는 플라스미드)는 이들의 발현 혹은 복제용으로 이종 DNA를 세포내로 도입하는데 사용되는 분리된 요소(discrete elements)이다. 이와 같은 운반체의 선택 및 사용은 이 기술분야에서 숙련된 자에게 잘 알려져 있다. 다수의 벡터가 유용하며, 적절한 벡터의 선택은 벡터의 계획된 사용 및 벡터로 형질전환되는 숙주 세포에 따라 달라진다. 모든 벡터는 그 기능 및 상호호환가능한 숙주 세포에 따라 여러가지 구성요소를 함유한다. 일반적으로 벡터 구성요소는 이에 한정하는 것은 아니지만, 하기중 하나 또는 그 이상을 포함한다: 복제 오리진, 하나 또는 그 이상의 마커 유전자, 인핸서(enhancer) 요소, 프로모터, 전사 종결 서열 및 신호 서열.

대부분의 발현 벡터는 셔틀 벡터이다. 즉, 이들은 최소 하나의 생물체 부류에서 복제가능하지만, 발현을 위해서 또 다른 부류 또는 다른 생물체내로 형질감염될 수 있다. 예를 들어, 벡터는E. coli에서 클로닝될 수 있으며 그 다음 그 동일한 벡터는 그 숙주 세포 염색체에 독립적으로 복제가 불가능하더라도 효모 혹은 다른 균류 세포내로 형질감염될 수 있다. DNA는 또한 예를 들어, PCR에 의해 증폭될수 있으며 그리고 어떠한 복제 요소없이 숙주 세포내로 직접 형질감염될 수 있다.

이득적으로, 발현 벡터는 선택 유전자(선택가능한 마커로도 불리움)를 포함할 수 있다. 이 유전자는 선택적인 배지에서 자란 형질전환된 숙주 세포의 생존 혹은 성장에 필요한 단백질을 암호한다. 상기 선택 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포는 상기 배지에서 생존하지 못할 것이다. 전형적인 선택 유전자는 항생제 및 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 혹은 테트라사이클린과 같은 다른 독소에 내성을 갖는 단백질들, 보충 영양요소 결핍 또는 복합 배지에 유용하지 않은 공급 임계 영양소들을 암호한다.

효모 및 다른 균류 생물체에 적절한 선택적 유전자 마커로서, 어떠한 마커 유전자도 마커 유전자의 표현형적 발현에 기인하는 형질전환체의 선택을 촉진하는데 사용될 수 있다. 효모에 적절한 마커는 예를 들어, 항생제 G418, 하이그로마이신 또는 블레오마이신에 내성을 갖는 것들 또는 예를 들어, URA3, LEU2, LYS2, TRP1 또는 HIS3 유전자와 같은 영양요소적 효모 돌연변이에서 원영양(prototrophy)을 제공하는 것들이다.

벡터의 복제는 E. coli에서 편리하게 이루어지므로, E. coli 유전 마커 및 E. coli 복제 오리진이 이득적으로 포함된다. 이들은 pBR322, Bluescript^ⓒ벡터또는 예를 들어, 모두 E. coli 복제 오리진 및 암피실린과 같은 항생제에 내성을 갖는 E. coli 유전 마커를 함유하는 pUC18 혹은 pUC19와 같은 pUC 플라스미드와 같은 E. coli 플라스미드로 부터 획득될 수 있다.

발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 생물제에 의해 인지되는 프로모터를 함유하며 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소를 암호하는 핵산에 실시가능하게 연결되어 있다. 이와 같은 프로모터는 유도가능하거나 구성적일 수 있다. 상기 프로모터는 제한 효소 절단에 의해 소스 DNA로 부터 상기 프로모터를 제거하고 그리고 상기 분리된 프로모터를 상기 벡터내로 삽입시킴으로써 상기 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소를 암호하는 DNA가 실시가능하게 연결된다. 본래의 프로모터 서열 및 다수의 이종 프로모터들은 상기 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소 암호 서열의 직접적인 증폭 및/또는 발현에 사용될 수 있다. 상기 용어 "실시가능하게 연결된"은 상기 구성요소들이 이들의 계획된 방식으로 작용하도록 하는 관계로 존재하는 병렬배치(juxtaposition)를 가리킨다. 암호 서열에 대하여 "실시가능하게 연결된" 조절 서열은 상기 암호 서열의 발현이 상기 조절 서열과 호환가능한 조건하에서 이루어지는 방식으로 연결된다.

효모 숙주에 적절한 프로모팅 서열은 조절되거나 구성될 수 있으며 바람직하게 고발현되는 균류 유전자로 부터 유래된다. 균류 프로모터는 문헌에 알려져 있다(예를 들어, 참조 Gurr 등(1987) The structure and organisation of nucleargenes of filamantous fungi. In Kinghorn, J.R.(ed), Gene Structure in Eukaryotic Microbes, IRL Press, Oxford, pp. 93-139). 효모 프로모터는 효모 TRP1 유전자, ADHI 또는 ADHII 유전자, 산성 인산 효소(PH05) 유전자의 프로모터, a- 또는 α-인자를 암호하는 효모 교배 페로몬 유전자의 프로모터 또는 에놀라아제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(GAP), 3-포스포 글리세레이트 키나아제(PGK), 헥소키나아제, 피루베이트 탈카르복시화 효소, 포스포프룩토키나아제(phosphofructokinase), 글루코스-6-포스페이트 이성질화 효소, 3-포스포글리세레이트 뮤타아제, 피루베이트 키나아제, 트리오스 포스페이트 이성질화 효소, 포스포글루코스 이성질화 효소 또는 글루코키나아제 유전자,S. cerevisiaeGAL 4 유전자,S. pombenmt 1 유전자 또는 TATA 바인딩 단백질(TBP) 유전자의 프로모터와 같은 당분해 효소를 암호하는 유전자로 부터 유래된 프로모터가 사용될 수 있다. 또한, 예를 들어, 효모 PH05 유전자의 업스트림 활성화 서열(UAS(s)) 및 효모 GAP 유전자(PH05-GAP 하이브리드 프로모터)의 작용 TATA 박스를 포함하는 다운스트림 프로모터 요소를 포함하는 하이브리드 프로모터와 같이, 효모 유전자의 UAS 및 다른 효모 유전자의 작용 TATA 박스를 포함하는 다운스트림 프로모터 요소를 포함하는 하이브리드 프로모터를 사용하는 것이 가능하다. 적절한 구성 PH05 프로모터는 예를 들어, PH05 유전자의 뉴클레오티드-173에서 시작하며 뉴클레오티드-9에서 끝나는 PH05(-173) 프로모터와 같은 업스트림 조절 요소(UAS)의 단축된 산성 인산 효소 PH05 프로모터이다.

본 발명과 관련되어, 예를 들어 생물공학 산업에 사용되는 필라멘트성 균류; 바람직하게 아스퍼질러스(Aspergillus),트리코데르마(Trichoderma),뉴로스포라(Neurospora),뮤코(Mucor) or 페니실리움(Penicillium)과 같은 균류 생물체를 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 바람직한 숙주 생물체는 A. 니듈란스(A. nidulans), A. 튜비제네시스(A. tubigensis),A. 소자에(A. sojae),A. 아와모리(A. awamori),A. 오리자에(A. oryzae),A. 자포니쿠스(A. japonicus),A. 아쿨레나투스(A. aculenatus),N. 크라사(N. crassa),T. 리세이(T. reesei) 및 T. 비리데(T. viride)이다. 본 발명의 핵산 구조물의 발현 및 본 발명에 따른 이종 폴리펩티드의 제조에 바람직한 숙주 생물체는 아스퍼질러스(Aspergillus) 속의 생물체, 이득적으로 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)이다. 이러한 관점으로, 본 발명에 따른 형질변환 아스퍼질러스(Aspergillus)는 Rambosek, J. 및 Leach, J.(1987)(Recombinant DNA in filamentous fungi: Progress and Prospects. CRC Crit. Rev. Biotechnol. 6:357-393), Davis R.W.(1994)(Heterologous gene expression and protein secretion inAspergillus. In: Martinelli S.D., Kinghorn J.R.(편집자)Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp 525-560), Ballance, D.J.(1991)(Transformation systems for Filamentous Fungi and an Overview of Fungal Gene structure. In: Leong, S.A., Berka R.M.(편집자) Molecular Industrial Mycology. Systems and Applications for Filamentous Fungi. Marcel Dekker Inc. New York 1991. pp 1-29) 및 Turner G.(1994)(Vectors for geneticmanipulation. In: Martinelli S.D., Kinghorn J.R.(편집자)Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp. 641-666)의 가르침에 따라 제조될 수 있다. 하기 설명은 본 발명에 따른 형질변환 아스퍼질러스(Aspergillus) 제조 방법을 요약한 것이다.

형질변환 아스퍼질러스(Aspergillus)를 제조하기위해, 발현 구조물은 이종 뉴클레오티드 서열(아밀라아제 효소를 암호하는 핵산 서열과 같은)을 필라멘트성 균류에서 발현용으로 설계된 구조물내에 삽입함으로써 제조된다.

이종 발현에 사용되는 여러가지 타입의 구조물이 발달되어 왔다. 본 발명에 따른 프로모터를 함유하는 구조물은 균류에서 활성적이다. 상기 이종 뉴클레오티드 서열은 이종 뉴클레오티드 서열로 암호화된 단백질이 분비되도록 하는 신호 서열과 융합될 수 있다. 일반적으로 균류 오리진의 신호 서열이 사용된다. 균류에서 활성적인 종결자(terminator)가 또한 사용될 수 있다.

이종 뉴클레오티드 서열이 안정한 단백질을 암호하는 균류 유전자와 융합되는 경우 다른 타입의 발현 시스템이 균류에서 발달해 왔다. 이것은 원하는 폴리펩티드를 암호하는 이종 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 단백질을 안정화시킬 수 있다. 이와 같은 시스템에서 특정 프로테아제에 의해 인지되는 분열 부위(cleavage site)가 균류 단백질과 이종 뉴클레오티드 서열로 암호화된 단백질 사이에 도입될수 있으며, 이렇게 제조된 융합 단백질은 상기 특정 프로테아제에 의해 이 지점에서 분리되어 따라서 상기 이종 뉴클레오티드 서열로 암호화된 단백질을 유리시킬 수 있다. 예를 들면, 적어도 일부 아스퍼질리(Aspergilli)에서 발견되는 KEX-2성 펩티드 가수분해효소에 의해 인지되는 부위가 도입될 수 있다(Broekhuijsen 등(1993), J Biotechnol31135-145). 이와 같은 융합은 생체내에서 분열(cleavage)을 이끌어 발현된 생성물을 보호하며 보다 큰 융합 단백질이 되지 않도록 한다.

아스퍼질러스(Aspergillus)에서 이종 발현은 세균, 균류, 척추동물 및 식물의 단백질을 암호하는 여러 유전자에서 보고되어 왔다. 안정성 및 숙주 스트레인 변형과 관련하여, 일부 이종 단백질은 이들이 균류의 배양액으로 분비될 때 아주 안정하지는 않다. 대부분의 균류는 이종 단백질을 분해하는 여러개의 세포외 프로테아제를 생성한다. 이러한 문제를 피하기 위해 감소된 프로테아제 생성을 갖는 특정 균류 스트레인이 이종 생성용 숙주로서 사용되어 왔다.

필라멘트성 균류의 형질전환을 위해, 다수의 필라멘트성 균류용으로 여러개의 형질전환 프로토콜이 발달되어 왔다(Ballance 1991,ibid). 이들 대부분은 원형질체의 준비 및 그 원형질체내에 PEG 및 Ca²⁺이온을 이용한 DNA의 도입에 기초한다. 그 다음 상기 형질전환된 원형질체는 재생성하며(regenerate) 형질전환된 균류는여러가지 선택 마커를 사용하여 선택된다. 형질전환에 사용되는 마커에는argB,trpC,niaD및pyrG와 같은 다수의 영양 요구성 마커, 베노밀(benomyl) 내성, 하이그로마이신 내성 및 플레오마이신 내성과 같은 항생제 내성 마커가 있다. 일반적으로 사용되는 형질전환 마커는 다수의 복제수로 균류가 단독 질소원으로서 아크릴아미드로 성장하도록 하는 A. 니둘란스(A. nidulans)의amdS유전자이다.

균류 생물체에 의한 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소 암호 DNA의 전사는 벡테내에 인핸서 서열을 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 상대적으로 방향 및 위치 독립적이다.

발현 벡터는 이와 같은 DNAs를 발현할 수 있는 프로모터 부위와 같은 조절 서열과 실시가능하게 연결된 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소 암호 핵산을 발현할 수 있는 어떠한 벡터를 포함한다. 따라서, 발현 벡터는 적절한 숙주 세포내로 도입시 클론된 DNA를 발현하는 플라스미드, 파아지, 재조합 바이러스 또는 이외 다른 벡터와 같은 재조합 DNA 또는 RNA 구조물을 칭한다. 적절한 발현 벡터는 이 기술분야에 숙련된 자에게 잘 알려져 있으며 진핵 세포 및/또는 원핵 세포에서 복제가능한 것들 및 에피솜에 유지되는 것들 혹은 숙주 세포 지놈내에 통합되는 것들을 포함한다.

본 발명에 따른 벡터의 구조물은 통상적인 결찰(ligation) 기술을 사용한다.분리된 플라스미드 또는 DNA 단편은 분열되고, 맞춰지고(tailored) 그리고 원하는 형태로 재결찰되어 필요한 플라스미드를 생성한다. 필요한 경우, 상기 구성된 플라스미드내의 올바른 서열을 확인하는 분석이 알려진 방식으로 수행된다. 발현 벡터를 구성하고, 시험관에서 전사물을 제조하고, DNA를 숙주 세포내로 도입시키고 그리고 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소 발현 및 작용에 대한 분석을 수행하는데 적절한 방법은 이 기술 분야에서 숙련된 자에게 알려져 있다. 유전자 존재, 증폭 및/또는 발현은 예를 들어, 통상적인 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 측정하는 노던 블롯팅, 도트 블롯팅(DNA 또는 RNA 분석), 또는 본 명세서에 제공된 서열에 기초하여 적절히 표지된 프로브를 사용한 원 위치 결합(in situ hybridisation)과 같이 직접적으로 시료에서 측정될 수 있다. 이 분야에서 숙련된 자는 원하는 경우 이러한 방법을 어떻게 변형하는지 쉽게 구상할 수 있을 것이다.

상기 동일한 또는 유사한 방법이 원하는 폴리펩티드를 암호하는 벡터를 구상하는데 적용될 것이다. 이것이 필요없음에도 불구하고, 이것은 상기 PPI 및 원하는 폴리펩티드가 상기 동일한 벡터상에, 아니면 에피솜으로 또는 통합에 의해 암호화되어 이들로부터 발현되도록한다. 바람직하게, 상기 원하는 폴리펩티드는 상기 숙주 생물체로 부터 유래되지않은 이종 뉴클레오티드 서열로 암호화된다.

원하는 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열의 전형적인 예는 대사 및 이화 공정을 조절하는 단백질 및 효소를 암호하는 서열을 포함한다. 이종 뉴클레오티드 서열은 병원 내성을 도입하거나 증가시키는 인자를 암호할 수 있다. 이종 뉴클레오티드 서열은 비-본래적인 필라멘트성 균류 단백질, 바람직하게 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 또는 동물 또는 사람에 이득적인 화합물을 암호할 수 있다. 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열의 예는 펙티나아제, 펙틴 디폴리머라아제, 폴리갈락튜로나아제, 펙테이트 리아제, 펙틴 리아제, 헥소스 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 리파아제, 글루칸 리아제, 람노갈락튜로나아제, 헤미셀룰라아제, 엔도-β-글루카나아제, 아라비나아제, 또는 아세틸 에스테라아제 또는 이들의 안티센스 서열 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 원하는 폴리펩티드는 식품 또는 작물에 영양 가치를 주는 단백질일 수 있다. 전형적인 예는 항-영양 인자의 형성을 억제할 수 있는 식물 단백질 및 보다 바람직한 아미노산 조성을 갖는 식물 단백질(예, 형질전환되지 않은 식물보다 라이신이 보다 많이 함유된 식물 단백질)을 포함한다.

상기 원하는 폴리펩티드는 키모신(chymosin), 타우마틴(thaumatin) 및 α-갈락토시다아제와 같은 식품 공정에 사용될 수 있는 효소일 수 있다. 나아가 상기 원하는 폴리펩티드는 페스트 독소, ADP-글루코스 피로포스릴라아제(예, 참조 EP-A-0455316), 또는 글루카나아제 또는 지놈의 β-1,4-엔도글루카나아제 중 어느 하나일 수 있다.

상기 이종 뉴클레오티드 서열은 인트론이 센스 또는 안티센스 방향일 수 있는 특정 뉴클레오티드 서열의 인트론을 암호할 수 있다.

상기 이종 뉴클레오티드 서열은 PCT 특허 출원 PCT/ET96/01009에 사용되는 아라비노퓨라노시다아제(arabinofuranosidase) 효소를 암호하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상기 이종 뉴클레오티드 서열은 PCT 특허 출원 PCT/ET94/01082에 사용되는 ADP-글루코스 피로포스포릴라아제 효소를 암호하는 어떠한 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상기 이종 뉴클레오티드 서열은 PCT 특허 출원 PCT/ET94/03397에 기술되어 있는 α-글루칸 리아제 효소를 암호하는 어떠한 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상기 이종 뉴클레오티드 서열은 PCT 특허 출원 PCT/EP95/02607에 기술되어 있는 T. 랭구이노수스(T. languinosus) 아밀라아제를 암호하는 어떠한 서열일 수 있다. 상기 이종 뉴클레오티드 서열은 PCT/EP96/01008에 기술되어 있는 글루카나아제 효소를 암호하는 어떠한 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

본 발명의 바람직한 견지로, 상기 핵산을 암호하는 PPI는 또한 이들에 실시가능하게 연결된 ER 유지 신호를 포함할 수 있다. 바람직하게 상기 ER 유지 신호는 이득적으로 HDEL, HEEL 또는 KDEL인 테트라펩티드이다. 상기 ER 유지 신호는 ER에 대한 폴리펩티드를 표적하며 그안에 유지되도록 한다.

본 발명의 제 2 견지에 있어서, 폴다아제 활성을 가지며 그리고 N-말단에 신호 서열 및 C-말단에 소포체 유지 신호, 그리고 20.7kDa의 분자량 및 6.27의 감소된 등전점(isoelectric point)을 가지며, 폴리펩티드에서 프롤린 잔기의 N 말단부상에 펩티드 결합의 시스-트란스 이성질화를 촉진하는 능력을 갖는 것으로 특징되는 폴리펩티드가 제공된다. 이득적으로, 본 발명의 이러한 견지에 따른 새로운 PPI는 예를 들어, 생물공학 산업에 사용되는 것들과 같은 필라멘트성 균류; 바람직하게 아스퍼질러스(Aspergillus), 트리코데르마(Trichoderma) 또는 페니실리움(Penicillium); 바람직하게 A. 나이거(A. niger)와 같은 균류 생물체로 부터 획득될 수 있다.

본 발명에 따른 PPI의 예는 SEQ ID No. 2의 배열이다. 이 서열로 밝혀진 분자는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)로 부터 얻을 수 있으며 본 명세서에서 CYPB로 나타낸다. 상기 배열 기준을 만족하는 PPI 효소는 본 명세서에서 일반적으로 "CYPB" 효소로 칭한다. 따라서, 바람직한 견지로, 본 발명은 SEQ ID No. 2의 배열인 CYPB 또는 이들의 바이오이소스테어(bioisostere)를 제공한다.

본 명세서에 사용된 "바이오이소스테어"는 이 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 것으로, 유사한(그러나 동일하지 않은) 또는 다른 구조를 가지며 그리고 동일한 생물학적 작용 효과를 갖는 화합물을 일컫는 것으로 사용된다.

이득적으로, 본 발명의 바이오이소스테어"는 예를 들어, 생물공학 산업에 사용되는 것들과 같은 필라멘트성 균류; 바람직하게 아스퍼질러스(Aspergillus), 트리코데르마(Trichoderma) 또는 페니실리움(Penicillium); 바람직하게 A. 나이거(A. niger)와 같은 균류 생물체로 부터 획득될 수 있다.

본 발명의 제 4 견지에 있어서, 본 발명에 따른 효소를 암호하는 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 재조합 단백질 제조에 유용할 뿐만 아니라 또한 프로브로서 유용하여, 따라서 이 기술 분야에서 숙련된 자가 PPIs 암호 핵산 또는 이들의 동종을 확인 및/또는 분리하는것을 쉽도록 할 수 있다. 상기 핵산은 표지되지않거나 또는 검출가능한 부로 표지될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 핵산은 예를 들어, 테스트 시료 핵산에 PPI를 암호하는(또는 상보적인) DNA(또는 RNA)를 하이브리드하고 상기 PPI의 존재를 검출함을 포함하는 PPI-특이 핵산의 존재를 검출하는 방법에 유용하다. 다른 견지로, 본 발명은 이들의 단편 PPI를 암호하는 핵산 서열에 상보적이거나 또는 엄격한 조건하에서 하이브리드되는 핵산 서열을 제공한다.

이득적으로, PPI-암호 핵산의 단편은 10-200뉴클레오티드 길이, 바람직하게 15-50뉴클레오티드 길이 그리고 가장 바람직하게 약 20뉴클레오티드 길이이다.

본 발명은 상기 PPI를 암호하는(또는 상보적인) 핵산(DNA 또는 RNA)과 핵산 중합효소 (연쇄) 반응을 시발함을 포함하는 핵산 시험 시료를 증폭시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 견지로, 상기 핵산은 DNA이며 나아가 벡터에 의해 형질전환된 숙주에 의해 인지되는 조절 서열에 실시가능하게 연결된 PPI를 암호하는 핵산 서열을 포함하는 복제가능한 벡터를 포함한다. 또한 본 발명은 이와 같은 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및 상기 형질전환된 숙주 세포의 배양물에서 PPI-암호 핵산을 발현시키는 단계 및 필요한 경우, 상기 숙주 세포 배양물로 부터 PPI를 회수하는 단계를 포함하는 PPI의 생성에 효과적인 PPI를 암호하는 핵산을 사용하는 방법을 제공한다.

나아가, 본 발명은 분리된 PPI 단백질 및 상기 핵산에 의해 암호화된 이들의 바이오이소스테어에 관한 것이다.

분리된 PPI 핵산은 천연 소스의 PPI 핵산 또는 DNA 도서관 등과 같은 천연그대로의 핵산 제조물과 일반적으로 관련된 핵산을 갖는 최소 하나의 오염 핵산이 없는 핵산을 포함한다. 따라서 분리된 핵산은 천연으로 발견되는 형태 또는 셋팅과는 다르게 존재한다. 그러나, 분리된 PPI 암호 핵산은 일반적으로 상기 핵산이 천연 세포의 염색체 위치와 다른 염색체 위치에 존재하거나 또는 천연에서 발견되는 것과는 다른 DNA 서열로 나열되는 PPI-발현 세포내의 PPI 핵산을 포함한다.

본 발명에 따라, 예를 들어, SEQ. ID. No. 2의 서열 배열을 갖는 CYPB를 암호하는 DNAs 또는 RNAs 또는 이들의 단편과 같은 분리된 핵산이 제공된다. 특히,본 발명은 SEQ. ID. No. 2의 배열과 같은 CYPB를 암호하는 DNA 분자 또는 이들의 단편을 제공한다. 정의에 의하면, 이와 같은 DNA는 코딩 단일 가닥 DNA, 상기 코딩 DNA의 이중 가닥 DNA 및 이들의 상보적인 DNA, 또는 그 상보적인(단일 가닥) DNA 자체를 포함한다.

바람직한 CYPB 암호 서열은 실질적으로 SEQ. ID. No. 2의 암호 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열이며, 상기 SEQ. ID. No. 2의 암호 서열과 동일한 서열을 갖는 핵산이 가장 바람직하다. 본 명세서에 사용된, 상기 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열은 최소 90% 동일성을 공유한다.

프로브로 또는 이외 다르게 사용되는 본 발명의 핵산은 바람직하게 SEQ. ID. No. 2에 나타낸 CYPB 서열과 실질적으로 일치한다. 여기서 서열 동일성을 나타내는 "실질적인 동종성"은 직접적인 서열 배열 및 비교에 의한 판단시 40% 서열 동일성, 바람직하게 45% 서열 동일성 및 가장 바람직하게 50% 또는 그 이상의 서열 동일성을 의미한다.

실질적으로 동종성인 아미노산 서열 및 핵산 서열은 75%이상의 동종성을 가질 수 있다(예를 들어, 최소 90% 동종성과 같은 최소 80% 동종성 또는 최소 85% 동종성, 또는 최소 97% 동종성과 같은 최소 95% 동종성). 뉴클레오티드 서열 동종성은 Myers 및 Miller의 프로그램 "Align"("Optimal Alignments in Linear Space",CABIOS 4, 11-17, 1988)을 사용하여 조사될 수 있으며 NCBI에서 이용가능하다. 택일적으로 또는 부가적으로, 상기 용어 "동종성"은 예를 들어, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 관하여 두 서열간의 정량적인 동종성 측정을 나타낼 수 있다. 퍼센트 서열 동종성은 (N _ref - N _dif )*100/N _ref 로 계산될 수 있으며, 여기서 N _dif 는 정렬시 두 서열에서 동일하지 않은 잔부의 총수이며 그리고 N _ref 는 상기 두 서열중 한 서열에 있는 잔부의 수를 나타낸다. 그러므로, DNA 서열 AGTCAGTC는 서열 AATCAATC와 75% 서열 동일성을 갖는다(N _ref = 8; N _dif = 2). 택일적으로 또는 부가적으로, 서열에 관련된 "동종성"은 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산을 갖는 위치들의 수를 두 서열중 보다 짧은 서열의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수로 나눈 것으로 할 수 있으며, 여기서 상기 두 서열들의 배열은 Wilbur 및 Lipman 알고리즘에 따라 결정될 수 있으며(Wilbyr and Lipman, 1983 PNAS USA 80:726), 예를 들어, 20 뉴클레오티드의 윈도우 사이즈, 4 뉴클레오티드의 워드 길이 및 4개의 갭 페널티(gap penalty)를 사용하고, 그리고 컴퓨터-보조 분석 및 배열을 포함하는 상기 서열의 해석이 상업적으로 이용가능한 프로그램(예, Intelligenetics^TMSuite, Intelligenetics Inc. CA)을 이용하여 통상적으로 수행될 수 있다. RNA 서열이 DNA 서열과 유사하거나 또는 DNA 서열과 서열 동일성 또는 동종성을 갖는 경우, DNA 서열의 티미딘(T)은 RNA 서열의 우라실(U)과 동일한 것으로 간주된다.

본 발명의 견지내에 있는 RNA 서열은 DNA의 티미딘(T)이 RNA 서열의우라실(U)과 동일한 것으로 간주됨으로써 DNA 서열로 부터 유래될 수 있다.

부가적으로 또는 택일적으로, 아미노산 서열 유사성 또는 동일성 또는 동종성은 BlastP 프로그램을 사용하여 조사될 수 있으며(Altschul 등, Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402) 그리고 이득적으로 기정 매개변수(default parameter)를 사용하는 NCBI에서 이용가능하다. 하기 참고문헌들은 두 단백질의 아미노산 잔기의 상대적인 동일성 또는 동종성을 비교하는 알고리즘을 제공하며 그리고 상기와 관련되어 부가적으로 또는 택일적으로, 이러한 참고문헌들의 가르침이 퍼센트 동종성 또는 동일성을 조사하는데 이용될 수 있다: Needleman SB 및 Wunsch CD, "A general method applecable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins,"J. Mol. Biol.48:444-453(1970); Smith TF 및 Waterman MS, "Comparison of Bio-sequences,"Advances in Applied Mathematics2:482-489(1981); Smith TF, Waterman MS 및 Sadler JR, "Statistical characterization of nucleic acid sequence functional domains,"Nucleic Acids Res., 11:2205-2220(1983); Feng DF 및 Dolittle RF, "Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenectic trees,"J. of Molec. Evol., 25:351-360(1987); Higgins DG 및 Sharp PM, "Fast and sensitive multiple sequence alignment on a microcomputer,"CABIOS, 5: 151-153(1989); Thompson JD, Higgins DG 및 Gibson TJ, "ClusterW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighing, positions-specific gappenalties and weight matrix choice,"Nucleic Acid Res., 22:4673-480(1994); 및, Devereux J, Haeberlie P 및 Smithies O, "A comprehensive set of sequence analysis program for the VAX,"Nucleic Acid Res., 12: 387-395(1984).

바람직하게, 본 발명에 따른 핵산은 CYPB-암호 서열의 단편이다. 몇개의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게 5-150 뉴클레오티드 길이의 핵산 서열의 단편이 프로브로서 특히 유용하다.

예를 들어 핵산은 CYPB 단백질을 암호하며 그리고 SEQ ID No. 2의 4번째 DNA 서열 세트 또는 상기 DNA 서열의 선택된 단편에 하이브리드되는 뉴클레오티드 서열로 특징지을 수 있다. 이와 같은 서열은 고 스트링전시(high stringency) 조건하에서 SEQ ID No. 2의 서열 또는 상기한 바와 같은 단편에 하이브리드되는 CYPB 암호 서열이 바람직하다.

하이브리드화의 엄격한 조건은 폴리뉴클레익 산 하이브리드가 안정한 조건을 나타낸다. 이와 같은 조건은 이 기술 분야에서 숙련된 자에게 명확하다. 이 기술 분야에서 숙련된 자에게 알려진 바와 같이, 하이브리드의 안정성은 약 1-1.5℃ 감소되어 각 서열 동종성이 1% 감소되는 하이브리드의 융해 온도에 반영된다. 일반적으로, 하이브리드의 안정성은 나트륨 이온 농도와 온도의 함수이다. 전형적으로, 하이브리드화 반응은 여러가지 엄격한 조건들이 세정되는 보다 높은 엄격한 조건하에서 수행된다.

본 명세서에 사용된, 고 스트링전시 조건은 65-68℃의 1M Na⁺또는 등가 염 농도에서 안정한 하이브리드를 형성하는 핵산 서열들만 하이브리드화되는 조건을 나타낸다. 고 스트링전시 조건은 예를 들어, 6×SSC, 5×Denhardt's, 1% SDS(소디움 도데실 술페이트), 0.1 Na⁺피로포스페이트 및 비특이 경쟁인자(non specific competitor)로서 0.1mg/ml 변성된 연어 정자 DNA를 함유하는 수용액에서 하이브리드화함으로써 제공될 수 있다. 하이브리드화 후, 고 스트링전시 세정이 0.2-0.1×SSC, 0.1% SDS에서 상기 하이브리드 온도로 최종 세정(약 30분)을 갖는 여러 단계로 이루어질 수 있다.

중 스트링전시 조건은 상기한 용액에서 그러나 약 60-62℃에서 하이브리드화되는 조건을 나타낸다. 이러한 경우 최종 세정은 상기 하이브리드 온도로 1×SSC, 0.1% SDS에서 수행된다.

저 스트링전시 조건은 상기한 용액에서 그러나 약 52-56℃에서 하이브리드화되는 조건을 나타낸다. 이러한 경우 최종 세정은 상기 하이브리드 온도로 4×SSC, 0.1% SDS에서 수행된다.

이러한 조건들은 예를 들어, 포름알데히드-기초 완충제와 같은 여러가지 완충제들 및 온도를 이용하여 적응되고 모방될 수 있는 것으로 이해된다. Denhardt's 용액 및 SSC는 다른 적절한 하이브리드화 완충제들(참조예, Sambrook 등, eds.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 또는 Ausubel 등, eds.(1990) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.)과 같이 이 기술분야에서 숙련된 자에게 잘 알려져 있다. 최적의 하이브리드화 조건은 프로브의 길이 및 GC 함량이 또한 영향을 미침에 따라 실험적으로 결정되어야 한다.

본 발명의 CYPB 단백질은 ER 유지 신호를 포함한다. 따라서, 본 발명의 바람직한 견지로, 저, 중 또는 고 스트링전시 조건하에서 SEQ ID No. 1로 부터 유래된 17 염기 올리고뉴클레오티드와 하이브리드될 수 있는 핵산으로 암호화된, 폴리펩티드에서 프롤린 잔기의 N-말단부상에 펩티드 결합의 시스-트란스 이성질화를 촉매할 수 있는 능력을 갖는 것으로 특징되는 폴리펩티드 공정 폴다아제 활성이 제공된다. 바람직하게 저 스티링전시 조건이 사용된다.

SEQ ID No. 1은 ER 유지 신호를 암호하는 변형된 서열을 나타낸다. 이러한 신호는 ER내에 위치하는 어떠한 CYPB상에 위치하기 쉽기때문에, 이러한 서열의 존재는 본 발명에 따른 CYPB 폴리펩티드를 특성화하고 분리하는데 유용하게 사용될 수 있다.

본 명세서에 제공된 안내에 따라 본 발명의 핵산은 이 기술 분야에서 잘 알려진 방법으로 획득될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 DNA는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하는 화학 합성에 의해 또는 지노믹 도서관 또는 CYPB를 가지며 검출가능한 수준으로 그것을 발현하는 것으로 여겨지는 공급원으로 부터 제조된 적절한 cDNA 도서관을 스크리닝함으로써 획득될 수 있다.

관심있는 핵산의 합성을 위한 화학적 방법은 이 기술 분야에서 알려져 있으며 이는 트리에스테르, 포스파이트, 포스포아미디트 및 H-포스포네이트 방법, PCR 및 고형 지지체상의 올리고뉴클레오티드 합성 뿐만 아니라 이외 오토프라이머 방법을 포함한다. 이러한 방법은 만일 핵산의 전체 핵산 서열이 알려진 경우에 사용될 수 있으며 또는 그 코딩 가닥에 상보적인 핵산의 서열이 이용가능하다. 또한, 만일 표적 아미노산 서열이 알려져 있는 경우, 각 아미노산 잔기에 대하여 알려져 있으며 바람직한 코딩 잔기를 이용하여 잠재적인 핵산 서열을 추정할 수 있다.

본 발명에 따른 PPI를 암호하는 유전자를 분리하는 다른 방법은 예를 들어 Sambrook 등(1989)의 14장에 기술된 바와 같은 PCR 기술을 사용하는 것이다. 이 방법은 PPI 핵산과 하이브리드되는 올리고뉴클레오티드 프로브의 사용이 요구된다. 올리고뉴클레오티드 선택에 대한 방법을 하기에 설명한다.

관심있는 유전자 또는 그것으로 암호화된 단백질을 확인하기위해 고안된 프로브 또는 분석 기기로 도서관들을 스크리닝한다. cDNA 발현 도서관에 적절한 수단은 CYPB를 인지하고 특이적으로 결합하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체; 동일하거나 또는 다른 종으로 부터 알려져있거나 또는 추정되는 CYPB cDNA를 암호하는 약 20-80 염기 길이의 올리고뉴클레오티드; 및/또는 동일하거나 또는 히이브리드되는 유전자를 암호하는 상보적이거나 동종성 cDNAs 또는 이들의 단편을 포함한다. 지노믹 DNA 도서관을 스크리닝하는데 적절한 프로브는 이에 한정하는 것은 아니지만, 동일하거나 또는 하이브리드되는 DNA를 암호하는 올리고뉴클레오티드, cDNAs 또는 이들의 단편; 및/또는 동종성 지노믹 DNA 또는 이들의 단편을 포함한다.

CYPB를 암호하는 핵산은 적절한 cDNA 또는 지노믹 도서관을 적절한 하이브리드화 조건하에서 프로브, 즉, SEQ ID NO.2의 4번째 서열 배열로 부터 유래가능한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 본 명세서에 개시된 핵산을 이용하여 스크리닝함으로써 분리될 수 있다. 적절한 도서관은 상업적으로 이용가능하며 또는 예를 들어 세포주, 조직 시료 등으로 부터 제조될 수 있다.

본 명세서에 사용된, 프로브는 SEQ ID NO.2 배열의 연속 염기와 동등하거나 또는 그 이상의 수와 동일한 염기 서열(또는 이와 상보적인) 10-50, 바람직하게 15-30 및 가장 바람직하게 최소 약 20개의 연속 염기들을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 단일-가닥 DNA 또는 RNA이다. 프로브로서 선택된 핵산 서열은 거짓의양성 결과가 최소화되도록 충분한 길이를 가지며 충분히 분명하여야한다. 상기 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 CYPB의 뉴클레오티드 서열 또는 부위와 보존된 또는 매우 동종성인 뉴클레오티드 서열 또는 부위에 기초한다. 프로브로서 사용된 핵산은 하나 또는 그 이상의 위치에서 변성될 수 있다. 변성 올리고뉴클레오티드의 사용은 특히 알려지지 않은 종에서 바람직한 코돈이 사용되는 종으로 부터 도서관을 스크리닝하는 경우에 중요할 수 있다.

프로브를 구성하는 바람직한 부위는 5' 및/또는 3' 암호 서열, 리간드 결합부를 암호하는 것으로 예측되는 서열 등을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 전장 cDNA 또는 이들의 단편이 프로브로서 사용될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 핵산 프로브는 하이브리드시 검출되도록 적절한 표지 수단으로 표지될 수 있다. 예를 들어, 적절한 표지 수단은 방사능표지이다. DNA 단편을 표지하는 바람직한 방법은 이 기술 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 랜덤 프라이밍(random priming) 반응에서 DNA 중합효소의 Klenow 단편과 함께 ³²P dATP를 편입하는 것이다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 γ³²P-표지된 ATP 및 폴리뉴클레오티드 키나아제로 말단-표지된다. 그러나, 예를 들어, 효소 표지, 적절한 플루오로포어 및 바이오티닐화를 이용한 형광 표지를 포함하는 다른 방법들(예, 비-방사능적)이 또한 상기 단편 또는 올리고뉴클레오티드를 표지하는데 사용될 수 있다.

예를 들어, 상기 전장 CYPB-암호 서열 또는 상기 DNA의 일부에 기초한 적절한 올리고뉴클레오티드를 실질적으로 포함하는 DNA 일부로 도서관을 스크리닝한 후, 하이브리드화 신호를 검출함으로써 양성 클론들을 확인하며; 상기 확인된 클론들은 제한 효소 맵핑 및/또는 DNA 서열 분석으로 특성을 나타낸 다음, 예를 들어 본 명세서의 서열 배열와 비교함으로써 이들이 완전한 CYPB를 암호하는 DNA를 포함하는지(즉, 이들이 번역 개시 및 종결 코돈을 포함하는지) 확인하기위해 검사된다. 만일 상기 선택된 클론들이 불완전하다면, 이들은 오버랩핑 클론들을 얻기위해 동일하거나 다른 도서관을 재스크리닝하는데 이용될 수 있다. 만일 상기 도서관이 지놈성인 경우, 상기 오버랩핑 클론들은 엑손 및 인트론을 포함할 수 있다. 만일 상기 도서관이 cDNA 도서관인 경우, 그 오버래핑 클론들은 오픈 리딩 프래임(open reading frame)을 포함할 것이다. 두가지 모든 경우, 완전한 클론들이 본 명세서에 제공된 DNAs 및 감소된 아미노산 서열과 비교됨으로써 확인될 수 있다.

내생성 CYPB의 어떠한 비정상성을 검출하기위한, 유전학적 스크리닝이 하이브리드화 프로브로서 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 사용하여 이루어질 수 있다. 또한, 필요한 경우 CYPB의 발현을 감소시키기위해 본 명세서에 제공된 핵산 서열에 기초한 안티센스-타입제(antisense-type agents)가 고안될 수 있다.

본 발명의 핵산은 뉴클레오티드 치환, 뉴클레오티드 제거, 뉴클레오티드 삽입 또는 뉴클레오티드 스트레치의 역위, 및 이들의 어떠한 조합으로 쉽게 변형될수 있다. 이와 같은 돌연변이체는 예를 들어 천연에서 발견되는 것과 다른 CYPB 서열의 아미노산 서열을 갖는 CYPB 돌연변이체를 생성하는데 사용될 수 있다. 돌연변이 유발은 미리결정되거나(부위-특이적) 또는 무작위로 이루어질 수 있다. 침묵 돌연변이(silent mutation)가 아닌 돌연변이는 리딩 프래임 바깥으로 서열들을 놓이지 않으며 바람직하게 하이브리드되어 루프 또는 헤어핀과 같은 2차 mRNA 구조를 형성할 수 있는 상보적인 부위를 생성하지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다.

실시예 1

아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) cDNA 도서관의 제조

ZAP-cDNA 합성 키트(Stratagene)를 제조업자에 의해 공급된 지시에 따라 사용하여 A. niger cDNA로 부터 λZAP-A.nigerN402 cDNA 도서관을 제조한다.

실시예 2

아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) cDNA 도서관의 스크리닝

약 2 ×50,000pfu를 하기 배지를 함유하는 큰(22×22cm) NZY 플래이트상에플래이트한다: NaCL 5g, MgSO₄ㆍ7H₂O 2g, 효모 추출액 5g, 카세인 가수분해 산물, 한천 15g, NaOH를 이용 pH 7.5로 조절됨. 상기 배지를 멸균하고 약 65℃로 냉각하고 그리고 상기 플래이트에 붓는다. 플래이트당 배지 240ml을 사용한다.

접종된 NZY 플래이트를 37℃에서 밤새 배양하여 그 플래이트에 플라크 리프트(plaque lifts)를 형성시킨다. 모든 플래이트에서 두개의 리프트를 Hybond N (Amersham) 필터상에 놓는다. 4분동안 UV 방사를 통해 DNA를 고정하고 상기 필터는 프로브로서 하기 방법에 따라 Terminal Transferase(Boehringer Mannheim)를 이용하여³²P-dCTP로 표지되는 변성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 하기에 기술된 바와 같이 하이브리드된다.

상기 변성 올리고 뉴클레오티드 500pmol을 사용한다. Terminal Transferase 반응 완충제(Boehringer Mannheim)에서 94℃ 배양 3분후, 그 혼합물을 얼음상에서 냉각시키고³²P-dCTP 4㎕을 첨가한다. Terminal Transferase (Boehringer Mannheim) 10units를 첨가하여 표지 반응을 시작한다. 37℃에서 30분동안 배양한 후, 상기 효소를 70℃에서 5분동안 열 불활성화시킨다. 방사능-표지된 올리고뉴클레오티드를 NAP 5 컬럼(Pharmacia-Sephadex G-25 배지 함유)으로 정제한다.

상기 필터를 20×SSC 12.5ml(0.3M Na₃시트레이트, 3M NaCl), 100×Denhardt's 용액 2.5ml, 10% SDS 2.5ml 및 물 32.5ml을 함유하는 프리하이브리드 완충제 50ml에서 56℃ 4시간동안 프리하이브리드한다. 사용하기 직전에 10mg/ml 변성된 연어 정자 DNA 300㎕를 상기 프리하이브리드 완충제에 첨가한다. 프리하이브리드한 다음, 표지된 올리고뉴클레오티드를 첨가하고 필터들을 56℃에서 밤새 하이브리드한다. 다음 날 상기 필터들을 4×SSC + 0.1% SDS로 56℃에서 30분동안 2회 세정한다.

상기 필터들을 16시간동안 자가방사하고 양성 클론들을 분리한다. NZY 플래이트의 양쪽 플라크 리프트상에 모두 하이브리드화 신호가 존재하는 경우에만 양성으로 포함시킨다.

6개의 추정 클론들을 분리하고 작은 페트리 디쉬에 플래이트하여 정제한다. 그 다음 이것들을 상기와 본질적으로 같은 방식으로 2차 스크리닝한다. 결국 4개의 클론들을 선택하여 Rapid Excision Kit(Stratagene)를 사용하여 플라스미드로 전환시킨다.

획득된 플라스미드의 시퀀싱(Sequencing)을 Reverse and Universal sequence primer를 사용하여 행한다. 시클로필린성 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소 B를 암호하는cypB 유전자를 함유하는 플라스미드를 pPD23으로 명명한다.

실시예 3

cypB 유전자를 함유하는 pPD23 플라스미드의 특성화

상기 클론의 제한 지도를 만든다. 단편을 pBluescript SK+의EcoRI 및XhoI 부위에 클론한다. pPD23의 구조를 나타내는 제한 지도를 도 1에 나타낸다. 사이클 시퀀싱법(cycle sequencing method)을 사용하여 유전자를 시퀀싱한다. 완전한 서열을 SEQ. ID. No. 2에 나타낸다. 상기 서열은 전체 구조물에 대한 양 스트랜드 모두로 조사된다.

감소된 아미노산 서열을 ClustalW 프로그램을 사용하여 3개의 시클로필린성 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소 B와 함께 정렬한다. 그 정렬을 도 2에 나타낸다.

상기 배열은 CYPB가 다른 알려진 CYPB 서열과 동종성임을 나타낸다.

SWISS-PROT 데이타베이스를 조사하였으며 상기 배열(도 2)에 나타낸 것보다 더 높은 동종성을 갖는 어떠한 서열도 보이지 않았다. 가장 높은 동종성을 갖는 서열은 동일성이 63%로 발견되는(도 3) 오르피노미세스 sp(Orpinomyces sp)의 시클로필린성 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소의 전구체이다.

잔기 1-23은 20,7kDa의 감소된 분자량 및 6.27의 감소된 등전점을 갖는 186 아미노산의 성숙 단백질을 남기는 신호 서열로 인지된다. CYPB 단백질은 극단 C-말단(위치 209-212)에 추정(putative) E.R. 유지 신호를 갖는다. 추정 N-글리코실화 부위는 CYPB내의 위치 139-142에서 발견된다. 시클로필린-타입 펩티딜-프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소에 대한 보존된 모티프는 위치 79-96에 존재한다.

실시예 4

E.coli에서cypB의 발현

성숙 CYPB 단백질을 암호하는 유전자의 일부를 함유하는 단편이 하기 프라이머를 이용한 PCR를 통해 생성된다:

상위 프라이머(upper primer):

5' ccc ata tgg aag atg ctc agc ccc ggg gcc cca aga 3'(SEQ. ID. No. 3)

하위 프라이머(lower primer):

5' cga agc tta gtg gtg gtg gtg gtg gtg gct acc ttt ttc t 3'(SEQ. ID. No.4)

PCR을 pfu 중합효소를 이용하여 52℃에서 수행한다. E.R. 표적 서열은 이 구조물에서 제외된다. 또한, 상기 단백질의 C-말단 부분은 HIS-tag를 이용하여 확장된다. 이 단편은 실질적으로E.coli에서 상기 유전자를 발현하는 플라스미드 pET-24a(+)(Novagen)에서 클론된다. 이 구조물은E.coli균주 BL21(DE3)pLsS로 형질전환된다.cypB의 발현은 OD₆₀₀=1에서 배양액에 첨가되는 1mM IPTG로 유도된다.

E.coli발현된 단백질은 Immobilised Metal Affinity Chromatograph(Ni-NTA 수지, Qiagen) 및 겔 여과(Superdex 75, Pharmacia)의 수단으로 정제된다. 정제된 CYPB의 겉보기 분자량은 SDS-PAGE 겔상에서 약 21kDa으로 측정된다. 정확한 분자량은 MALDI-TOF 분석에 의해 21100.6Da으로 측정된다. N-말단 서열은 상기 성숙 단백질의 처음 10 아미노산 서열 (EDAQPRGPK - SEQ.ID.No.2의 잔기 24-32)을 나타내었다.

CYPB의 활성을 측정하기위해 α-키모트립신(Boehringer Mannheim)에 의한 기질 suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(Sigma)의 입체특이성 분해에 기초한 방법이 설정된다. 이 기질의 트랜스-이성질체는 α-키모트립신에 의해 신속히 분해된다. 물에서 상기 기질의 88%가 트랜스-이성질체로 존재하며 12%가 시스-이성질체로 존재한다. 시스-이성질체에서 트랜스-이성질체로의 전환은 비율 한정적이며 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소에 의해 촉진된다.

CYPB는 50μM 기질 및 25μM α-키모트립신을 함유하는 50mM HEPES 완충제(pH 7.8)로 25℃에서 측정된다. 0.5nM CYPB 단백질을 상기 혼합물에 첨가하고 380nm에서 흡광도를 0.5초마다 측정한다. CYPB 단백질의 첨가는 분명히 상기 기질의 보다 빠른 분해를 이끌어 이들의 폴다아제 활성을 제공한다.

실시예 5

CYPB와 트리아실글리세롤 리파아제의 동시발현

리파아제-발현 및 CypB 플라스미드

플라스미드 pLIP4(도 4)는 lipA 유전자의 전체 지놈의 서열을 포함한다. 그 서열은 SEQ. ID. No. 4의 배열이다. CYPB는 각각 도 5 및 6에 나타낸 바와 같이 ppd23d14 또는 ppd23d14으로 부터 발현된다. ppd23d14는 유도가능한 glaA 프로모터(일반적으로 이용가능함; 참조예, Ward 등(1995) Biotechnology 13:498-503)의 조절하에서CypB서열을 포함한다. ppd23d13은 구성적으로 활성적인 A. 니둘란스(A. nidulans) gpdA 프로모터(Punt 등(1991) J. Biotechnol. 17:19-34)의 조절하에서CypB서열을 포함한다. 두 경우 모두, 상기CypB유전자는 A. 니둘란스(A. nidulans) trpC 종결자가 후속된다.

항생제 내성은 상기 gpdA 프로모터의 조절하에서 하이그로마이신 내성 유전자(스트렙토미세스 하이그로소피쿠스(Streptomyces hygrosopicus) 및E. coli에서 분리됨)를 상기 플라스미드내에 삽입함으로써 편입된다.

리파아제 유전자를 이용한 아스퍼질러스 튜비제네시스(Aspergillus tubigensis)균주 3M pyrA의 형질전환

A. 튜비제네시스(A. tubigenesis) 균주 3Mpyr A의 포자를 2% 글루코즈 및 10mM 우리딘을 갖는 최소 배지를 함유하는 쉐이크 플라스크내에서 34℃로 밤새 배양한다. 균사를 거두어 분해 효소가 첨가된 용해 완충제에 재분산한다. 생성된 원형질체를pyrG및 원하는 재조합체를 선택하기위한 항생제 내성 마커를 이용하여 pLIP4로, ppd23d14 혹은 ppd23d13와 함께 동시형질전환함으로써 혼합된다.

형질전환된 아스퍼질러스(Aspergillus)균주에서 리파아제 생성의 원 위치(in situ)검출

초박막층 등전 집속(isoeletric focusing)후 균류의 리파아제를 가시화하는데 사용되는 스크리닝 방법이 한천 플래이트에 성장한 아스퍼질러스(Aspergillus) 형질전환체를 스크리닝하는데 적용된다. 이 방법은 형질전환된 아스퍼질러스(Aspergillus) 균주의 발현 및 비발현을 초기 분석하는데 매우 편리하다. 한천 플래이트상의 리파아제 스크리닝 방법은 상기 리파아제 프로모터의 유도인자로서 뿐만 아니라 상기 효소(리파아제)의 기질로서 2% 올리브 오일을 사용하여이루어진다. 또한, 상기 플래이트는 형광 염료 Rhodamine B(N-9-(2-카르복시페닐)-6-(디에틸아미노)-3H-크산덴-3-일리덴-N-에틸에탄아미니움 클로라이드)를 함유한다. 올리브 오일의 존재하에서, 상기 형질전환체들은 리파아제를 분비하도록 유도된다. 한천 플래이트내로 분비된 리파아제는 UV 방사(350nm)시 보이는 오렌지 형광 콜로니의 형성으로 인해 올리브 오일을 가수분해한다. 형광 콜로니의 검출은 형질전환체에 따라 달라지며 약 성장 24시간후에 얻어진다. 성장 며칠 후, 상기 리파아제를 생성하는 균주는 눈으로 볼 수 있는 오렌지 형광의 균주로 확인될 수 있다. 이러한 플래이트 스크리닝 조건하에서, 형질전환되지않은 균주는 형광 배경을 나타내지 않으며 불투명한 분홍 콜로니로 나타난다. 그러나, 상기 오일을 함유하는 플래이트상에서 신속히 자랄 수 있는 효모 및 세균 균주들이 오염될 가능성도 인식하여야 한다. 오염은 항생제-암피실린을 편입함으로써 억제된다.

리파아제 분비 형질전환체의 특성화

오렌지 형광 후광을 나타내는 16개의 형질전환체를 올리브 오일 1% ,효모 추출액 0.5%, 카사미노산 0.2%가 첨가된 최소 배지 100ml을 함유하는 쉐이크 플라스크에 배양하고 8일동안 성장시켰다. 세포가 제거된 배양 상층액 10㎕를 상기 올리브 오일 - 로다민 B 한천 플래이트내의 천공된 구멍내로 적용하고 그 플래이트를 37℃에서 밤새 배양함으로써 분비된 리파아제의 양을 측정하였다. 이 기술을 이용하여, 가장 강한 형광을 나타내는 5개의 형질전환체로 부터 세포가 제거된 배양 상층액을 크로마토그래피에 의해 더욱 분석한다.

소수성 작용 크로마토그래피(HIC)에 의한 재조합 리파아제의 정제

상기 플래이트 스크리닝 방법에 의해 양성으로 발견된 상기 5개의 다른 리파아제 분비 형질전환체로 부터 얻은 배양 상층액을 NAP 5 컬럼(Pharmacia: Sephadex G-25 배지 함유)을 사용하여 염을 제거하고 1M (NH₄)₂SO₄, 50mM 소디움 아세테이트(pH 5.5)에서 평형(equilibrate)시킨다. 염이 제거된 배양 상층액은 Biogel Phenyl-5 PW Colum(Biorad)상에서 소수성 작용 크로마토그래피로 분획된다. 용리(elution)는 1M - 0M의 (NH4)2SO4, 20mM 소디움 아세테이트, pH 5.5의 하향 염 기울기로 수행된다. 분획후 단일의 이산적인 단백질 피크가 관찰된다. 상기 단백질 피크 지역을 다른 형질전환체들사이에 계산하고 형질전환되지 않은 균주와 비교한다. 하기 표는 상기 5개의 형질전환체들에 의해 분비된 리파아제의 수준을 요약한 것이다. 최상의 형질전환체는 HIC 분획후 정제된 리파아제의 양에서 62배 증가된 것으로 나타난다. 하기 표는 또한 최적화되지 않은 작은 스캐일의 쉐이크 플라스크 조건하에서 성장 6일후 다른 형질전환체에 의해 생성된 리파아제의 여러가지 양을 나타낸다.

탄소원으로서 1% 올리브 오일내에 6일동안 성장한 형질전환체	HIC후 분비된 리파아제의 수준=이산 단백질 피크 지역/6M 지역지역=높이 ×FWHM(전체 폭의 중간 지점)
L43-6 플리퍼(flipper)	61.9
L3-6	10.5
L1-6	13.1
L13-6	17.0
L47-6	29.3
6M-6 형질전환되지 않은 6M 균주	1.0

b. 재조합 리파아제의 특성화

1.아미노산 분석 및 단백질 조사

HIC에 의한 분획 후 이산 단백질 피크의 단백질을 동결 건조하고 물에 재분산한다. 그 아미노산 조성 및 정제된 리파아제 단백질의 단백질 농도를 280nm에서 UV 흡수와 단백질 농도사이의 상관 계수를 얻어 측정한다. 이것은 동종성 제조물에서 리파아제 농도를 측정하도록 한다.

상기 리파아제 단백질은 카르복시메틸화되고 처음 15개의 아미노산의 서열을 N-말단 아미노산 시퀀싱을 통해 조사한다. 상기 재조합 리파아제의 15 아미노산 서열은 올바른 신호 서열 분열을 나타내는 본래의 리파아제와 정확히 동일하다.

2.SDS-PAGE 전기영동

HIC후 수집된 다른 단백질 분획을 12% Tris Glycine SDS 겔에서 분리한다. 실버 스태이닝(silver staining)은 단백질 피크의 동질성을 확인하는 하나의 단백질 밴드를 나타낸다. 또한, 미정제 추출물(crude extract)은 상기 균류가 오일을 함유하는 배지에서 배양되는 경우에 매우 많은 양으로 그 배양 상층액에 축적되는 단백질만의 밴드로서 하나의 주요한 리파아제 밴드를 나타낸다.

3. 재조합 리파아제에서 공유결합으로 부착된 N-결합 올리고당 존재의 검출

N-결합 올리고당의 검출은 스트렙토미세스(Streptomyces)의 Endo- N-아세틸-글루코스아미다아제 H (Sigma)를 이용한 리파아제의 분해에 의해 달성된다. 성장 배지내로 분비되는 재조합 리파아제의 Endo H 처리는 SDS-PAGE상에 나타나는 밴드의 이동도를 변화시키며 그리고 약 30kDa의 분자량을 갖는 단일 종으로서 움직인다. 이것은 N-결합 글리코실화 정도를 나타낸다.

4. 재조합 리파아제의 매트릭스 보조 레이저 탈착 질량 분석(matrix assisted laser desorption mass spectrometry)

MALDI-TOF 질량 분석을 70% 아세토니트릴, 0.1% TFA내의 시내핀산(3,5-디메톡시-4-히드록시 신남산)으로 구성된 매트릭스 용액과 혼합된 정제된 리파아제를 사용하여 수행한다. 염이 제거된 재조합 리파아제로 부터 측정된 분자량은 32,237Da이다.

엔도글리코시다아제 H 분해에 의해 생성되고 Maldi-MS에 의해 직접 분석된 글리코실화되지 않은 리파아제는 29.325Da의 폴리펩티드 백본 중량으로 측정된다.

이 분석을 사용하여, 상기 글리코단백질상에 N-결합된 올리고당의 존재 및 대략적인 수를 측정할 수 있다. 결론적으로, N-결합 올리고당은 재조합 리파아제 분자량의 약 10%로 계산된다.

리파아제의 질량 분석

		+ 엔도글리코시다아제 H
재조합 리파아제	32,237Da	29,326Da
본래의 리파아제	30,310Da	29,333Da

실시예 6

아스퍼질러스 나이거( Aspergillus niger )에서 cypB의 과발현

아스퍼질러스(Aspergillus) 균주 N592(cspA1,pyrA5)는 강하고 구성적인gpdA 프로모터하에서cypB를 발현하는 플라스미드로 형질전환된다. 추정되는 형질전환체는 이 플라스미드의 존재를 확인하는 PCR로 스크리닝된다. 통합된 복제물의 수 및 상기 균주(N592::pPD23d13)에서의 cypB 발현 수준은 각각 Southern 및 Northern 분석에 의해 조사된다.

상기 Southern 분석은 균주 N592::pPD23d13이 통합된 플라스미드 pPD23d13의 다수 복제물을 함유함을 분명히 나타낸다. 상기 균주에서cypB의 발현 수준은 야생형의 발현 수준보다 약 15배 높다.

상기 균주가 보다 많은 단백질을 분비할 수 있는지 조사하기 위해, 야생형 균주(N402) 및 N592::pPD23d13이 2%(w/v) 전분의 존재하에서 성장되는 성장 실험이 설정된다. 전분은 글루코아밀라아제 발현 특이 유도인자로 알려져 있다. 따라서 상층액 시료를 글루코아밀라아제 및 분비된 단백질의 양에 대하여 분석하였다.

글루코아밀라아제는 잘 분비되는 단백질로 간주되며 이것은 일반적으로 어려운 표적 단백질(difficult target proteins)의 분비를 돕는 융합 단백질로 사용된다.

cypB의 과발현은 분명히 글루코아밀라아제의 증가된 생성 수준을 이끈다. 72시간의 유도후 거의 2배의 글루코아밀라아제 활성 증가가 측정된다. 이 시점에서 더 이상의 새로운 글루코아밀라아제 생성은 나타나지 않으며, 이는 탄소원 유도의 고갈때문인 것으로 보인다.

실시예 7

CYPB의 국소화

진핵 세포의 단백질 분비는 복합적인 공정이다. 새로 합성된 분비 단백질 및 막 단백질은 접히지않은 상태로 소포체(ER)에 들어가며 그리고

이들이 계속해서 분비 경로로 수송될 수 있기전에 특정한 확인을 얻어야 한다. 다수의 단백질들은 ER의 세포내강내에서 발견된다. 이들은 BiP(바인딩 단백질, 70kDa 열-충격(heat shock) 단백질에 상당함), 단백질 이황화물 이성질화 효소(PDI) 및 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소(PPI)를 포함한다. 이러한폴다아제들은 접히지 않은 상태에서 본래 상태로의 단백질 접힘을 촉매하는데 관여한다. ER내에 유지되기위해, 그리고 따라서 분비 단백질의 총괄 흐름으로 부터 전환되기위해, 폴다아제들은 특정한 유지 신호 및 회복 신호를 갖는다. 일반적인 카르복시 종결 테트라펩티드, HDEL은 ER의 세포내강내에 단백질을 유지할 수 있는 신호로서 확인되었다. 이 테트라펩티드의 제거는 상기 단백질의 분비를 이끈다(Pelham(1990) Trends Biochem. Sci. 15, 483-486).

CYPB 단백질은 ER내에 상기 단백질이 표적되고 유지되는 것을 나타내는 신호 서열 및 추정 ER 유지 신호를 갖는다. 그러나 이 단백질내의 유지 신호는 알려진 유지 신호와는 미세한 차이가 있다. 위치 -3(마지막 아미노산 잔기에서 부터 카운팅)에서 상기 CYPB 단백질은 글루탐산 잔기를 함유한다. 이 HEEL 서열은 ER 유지 신호로 확인되지 않았다. 이 서열이 CYPB를 ER의 세포내강내에 유지할 수 있는 서열인지 평가하기위해, CYPB 신호 서열 및 CYPB ER 유지 신호를 모두 함유하는 GFP 구조물을 제조한다. 이 유전자의 발현은 강하고, 구성적인 gpdA 프로모터(플라스미드 pPD38d3; 도 7)에 의해 유도된다.

상기 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주 D15의 형질전환체들 (prtT;pyrG;phmA)은 GFP 발현 플라스미드의 삽입용 PCR에 의해 스크리닝된다. 상기 발현 구조물을 함유하는 균주는 GFP의 발현으로 분석된다.

균주 D15::pPD38d3#5를 액체 배양으로 밤새 성장시켰으며 그 GFP는 그 세포내에 관 그물망으로 지시되는 것으로 나타났다. A. 니둘란스(A. nidulans)내의 동등한 구조물은 GFP를 ER로 표적함을 나타내며, 이는 본 발명자들의 발견(Fernandez-Abalos 등(1998) Mol. Microbiol. 27, 121-130)과 유사한 그물망을 입증하는 것이다. ER-Tracker DPX(분자 프로브)를 이용한 균사의 염색은 동일한 타입의 관 그물망을 입증한다.

최종적으로 보다 높은 농도에서 적용시 ER 염색에 또한 효과적인, 저농도에서의 미토콘드리아에 대한 염색, DIOC₆은 DPX 및 GFP에서 나타난 바와 같은 동일한 관 그물망을 보여준다.

본 발명자들의 결과는 분명히 HEEL은 ER내에서 GFP 유지에 필요 충분함을 모두 보여준다. 따라서 상기 CYPB 단백질은 ER내에 표적되고 유지되는 것이 분명하다.

본 발명의 폴리펩티드 생성 방법은 숙주 세포에서 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소를 과발현시킴으로써 분비되는 폴리펩티드의 수율을 증가시킬 수 있다.

Claims

숙주 세포에서 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소를 과발현하고 따라서 분비되는 폴리펩티드의 수율을 증가시킴을 포함하는, 숙주 세포에서 분비가능한 폴리펩티드를 생성하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 암호하는 제1 암호 서열 및 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소를 암호하는 제2 암호 서열로 상기 세포를 공형질감염(cotransfecting)함을 포함하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 폴리펩티드 및 상기 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소는 별도의 벡터에 암호됨을 특징으로 하는 방법.
상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소를 암호하는 암호 서열은 상기 숙주 세포의 지놈내로 통합됨을 특징으로 하는 방법.
상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 균류 세포임을 특징으로 하는 방법.
상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시클로필린 펩티딜 시스-트란스 이성질화 효소는 균류 오리진임을 특징으로 하는 방법.
상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 ER 유지 신호를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 ER 유지 신호는 H D E L, H E E L 또는 K D E L임을 특징으로 하는 방법.
N-말단에 신호 서열 및 C-말단에 소포체 유지 신호, 그리고 20.7kDa의 분자량 및 6.27의 감소된 등전점(isoelectric point)을 가지며, 폴리펩티드에서 프롤린 잔기의 N 말단부상에 펩티드 결합의 시스-트란스 이성질화를 촉진하는 능력을 갖는 것으로 특징되는 폴다아제(foldase) 활성을 갖는 폴리펩티드.
제 9항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 균류 오리진임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 10항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 아스퍼질러스(Aspergillus) 속으로 부터 유래됨을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 11항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)로 부터 유래됨을 특징으로 하는 폴리펩티드.
저 스트링전시(stringency) 조건하에서 SEQ ID No. 2로 부터 유래된 20 염기 올리고뉴클레오티드와 하이브리드 가능한 핵산으로 암호화되며, 폴리펩티드에서 프롤린 잔기의 N 말단부상에 펩티드 결합의 시스-트란스 이성질화를 촉진하는 능력을 갖는 것으로 특징되는 폴다아제 활성을 갖는 폴리펩티드.
저 스트링전시(stringency) 조건하에서 SEQ ID No. 1로 부터 유래된 17 염기 올리고뉴클레오티드와 하이브리드 가능한 핵산으로 암호화되며, 폴리펩티드에서 프롤린 잔기의 N 말단부상에 펩티드 결합의 시스-트란스 이성질화를 촉진하는 능력을 갖는 것으로 특징되는 폴다아제 활성을 갖는 폴리펩티드.
SEQ ID No. 2와 최소 40% 일치하며, 폴리펩티드에서 프롤린 잔기의 N 말단부상에 펩티드 결합의 시스-트란스 이성질화를 촉진하는 능력을 갖는 것으로 특징되는 폴다아제 활성을 갖는 폴리펩티드.
제 1항 내지 8항중 어느 한 항에 있어서, 상기 시클로필린 펩티딜 프롤릴 시스-트란스 이성질화 효소는 제 9항 내지 15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드임을 특징으로 하는 방법.
제 9항 내지 15항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 암호하는 핵산 벡터.
제 17항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
제 18항에 있어서, 상기 숙주 세포는 균류 숙주 세포임을 특징으로 하는 숙주 세포.
제 19항에 있어서, 상기 숙주 세포는 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주 세포임을 특징으로 하는 숙주 세포.
제 17항의 벡터로 숙주 세포를 형질전환함을 포함하는, 폴리펩티드에서 프롤린 잔기의 N 말단부상에 펩티드 결합의 시스-트란스 이성질화를 촉진하는 능력을 갖는 것으로 특징되는 폴다아제 활성을 갖는 폴리펩티드 제조 방법.