CN1321195A - 肽基脯氨酰基顺反异构酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供在宿主细胞中制备分泌多肽的方法,包括在该宿主细胞中过量表达一种肽基脯氨酰基顺反异构酶,从而提高分泌多肽的产量,本发明也提供了用于该方法的来自黑曲霉的肽基脯氨酰基顺反异构酶。

Description

肽基脯氨酰基顺反异构酶
本发明涉及一种新酶，具体的说，本发明涉及一种新的亲环蛋白样肽基脯氨酰基顺反异构酶。
在大多数过量生产蛋白的策略中，能指导极高水平转录的强启动子被用于过量表达编码异源和同源的蛋白质基因。蛋白分泌的局限性可能是缘于翻译及翻译后水平的瓶颈作用(Tsuchiya K.等(1992)应用微生物与生物技术38:109-114)。蛋白的正确折叠对于输出能力是必需的。过量表达的异源蛋白可能折叠不正确，而且此后在通过分泌途径的蛋白运输过程中会被降解。因此，为了增加蛋白的分泌作用，折叠缺陷的矫正是令人期待的。
一种蛋白的折叠被许多因子催化，包括两个异构酶家族，即蛋白质二硫键异构酶家族，其催化二硫键的形成，和肽基脯氨酰基顺反异构酶家族，其催化x氨基酸-脯氨酸键的异构化。
在啤酒酵母中蛋白二硫键异构酶的过量表达导致人血小板衍生生长因子的分泌增加(Robinson等1994)。但是，黑曲霉蛋白二硫键异构酶的过量产生并不导致鸡蛋清溶菌酶(HEWL)或葡糖淀粉酶分泌的增力(Ngiam C.,Jeenes,D.J.J.Punt,P.J.,Van den Hondel,C.A.M.J.J.,Archer,D.A.(1998)在黑曲霉蛋白分泌途径中一种折叠酶PDIA的特性，已提交)。
在蛋白折叠过程中最慢的一步是x氨基酸-脯氨酸键的顺反异构化。当肽基脯氨酰基顺反异构酶存在时，这种异构化作用明显地被加速。来源于不同有机体的亲环蛋白家族的肽基脯氨酰基顺反异构酶已被表明在体外具有折叠酶活性(Schohhrunner E R.,MayerS.,Tropschug M.,Fischer G.,Takahashi N.,Schmid F.,(1991)由来源于不同种的亲环蛋白的蛋白折叠的催化。生物化学杂志266:3631-3637)。这些异构酶被免疫抑制剂药物环孢菌素A抑制。但是，肽基脯氨酰基顺反异构酶的过量表达对异源肽的分泌的影响在现有技术中是不知道的。
在内质网中起作用的蛋白由C末端4个氨基酸的延伸定位于此间隔区。在黑曲霉中HDEL和KDEL已被报道起类似于ER(内质网)保留信号的功能(Jeenes D.J.等(1997)基因193:151-156)。
发明概述
本发明的第一个方面：提供一种在一种宿主细胞中生产可分泌的多肽的方法，包括在该细胞中过量表达一种肽基脯氨酰基顺反异构酶，因此增加分泌多肽的产量。
本发明的第二方面：本发明涉及一种具有折叠酶活性的多肽，该多肽的特征在于能催化多肽中脯氨酸残基N端肽键的顺反异构化，在其N端有一个信号序列，在其C端有一个内质网保留信号，分子量为20.7kDa，推测的等电点为6.27。
本发明的第三方面：本发明涉及一种具有折叠酶活性的多肽，该多肽的特征在于能催化多肽中脯氨酸残基N端肽键的顺反异构化，它由一个核酸编码，该核酸能在低、中或高度严格的条件下与衍生自序列SEQ ID NO.1的17个碱基的寡核苷酸杂交。
本发明的第四方面：本发明涉及一种具有折叠酶活性的多肽，该多肽的特征在于能催化多肽中脯氨酸残基N端肽键的顺反异构化，它由一个核酸编码，该核酸能在低、中或高度严格的条件下与序列与衍生自序列SEQ ID NO.2的20个碱基的寡核苷酸杂交。
本发明的第五方面：本发明涉及一种具有折叠酶活性多肽，该多肽的特征在于能催化多肽中脯氨酸残基N端肽键的顺反异构化，其至少与序列SEQ ID NO.2有40％的同源性。
附图简述：
图1是一个质粒pPD23的限制性图谱，其编码黑曲霉的cypB。
图2显示cypB基因和来自Orpinomyces,M.musculus及人的肽基顺反异构酶的的序列对比。
图3显示cypB基因和Orpinimyces PPI基因间的最佳序列对比
图4代表pLIP4质粒，其编码lipA基因。
图5代表ppd23d13质粒。
图6代表ppd23d14质粒。
图7代表ppd38d3质粒。
发明详述
本发明涉及一种肽基脯氨酰基顺反异构酶多肽(PPI)的过量表达，以增加宿主细胞中分泌多肽的表达。已发现在细胞中增加PPI的水平可有效促进多肽从细胞分泌。PPI被认为是通过降低多肽的错误折叠水平阻止了多肽产物在内质网中的保留和它们随后的降解。因此本发明尤其适合于增加来自细胞的分泌多肽的产量。
在本文中，术语“肽基脯氨酰基顺反异构酶”多肽(PPI)被用于表示一种酶，该酶能催化多肽中脯氨酸残基N端肽键的顺反异构化。PPIs无所不在，并且在本领域中几个实例是熟知的，实例包括亲环蛋白(见，例如，Bergsma等(1991)生物学和生物化学杂志。266:23204-23214)，小小菌素(parvulin)、SurA(Rouviere和Gross,(1996)基因发育10:3170-3182)及FK506结合蛋白FKBP51和FKBP52。PPI负责多肽中肽基脯氨酰基键的顺反异构化，因而促进折叠的正确性。本发明包括任何含有PPI活性的多肽。这包括可能具有PPI活性的伴侣多肽或其片段(Wang和Tsou,(1998)FEBS Lett.425:382-384)。优选地，本发明涉及亲环蛋白家族的PPI多肽。
有利的是，宿主细胞是表达一种异源基因产物的转化宿主细胞。尤其是异源基因产物被过量表达的情况下，最终的多肽产物被错误折叠的倾向和如前所述在内质网中被降解的倾向增加。因此在这些情况下，根据本发明的PPI的过量表达是非常有利的。
然而，本发明也可被用于增加宿主细胞中同源多肽的产量。例如，本发明对如由自然生物作用引起的或由能引起调节基因转录上升的药剂的给药而引起的细胞活性增加而导致的同源多肽的转录的增加是有用的。此外，细胞也能用能引起内源基因上调的表达***转化，例如表达***编码转录因子，该转录因子作用于内源启动子。
同样地，PPI表达的上调也可以通过增加内源PPI的表达或用能提高PPI产量水平的一个编码序列转化宿主细胞来实现。用一个PPI编码序列转化宿主细胞是有利的。
因此在一个优选的方案中，本发明涉及一种在宿主细胞中生产一种分泌多肽的方法，包括用一个编码该多肽的第一编码序列和编码肽基脯氨酰基顺反异构酶的第二编码序列共转染该细胞。
有利的是，本发明涉及在一种宿主细胞中表达一种分泌多肽的方法。该方法包括以下步骤：
a)用一个表达本发明的肽基脯氨酰基顺反异构酶的编码序列转化该细胞；
b)用一个表达一种目的多肽的编码序列转化该细胞；
c)培养该细胞以生产该多肽。
用于此处的转染和转化可考虑为等同的，且包括任何形式的向细胞中***DNA，包括病毒的转导，电穿孔和传统的转染技术。编码肽基脯氨酰基顺反异构酶和目的多肽的编码序列可以使用载体或独立地如以裸露的DNA被***细胞。优选使用载体。在此肽基脯氨酰基顺反异构酶和目的多肽存在于独立的载体上时，任意一个独立的载体可先于另一个载体被***到宿主细胞。只要在细胞中，在目的多肽的表达过程中获得了肽基脯氨酰基顺反异构酶的增加水平，***顺序是不重要的。
有利的是，肽基脯氨酰基顺反异构酶和目的多肽可以存在于同一载体上。
优选地，构建宿主细胞，其中一种表达肽基脯氨酰基顺反异构酶的编码序列被整合进宿主细胞和基因组。这能通过用一个所说编码序列的整合表达载体去转化该细胞而实现。
如上所指出的，该表达肽基脯氨酰基顺反异构酶的编码序列优选整合入一个适当的载体。用于此处的载体(或质粒)是指分立的元件，这些元件被用于引入异源DNA进入细胞，在此表达或复制。对于本领域的技术人员来说，选择和使用这样的载体是容易的。许多载体可以利用，且适当载体的选择将依赖于载体的打算用途和待用载体转化的宿主细胞。每种载体含有依赖于它的作用和相容宿主细胞的不同成分，这种载体成分一般包括但并不限于以下的一种或多种成分：复制起点，一个或多个标记基因，增强子元件，启动子，转录终止序列和信号序列。
大多数的表达载体是穿梭载体，即它们至少能在一类生物体中复制，但能被转染进另一类生物体中表达。例如，一种载体能在大肠杆菌中被克隆，然后同样的载体被转染进酵母或其它真菌细胞，即使它必需依赖于宿主细胞染色体而独立地复制。DNA也能被扩增，例如通过PCR，和不用任何复制成分而被直接转染进宿主细胞。
有利的是，一个表达载体含有一个选择基因，也称为可选择的标记。该基因编码一种转化宿主细胞在选择培养基上生长或生存必须的蛋白。不用含有选择基因的载体转化的宿主细胞在培养基上将不存活。典型的选择基因编码蛋白，该蛋白授予抗生素和其它毒素抗性，如氨苄青霉素，新霉素，氨甲蝶呤或四环素，补充营养缺陷型缺乏，或提供从复合培养基无法获得的关键营养成分。
至于适合于酵母和其它真菌有机体的选择性基因标记，由于标记基因的表型的表达有利于转化子筛选的任何标记基因都能使用。例如适合于酵母的标记基因包括赋予抗生素G418、潮霉素或博来霉素抗性的基因或在营养缺陷型的酵母突变株中提供原养型的基因，如URA3,LEU2,LYS2,TRP1或HIS3基因。
由于载体的复制在大肠杆菌中可方便地进行，包括一个大肠杆菌遗传标记和大肠杆菌的复制起点是有利的。这些能从大肠杆菌质粒如pBR322,Bluescrip载体或pUC质粒如pUC18或pUC19获得，这些质粒都含有大肠杆菌复制起点和赋予抗生素抗性如氨苄青霉素抗性的大肠杆菌遗传标记。
表达和克隆载体通常含有一个启动子，该启动子能被宿主有机体识别并有效连接至编码肽基脯氨酰基顺反异构酶的核酸。这样的一个启动子可以是诱导或是组成型的。该启动子有效连接至编码肽基脯氨酰基顺反异构酶的DNA，方法是通过限制性酶消化除去了来源DNA的启动子并***分离的启动子序列至载体。天然启动子序列和许多外源启动子两者都能被用作直接扩增和(或)肽基脯氨酰基顺反异构酶编码序列的表达。术语“有效连接”是指并置，其中描述的成分是在允许它们以打算方式发挥作用的一种关系中。一个控制序列“有效连接”到一个编码序列是指以这样一种方式连接，即编码序列的表达是在与控制序列相容的条件下被完成的。
用于酵母宿主的适合的启动子序列是可调节的或组成型的，并且优选来源于高度表达的真菌基因。真菌启动子在文献中是熟知的(例如，见Gurr等(1987)丝状真菌核基因的结构和组织。King horn编著，真核微生物基因结构，IRL出版，牛津93-139页)。酵母启动子也可被使用，如酵母的TRP1基因，ADHI或ADHⅡ基因，酸性磷酸化酶(PHO5)基因的启动子，编码a或α因子的酵母交配信息素基因启动子或来源于编码糖酵解酶的基因的启动子如：烯醇化酶，3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAP),3-磷酸甘油酸激酶(PGK)，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，6-磷酸葡萄糖异构酶，3-磷酸甘油变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶或葡萄糖激酶基因的启动子，酿酒酵母GAL4基因，非洲栗酒酵母(S.ponbe)nmt1基因的启动子或来源于TATA结合蛋白(TBP)基因的启动子。另外，用杂合启动子也是可能的，包括一种酵母基因的上游激活序列(UAS)和含有功能性TATA框的另一酵母基因下游启动子元件，如一个包含有酵母PHO5基因的UAS和含有功能性TATA框的酵母GAP基因的下游启动子元件的杂合启动子(PHO5-GAP杂合启动子)。一种适合的组成型PHO5启动子是没有上游调控元件(UAS)的短的酸性磷酸酶PHO5启动子，如PHO5(-173)启动子元件开始于PHO5基因的-173核苷酸，终止于-9核苷酸。
在本发明中，优选使用真菌有机体，如一种丝状真菌，例如那些用于生物技术工业的，优选曲霉(Asperillus)、木霉(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)、毛霉(Mucor)或青霉(Penicillium)。更具体地说，优选宿主有机体包括构巢曲霉、塔宾曲霉、酱油曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、日本曲霉、棘孢曲霉、粗糙脉孢菌、T.reesei和绿色木霉。一种用于本发明核酸构建体的表达和/或用于制备根据本发明的异源多肽的优选宿主有机体是一种曲霉属的有机体，有利地是黑曲霉。关于根据本发明的一种转基因曲霉能通过以下教导制备：Rambosek,J和Leach,J 1987(丝状真菌中的重组DNA：进展与展望。CRC Crit.生物技术综述6:357-393),Dauis RW 1994(在曲霉中异源基因表达和蛋白分泌，在Marfinelli S.D.Kinghorn J.R.(编者)曲霉：50年工业微生物进展29卷。Elsevier Amsterdam 1994 525-560页)，Ball ance D.J.1991(丝状真菌的转化***和真菌基因结构概述。在Leong,S.A.,Berka R.M.(编者)分子工业真菌学。丝状真菌的***和应用。Marcel Deklar lnc纽约1991 1-29页)和Turner,G.1994(基因操作载体，在：Martinelli.S.D.,Kinghorn J.R.(编者)曲霉：50年工业微生物进展29卷，Elsevier Amsterdam 1994 641-666页)。下面评述提供一个制备发明转基因曲霉的教导的摘要。
为了制备转基因曲霉，通过***异源核酸序列(如编码一种淀粉酶的核酸序列)至设计用于丝状真菌中表达的构建体制备表达构建体。
已经发展了异源表达使用的几种类型的构建体。这种构建体含有在真菌中有作用的根据本发明的启动子。异源核苷酸序列能与一种信号序列融合，该信号序列指导异源核苷酸序列编码的蛋白的分泌。通常使用一种真菌来源的信号序列。也可使用在真菌中有活性的终止子。
在真菌中已经发展了另一种类型的表达***，其中异源核酸序列被融合至编码一种稳定蛋白的真菌基因中。这样能稳定编码一种目的多肽的异源核酸序列编码的蛋白。在这样一种***中，被一种特殊的蛋白酶识别的切割位点能被引入到真菌蛋白和由异源核苷酸序列编码的蛋白之间，使得产生的融合蛋白在该位点能被该特殊蛋白切开，这样释放出由异源核酸序列编码的蛋白。作为例子，可以引入至少在某些曲霉中发现的KEX-2样肽酶识别的位点(Broekhuijsen等1993生物技术杂志31:135-145)。这种融合造成体内切割，导致表达产物的保护，和不出现大的融合蛋白。
已报导了编码细菌，真菌，脊椎动物和植物蛋白的几个基因在曲霉中的异源表达。关于产物稳定性和宿主菌株的修饰，一些异源蛋白当它们分泌至真菌培养液时不是十分稳定。大多数真菌产生几种降解异源蛋白的胞外蛋白酶。为避免这一问题，降低了蛋白酶产生的特殊真菌菌株已被用作宿主以进行异源生产。
为转化丝状真菌，对于许多丝状真菌来说几种转化方法已被建立起来了(Balance 1991，同前)。它们中的许多方法是基于原生质体的制备和用PEG和Ca+2离子引入DNA至该原生质体。这种转化的原生质体然后再生，并用不同的选择标记筛选转化真菌。转化使用的标记是一些营养缺陷标记如argB,trpC,niaD和pyrG，抗生素抗性标记如苯菌灵抗性，潮霉素抗性和腐草霉素抗性。一种常用的转化标记是构巢曲霉的amds基因，该基因的高拷贝数量允许该真菌以丙烯酰胺为唯一N源生长。
通过***一个增强子序列至载体也可增加真菌有机体编码肽基脯氨酰基顺反异构酶的DNA的转录。增强子相对方向和位置独立。
表达载体包括任何能表达肽基脯氨酰基顺反异构酶编码核酸的载体，该核酸被有效的与调控序列如能表达这样的DNA的启动子区域连接。这样一种表达载体是指重组DNA或RNA构建体，如质粒，噬菌体，重组病毒或其它载体，将其引入一种适合的宿主细胞导致克隆DNA的表达。适合的表达载体对于本领域普通技术人员来说是熟知的，包括在真核和/或原核细胞中能复制的载体，和仍为附加体或整合进宿主细胞基因组的载体。
根据本发明载体的构建使用传统的连接技术。分离的质粒或DNA片段被切割，处理并以期望的形式连接形成需要的质粒。假如需要的话，以已知的方式进行构建质粒的分析以证实正确的序列。构建表达载体适合的方法，体外转录物的制备，导入DNA进入宿主细胞和进行肽基脯氨酰基顺反异构酶表达和作用的评价分析对于本领域技术人员来说是熟知的。基因存在，扩增和/或表达也可在一种样品中直接被测定，例如通过传统的DNA印迹，RNA印迹进行mRNA转录的定量，斑点印迹(DNA或RNA分析)，或原位杂交，用一个适合的标记探针，该探针可基于在此提供的一种序列。必要时，本领域技术人员很容易知道如何调整这些方法。
相同的或相似的考虑将应用于编码目的多肽的载体的设计。尽管不是必须的，PPI和目的多肽被编码在同一载体上是可能的，无论是处于游离状态还是整合状态，并从此而被表达。优选目的多肽是由不来源于宿主有机体的异源核苷酸序列编码的多肽。
编码目的多肽的核苷酸序列的典型例子包括编码蛋白和酶的序列，该蛋白和酶改变代谢和分解过程。异源核苷酸序列可以编码一种试剂用以引入或增加病原体抗性。异源核苷酸序列可以编码一种丝状真菌，优选曲霉属的非天然蛋白，或对动物或人体有益的化合物。根据本发明的核苷酸序列的例子包括果胶酶，果胶解聚酶，多聚半乳糖醛酸酶，果胶酸裂解酶，果胶裂解酶，己糖氧化酶，氧化还原酶，酯酶，葡聚糖裂解酶，鼠李糖-半乳糖醛酸酶，半纤维素酶，内-β-葡聚糖酶，***糖酶，或乙酰酯酶或其组合及其反义序列。目的多肽也可是一种提高一种食品或谷物营养价值的蛋白。典型的例子包括能抑制抗-营养因子形式的植物蛋白和有更理想的氨基酸组成(如比非转基因植物赖氨酸含量高)的植物蛋白。
目的多肽可以是一种酶，该酶能被用于食品加工，如凝乳酶，奇甜蛋白和α-半乳糖酶。此外目的多肽可以是任何一种害虫毒素，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(例如，见EP-A-0455316)，一种葡聚糖酶或基因组B-1,4-内葡聚糖酶。
异源核苷酸序列可以编码一种特定核苷酸序列的内含子，其中该内含子可以是有义或反义方向。
该异源核苷酸序列是能编码***呋喃糖苷酶的核苷酸序列，该酶是PCT专利申请PCT/EP96/01009的主题(在此引入作为参考)。该异源核苷酸序列可以是能编码ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的任何核苷酸序列，该酶是PCT专利申请PCT/EP94/01082的主题(在此引入作为参考)。该异源核苷酸序列可以是能编码α-葡聚糖裂解酶的任何核苷酸序列，该酶在PCT专利申请PCT/EP94/03397中被描述(在此引入作为参考)。该异源核苷酸序列可以是能编码T.languinosus淀粉酶的任何核苷酸序列，如在PCT专利申请PCT/EP95/02607中被描述的，该专利申请在此引入作为参考。该异源核苷酸序列可以是能编码葡聚糖酶的任何核苷酸序列，该酶在PCT专利申请PCT/EP96/01008中被描述(在此引入作为参考)。
在本发明的一个优选方面，编码PPI的核酸将包括有效连接于其上的一种内质网保留信号。优选内质网保留信号是一种四肽，该四肽是HDEL,HEEL或KDEL是有利的。该内质网保留信号是让该多肽运向内质网并使其停留于此。
根据本发明的第二方面，提供了一种多肽，该多肽拥有折叠酶活性，并且具有在多肽中催化脯氨酸残基N端肽键顺反异构化作用能力的特点，在N端有一种信号序列，且在C端有内质网保留信号，其分子量为20.7kDa，推测的等电点为6.27。有利的是，根据本发明这一方面的新的PPI从一种真菌有机体如丝状真菌中获得，例如那些用于生物技术工业的真菌；优选曲霉，木霉或青霉；优选黑曲霉。
根据本发明的PPI的一个例子于SEQ.ID.No.2示出。经鉴定具有这一序列的分子可从黑曲霉中获得，并且在此称为CYPB。满足上述标准的PPI酶在此一般称为“CYPB”酶。因此，在优选方面，本发明提供SEQ.ID.No.2所示CYPB或其生物同配体(bioisostere)。
当用于此时，术语“生物同配体”根据本领域的普通用法被使用，意即一种有相似(但不相同)或不同结构、具有相同生物功能效果的化合物。
本发明的生物同配体从真菌有机体如丝状真菌中获得是有利的，例如用于生物技术工业的丝状真菌，优选曲霉，木霉或青霉；优选黑曲霉。
根据本发明的更进一步的方面，提供一种编码本发明酶的核酸。除了被用于生产重组PPI蛋白外，这些核酸也可用于作为探针，这样使得本领域技术人员容易鉴定和/或分离编码PPIs或其同源物的核酸。该核酸也可不标记或用一种可查明的部分标记。而且，本发明的核酸可用于确定PPI特异性核酸存在的检测方法中，所说的方法包括使编码(或互补于)PPI的DNA(或RNA)和一种试验样品核酸杂交并确定PPI的存在。在另一方面，本发明提供与编码PPI的核酸序列互或在严格条件下与所述核酸序列杂交的核酸序列。
PPI编码核酸片段的长度在10-200核苷酸之间是有利的，优选在15-50核苷酸之间，并且更优选为约20个核苷酸。
本发明也提供一种扩增试验样品核酸的一种方法，包括用编码(或互补于)PPI的核酸(DNA或RNA)起始核酸聚合酶(链)反应。
在本发明的另一方面，该核酸是DNA，且还包括一种可复制的载体，该载体含有有效连接于控制序列的编码PPI的核酸，该控制序列可被载体转化的宿主细胞识别。而且本发明提供用这种载体转化的宿主细胞和用一种编码PPI的核酸去实现PPI生产的方法，该方法包括在转化宿主细胞培养物中表达PPI编码核酸，并且需要时，可从宿主细胞培养物中回收PPI。
此外，本发明涉及分离的PPI蛋白和由上述核酸编码的其生物同配体。
分离的PPI核酸包括除去了至少一种污染核酸的核酸，该污染核酸通常与天然来源的PPI核酸或在粗提核酸制品如DNA文库等中伴随存在。这样的核酸除了以这种形式存在外，在自然界也有发现。但是，分离的PPI编码核酸包括在通常的PPI表达细胞中的PPI核酸，在表达细胞中，该核酸在染色体上的位置不同于天然细胞或其旁侧有一个与自然界中发现的DNA序列不同的DNA序列。
根据本发明，提供编码具有示于SEQ.ID.No.2序列的CYPB的分离核酸(如DNAs或RNAs)或其片段。尤其是本发明提供一种编码如SEQ.ID.No.2所示CYPB的DNA分子或其片段。依据定义，这样一种DNA包括一种编码的单链DNA，上述的编码DNA和其互补DNA的双链DNA或这种互补(单链)DNA本身。
编码CYPB的优选序列是具有基本上与SEQ.ID.No.2编码序列相同的核苷酸序列的序列，最优选具有与SEQ.ID.No.2编码序列相同序列的核酸。当用于此时，基本上相同的核酸序列至少要有约90％的同一性。
本发明的核酸，不管是用于探针还是其它方面，优选与显示于SEQ.ID.No.2的CYPB序列基本上同源。“基本上同源”中的同源指序列的同一性，当通过直接序列对比和比较判断时，序列同一性超过40％，优选超过45％，最优选序列同一性为50％或更多。
基本上同源的氨基酸和核苷酸序列应具有大于75％的同源性(如至少80％的同源性，或至少85％的同源性，如至少90％的同源性或甚至至少95％的同源性，例如至少97％的同源性)。核苷酸序列同源性可使用Myers和Miller的“Align”程序(线性空间的最佳序列对比，CABIOS4,11-17,1988，在此引入作为参考)并获自NCBI。或者，关于核苷酸或氨基酸序列的术语“同源性”可表明两个序列之间的同源性定量测定。序列同源性百分比能用(Nref-Ndif)*100/Nref进行计算，其中Ndif是指当进行序列对比时，在两序列中不相同的残基的总数，其中Nref是指在一个序列中的残基数目。因此，DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC将有75％的序列相似性(Nref=8；Ndif=2)。或者，序列的“同源性”可以指用相同核苷酸或氨基酸的数量除以在两序列中较短序列的核苷酸或氨基酸的数量，其中两序列的对比能根据Wilbur和Lipman算法确定(Wibur and Lipma 1983 PNAS USA 8:7267，在此引入作为参考)，例如用20个核苷酸大小为一个窗口，四个核苷酸为一个词的长度，且间隙为4，计算机辅助分析和序列数据包括序列对比的翻译可用商用程序方便地进行(如IntelligeneticsTM Suit IntelligeneticsInc.CA)。当提及RNA序列与DNA序列相似或有一定程度的同一性或同源性时，在DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。
将DNA序列中的T视为等同于RNA序列中的U，本发明范围中的RNA序列可从DNA序列衍生。
或者，氨基酸序列的相似性或同一性或同源性能用BlastP程序进行测定(Altschul等核酸研究25,3389-3402，在此引入作为参考)，并获自NCBI，使用默认参数是有利的。下面的文献(在此引入作为参考)提供了比较两种蛋白的氨基酸残基的相对同一性或同源性的算法，或者，关于上述的这些文献中的教导能被用于测定同源性或同一性百分比：Needleman SB和Wunsch CD，“可用于在两种蛋白的氨基酸序列中寻找相似性的一般方法”，分子生物学杂志，48:444-453(1970)；Smith TH和Waterman MS，“生物序列的比较”，应用数学进展2:482-489(1981)；Smith TH,Waterman MS，和SadlerJR，“核酸序列功能域的统计特征”，核酸研究，11:2205-2220(1983)；Feng DF和Dolittle RF，“渐进的序列对比作为修改***发生树的先决条件”，分子进化杂志，25:351-360(1987)；Higgins DG和Sharp PM，“在一微型计算机上快速而灵敏的多重序列对比”，CABIOS,5:151-153(1989)；Thompson JD,Higgins DG和Gibson TJ,“ClusterW：通过序列权重、位置特异性缺口补偿和权重基质选择提高渐进多重序列对比的敏感性”核酸研究，22:4673-480(1994)；和，Devereux J,Haeberlie P和Smithies O，“用于VAX的全面序列分析程序”，核酸研究，12:387-395(1984)。
根据本发明的核酸优选是CYPB基因编码序列的片段。作为探针，长度为较少核苷酸，优选5至150个核苷酸的核酸序列片段是特别有用的。
或者范例性核酸的特征是编码CYPB蛋白并能与SEQ.ID.NO.2所示DNA序列或所说DNA序列的选定片段杂交。优选的是在严格条件下与SEQ.ID.NO.2序列或上述定义的此序列的一个片段杂交、编码CYPB基因的序列。
杂交的严格性指的是在此条件下核酸杂合体是稳定的。这些条件对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。如对本领域技术人员所知，杂合体的稳定性体现于杂合体的融解温度(Tm)，此融解温度随序列同源性每降低1％而大约降低1至1.5℃。一般来说，杂合体的稳定性与Na+的浓度及温度密切相关。典型地，杂交反应在高严格条件下进行，然后在不同严格条件下漂洗。
在本文中，高严格性是指仅有在1M Na+或者相等盐浓度、65-68℃下能形成稳定杂合体的核酸可以杂交的条件。高严格条件可以是，例如在含有6×SSC,5×Denhardt’s,1％SDS(十二烷基硫酸钠)、0.1焦磷酸钠和0.1mg/ml变性鲑精DNA作为非特异性竞争剂的水溶液中进行杂交。杂交后，高严格条件的漂洗可以分几步进行，最后的漂洗(大约30分钟)，在0.2-0.1×SSC,0.1％SDS及杂交温度下进行。
中等严格条件指在上面所述相同溶液中，但在约60-62℃的条件下进行杂交。在此条件下，最后的漂洗在1×SSC,0.1％SDS及杂交温度下进行。
低严格条件指在上面所述相同溶液中，但在约52-56℃的条件下进行杂交。在此条件下，最后的漂洗在4×SSC,0.1％SDS及杂交温度下进行。
显然，这些条件是可以改变的且用不同的缓冲液和温度也能被重复，例如，基于甲酰胺的缓冲液。Denhardt溶液和SSC就象其它适用于杂交的缓冲液一样对本领域技术人员来说是熟知的(见，例如，Sambrook，等编著(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版，纽约或者Ausubel，等编著(1990)最新分子生物学指南，JohnWiley&Sons,Inc)。最佳的杂交条件只能由经验来决定，例如探针的长度和GC含量同样也很重要。
本发明的CYPB蛋白包括一个ER保留信号。因此，在本发明的一个优选方面，提供了一种具有折叠酶活性的多肽，此多肽的特征是能催化多肽中脯氨酸残基N端一侧肽键的顺反异构化，由一个能够在低严格、中等严格或高严格条件下与由SEQ ID N0.1衍生而成的一个17个碱基的寡核苷酸杂交的核酸编码。优选使用低严格条件。
SEQ.ID.NO.1代表编码一种ER保留信号的简并序列。因为此信号很可能位于任何位于ER中的CYPB蛋白中，所以此序列的存在可有利地用于鉴定和分离根据本发明的CYPB多肽。
根据本发明提供的指导，本发明的核酸可根据本领域中熟知的一些方法获得。例如，本发明的一种DNA可通过PCR方法化学合成，或通过筛选基因组文库或合适的cDNA文库来获得，这些文库由确信含有CYPB并以可检测水平表达CYPB的来源而制得。
化学合成目的核苷酸的方法在本领域是熟知的，包括三酯法，亚磷酸法，亚磷酰胺法和H-膦酸脂法，PCR及其它自动引物方法及固相寡核苷酸合成。如果核酸的全核酸序列已知或者可获得与编码链互补的核酸序列，可以使用这些方法。另外，如靶氨基酸序列是已知的，可以应用每个氨基酸已知的和优选的编码推断可能的核酸序列。
根据本发明，分离编码PPI的基因的另一方法就是如Sambrook等1989年的书中14章所述利用PCR技术。该方法需要利用能和PPI核酸杂交的寡核苷酸探针。选择寡核苷酸的策略如下描述。
利用设计用来鉴定目的基因或目的基因所编码蛋白的探针或分析工具筛选文库。对于cDNA表达文库合适的方法包括，识别并特异结合CYPB的单克隆或多克隆抗体；长度大约在20至80个碱基的编码同种或不同种已知或可疑CYPB cDNA的寡核苷酸；和/或互补或同源的cNDA或者其片段，它们编码同一基因或能与其杂交的基因。筛选基因组DNA文库的合适探针包括，但不限于寡核苷酸，cDNA或者其片段，它们能编码同一DNA或编码能与其杂交的DNA；和/或同源的基因组DNAs或其片段。
编码CYPB的核酸可以通过在适合的杂交条件下，用一个探针来筛选合适的cDNA文库或基因组文库而被分离，所述探针即此处公开的包括来自于SEQ.ID.NO.2所示序列的寡核苷酸的核酸。
在本文中，一个探针是例如单链DNA或RNA，此单链DNA或RNA含有一个核苷酸序列，包括10-50，优选15-30，最优选大约20个连续碱基，这些连续的碱基与示于SEQ.ID.NO.2的相同数量或更多的连续碱基是相同(或互补)的。被选作探针的核酸序列应有足够的长度及非常确切，以使假阳性结果降至最小。该核苷酸序列通常基于保守的或高度同源的核苷酸序列或CYPB区域。用作探针的核酸可以在一个或多个位点是简并的。在从其密码子使用偏嗜不清楚的种中筛选文库时，简并寡核苷酸的利用尤其重要。
用来构建探针的优选区域包括5′和/或3′编码序列、预测编码配体结合位点的序列等。例如，不管是本发明公开的全长cDNA克隆还是其片段都能用作探针。优选，本发明的核酸探针用适合的标记方法标记，以通过杂交进行快速检测。例如，一种适合的标记方法是放射性标记。该优选的标记一个DNA片段的方法是在随机引发反应中用DNA聚合酶的Klenow片段掺入α32P dAIP的方法，此方法在本领域是熟知的。寡核苷酸通常是用γ32P标记的ATP和多核苷酸激酶来进行末端标记。然而，其它方法(如非放射性)也同样可以被用来标记片段或寡核苷酸，包括如酶标记、利用适合荧光基团的荧光标记及生物素化。
筛选文库以后，例如，利用包括基本上整个CYPB编码序列的DNA一部分或者基于所述DNA的一部分的一个适合寡核苷酸，阳性克隆通过检测杂交信号被鉴定；所鉴定的克隆通过限制性作图和/或cDNA序列分析来定性，并且通过与本发明所列序列比较来检查，以确定是否它们含有编码完整CYPB的DNA(即，它们是否包括翻译起始和终止密码子)。如果所选克隆是不完全的，它们可以被用来重新筛选相同或不同的文库以获得重叠克隆。如果文库是基因组，那么这些重叠克隆可能包含外显子和内含子。如果文库是cDNA文库，那么这些重叠克隆将包含一个开放阅读框架。以上两种情况下，完整的克隆可以通过与本发明提供的DNAs和推测的氨基酸序列的比较来鉴定。
为了检测内源性CYPB的任何异常，遗传学的筛选可以通过运用本发明的核苷酸序列作杂交探针来进行。同样，如果需要的话，根据此处提供的核酸序列，可以设计反义型试剂用于降低CYPB的表达。
可以设想，本发明的核酸能通过核苷酸替代，核苷酸缺失，核苷酸***或核苷酸片段的倒转及它们的任何组合来方便地修饰。这些突变体能够用来，例如，产生具有与自然界中发现的CYPB序列不同的氨基酸序列的CYPB突变体。诱变可以被预先确定(定点)或是随机的。不是沉默突变的突变必须位于阅读框之内并且最好不会产生能产生象环状或发夹的二级mRNA结构的互补区。
以下通过实施例描述本发明，其目的仅仅为了说明本发明。
实施例1
黑曲霉(Aspergillus niger)cDNA文库的构建
λZAP-黑曲霉N402 cDNA文库通过应用Stratagene公司的ZAP-cDNA合成试剂盒及根据制造商提供的指导从黑曲霉cDNA构建而来。
实施例2
黑曲霉cDNA文库的筛选
大约2×50.000 pfu被涂布于大的(22×22cm)NZY平板上，平板含有以下培养基(每升)：5g NaCl,2g MgSO4·7H2O,5g酵母浸提物，10g酪蛋白水解物，15g琼脂，用NaOH调节pH值至7.5。培养基灭菌、冷却到约65℃后倒平板。每个平板用240ml培养基。
接种后的NZY平板于37℃下培养过夜，并且制作平板的噬菌斑的印膜。在Hyboud N(Amersham)膜上，每个平板做两个印膜。DNA用紫外射线固定4分钟，并且如下面所描述的，滤膜用32P-dCTP标记的简并寡核苷酸作探针进行杂交，探针的标记用Terminal Transferase(Boehringer Uannherm)试剂盒，根据以下程序进行。
用500pmol的简并寡核苷酸，在末端转移酶(TerminalTransferase)反应缓冲液(Boehinger Mannheim)中，94℃温育3分钟后，混合液置冰上冷却并加入4ul 32P-dCTP。标记反应通过加入10个单位的末端转移酶(Boehringer Mannheim)来起动。37℃温育30分钟后，70℃温育5分钟，热失活末端转移酶。放射性标记的寡核苷酸用NAP5柱子(Pharmaeia-含Sephader G-25介质)纯化。
滤膜在50ml预杂交缓冲液中，56℃预杂交4小时，预杂交缓冲液含有12.5ml 20×SSC(0.3M柠檬酸钠，3M NaCl),2.5ml 100×Denhardt溶液，2.5ml 10％SDS及32.5ml水。在使用之前向预杂交缓冲液中加入300ul 10mg/ml变性的鲑鱼精DNA。预杂交后，加入放射性标记的寡核苷酸，滤膜在56℃下杂交过夜。第二天，滤膜用4×SSC+0.1％SDS在56℃下漂洗两次，每次30分钟。
滤膜进行放射自显影16小时，阳性克隆得到分离。只有当NZY平板的两个印膜都有杂交信号时，此克隆才被认为是阳性。
基本上按如上所述进行第二次筛选，六个推断的克隆得到分离，并通过在小的Petri氏培养皿上涂板得以纯化。最终筛选了4个克隆，用Rapid Excision Kit (Stratagene)将其转入质粒。
所得质粒的测序用反向及通用序列引物进行。含有cypB基因的质粒被定名为pPD23，此cypB基因编码亲环蛋白样肽基脯氨酰基顺反异构酶B。
实施例3
含有cypB基因的质粒pPD23的鉴定
作了此克隆的限制性图谱。片段被克隆于pBluescript SK+的EcoRⅠ和XhoⅠ位点间。显示op pPD23结构的限制性图谱在图1(图1)中表示。此基因用循环测序法测序。全序列如SEQ.ID.NO.2所示。对全部构建体的两条链测序。
推导的氨基酸序列用Clustal W程序与3个亲环蛋白样肽基脯氨酰基顺反异构酶B作了序列对比。序列对比如图2(图2)所示。以上的序列对比表明，此CYPB与其它已知的CYPB序列是同源的。
在SWISS-PROT数据库中进行了检索，没有发现任何比上述序列对比中(图2)有更高同源性的序列。具有最高同源性的序列是来自Orpinomyces属种的亲环蛋白样肽基脯氨酰基顺反异构酶的一个前体，此处的同一性为63％(图3)。
1-23位残基被确认为信号序列，余下的是一推测分子量为20,7kDa，推测的等电点(pI)为6.27的186个氨基酸的成熟蛋白。此CYPB蛋白含有一个推测的ER保留信号，在其C-端的最末端(位点209-212)。一个推测的N-糖基化的位点在CYPB蛋白的139-142位被发现。一个亲环蛋白型的肽基-脯氨酰基顺反异构酶的保守基序存在于79-76位。
实施例4
cypB在大肠杆菌中的表达
含有编码成熟的CYPB蛋白基因部分的一个片段用以下引物通过PCR获得。
上游引物：
5′ccc ara tgg aag atg ctc agc ccc ggg gcc cca aga3′(SEQ.ID.NO.3)
下游引物：
5′cga agc tta gtg gtg gtg gtg gtg gtg gct gct acc ttt ttct3′(SEQ.ID.NO.4)
PCR用pfu聚合酶于52℃下进行。ER靶序列从此构建体中去除。而且，此蛋白的C-末端部分用一个HIS-标志延伸。随后，此片段被克隆入pET-24a(+)(Novagen)，能使此基因在大肠杆菌中表达。此构建被转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS中。cypB的表达通过向OD600=1时的培养物中加1mM IPTG来诱导。
大肠杆菌中表达的蛋白用固定化金属疏水相互作用色谱(Ni-NTA树脂，Qiagen)和凝胶过滤(Superdex 75,Pharmacia)纯化。纯化的CYPB的表现分子量用SDS-PAGE凝胶电泳确定大约为21kDa。准确的分子量用MALDI-TOF分析来确定，显示分子量为21100.6Da,N-末端的测序显示了成熟序列的前10个氨基酸(EDAQPRGPK-SEQ.ID.NO.2序列中24到32位残基)。
一种基于α-chemotrypsin(Boehringer Mannheim)立体特异性降解底物suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(Sigma)的分析法已被建立用于确定CYPB的活性。此底物的反式异构体被chemotrypsin快速降解。在水中，88％的此底物是以反式形式存在，而12％以顺式形式存在。顺式异构体向反式异构体的转变是限速的并且被肽基脯氨酰基顺反异构酶催化。
CYPB在含有50uM底物及25umα-chemotrysin的50mM HEPESpH7.8的缓冲液中，25℃下被测定。0.5nM CYPB蛋白被加入到以上混合体系并且每隔0.5秒钟测一次380nm处的吸光值。CYPB蛋白的加入明显导致了底物的更快的降解，证明了其折叠酶的活性。
实施例5
CYPB与三酰甘油脂酶的共表达
脂酶表达和CypB质粒
质粒pLIP4(图4)包括lipA基因的整个基因组的序列。此序列示于SEQ.ID.NO.4。CYPB表达自ppd23d14或ppd23d13，分别如图5或图6所示。ppd23d14包括受启动子glaA控制的CypB序列(通常可得到，见，例如，Ward等，(1995)。生物技术13:498-503),glaA启动子是可诱导的。ppd23d13包括受构巢曲霉gpdA启动子控制的CypB序列(Punt等，(1991)生物技术杂志17:19:34)，此gpdA启动子是有组成型活性的。以上两种情况中，CypB基因后都接着构巢曲霉的trpC终止子。
通过***一个受gpdA启动子控制的潮霉素抗性基因(从吸水链霉菌和大肠杆菌分离)，抗生素抗性被掺入到质粒中。
脂酶基因转化塔宾曲霉菌株3M pyrA。
塔宾曲霉菌株3M pyrA的孢子在含有2％葡萄糖和10mM尿嘧啶核苷的基本培养基的摇瓶中，34℃培养过夜。收集菌丝并用加有裂解酶的裂解缓冲液重悬浮。所产生的原生质体与pLIP4和ppd23d14或ppd23d13一起混合，通过共转化，用pyrG和抗生素基因标记去选择目的重组体。
在转化的曲霉菌株中脂酶产物的原位检测
一种用于超薄层等电聚焦后使真菌脂酶可见的筛选程序被应用于筛选生长于琼脂平板上的Aspergillas转化子。此程序对于表达和非表达的转化曲霉菌株的早期分析是非常方便的。在琼脂平板上脂酶产生菌的筛选是通过用2％橄榄油作为酶(脂酶)的底物及脂酶启动子的诱导物来进行的。另外，平板中含有一种荧光染料罗丹明B(RhodamineB)(N-9-(2-carboxylphenyl)-6-(diethylamino)-3H-xanthen-3-ylidene-N-ethylethanaminium chloride)。在橄榄油的存在下，转化子受诱导分泌脂酶。脂酶分泌在琼脂平板中水解橄榄油，在UV照射(350nm)下，引起可见的橙色荧光克隆的形成，取决于转化子，荧光克隆的检测在培养24小时后观察。生长几天后，脂酶产生菌能通过肉眼可见的橙色荧光来确定。在这些平板筛选的条件下，没有转化的菌株没有荧光背景，而且显现不透明的粉红色菌落。然而，研究者应小心能在含有橄榄油的平板上快速生长的真菌及细菌的可能污染。通过加入抗生素-氨苄青霉素来防止污染。
脂酶分泌转化子的鉴定
显现橙色荧光环的16个转化子在加有1％橄榄油，0.5％酵母浸提物，0.2％酪蛋白氨基酸的100ml基本培养基中摇瓶培养8天。所分泌脂酶量的定量测定，通过向打在橄榄油-罗丹明B琼脂平板上的孔中加入10ul无细胞的培养液上清，将此平板于37℃温育过夜来进行。利用此技术，能生产最强荧光的来自5个转化子的无细胞培养液上清用色谱进行进一步的分析。
疏水相互作用色谱纯化重组脂酶
通过平板筛选法发现的五个不同的脂酶分泌转化子的培养液上清，用NAP5柱子(Pharmacia，含Sephadex G-25介质)脱盐并用含1m(NH4)2SO4的50mM Na2AC pH5.5平衡。脱盐的培养液上清用一个Biogel Phenyl-5 PW柱子(Biorad)进行疏水相互作用色谱分离各组分。洗脱用含1M至0M(NH4)2SO4的20mM Na2Ac pH5.5逐渐降低盐浓度的梯度洗脱。分离后观察到一个单个的蛋白峰。对不同转化子中的此蛋白峰的面积进行计算并与非转化菌株作比较。下面的表格总结了这5个转化子所分泌的脂酶的水平。最好的转化子疏水相互作用色谱分离后的纯化脂酶的量增加了62倍。表格也显示了在非最佳小规模摇瓶条件下生长6天后不同转化子产生的不同脂酶量。
以1％橄榄油为碳源生长6天的转化子 HIC后的分泌脂酶水平=分立蛋白峰面积/6M的面积面积=峰高×FWHN(半峰宽)
L43-6    Flipper 61.9
L3-6 10.5
L1-6 13.1
L13-6 17.0
L47-6 29.3
6M-6    未转化的6M菌株 1.0
b．重组脂酶的鉴定
1．氨基酸分析和蛋白的确定
HIC分离的分立蛋白峰，通过冷冻干燥并重新溶解于水。纯化脂酶的氨基酸组成和蛋白浓度被确定，以获得280nm下紫外吸收和蛋白浓度的相关系数。这使得同源制备物的脂酶浓度的估计可以进行。
脂酶蛋白被羧甲基化并通过N-末端氨基酸测序确定头15个氨基酸的序列。重组脂酶的头15个氨基酸的序列与表现正确信号序列切割的天然脂酶完全相同。
2．SDS-PAGE电泳
疏水相互作用色谱分离后收集的不同蛋白组分用12％ Tris-甘氨酸SDS胶分离。银染表现为一条带，确证此蛋白峰的同一性。另外，粗提液表现为一条主要的带，它是当此真菌在含有橄榄油的培养基中培养时，以极大量在培养液上清中积累的唯一蛋白带。
3．重组脂酶中共价连接的N-联寡糖存在的检测。
N-联寡糖的检测通过来自链霉菌的内切N-乙酰葡萄糖胺酶H(Sigma)消化脂酶来实现。内切酶H处理分泌到生长培养基中的重组脂酶，改变了SDS-PAGE所显条带的迁移率并且以大约30kDa分子量的单一分子种类移动。这说明了N-联糖基化的程度。
4．重组脂酶的基质辅助激光解吸附质谱
将已纯化的脂酶与由70％乙腈、0.1％三氟乙酸中的芥子酸(3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)组成的基质溶液混合，进行MALDT-TOF质谱分析。脱盐重组脂酶的分子量确定为32,237道尔顿(Daltons)。
脱糖基化的脂酶通过用内切糖苷酶H消化产生，并直接用Maldi-MS分析，给出一个多肽骨架分子量的估计值为29.325Da。
通过这些分析，N-联寡糖在糖蛋白上的存在及其大约数量可以被确定。总之，N-联寡糖占重组脂酶分子量的大约10％。脂酶的质谱分析
+内切糖苷酶H
重组脂酶 32,237道尔顿 29,326道尔顿
天然脂酶 30,310道尔顿 29,333道尔顿
实施例6
cypB基因在黑曲霉(Aspergillas niger)中的过量表达
曲霉N592(cspAl,pyrA5)已经转化入一个质粒，此质粒能表达受组成型强启动子gpdA控制的CypB。推测的转化子通过PCR筛选以确认此质粒的存在。菌株(N592::ppD23d13)中CypB整合的拷贝数及表达水平分别通过Southern和Northern分析被确定。
Southern分析清楚地表明，菌株N592::pPD23d13含有整合质粒pPD23d13的多个拷贝。在此菌株中cypB的表达水平大约比野生型的表达水平高约15倍。
为了确定是否此菌株有分泌更多蛋白的能力，设立了一个生长实验，在此生长实验中，野生型菌株(N402)和菌株N592::pPD23d13在含有2％(w/v)淀粉的条件下生长。淀粉被认为是葡糖淀粉酶表达的特异诱导物。因而，分析上清样品酶的活性及分泌蛋白的量。
葡糖淀粉酶被认为是一个很好的分泌蛋白并通常作为融合蛋白用来帮助难分泌靶蛋白的分泌。
cypB的过量表达明显导致了葡糖淀粉酶的高产水平，72小时诱导后，几乎两倍的葡糖淀粉酶活性被检测出。此时不再有葡糖淀粉酶从头产生，最大的可能是因为诱导碳源的耗尽。
实施例7
CYPB的定位：
真核细胞的蛋白分泌是一个复杂的过程。最新合成的分泌蛋白及膜蛋白以一种非折叠状态进入内质网(ER)，并且在它们能在分泌路径中进一步运输之前需要一种特异的构型。许多蛋白已经被发现在ER的腔中。这些包括BiP(结合蛋白，70kDa热激蛋白的一种同源物)，蛋白二硫键异构酶(PDI)及肽基脯氨酰基顺反异构酶(PPI)。这些折叠酶与催化蛋白从非折叠状态到天然状态的折叠有关。为了保留在ER中，因此也为了被从大量的分泌蛋白流中转移出，折叠酶有特异的保留及回复信号。一个普通的羧基末端四肽HDEL已经被鉴定为能保留蛋白在ER腔中的一个信号。去除此四肽导致蛋白的分泌(Pelham(1990)Trends Biochem Sci.15,483-486)。
CYPB蛋白含有一个信号序列及一个推测的ER保留信号，说明此蛋白是被定位及保留在ER中的。然而，此蛋白中的保留信号与已知保留信号有细微的差别。在-3位上(从最后一个氨基酸残基开始数)，此CYPB蛋白含有一个谷氨酸残基。此HEEL序列还没有被鉴定为是一个ER保留信号。为了评价是否能保留CYPB于ER的腔中，构建了含有CYPB信号序列及CYPB ER保留信号的GFP构建体。此基因的表达受组成型强启动子gpdA的驱动(质粒pPD38d3；图7)。
通过PCR筛选黑曲霉D15(prtT；pyrG；phmA)转化子中GFP表达质粒的***。含表达构建体的菌株被用来分析GFP的表达。
菌株D15::pPD38d3#5在液体培养基中生长过夜，并显示GFP被定位于细胞中的一个管状网络。在构巢曲霉中同样的构建体已经被证实使GFP靶向ER，显示了一个类似于我们发现的网络(Fernandez-Abalos，等(1998)Mol.Microbiol.27,121-130)。用ER-Tracker DPX(分子探针)染菌丝显示了同型的管状网络。
最后，DIOC6显示如DPX和GFP中所见的同样的管状网络，这种物质低浓度时是线粒体的染料，但较高浓度时对ER染色也有效。然而，DIOC6染色为ER染料向外扩散所阻碍，只会染色线粒体。
我们的结果清楚地表明，HEEL对GFP保留在ER中是必需和充分的。因此，CYPB蛋白是靶向并保留在ER中也是很清楚了。
序列表<110>Danisco A\S<120>酶<130>p4837gb<140><141><160>4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：ER保留信号<400>1ggyyavagyt crtcrtg                                                17<210>2<211>987<212>DNA<213>黑曲霉<220><221>CDS<222>(42)..(677)<400>2ggcacgagaa ttctcctaca ttggagacat cctgagcaat c atg aac ttc aag aac 56
                                          Met Asn Phe Lys Asn
                                            1               5att ttt cta tct ttc ttc ttc gtc ctg gcg gtt gga ctt gct ctt gtc   104Ile Phe Leu Ser Phe Phe Phe Val Leu Ala Val Gly Leu Ala Leu Val
             10                  15                  20cac gcc gaa gat gct cag ccc cgg ggc ccc aag atc acc agt aag gtg   152His Ala Glu Asp Ala Gln Pro Arg Gly Pro Lys Ile Thr Ser Lys Val
         25                  30                  35ttc ttt gat ata gag cac gga gac aag cct ctg ggc aga gtc gtg ctt   200Phe Phe Asp Ile Glu His Gly Asp Lys Pro Leu Gly Arg Val Val Leu
     40                  45                  50ggc ttg tat ggc aag act gtt cct aag acc gct gag aac ttc cgg gct   248Gly Leu Tyr Gly Lys Thr Val Pro Lys Thr Ala Glu Asn Phe Arg Ala
 55                  60                  65ctc gct act ggt gag aag ggc ttt ggc tat gaa gga tct acc ttc cac   296Leu Ala Thr GIy Glu Lys Gly phe Gly Tyr Glu Gly Ser Thr Phe His70                  75                  80                  85cgt gtc att aag gac ttc atg atc cag ggt ggt gac ttc act cgt ggc   344Arg Val Ile Lys Asp Phe Met Ile Gln Gly Gly Asp Phe Thr Arg Gly
             90                  95                 100gat ggt acc ggt gga aag tcg atc tac ggt gag aag ttc gcc gac gaa   392Asp Gly Thr Gly Gly Lys Ser Ile Tyr Gly Glu Lys Phe Ala Asp Glu
        105                 110                 115aac ttc aag ctg agg cat acg cgc aag ggg ctc ctg agc atg gcc aac   440Ash Phe Lys Leu Arg His Thr Arg Lys Gly Leu Leu Ser Met Ala Asn
    120                 125                 130gcc ggc aag gac acc aac ggc tcc cag ttc ttc atc acc acc gtt cct   488Ala Gly Lys Asp Thr Asn Gly Ser Gln Phe Phe Ile Thr Thr Val Pro
135                 140                 145aca cct tgg ctt gat ggc cgc cat gtc gtc ttc ggt gaa gtg ctc gag   536Thr Pro Trp Leu Asp Gly Arg His Val Val Phe Gly Glu Val Leu Glu150                 155                 160                 165ggc tac gag atc gtc gct cag att gag aac gtg ccc aag ggc cgt tct   584Gly Tyr Glu Ile Val Ala Gln Ile Glu Asn Val Pro Lys Gly Arg Ser
            170                 175                 180gac aga ccc gtg gag act gtc aag atc gtc aag agt gga gag ttg gag   632Asp Arg Pro Val Glu Thr Val Lys Ile Val Lys Ser Gly Glu Leu Glu
        185                 190                 195tct gag gac aag gct gga gaa aaa ggt agc agc cac gag gag ctg       677Ser Glu Asp Lys Ala Gly Glu Lys Gly Ser Ser His Glu Glu Leu
    200                 205                 210tagacctgtt tcctgaggtc tcggccytgc ttctcgataa ractgtgaat gtgcydaacc 737gcttkgtaaa gaaacgagct ccgaagaaga gtcacaacct tcagcaattg ctgttattcc 797ttctccaacc cctttgccta tgacatctga taacgcycct tatattttcc cgaaattcgc 857agcgcttgcc attgttgtcg gtcycctggt tgtcctggtc cgacgcagct caagggagaa 917caagagaagg ctgaaagaag tattgtttga tagaaattgt actcatccaa wtaaaaaaaa 977aaaaaaaaaa                                                        987<210>3<211>212<212>PRT<213>黑曲霉<400>3Met Asn Phe Lys Asn Ile Phe Leu Ser Phe Phe Phe Val Leu Ala Val1               5                  10                  15Gly Leu Ala Leu Val His Ala Glu Asp Ala Gln Pro Arg Gly Pro Lys
         20                  25                  30Ile Thr Ser Lys Val Phe Phe Asp Ile Glu His Gly Asp Lys Pro Leu
     35                  40                  45Gly Arg Val Val Leu Gly Leu Tyr Gly Lys Thr Val pro Lys Thr Ala
 50                  55                  60Glu Ash Phe Arg Ala Leu Ala Thr Gly Glu Lys Gly Phe Gly Tyr Glu65                  70                  75                  80Gly ser Thr Phe His Arg Val Ile Lys Asp Phe Met Ile Gln Gly Gly
             85                  90                  95Asp Phe Thr Arg Gly Asp Gly Thr Gly Gly Lys Ser Ile Tyr Gly Glu
        100                 105                 110Lys Phe Ala Asp Glu Asn Phe Lys Leu Arg His Thr Arg Lys Gly Leu
    115                 120                 125Leu Ser Met Ala Asn Ala Gly Lys Asp Thr Asn Gly Ser Gln Phe Phe
130                 135                 140Ile Thr Thr Val Pro Thr Pro Trp Leu Asp Gly Arg His Val Val Phe145                 150                 155                 160Gly Glu Val Leu Glu Gly Tyr Glu Ile Val Ala Gln Ile Glu Asn Val
            165                 170                 175Pro Lys Gly Arg Sar Asp Arg Pro Val Glu Thr Val Lys Ile Val Lys
        180                 185                 190Ser Gly Glu Leu Glu Ser Glu Asp Lys Ala Gly Glu Lys Gly Ser Ser
    195                     200             205His Glu Glu Leu
210<210>4<211>1842<212>DNA<213>黑曲霉<400>4ccndttaatc ccccaccggg gttcccgctc ccggatggag atggggccaa aactggcaac 60ccccagttgc gcaacggaac aaccgccgac ccggaacaaa ggatgcggat gaggagatac 120ggtgcctgat tgcatggctg gcttcatctg ctatcgtgac agtgctcttt gggtgaatat 180tgttgtctga cttaccccgc ttcttgcttt ttcccccctg aggccctgat ggggaatcgc 240ggtgggtaat atgatatggg tataaaaggg agatcggagg tgcagttgga ttgaggcagt 300gtgtgtgtgt gcattgcaga agcccgttgg tcgcaaggtt ttggtcgcct cgattgtttg 360tataccgcaa gatgttctct ggacggtttg gagtgctttt gacagcgctt gctgcgctgg 420gtgctgccgc gccggcaccg cttgctgtgc ggagtaggtg tgcccgatgt gagatggttg 480gatagcactg atgaagggtg aataggtgtc tcgacttcca cgttggatga gttgcaattg 540ttcgcgcaat ggtctgccgc agcttattgc tcgaataata tcgactcgaa agactccaac 600ttgacatgca cggccaacgc ctgtccatca gtcgaggagg ccagtaccac gatgctgctg 660gagttcgacc tgtatgtcac tcagatcgca gacatagagc acagctaatt tgaacaggac 720gaacgacttt ggaggcacag ccggtttcct ggccgcggac aacaccaaca agcggctcgt 780ggtcgccttc cggggaagca gcacgattga gaactggatt gctaatcttg acttcatcct 840ggaagataac gacgacctct gcaccggctg caaggtccat actggtttct ggaaggcatg 900ggagtccgct gccgacgaac tgacgagcaa gatcaagtct gcgatgagca cgtattcggg 960ctatacccta tacttcaccg ggcacagttt gggcggcgca tgggctacgc tgggagcgac 1020agttctgcga aatgacggat atagcgttga gctggtgagt ccttcacaaa ggtgatggag 1080cgacaatcgg gttctgacag tcaatagtac acctatggat gtcctcgaat cggaaactat 1140gcgctggctg agcatatcac cagtcaggga tctggggcca acttccgtgt tacacacttg 1200aacgacatcg tcccccgggt gccacccatg gactttggat tcagtcagcc aagtccggaa 1260tactggatca ccagtggcaa tggagccagt gtcacggcgt cggatatcga agtcatcgag 1320ggaatcaatt caacggcggg aaatgcaggc gaagcaacgg tgagcgttgt ggctcacttg 1380tggtactttt ttgcgatttc cgagtgcctg ctataactag accgactgtc agattagtgg 1440acgggagaag tgtacataag taattagtat ataatcagag caacccagtg gtggtgatgg 1500tggtgaaaga agaaacacat tgagttccca ttacgkagca gwtaaagcac ktkkggaggc 1560gctggttcct ccacttggca gttggcggcc atcaatcatc tttcctctcc ttactttcgt 1620ccaccacaac tcccatcctg ccagctgtcg catccccggg ttgcaacaac tatcgcctcc 1680ggggcctccg tggttctcct atattattcc atccgacggc cgacgtttca ccctcaacct 1740gcgccgccgc aaaatctccc cgagtcggtc aactccctcg aaccgccgcc cgcatcgacc 1800tcaccgaccc cgaccgtctg ygatygtcca accg                             1834

Claims (21)

1．在一种宿主细胞中生产一种分泌多肽的方法，包括在该宿主细胞中过量表达一种肽基脯氨酰基顺反异构酶，因此提高分泌多肽的产量。
2．根据权利要求1的方法，包括用编码该多肽的第一编码序列和编码肽基脯氨酰基顺反异构酶的第二编码序列共转染该细胞。
3．根据权利要求2的方法，其中该多肽和肽基脯氨酰基顺反异构酶被编码于不同的载体。
4．根据前述任何权利要求的方法，其中编码肽基脯氨酰基顺反异构酶的编码序列被整合到该宿主细胞的基因组中。
5．根据前述任何权利要求的方法，其中该细胞为真菌细胞。
6．根据前述任何权利要求的方法，其中该亲环蛋白肽基脯氨酰基顺反异构酶是真菌来源的。
7．根据前述任何权利要求的方法，其中该多肽包括一个ER保留信号。
8．根据权利要求7的方法，其中此ER保留信号是HDEL,HEEL或KDEL。
9．一种具有折叠酶活性的多肽，此多肽有以下特征：能够催化多肽链中脯氨酸残基N端一侧肽键的顺反异构化，在N末端有一个信号序列，在C末端有一个内质网保留信号，分子量为20.7kDa，推测的等电点为6.27。
10．根据权利要求9的多肽，该多肽是真菌来源的。
11．根据权利要求10的多肽，该多肽来自曲霉属。
12．根据权利要求11的多肽，该多肽来自黑曲霉。
13．一种具有折叠酶活性的多肽，其特征在于能够催化多肽链中脯氨酸残基N端一侧肽键的顺反异构化，由能够在低严格条件下与来自SEQ.ID.N0.2的20个碱基的寡核苷酸杂交的核酸编码。
14．一种具有折叠酶活性的多肽，其特征在于能够催化多肽链中脯氨酸残基N端一侧肽键的顺反异构化，由能够在低严格条件下与来自SEQ.ID.NO.1的17个碱基的寡核苷酸杂交的核酸编码。
15．一种具有折叠酶活性的多肽，其特征在于能够催化多肽链中脯氨酸残基N端一侧肽键的顺反异构化，其与SEQ.ID.NO.2至少40％同源。
16．根据权利要求1至8任一项的方法，其中该亲环蛋白肽基脯氨酰基顺反异构酶是根据权利要求9至15任一项的多肽。
17．编码根据权利要求9至15任一项的多肽的核酸载体。
18．用权利要求17的载体转化的宿主细胞。
19．根据权利要求18的宿主细胞，其为真菌宿主细胞。
20．根据权利要求19的宿主细胞，其为曲霉宿主细胞。
21．一种生产具有折叠酶活性的多肽的方法，该多肽的特征在于能够催化多肽链中脯氨酸残基N端一侧肽键的顺反异构化，该方法包括用权利要求17的载体转化宿主细胞。
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