JP2002525120A

JP2002525120A - ペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼ

Info

Publication number: JP2002525120A
Application number: JP2000572381A
Authority: JP
Inventors: パトリックエム．エフ．ダークス，; スーザンエム．マドリッド，
Original assignee: ダニスコエイ／エス
Priority date: 1998-09-30
Filing date: 1999-09-30
Publication date: 2002-08-13
Also published as: EP1117806A1; BR9914146A; CN1321195A; GB2357769B; GB2357769A; US20020150969A1; AU5993299A; US6638737B1; CA2340789A1; AU764169B2; NZ510037A; GB0103639D0; WO2000018934A1; GB9821198D0; KR20010082208A; US6607904B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、宿主細胞中で分泌可能なポリペプチドを産生するための方法、およびこのような方法に有用なＡ．ｎｉｇｅｒ由来の新規なペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼを提供する。上記の方法は、この宿主細胞中にペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼを過剰発現させ、それによりこの分泌されたポリペプチドの収率を増大させる工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、新規な酵素に関する。特に、本発明は、新規なシクロフィリン様ペ
プチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼに関する。

【０００２】ほとんどのタンパク質過剰産生ストラテジーでは、非常に高レベルの転写を指
向し得る強力なプロモーターが、異種タンパク質および同種タンパク質をコード
する遺伝子を過剰発現させるために使用される。タンパク質分泌における制限は
、翻訳レベルおよび翻訳後レベルでの狭い通路に起因するようである（Ｔｓｕｃ
ｈｉｙａ，Ｋ．ら、（１９９２）ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
３８：１０９〜１１４）。タンパク質の適切な折り畳みは、搬出受容能に必要と
される。過剰発現した異種タンパク質は、不適切に折り畳まれ得、次いで分泌経
路を通じてのタンパク質輸送の間に分解され得る。従って、折り畳み欠損の補正
が、タンパク質分泌を増強するために所望され得る。

【０００３】タンパク質の折り畳みは、多数の因子により触媒される。この多数の因子には
、２つのイソメラーゼファミリー、すなわち、ジスルフィド結合形成を触媒する
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、およびＸａａプロリン結合の異性化を触
媒するペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼが挙げられる。

【０００４】Ｓ．ｃｅｒｅｂｖｉｓｉａｅにおけるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの
過剰発現は、ヒト血小板由来増殖因子の分泌の増大を生じる（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ
ら、１９９４）。しかし、Ａ．ｎｉｇｅｒタンパク質ジスルフィド結合イソメラ
ーゼの過剰発現は、鶏卵白リゾチーム（ＨＥＷＬ）またはグルコアミラーゼの分
泌における増大を生じなかった（ＮｇｉａｍＣ．、Ｊｅｅｎｅｓ，Ｄ．Ｊ．Ｊ
．、Ｐｕｎｔ，Ｐ．Ｊ．ｖａｎｄｅｎＨｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．
、Ａｒｃｈｅｒ，Ｄ．Ａ．（１９９８）；Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ
ｏｆａｆｏｌｄａｓｅ，ＰＤＩＡ，ｉｎｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓｅｃ
ｒｅｔｏｒｙｐａｔｈｗａｙｏｆＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ；
提出済）。

【０００５】タンパク質の折り畳みにおいて最も遅い工程のうちの１つは、Ｘａａプロリン
結合のシス−トランス異性化である。この異性化は、ペプチジルプロリルシス−
トランスイソメラーゼが存在する場合に著しく加速される。異なる生物由来のシ
クロフィリンファミリーのペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼは、
インビトロでフォルダーゼ（ｆｏｌｄａｓｅ）活性を保有することが示されてい
る（ＳｃｈｏｎｅｂｒｕｎｎｅｒＥ．Ｒ．、ＭａｙｅｒＳ．、Ｔｒｏｐｓｃ
ｈｕｇＭ．、ＦｉｓｃｈｅｒＧ．、ＴａｋａｈａｓｈｉＮ．、Ｓｃｈｍｉ
ｄ，Ｆ．（１９９１）；Ｃａｔａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｆｏｌｄ
ｉｎｇｂｙｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎｓｆｒｏｍｄｉｆｅｒｅｎｔｓｐ
ｅｃｉｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：３６３０〜３６３５）。これら
のイソメラーゼは、免疫抑制薬物であるシクロスポリンＡによって阻害される。
しかし、ペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼの過剰発現による異種
ペプチドの分泌に対する効果は、当該分野において公知ではない。

【０００６】Ｅ．Ｒ．中で活性なタンパク質は、４アミノ酸のカルボキシ末端伸長によって
この区画に標的化される。Ａ．ｎｉｇｅｒにおいて、ＨＤＥＬおよびＫＤＥＬは
、Ｅ．Ｒ．保持シグナルとして機能することが報告されている（Ｊｅｅｎｅｓ
Ｄ．Ｊ．ら、（１９９７）Ｇｅｎｅ１９３：１５１〜１５６）。

【０００７】（発明の要旨）本発明の第１の局面において、宿主細胞中に分泌可能なポリペプチドを産生す
るための方法が、提供され、この方法は、この細胞中にペプチジルプロリルシス
−トランスイソメラーゼを過剰発現させ、それによりこの分泌されたポリペプチ
ドの収率を増大させる工程を包含する。

【０００８】第２の局面において、本発明は、ポリペプチド中のプロリン残基のＮ末端上の
ペプチド結合のシス−トランス異性化を触媒する能力を有することによって特徴
付けられる、フォルダーゼ活性を保有するポリペプチドであって、このポリペプ
チドがＮ末端にシグナル配列およびＣ末端に小胞体保持シグナルを、ならびに２
０．７ｋＤａの分子量および６．２７の推定等電点を有するポリペプチドに関す
る。

【０００９】第３の局面において、本発明は、ポリペプチドにおけるプロリン残基のＮ末端
側鎖上のペプチド結合のシス−トランス異性化を触媒する能力により特徴付けら
れる、フォルダーゼ活性を有するポリペプチドであって、低い、中程度または高
いストリンジェンシー条件下でＳＥＱＩＤＮＯ：１に由来する１７塩基のオ
リゴヌクレオチドとハイブリダイズし得る核酸によってコードされるポリペプチ
ド。に関する第４の局面において、本発明は、ポリペプチドにおけるプロリン残基のＮ末端
側鎖上のペプチド結合のシス−トランス異性化を触媒する能力により特徴付けら
れる、フォルダーゼ活性を有するポリペプチドであって、低い、中程度または高
いストリンジェンシー条件下でＳＥＱＩＤＮＯ：２に由来する２０塩基のオ
リゴヌクレオチドとハイブリダイズし得る核酸によってコードされるポリペプチ
ドに関する。

【００１０】第５の局面において、本発明は、ポリペプチドにおけるプロリン残基のＮ末端
側鎖上のペプチド結合のシス−トランス異性化を触媒する能力により特徴付けら
れる、フォルダーゼ活性を有するポリペプチドであって、ＳＥＱＩＤＮＯ：
２に少なくとも４０％相同性であるポリペプチドに関する。

【００１１】（発明の詳細な説明）本発明は、異なる宿主から分泌されたポリペプチドの発現を増大させるペプチ
ジルプロリルシス−トランスイソメラーゼ（ＰＰＩ）の過剰発現に関する。細胞
中のＰＰＩレベルの増大は、この細胞からのポリペプチドの分泌を促進するに効
果的であることが示されている。ＰＰＩは、その誤った折り畳みのレベルを減少
させることによって、ＥＲ中のポリペプチド産物の保持、およびその後の分解を
防ぐと考えられる。従って、本発明は、細胞から分泌されたポリペプチドの収率
を増大させるために特に適切である。

【００１２】本明細書中で使用される用語「ペプチジルプロリルシス−トランスイソメラー
ゼ」ポリペプチド（ＰＰＩ）は、ポリペプチド中のプロリン残基のＮ末端上のペ
プチド結合のシス−トランス異性化を触媒し得る酵素を示すために使用される。
ＰＰＩは、遍在性であり、そしていくつかの例が当該分野において公知である。
例としては、シクロフィリン（例えば、Ｂｅｒｇｓｍａら（１９９６）Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２３２０４〜２３２１４を参照のこと）、パルブリン
（ｐａｒｖｕｌｉｎ）、ＳｕｒＡ（ＲｏｕｖｉｅｒｅおよびＧｒｏｓｓ、（１９
９６）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１０：３１７０〜３１８２）ならびにＦＫ５０６結
合タンパク質であるＦＫＢＰ５１およびＦＫＢＰ５２が挙げられる。ＰＰＩは、
ポリペプチド中のペプチジル−プロリル結合のシス−トランス異性化を担い、そ
れにより正確な折り畳みを促進する。本発明は、ＰＰＩ活性を有する任意のポリ
ペプチドを含む。これには、ＰＰＩ活性を保有し得るシャペロンポリペプチド、
またはそのフラグメントが挙げられる（ＷａｎｇおよびＴｓｏｕ、（１９９８）
ＦＥＢＳｌｅｔｔ．４２５：３８２〜３８４）。好ましくは、本発明は、シク
ロフィリンファミリーのＰＰＩポリペプチドに関する。

【００１３】有利なことに、この宿主細胞は、異種遺伝子産物を発現する、形質転換された
宿主細胞である。特に、この異種遺伝子産物が過剰発現される場合に、得られた
ポリペプチドが誤って折り畳まれ、それにより上記に示されたＥＲ中で分解され
る傾向が、増大される。従って、これらの環境下では、本発明に従うＰＰＩの過
剰発現は、非常に有利である。

【００１４】しかし、本発明はまた、宿主細胞における異種ポリペプチドの産生を増大させ
るために使用され得る。例えば、本発明は、天然の生物学的プロセスによってか
、または遺伝子の転写を上方制御し得る薬剤の投与によって引き起こされる、細
胞活性における増大の結果として、相同的なポリペプチドの転写が増大される場
合に有用である。さらに、細胞は、内因性遺伝子の情報制御を生じ得る発現系（
例えば、内因性プロモーターに対して活性である転写因子をコードする発現系）
で形質転換され得る。

【００１５】同様に、ＰＰＩ発現の上方制御は、内因性ＰＰＩの発現の増大によってか、ま
たは上昇したレベルでＰＰＩを産生し得るコード配列で宿主細胞を形質転換する
ことによって達成され得る。有利なことに、宿主細胞は、ＰＰＩをコードする配
列で形質転換される。

【００１６】従って、好ましい実施態様では、本発明は、宿主細胞において分泌可能なポリ
ペプチドを産生するための方法に関与し、この方法は、ポリペプチドをコードす
る第１のコード配列およびペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼをコ
ードする第２のコード配列をこの細胞に共トランスフェクトする工程を包含する
。

【００１７】有利なことに、本発明は、宿主細胞中で分泌可能なポリペプチドを発現させる
ための方法に関し、この方法は、以下の工程：ａ）本発明に従うペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼを発現する
コード配列で細胞を形質転換する工程；ｂ）所望のポリペプチドを発現するコード配列でこの細胞を形質転換する工程
；およびｃ）この細胞を培養してポリペプチドを産生する工程、を包含する。

【００１８】本明細書中で使用される場合、トランスフェクションおよび形質転換は、等価
であるとみなされ、そしてＤＮＡの細胞中への挿入の任意の形態（ウイルス形質
導入技術、エレクトロポレーション技術、および従来のトランスフェクション技
術を含む）を含む。ペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼおよび所望
のポリペプチドをコードするコード配列は、ベクター上で、または独立して裸と
して細胞に挿入され得る。ベクターの使用が好ましい。ペプチジルプロリルシス
−トランスイソメラーゼおよび所望のポリペプチドが、別々のベクター上に存在
する場合、別々のベクターのうちのいずれか一方が、他方よりも前にこの宿主中
に挿入され得る。挿入の順番は、増大したレベルのペプチジルプロリルシス−ト
ランスイソメラーゼがこの所望のポリペプチドの発現の間に宿主細胞中で得られ
る限り重要ではない。

【００１９】有利なことに、ペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼおよび所望の
ポリペプチドは、同じベクターに存在し得る。

【００２０】好ましくは、宿主細胞は、ペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼを
発現するコード配列がこの宿主細胞およびゲノム中に組み込まれるように構築さ
れ得る。このことは、上記のコード配列で細胞を形質転換するために組み込み発
現ベクターを使用して達成され得る。

【００２１】上記のように、ペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼを発現するコ
ード配列は、好ましくは、適切なベクター中に組み込まれる。本明細書中で使用
する場合、ベクター（またはプラスミド）とは、異種ＤＮＡの発現または複製の
いずれかのために、細胞中に異種ＤＮＡを導入するために使用される分離したエ
レメントをいう。このようなビヒクルの選択および使用は、当業者に周知である
。多くのベクターが利用可能であり、そして適切なベクターの選択は、ベクター
およびこのベクターで形質転換される宿主の意図される使用に依存する。各々の
ベクターは、その機能および適合性である宿主細胞に依存する種々の成分を含む
。このベクター成分は、一般に、１以上の以下のもの：複製起点、１以上のマー
カー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結配列およびシグ
ナル配列を含むがこれらに限定されない。

【００２２】ほとんどの発現ベクターは、シャトルベクターであり、すなわち、それらは、
少なくとも１つのクラスの生物中で複製し得るが、発現のために別のクラスの生
物中にトランスフェクトされ得る。例えば、ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ中にクロ
ーニングされ得、次いで、この同じベクターが、この宿主細胞の染色体から独立
して複製し得ない場合でも酵母または他の真菌細胞中にトランスフェクトされ得
る。ＤＮＡはまた、例えば、ＰＣＲによって増幅され得、そして任意の複製成分
なしに宿主細胞中に直接トランスフェクトされ得る。

【００２３】有利には、発現ベクターは、選択遺伝子（選択マーカーともいわれる）を含み
得る。この遺伝子は、選択培養培地中で増殖される、形質転換された宿主細胞の
生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターを
用いて形質転換されない宿主細胞は、この培養培地中で生存しない。代表的な選
択遺伝子は、抗生物質および他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、
メトトレキサートまたはテトラサイクリン）に対して抵抗性を付与するタンパク
質をコードするか、栄養素要求性欠損を補足するか、あるいは複合培地から利用
可能でない、重要な栄養素を供給する。

【００２４】酵母および他の真菌生物に適切な選択遺伝子マーカーに関して、マーカー遺伝
子の表現型発現に起因して、形質転換体についての選択を容易にする任意のマー
カー遺伝子が、使用され得る。酵母のための適切なマーカーは、例えば、抗生物
質Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはブレオマイシンに対して抵抗性を付与する
マーカーであるか、または栄養素要求性酵母変異体（例えば、ＵＲＡ３遺伝子、
ＬＥＵ２遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＴＲＰ１遺伝子またはＨＩＳ３遺伝子）にお
いて原栄養体を提供する。

【００２５】ベクターの複製がＥ．ｃｏｌｉにおいて都合良くなされるので、Ｅ．ｃｏｌｉ
遺伝子マーカーおよびＥ．ｃｏｌｉ複製起点は、有利に含まれる。これらは、Ｅ
．ｃｏｌｉプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｃ）ベ
クターまたはｐＵＣプラスミド（例えば、ｐＵＣ１８もしくはｐＵＣ１９））か
ら得られ得る。このＥ．ｃｏｌｉプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点および抗
生物質（例えば、アンピシリン）に対する抵抗性を付与するＥ．ｃｏｌｉ遺伝子
マーカーの両方を含む。

【００２６】発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主細胞によって認識さ
れるプライマーを含み、そしてペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼ
をコードする核酸に作動可能に連結される。このようなプロモーターは、誘導性
であるか、または構成的であり得る。プロモーターは、制限酵素消化による供給
源ＤＮＡからのプロモーターの除去、および単離されたプロモーター配列のベク
ターへの挿入によって、ペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼをコー
ドするＤＮＡに作動可能に連結される。ネイティブプロモーター配列および多く
の異種プロモーターの両方を使用して、ペプチジルプロリルシス−トランスイソ
メラーゼコード配列の増幅および／または発現を指向し得る。用語「作動可能に
連結される」は、記載される成分が、意図される様式でそれらが機能することを
許容する関係にある近位をいう。コード配列に「作動可能に連結される」コント
ロール配列は、コード配列の発現がコントロール配列と適合する条件下で達成さ
れる方法で連結される。

【００２７】酵母宿主を用いる使用のための適切な促進配列は、調節され得るか、または構
成的であり、そして好ましくは、高度に発現される真菌遺伝子由来である。真菌
のプロモーターは、文献において公知である（例えば、Ｇｕｒｒら（１９８７）
Ｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎｏｆｎｕ
ｃｌｅａｒｇｅｎｅｓｏｆｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｉを参照の
こと。Ｋｉｎｇｈｏｒｎ，Ｊ．Ｒ．（編）においては、ＧｅｎｅＳｔｒｕｃｔ
ｕｒｅｉｎＥｕｋａｒｙｏｔｉｃＭｉｃｒｏｂｅｓ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ
，Ｏｘｆｏｒｄ、９３〜１３９頁）。酵母プロモーター（例えば、酵母ＴＲＰ１
遺伝子、ＡＤＨＩ遺伝子、ＡＤＨＩＩ遺伝子、酸ホスファターゼ（ＰＨ０５）遺
伝子のプロモーター、ａ−因子またはα−因子をコードする酵母交配フェロモン
遺伝子のプロモーターあるいはグリコール酸酵素をコードする遺伝子由来のプロ
モーター（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ（ＧＡＰ）、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、
ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リ
ン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、ト
リオ−スリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼまたはグルコキナ
ーゼ遺伝子のプロモーター）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＧＡＬ４遺伝子、
Ｓ．ｐｏｍｂｅｎｍｔＩ遺伝子、またはＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）
遺伝子からのプロモーター）もまた、使用され得る。さらに、１つの酵母遺伝子
の上流活性化配列（ＵＡＳ）および別の酵母遺伝子の機能的ＴＡＴＡボックスを
含む下流プロモーターエレメントを含む、ハイブリッドプロモーター（例えば、
酵母ＰＨ０５遺伝子のＵＡＳおよび酵母ＧＡＰ遺伝子の機能的ＴＡＴＡボックス
を含む下流プロモーターエレメントを含む、ハイブリッドプロモーター（ＰＨ０
５−ＧＡＰハイブリッドプロモーター）を使用することが、可能である。適切な
構成的ＰＨＯ５プロモーターは、例えば、ＰＨ０５遺伝子のヌクレオチド−１７
３で始まり、そしてヌクレオチド−９で終結するＰＨ０５（−１７３）プロモー
ターエレメントのような上流調節エレメント（ＵＡＳ）を除く短縮型酸ホスファ
ターゼＰＨ０５プロモーターである。

【００２８】本発明に関連して、例えば、バイオテクノロジー産業において使用される真菌
生物（例えば、糸状真菌）；好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、ＭｕｃｏｒまたはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ
の使用が、好ましい。より具体的には、好ましい宿主生物には、Ａ．ｎｉｄｕｌ
ａｎｓ、Ａ．ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ、Ａ．ｓｏｊａｅ、Ａ．ａｗａｍｏｒｉ、Ａ
．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ａ．ａｃｕｌｅａｔｕｓ、Ｎ．ｃｒ
ａｓｓａ、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉおよびＴ．ｖｉｒｉｄｅが挙げられる。本発明の核
酸構築物の発現のためおよび／または本発明に従う異種ポリペプチドの調製のた
めに好ましい宿主生物は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の生物であり、有利には、
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒである。この点に関して、本発明に従うト
ランスジェニックＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓは、以下の教示に従って調製され得る
：Ｒａｍｂｏｓｅｋ，Ｊ．およびＬｅａｃｈ，Ｊ．１９８７（Ｒｅｃｏｍｂｉｎ
ａｎｔＤＮＡｉｎｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｉ：Ｐｒｏｇｒｅｓ
ｓａｎｄＰｒｏｓｐｅｓｔｓ．ＣＲＣＣｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．６：３５７〜３９３）、ＤａｖｉｓＲ．Ｗ．１９９４（Ｈｅｔｅｒ
ｏｌｏｇｏｕｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｒｏｔｅｉｎ
ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｉｎＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ．：Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ
Ｓ．Ｄ．、ＫｉｎｇｈｏｒｎＪ．Ｒ．（編）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ：５０
ｙｅａｒｓｏｎ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ第２９巻．ＥｌｓｅｖｉｅｒＡｍｓｔｅｒｄａｍ１９
９４、５２５〜５６０頁）、Ｂａｌｌａｎｃｅ，Ｄ．Ｊ．１９９１（Ｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓｆｏｒＦｉｌａｍｅｎｔｏｕｓＦｕ
ｎｇｉａｎｄａｎＯｖｅｒｖｉｅｗｏｆＦｕｎｇａｌＧｅｎｅｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅ：Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ａ．，ＢｅｒｋａＲ．Ｍ．（編）Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｙｃｏｌｏｇｙ．Ｓｙｓｔｅｍｓａ
ｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＦｉｌａｍｅｎｔｏｕｓＦｕｎｇ
ｉ．ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒＩｎｃ．ＮｅｗＹｏｒｋ１９９１，１〜
２９頁）およびＴｕｒｎｅｒＧ．１９９４（Ｖｅｃｔｏｒｓｆｏｒｇｅｎ
ｅｔｉｃｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：ＭａｒｔｉｎｅｌｌｉＳ．Ｄ．、Ｋｉ
ｎｇｈｏｒｎＪ．Ｒ．（編）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ：５０ｙｅａｒｓｏ
ｎ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ第２９巻．ＥｌｓｅｖｉｅｒＡｍｓｔｅｒｄａｍ１９９４、６４１〜６
６６頁）。以下の説明は、本発明に従ってトランスジェニックＡｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓを産生するための教示の要旨を提供する。

【００２９】トランスジェニックＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓを調製するために、発現構築物は
、糸状真菌における発現のために設計される構築物への異種ヌクレオチド配列（
例えば、アミラーゼ酵素をコードするヌクレオチド）の挿入によって調製される
。

【００３０】異種発現のために使用されるいくつかの型の構築物が、開発されている。この
構築物は、真菌において活性である、本発明に従うプロモーターを含む。異種ヌ
クレオチド配列は、分泌されるべき異種ヌクレオチド配列によりコードされるタ
ンパク質に指向する、シグナル配列に融合され得る。通常、真菌起源のシグナル
配列が使用される。真菌において活性なターミネーターもまた、使用され得る。

【００３１】別の型の発現系は、異種ヌクレオチド配列が安定なタンパク質をコードする真
菌遺伝子に融合される真菌において開発されている。これは、所望のポリペプチ
ドをコードする異種ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質を安定化
し得る。このような系において、特定のプロテアーゼによって認識される切断部
位が、真菌タンパク質と、異種ヌクレオチド配列荷よりコードされるタンパク質
との間に導入され得、そのように生成された融合タンパク質は、特定のプロテア
ーゼによってこの位置で切断され得、それにより、異種ヌクレオチド配列によっ
てコードされるタンパク質を解放する。例示の目的によって、少なくともいくつ
かのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｉにおいて見出されるＫＥＸ−２様ペプチダーゼによっ
て認識される部位を導入し得る（Ｂｒｏｅｋｈｕｉｊｓｅｎら、１９９３、Ｊ
Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ３１１３５〜１４５）。このような融合は、発現された
生成物の保護を生じるインビボにおける切断を誘導し、そしてより大きな融合タ
ンパク質を誘導しない。

【００３２】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓにおける異種発現は、細菌タンパク質、真菌タンパク
質、脊椎動物タンパク質および植物タンパク質をコードするいくつかの遺伝子に
ついて報告されている。生成物の安定性および宿主株の改変に関して、いくつか
の異種タンパク質は、それらが真菌の培養液体へ分泌される場合にあまり安定で
はない。ほとんどの真菌は、異種タンパク質を分解するいくつかの細胞外プロテ
アーゼを生成する。この問題を回避するために、プロテアーゼ生成を減少する特
定の真菌株が、異種生成のための宿主として使用されている。

【００３３】糸状真菌の形質転換について、いくつかの形質転換プロトコルが、多くの糸状
真菌について開発されている（Ｂａｌｌａｎｃｅ１９９１同書）。それらの
多くは、プロトプラストの調製ならびにＰＥＧおよびＣａ²⁺イオンを使用する、
ＤＮＡのそのプロトプラストへの導入に基づく。次いで、形質転換されたプロト
プラストは再生され、そして形質転換された真菌は、種々の選択マーカーを使用
して選択される。形質転換のために使用されるマーカーは、多くの栄養素要求性
マーカー（例えば、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、ｎｉａＤおよびｐｙｒＧ）、抗生物質
抵抗性マーカー（例えば、ベノミル抵抗性、ハイグロマイシン抵抗性およびフレ
オマイシン（ｐｈｌｅｏｍｙｃｉｎ）抵抗性）である。共通に使用される形質転
換マーカーは、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓのａｍｄＳ遺伝子（これは、高いコピ−数
において、唯一の窒素供給源としてアクリルアミドを用いて真菌を増殖し得る）
である。

【００３４】真菌生物によるペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼをコードする
ＤＮＡの転写は、ベクターへのエンハンサー配列の挿入によって増大され得る。
エンハンサーは、相対的に配向依存性および位置依存性である。

【００３５】発現ベクターは、このようなＤＮＡを発現し得る調節配列（例えば、プロモー
ター領域）と作動可能に連結される、ペプチジルプロリルシス−トランスイソメ
ラーゼをコードする核酸を発現し得る任意のベクターである。従って、発現ベク
ターは、適切な宿主細胞への導入の際に、組換えＤＮＡ構築物または組換えＲＮ
Ａ構築物（例えば、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクター
）をいい、クローン化されたＤＮＡを生じる。適切な発現ベクターは当業者に周
知であり、そしてこれには、真核生物細胞および／もしくは原核生物細胞におい
て複製可能なベクターならびにエピソームを保持するベクターまたは宿主細胞ゲ
ノムへ組み込まれるベクターが挙げられる。

【００３６】本発明に従うベクターの構築は、従来の連結技術を使用する。単離されたプラ
スミドまたはＤＮＡフラグメントは、必要とされるプラスミドを生成するために
所望される形態で切断、変更、および再連結される。所望であれば、構築された
プラスミド中の正確な配列を確認するための分析が、公知の形式で実施される。
発現ベクターの構築、インビトロ転写物の調製、宿主細胞へのＤＮＡの導入、お
よびペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼ発現の評価のための適切な
方法は、当業者に公知である。遺伝子の提示、増幅および／または発現は、本明
細書中に提供される配列に基づき得る適切な標識されたプローブを使用して、サ
ンプル中で直接（例えば、従来のサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量
するためのノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡもしくはＲ
ＮＡ分析）、またはインサイチュハイブリダイゼーションによって）測定され得
る。当業者は、所望であれば，どのようにこれらの方法が改変され得るかを容易
に予測する。

【００３７】同一または類似の考慮が、所望のポリペプチドをコードするベクターの設計に
適用される。必要ではないが、エピソームであろうと組込みであろうと、ＰＰＩ
および所望のポリペプチドが、同じベクター上でコードされ、そしてそこから発
現されることが可能である。好ましくは、所望のポリペプチドは、宿主生物に由
来しない異種ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドである。

【００３８】所望のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の代表的な例は、代謝プロ
セスおよび異化プロセスを改変するタンパク質および酵素をコードする配列を含
み得る。異種ヌクレオチド配列は、病原体抵抗性を導入するかまたは増大するた
めの因子をコードし得る。異種ヌクレオチド配列は、糸状真菌，好ましくはＡｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の非ネイティブタンパク質か、または動物もしくはヒトに
有利である化合物をコードし得る。本発明に従うヌクレオチド配列の例には、ペ
クチナーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ポリガラクトウロナーゼ、ペクチン酸リ
アーゼ、ペクチンリアーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、
リパーゼ、グルカンリアーゼ、ラムノガラクトウレアーゼ、ヘミセルラーゼ、エ
ンド−β−グルカナーゼ、アラビナーゼ、もしくはアセチルエステラーゼ、また
はそれらの組合せ、ならびにそれらのアンチセンス配列が挙げられる。所望のポ
リペプチドは、食品または作物に対する栄養的価値を与えるタンパク質であり得
る。代表的な例には、抗栄養性因子の形成を阻害し得る植物タンパク質、および
より望ましいアミノ酸組成（例えば、非トランスジェニック植物よりもより高い
リジン含量）を有する植物タンパク質が挙げられる。

【００３９】所望のポリペプチドは、食品加工において使用され得る酵素（例えば、キモシ
ン、タウマチンおよびα−ガラクトシダーゼ）であり得る。所望のポリペプチド
は、さらに、ペスト毒素、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（例えば、Ｅ
Ｐ−Ａ−０４５５３１６を参照のこと）、グルカナーゼまたはゲノムβ−１，４
−エンドグルカナーゼのいずれかであり得る。

【００４０】異種ヌクレオチド配列は、特定のヌクレオチド配列のイントロンをコードし得
る。ここで、このイントロンは、センス配向またはアンチセンス配向であり得る
。

【００４１】異種ヌクレオチド配列は、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９６／０１００９（本
明細書に参考として援用される）の対象であるアラビノフラノシダーゼ酵素をコ
ードするヌクレオチド配列であり得る。この異種ヌクレオチド配列は、ＰＣＴ特
許出願ＰＣＴ／ＥＰ９４／０１０８２（本明細書中に参考として援用される）の
主題であるＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ酵素をコードする任意のヌク
レオチド配列であり得る。この異種ヌクレオチド配列は、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ
／ＥＰ９４／０３３９７（本明細書中に参考として援用される）に記載されるα
−グルカンリアーゼ酵素をコードする任意のヌクレオチド配列であり得る。この
異種ヌクレオチド配列は、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９５／０２６０７（本明
細書中に参考として援用される）に記載されるようなＴ．ｌａｎｇｕｉｎｏｓｕ
ｓアミラーゼをコードする任意の配列であり得る。この異種ヌクレオチド配列は
、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９６／０１００８（本明細書中に参考として援用
される）に記載されるグルカナーゼ酵素をコードする任意のヌクレオチド配列で
あり得る。

【００４２】本発明の好ましい局面において、ＰＰＩをコードする核酸はまた、それに作動
可能に連結される、ＥＲ保持シグナルを含む。好ましくは、このＥＲ保持シグナ
ルは、テトラペプチドであり、これは、有利にはＨＤＥＬ、ＨＥＥＬまたはＫＤ
ＥＬである。このＥＲ保持シグナル標的は、ＥＲに対してポリペプチドを標的と
し、そしてＥＲをポリペプチドに保持させる。

【００４３】本発明の第２の局面に従って、フォルダーゼ（ｆｏｌｄａｓｅ）活性を保有し
、そしてポリペプチド中のプロリン残基のＮ末端側に結合されるペプチドのシス
−トランスイソメラーゼ化を触媒する能力を有することによって特徴付けられる
ポリペプチドが、提供される。このポリペプチドは、Ｎ末端にシグナル配列およ
びＣ末端に小胞体保持シグナルを、そして２０．７キロダルトンの分子量および
６．２７の推定等電点を有する。有利には、本発明のこの局面に従う新規なＰＰ
Ｉは、真菌生物（例えば、糸状真菌（例えば、バイオテクノロジー産業に使用さ
れる；好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａまたはＰｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ；好ましくはＡ．ｎｉｇｅｒ））から得ることができる。

【００４４】本発明に従うＰＰＩの例は、配列番号２に示される。この配列において同定さ
れる分子は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒから得ることができ、そして
本明細書中でＣＹＰＢといわれる。上記に示される基準を満たすＰＰＩ酵素は、
一般に本明細書中で「ＣＹＰＢ」酵素といわれる。従って、好ましい局面におい
て、本発明は、配列番号２に示されるＣＹＰＢ、またはその生物学的等価物（ｂ
ｉｏｉｓｏｓｔｅｒｅ）を提供する。

【００４５】本明細書中で使用される場合、用語「生物学的等価物（ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒ
ｅ）」は、当該分野において共通の慣習に従って使用され、すなわち、同様の（
しかし同じではない）かまたは異なる構造を有し、かつ同じ生物学的機能効果を
有する化合物をいう。

【００４６】有利には、本発明の生物学的等価物は、真菌生物（例えば、糸状真菌（例えば
、バイオテクノロジー産業に使用される；好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、
ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａまたはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ；好ましくはＡ．ｎｉｇ
ｅｒ））から得ることができる。

【００４７】本発明のさらなる局面に従って、本発明に従う酵素をコードする核酸が、提供
される。組換えＰＰＩタンパク質の生成について有用であることに加えて、これ
らの核酸はまた、プローブとして有用であり、従って、ＰＰＩまたはそのホモロ
グをコードする核酸を同定および／または単離することは当業者に容易に可能で
ある。この核酸は、標識されなくてもよいし、または検出可能な部分を用いて標
識されてもよい。さらに、本発明に従う核酸は、例えば、ＰＰＩ特異的核酸の存
在を決定する方法において有用であり、上記方法は、ＰＰＩをコードする（かま
たは相補的な）ＤＮＡ（またはＲＮＡ）を試験サンプル核酸にハイブリダイズす
る工程、およびＰＰＩの存在を決定する工程を包含する。別の局面において、本
発明は、ＰＰＩまたはそのフラグメントをコードする核酸配列に相補的であるか
、またはＰＰＩまたはそのフラグメントをコードする核酸配列にストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズする、核酸を提供する。

【００４８】有利には、ＰＰＩをコードする核酸のフラグメントは、１０ヌクレオチド長と
２００ヌクレオチド長との間であり、好ましくは、１５ヌクレオチド長と５０ヌ
クレオチド長との間であり、そして最も好ましくは、約２０ヌクレオチド長であ
る。

【００４９】本発明はまた、核酸試験サンプルを増幅するための方法を提供し、この方法は
、ＰＰＩをコードする（かまたは相補的である）核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を
用いて核酸ポリメラーゼ（連鎖）反応をプライムする工程を包含する。

【００５０】本発明のなお別の局面において、核酸は、ＤＮＡであり、そして複製ベクター
をさらに含む。この複製ベクターは、このベクターにより形質転換された宿主に
よって認識されるコントロール配列に作動可能に連結するＰＰＩをコードする核
酸を含む。さらに、本発明は、このようなベクターを用いて形質転換された宿主
細胞、およびＰＰＩをコードする核酸を使用してＰＰＩの生成をもたらす方法を
提供し、この方法は、形質転換された宿主細胞の培養物中でＰＰＩをコードする
核酸を発現する工程、そして所望であれば、この宿主細胞培養物からＰＰＩを取
り出す工程を包含する。

【００５１】さらに、本発明は、上記の核酸によってコードされる単離されたＰＰＩタンパ
ク質およびその生物学的等価物に関する。

【００５２】単離されたＰＰＩ核酸は、ＰＰＩ核酸の天然供給源に通常随伴するかまたは粗
核酸調製物（例えば、ＤＮＡライブラリーなど）に随伴する、少なくとも１つの
夾雑核酸を含まない核酸を、含む。従って、単離された核酸は、天然に見出され
る形態または状況以外で存在する。しかし、単離された、ＰＰＩをコードする核
酸は、通常、ＰＰＩ発現細胞中でＰＰＩ核酸を含み、ここで、この核酸は、天然
細胞の染色***置とは異なる染色***置にあるか、または天然において見出され
る配列とは異なるＤＮＡ配列によって隣接される。

【００５３】本発明に従って、配列番号２に示される配列を有するＣＹＰＢをコードする単
離された核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、またはそのフラグメントが、提
供される。特に、本発明は、配列番号２に示されるようなＣＹＰＢをコードする
ＤＮＡ分子、またはそのフラグメントを提供する。定義によって、このようなＤ
ＮＡは、コードシグナル鎖ＤＮＡ、このコードＤＮＡの二本鎖ＤＮＡおよびそれ
らの相補的ＤＮＡ、またはこの相補的（一本鎖）ＤＮＡ自体を含む。

【００５４】ＣＹＰＢをコードする好ましい配列は、配列番号２のコード配列と実質的に同
じヌクレオチド配列を有する配列であり、配列番号２のコード配列と同じヌクレ
オチド配列を有する核酸が、最も好ましい。本明細書中で使用される場合、実質
的に同じであるヌクレオチド配列は、少なくとも約９０％の同一性を共有する。

【００５５】本発明の核酸は、プローブとして使用されるか否かにかかわらず、好ましくは
、配列番号２に示されるようなＣＹＰＢの配列に実質的に相同である。「実質的
な相同」は、相同性が配列同一性を示す場合、直接的な配列アラインメントおよ
び配列比較によって判断されるときに、４０％を超える配列同一性、好ましくは
４５％を超える配列同一性、そして最も好ましくは５０％以上の配列同一性を意
味する。

【００５６】実質的に相同なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列が、７５％より大きな相
同性（例えば、少なくとも８０％の相同性、または少なくとも８５％の相同性、
例えば少なくとも９０％の相同性、またはさらに少なくとも９５％の相同性、例
えば少なくとも９７％の相同性）を有し得る。ヌクレオチド配列相同性が、Ｍｙ
ｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒの「整列」プログラム（「ＯｐｔｉｍａｌＡｌｉｇ
ｎｍｅｎｔｓｉｎＬｉｎｅａｒＳｐａｃｅ」、ＣＡＢＩＯＳ４、１１−
１７、１９８８、本明細書中に参考として援用される）（ＮＣＢＩにおいて入手
可能）を使用して決定され得る。あるいは、またはさらに、例えば、ヌクレオチ
ド配列またはアミノ酸配列に関する用語「相同性」は、２つの配列間の相同性の
定量的測定値を示し得る。配列相同性パーセントは、（Ｎ_ref−Ｎ_dif）^*１００
／Ｎ_refとして計算され得、ここで、Ｎ_difは、整列された場合の２つの配列にお
ける全非同一残基数であり、ここで、Ｎ_refは、これら配列の一方における残基
の数である。従って、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣは、配列ＡＡＴＣＡＡＴＣ（
Ｎ_ref＝８；Ｎ_dif＝２）と７５％の配列類似性を有する。あるいは、またはさら
に、配列に関する「相同性」とは、２つの配列のうち短い方のヌクレオチド数ま
たはアミノ酸数により除算される同一のヌクレオチドまたはアミノ酸を有する位
置の数に言及し得、ここで、その２つの配列のアラインメントが、Ｗｉｌｂｕｒ
ａｎｄＬｉｐｍａｎアルゴリズム（ＷｉｌｂｕｒおよびＬｉｐｍａｎ、１９
８３ＰＮＡＳＵＳＡ８０：７２６、本明細書中に参考として援用される）
に従って、例えば、２０ヌクレオチドのウインドウサイズ、４ヌクレオチドのワ
ード長、および４のギャップペナルティーを使用して決定され得、そしてアライ
ンメントを含む配列データのコンピューター補助分析および解釈が市販のプログ
ラムを使用して都合良く実施され得る（例えば、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ（商標）Ｓｕｉｔｅ、ＩｎｔｅｌｌｅｇｅｎｅｔｉｃｓＩｎｃ．ＣＡ）。Ｒ
ＮＡ配列が、ＤＮＡ配列と、類似するといわれるか、あるいはある程度の配列同
一性もしくは相同性を有する場合、ＤＮＡ配列におけるチミジン（Ｔ）は、ＲＮ
Ａ配列におけるウラシル（Ｕ）と等しいと見なされる。

【００５７】本発明の範囲内のＲＮＡ配列は、ＤＮＡ配列におけるチミジン（Ｔ）をＲＮＡ
配列におけるウラシル（Ｕ）と等しいと見なすことにより、ＤＮＡ配列から誘導
され得る。

【００５８】さらに、またはあるいは、アミノ酸配列の類似性または同一性または相同性が
、デフォルトパラメーターを有利に利用して、ＢｌａｓｔＰプログラム（Ａｌｔ
ｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５、３３８９−３４０２、本
明細書中に参考として援用される）（ＮＣＢＩにおいて入手可能）を使用して決
定され得る。以下の参考文献（それぞれ参考として本明細書中に援用される）は
、２つのタンパク質のアミノ酸残基の相対的な同一性または相同性を比較するた
めのアルゴリズムを提供し、そしてさらに、またはあるいは、前述に関して、こ
の参考文献における教示が、相同性パーセントまたは同一性パーセントを決定す
るために使用され得る：ＮｅｅｄｌｅｍａｎＳＢおよびＷｕｎｓｃｈＣＤ，
「Ａｇｅｎｅｒａｌｍｅｔｈｏｄａｐｐｌｉｃａｂｌｅｔｏｔｈｅ
ｓｅａｒｃｈｆｏｒｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓｉｎｔｈｅａｍｉｎｏ
ａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｔｗｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０）；ＳｍｉｔｈＴＦおよびＷ
ａｔｅｒｍａｎＭＳ、「ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＢｉｏ−ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅｓ」ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈｅｍａｔｉｃｓ
２：４８２−４８９（１９８１）；ＳｍｉｔｈＴＦ、ＷａｔｅｒｍａｎＭＳ
およびＳａｄｌｅｒＪＲ、「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｚａｔｉｏｎｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｆｕｎｃ
ｔｉｏｎａｌｄｏｍａｉｎｓ」ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１１
：２２０５−２２２０（１９８３）；ＦｅｎｇＤＦおよびＤｏｌｉｔｔｌｅ
ＲＦ、「Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔａ
ｓａｐｒｅｒｅｑｕｉｓｉｔｅｔｏｃｏｒｒｅｃｔｐｈｙｌｏｇｅｎ
ｅｔｉｃｔｒｅｅｓ」Ｊ．ｏｆｍｏｌｅｃ．Ｅｖｏｌ．、２５：３５１−３
６０（１９８７）；ＨｉｇｇｉｎｓＤＧおよびＳｈａｒｐＰＭ、「Ｆａｓｔ
ａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉ
ｇｎｍｅｎｔｏｎａｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒ」ＣＡＢＩＯＳ、５：１
５１−１５３（１９８９）；ＴｈｏｍｐｓｏｎＪＤ、ＨｉｇｇｉｎｓＤＧお
よびＧｉｂｓｏｎＴＪ、「ＣｌｕｓｔｅｒＷ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅ
ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｍｕｌｔｉｐｌｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｔｈｒｏｕｇｈｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｗｅｉｇｈｉｎｇ、ｐｏｓｉｔｏｎｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｇａｐｐｅｎａｌ
ｔｉｅｓａｎｄｗｅｉｇｈｔｍａｔｒｉｘｃｈｏｉｃｅ」Ｎｕｃｌｅｉ
ｃＡｃｉｄＲｅｓ．、２２：４６７３−４８０（１９９４）；およびＤｅｖ
ｅｒｅｕｘＪ、ＨａｅｂｅｒｌｉｅＰおよびＳｍｉｔｈｉｅｓＯ、「Ａ
ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｓｅｔｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓ
ｉｓｐｒｏｇｒａｍｆｏｒｔｈｅＶＡＸ」Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．、１２：３８７−３９５（１９８４）。

【００５９】好ましくは、本発明に従う核酸は、ＣＹＰＢをコードする配列のフラグメント
である。長さにおいて数ヌクレオチド、好ましくは、長さにおいて５〜１５０ヌ
クレオチドの核酸配列のフラグメントは、特にプローブとして有用である。

【００６０】あるいは、模範的な核酸が、ＣＹＰＢタンパク質をコードし、そして配列番号
２に記載のＤＮＡ配列またはそのＤＮＡ配列のフラグメントにハイブリダイズす
るヌクレオチド配列として特徴付けられ得る。配列番号２の配列または上記で定
義されるようなそのフラグメントに高ストリンジェンシーな条件下においてハイ
ブリダイズするＣＹＰＢをコードする配列が好ましい。

【００６１】ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとは、ポリ核酸ハイブリッドが
安定である条件のことを言う。そのような条件は、当業者に対して明白である。
当業者に公知であるように、ハイブリッドの安定性はそのハイブリッドの融解温
度（Ｔｍ）（配列相同性が１％減少する毎におよそ１〜１．５℃減少する）に反
映される。一般的に、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度および温
度の関数である。代表的に、ハイブリダイゼーション反応は、より高いストリン
ジェンシーな条件下で実施され、次に種々のストリンンジェンシーな条件で洗浄
される。

【００６２】本明細書中で使用される場合、高ストリンジェンシーとは、１ＭＮａ⁺また
は等しい塩濃度で、６５〜６８℃において安定なハイブリッドを形成する核酸配
列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を言う。例えば、高ストリン
ジェンシーな条件が、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｔ、１％ＳＤＳ（ドデシル
硫酸ナトリウム）、０．１Ｎａ⁺ピロリン酸および０．１ｍｇ／ｍｌ変性サケ精
子ＤＮＡ（非特異的競合物）を含む水溶液中でのハイブリダイゼーションにより
提供され得る。ハイブリダイゼーションの後、高ストリンジェンシーな洗浄が、
０．２〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション温度に
おける最終洗浄（約３０分）とともにいくつかの工程においてなされ得る。

【００６３】中程度のストリンジェンシーとは、約６０〜６２℃で行うこと以外は、上記溶
液中のハイブリダイゼーションと等しい条件を言う。その場合、最終洗浄は、１
×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でハイブリダイゼーション温度において実施される
。

【００６４】低ストリンジェンシーとは、約５２〜５６℃で行うこと以外は、上記溶液中の
ハイブリダイゼーションと等しい条件を言う。その場合、最終洗浄は、４×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳ中でハイブリダイゼーション温度において実施される。

【００６５】これらの条件は、種々の緩衝液（例えば、ホルムアミドを基にした緩衝液）お
よび温度を使用して適用され、かつ再現され得ることが理解される。Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ溶液およびＳＳＣは、他の適切なハイブリダイゼーション緩衝液と同様に
、当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、編。（１９８９）Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、Ｎ
ｅｗＹｏｒｋまたはＡｕｓｕｂｅｌら、編。（１９９０）ＣｕｒｒｅｎｔＰ
ｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷ
ｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．を参照のこと）。プローブの長さおよびＧＣ含量
もまた役割を果たすので、最適なハイブリダイセーション条件は、経験的に決定
されなければならない。

【００６６】本発明のＣＹＰＢタンパク質は、ＥＲ保持シグナルを含む。従って、本発明の
好ましい局面において、ポリペプチド内のプロリン残基のＮ末端側のペプチド結
合のシス−トランス異性化反応を触媒する能力を有することにより特徴づけられ
るホルダーゼ（ｆｏｌｄａｓｅ）活性を有するポリペプチドが提供され、このポ
リペプチドは、低、中、または高ストリンジェンシーな条件下で、配列番号１由
来の１７塩基オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし得る核酸によりコードされ
る。好ましくは、低ストリンジェンシーな条件が使用される。

【００６７】配列番号１は、ＥＲ保持シグナルをコードする変性された配列を表す。このシ
グナルは、ＥＲ内に位置する任意のＣＹＰＢタンパク質上に位置するようなので
、この配列の存在を有利に使用し、本発明に従って、ＣＹＰＢポリペプチドを特
徴付け、そして単離し得る。

【００６８】本明細書中に提供されるガイダンスが与えられているので、本発明の核酸は、
当該分野で周知の方法に従って入手可能である。例えば、化学合成によりポリメ
ラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用するか、またはＣＹＰＢを所有し、かつ検出可
能なレベルでそれを発現すると考えられている供給源より調製されるゲノムライ
ブラリーもしくは適切なｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより
、本発明のＤＮＡは、入手可能である。

【００６９】目的の核酸の合成についての化学的方法は、当該分野に公知であり、そしてそ
の方法にはトリエステル法、亜リン酸塩法、ホスホラミダイト法およびＨ−ホス
ホネート法、ＰＣＲおよび他の自動プライマー法ならびに固体支持体上にオリゴ
ヌクレオチド合成が挙げられる。これらの方法は、この核酸の核酸配列全体が公
知であるか、またはコード鎖に相補的な核酸の配列が入手可能である場合、使用
され得る。あるいは、標的アミノ酸配列が公知の場合、各アミノ酸残基について
公知かつ好ましいコード残基を使用して、可能性のある核酸配列を推論し得る。

【００７０】本発明に従うＰＰＩをコードする遺伝子を単離する代替的な手段は、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、１９８９のセクション１４に記載されるＰＣＲ技術を使用すること
である。この方法は、ＰＰＩ核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプロ
ーブの使用を要求する。オリゴヌクレオチドの選択のためのストラテジーは以下
に記載される。

【００７１】目的の遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を同定するために設計
されたプローブまたは分析手段とともにライブラリーをスクリーニングする。ｃ
ＤＮＡ発現ライブラリーについて、適切な手段としては、ＣＹＰＢ；同種または
異種由来の、既知のＣＹＰＢｃＤＮＡもしくは疑わしいＣＹＰＢｃＤＮＡをコー
ドする約２０〜８０塩基長のオリゴヌクレオチド；および／または同じ遺伝子ま
たはハイブリダイズする遺伝子をコードする相補的もしくは相同的なｃＤＮＡま
たはそのフラグメントを認識し、かつ特異的に結合するモノクローナル抗体また
はポリクローナル抗体が挙げられる。ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グするための適切なプローブには、同じＤＮＡまたはハイブリダイズするＤＮＡ
をコードするオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡまたはそのフラグメント；および／
または相同的なゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントが挙げられるが、それらに
限定されない。

【００７２】ＣＹＢＰをコードする核酸を、プローブ（すなわち、配列番号２に記載される
配列から誘導可能なオリゴヌクレオチドを含む本明細書中に開示される核酸）と
ともに適切なハイブリダイゼーション条件下で、適切なｃＤＮＡライブラリーま
たはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより単離し得る。適切なラ
イブラリーは市販されているか、または例えば、細胞株、組織試料などから調製
され得る。

【００７３】本明細書中で使用される場合、プローブは、例えば、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮ
Ａであり、これは、配列番号２に記載される、等しい数か、もしくはより大きな
数の連続した塩基と同じ（あるいはその相補体である）１０と５０との間の連続
した塩基、好ましくは１５と３０との間の連続した塩基、最も好ましくは少なく
とも約２０の連続した塩基を含むヌクレオチドの配列を有する。プローブとして
選択されるこの核酸配列は、偽陽性結果を最小にするために十分な長さでかつ十
分に明確なものであるべきである。このヌクレオチド配列は、通常、ＣＹＰＢの
保存された、もしくは高度に相同的なヌクレオチド配列または領域に基づいてい
る。プローブとして使用されるこの核酸は、１つ以上の位置において縮重であり
得る。種における優先コドンの使用が未知であるその種からのライブラリーがス
クリーニングされる場合、縮重オリゴヌクレオチドの使用は特に重要であり得る
。

【００７４】５’および／または３’コード配列、リガンド結合部位をコードするものと推
定される配列などを含むプローブを構築するための領域が好ましい。例えば、本
明細書中に開示される全長ｃＤＮＡクローンまたはそのフラグメントのいずれか
がプローブとして使用され得る。好ましくは、本発明の核酸プローブは、ハイブ
リダイゼーションにおいてすぐ検出できるように、適切な標識手段で標識される
。例えば、適切な標識手段は放射性同位元素標識である。ＤＮＡフラグメントを
標識する好ましい方法は、当該分野において周知であるように、ランダムプライ
ミング反応（ｒａｎｄｏｍｐｒｉｍｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎ）におけるＤＮ
ＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いてα³²ＰＡＴＰを組み込む
ことによるものである。通常、オリゴヌクレオチドは、γ³²Ｐ標識化ＡＴＰおよ
びポリヌクレオチドキナーゼで末端標識される。しかし、他の方法（例えば、非
放射性）をも使用し、フラグメントまたはオリゴヌクレオチドを標識し得、その
方法としては、酵素標識、適切な発蛍光団での蛍光標識およびビオチン化が挙げ
られる。

【００７５】実質的に全体のＣＹＰＢコード配列を含むＤＮＡの一部または前記ＤＮＡの一
部に基づく適切なオリゴヌクレオチドを用いて、ライブラリーをスクリーニング
した後、ハイブリダイゼーションシグナルを検出することにより陽性クローンが
同定される；同定されたクローンは制限酵素地図作成および／またはＤＮＡ配列
分析により特徴づけられ、次いで、例えば本明細書中に述べられる配列と比較す
ることにより検査され、それらが完全ＣＹＰＢをコードするＤＮＡを含むか否か
（すなわち、それらが翻訳開始コドンおよび翻訳終結コドンを含むかどうか）を
確かめる。選択されたクローンが不完全である場合、それらを使用し、重複クロ
ーンを得るために同じライブラリーまたは異なるライブラリーを再スクリーニン
グし得る。そのライブラリーがゲノムライブラリーである場合、その重複クロー
ンはエキソンおよびイントロンを含み得る。そのライブラリーがｃＤＮＡライブ
ラリーである場合、その重複クローンはオープンリーディングフレームを含む。
両方の場合において、完全クローンが、本明細書中に提供されるＤＮＡおよび推
定アミノ酸配列との比較により同定され得る。

【００７６】内因性ＣＹＰＢのいかなる異常性をも検出するために、ハイブリダイゼーショ
ンプローブとして本発明のヌクレオチド配列を使用して遺伝子スクリーニングが
実行され得る。また、所望される場合、本明細書中に提供される核酸配列に基づ
いて、ＣＹＰＢの発現を減少させるアンチセンスタイプ因子が設計され得る。

【００７７】ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入またはヌクレオチド
範囲の逆位およびそれらの任意の組合せにより、本発明の核酸を容易に改変し得
ることが予想される。例えば、そのような変異体を使用し、天然に見出されるＣ
ＹＰＢ配列と異なるアミノ酸配列を有するＣＹＰＢ変異体を産生し得る。変異誘
発は予め決定され得るか、またはランダムであり得る。サイレント変異ではない
変異生成は、リーディングフレームの外に配列を配置してはならない、好ましく
は、この変異は、ｍＲＮＡの二次構造（例えば、ループまたはヘアピン）を産生
するようにハイブリダイズし得る相補的領域を生成しない。

【００７８】以下の実施例において、説明だけの目的のために、本発明を以下に記載する：（実施例１）ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒｃＤＮＡライブラリーの構築 λＺＡＰ−Ａ．ｎｉｇｅｒＮ４０２ｃＤＮＡライブラリーを、Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅのＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キットを使用することにより（製造業者により
提供される説明書を利用して）Ａ．ｎｉｇｅｒｃＤＮＡから構築する。

【００７９】（実施例２）ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒｃＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グおよそ２×５０，０００ｐｆｕを以下の培地（１リットルあたり）を含む大（
２２×２２ｃｍ）ＮＺＹプレートにプレーティングする：５ｇＮａＣｌ、２ｇＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、５ｇ酵母抽出物、１０ｇカゼイン加水分解物、１５ｇア
ガー、ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整する。この培地をオートクレーブ処理し、
約６５℃まで冷却し、プレートに注ぎ込む。１プレートあたり２４０ｍｌの培地
を使用する。

【００８０】接種されたＮＺＹプレートを３７℃で一晩インキュベートし、そのプレートの
プラークリフト（ｌｉｆｔｓ）を行う。ＨｙｂｏｎｄＮ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）
フィルター上に各プレートについて２つのリフトを行う。ＤＮＡを４分間のＵＶ
放射を使用して固定する。そしてそのフィルターを、プローブとして、以下の手
順に従ってＴｅｒｍｉｎａｌＴｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して³²Ｐ−ｄＣＴＰで標識された縮重オリゴヌクレ
オチドを使用して以下に記載されるようにハイブリダイズさせる。

【００８１】５００ｐｍｏｌの縮重オリゴヌクレオチドを使用する。ＴｅｒｍｉｎａｌＴ
ｒａｎｓｆｅｒａｓｅ反応緩衝液（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）
における９４℃でのインキュベーションを３分間した後、その混合物を氷上で冷
却し、４μｌの³²Ｐ−ｄＣＴＰを添加する。標識反応を１０単位のＴｅｒｍｉｎ
ａｌＴｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を
添加することにより開始させる。３７℃、３０分でインキュベーションした後、
その酵素を７０℃での５分のインキュベーションにより熱不活性化する。放射標
識されたオリゴヌクレオチドをＮＡＰ５カラムで精製する（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
−ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５培地を含有）。

【００８２】このフィルターを、５０ｍｌのプレハイブリダイゼーション緩衝液（２０×Ｓ
ＳＣ１２．５ｍｌ（０．３Ｍクエン酸Ｎａ₃、３ＭＮａＣｌ）、１００×Ｄ
ｅｎｈａｒｄ２．５ｍｌ、１０％ＳＤＳ２．５ｍｌおよび水３２．５ｍｌ）中で
５６℃で４時間プレハイブリダイズさせる。使用直前に、１０ｍｇ／ｍｌ変性サ
ケ***ＤＮＡ３００μｌをプレハイブリダイゼーション緩衝液に添加する。プレ
ハイブリダイゼーション後、放射標識されたオリゴヌクレオチドを添加し、そし
て５６℃で一晩フィルターをハイブリダイズさせる。次の日、そのフィルターを
５６℃３０分間で４×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳにより２回洗浄する。

【００８３】このフィルターを１６時間、オートラジオグラフィーにかけ、陽性クローンを
単離する。ＮＺＹプレートの両方のプラークリフト上にハイブリダイゼーション
シグナルが存在する場合にのみ、陽性としてクローンを計数する。

【００８４】６つの推定クローンを単離し、小さなぺトリ皿上にプレーティングすることに
より精製する。この後、本質的に上記のように、そのクローンを二次スクリーニ
ングに供する。結局、４つのクローンを、ＲａｐｉｄＥｘｃｉｓｉｏｎＫｉ
ｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、プラスミドに転換するために選択する
。

【００８５】リバース（Ｒｅｖｅｒｓｅ）配列プライマーおよびユニバーサル（Ｕｎｉｖｅ
ｒｓａｌ）配列プライマーを用いて、得られたプラスミドの配列決定をする。シ
クロフィリン様ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼＢをコードするｃ
ｙｐＢ遺伝子を含むプラスミドをｐＰＤ２３と称する。

【００８６】（実施例３）（ｃｙｐＢ遺伝子を含むｐＰＤ２３プラスミドの特徴づけ）クローンの制限酵素地図を作製する。フラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔＳＫ＋のＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩサイトにクローン化する。ｐＰＤ２３の
構造を示す制限酵素地図を図１に示す。遺伝子をサイクルシーケンシング法（ｃ
ｙｃｌｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｍｅｔｈｏｄ）を用いて配列決定する。完全
な配列を配列番号２に示す。配列をすべての構築物に対して両鎖において決定す
る。

【００８７】推定されるアミノ酸配列を、三つのサイクロフィリン様のペプチジルプロリル
ｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼＢとともにＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用い
て整列する。整列を図２に示す。上記の整列は、ＣＹＰＢが、他の既知のＣＹＰ
Ｂ配列に相同性であることを示す。

【００８８】ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースにおける検索を実施し、そしてこの検索は
、整列（図２）に示される配列よりも高い相同性を有するいずれの配列をも示さ
なかった。最も高い相同性を有する配列は、Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ種由来のサ
イクロフィリン様のペプチジルプロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼに対す
る前駆体であり、その相同性は、６３％であることが見出されている（図３）。

【００８９】残基１〜２３は、シグナル配列として認識され、２０．７ｋＤａの推定分子量
および６．２７の推定等電点（ｐＩ）を有する１８６アミノ酸の成熟タンパク質
が続く。ＣＹＰＢタンパク質は、そのＣ末端（２０９〜２１２位）において推定
される小胞体貯留シグナルを含む。一つの推定Ｎ−グルコシル化部位は、ＣＹＰ
Ｂにおいて１３９〜１４２位に見出される。サイクロフィリン型ペプチジルプロ
リルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼにおいて保存されたモチーフは、７９〜９
６位に存在する。

【００９０】（実施例４）（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｃｙｐＢの発現）成熟したＣＹＰＢタンパク質をコードする遺伝子の一部を含むフラグメントを
、以下に示すプライマーを用いたＰＣＲによって生成する：上流プライマー：５’ ｃｃｃａｔａｔｇｇａａｇａｔｇｃｔｃａｇｃｃｃｃｇ
ｇｇｇｃｃｃｃａａｇａ３’（配列番号３）下流プライマー：５’ ｃｇａａｇｃｔｔａｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇ
ｔｇｇｃｔｇｃｔａｃｃｔｔｔｔｔｃｔ３’（配列番号４）ｐｆｕポリメラーゼを用いて５２℃でＰＣＲを実施する。この構築物から小胞
体標的配列を取り除く。さらに、ＨＩＳタグを用いてタンパク質のＣ末端部位を
伸長する。このフラグメントを、Ｅ．ｃｏｌｉ中への遺伝子の発現を可能にする
ｐＥＴ−２４ａ（＋）プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）中に引き続いてクローン
化する。この構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳへ形質転
換する。ｃｙｐＢの発現は、光学濃度６００（ＯＤ₆₀₀）＝１の培養液に加えら
れる１ｍＭＩＰＴＧによって誘導する。

【００９１】Ｅ．ｃｏｌｉに発現したタンパク質を、固定した金属アフィニティクロマトグ
ラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡレジン、Ｑｉａｇｅｎ）およびゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄ
ｅｘ７５，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって精製する。精製したＣＹＰＢタンパ
ク質の見かけの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でおよそ２１ｋＤａと決定さ
れた。正確な分子質量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によって決定され、２１１０
０．６Ｄａの分子量を示す。Ｎ末端配列決定は、成熟した配列の最初から１０ア
ミノ酸を示す（ＥＤＡＱＰＲＧＰＫ（配列番号２に示す残基２４〜３２））。

【００９２】 α−ケモトリプシン（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）による基質
ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ（Ｓｉｇｍａ）の立体特異的
な分解に基づくアッセイを、ＣＹＰＢの活性を決定するためにセットアップする
。この基質のｔｒａｎｓ異性体は、α−ケモトリプシンによって急速に分解され
る。水中では、基質の８８％がｔｒａｎｓ異性体そして１２％がｃｉｓ異性体と
して存在する。ｃｉｓ異性体からｔｒａｎｓ異性体への転換は、速度が制限され
ており、ペプチジルプロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼによって触媒され
る。

【００９３】ＣＹＰＢを、５０μＭの基質および２５μＭのα−ケモトリプシンを含む５０
ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．８中で２５℃においてアッセイする。０．５
ｎＭＣＹＰＢタンパク質を、その混合物に加え、そして３８０ｎｍにおける吸
光度を、０．５秒ごとに測定する。ＣＹＰＢタンパク質の添加は、基質のより速
い分解を明白に導き、その折り畳み酵素（ｆｏｌｄａｓｅ）の活性を、提供する
。

【００９４】（実施例５）（ＣＹＰＢおよびトリアシルグリセロールリパーゼの同時発現）（リパーゼ発現プラスミドおよびＣｙｐＢプラスミド）ｐＬＩＰ４プラスミド（図４）は、ｌｉｐＡ遺伝子の全体のゲノム配列を含む
。この配列を、配列番号４に示す。図５および６に個々に示されるように、ＣＹ
ＰＢは、ｐｐｄ２３ｄ１４またはｐｐｄ２３ｄ１３のいずれかから発現する。ｐ
ｐｄ２３ｄ１４は、ｇｌａＡプロモーターの制御下にＣｙｐＢ配列を含み（一般
的に利用可能な；例えば、Ｗａｒｄら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ１３：４９８−５０３を参照）、これは誘導性である。ｐｐｄ２３ｄ１３は
、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓｇｌａＡプロモーターの制御下にＣｙｐＢ配列を含み
（Ｐｕｎｔら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. １７：１９−３４）
、これは構成的に活性的である。いずれの場合においても、ＣｙｐＢ遺伝子には
、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓｔｒｐＣターミネーターが続く。

【００９５】抗菌性の耐性を、ｇｐｄＡプロモーターの制御下におけるハイグロマイシン耐
性遺伝子（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓおよびＥ．
ｃｏｌｉから単離された）の挿入によってプラスミドに組み込む。

【００９６】（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ株３ＭｐｙｒＡのリパー
ゼ遺伝子を用いる形質転換）Ａ．ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ株３ＭｐｙｒＡ由来の胞子を、２％のグルコース
および１０ｍＭのウリジンを補充した最小限の培地を含む振盪フラスコ中におい
て、３４℃で一昼夜培養する。菌糸を、回収し、そして溶解酵素をプラスした溶
解緩衝液中に再懸濁する。産生されたプロトプラストを、所望されるリコンビナ
ントを選択するためのｐｙｒＧおよび抗生剤耐性マーカーを用いた同時形質転換
によってｐｐｄ２３ｄ１４またはｐｐｄ２３ｄ１３とともにｐＬＩＰ４と混合す
る。

【００９７】（形質転換したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ株におけるリパーゼ産生のインサイチ
ュ検出）超薄層等電点焦点化（ｕｌｔｒａｔｈｉｎｌａｙｅｒｉｓｏｅｌｅｃｔｒ
ｉｃｆｏｃｕｓｉｎｇ）後の真菌リパーゼを可視化するために用いたスクリー
ニングの手順は、寒天板上で増殖したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ形質転換体をスク
リーニングするために適応する。この手順は、形質転換したＡｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ株を発現する工程および発現しない工程の初期解析において非常に便利であ
る。寒天プレート上のリパーゼ産生株のスクリーニングは、リパーゼプロモータ
ーのインデューサーとして同様、酵素（リパーゼ）の基質として２％オリーブオ
イルを用いて実施する。さらに、プレートは、蛍光色素ローダミンＢ（Ｎ−９−
（２−カルボキシフェニル）−６−（ジエチルアミノ）−３Ｈ−キサンチン−３
−イリデン−Ｎ−エチレエタナミニウム塩化物）を含む。オリーブオイル存在下
においては、形質転換体は、リパーゼの分泌を誘導する。寒天プレート中に分泌
されたリパーゼは、紫外照射（３５０ｎｍ）によって可視化されるオレンジ色の
蛍光コロニーの形成を生じさせるオリーブオイルを加水分解する。蛍光コロニー
の検出は、形質転換体に依存して、増殖約２４時間後に観察される。増殖数日後
、リパーゼを産生する菌株は、目で可視のオレンジ色の蛍光菌株として同定され
得る。このプレートスクリーニングの条件下において、形質転換しなかった菌株
は、バックグラウンド蛍光を示さず、不透明なピンク色のコロニーとして出現す
る。しかし、オイル含有プレート上で急速に増殖し得る陽性の混入する酵母およ
び細菌株を意識するべきである。汚染は、抗生物質（アンピシリン）を組み込む
工程によって防止する。

【００９８】（リパーゼを分泌する形質転換体の特徴づけ）オレンジ色の蛍光の光輪を呈する１６の形質転換体を、１００ｍｌの最小限の
培地プラス１％のオリーブオイル、０．５％の酵母抽出エキス、０．２％のカサ
ミノ（ｃａｓａｎｉｍｏ）酸を含む振盪フラスコ中で培養し、そして８日間増殖
する。分泌されたリパーゼの量は、無細胞の培養上清の１０μｌを、オリーブオ
イル−ローダミンＢ寒天プレートにあけられた穴へ適用する工程、およびプレー
トを、３７℃において一昼夜インキュベートする工程によって定量化する。この
技術を用いて、もっとも強い蛍光を呈する５つの形質転換体から得た無細胞培養
上清を、クロマトグラフィーによってさらに分析する。

【００９９】（疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によるリコンビナントリパー
ゼの精製）プレートスクリーニング法によって陽性と判定された５つの異なるリパーゼ分
泌形質転換体から得た培養上清を、ＮＡＰ５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ：Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘＧ−２５メディウムを含む）を用いて脱塩し、そして１Ｍの（Ｎ
Ｈ₄）₂ＳＯ₄、５０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．５中に平衡化する。脱塩し
た培養上清を、ＢｉｏｇｅｌＰｈｅｎｙｌ−５ＰＷカラム（Ｂｉｏｒａｄ社
）上で、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって分画する。溶出は、１Ｍか
らゼロモル濃度の（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄の減少する塩濃度勾配、２０ｍＭ酢酸ナトリ
ウムｐＨ５．５によって実施する。単一の分散したタンパク質のピークを、分
画後観察する。タンパク質のピークの範囲を、異なる形質転換体を通じて計算し
、形質転換しない菌株と比較する。以下の表は、５つの形質転換体によって分泌
されたリパーゼのレベルを要約する。最も優れた形質転換体は、ＨＩＣ分画後精
製されたリパーゼの量において６２倍の増加を示す。表は、最適化していない小
スケールの振盪フラスコの条件下において増殖した６日後の、異なる形質転換体
によって産生するリパーゼの変動する量もまた示す。

【０１００】

【表１】（ｂ．リコンビナントリパーゼの特徴づけ）（１．アミノ酸分析およびタンパク質決定）ＨＩＣによる分画後の減少するタンパク質のピークを、凍結乾燥し、そして水
中に再撹拌する。精製リパーゼタンパク質のアミノ酸組成およびタンパク質濃度
を、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度とタンパク質濃度との間の相関係数を得るこ
とによって決定する。これは、同種の標本におけるリパーゼ濃度の推定を可能に
する。

【０１０１】リパーゼタンパク質は、カルボキシルメチル化しており、そして最初の１５ア
ミノ酸の配列は、Ｎ末端アミノ酸配列決定によって決定される。組換えリパーゼ
の１５アミノ酸配列は、正確なシグナル配列切断を示す天然のリパーゼと正確に
同じである。

【０１０２】（２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動）ＨＩＣ後に回収した異なるタンパク質分画を、１２％トリス−グリシンＳＤＳ
ゲル上において分離する。銀染色は、一つのタンパク質バンドを示し、タンパク
質ピークの同一性を確認する。さらに、粗製抽出物は、真菌がオイルを含む培地
中で培養される時、非常に高い含量で培養上清中に蓄積する唯一のタンパク質バ
ンドである主要なリパーゼバンドを示す。

【０１０３】（３．組換えリパーゼ中における共有結合性に連結するＮ−連結型オリゴ糖の
存在の検出）Ｎ−連結型オリゴ糖の検出を、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来の内在性Ｎ−ア
セチルグルコサミダーゼＨ（シグマ）を用いたリパーゼの消化によって達成する
。増殖培地中に分泌された組換えリパーゼの内在性Ｈ処理は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上において観察されるバンドの移動度を変更し、そして約３０ｋＤａの分子質量
を有する単一種であるかのように電気泳動する。このことは、Ｎ−連結型糖鎖の
程度を示す。

【０１０４】（４．レーザー脱離質量分光測定組換えリパーゼを助力する基質）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光測定を、７０％のアセトニトリル、０．１％のト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中にシナピン酸（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキ
シケイヒ酸）を含むマトリックス溶液とともに混合した、精製リパーゼを用いて
実施する。脱塩した組換えリパーゼから決定した分子質量は、３２，２３７ダル
トンである。内在性グリコシダーゼＨを用いた切断によって生成され、そしてＭ
ａｌｄｉ−ＭＳによって直接分析された脱糖鎖結合リパーゼは、２９．３２５Ｄ
ａのポリペプチド骨格の推定分子量を示した。

【０１０５】この分析を用いて、糖タンパク質におけるＮ−連結型オリゴ糖の存在およびお
およその数が、決定され得る。結論として、Ｎ−連結型オリゴ糖は、組換えリパ
ーゼの分子量の約１０％とみなす。

【０１０６】（リパーゼの質量分光測定）

【０１０７】

【表２】（実施例６）（ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒにおけるｃｙｐＢの過剰発現）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ株Ｎ５９２（ｃｓｐＡ１、ｐｙｒＡ５）を、強力で構
成的なｇｐｄＡプロモーターの制御下においてｃｙｐＢの発現を可能にするプラ
スミドとともに形質転換した。推定される形質転換体は、このプラスミドの存在
を確認するためにＰＣＲによってスクリーニングする。この株（Ｎ５９２：：ｐ
ＰＤ２３ｄ１３）における統合されたコピーの数およびｃｙｐＢの発現レベルを
、サザン分析およびノーザン分析によって個々に決定する。

【０１０８】サザン分析は、Ｎ５９２：：ｐＰＤ２３ｄ１３株が、統合されたプラスミドｐ
ＰＤ２３ｄ１３の複数のコピーを含むことを明確に示す。この株におけるｃｙｐ
Ｂの発現レベルは、野生型の発現レベルよりも約１５倍高い。

【０１０９】この株が、より多くのタンパク質の分泌を可能にするか否かを決定する目的で
、野生型株（Ｎ４０２）およびＮ５９２：：ｐＰＤ２３ｄ１３が、２％（重量／
容積）のデンプン存在下において増殖される増殖実験を設定する。デンプンが、
グルコアミラーゼの発現のための特異的なインデューサーであることは公知であ
る。このため上清標本を、グルコアミラーゼ活性および分泌タンパク質の量に対
してアッセイした。

【０１１０】グルコアミラーゼは、よく分泌されたタンパク質としてみなされ、そして困難
な標的タンパク質の分泌を助ける目的の融合タンパク質として一般的に用いられ
る。

【０１１１】ｃｙｐＢの過剰発現は、グルコアミラーゼの産生レベルの増加を明白に導く。
グルコアミラーゼ活性のおおよそ２倍の増加が、誘導の７２時間後に測定される
。新規のグルコアミラーゼの産生は、この時点ではみられず、これは誘導する炭
素源の枯渇の理由がもっとも可能性が高い。

【０１１２】（実施例７）（ＣＹＰＢの局在化）真核生物性の細胞からのタンパク質の分泌は、複合した過程である。新たに合
成された分泌性および膜性タンパク質は、折り畳まれていない状態で小胞体（Ｅ
Ｒ）に入り、そして分泌経路へさらに輸送され得る前に、特異的な高次構造を手
に入れなければならない。多くのタンパク質が、ＥＲの内腔中に見出される。こ
れらは、ＢｉＰ（結合タンパク質、７０ｋＤａの熱ショックタンパク質の相同体
）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）およびペプチジルプロリル
ｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼ（ＰＰＩ）を含む。これらの折り畳み酵素（ｆ
ｏｌｄａｓｅ）は、折り畳まれていない状態から天然の状態へのタンパク質の折
り畳みを触媒する工程に関与する。ＥＲ中に残存し、それにより分泌タンパク質
の大部分の流れから迂回される目的で、折り畳み酵素は、特異的な貯留シグナル
および回収できるシグナルを有する。共通のＣ末端テトラペプチド（ｔｅｔｒａ
ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＨＤＥＬは、ＥＲの内腔にタンパク質を保持し得るシグナル
として同定された。このテトラペプチドの除去は、タンパク質の分泌を導く（Ｐ
ｅｌｈａｍ（１９９０）ＴｒｅｎｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１５，４８３
−４８６）。

【０１１３】ＣＹＰＢタンパク質は、シグナル配列および推定されるＥＲ貯留シグナルを含
み、これはタンパク質がＥＲに標的されて、そしてＥＲに残存されることを示す
。しかしこのタンパク質における貯留シグナルは、既知の貯留シグナルからわず
かに分岐する。ＣＹＰＢタンパク質の３位（最後のアミノ酸残基から数えて）は
、グルタミン酸残基を含む。このＨＥＥＬ配列は、ＥＲ貯留シグナルとして同定
されたものではない。この配列が、ＥＲの内腔にＣＹＰＢを残存し得るかどうか
を調べる目的に、ＣＹＰＢのシグナル配列およびＣＹＰＢのＥＲ貯留シグナルの
両方を含むＧＦＰ構築物が、作製された。この遺伝子の発現は、強力で構成的な
ｇｐｄＡプロモーター（プラスミドｐＰＤ３８ｄ３；図７）によって駆動される
。

【０１１４】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ株Ｄ１５（ｐｒｔＴ；ｐｙｒＧ；ｐｈｍ
Ａ）の形質転換体を、ＧＦＰ発現プラスミドの挿入についてＰＣＲによってスク
リーニングする。発現構築物を含む株を、ＧＦＰの発現について分析する。

【０１１５】Ｄ１５：：ｐＰＤ３８ｄ３＃５株を、液体培地中で一昼夜増殖し、そしてＧＦ
Ｐが、細胞内において管状のネットワークとして検出されることを示す。Ａ．ｎ
ｉｄｕｌａｎｓにおいて相当する構築物は、ＥＲへＧＦＰを標的することが、実
証されており、本発明者らの発見（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｂａｌｏｓら（１９
９８）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７，１２１−１３０）と類似するネッ
トワークを光らせる。ＥＲ−ＴｒａｃｋｅｒＤＰＸ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰ
ｒｏｂｅｓ社）を用いた菌糸の染色は、同じタイプの管状のネットワークを光ら
せる。

【０１１６】最後にＤＩＯＣ₆（ミトコンドリアについて低濃度の株であり、高濃度におい
て適用されたときＥＲ染色に対してもまた効果的である株）は、ＤＰＸおよびＧ
ＦＰに対して見られるのと同じ管状ネットワークを示す。しかしＤＩＯＣ₆は、
ＥＲの外の染色の拡散によって妨害され、結果としてミトコンドリアの染色を生
じる。

【０１１７】本発明者らの結果は、ＨＥＥＬが、ＥＲ内のＧＦＰ貯留に対して必要および十
分の両方であることを明確に示す。したがって、ＣＹＰＢタンパク質は、ＥＲを
標的とし、そしてＥＲ内に貯留されることが明白である。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ａ．ｎｉｇｅｒｃｙｐＢをコードするプラスミドｐＰＤ２３の制限マップである。

【図２】図２は、ｃｙｐＢ遺伝子と、Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ
およびＨ．ｓａｐｉｅｎｓに由来するペプチジルプロリルシス−トランスイソメ
ラーゼとのアライメントを示す。

【図３】図３は、ｃｙｐＢ遺伝子とＯｒｐｉｎｉｍｙｃｅｓＰＰＩ遺伝子との間で最
適化されたアライメントを示す。

【図４】図４は、ｌｉｐＡ遺伝子をコードするｐＬＩＰ４の図である。

【図５】図５は、ｐｐｄ２３ｄ１３の図である。

【図６】図６は、ｐｐｄ２３ｄ１４の図である。

【図７】図７は、ｐｐｄ３８ｄ３の図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:685）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA03 BA07 CA04 DA11 EA04 GA11 HA01 4B050 CC05 CC08 DD03 LL05 4B064 AG01 CA05 CA19 CC24 DA01 4B065 AA62X AA62Y AB01 AC14 BA02 BA10 BA25 CA27 CA41 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】宿主細胞中に分泌可能なポリペプチドを産生するための方法
であって、該宿主細胞中にペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼを過
剰発現させ、それにより該分泌されたポリペプチドの収率を増大させる工程を包
含する、方法。
【請求項２】請求項１に記載の方法であって、前記ポリペプチドをコード
する第１のコード配列およびペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼを
コードする第２のコード配列を前記細胞に共トランスフェクトする工程を包含す
る、方法。
【請求項３】前記ポリペプチドおよび前記ペプチジルプロリルシス−トラ
ンスイソメラーゼが別々のベクターにコードされる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記ペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼをコー
ドするコード配列が、前記宿主細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項１〜３の
いずれか１項に記載の方法。
【請求項５】前記細胞が真菌細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に
記載の方法。
【請求項６】シクロフィリンペプチジルプロリルシス−トランスイソメラ
ーゼが真菌起源である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】前記ポリペプチドがＥＲ保持シグナルを含む、請求項１〜６
のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】前記ＥＲ保持シグナルが、ＨＤＥＬ、ＨＥＥＬ
またはＫＤＥＬである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】フォルダーゼ活性を保有するポリペプチドであって、該フォ
ルダーゼ活性は、ポリペプチド中のプロリン残基のＮ末端側鎖上のペプチド結合
のシス−トランス異性化を触媒する能力を有することによって特徴付けられ、該
ポリペプチドが該Ｎ末端にシグナル配列およびＣ末端に小胞体保持シグナルを、
ならびに２０．７ｋＤａの分子量および６．２７の推定等電点を有する、ポリペ
プチド。
【請求項１０】真菌起源である、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来である、請求項１０に記載
のポリペプチド。
【請求項１２】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ由来である、請求項
１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】フォルダーゼ活性を保有するポリペプチドであって、該フ
ォルダーゼ活性は、ポリペプチド中のプロリン残基のＮ末端側鎖上のペプチド結
合のシス−トランス異性化を触媒する能力を有することによって特徴付けられ、
低ストリンジェンシー条件下でＳＥＱＩＤＮＯ：２に由来する２０塩基のオ
リゴヌクレオチドとハイブリダイズし得る核酸によってコードされる、ポリペプ
チド。
【請求項１４】フォルダーゼ活性を保有するポリペプチドであって、該フ
ォルダーゼ活性は、ポリペプチド中のプロリン残基のＮ末端側鎖上のペプチド結
合のシス−トランス異性化を触媒する能力を有することによって特徴付けられ、
低ストリンジェンシー条件下でＳＥＱＩＤＮＯ：１に由来する１７塩基のオ
リゴヌクレオチドとハイブリダイズし得る核酸によってコードされる、ポリペプ
チド。
【請求項１５】フォルダーゼ活性を保有するポリペプチドであって、該フ
ォルダーゼ活性は、ポリペプチド中のプロリン残基のＮ末端側鎖上のペプチド結
合のシス−トランス異性化を触媒する能力を有することによって特徴付けられ、
ＳＥＱＩＤＮＯ：２に少なくとも４０％相同性である、ポリペプチド。
【請求項１６】シクロフィリンペプチジルプロリルシス−トランスイソメ
ラーゼが、請求項９〜１５のいずれか１項に記載されるポリペプチドである、請
求項１〜８のいずれか１項に記載される方法。
【請求項１７】請求項９〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコ
ードする核酸ベクター。
【請求項１８】請求項１７に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１９】真菌宿主細胞である、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主細胞である、請求項１９に記
載の宿主細胞。
【請求項２１】フォルダーゼ活性を保有するポリペプチドを産生するため
のプロセスであって、該フォルダーゼ活性は、ポリペプチド中のプロリン残基の
Ｎ末端側鎖上のペプチド結合のシス−トランス異性化を触媒し得る能力を有する
ことによって特徴付けられ、該プロセスが、請求項１７に記載のベクターで宿主
細胞を形質転換する工程を包含する、プロセス。