KR20010041111A

KR20010041111A - 척추동물의 미오스태틴의 면역학적 조절방법

Info

Publication number: KR20010041111A
Application number: KR1020007009152A
Authority: KR
Inventors: 바커크리스토퍼에이.; 모르세이모하매드
Original assignee: 로날드 엘. 스토티쉬; 메타몰픽스 인코포레이티드
Priority date: 1998-02-19
Filing date: 1999-02-19
Publication date: 2001-05-15
Also published as: DE69934970T2; EP1056845B1; DE69940230D1; AR019818A1; PT1056845E; CA2687533C; CA2323607C; BR9907995A; EP1056845A1; AU2507399A; EP1770162B1; DK1770162T3; ES2527410T3; CA2323607A1; ES2280115T3; JP2002504326A; EP1770162A1; ZA991369B; ATE419353T1; US20030065137A1

Abstract

척추동물의 미오스태틴활성을 감소시키기 위한 면역조성물과 방법이 기술되어 있다. 이 조성물은 이 조성물이 투여되는 척추동물의 면역응답을 유발할 수 있는 미노스태틴 펩티드 면역원, 미오스태틴 다량체와/또는 미오스태틴 면역접합체를 포함한다. 방법은 광범위한 장애의 치료에 유용하다.

Description

척추동물의 미오스태틴의 면역학적 조절방법 {IMMUNOLOGICAL METHODS TO MODULATE MYOSTATIN IN VERTEBRATE SUBJECTS}

전통적으로 축산업자는 사료의 효율성, 번식기능 및 일반위생에 의하여 판단되는 허용가능한 성과를 갖는 최대단백질량을 제공하는 동물을 선택하는 사육프로그램을 이용하였다. 근육세포의 이상비대 및 이상증식에 의한 증가된 근육질을 보이는 소가 다수의 품종에서 관찰되었다. 더블 머슬링(double-muscling)이라고 불리는 이러한 조건의 반영은 벨기에 블루(Belgian Blue) 품종의 소에서 가장 두드러지게 나타난다. 이들 동물에 있어서 근육질은 약 20%가 증가한 반면에 뼈와 지방질은 감소하였다(Shahin and Berg, Can. J. Anim. Sci.(1985) 65:279-293). 또한 벨기에 블루 품종의 소는 사료의 효율성이 좋고 높은 비율의 바람직한 육질을 제공한다(Casas 외, J. Anim. Sci.(1997) 75(Supp 1):149). 벨기에 블루 품종의 소에 있어서 더블 머슬링은 이형접합체가 정상이거나 적당한 근육질의 증가만을 보이므로 유전되고 열성인 것으로 믿어진다.

이러한 조건의 이점에도 불구하고 종종 더블 머슬링된 소는 바람직하지 않은 특징을 갖는다. 예를 들어 이러한 송아지는 정상보다 10-38%가 무거우므로 다이스토시아(dystocias)의 영향으로 제왕절개분만이 요구된다. 또한 동물은 생식계통의 발달부족으로 비정상적인 번식을 보이며 대설증(大舌症)과 같은 다른 해부학적 이상을 갖는다. 북부 이탈리아의 피에몬테세(Piemontese)와 같은 다른 품종의 소는 더블 머슬링에 큰 차이를 보이고 바람직하지 않은 많은 특징을 보인다.

일부 소의 품종에서 확인된 더블 머슬링 특성은 미오스태틴 유전자의 변이를 추적하여왔다(Grobet 외, Nature Genetics (1997) 17:71-74: Kambadur 외, Genome Research (1997) 7:910-915: McPherron and Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:12457-12461). 이러한 변이는 주로 각 근육섬유의 크기의 증가(이상비대) 보다는 주로 근육세포의 수의 증가(이상증식)의 결과로 나타난다. 또한 근육이상비대로 불리는 조건은 돼지의 피트레인(Pietrain) 품종에서 확인되었다. 이러한 조건은 미오스태틴 유전자와는 관련이 없고 칼슘수송을 맡고 있는 유전자의 변이로 확인되었다.

McPherron 등(Nature (1997) 387:83-90)은 증식/분화인자-8(GDF-8)로 불리는 쥐 단백질의 형질전환증식인자-β(TGF-β) 초군의 인자를 확인하였다. GDF-8은 골격근증식을 위한 부조절체로서 작용하고 전개 및 성인골격근으로 표현된다. 쥐의 유전자 녹아웃실험에서 호모접합변이체가 야생쥐 보다 30% 큰 결과를 보였다. 이러한 크기의 증가는 주로 근육질의 증가에 의한 것이며 변이체로부터의 각 근육은 야생쥐의 경우보다 중량이 2-3배가 된다(McPherron 등, Nature (1997) 387:83-90). McPherron and Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:12457-12461와 Grobet 외, Nature Genetics (1997) 17:71-74는 소를 포함하는 다수의 종에서 유사한 게놈서열을 구하였으며 더블 머슬링된 소가 GDF-8와 거의 일치하는 단백질의 유전자 코드에 결함을 가짐을 보고하였다. 현재 이러한 단백질을 미오스태틴이라고 부른다.

이와 같이, 미오스태틴은 근육세포에서 생성되고 근아세포의 증식과 분화를 조절한다. 벨기에 블루와 피에몬테세 품종의 소에 있어서, 유전자의 고유결함은 근육증식에 영향을 주는 비정상 단백질의 생성과 미오스태틴의 감소를 가져오는 것으로 믿어진다.

쥐, 래트(rat), 사람, 비비, 소, 돼지, 양, 닭, 칠면조, 제브라피시를 포함하는 다수의 척추동물종으로부터의 미오스태틴 유전자가 확인되었으며 단백질서열이 결정되었다(McPherron and Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:12457-12461). 미오스태틴 단백질서열은 이들 모든 종에 대하여 보존되었다. 유사한 방법으로 쥐, 래트, 사람, 비비, 소, 돼지, 양, 닭 및 칠면조의 미오스태틴에 대한 뉴클레오티드서열이 결정되었다. 이에 대하여, 예를 들어, 쥐과동물 및 사람의 미오스태틴의 뉴클레오티드서열에 관한 미국특허 제5,827,733호, 소 속(屬)의 미오스태틴의 뉴클레오티드서열에 관한 국제특허공보 WO 99/02667, 래트, 사람, 비비, 소, 돼지, 양, 닭 및 칠면조 미오스태틴의 뉴클레오티드서열에 관한 국제특허공보 WO 99/33887를 참조바란다.

미오스태틴 유전자의 뉴클레오티드서열은 약 43 kDa의 분자량을 갖는 약 376개 아미노산의 단백질을 예상한다. 이 단백질은 분비리더서열과 9개의 시스테인잔기를 포함하는 13 kDa의 펩티드를 방출하는 단백질분해처리사이트를 포함한다. 차이니스 햄스터 난소세포에 나타나는 클론화 미오스태틴은 두 종류의 단백질을 생산한다. 그 하나는 약 52 kDa의 겉보기 분자량을 가지며 다른 하나는 약 15 kDa이다. 비환원 조건하에서, 이들 단백질은 약 101 kDa와 25 kDa의 분자량을 갖는 이량체인 것으로 보인다(McPherron 등, Nature (1997) 387:83-90).

연구자들은 증가된 근육조직을 갖는 형질전환종의 생산을 위하여 동물에게 변이된 미오스태틴 유전자를 공급하는 것을 제안하였다. 이에 대하여서는 예를 들어 국제특허공보 WO 99/33887를 참조바란다. 그러나, 이러한 방법에는 여러 결점이 있다. 예를 들어, 미오스태틴 유전자는 배아단계중에 활성화되므로 감소된 미오스태틴생산이 자궁에서 과잉근육발달의 원인이 된다. 이와 같이, 변이유전자를 포함하는 형질전환동물은 제왕절개분만을 요구하게 되어 대규모 축산업자에게는 큰 부담이 된다. 아울러, 인간이 소비하는 유전공학동물에 대한 공공의 반대가 있어 이러한 동물을 생산하는 다른 방법이 바람직하다.

본 발명은 척추동물에 있어서 근육조직을 증가시키고 질병을 치료하기 위한 조성물과 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 척추동물의 미오스태틴의 감소를 위한 면역조성물과 방법에 관한 것이다.

도 1a-도 1d는 다음과 같은 여러 종으로부터 유도된 미오스태틴의 비교표: 쥐(SEQ ID NO;27), 래트(SEQ ID NO;28), 사람(SEQ ID NO;29), 비비(SEQ ID NO;30), 소(SEQ ID NO;31), 돼지(SEQ ID NO;32), 양(SEQ ID NO;33), 닭(SEQ ID NO;34), 칠면조(SEQ ID NO;35), 제브라피시쥐(SEQ ID NO;36). 아미노산은 서열의 좌우에 번호를 붙였다.

도 2는 뉴클레오티드서열(SEQ ID NO:3)과 이에 일치하는 MYOS 1 펩티드의 아미노산서열(SEQ ID NO:4)을 보인 것이다. MYOS 1은 단백질분해분할사이트, Arg-Ser-Arg-Arg 및 활성단백질의 N-말단을 포함한다.

도 3은 뉴클레오티드서열(SEQ ID NO:5)과 이에 일치하는 MYOS 3 펩티드의 아미노산서열(SEQ ID NO:6)을 보인 것이다.

도 4는 뉴클레오티드서열(SEQ ID NO:7)과 이에 일치하는 MYOS 5 펩티드의 아미노산서열(SEQ ID NO:8)을 보인 것이다.

도 5는 뉴클레오티드서열(SEQ ID NO:9)과 이에 일치하는 MYOS 7 펩티드의 아미노산서열(SEQ ID NO:10)을 보인 것이다.

도 6은 뉴클레오티드서열(SEQ ID NO:11)과 이에 일치하는 MYOS 9 펩티드의 아미노산서열(SEQ ID NO:12)을 보인 것이다.

도 7은 뉴클레오티드서열(SEQ ID NO:13)과 이에 일치하는 MYOS 11 펩티드의 아미노산서열(SEQ ID NO:14)을 보인 것이다.

도 8은 뉴클레오티드서열(SEQ ID NO:15)과 이에 일치하는 MYOS 13 펩티드의 아미노산서열(SEQ ID NO:16)을 보인 것이다.

도 9는 뉴클레오티드서열(SEQ ID NO:17)과 이에 일치하는 MYOS 15 펩티드의 아미노산서열(SEQ ID NO:18)을 보인 것이다.

도 10은 뉴클레오티드서열(SEQ ID NO:19)과 이에 일치하는 MYOS 17 펩티드의 아미노산서열(SEQ ID NO:20)을 보인 것이다.

도 11은 뉴클레오티드서열(SEQ ID NO:21)과 이에 일치하는 MYOS 19 펩티드의 아미노산서열(SEQ ID NO:22)을 보인 것이다. MYOS 19는 단백질분해분할사이트, Arg-Ser-Arg-Arg를 포함한다.

도 12는 미오스태틴서열내의 MYOS 펩티드 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19의 근사위치를 보인 것이다.

도 13은 뉴클레오티드 위치 55-60, 139-144 및 241-246과 C-말단에서 서열에 삽입된 3개 셋트의 두 아미노산결합(Arg-Ser)을 포함하는 재구성 미오스태틴 활성영역을 위한 뉴클레오티드서열(SEQ ID NO:23)과 이에 일치하는 아미노산서열(SEQ ID NO:24)을 보인 것이다.

도 14는 류코톡신 폴리펩티드담체를 부호화하고 예시적으로 설명되는 바와 같이 미오스태틴 발현벡터를 생성하는데 사용된 플라스미드 pCB150의 다이아그램을 보인 것이다.

도 15a-도 15d는 플라스미드 pCB150에 존재하는 류코톡신담체 폴리펩티드의 뉴클레오티드서열(SEQ ID NO:25)과 이에 일치하는 아미노산서열(SEQ ID NO:26)을 보인 것이다. 미오스태틴 올리고반복단위가 뉴클레오티드 위치 3334에 존재하는 BamH1에 삽입된다.

도 16a는 뉴클레오티드서열(SEQ ID NO:1)을 보인 것이고 도 16b는 본 발명으로 사용하기 위한 대표 미오스태틴의 아미노산서열(SEQ ID NO:2)을 보인 것이다. 단백질분해분할사이트는 도 16b의 위치 263-266에서 발견되었다. 폴리펩티드의 미오스태틴 활성영역의 범위는 아미노산 264-375이다.

도 17은 미오스태틴 단백질의 친수성 특징을 보인 것이다. 이 특성은 6개 아미노산의 평균그룹길이를 이용하여 계산된다. 친수성의 3개 최고점은 단백질분해분할사이트의 범위인 아미노산 위치 263-268, 위치 31-37 및 위치 106-111에서 발견되었다.

도 18은 예시적으로 설명되는 바와 같이, 미오스태틴 펩티드 면역원으로 처리된 동물에서의 중량이득량을 보인 것이다.

본 발명은 척추동물의 내인성 미오스태틴활성을 조절하기 위한 면역조성물과 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 사람과 기타 동물을 포함하는 척추동물에서 근육의 퇴화와 감쇠의 원인이 되는 다양한 장애와 같은 다수의 조건을 처리하는데 유용하다. 미오스태틴의 편재특성에 의하여 본 발명의 조성물과 방법은 이후 상세히 설명되는 바와 같이 광범위한 척추동물에 이용될 수 있음을 확인한다.

놀랍게도 본 발명은 면역학적 기술에 의하여 이들 결과를 얻을 수 있었다. 미오스태틴과 같은 내인성 분자에 대한 면역화는 면역계가 이러한 "자기"분자를 인식하지 않으므로 불확실한 것이다. 따라서, 본 발명은 내인성 물질에 대한 면역시 통상적으로 부딪치게 되는 문제를 해결할 수 있도록 한다.

따라서, 한 실시형태에 있어서, 본 발명은 약 3-100개의 아미노산으로 구성되는 미오스태틴 펩티드에 관한 것이다. 이 펩티드는 미오스태틴의 적어도 하나의 에피토프로 구성된다. 우선실시형태에 있어서, 미오스태틴 펩티드는 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하여 아미노산 45-376 또는 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하여 아미노산 235-376 범위의 미오스태틴의 영역으로부터 유도된다.

다른 실시형태에 있어서, 미오스태틴 펩티드는 SEQ ID NO:4를 포함하는 아미노산 3-18, SEQ ID NO:6을 포함하는 아미노산 3-15, SEQ ID NO:8을 포함하는 아미노산 3-17, SEQ ID NO:10을 포함하는 아미노산 3-16, SEQ ID NO:12를 포함하는 아미노산 3-22, SEQ ID NO:14를 포함하는 아미노산 3-25, SEQ ID NO:16을 포함하는 아미노산 3-22, SEQ ID NO:20을 포함하는 아미노산 3-18과, SEQ ID NO:22를 포함하는 아미노산 3-18로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산서열로 구성된 펩티드에 대한 적어도 약 75%의 아미노산 아이덴터티을 갖는다.

또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 약 3-200개의 아미노산으로 구성되는 미오스태틴 펩티드에 관한 것이다. 이 펩티드는 적어도 하나의 미오스태틴 에피토프로 구성되고, 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하는 아미노산 1-350 범위의 미오스태틴의 영역, 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하는 아미노산 1-275 범위의 미오스태틴의 영역, 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하는 아미노산 25-325 범위의 미오스태틴의 영역, 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하는 아미노산 50-325 범위의 미오스태틴의 영역과, 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하는 아미노산 75-350 범위의 미오스태틴의 영역으로 구성된 그룹으로부터 선택된 미오스태틴 영역으로부터 유도된다.

또 다른 실시형태에 있어서, 미오스태틴 펩티드는 아미노산서열 Lys-Arg-Ser-Arg-Arg-Asp (SEQ ID NO:37), 아미노산서열 Lys-Glu-Asn-Val-Glu-Lys-Glu (SEQ ID NO:38) 또는 아미노산서열 Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO:39)로 구성된다.

또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 둘 이상의 선택된 미오스태틴 면역원으로 구성되는 미오스태틴 다량체에 관한 것으로, 각 면역원은 독립적으로 하나 이상의 미오스태틴 에피토프를 한정하는 적어도 3개의 아미노산으로 구성된다. 우선실시형태에 있어서, 각 선택된 미오스태틴 면역원은 하나 이상의 미오스태틴 에피토프로 구성되고 독립적으로 약 3-200개의 아미노산, 또는 약 3-100개의 아미노산, 또는 약 3-30개의 아미노산, 또는 약 3-15개의 아미노산으로 구성된다.

다른 실시형태에 있어서, 다량체에서 각 선택된 미오스태틴 면역원은 독립적으로 상기 언급된 바와 같은 선택된 미오스태틴 펩티드로 구성된다. 특히 우선실시형태에 있어서, 다량체는 일반식 (MP-X-MP)y에 따른 구성단위가 반복되는 분자로 구성된다. 여기에서 MP는 미오스태틴 펩티드이고, X는 펩티드결합, 아미노산 그룹, 류코톡신 폴리펩티드와, [MP]n(여기에서 n은 1 보다 크거나 같다)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되고, y는 1 보다 크거나 같다.

다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 면역담체에 결합된 상기 언급된 바와 같은 하나 이상의 미오스태틴 펩티드 또는 다량체로 구성되는 미오스태틴 면역접합체에 관한 것이다.

또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 미오스태틴 펩티드, 미오스태틴 다량체와/또는 미오스태틴 면역접합체와, 약학적으로 허용가능한 부형제로 구성되는 백신조성물에 관한 것이다.

또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 상기 미오스태틴 펩티드, 미오스태틴 다량체 및 미오스태틴 면역접합체를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드와, 폴리뉴클레오티드와 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포로 구성되는 재조합벡터에 관한 것이며, 미오스태틴 펩티드, 미오스태틴 다량체 및 미오스태틴 면역접합체를 재조합적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 척추동물에 상기 백신조성물 또는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것으로 구성되는 척추동물의 미오스태틴 면역원에 대한 면역응답을 유발하는 방법에 관한 것이다. 특히 우선실시형태에 있어서, 유발된 면역응답은 척추동물내에서 내인성 미오스태틴활성을 감소시키며, 적어도 하나의 다음과 같은 생물학적 효과를 보인다.

(a) 체중의 증가;

(b) 근육질의 증가;

(c) 근육세포수의 증가;

(d) 근육세포크기의 증가;

(e) 체지방량의 감소;

(f) 근육강도의 증가;

(g) 유선조직의 증가;

(h) 비유의 증가;

(i) 식용 또는 사료흡수력의 증가;

(j) 척추동물의 수명의 증가.

다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 척추동물의 근육의 퇴화 및 감쇠와 같은 장애를 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 이러한 척추동물에 백신조성물 또는 폴리큐클레어티드를 투여하는 단계로 구성된다. 또한 본 발명은 상기 백신조성물을 투여하는 단계로 구성되는 척추동물의 GDF11 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 이들 실시형태와 다른 실시형태들이 다음의 설명으로 당해 기술분야의 전문가에게 명백하게 될 것이다.

본 발명은 달리 설명되지 않는 한 당해 기술분야의 전문가에게 명백한 분자생물학, 미생물학, 바이러스학, 재조합DNA기술 및 면역학의 통상적인 기술을 이용한다. 이러한 기술은 다음의 문헌에서 충분히 설명된다.

예를 들어 Sambrook, Fritsh ＆ Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; DNA Cloning, Vols. I and II (D.N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames ＆ S.J. Higgins eds.); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)와; Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publication)를 참조바란다.

A. 정의

본 발명을 설명함에 있어서, 다음의 용어들이 사용되었으며 이들은 다음과 같이 정의된다.

"미오스태틴 면역원"은 이후 정의되는 바와 같이 면역응답을 유발하는 미오스태틴 분자로부터 유도된 폴리펩티드를 의미한다. 이 용어는 관련된 면역담체, 면역조성제, 또는 면역촉진제없이 면역응답을 유발하는 분자를 포함하며, 미오스태틴 폴리펩티드는 관련된 담체분자, 면역조성제 또는 면역촉진제에 의하여, 또는 미변성서열의 변이에 의하여, 또는 미오스태틴 분자의 적어도 하나의 에피토프의 다중반복단위를 포함하는 분자에 대한 결합에 의하여 면역원성을 갖거나 보다 면역원성이 될 수 있다. 이 용어는 각 고분자 또는 미오스태틴으로부터 유도된 항원고분자의 동종 또는 이종집단을 참조하는데 사용된다.

본 발명의 목적을 위하여, 미오스태틴 면역원은 제한없이 쥐, 래트, 사람, 비비, 소 돼지, 양, 닭, 칠면조 및 제브라피시로부터 유도된 미오스태틴 폴리펩티드를 포함하는 여러 가지 알려진 미오스태틴서열로부터 유도될 수 있다(McPherron and Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:12457-12461). 미오스태틴 단백질서열은 이들 모든 종을 통하여 주로 보존된다.

아울러, 용어 "미오스태틴 면역원"은 문제의 미변성 펩티드서열의 해당부분에 대하여 기준서열에 대해 적어도 약 50%의 아미노산 아이덴터티, 좋기로는 약 75-85%의 아이덴터티, 가장 좋기로는 90-95%의 아이덴터티를 갖는 하나 이상의 아미노산치환, 결실 또는 첨가에 의하여 기준서열과는 다른 미오스태틴 폴리펩티드를 포함한다. 아미노산서열은 약 10-20개 이하의 아미노산치환, 또는 약 5-10개 이하의 아미노산치환 또는 1, 2, 3 또는 5개까지의 치환을 가질 것이다. 특별히 우선되는 치환은 일반적으로 그대로 보존될 것이다. 즉, 이들 치환은 아미노산 계통군내에서 이루어진다. 이 점에 관하여, 아미노산은 일반적으로 다음과 같은 4개의 계통군으로 나누어진다. (1) 산성--아스파르타제와 글루탐산; (2) 염기-- 라이신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 무극성-- 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메치오닌, 트립토판; (4)불변극성-- 글리신, 아스파리긴, 글루타민, 시스틴, 세린 트레오닌, 티로신. 때로는 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신이 방향족 아미노산으로 분류되기도 한다. 예를 들어 류신을 이소류신 또는 발린과 독립된 치환 또는 그 반대의 치환, 아스파라타제와 글루탐산, 트레오닌과 세린, 또는 아미노산과 구조적으로 관련된 아미노산의 유사한 보존적 치환이 활성에 큰 영향을 주지 않을 것으로 예상된다.

따라서, 실질적으로 기준분자와 동일한 아미노산서열을 가지나 단백질의 면역원성에 영향을 주지 않는 소수의 아미노산치환을 가지는 단백질이 미오스태틴 면역원의 정의내에 포함된다.

또한 본문에 사용된 "미오스태틴 면역원"은 미변성 미오스태틴서열로부터 유도된 분자와, 전장의 미오스태틴기준서열 및 이후 설명되는 면역원성을 유지하는 미오스태틴 펩티드를 포함하는 재조합적으로 생산되거나 화학적으로 합성된 미오스태틴 폴리펩티드를 포함한다. 이와 같이 "미오스태틴 면역원"은 분자가 면역원이 공급되는 척추동물종의 자연발생 미오스태틴과 교차반응하는 항체의 형성을 유발하는 능력을 갖는 한 미변성서열을 갖는 분자, 단일 또는 다중 아미노산 첨가, 치환 또는 결실을 갖는 분자와, 기준 미오스태틴 분자의 폴리펩티드 프라그먼트를 포함한다. 미오스태틴의 에프토프도 이러한 정의내에 포함된다.

"미오스태틴 펩티드"는 본문에 설명되는 바와 같이 문제의 기준 미오스태틴 분자의 길이보다 짧고 이후 설명되는 바와 같이 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 미오스태틴 면역원이다. 따라서, 미오스태틴 펩티드로 구성되는 백신조성물은 전장의 분자 일부를 포함한 문제의 전체 미오스태틴 분자는 포함하지 않는다.

"미오스태틴 다량체"는 선택된 미오스태틴 면역원, 미오스태틴 펩티드 또는 에피토프 중 하나 이상의 복사를 갖거나, 또는 선택된 미오스태틴 면역원, 미오스태틴 펩티드 또는 에피토프의 다중 종렬반복을 갖는 분자를 의미한다. 미오스태틴 다량체는 일반식 (MP-X-MP)y의 반복단위를 갖는 분자에 일치한다. 여기에서 MP는 미오스태틴 펩티드이고, X는 펩티드결합, 아미노산 스페이서그룹과, [MP]n(여기에서 n은 1 보다 크거나 같다)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되고, 또한 "MP"는 MP 펩티드로 구성될 수 있다. 따라서 y는 1-40 또는 그 이상의 반복단위, 좋기로는 1-30 이상의 반복단위, 가장 좋기로는 1-20 이상의 반복단위로 한정될 수 있다. 또한 선택된 미오스태틴 펩티드서열은 모두 동일하거나 또는 면역응답을 유발할 수 있는 능력을 갖는 한 다른 유도체, 유사체, 변이체 또는 미오스태틴의 에피토프와 같을 수 있다. 아울러 미오스태틴 펩티드가 담체에 화학적으로 또는 재조합적으로 결합된 경우 미오스태틴 펩티드는 5'-말단 또는 3'-말단에 결합되거나 또는 문제의 담체에 인접할 수 있다. 더욱이, 미오스태틴 다량체는 담체내의 사이트에 배치될 수 있다. 미오스태틴 다량체는 이후 상세히 설명된다.

"상동성"은 두 폴리뉴클레오티드 또는 두 폴리펩티드 성분사이의 퍼센트 아이덴터티에 관한 것이다 두 DNA 또는 두 폴리펩티드서열은 이들 서열이 분자의 한정된 길이에서 적어도 약 75-85%, 좋기로는 적어도 약 90%, 가장 좋기로는 적어도 약 95-98%의 서열아이덴터티를 보일 때에 서로 "실질적으로 상동"한다. 본문에 사용된 바와 같이, 실질적으로 상동한다는 것은 특정 DNA 또는 폴리펩티드서열에 대하여 완전한 아이덴터티를 보이는 서열에 관한 것이다.

두 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열사이의 퍼센트 "아이덴터티"는 서열을 정렬하고, 정렬된 두 서열사이의 정확한 매칭수를 계산하며, 짧은 서열의 길이로 나누고, 그 결과를 100으로 곱하여 두 분자사이의 서열정보를 직접 비교함으로서 결정된다. 펩티드분석을 위한 Smith and Waterman의 국소상동 알고리즘 (1981) Advances in Appl. Math. 2:482-489을 적용하는 ALIGN, Dayhoff, M.O. in Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC과 같이 이미 사용되고 있는 컴퓨터 프로그램이 분석에 이용될 수 있다. 뉴클레오티드서열 아이덴터티를 결정하기 위한 프로그램은 역시 Smith and Waterman의 알고리즘에 기초하는 예를 들어 BESTFIT, FASTA와 GAP 프로그램과 같은 Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (위스콘신 매디슨에 소재하는 Genetics Computer Group으로부터 입수가능함)에서도 유용하다. 이들 프로그램은 제작자에 의하여 권유된 디폴트 파라메타와 함께 이미 이용되고 있으며 상기 언급된 Wisconsin Sequence Analysis Package에서 설명되어 있다. 예를 들어 기준서열에 대한 특정 뉴클레오티드서열의 퍼센트 아이덴터티는 디폴트 스코링 테이블과 6개 뉴클레오티드 위치의 갭 페널티를 갖는 Smith and Waterman의 상동성 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다.

또한, 아이덴터티는 단쇄종 뉴클레아제에 의하여 분해가 이루어지는 동상영역사이의 안정된 복식을 형성하는 조건하의 폴리뉴클레오티드의 하이브리다이제이션과, 분해된 프라그먼트의 크기결정화에 의하여 결정될 수 있다. 실질적으로 동상인 DNA서열은 예를 들어 특정시스템을 위하여 한정된 긴축조절하에서 사선(Southern) 하이브리다이제이션 실험에서 확인될 수 있다. 적당한 하이브리다이제이션조건을 한정하는 것은 전문가의 몫이다. 예를 들어, Sambrook 등의 supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra를 참조바란다.

용어 "변성변이체"는 핵산서열의 변화를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 이는 변성변이체가 유도되는 폴리뉴클레오티드에 의하여 부호화된 폴리펩티드와 같은 동일한 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드를 부호화한다.

면역원 또는 백신에 대한 "면역응답"은 대상의 면역원 또는 백신에 대한 세포 또는 항체매개면역응답의 숙주의 현상이다. 통상적으로 이러한 응답은 하나 이상의 다음과 같은 효과를 포함한다. 대상의 조성물 또는 백신에 포함된 면역원에 특별히 유도된 항체, B세포, 헬퍼 T세포, 억제 T세포, 또는 세포장해성 T세포 또는 γδ T세포의 발생. 면역응답은 웨스턴 블로트, 닷 블로트 및 면역친화성분석방법을 포함하는 표준면역학적분석 및 중화분석방법과 같은 잘 알려진 여러 가지 분석을 이용하여 검출될 수 있다. 세포매개성 면역응답의 존재는 Erickson 등의 J. Immuol. (1993) 151:4189-4199와, Doe 등의 Eur. J. Immunol. (1994) 24:2369-2376에 기술된 분석과 같이 잘알려진 CTL 세포장해성 세포분석방법을 이용하여 결정될 수 있다.

"에피토프"는 미오스태틴종 항체를 유발하고 이와 조합될 수 있는 역량 또는 능력을 갖는 분자의 부분 또는 영역에 관한 것이다. 본 발명의 목적을 위하여, 폴리펩티드 에피토프는 통상적으로 기준분자의 적어도 약 3개의 아미노산, 좋기로는 적어도 약 5개의 아미노산, 가장 좋기로는 적어도 약 10-15개의 아미노산으로부터 20-30 이상의 아미노산을 포함한다. 플라그먼트의 길이의 상한은 제한이 없으며, 이는 거의 전장의 단백질서열 또는 문제의 단백질의 둘 이상의 에피토프로 구성되는 융합단백질로 구성될 수 있다.

폴리펩티드분자의 에피토프는 잘 알려진 다수의 에피토프 맵핑기술을 이용하여 확인될 수 있다. 예를 들어 Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey를 참조바란다. 예를 들어, 선형 에피토프는 예를 들어 고형지지물질상에서 단백질분자의 일부인 다수의 펩티드를 동시에 합성하고, 펩티드가 지지물질에 부착되어 있는 동안에 펩티드를 항체와 반응시켜결정될 수 있다. 이러한 기술은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 미국특허 제4,708,871호; Geysen 등의 (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen 등의 (1986) Molec. Immunol. 23:709-715에 기술되어 있다. 마찬가지로, 배좌에피토프는 예를 들어 x선 결정학 및 2차원 핵자기공명에 의한 것과 같이 아미노산의 공간배좌를 측정함으로서 용이하게 확인될 수 있다. 예를 들어 Epitope Mapping Protocols, supra.를 참조바란다. 예를 들어 Kyte 등의 J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132와; Hopp and Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981)78:3824-3828에 기술된 바와 같이 각 20개 아미노산의 소수성 및 친수성의 특성을 이용하여 단백질의 아미노산서열로부터 하이드로파시 스케일을 작성하는 컴퓨터 프로그램이 주어진 분자의 항원부분을 측정하는데 이용될 수 있다. 예를 들어 Hopp and Woods의 기술은 수치상의 친수성 값을 각 아미노산에 지정하고 단백질쇄를 따라 이들 값을 반복적으로 평균한다. 평균친수성의 최고위점은 분자의 항원부분을 나타낸다.

"면역담체"는 대상의 미오스태틴 면역원과 관련되었을 때 이러한 분자에 면역원성을 부여하거나 이 분자의 면역원성을 향상시키는 분자를 의미한다. 적당한 담체의 예로서는 단백질; 세파로스, 아가로스, 셀루로스, 셀루로스 비이드 등과 같은 다당류; 폴리글루탐산, 폴리라이신 등과 같은 고분자 아미노산; 아미노산 코폴리머; 비활성 바이러스입자; 디프테리아, 파상풍, 콜레라, 류코톡신분자 등과 같은 세균독소와 같은 다수의 지변형 고분자를 포함한다. 담체는 이후에 상세히 설명된다.

미오스태틴 면역원은 면역원이 담체에 화학적으로 결합될 때, 또는 면역원이 면역원과 대상의 담체를 부호화하는 키메라 DNA분자로부터 표현될 때 특정 담체분자에 "결합"된다.

"면역접합체"는 상기 언급된 바와 같이 담체분자에 결합된 미오스태틴 펩티드 또는 다량체와 같은 미오스태틴 면역원이다.

용어 "류코톡신 폴리펩티드" 또는 "LKT 폴리펩티드"는 카르복시-말단 공통아미노산서열 Gly-Gly-X-Gly-X-Asp(Highlander 등. (1989) DNA 8:15-28)에 의하여 특징지어지는 분자으 계통군에 속하는 단백질로부터 유도된 폴리펩티드를 의미한다. 여기에서, X는 Lys, Asp, Val 또는 Asn이다. 이러한 단백질은 그 중에서도 P. haemolytica와 Actinobacillus pleuropneumoniae 및 E. coli 알파 헤몰리신(Strathdee 등의 (1987) Infeect. Immun. 55:3233-3236; Lo (1990) Can. J. Vet. Res. 54:S33-S35; Welch (1991) Mol. Microbiol. 5:521-528)으로부터 유도된 류코톡신을 포함한다. 이러한 독소계통군은 독소의 "RTX"계통군으로 알려져 있다(Lo (1990) Can. J. Vet. Res. 54:S33-S35). 아울러, 용어 "류코톡신 폴리펩티드"는 화학적으로 합성되거나 동일하게 표현되는 생물체로부터 분리되거나 또는 재조합되어 생성되는 류코톡신 폴리펩티드를 나타낸다. 더욱이, 이 용어는 특정한 미변성 류코톡신 폴리펩티드에서 발견되는 인접한 아미노산서열에 실질적으로 동상인 아미노산서열을 갖는 면역원 단백질에 사용된다. 이와 같이, 이 용어는 전장 및 부분서열과 이에 유사한 서열을 포함한다. 비록 미변성 전장 류코톡신이 세포장해성의 활성을 나타내나, 용어 "류코톡신"은 미변성 류코톡신의 세포장해특성은 없으나 면역원성을 갖는 분자에 대하여 사용된다.여러 류코톡신에 대한 뉴클레오티드서열과 해당 아미노산서열은 알려져 있다. 예를 들어, 미국특허 제4,957,739호 및 제5,055,400호; Lo 등의 (1985) Infect. Immun. 50:667-67; Lo 등의 (1987) Infect. Immun. 55:1987-1996; Strathdee 등의 (1987) Infect. Immun. 55:3233-3236; Highlander 등. (1989) DNA 8:15-28; Welch (1991) Mol. Microbiol. 5:521-528을 참조바란다. 본 발명의 우선실시형태에 있어서, 류코톡신 키메라는 용합된 하나 이상의 미오스태틴 다량체에 증강된 면역원성을 부여하는 선택된 류코톡신 폴리펩티드를 갖는 것으로 제공된다.

본 발명에 이용하기 위한 면역원 류코톡신 폴리펩티드의 특수한 예는 미국특허 제5,476,657호 및 제5,837,268호에 기술된 단을 절취한 류코톡신 분자이다. 이들 단절취형 분자는 LKT 352, LKT 111 및 LKT 114를 포함한다. LKT 352는 플라스미드 pAA352(ATCC 접수번호 68283)에 존재하는 lktA 유전자로부터 유도된다. 이 유전자의 뉴클레오티드서열과 해당 아미노산서열은 미국특허 제5,476,657호에 기술되어 있다. 이 유전자는 914개의 아미노산을 가지고 약 99 kDa의 평가분자량을 갖는 단절취형 류코톡신을 부호화한다. LKT 111은 플라스미드 pCB111(ATCC 접수번호 69748)에 존재하는 lktA 유전자로부터 유도된 류코톡신 폴리펩티드이다. 이 유전자의 뉴클레오티드서열과 해당 아미노산서열은 미국특허 제5,837,268호에 기술되어 있다. 이 유전자는 약 1300bp 길이의 내부 DNA 프라그먼트를 제거함으로서 플라스미드 pAA352(ATCC 접수번호 68283)에 존재하는 재조합 류코톡신 유전자로부터 발현된 단축버전의 류코톡신을 부호화한다. LKT 111 폴리펩티드는 52kDa의 평가분자량을 가지나(99 kDa LKT 352 폴리펩티드에 비교하였을 때) 충분한 T-세포 면역원성을 위하여 필요한 T-세포 에피토프를 포함하는 LKT 352 N-말단의 부분과, 본 발명에 이용하기 위한 융합단백질을 생성하기 위한 적당한 제한사이트를 포함하는 LKT 352 C-말단의 부분을 가진다. LKT 114는 플라스미드 pAA114에 존재하는 유전자로부터 유도되고(미국특허 제5,837,268호에 기술됨) 도 15a-도 15d에 도시되어 있다. LKT 114는 분자의 내부로부터의 부가적인 아미노산의 결실에 의하여 LKT 111과 상이하다.

"면역조성제"는 특정 항원에 대한 면역응답을 증가시키도록 비특이 방법으로 작용하여 어느 주어진 백신에서 필여한 항원의 양과 대상의 항원에 대한 적당한 면역응답을 발생하기 위하여 필요한 주입빈도를 감소시키는 작용제이다. 예를 들어 A.C. Allison J. Reticuloendothel. Soc. (1979) 26:619-630을 참조바란다.

"미변성" 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 단백질이 자연적으로 밸생되는 소오스로부터 분리된 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드이다. "재조합체" 폴리펩티드는 재조합 DNA 기술에 의하여 생산된, 즉 요구된 폴리펩티드를 부호화하는 외인성 DNA 구조에 의하여 형질전환된 세포로부터 생산된 폴리펩티드를 나타낸다. "합성" 폴리펩티드는 화학적 합성에 의하여 제조되는 폴리펩티드이다.

"폴리뉴클레오티드"는 mRNA, cDNA, 게놈 DNA서열 및 합성 DNA서열을 포함하는 뉴클레오티드의 서열을 의미한다. 또한 이 용어는 알려진 DNA와 RNA의 염기유사체를 포함하는 서열까지도 포함한다.

"벡터"는 부착된 세그먼트의 복제가 이루어지도록 다른 DNA 세그먼트가 부착되는 플라스미드, 파아지 또는 코스미드와 같은 레플리콘이다.

특정 단백질을 DNA "코드서열" 또는 "서열부호화"는 적당한 조절인자의 제어하에 배치될 때 생체외 또는 생체내 폴리펩티드로 전사 및 번역되는 DNA서열이다. 코드서열의 경계는 5'-말단에서 개시코돈과 3'-말단에서 번역종지코돈에 의하여 결정된다. 코드서열은 원핵서열, 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 진핵(예를 들어, 포유동물)DNA로부터의 게놈 DNA서열 및 합성 DNA서열을 제한없이 포함한다. 전사종지서열은 통상 코드서열의 3'에 위치한다.

용어 DNA"제어인자"는 집약적으로 숙주세포에서 코드서열의 전사 및 번역을 위하여 제공되는 촉진인자. 리보솜결합사이트, 폴리아데닐화 신호, 전사종지서열, 상류조절영역, 증강구조 등에 관한 것이다. 이들 모든 제어서열은 요구된 유전자가 전사되거나 번역될 수 있는 한 재조합체 벡터에 항시 존재하는 것은 아니다.

"동작가능 결합"이라는 용어는 기술된 구성요소가 이들의 통상적인 기능을 수행하도록 구성되는 인자의 배열에 관한 것이다. 이와 같이, 코드서열에 동작가능하게 결합된 제어인자는 코드서열의 표현이 가능하도록 한다. 제어인자는 이들이 그 표현을 직접 나타내는 기능을 발휘하는 한 코드서열에 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 번역되지는 않았으나 전사된 방해서열은 촉진인자와 코드서열사이에 존재할 수 있고 촉진인자는 코드서열에 "동작가능하게 결합"되었다고 할 수 있다.

촉진인자와 같은 제어인자는 RNA 중합효소가 촉진인자에 결합하고 코드서열은 mRNA로 전사하여 코드서열로 부호화된 폴리펩티드로 번역될 때 세포에서 코드서열의 "전사를 유도"한다.

"숙주세포"는 외인성 핵산분자에 의하여 형질전환되었거나 형질전환가능한 세포이다.

이 세포는 이러한 외인성 DNA가 세포막내로 진입하였을 때 외인성 DNA에 의하여 "형질전환"된다. 외인성 DNA는 세포의 게놈을 구성하는 염색체 DNA로 통합되거나(공유결합) 또는 통합되지 않을 수 있다. 예를 들어 원핵생물과 효모에 있어서 외인성 DNA는 플라스미드와 같은 에피솜인자에 유지될 수 있다. 진핵세포에 대하여, 적당히 형질전환된 세포는 외인성 DNA가 염색체에 통합되어 염색체복제를 통한 낭세포에 의하여 유전되는 세포이다. 이러한 안정성은 외인성 DNA를 포함하는 낭세포집단으로 구성된 세포주 또는 클론을 형성하는 진핵세포의 능력에 의하여 나타난다. 본문에서 "∼로부터 유도된다"라는 용어는 대상체의 분자 또는 면역원의 실질적이거나 이론적인 소오스 또는 기원을 나타낸다. 예를 들어, 특정 미오스태틴 분자로부터 "유도"된 면역원은 기준분자의 당해부분과 유사한 근접서열을 가질 것이다. 따라서, 특정 미오스태틴 분자로부터 "유도"된 면역원은 모든 야생형 미오스태틴서열을 포함하거나 또는 유도된 서열이 목표로 하는 미오스태틴 분자에 해당하는 면역원을 위하여 제공되는 한 아미노산잔기의 삽입, 결실 또는 치환에 의하여 변형될 수 있다. 열거된 분자로부터 유도된 면역원은 이러한 분자에 대하여 특정된 적어도 하나의 에피토프를 포함할 것이다.

"척추동물"이라는 용어는 달리 제한없이 소, 양, 돼지, 염소, 말 및 사람과 같은 포유동물, 개나 고양이와 같은 동물, 암탉이나 숫탉 칠면조나 기타 순계류의 조류등 가금류나 야생류 및 엽조류를 포함하는 조류, 그리고 어류를 포함하는 아문계의 동물을 의미한다. 이 용어는 특별히 연령이나 성별을 언급치 아니한다. 이와 같이 이 용어는 암수, 성체와 신생동물, 태자와 난등 모두에 사용된다.

본 발명의 조성물과 방법은 "미오스태틴 활성을 감소시키기" 위한 것이다. 이러한 활성의 감소는 척추동물에서 통상적으로 발견되는 미오스태틴의 순환레벨의 감소, 또는 미오스태틴의 순환레벨을 높이는 장애에 의한 척추동물에서 미오스태틴의 순환레벨의 감소일 수 있다. 일반적으로 미오스태틴활성의 감소는 문제의 대상체에 공급된 미오스태틴 펩티드 면역원에 대하여 발생된 항체에 의한 순환 미오스태틴의 비활성의 결과를 가져온다. 그러나, 활성의 감소는 특정의 비활성모드로 제한될 뿐 아니라 순환으로 미오스태틴의 감소된 생산 또는 분비의 결과일 수 있다.특정 이론에 의하여 얽매임이 없이, 미오스태틴 펩티드 면역원은 미오스태틴이 단백질의 활성부분을 방출토록 절단되는 것을 방지하거나, 또는 단백질이 그 수용체에 결합되는 것을 방지하는 항체의 생성을 유발할 수 있다. 또한, 항체는 미오스태틴이 그 활성사이트에 이르기 전에 순환 또는 기타체액으로부터 분비된 미오스태틴을 제거할 수 있다.

미오스태틴활성의 감소는 그 자체가 여러 가지 방법으로 확인될 수 있다. 예를 들어, 미오스태틴활성의 감소는 체중의 증가, 증강된 근육질, 증가된 근육강도, 근육대 지방의 비율변화, 무지방 근육질의 증가, 근육세포의 크기와 수의 증가, 정상적인 척추동물 또는 질환이 있는 척추동물의 수명증가, 식용 또는 사료흡수력의 증가, 생활의 질의 향상, 그리고 포유동물에 있어서 유선조직 및 비유의 증가의 결과를 가져온다.

"증강된 근육질"이라는 용어는 본 발명의 조성물을 투여한 동물이 근육세포크기의 증가(이상비대) 또는 근육세포수(이상증식)의 증가를 보이는 것을 의미한다. 이러한 증가는 타입 1 또는 타입2의 근육섬유에서 이루어질 수 있다. 본문에 사용된 용어 "근육"은 어류의 유사조직형태까지도 포함한다. "증강된 근육질"을 측정하는 방법은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 근육함량은 수중칭량(예를 들어 Bhasin 등의 New Eng. J. Med. (1996) 335:1-7을 참조바란다)과, 이중에너지 x선 흡수계(예를 들어 Bhasin 등의 Mol. Endocrinol. (1998) 83:3155-3162를 참조바란다)와 같은 표준기술을 이용하여 본 발명 미오스태틴 펩티드의 투여전후에 측정될 수 있다. 근육크기의 증가는 적어도 약 5-10%, 좋기로는 적어도 약 10-20% 또는 그 이상의 체중이득에 의하여 입증될 수 있다.

B. 일반방법

본 발명을 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 물론 변할 수 있는 특정 공식 또는 프로세스 파라메타로 제한되지 않음을 이해하여야 할 것이다. 또한 본문에 사용된 용어는 본 발명의 특정 실시형태를 설명하기 위한 것으로 어떠한 제한을 두고자 한 것이 아님을 이해하여야 할 것이다.

비록 본문에 설명된 것과 유사한 다수의 조성물과 방법이 본 발명의 실시에 이용될 수 있으나 우선적인 물질이나 방법이 본문에 설명되고 있다.

본 발명의 목적은 척추동물에 있어서 내인성 미오스태틴생성을 조절하기 위한 면역조성물과 방법의 개발에 있다. 비록 미오스태틴이 일반적으로는 "자기"면역원과 비면역원으로 인식되었으나, 본문에 설명된 조성물은 놀랍게도 이로써 면역된 대상체에서 면역응답을 발생하기 위한 수단을 제공한다.

따라서, 본 발명은 척추동물에서 면역응답을 발생하는데 이용하기 위한 면역원 미오스태틴 펩티드, 미오스태틴 다량체와 미오스태틴 면역접합체에 관한 것이다. 미오스태틴 단백질은 분비형이므로 어린 동물의 능동 또는 수동면역화는 근육질을 증가시키나 배아기중에 유도된 변화로부터 야기되는 다른 이상에 관련된 문제점이 없도록 한다. 이와 같이, 예를 들어, 백신화 스케줄은 이상비대 또는 이상증식이 이루어질 수 있도록 출산직후에 개시될 수 있다. 또한, 면역화는 근육단백질생산을 개선하기 위하여 발달의 후단계에서(사육장의 소에 대하여) 행하여질 수 있다. 아울러, 면역화는 요구된 결과를 얻기 위하여 태아기에 또는 자궁내 동물에 대하여 행하여질 수 있다.

본문에 설명된 조성물과 기술은 조류와 어류와 같은 난태생 척추동물에 대하여서도 동일하게 적용할 수 있다. 이 점에 관하여서, McPherron and Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:12457-12461에서는 포유동물 미오스태틴 유전자와 거의 동상인 조류와 어류에서 a;오스태틴 유전자를 확인하였다. 따라서, 유전자는 모든 종에서 보존되고 모든 종에서 유사한 기능을 발휘하는 것으로 믿어진다. 이와 같이, 예를 들어, 난태생 조류와 어류는 면역되어 모계혈장에서 높은 항체가를 만든다. 항체는 난의 난황난으로 전달되므로 이들 항체는 배아기중에 미오스태틴을 감소시키고 근육세포의 크기 또는 수의 요구된 증가가 이루어질 수 있도록 한다. 또한 면역화는 난내에서 이루어질 수도 있다.

더욱이, 본 발명의 방법과 백신은 사람 또는 다른 동물의 여러 장애를 치료하는데 유용한 것임을 알 수 있을 것이다. 예를 들어 미오스태틴 생성물의 조절은 하반신마비 및 사지마비의 치료와 같은 근육위축이 관련된 근육쇠약증상의 근본적이거나 부수적인 원인이 되는 장애의 치료에 유용하다. 또한 근육강도의 결핍이 활동적이고 건강한 생활을 하는데 여러 제한이 되는 노화된 대상체에 대하여 본 발명의 방법과 백신은 유용할 것이다. 아울러 본 발명의 조성물은 여러 가지 암, 신경성 무식욕증, 악액질, AIDS 등의 장애에 의한 근육쇠약을 치료하거나 방지하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 방법과 백신은 의사이상비대근육영양증, 안면견갑상완근이영양증, 지대형이영양증, 말단근영양증, 안구근병증, 근강직성이영양증과 같은 여러 가지 영양증을 치료하는데 이용할 수 있을 것이다. 이들 질환은 베이커형 근영양증, 디저린-랜도우지 근영양증, 더친형 근영양증, 랜도우지 근영양증, 에머리-드리퓨스 근영양증, 에르브 근영양증, 후쿠야마형 근영양증, 고워 근영양증, 소아축근색영양증, 레이덴-뫼블루스 근영양증, 안구새낭근영양증, 골반대퇴근영양증, 진행성 근영양증, 견갑골상완근영양증 및 시머린 근영양증으로 알려진 장애를 포함한다.

아울러, 미오스태틴은 GDF11과 아주 유사함으로 본 발명의 미오스태틴 펩티드는 GDF11활성을 조절하는데 사용할 수 잇다. 예를 들어 GDF11의 서열에 대한 NCBI 접수번호 AF092734를 참조바란다.

면역화는 펩티드 백신의 이용 또는 DNA 면역화를 포함하는 잘 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 이러한 방법은 이후 상세히 설명된다.

1. 미오스태틴 펩티드

본 발명에 사용되는 미오스태틴 펩티드는 일반적으로 선택된 미오스태틴 단백질로부터 적어도 약 3-200개의 아미노산, 좋기로는 적어도 약 3-100개의 아미노산, 더 좋기로는 적어도 약 3-50개의 아미노산, 더 좋기로는 적어도 약 3-30개의 아미노산, 더 좋기로는 적어도 약 3-15개의 아미노산, 더 좋기로는 적어도 약 5-25개의 아미노산 또는 5-15개의 아미노산을 포함한다.

본 발명의 미오스태틴 펩티드가 유도될 수 있는 10종으로부터의 대표적인 미오스태틴 단백질이 도 1a-도 1d에서 보이고 있다. 소의 미오스태틴의 아미노산서열은 도 16b에 보이고 있다. 펩티드는 미오스태틴분자에 면역원성을 부여하는 적어도 하나의 에피토프를 포함할 것이다.

우선실시형태에 있어서, 미오스태틴 펩티드는 도 1a-도 1d (SEQ ID NOS:27-36)의 아미노산 1-350 범위의 영역; 도 1a-도 1d (SEQ ID NOS:27-36)의 아미노산 1-275 범위의 미오스태틴의 영역; 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)의 아미노산 25-300 범위의 미오스태틴의 영역; 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)의 아미노산 50-325 범위의 미오스태틴의 영역; 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)의 아미노산 75-350 범위의 미오스태틴의 영역; 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)의 아미노산 45-376 범위의 미오스태틴의 영역; 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)의 100-376; 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)의 아미노산 235-376 범위의 미오스태틴의 영역을 포함하는 영역으로부터 유도되거나, 펩티드가 공급되는 대상체에서 면역응답을 유발할 수 있는 미오스태틴의 에피토프를 포함하는 것으로 믿어지는 다른 영역으로부터 유도된다.

어떠한 실시형태에 있어서, 미오스태틴 펩티드는 도 17에서 보인 친수성 특성에서 친수성의 최고점을 보이는 미오스태틴의 3개 영역 중 한 영역으로부터 유도된다. 친수성의 3개 최고점은 단백질분해 분할사이트, 위치 31-37 및 위치 106-111에 걸친 아미노산 위치 263-268에서 발견된다. 이와 같이 이들 실시형태에서 미오스태틴 펩티드는 단백질분해 분할사이트에 걸친 아미노산서열 Lys-Arg-Ser-Arg-Arg-Asp (SEQ ID NO:37); 미오스태틴의 아미노산 31-37에 해당하는 아미노산서열 Lys-Glu-Asn-Val-Glu-Lys-Glu (SEQ ID NO:38); 또는 미오스태틴의 아미노산 106-111에 해당하는 아미노산서열 Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 39)로 구성된다.

다른 실시형태에 있어서, 미오스태틴 펩티드는 SEQ ID NO:4 (MYOS 1, 도 2에 도시됨)의 아미노산 3-18; SEQ ID NO:6 (MYOS 3, 도 3에 도시됨)의 아미노산 3-15; SEQ ID NO:8 (MYOS 5, 도 4에 도시됨)의 아미노산 3-17; SEQ ID NO:10 (MYOS 7, 도 5에 도시됨)의 아미노산 3-16; SEQ ID NO:12 (MYOS 9, 도 6에 도시됨)의 아미노산 3-22; SEQ ID NO:14 (MYOS 11, 도 7에 도시됨)의 아미노산 3-25; SEQ ID NO:16 (MYOS 13, 도 8에 도시됨)의 아미노산 3-22; SEQ ID NO:18 (MYOS 15, 도 9에 도시됨)의 아미노산 3-19; SEQ ID NO:20 (MYOS 17, 도 10에 도시됨)의 아미노산 3-18; 또는 SEQ ID NO:22 (MYOS 19, 도 11에 도시됨)의 아미노산 3-18의 아미노산서열로 구성된 펩티드에 대하여 적어도 약 75%의 아미노산 아이덴터티를 갖는다. 전장 미오스태틴에 대한 상기 여러 MYOS 펩티드의 위치가 도 12에 나타나 있다.

미오스태틴 펩티드는 이후 상세히 설명되는 바와 같이 미오스태틴 면역접합체를 형성하기 위하여 선택적으로 결합된다.

2. 미오스태틴 면역접합체

상기 언급된 바와 같이, 미오스태틴은 내인성 분자이고 이와 같이 이는 미오스태틴 면역접합체를 형성하기 위하여 이를 담체에 결합함으로서 미오스태틴 펩티드(또는 이후 설명되는 다량체)의 면역원성을 더욱 증가시키는데 바람직하다. 이는 특히 미오스태틴 면역원이 이것이 유도되는 동일종에 투여되는 경우 필요한 것이다.

적당한 담체는 일반적으로 바이러스표면단백질 또는 담체펩티드서열과 같은 감염물질로부터 유도된 단백질의 항원영역을 포함하는 폴리펩티드이다. 이들 담체는 비특이적으로 T-헬퍼 세포의 활성을 자극하고 주요조직적합복합체의 분자와 결합된 세포표면에서 프로세싱과 프레센테이션을 위한 항원제시세포(APC)에 대상의 면역원을 유도하는데 도움을 주도록 작용한다.

이를 위하여 여러 담체시스템이 개발되었다. 예를 들어, 작은 펩티드 헵텐이 면역응답을 발생하기 위하여 키홀 림펫트 헤모시아닌(Bittle 등의 (1982) Nature 298:30-33), 파상풍 톡소이드와 같은 세균성 독소(Muller 등의 (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:569-573), 난맥알부민, 류코톡신 폴리펩티드 및 향유고래 미오글로빈과 같은 단백질담체에 결합되었다. 이들 결합반응은 전형적으로 담체단백질의 몰 당 펩티드 헵텐의 수 몰이 결합된다.

본 발명에 사용될 수 있는 다른 적당한 담체는 미국특허 제5,071,651호에 기술된 바와 같이로타바이러스 또는 그 기능프라그먼트의 VP6 폴리펩티드를 포함한다. 또한 바이러스단백질과 미오스태틴으로부터 하나 이상의 에피토프의 융합생성물도 유용하며, 이러한 융합생성물은 미국특허 제4,722,840호에 기술된 방법에 의하여 제조된다. 또 다른 적당한 담체로서는 이러한 형태의 프레센테이션이 면역화된 상태를 나타내는 대상체의 자연프레젠테이션 모드를 모사함으로 림프구와 같은 세포를 포함한다. 또한 미오스태틴 면역원은 적혈구, 좋기로는 대상체 자신의 적혈구에 결합될 수 있다. 펩티드를 단백질이나 세포에 결합시키는 방법은 당해 기술분야의 전문가라면 잘 알 것이다.

본 발명의 실시에 유용한 공급시스텝은 입자담체를 이용한다. 예를 들어, 사전에 준비된 입자가 면역원이 결합될 수 있는 플래트폼으로서 사용되었다. 프로테오섬(Lowell 등의 (1988) Science 240:800-802)과 면역자극복합체(Morein 등의 (1984) Nature 308:457-460)에 기초한 시스템이 알려져 있다.

또한 입자에 자기조립되는 재조합적으로 생성된 키메라 단백질을 이용하는 담체시스템이 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 효모 레토로트랜스포존 Ty가 바이러스형 입자에 조립되는 일련의 단백질을 부호화한다(Ty-VLPa; Kingsman 등의 (1988) Vaccines 6:304-306). 이와 같이 대상의 미오스태틴 면역원을 부호화하는 유전자 또는 그 프라그먼트는 TyA 유전자에 삽입될 수 있고 융합단백질로서 효모에 발현될 수 있다. 융합단백질은 균일한 크기의 입자로 자기조립하는 능력을 갖는다. 다른 유용한 바이러스형 담체시스템은 HBsAg (Valenzuela 등의 (1985) Bio/Technol. 3:323-326; 미국특허 제4,722,840호; Delpeyroux 등의 (1986) Science 233:472-475), 헤파티티스 B 코어항원 (Clarke 등의 (1988) Vaccines 88 (Ed. H. Ginsberg 등) pp.127-131), 폴리오바이러스 (Burke 등의 (1988) Nature 332:81-82)와, 담배모자이크바이러스 (Haynes 등의 (1986) Bio/Technol. 4:637-641)에 기초하고 있다.

특별히 우선하는 담체는 상기 언급된 바와 같은 혈청알부민, 키홀림펫트 헤모시아닌, 난백알부민, 향유고래 미오글로빈, 류코톡신 분자와 기타 전문가에게 잘 알려진 다른 단백질을 포함한다. 본 발명의 담체로서 사용하기 위한 한 특정 류코톡신 폴리펩티드가 도 15a-도 15d에서 보이고 있다. 실시예에서 추후 설명되는 바와 같이 미오스태틴은 뉴클레오티드 위치3334에 존재하는 BamH1 사이트에 삽입될 수 있다.

단백질담체는 이들의 자연상태에서 사용될 수 있거나 이들의 기능기 내용이 예를 들어 라이신잔기의 석시닐화 또는 Cys-티오락톤과의 반응에 의하여 수정될 수 있다. 설프하이드릴기가 예를 들어 2-이미노치올란 또는 3-(4-디치오피리딜 프로피온산염의 N-히드록시석신이미드 에스테르와 아미노기능의 반응으로담체(또는 항원)에 결합될 수 있다. 또한 적당한 담체는 펩티드 면역원의 부착을 위하여 스페이서 암(헥사메틸렌 디아민 또는 기타 유사한 크기의 2가성 분자)에 결합토록 수정될 수 있다.

담체는 표준결합반응방법을 이용하여 대상의 미오스태틴 면역원에 물리적으로 접합될 수 있다. 또한, 키메라 분자는 적당한 폴리펩티드 담체를 부호화하는 유전자를 미오스태틴 면역원을 위하여 부호화하는 유전자 또는 그 프라그먼트의 하나 이상의 복사에 융합에 의한 것과 같이 본 발명에 이용하기 위하여 재조합되어 준비될 수 있다.

또한 미오스태틴 면역원은 이를 발현하는 담체바이러스를 통하여 투여될 수 있다, 본 발명에서 사용될 수 있는 담체바이러스는 백시니아와 다른 천연두바이러스, 아데노바이러스 및 헤르페스 바이러스를 포함한다. 예를 들어 단백질을 발현하는 백시니아 바이러스재조합체는 다음과 같이 구성될 수 있다. 특정 단백질을 부호화하는 DNA가 먼저 적당한 벡터에 삽입되어 서열부호화 티미딘 키나아제(TK)와 같은 백시니아 촉진인자와 인접백시니아 DNA 서열에 인접하게 된다. 그리고 이 벡터는 백시니아로 동시에 감염된 세포를 이입하는데 사용된다. 상동성 재조합은 백시니아 촉진인자와 요구딘 면역원을 부호화하는 유전자를 바이러스 게놈에 삽입토록 작용한다. 그 결과의 TK-재조합체는 5-브로모디옥시우리딘의 존재하에서 세포를 배양하고 그 바이러스성 플라크내성을 뽑아냄으로서 선택될 수 있다.

3. 미오스태틴 다량체

미오스태틴 면역원의 면역원성은 선택된 에피토프의 다중복사로 구성되는 분자의 면역원형태를 생성하여 현저히 증가될 수 있다. 이와 같이 함으로서, 내인성 미오스태틴은 효과적인 자기면역원이 될 것이다.

아울러, 본 발명의 한 관점에서, 미오스태틴 다량체를 포함하는 백신조성물은 대상체에 공급하기 위한 핵산 또는 펩티드형태로 제공될 수 있다. 미오스태틴 다량체는 상기 언급된 바와 같이 선택된 미오스태틴 면역원, 펩티드 또는 에피토프의 하나 이상의 복사 또는 선택된 미오스태틴 면역원, 펩티드 또는 에피토프의 다중종열반복을 가질 것이다. 이와 같이 미오스태틴 다량체는 선택된 미오스태틴 서열의 다중 또는 종열반복, 선택된 미오스태틴 에피토프의 다중 또는 종열반복 또는 그 예상되는 조합으로 구성될 수 있다. 미오스태틴 에피토프는 상기 언급된 기술을 이용하여 확인될 수 있다.

예를 들어, 미오스태틴 다량체는 일반식 (MP-X-MP)y의 반복단위를 갖는 분자에 일치한다. 여기에서 MP는 미오스태틴 펩티드이고, X는 펩티드결합, 아미노산 스페이서그룹과, [MP]n(여기에서 n은 1 보다 크거나 같다)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되고, 또한 "MP"는 MP 펩티드로 구성될 수 있다. 이와 같이 미오스태틴 다량체는 2-64 이상의 미오스태틴 펩티드 또는 2-32 또는 2-16개의 미오스태틴 펩티드를 포함할 수 있다.

또한 선택된 미오스태틴 펩티드서열은 모두 동일하거나 또는 면역응답을 유발할 수 있는 능력을 갖는 한 다른 유도체, 유사체, 변이체 또는 미오스태틴의 에피토프와 같을 수 있다. 아울러 미오스태틴 펩티드가 담체에 화학적으로 또는 재조합적으로 결합된 경우 미오스태틴 펩티드는 5'-말단 또는 3'-말단에 결합되거나 또는 문제의 담체에 인접할 수 있다. 더욱이, 미오스태틴 다량체는 담체내의 사이트에 배치될 수 있다.

본 발명에 사용되는 한 특정 담체는 상기 언급된 바와 같은 류코톡신 폴리펩티드이다. 예를 들어, 미오스태틴 올리고반복은 도 15a-도 15d에서 보인 류코톡신 폴리펩티드의 뉴클레오티드 위치3334에 존재하는 BamH1에 삽입될 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 스페이서서열은 미오스태틴성분사이에 존재할 수 있다. 예를 들어, Arg-Ser 및 Gly-Ser 이량체는 미오스태틴 펩티드의 반복서열사이에 스페이서를 제공하는 본문에 예시된 MYOS 펩티드에 존재한다. 선택된 미오스태틴 면역원사이의 여러 스페이서서열의 전략적인 배치는 대상체 구조에서 증가된 면역원성을 제공하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명하에서, 선택된 스페이서서열은 단일 아미노산링크 또는 둘 이상의 여러 아미노산의 서열과 같은 다양한 성분을 부호화할 수 있다. 선택된 스페이서 그룹은 효소분할사이트를 제공함으로서 발현된 다량체가 각각 담체부분으로부터 유도된 적어도 하나의 T-세포를 포함하고 완전한 미오스태틴 펩티드서열에 융합되는 다수의 펩티드를 생성토록 생체내 단백질분해효소(APC 등)에 의하여 처리될 수 있다.

스페이서 그룹은 선택된 미오스태틴성분사이의 접합영역이 면역화된 대상체에 대한 분명한 이종서열로 구성될 수 있게 구성되어 미오스태틴 펩티드에 증강된 면역원성을 제공한다. 아울러, 스페이서 서열은 당해분야에서 면역원 헬퍼 T-세포 에피토프를 제공하는 것으로 알려진 양친매성 또는 α-나선형 펩티드 서열을 부호화하는 서열과 같은 T-세포 항원성을 제공토록 구성될 수 있다. 이러한 스페이서 서열에 의하여 제공될 특정 T-세포 에피토프의 선택은 백신화될 특정 척추동물종에 따라 달라질 수 있다. 비록 특정 미오스태틴 부분이 스페이서서열을 포함하는 것으로 예시되었으나, 본 발명의 목적은 또한 직접 인접한 미오스태틴 서열(스페이서서열의 간섭없이)로 구성되는 하나 이상의 미오스태틴 다량체를 제공하는데 있다.

이와 같이 생성된 미오스태틴 다량체서열은 본 발명의 조성물에 사용하기 위한 높은 면역원성 미오스태틴 항원을 제공한다.

미오스태틴 펩티드, 면역접합체 및 다량체는 이후 설명되는 방법을 이용하여 생산될 수 있으며, 핵산면역화, 유전자요법, 단백질기초 면역화방법 등에 이용된다.

4. 핵산기초형 면역화방법

일반적으로, 본 발명에 이용되는 핵산기초형 백신은 적당한 제어서열과 선택적이고 보조적인 치료용 뉴클레오티드 서열을 갖는 미오스태틴 면역원을 부호화하는 관련부분을 포함할 것이다. 핵산분자는 수용체 세포에 전사와 번역을 유도하도록 필수인자를 포함하는 벡터의 형태로 준비된다.

면역화된 대상체에서 면역응답을 증대시키기 위하여, 핵산분자는 약리학적 물질, 면역조성제와 같은 보조물질과 함께, 또는 사이토카인 등과 같은 생물학적 응답수식인자를 부호화하는 벡터의 공급과 함께 투여될 수 있다. 다른 보조물질로서는 성장호르몬, 성장촉진제, 베타길항물질, 분배물질 및 항생제와 같은 중량이득, 근육질 또는 근육강도를 증가시키는 물질을 포함한다.

본 발명에 사용토록 선택된 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 표준기술을 이용한 요구된 유전자 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포 또는 조직으로부터 분리하거나 또는 재조합이나 합성기술을 이용하여 알려진 소오스로부터 유도될 수 있다.

미오스태틴 면역원을 위한 코드서열이 준비되거나 분리되었을 때, 이러한 서열은 적당한 벡터 또는 레플리콘으로 클론화될 수 있다. 당해 기술분야의 전문가에게는 다수의 클론벡터가 알려져 있으며, 적당한 클론벡터는 선택의 문제이다. 다른 서열, 예를 들어 보조분자 또는 담체분자에 대한 연결반응은 잘 알려진 표준절차에 따라 수행된다. 키메라의 하나 이상의 미오스태틴 면역원부분은 요구된 보조서열 또는 담체분자에 대하여 5' 또는 3'에 융합될 수 있다. 또한 하나 이상의 미오스태틴 면역원부분이 담체분자에 대하여 내부사이트에 배치되거나 또는 이러한 부분이키메라의 말단 및 내부 위치에 배치될 수 있다.

또한, 담체분자에 선택적으로 결합되는 대상의 미오스태틴 면역원을 부호화하는 DNA서열은 클론화보다는 합성화로 준비될 수 있다. DNA서열은 특정서열을 위한 적당한 코돈으로 설계될 수 있다. 그리고 면역원의 완전서열은 표준방법으로 준비된 중복 올리고뉴클레오티드로부터 조립되고 완전 코드서열로 조립된다. 예를 들어 Edge (1981) Nature 292:756; Nambaire 등의 (1984) Science 223:1299와; Jay 등의 (1984) J. Biol. Chem. 259:6311을 참조바란다.

그리고 코드서열은 생체내의 적당한 숙주조직에서 발현토록 적당한 제어인자의 제어하에 배치된다. 제어인자의 선택은 치료되는 대상체와 사용된 제제의 형태에 따라 달라질 수 있다. 이와 같이, 대상체의 내인성 전사 및 번역기관은 면역원을 발현하는데 사용될 것이며, 특정 대상체에 적합한 제어인자가 사용될 것이다. 이 점에 관하여, 포유동물계에서 이용하기 위한 여러 촉진인자는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 포유동물 세포발현을 위한 전형적인 촉진인자는 SV40 조기촉진인자, CMV 즉시조기촉진인자와 같은 CMV 촉진인자, 아데노바이러스 주요후기촉진인자(Ad MLP)와, 헤르페스 심플렉스 바이러스 촉진인자 등을 포함한다. 마우스 메탈로치오네인 유전자로부터 유도된 촉진인자와 같은 다른 비바이러스 촉진인자도 포유동물 발현에 이용될 수 있음이 확인될 것이다.

전형적으로, 전사종료 및 폴리아데닐화서열이 번역종지코돈에 대하여 3'에 위치할 것이다. 좋기로는 코돈서열의 5'에 위치하는 번역의 최적개시를 위한 서열도 역시 존재할 것이다. 전사종료/폴리아데닐화신호의 예는 Sambrook 등의 supra에 기술된 바와 같은 SV40과, 소 성장호르몬터미네이터서열로부터 유도된 것을 포함한다. 스플라이스 공여체 및 수용체 사이트를 포함하는 인트론도 본 발명에 사용하기 위한 구조로 설계될 수 있다.

또한 증강인자가 구조의 발현레벨을 증가시키도록 사용될 수 있다. 그 예로서는 SV40 조기유전자증강구조(Dijkema 등의 (1985) EMBO J. 4:761), 라우스육종바이러스(Gorman 등의 (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777)의 장기말단반복(LTR)로부터 유도된 증강인자/촉진인자와, CMV 인트론 A 서열에 포함되는 인자와 같은 인간 CMV (Boshart 등의 (1985) Cell 41:521)로부터 유도된 인자를 포함한다.

준비되었을 때, 핵산백신조성물은 공지의 방법을 이용하여 대상체에 공급될 수 있다. 이 점에 관하여, 항원-부호화 DNA로 면역화하기 위한 여러 기술이 설명되었다. 예를 들어, Felgner 등의 미국특허 제5,589,466호; Tang 등의 (1992) Nature 358:152; Davis 등의 (1993) Hum. Molec. Genet. 2:1847; Ulmer 등의 (1993) Science 258:1745; Wang 등의 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4156; Eisenbraun등의 (1993) DNA Cell Biol, 12:791; Fynan 등의 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:12476; Fuller 등의 (1994) AIDS Res. Human Retrovir. 10:1433과; Raz 등의 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519를 참조바란다. 리포솜매개 유전자전달과 같은 숙주에 연속 재주입하기 위하여 생체내의 세포에 핵산분자를 공급하기 위한 일반적인 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, Hazinski 등의 (1991) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 4:206-209; Brigham 등의 (1989) Am. J. Med. Sci. 298:278-281; Canonico 등의 (1991) Clin. Res. 39:219A와; Nabel 등의 (1990) Science 249:1285-1288을 참조바란다. 이와 같이, 핵산백신조성물은 다양한 공지의 기술을 이용하여 액상 또는 입자형태로 공급될 수 있다. 전형적인 백신조성물은 이후 상세히 설명된다.

5. 단백질기초형 면역화방법

또한 펩티드기초형 백신조성물이 전문가에게 잘 알려진 여러 방법을 이용하여 생산될 수 있다. 특히 미오스태틴 면역원은 표준정제기술을 이용하여 천연자원으로부터 직접 분리될 수 있다. 또한, 면역원은 상기 언급된 핵산발현시스템을 이용하여 재조합적으로 생산되고 공지의 기술을 이용하여 정제될 수 있다. 펩티드면역원은 상기 언급된 아미노산서열 또는 고체상 펩티드합성과 같은 화학적인 중합체합성방법을 이용하여 대상의 분자의 DNA 서열로부터 유도된 아미노산서열에 기초하여 합성될 수 있다. 이러한 방법은 당해 전문가에게 잘 알려진 것이다. 예를 들어, 고체상 펩티드합성기술에 대한 J. M. Stewart 와 J. D. Young의 Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL(1984)과, G. Barany와 R. B. Merrifield, The Peptide: Analysis, Synthesis, Biology, editors E. Gross and J. Meienhofer, Vol. 2, Axademic Press, New York, (1980), pp 3-254와; 고전적인 용액합성에 대한 M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984)과, E. Gross와 J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis Biology, supra, Vol. 1을 참조바란다.

펩티드 면역원은 또한 이를 위한 코드서열을 적당한 발현벡터 Ehss 레플리콘으로 클론화하여 제조될 수 있다. 전문가에게는 다수의 클론벡터가 알려져 있으며, 적당한 클론벡터의 선택은 선택의 문제이다. 클론화를 위한 재조합체 DNA 벡터와 이들이 형질전환할 수 있는 숙주세초의 예는 `세균성파아지 람다(E. coli), pBR322(E. coli), pACYC177(E. coli), pKT230(그람음성균), pGV1106(그람음성균), pLAFR1(그람음성균), pME290(non-E. coli 그람음성균), pHV14(E. coli와 Bacillus subtilis), pBD9(Bacillus), pIJ61(Streptomyces), pUC6(Streptomyces), YIp5(Saccharomyces), YCp19(Saccharomyces)와, 소 유두종바이러스(포유류세포)를 포함한다. DNA Cloning: Vols. I ＆ II, supra; Sambrook 등 supra; B. Perbal, supra를 참조바란다.

예를 들어, 쥐, 래트, 사람, 비비, 소, 돼지, 양, 닭 및 칠면조를 포함하는 다수의 척추동물로부터의 미오스태틴을 위한 코드서열이 결정되었다. 예를 들어 마우스 미오스태틴의 뉴클레오티드서열에 대한 미국특허 제5,827,733호와 NCBI 접수번호 U84OC5; 사람의 미오스태틴의 뉴클레오티드서열에 대한 미국특허 제5,827,733호, 국제특허공보 WO 98/33887 및 NCBI 접수번호 AFO19627; 소 미오스태틴의 뉴클레어티드서열에 대한 본문의 도 16a, 극제특허공보 WO 99/02667과 째 98/33887 및 NCBI 접수번호 AFO19620; 제브라피시의 뉴클레오티드서열에 대한 NCBI 접수번호19626; 래트(NCBI 접수번호 AFO19624 참조), 비비(NCBI 접수번호 AFO19619 참조), 돼지(NCBI 접수번호 AFO19623 참조), 양(NCBI 접수번호 AFO19622 참조), 닭(NCBI 접수번호 AFO19621 참조) 및 칠면조(NCBI 접수번호 AFO19625 참조) 미오스태틴의 뉴클레오드서열에 대한 국제특허공보 WO 98/33887을 참조바란다. 미오스태틴서열은 이들 모든 종을 통하여 보존되고 있다.

요구된 미오스태틴 펩티드를 부호화한 이들 서열의 부분과, 요구된 경우 담체단백질을 부호화한 서열은 잘 알려진 재조합기술을 이용하여 클론화되고 분리되며 함께 결합된다. Sambrook 등의 supra를 참조바란다.

유전자는 촉진인자, 리보솜 결합사이트(세균발현을 위하여)와, 선택적으로 작동인자의 제어하에 배치되어 대상의 DNA 서열이 적당한 전환체에 의하여 RNA로 전사된다. 코드서열은 신호펩티드 또는 리더서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 펩티드 면역원은 예를 들어 E. coli tac 촉진인자 또는 단백질 A 유전자(spa) 촉진인자와 신호서열을 이용하여 발현될 수 있다. 리더서열은 번역후 프로세싱의 세균성 숙주에 의하여 제거될 수 있다. 미국특허 제4,431,739호, 제4,425,437호 및 제4,338,397호를 참조바란다. 상기 언급된 바와 같은 보조서열이 존재할 수 있다.

제어서열에 부가하여, 숙주세포의 성장에 대한 면역원서열의 발현의 조절이 이루어지도록 하는 조절서열을 부가하는 것이 바람직하다. 조절서열은 잘 알려진 것으로, 그 예로서는 조절화합물의 실재를 포함하여 화학적이고 물리적인 자극에 따라 유전자의 발현이 이루어지거나 이루어지지 않도록 하는 것을 포함한다. 다른 형태의 조절인자는 벡터, 예를 들어 증강구조서열에 존재할 수 있다.

발현벡터는 특정 코드서열이 적당한 조절서열을 갖는 벡터내에배치되게 구성되며, 제어서열에 대한 코드서열의 배치 및 배향은 코드서열이 제어서열의 "제어"하에 전사될 수 있게 되어 있다(즉, 제어서열에서 DNA 분자에 결합된 RNA 중합효소가 코드서열을 전사한다). 특정 미오스태틴 면역원을 부호화한 서열의 수정은 이를 달성하는데 바람직한 것이다. 예를 들어, 어떤 경우에 있어서, 서열을 수정하여, 즉, 해독구조를 유지하기 위하여 적당한 배향으로 조절서열에 부착될 수 있도록 하는 것이 필요하다. 제어서열과 다른 조절서열이 상기 언급된 클론벡터와 같이 벡터에 삽입되기 전에 코드서열에 결합된다. 또한, 코드서열은 이미 제어서열과 적당한 제한사이트를 갖는 발현벡터에 직접클론화될 수 있다.

일부의 경우에 있어서, 분비신호의 분할이 연속하는 숙주생물체로부터 면역원의 분비가 이루어질 수 있도록 하는 서열을 부가하는 것이 바람직하다. 또한, 면역원의 변이체 또는 유사체를 생성하는 것이 바람직하다. 변이체 또는 유사체는 면역원을 부호화하는 서열의 일부, 또는 존재하는 경우, 서열의 삽입 또는 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 치환함으로서 요구된 담체분자를 부호화하는 서열의 일부를 삭제함으로서 얻을 수 있다. 부위특이적 변이유발과 같은 뉴클레오티드서열을 수정하는 기술은 전문가에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, Sambrook 등의 supra; DNA Cloning, Vols. I and II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra; Kunkel, T.A. Proc. Natl. Avad. Sci. USA (1985) 82:448; Geisselsoder 등의 BioTechiques (1987) 5:786; Zoller and Smith, Methods Enzymol. (1983) 100:468; Dalbie-McFarland 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79:6409를 참조바란다.

미오스태틴 면역원은 잘 알려진 바와 같이 곤충, 포유동물, 세균, 바이러스 및 효묘발현시스템을 포함하는 광범위한 시스템에서 발현될 수 있다. 예를 들어 바큘로바이러스시스템과 같이 곤충세포발현시스템이 전문가에게 알려져 있으며, 예를 들어 Summers와 Smith의 Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)에 기술되어 있다. 바큘로바이러스/곤충세포발현을 위한 물질과 방법은 San Diego CA의 Invitrogen으로부터 키트형태로 입수가능하다("MaxBac" 키트). 마찬가지로, 세균 및 포유동물세포 발현시스템이 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Sambrook 등의 supra에 상세히 기술되어 있다. 효모발현시스템도 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Yeast Genetic Engineering (Barr 등, eds. 1989) Butterworths, London에 기술되어 있다.

상기 시스템에 사용하기 위한 다수의 적당한 숙주세포도 알려져 있다. 예를 들어, 포유동물 세포주가 알려져 있으며, 차이니스 햄스터난소(CHO)세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터신장(BHK)세포, 원숭이신장세포(COS), 사람 간세포암종세포(예를 들어, Hep G2), 마딘-다비 소신장("MDBK")세포 등과 같은 American Type Culture Collection(ATCC)로부터 입수가능한 불사화 세포주를 포함한다. 마찬가지로, E. Coli, Basillus subtilis 및 Streptococcus spp.와 같은 세균성 숙주가 본 발명의 발현구조로 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 효모숙주는 Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe 및 Yarrowia lipolytica를 포함한다. 바큘로바이로스발현 벡터에 사용하기 위한 곤충세포는 Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda 및 Trichoplusiani를 포함한다.

선택된 발현시스템과 숙주에 따라서, 미오스태틴 면역원은 면역원이 발현되는 조건하에서 상기 언급된 발현벡터에 의하여 전환된 숙주세포를 성장시킴으로서 생성될 수 있다. 그리고 발현된 면역원은 숙주세포로부터 분리되고 정제된다. 만약 발현시스템이 성장매체에 면역원을 분비한다면 그 생성물은 매체로부터 직접 정제될 수 있다. 만약 분비되지 않는다면, 세포여액으로부터 분리될 수 있다. 적당한 성장조건과 회수방법의 선택은 전문가의 몫이다.

담체의 결합여부에 관계없이 미오스태틴 펩티드는 이를 얻었을 때 척추동물에서 항체생성물의 유발을 위하여 이후 상세히 설명되는 백신조성물과 같은 백신조성물로 제조될 수 있다.

6. 항체생성물

본 발명의 미오스태틴 펩티드는 수동면역화방법에 이용하기 위하여 또는 면역정제 또는 면역진단의 목적을 위한 항체를 발생하는데 사용될 수 있다. 전형적으로, 항체생성에 유용한 펩티드는 길이가 적어도 약 3-5인 아미노산, 좋기로는 7-10인 아미노산, 가장 좋기로는 적어도 약 10-15인 아미노산일 수 있다.

대상체 면역원에 대한 항체는 문제의 대상분자에 대하여 특이성을 갖는 폴리클로날 및 모노클로날 항체제제, 단일특이성 항혈청과, 하이브리드 항체, 변성항체, F(ab')₂프라그먼트, F(ab) 프라그먼트, Fv 프라그먼트, 단일영역 항체, 키메라 항체, 인체항체 및 그 기능프라그먼트를 포함하는 제제를 포함한다. 예를 들어, 항체는 문제의 분자에 대한 특이성을 갖는 가변영역 또는 가변영역의 프라그먼트를 포함할 수 있다. 항체의 나머지부분은 항체가 사용될 종으로부터 유도될 수 있다. 이와 같이, 항체가 사람에 사용되는 경우, 항체는 면역원성을 감소시키면서 활성은 그대로 유지하기 위하여 "인체적응화"될 수 있다. 키메라 항체에 대한 것은 예를 들어 Winter G.와 Milstein C. (1991) Nature 349:293-299; Jones P. T. 등의 (1986) Nature 321:522-525; Riechmann L. 등의 (1988) 332:323-327; Carter P. 등의 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289를 참조바란다. 이러한 키메라 항체는 대상의 분자를 위한 조합사이트를 포함할 뿐만아니라 다른 단백질을 위한 결합사이트를 포함한다, 이와 같이 함으로서, 2가성 시약이 외부 또는 내부 항원에 대하여 대상의 특이성으로 발생될 수 있다.

만약 폴리클로날 항체가 요구되는 경우, 선택된 포유동물(예를 들어 쥐, 토끼, 염소, 말 등)이 상기 언급된 바와 같은 요구된 항원, 또는 그 프라그먼트 또는 변이된 항원으로 면역화된다. 면역화 전에 특정 면역원의 면역원성을 더욱 증가시키는 것이 바람직하다. 이는 전문가에게 알려진 여러 가지 방법 중의 하나에 의하여 수행될 수 있다.

예를 들어, 항체생성을 위한 면역화는 일반적으로 생리식염수와 같은 적당한 부형제에서, 좋기로는 프로인트 완전면역조성제 또는 이후 설명되는 면역조성제에서 단백질을 혼합 또는 에멀존화하고 혼합물 또는 에멀존을 비경구적으로 주입(통상 피하주입 또는 근육내 주입)하여 수행된다. 동물은 프로인트 불완전 면역조성제 등을 이용하여 생리식염수의 단백질을 1회 이상 주입후 2-6주간 상승되었다. 항체는 잘 알려진 방법을 이용하여 생체외 면역화에 의하여 발생될 수 있다. 그리고 폴리클로날 항혈청이 면역화된 동물로부터 얻어지며 알려진 과정을 통하여 처리된다. 예를 들어 Jurgens 등의 (1985) J. Chrom. 348:363-370을 참조바란다. 만약 폴리클로날 항체를 포함하는 혈청이 사용되는 경우 폴리클로날 항체는 잘 알려진 방법을 이용하여 면역친화성 크로마토그라피에 의하여 정제될 수 있다.

일반적으로 모노클로날 항체는 Kohler와 Milstein의 방법, Nature (1975) 256:495-96 또는 그 수정방법을 이용하여 얻을 수 있다. 전형적으로, 쥐 또는 래트가 상기 언급된 바와 같이 면역화된다. 그러나, 혈청을 추출하기 위하여 동물의 피를 뽑는 대신에 비장(선택적으로 다수의 림프절)이 제거되고 단일세포로 해리된다. 요구된 경우, 비장세포는 단백질항원으로 도포된 평판 또는 오목판에 세포현탁액을 적가하여 여과시킬 수 있다(비특이성 부착세포를 제거한 후). 항원에 대하여 세포표면결합성 면역글로블린을 발현하는 B-세포는 평판에 결합되어 현탁액의 나머지 부분에 의하여 세척되지 않을 것이다. 그 결과의 B-세포 또는 해리되지 않은 모든 비장세포는 하이브리도마를 형성토록 골수종세포에 융합되도록 유도되며 선택매체(예를 들어 하이포잔틴, 아미노프테린, 티미딘매체, "HAT")에서 배양된다. 이로써 얻은 하이브리도마는 한계희석방법에 의하여 도포되고 특히 면역화 항원에 대하여 결합(관련없는 항원에는 결합되지 않음)하는 항체의 생산을 위하여 분석된다. 그리고 선택된 모노클로날 항체분비 하이브리도마가 생체외(예를 들어 조직배양용 병 또는 중공형 섬유반응기), 또는 생체내(쥐의 복수)에서 배양된다. 예를 들어, M. Schreiter 등의 Hybridoma Techniques (1980); Hammerling 등의 Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (1981); Kennett 등의 Monoclonal Antibodies (1980); 또한 미국특허 제4,341,761호, 제4,399,121호, 제4,427,783호, 제4,444,887호, 제4,452,570호, 제4,466,917호, 제4,472,500호, 제4,491,632호 및 제4,493,890호를 참조바란다. 대상의 미오스태틴 펩티드 또는 그 프라그먼트에 대하여 생성된 모노클로날 항체의 패널은 다양한 특성, 즉 이소타입, 에피토프, 친화성에 대하여 스크린된다.

항체의 기능프라그먼트는 대상의 미오스태틴 펩티드에 대하여 만들어질 수 있고 F(ab')₂프라그먼트를 생성토록 예를 들어 펩신을 이용하여 항체분자로부터 항원결합을 이행치 않는 불변부를 분할함으로서 생성될 수 있다. 이들 프라그먼트는 두 항원결합사이트를 가지나 각 중쇄로부터 불변부의 일부가 없다. 마찬가지로, 만약 요구되는 경우, 단일항원결합사이트로 구성되는 Fab 프라그먼트가 예를 들어 파파인을 갖는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체의 가수분해에 의하여 생성될 수 있다. 중쇄 및 경쇄의 가변영역만을 갖는 기능프라그먼트는 표준기술을 이용하여 생성될 수 있다. 이들 프라그먼트는 Fv로서 알려져 있다.

키메라 또는 인체항체는 또한 본 발명의 면역원을 이용하여 생성될 수 있다. 이들 항체는 전형적으로 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 존재하는 이종정수와 종특이성 프레임워크 가변영역에 기인하는 원치않는 면역반응을 최소화하도록 되어 있다. 예를 들어, 항체가 사람에 대하여 사용되어야 하는 경우, 키메라항체는 잘 알려진 기술을 이용하여 중쇄 또는 경쇄, 또는 이들 모두에서 비인체 불변부를 인체불변부로 대체하여 생성될 수 있다. 예를 들어, Winter G. 및 Milstein C.의 (1991) Nature 349:293-299; Jones P. T. 등의 (1986) Nature 321:522-525; Riechmann L. 등의 (1988) 332:323-327; Carter P. 등의 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289를 참조바란다.

7. 백신조성물

상기 분자들이 생성되었을 때, 이들은 척추동물에 공급하기 위한 백신조성물로 만들어진다. 관련된 미오스태틴 분자는 이것만으로 투여되거나 약리학적으로 허용된 부형제와 혼합되어 투여된다. 적당한 부형제로서는 예를 들어 물, 생리식염수, 포도당, 글리세롤, 에탄올 등이 있다. 아울러, 부형제는 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 또는 백신의 효과를 높기기 위한 면역조성제와 같은 소량의 보조물질을 포함할 수 있다. 적당한 면역조성제는 이후 상세히 설명된다. 이러한 제형을 제조하는 실제의 방법은 전문가에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, Reminton's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton, Pennsyvanis, 18th edition, 1990을 참조바란다. 투여될 조성물 또는 제제는 치료 대상체의 요구된 면역화 상태를 얻기 위하여 적량의 미오스태틴 면역원을 포함할 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 백신조성물은 미오스태틴 면역원의 면역원성을 더욱 증가시키기 위한 면역조성제를 포함할 수 있다. 면역조성제는 예를 들어 유화제, 뮤라밀 디펩티드, 아브리딘, 수산화 알루미늄, 오일류, 사포닌 및 기타 알려진 다른 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유화제로서 작용하는 화합물은 천연 및 합성유화제와, 음이온성, 양이온성 및 비이온성 화합물을 포함한다. 합성화합물 중에서, 음이온성 유화제는 예를 들어 라우릴산 및 올레오산의 칼륨, 나트륨 및 암모늄염, 지방산의 칼슘, 마그네슘 및 알루미늄염(즉 금속비누),와 라우릴황산나트륨과 같은 유기설폰산염을 포함한다. 합성 양이온성 물질은 예를 들어 세틸트리메틸암모니아 브롬화물을 포함하는 반면에, 합성 비이온성 물질은 글리세롤 에스테르(에를 들어 글리세릴 모노스테아린산), 폴리옥시에틸렌 글리콜 에스테르와 에테르, 그리고 소르비탄 지방산 에스테르(예를 들어 소르비탄 모노팔미트산염)과 이들의 폴리옥시에틸렌 유도체(예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미트산염)을 예로 들 수 있다. 천연유화제로서는 아카시아, 젤라틴, 레시틴 및 콜레스테롤이 있다.

다른 적당한 면역조성제는 단순 오일, 오일혼합체, 유중수형 유제 및 수중유형 유제와 같은 오일성분으로 조성될 수 있다. 오일은 광물성 오일, 식물성 오일 또는 동물성 오일일 수 있다.광물성 오일, 또는 오일성분이 광물성 오일인 수중유형 유제가 좋다. 이 점에 관하여 "광물성 오일"은 증류기술을 통하여 광유로부터 얻은 액상 탄화수소의 혼합체로서 정의되며, 이 용어는 "액상 파라핀", "액상 와셀린" 및 "화이트 미네랄 오일"과 동의어이다. 또한 이 용어는 "라이트 미네랄 오일", 즉, 광유의 증류로얻을 수 있으나 화이트 미네랄 오일에 비하여 비중이 낮은 오일을 포함한다. 예를 들어, Reminton's Pharmaceutical Science, supra를 참조바란다. 특히 좋은 오일성분은 MVP Laboratories, Ralston, Nebraska로부터 입수가능한 상표명 "EMULSIGEN PLUS"의 수중유형 유제(라이트 미네랄 오일과, 0.05%의 포르마린 및 보존제로서 30mcg/mL의 겐타미신으로 구성됨), 또는 "EMULSIGEN PLUS" 면역조성제의 수정형태인 VSA-3 면역조성제가 있다. 적당한 동물성 오일은 예를 들어 상업적으로 입수가능한 대구간유, 북양가자미유, 청어유, 오랜지 로피유와 상어간유를 포함한다. 적당한 식물성 오일로서는 캐놀라유, 아몬드유, 면실유, 옥수수유, 올리브유, 피넛츠유, 잇꽃유, 참기름, 콩기름 등이 있다.

또한, 다수의 지방족 질소성 베이스가 백신조성물의 면역조성제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 공지의 면역조성제는 아민, 4급 암모늄화합물, 구아니딘, 벤즈아미딘 및 티오우로늄을 포함한다(Gall D. (1966) Immunology 11:369-386). 특정화합물로는 디메틸디옥트아데실암모늄 브롬화물(DDA)(Kodak로부터 입수가능함)과 N,N-디옥트아데실-N,N-비스(2-히드록시에틸)프로판디아민("마브리딘")을 포함한다. 면역조성제로서 DNA을 이용하는 것이 알려진 바 있다. 예를 들어, the Kodak Laboratory Chemicals Bulletin 56(1):1-5 (1986); Adv. Drug Deliv. Rev. 5(3):163-187 (1990); J. Controlled Release 7:123-132 (1988); Clin. Exp. Immunol. 78:(2)256-262 (1989); J. Immunol. Methods 97:(2)159-164 (1987); Immunology 58(2):245-250 (1986); 그리고 Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 68(3):201-208 (1982)를 참조바란다. 아브리딘도 역시 잘 알려진 면역조성제이다. 예를 들어, 일반적으로 N,N-고급알킬-N',N'-비스(2-히드록시에틸)프로판 디아민의 사용과 특히 백신조성제로서 아브리딘의 사용을 기술하고 있는 미국특허 제4,310,550호(Wolff, III 등)를 참조바란다. 또한 미국특허 제5,151,267호(Babiuk)와 Babiuk 등의 (1986) Virology 159:57-66에도 백신조성제로서 아브리딘의 사용이 언급되고 있다.

또한 본 발명의 백신조성물은 약리학적 물질, 사이토카인, 또는 기타 생체응답수식인자와 같은 보조물질을 포함할 수 있다. 다른 보조물질로서는 성장호르몬, 성장촉진제, 베타길항물질, 분배물질 및 항생제와 같은 중량이득, 근육질 또는 근육강도를 증가시키는 물질을 포함한다.

본 발명의 백신은 통상적으로 액상용액 또는 현탁액과 같은 주사형태 또는 주사전 액상담체의 용액 또는 현탁액으로서 적합한 고형체로서 만들어진다. 또한 이 제제는 리포솜담체 또는 특별히 사용되는 담체에 밀봉된 유화 또는 활성성분일 수 있다.

백신조성물은 또한 고형체의 형태로 만들어질 수 있다. 예를 들어, 고체입자상 제제가 상업적으로 입수가능한 바늘없는 주사장치로부터 공급될 수 있도록 만들어질 수 있다. 또한, 고형 도우즈 임플란트가 대상체에 이식용으로 제공될 수 있다. 제어 또는 지속형 방출제제가 사용될 수 있으며 미오스태틴 면역원을 리포솜, 에틸렌비닐 아세테이트 코폴리머 및 Hytrel™ 코폴리머와 같은 비재흡수성의 비투과성 폴리머, 히드로겔과 같은 팽창성 폴리머, 또는 콜라겐과 같은 재흡수성 폴리머와 재흡수성 봉합사를 제조하는데 사용되는 것과 같은 다중산 또는 폴리에스테르와 같은 담체에 결합시켜 만들어진다.

더욱이, 면역원은 중성 또는 염 형태의 백신조성물로 만들어질 수 있다. 약리학적으로 허용가능한 염으로서는 산 첨가염(활성폴리펩티드의 유리아미노기로 구성됨)을 포함하며 이는 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델릴산과 같은 유기산으로 구성될 수 있다. 유리카르복실기로부터 구성된 염은 예를 들어나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화 철과 같은 무기염기와, 이소프로필아민, 트리메틸아민 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등의 유기염기로부터 유도될 수 있다.

백신조성물은 유효량의 미오스태틴 면역원을 함유토록 조성되고, 정확한 양은 전문가에 의하여 용이하게 결정될 수 있으며, 그 양은 치료될 동물, 항체를 합성하는 동물면역계의 역량과, 요구된 미오스태틴의 면역중화도에 따라 달라진다. 본 발명의 목적을 위하여, 1회분의 주사용액 당 약 1μg-1mg, 좋기로는 약 5μg-200μg의 면역원을 포함하는 백신조성물이 투여시면역응답을 야기하는데 적합하여야 한다. 만약 펩티드담체 키메라가 사용되는 경우, 백신조성물의 담체에 대한 면역위의 비율은 이러한 분자를 구성토록 선택된 특정 담체와 면역원에 기초하여 달라질 수 있다. 효과적인 투여량은 투여량응답곡선을 확립하는 루우틴시행을 통하여 전문가에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

대상체는 적어도 1회 분량 또는 2회 이상의 분량으로 상기 언급된 백신조성물의 하나를 투여함으로서 면역된다. 더욱이, 동물은 면역상태를 유지하는데 요구된 분량으로 투여될 수 있다.

다른 약리학적 공급수단이 척추동물에 백신조성물을 공급하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 통상적인 바늘주시기, 스프링 또는 압축가스(공기)주입기(Smoot의 미국특허 제1,605,763호, Laurens의 미국특허 제3,788,315호, Clark 등의 미국특허 제3,853,125호, Morrow 등의 미국특허 제4,596,556호 및 Dunlap의 미국특허 제5,062,830호), 액체분사주입기(Scherer의 미국특허 제2,754,818호, Gordon의 미국특허 제3,330,276호 및 Lindmayer 등의 미국특허 제4,518,385호)와, 입자주입기(McCabe 등의 미국특허 제5,149,655호 및 Sanford 등의 미국특허 제5,204,253호)가 모두 백신조성물의 공급에 적합하다.

백신조성물은 대상체에 대하여 근육주사, 피하주사, 정맥주사 등으로 투여되는 것이 좋다. 만약 분사주입기가 사용되는 경우, 액상 백신조성물의 단일분사가 예를 들어 1200-1400PSI의 압력과 속도로 방출되어 표피에 개방부가 형성되고 면역화를 위한 적당한 깊이의 침투가 이루어진다.

다음은 본 발명을 수행하기 위한 특정 실시형태의 실시예를 든 것이다. 이들 실시예는 다만 설명을 위하여 제공되는 것으로 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.

C. 실험

실시예 1

면역원 미오스태틴 펩티드의 확인

소 미오스태틴 분자의 다수 영역이 여러 컴퓨터 프로그램을 이용하여 전장 분자의 컴퓨터분석에 기초하여 잠재 면역원으로서 확인되었다. 이용된 하나의 프로그램은 각 20개 아미노산의 소수 및 친수특성에 기초하여 단백질의 아미노산서열로부터 하이드로파시 스케일을 공식화한다. 예를 들어 Hopp and Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78:3824-3828을 참조바란다. 도 17은 6개 아미노산의 평균그룹길이를 이용하여 계산된 친수성의 형태를 보인 것이다. 미오스태틴 분자의 친수성의 3개 최고점은 단백질분해 분할사이트에 걸쳐 있고 아미노산 서열 Lys-Arg-Ser-Arg-Arg-Asp (SEQ ID NO:37)를 갖는 아미노산 위치263-268, 아미노산 서열 Lys-Glu-Asn-Val-Glu-Lys-Glu (SEQ ID NO:38)을 갖는 위치 31-37과, 아미노산 서열 Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO:39)를 갖는 위치 106-111에서 확인되었다.

또한 단백질의 분석은 프로그램 PC/Gene, Release 6.60 (Intelligenetics Inc., Geneva, Switzerland)을 이용하여 수행되었다. 미오스태틴 단백질의 3차원 분석은 Swiss-Pdb Viewer v2.6(http://expasy.hcuge.ch/spdbv/mainpage.html)을 이용하여 유도되었다.

이러한 정보로부터, 일련의 대표적인 DNA 올리고머가 설계되고 포스포라미디트 화학을 이용하는 Beckman Oligo 1000M DNA 합성기로 구성되었다. 올리고머는 MYOS 1-20으로 ??명되었다. Moys 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17과 19(각각 도 1-도 11에서 보임)는 DNA의 코드 스트랜드의 일부를 포함하는 반면에 Moys 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18과 20은 보상스트랜드의 부분을 포함한다. 전장 미오스태틴 분자에 대한 이들 펩티드의 위치는 도 12에 도시되어 있다.

DNA 올리고머는 12-23개의 아미노산을 갖는 펩티드에 대하여 부호화되고 담체분자에 연결토록 2개의 아미노산 링커에 의하여 연결되었다(이후 상세히 설명됨). 이들 펩티드는 집약적으로 단백질의 전체 활성부분과, 활성단백질을 방출하는 단백질분해 분할사이트의 상류측 3개의 각 부분을 나타낸다.

특히, 컴퓨터분석에 기초하여, 활성단백질의 3개 부분은 1차면역타킷으로 선택되었다. 제1부분은 MYOS1과 2로 지정된 올리고뉴클레오티드 쌍을 조합하여 구성되며 단백질분해 분할사이트와 활성단백질의 N-말단을 포함한다. MYOS 1은 Hopp and Woods 컴퓨터 프로그램을 이용하여 최고항원결정인자비율을 제공한다(도 17 참조). 미오스태틴의 활성부분의 3차원분석은 MYOS 1 펩티드가 단백질표면으로 노출되어 면역계에 의하여 보여질 수 있음을 보이고 있다. MYOS 1은 단백질분해 분할사이트에 중복되어 단백질의 활성부분을 방출한다. 항체를 이용하여 이 사이트를 차단함으로서 단백질의 분할을 방지하고 근육조직에 대한 그 효과를 방지하기 위하여 단백질의 활성부분을 방출한다.

활성단백질의 다른 두 세그먼트(MYOS 5와 6 그리고 MYOS 9와 10)는 이들이 3차원 구조분석에 기초하여 루우프와 나선을 형성하는 것으로 보이므로 선택되었다. 이러한 루우프구조는 단백질표면에 노출되기 쉬워 면역계에 의하여 보여질 수 있다. 분자의 이들 부분에 대하여 발생된 항체는 미오스태틴 단백질에 결합하고 이를 순환구조로부터 분리한다. 단백질의 나머지 활성부분은 올리고뉴클레오티드 쌍(MYOS 3과 4, MYOS 7과 8, MYOS 11과 12, MYOS 13과 14)로부터 재구성된다. 전체 활성부분을 이용함으로서 효과적인 면역응답을 유발하는 적절한 3차원 구조가 이루어질 수 있도록 한다. 단백질의 활성부분의 상류측 영역의 하나(MYOS 15와 16)가 항원 에프토프의 컴퓨터분석에 기초하여 선택되었다. 단백질의 다른 두 상류측 부분은 단백질분해 분할사이트(분할사이트와 이 분할사이트의 직상류측 아미노산을 포함하는 MYOS 19와 20)를 포함하거나 또는 이를 근접시켜(MYOS 17과 18) 이 사이트에 결합된 항체가 프로티아제활성을 방해하도록 선택되었다.

다른 알려진 단백질서열과 비교하였을 때, 미오스태틴은 다른 형질전환 성장인자 β 단백질과 상동의 영역을 갖는다. 뼈 형태형성 단백질 6 (BMP-6)는 미오스태틴의 활성부분의 중간 및 C-말단 영역에 대하여 큰 상동성을 갖는다.

실시예 2

pCB150의 구조

상기 올리고머는 본문에서 "LKT114"로 명명된 52 kDa 류코톡신(LKT) 담체단백질에 융합될 수 있게 되어 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 미국특허 제5,837,268호에 기술된 바와 같이 플라스미드 pCB114에 존재하는 1ktA 유전자로부터 유도되었다. 이러한 플라스믹드, 이 유전자의 뉴클레오티드서열과, 해당 아미노산서열이 도 15a-도 15d에 보이고 있으며 역시 미국특허 제5,837,268호에 기술되어 있다. 유전자는 약 1300bp 길이의 내부 DNA 프라그먼트를 분리함으로서 플라스미드 pAA352(ATCC 접수번호 68283, 미국특허 제5,476,657에 기술됨)에 존재하는 재조합체 류코톡신 유전자로부터 발전된 류코톡신의 단축버전을 부호화한다. LKT 114 폴리펩티드는 평가된 분자량이 52 kDa이며 본 발명의 융합단백질의 생산에 사용하기 위한 통상적인 제한사이트를 포함한다.

MYOS 올리고뉴클레오티드가 클론화되는 LKT 114에 대한 코드서열을 포함하는 플라스미드 pCB150가 다음과 같이 제조되었다. 류코톡신 유전자는 미국특허 제5,476,657호와 제5,837,268호에 기술된 바와 같이 분리되었다. 특히, 류코톡신 유전자를 분리하기 위하여, P. haemolytica A1(균주 B122)의 유전자 라이브러리가 표준시술을 이용하여 구성되었다. Lo 등의 Infect. Immun., supra; DNA CLONING: Vols. I and II, supra와; Sambrook 등의 supra를 참조바란다. 게놈 라이브러리가 플라스미드 벡터 pUC13에 구성되고 DNA 라이브러리가 세균성파지 람다 gt11에 구성되었다. 그 결과의 클론은 E. coli를 형질전환시키는데 사용되었으며 각 콜로니는 P. haemolytica가 생존되고 항류코톡신 항체레벨을 증가시키기 위하여 P. haemolytica의 농축배양상청액으로 증강된 소의 혈청과 반응토록 모아져 여과된다. 포지티브 콜로니가 세포여액을 소 호중구로 배양하고 이로부터 유산탈수소효소의 방출을 측정하여 류코톡신을 생성하도록 여과되었다.

여러 포지티브 콜로니가 확인되었으며 이들 재조합체가 제한엔도뉴클레아제 맵핑에 의하여 분석되었다. 하나의 클론이 이전에 클론화된 류코톡신 유전자와 동일한 것으로 보였다. Lo 등의 Infect. Immun., supra를 참조바란다. 이를 확인하기 위하여 소량의 프라그먼트가 재클론화되었으며 제한 맵이 비교되었다. 그 결과, 약 4 킬로베이스 쌍의 DNA가 클론화되었음이 측정되었다. 약 8 kb 길이의 전장 재조합체를 분리하기 위하여 점진적으로 다량의 클론이 염색체보행(5'로부터 3' 방향으로)을 수행함으로서 분리되었다. 최종 구조가 pAA114로 명명되었다. 이 구조는 전체 류코톡신 유전자서열을 포함한다.

전체 류코톡신 유전자를 포함하는 pAA114로 부터의 1ktA의 MaeI 제한엔도뉴클레아제 프라그먼트가 DNA 폴리머라제 I 플러스 뉴클레오티드 삼중인산염의 Klenow 프라그먼트로 처리되고 클론화 벡터 pUC13의 SmaI 사이트에 결합되었다. 이 플라스미드는 pAA179로 명명되었다. 이로부터, 두 발현구조가 SmaI로 분해된 ptac-베이스형 벡터 pGH432:lacI에서 만들어졌다. 상기 언급된 바와 같이, 하나는 1kta 유전자의 5'-AhaIII 프라그먼트로 구성된 pAA342이고 다른 하나는 전체 MaeI 프라그먼트를 포함하는 pAA345이다.클론 pAA342는 높은 레벨에서 절단형 류코톡신 펩티드를 발현하고 pAA345는 매우 낮은 레벨에서 전장의 류코톡신을 발현한다. 따라서, 1ktA 유전자의 3' 말단(pAA345로부터의 SryI BamHI)은 플라스미드 pAA352를 생성하는 StyI BamI 분해형 pAA342에 결합된다. pAA352 구조로부터 발생된 P. haemolytica 류코톡신은 이후 LKT 352라 하였다.

그리고 플라스미드 pAA352는 재조합체류코톡신 폴리펩티드의 단축버전을 생산하는데 사용되었다. 단축형 LKT 유전자는 다음과 같이 재조합체 LKT 유전자로부터 약 1300bp 길이의 내부 DNA 프라그먼트를 제거함으로서 발생되었다. LKT 352 폴리펩티드를 포함하는 플라스미드 pCB113(ATCC 접수번호 69749, 미국특허 제5,837,268에 기술됨)이 제한효소 BstB1(New England Biolabs)로 분해되었다. 그리고 그 결과의 직선형 플라스미드가 BstB1 분해에 의하여 발생된 단쇄돌출터미니를 제거하기 위하여 녹두 뉴클레오티드(Pharmacia)로 분해되었다. 그리고 블런트 DNA가 제한효소 NaeI(New England Biolabs)로 분해되었으며, 분해된 DNA가 1%의 아가로스겔에 투입되고 여기에서 DNA 프라그먼트가 전기영동으로 분리되었다. 약 6190bp의 대형 DNA 프라그먼트가 분리되고 유전자 클린 키트(Bio 101)을 이용하여 아가로스겔로부터 정제되었으며, 정제된 프라그먼트가 세균성파지 T4 DNA 리가아제(Pharmacia)를 이용하여 결합되게 허용되었다. 그 결과의 결합혼합체는 수용 E. coli JM105 세포를 형질전환시키는데 사용되었으며, 포지티브 클론이 적당한 분자량을 갖는 응집단백질을 생성토록 하는 이들의 능력에 의하여 확인되었다. 이와 같이 형성된 재조합체 플라스미드는 pCB114로 정하였으며(미국특허 제5,837,268에 기술됨), "LKT114"로 명명된 단축형 류코톡신 폴리펩티드를 생성한다.

그리고 플라스미드 pCB114는 플라스미드 pSLKT-30을 생성하는데 사용되었다. 플라스미드 pSLKT-30는 PCR에 의하여 pCB114로부터의 류코톡신 부호화 프라그먼트를 플라스미드 pAA352(ATCC 접수번호 68283, 미국특허 제5,476,657에 기술됨)로 클론화함으로서 만들어졌다. 이와 같이 함으로서, C-말단에 근접하여 변이가 도입되고 그 결과 두 개의 아미노산이 미변질 류코톡신 분자로 변환하였다. 이와 같이, 영향영역의 PCR 프라그먼트는 다시 플라스미드 pSLKT-30으로 클론화되었다. 특히, pSLKT-30으로부터의 프라그먼트는 상류 PCR 프라이머로서 LKT6 (SEQ ID NO:40)과 하류 PCR 프라이머로서 LKT13 (SEQ ID NO:41)을 이용하여 PCR에 의하여 생성되었다.

LKT6: TTA GAG AGT TAT GCC GAA CGC (SEQ ID NO:40)

LKT13: GAT GCC ATC GCT AGC TAG CTA GGA TCC CCT AGC AAA TTC

AAG AGA TAA ACT TTG ATC CAA CAT TGA (SEQ ID NO:41)

프라그먼트는 요구된 변화와 Nsi1 및 Nco1 제한사이트를 포함한다. 분리된 프라그먼트는 플라스미드 pSLKT-30과 같이 제한효소 Nsi1 와 Nco1를 이용하여 분해되었다. Nsi1/Nco1 프라그먼트는 플라스미드로부터 분리되고 PCR 프라그먼트로 대체되었으며, 그 변이의 결과는 본래의 서열로 되돌아갔다. 이 플라스미드는 pCB150으로 명명되었다. 플라스미드 pCB150의 다이아그램이 도 14에 도시되어 있다. 플라스미드 pCB150으로부터 LKT 114의 핵산서열이 도 15a-도 15d에 보이고 있다.

실시예 3

LKT-미오스태틴 펩티드 다량체융합의 구조

실시예 1에서 언급된 각 올리고머 쌍의 다수 복사는 LKT 114 유전자에 결합된 미오스태틴 펩티드 다량체를 위한 코드서열의 종렬반복을 얻기위하여 사용되었다. 단백질의 전체 활성부분은 재구성되고 면역제제로서 사용하기 위하여 LKT 114에 융합되었다.

대표적인 LKT-미오스태틴 펩티드융합체는 다음과 같이 구성되었다. 실시예 1로부터의 올리고뉴클레오티드 쌍이 어닐링되고 제한엔도뉴클레아제 HincII로 분해된 벡터 pUC19(Pharmacia)에 결합되었다. 결합된 DNA는 E. coli 균주 TOP10F'(Invitrogen)를 형질전환시키는데 사용되었다. 올리고뉴클레오티드 삽입체를 포함하는 전환체는 PCR과 제한엔도뉴클레아제 맴핑으로 확인되었다.

올리고뉴클레오티드 쌍들은 하나의 올리고뉴클레오티드 쌍의 선단의 BamHI 사이트를 제2복사의 올리고뉴클레오티드 쌍의 후단의 BglII 사이트에 결합함으로서 함께 연결되도록 지정되었다. 결합점의 제한사이트는 반복의 선단의 단일 BamHI 사이트와 반복의 후단의 단일 BglII 사이트를 남겨둘 수 없게 되어 있다. 각 올리고뉴클레오티드 쌍의 종렬반복은 삽입된 올리고뉴클레오티드 프라그먼트를 방출토록 제한엔도뉴클레아제 BamHI와 BglII를 갖는 올리고뉴클레오티드함유 플라스미드를 분해함으로서 구성된다. 그리고 이 프라그먼트는 제한엔도뉴클레아제 BglII로 분해되는 올리고뉴클레오티드함유 플라스미드에 다시 결합된다. 결합된 DNA는 E. coli 균주 TOP10F'를 형질전환시키는데 사용되었다. 올리고뉴클레오티드 삽입체의 반복을 포함하는 전환체는 PCR과 제한엔도뉴클레아제 맴핑으로 확인되었다. 이러한 과정은 적어도 4개의 반복복사와 정확한 배향의 각 올리고뉴클레오티드 쌍의8개까지의 복사를 포함하는 pUC19 플라스미드가 생성될 때까지 반복된다.

자체연결되는 것에 부가하여, 일부의 올리고뉴클레오티드 쌍은 또한 가능한 한 미오스태틴 단백질의 활성영역을 재생성하도록 서로 연결되게 지정되었다. 이는 pUC19 벡터의 올리고뉴클레오티드 쌍 MYOS 1/2 후측의 BglII 사이트로 BamHI, BglII 컷트 올리고뉴클레오티드 쌍 MYOS 3/4을 결합함으로서 수행되었다. 이후에 BstBI와 BglII가 컷트된 올리고뉴클레오티드 쌍 MYOS 5/6이 BstBI와 BglII가 컷트된 재구성 미오스태틴 활성영역을 포함하는 벡터에 결합되었다. 올리고뉴클레오티드 쌍 MYOS 7/8은 BamHI와 BglII가 컷트되고 BglII 사이트에서 재구성 미오스태틴 활성영역을 포함하는 벡터에 결합되었다. 벡터를 포함하는 올리고뉴클레오티드 쌍 MYOS 9/10은 EcoRI가 컷트되었으며 pUC19 미오스태틴 재구성으로부터의 EcoRI 프라그먼트가 결합되었다. 올리고뉴클레오티드 쌍 MYOS 11/12는 BamHI와 BglII가 컷트되고 BglII 사이트에서 재구성 미오스태틴 활성영역을 포함하는 벡터에 결합되었다. 이후에 BamHI와 BglII가 컷트된 올리고뉴클레오티드 쌍 MYOS 13/14가 BamHI와 BglII가 컷트된 재구성 미오스태틴 활성영역을 포함하는 벡터에 결합되었다. 이러한 과정은 미오스태틴 활성영역을 위한 코드서열의 재구성을 완료하며, 이는 위치 55-60, 139-144 및 241-246과 C-말단에서 미오스태틴 활성영역에 삽입된 3개 셋트의 두 아미노산 링커를 포함한다(도 13 참조).

각 올리고뉴클레오티드 쌍의 다중복사와 미오스태틴 활성영역 재구성이 제한엔도뉴클레아제 BamHI와 BglII의 분해에 의하여 pUC19 플라스미드로부터 방출된다. 이들 DNA 프라그먼트는 플라스미드 pUC150에 결합되었다. 플라스미드 pUC150은 제한엔도뉴클레아제 BamHI로 분해되었다. 결합된 DNA는 E. coli 균주 TOP10F'를 형질전환시키는데 사용되었다. 올리고뉴클레오티드 삽입체를 포함하는 전환체는 PCR과 제한엔도뉴클레아제 맴핑으로 확인되었다. 재조합체 플라스미드는 pJS121, pJS122, pJS123, pJS124, pJS125, pJS126, pJS127, pJS128, pJS129, pJS130 및 pCB317로 지정되었다.

플라스미드 pJS121은 LKT 114에 융합된 올리고뉴클레오티드 쌍 MYOS 1/2의 6개 반복복사를 포함한다. 플라스미드 pJS122는 LKT 114에 융합된 올리고뉴클레오티드 쌍 MYOS 3/4의 8개 반복복사를 포함한다. 플라스미드 pJS123은 LKT 114에 융합된 올리고뉴클레오티드 쌍 MYOS 5/6의 8개 반복복사를 포함한다. 플라스미드 pJS124는 LKT 114에 융합된 올리고뉴클레오티드 쌍 MYOS 7/8의 8개 반복복사를 포함한다. 플라스미드 pJS125는 LKT 114에 융합된 올리고뉴클레오티드 쌍 MYOS 9/10의 6개 반복복사를 포함한다. 플라스미드 pJS126은 LKT 114에 융합된 올리고뉴클레오티드 쌍 MYOS 11/12의 6개 반복복사를 포함한다. 플라스미드 pJS127은 LKT 114에 융합된 올리고뉴클레오티드 쌍 MYOS 13/14의 6개 반복복사를 포함한다. 플라스미드 pJS128은 LKT 114에 융합된 올리고뉴클레오티드 쌍 MYOS 15/16의 6개 반복복사를 포함한다. 플라스미드 pJS129는 LKT 114에 융합된 올리고뉴클레오티드 쌍 MYOS 17/18의 6개 반복복사를 포함한다. 플라스미드 pJS130은 LKT 114에 융합된 올리고뉴클레오티드 쌍 MYOS 19/20의 6개 반복복사를 포함한다. 플라스미드 pCB317은 LKT 114에 융합된 미오스태틴 활성영역 재구성의 단일복사를 포함한다.

실시예 4

LKT-미오스태틴 펩티드융합의 정제

상기로부터의 재조합체 LKT-미오스태틴 펩티드융합 단백질은 봉입체로서 발현되고 다음의 과정을 이용하여 정제된다. 각 동결주로부터 세포의 루우프가 50ml 엘렌마이어 플라스크의 10ml의 브로스에 접종되었다. TB 브로스에는 100μg/ml의 암피실린이 보충되고 250rpm의 Innova 4000 진탕기에서 12-16시간동안 37℃로 배양되었다. 그리고 1 ml의 1M IPTG(이소프로필-B,D-티오갈락토피라노시드)용액이 재조합체 단백질생성물을 유도하도록 배양체에 부가되었다. 배양체는 추가로 두 시간동안 배양되었다. Avanti J25 원심분리기의 JA 10 로타를 이용하여 3 x 500 ml의 폴리프로필렌 용기에서 10분 동안 6000rpm으로 원심분리하여 세포를 얻는다. 세포펠릿은 pH 8,0인 40 ml의 25% 자당 50mM 트리스-하이드로클로라이드에 재현탁되고 15분동안 -70℃로 동결된다. 동결된 세포는 실온으로 해동되고 10 ml의 라이소자임(Sigma, pH 8.0인 10 ml의 250 mM 트리스-하이드로클로라이드)과 혼합된다. 얼음 위에서 15분 동안 배양 후, 300 ml의 용균완충액(2% triton X100, 50mM EDTA, 100mM 트리스-하이드로클로라이드, pH 8.0)을 첨가하고 진동혼합한다. 그리고 용균된 세포현탁액이 Misonix 음파처리기의 프로우브로 최대출력에서 4X 30 초 버스트로 음파처리된다. 용액을 2X 250ml 원심분리용기에 나누고 JA 14 로타에서 10000 rpm으로 25분 동안 원심분리한다. 봉입체 펠릿이 100 ml의 이중증류수에 재현탁하고 원심분리하여 세척되어 봉입체가 수집된다. 이러한 세척과정은 한번 더 반복되고 최종 봉입체 펠릿이 10 ml의 이중증류수에 현탁되고 사용전까지 -20℃로 저장된다.

모든 분리된 융합단백질은 분자량으로 이들의 아이덴터티를 측정하고 알려진 표준에 이 단백질을 비교하여 농도와 순도를 측정토록 SDS-PAGE에 의하여 시험된다. 각 융합단백질의 일벙분량이 10μl의 8M 우레아에 용해되고 2μl의 용해된 단백질이 100μl의 1X SDS-PAGE 로딩완충액과 혼합된다. 로딩완충액 표본이 5분 동안 94℃로 가열되고 10% 폴리아크릴아미드 겔에 추가된다. pCB150으로부터의 재조합체 LKT 114가 조절용으로서 추가된다.

실시예 5

LKT-미오스태틴 펩티드 융합단백질의 생체내 생물학적 효과

생체내 생물학적 효과를 증명하기 위하여 담체단백질에 융합된 미오스태틴의 여러 펩티드의 다중복사로 구성된 융합단백질의 능력을 시험하기 위하여, 다음의 백신화 시험이 수행되었다. 재조합체 LKT-미오스태틴 펩티드 융합단백질이 상기 언급된 바와 같이 제조되었다. 각각에 대한 백신이 각 융합단백질을 최종농도의 6M 우레아(초기 주입용으로 사용됨) 또는 4M 가니딘-HCl에 용해하여 제조되었다. VSA-3 면역조성제의 2.5 ml(초기 2회의 주입용으로 사용됨) 또는 1,5 ml(최종 주입용으로 사용됨)의 일정분량에 1250μg의 각 용해된 단백질이 첨가되고 마이크로팁 프로우브를 갖는 Misonix 음파처리기로 출력을 5로 셋팅하여 5X5 초 버스트로 혼합되었다. 이들 혼합체에 대하여 최종 5ml의 체적에 50μl의 1% 티머로솔 용액과 pH 7.4의 PBH(인산완충액 식염수)가 첨가되고 다시 혼합물이 음파처리되었다. 각 주입시 200μl 체적이 사용되었다. 각 주입량에는 50μg의 융합단백질이 포함되어 있다. 이러한 초기주입은 3-4주에서 이루어졌고 28일과 56일에 후속 주입이 이루어졌다.

14개 처리그룹에는 15 CD1 스위스 쥐가 포함되었다. 이들 처리그룹은 다음과 같다(표1 참조). 그룹1은 백신화제어가 없었고, 그룹2는 면역조성제만을 제어하였으며, 그룹3은 pCB150 담체단백질이 제어되었고, 그룹4-13은 pJS121-pJS130 단백질 시험되었으며, 그룹14는 pCB317 단백질 시험되었다. 쥐는 98일간의 실험기간중에 체중이득을 측정하기 위하여 일주일마다 체중을 재었다. 이러한 시험의 결과가 표2와 도 18에 요약되었다. 가니딘-HCl은 백신조성에서 우레아보다 개선된 단백질안정도를 제공하는 것으로 보여 용해물질로 선택하여 사용되었다. VSA-3의 농도는 주입사이트반응을 줄이고자한 노력으로 백신조성에서 50%로부터 30%로 감소되었다.

처리그룹	Myos Oligo	플라스미드
1	-	-
2	-	-
3	-	pCB150
4	1	pJS121
5	3	pSJ122
6	5	pSJ123
7	7	pJS124
8	9	pJS125
9	11	pJS126
10	13	pJS127
11	15	pJS128
12	17	pJS129
13	19	pJS130
14	재구성	pCB317

처리그룹	0일 평균 그룹 체중±SEM	98일 평균 그룹 체중±SEM	84일을 통한 평균 그룹 체중±SEM
1 제어	16.67±0.32	29.33±0.71	12.67±0.65
2 제어	16.11±0.25	29.09±0.79	12.99±0.72
3 제어	16.05±0.34	29.33±0.70	13.27±0.61
4 시험	16.39±0.37	30.02±0.60	13.63±0.60
5 시험	15.52±0.35	30.48±0.84	14.96±0.72
6 시험	15.78±0.33	30.84±0.99	15.06±0.90
7 시험	15.72±0.27	30.36±0.76	14.64±0.65
8 시험	15.46±0.25	29.42±0.84	13.96±0.79
9 시험	15.32±0.32	29.48±0.54	14.16±0.50
10 시험	16.44±0.31	31.27±0.92	14.85±0.92
11 시험	16.30±0.41	31.02±0.70	14.72±0.75
12 시험	15.54±0.28	30.73±0.71	15.19±0.69
13 시험	15.57±0.30	31.04±0.96	15.47±0.99
14 시험	15.51±0.20	29.25±0.62	13.73±0.56

실시예 6

시험결과의 통계학적 분석

시험결과의 통계학적 분석은 통계소프트웨어 패키지(Statistix Version 1.0)를 이용하여 수행되었다. 이 시험에 있어서, 모든 제어그룹은 매우 유사한 평균 총중량을 가진 반면에 여러 시험그룹은 상승된 평균 총중량을 가졌다. 98일간의 실험을 통하여 체중이득의 일방향 ANOVA가 수행되었다. 평균시험의 LSD 비교에서는 처리그룹 13이 다른 제어그룹과는 현저한 차이를 보이는 것으로 나타났다. 시험그룹 12와 6은 3개 제어그룹중 두 그룹과 현처한 차이를 보였다.처리그룹은 또한 이들을 제어그룹(그룹 1-3)과 시험그룹(그룹 4-14)으로 나누어 분석되었다. 이들 두 그룹으로부터 체중이득의 일방향 ANOVA가 수행되었다. 평균시험의 LSD 비교에서는 시험처리된 그룹이이 제어그룹과는 현저한 차이를 보이는 것으로 나타났다.

본 발명의 실시에 유용한 균주의 기탁

다음 균주의 생물학적 순수배양의 기탁은 미국 버지니아주 매나사스 유니버시티 불바드 10801에 소재하는 American Type Culture Collection(ATCC)에 대하여 이루어졌다. 표시된 접수번호는 성공적인 생존도시험후에 부여된 것이며, 필요한 수수료가 납부되었다. 기탁은 특허절차 및 법규의 목적으로 미생물기탁의 국제적인 인정을 위한 부다페스트조약하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 그리고 수탁자에 의한 기탁표본의 공급을 위한 최근의 청구 후 적어도 5년간 생존배양물의 유지를 보장한다, 유기체는 미국 특허법 35 U.S.C. §122와 그 시행규칙(37 C.F.R. §1.12)에 따라 자격이 주어지는 미국특허청장에 의하여 결정된 자에 대하여 배양물의 영구적이고 비제한적인 이용을 보장한다. 특허가 허여된 후에는 기탁된 배양물의 공중에대한 이용가능성의 모든 제한은 제거될 것이다.

이들 기탁은 단순히 전문가에게 편리하도록 제공되는 것이며, 기탁이 35 U.S.C. §122하에 요구되는 것이 허용되지 않는다. 이들 플라스미드의 핵산서열과 이로써 부호화되는 폴리펩티드의 아미노산서열은 참조로 반영되었으며 본문의 설명과 상충되는 경우 조정된다. 허가는 기탁물질의 조제, 사용 또는 판매를 요구할 수 있으며 이러한 허가는 허여되지 않았다.

균주 기탁일 접수번호

pAA352 in E. coli W1485 1990.3.30 68283

pCB113 in E. coli JM105 1995.2.1 69749

이와 같이, 면역원 미오스태틴 펩티드, 다량체 및 면역접합체가 기술되었으며, 이들의 제조 및 이용방법이 기술되었다. 비록 본 발명의 우선실시형태들이 어느 정도 상세히 설명되었으나 본 발명은 그 기술사상이나 범위를 벗어남이 없이 변경이 있을 수 있다.

Claims

펩티드가 적어도 하나의 미오스태틴의 에피토프로 구성되는 약 3-100개의 아미노산으로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 1 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 약 3-30개의 아미노산으로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 1 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 약 3-15개의 아미노산으로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 1 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하는 아미노산 45-376 범위의 미오스태틴의 영역으로부터 유도됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 2 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하는 아미노산 45-376 범위의 미오스태틴의 영역으로부터 유도됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 4 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하는 아미노산 235-376 범위의 미오스태틴의 영역으로부터 유도됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 4 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 SEQ ID NO:4를 포함하는 아미노산 3-18, SEQ ID NO:6을 포함하는 아미노산 3-15, SEQ ID NO:8을 포함하는 아미노산 3-17, SEQ ID NO:10을 포함하는 아미노산 3-16, SEQ ID NO:12를 포함하는 아미노산 3-22, SEQ ID NO:14를 포함하는 아미노산 3-25, SEQ ID NO:16을 포함하는 아미노산 3-22, SEQ ID NO:20을 포함하는 아미노산 3-18과, SEQ ID NO:22를 포함하는 아미노산 3-18로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산서열로 구성된 펩티드에 대한 적어도 약 75%의 아미노산 아이덴터티을 가짐을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 7 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 SEQ ID NO:4를 포함하는 아미노산 3-18의 아미노산서열로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 7 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 SEQ ID NO:6을 포함하는 아미노산 3-15의 아미노산서열로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 7 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 SEQ ID NO:8을 포함하는 아미노산 3-17의 아미노산 서열로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 7 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 SEQ ID NO:10을 포함하는 아미노산 3-16의 아미노산 서열로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 7 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 SEQ ID NO:12를 포함하는 아미노산 3-22의 아미노산서열로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 7 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 SEQ ID NO:14를 포함하는 아미노산 3-25의 아미노산 서열로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 7 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 SEQ ID NO:16을 포함하는 아미노산 3-22의 아미노산 서열로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 7 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 SEQ ID NO:20을 포함하는 아미노산 3-18의 아미노산 서열로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 7 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 SEQ ID NO:22를 포함하는 아미노산 3-18의 아미노산 서열로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 1 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 아미노산 서열 Lys-Arg-Ser-Arg-Arg-Asp (SEQ ID NO:37)로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 2 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 아미노산 서열 Lys-Arg-Ser-Arg-Arg-Asp (SEQ ID NO:37)로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 1 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 아미노산 서열 Lys-Glu-Asn-Val-Glu-Lys-Glu (SEQ ID NO:38)로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 2 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 아미노산 서열 Lys-Glu-Asn-Val-Glu-Lys-Glu (SEQ ID NO:38)로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 1 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 아미노산 서열 Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO:39)로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 2 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 아미노산 서열 Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO:39)로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
펩티드가 적어도 하나의 미오스태틴 에피토프로 구성되는 약 3-200개의 아미노산으로 구성된 미오스태틴 펩티드에 있어서, 상기 펩티드가 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하는 아미노산 1-350범위의 미오스태틴의 영역, 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하는 아미노산 1-275 범위의 미오스태틴의 영역, 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하는 아미노산 25-325 범위의 미오스태틴의 영역, 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하는 아미노산 50-325 범위의 미오스태틴의 영역과, 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하는 아미노산 75-350 범위의 미오스태틴의 영역으로 구성된 그룹으로부터 선택된 미오스태틴 영역으로부터 유도됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 23 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 약 3-30개의 아미노산으로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 23 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 약 3-15개의 아미노산으로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 23 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 SEQ ID NO:18를 포함하는 아미노산 3-19의 아미노산 서열로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 23 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 아미노산 서열 Lys-Arg-Ser-Arg-Arg-Asp(SEQ ID NO:37)로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 24 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 아미노산 서열 Lys-Arg-Ser-Arg-Arg-Asp(SEQ ID NO:37)로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 23 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 아미노산 서열 Lys-Glu-Asn-Val-Glu-Lys-Glu(SEQ ID NO:38)로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 24 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 아미노산 서열 Lys-Glu-Asn-Val-Glu-Lys-Glu(SEQ ID NO:38)로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 23 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 아미노산 서열 Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Asp(SEQ ID NO:39)로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
제 24 항에 있어서, 상기 미오스태틴 펩티드가 아미노산 서열 Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Asp(SEQ ID NO:39)로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 펩티드.
둘 이상의 선택된 미오스태틴 면역원으로 구성되는 미오스태틴 다량체에 있어서, 각 상기 미오스테틴 면역원이 독립적으로 하나 이상의 미오스태틴 에피토프를 한정하는 적어도 3개의 아미노산으로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 다량체.
제 33 항에 있어서, 각 상기 미오스테틴 면역원이 독립적으로 약 3-200개의 아미노산으로 구성되고 하나 이상의 미오스태틴 에피토프로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 다량체.
제 33 항에 있어서, 각 상기 미오스테틴 면역원이 독립적으로 약 3-100개의 아미노산으로 구성되고 하나 이상의 미오스태틴 에피토프로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 다량체.
제 33 항에 있어서, 각 상기 미오스테틴 면역원이 독립적으로 약 3-30개의 아미노산으로 구성되고 하나 이상의 미오스태틴 에피토프로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 다량체.
제 33 항에 있어서, 각 상기 미오스테틴 면역원이 독립적으로 약 3-15개의 아미노산으로 구성되고 하나 이상의 미오스태틴 에피토프로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 다량체.
제 33 항에 있어서, 각 상기 미오스테틴 면역원이 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하는 아미노산 100-376 범위의 미오스태틴의 영역, 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하는 아미노산 235-376 범위의 미오스태틴의 영역, 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하는 아미노산 1-376 범위의 미오스태틴의 영역, 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하는 아미노산 1-350 범위의 미오스태틴의 영역, 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하는 아미노산 1-275 범위의 미오스태틴의 영역, 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하는 아미노산 25-300 범위의 미오스태틴의 영역, 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하는 아미노산 50-325 범위의 미오스태틴의 영역과, 도 1a-도 1d(SEQ ID NOS:27-36)를 포함하는 아미노산 75-350 범위의 미오스태틴의 영역으로 구성된 그룹으로부터 선택된 미오스태틴 영역으로부터 유도됨을 특징으로 하는 미오스태틴 다량체.
제 33 항에 있어서, 상기 각 미오스태틴 면역원이 SEQ ID NO:4를 포함하는 아미노산 3-18, SEQ ID NO:6을 포함하는 아미노산 3-15, SEQ ID NO:8을 포함하는 아미노산 3-17, SEQ ID NO:10을 포함하는 아미노산 3-16, SEQ ID NO:12를 포함하는 아미노산 3-22, SEQ ID NO:14를 포함하는 아미노산 3-25, SEQ ID NO:16을 포함하는 아미노산 3-22, SEQ ID NO:18을 포함하는 아미노산 3-19, SEQ ID NO:20을 포함하는 아미노산 3-18과, SEQ ID NO:22를 포함하는 아미노산 3-18로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 펩티드에 대한 적어도 약 75%의 아미노산 아이덴터티을 가짐을 특징으로 하는 미오스태틴 다량체.
제 33 항에 있어서, 적어도 하나의 상기 선택된 미오스태틴 면역원이 아미노산 서열 Lys-Arg-Ser-Arg-Arg-Asp(SEQ ID NO:37)로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 다량체.
제 34 항에 있어서, 적어도 하나의 상기 선택된 미오스태틴 면역원이 아미노산 서열 Lys-Arg-Ser-Arg-Arg-Asp(SEQ ID NO:37)로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 다량체.
제 33 항에 있어서, 적어도 하나의 상기 선택된 미오스태틴 면역원이 아미노산 서열 Lys-Glu-Asn-Val-Glu-Lys-Glu(SEQ ID NO:38)로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 다량체.
제 34 항에 있어서, 적어도 하나의 상기 선택된 미오스태틴 면역원이 아미노산 서열 Lys-Glu-Asn-Val-Glu-Lys-Glu(SEQ ID NO:38)로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 다량체.
제 33 항에 있어서, 적어도 하나의 상기 선택된 미오스태틴 면역원이 아미노산 서열 Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Asp(SEQ ID NO:39)로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 다량체.
제 34 항에 있어서, 적어도 하나의 상기 선택된 미오스태틴 면역원이 아미노산 서열 Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Asp(SEQ ID NO:39)로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 다량체.
제 33 항에 있어서, 다량체가 일반식 (MP-X-MP)y에 따른 분자로 구성되고, 여기에서 MP는 미오스태틴 펩티드이며, X는 펩티드결합, 아미노산 그룹, 류코톡신 폴리펩티드와, [MP]n(여기에서 n은 1 보다 크거나 같다)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되고, y는 1 보다 크거나 같음을 특징으로 하는 미오스태틴 다량체.
제 46 항에 있어서, X가 적어도 하나의 헬퍼 T-세포 에피토프를 포함하는 아미노산 스페이서그룹으로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 다량체.
제 46 항에 있어서, 다량체에 존재하는 미오스태틴 펩티드가 동일함을 특징으로 하는 미오스태틴 다량체.
제 46 항에 있어서, 다량체에 존재하는 미오스태틴 펩티드가 상이함을 특징으로 하는 미오스태틴 다량체.
면역담체에 결합된 청구항 제 1 항-제 49 항의 어느 하나에 따른 적어도 하나의 미오스태틴 펩티드 또는 미오스태틴 다량체로 구성됨을 특징으로 하는 미오스태틴 면역접합체.
제 50 항에 있어서, 면역담체가 류코톡신 폴리펩티드임을 특징으로 하는 미오스태틴 면역접합체.
청구항 제 1 항-제 49 항의 어느 하나에 따른 미오스태틴 펩티드 또는 미오스태틴 다량체와 약학적으로 허용가능한 부형제로 구성됨을 특징으로 하는 백신조성물.
청구항 제 50 항에 따른 미오스태틴 면역접합체와 약학적으로 허용가능한 부형제로 구성됨을 특징으로 하는 백신조성물.
청구항 제 51 항에 따른 미오스태틴 면역접합체와 약학적으로 허용가능한 부형제로 구성됨을 특징으로 하는 백신조성물.
제 52 항에 있어서, 면역조성제가 구성되어 있음을 특징으로 하는 백신조성물.
제 53 항에 있어서, 면역조성제가 구성되어 있음을 특징으로 하는 백신조성물.
제 54 항에 있어서, 면역조성제가 구성되어 있음을 특징으로 하는 백신조성물.
청구항 제 52 항의 백신조성물을 척추동물에 투여하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 척추동물의 미오스태틴 면역원에 대한 면역응답을 유발하는 방법.
청구항 제 53 항의 백신조성물을 척추동물에 투여하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 척추동물의 미오스태틴 면역원에 대한 면역응답을 유발하는 방법.
청구항 제 54 항의 백신조성물을 척추동물에 투여하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 척추동물의 미오스태틴 면역원에 대한 면역응답을 유발하는 방법.
제 58 항에 있어서, 유발된 면역응답이 상기 척추동물내에서 내인성 미오스태틴활성을 감소시키며, 적어도 하나의 다음과 같은 생물학적 효과를 보임을 특징으로 하는 방법.

(a) 체중의 증가;

(b) 근육질의 증가;

(c) 근육세포수의 증가;

(d) 근육세포크기의 증가;

(e) 체지방량의 감소;

(f) 근육강도의 증가;

(g) 유선조직의 증가;

(h) 비유의 증가;

(i) 식용 또는 사료흡수력의 증가;

(j) 척추동물의 수명의 증가.
제 59 항에 있어서, 유발된 면역응답이 상기 척추동물내에서 내인성 미오스태틴활성을 감소시키며, 적어도 하나의 다음과 같은 생물학적 효과를 보임을 특징으로 하는 방법.

(a) 체중의 증가;

(b) 근육질의 증가;

(c) 근육세포수의 증가;

(d) 근육세포크기의 증가;

(e) 체지방량의 감소;

(f) 근육강도의 증가;

(g) 유선조직의 증가;

(h) 비유의 증가;

(i) 식용 또는 사료흡수력의 증가;

(j) 척추동물의 수명의 증가.
제 60 항에 있어서, 유발된 면역응답이 상기 척추동물내에서 내인성 미오스태틴활성을 감소시키며, 적어도 하나의 다음과 같은 생물학적 효과를 보임을 특징으로 하는 방법.

(a) 체중의 증가;

(b) 근육질의 증가;

(c) 근육세포수의 증가;

(d) 근육세포크기의 증가;

(e) 체지방량의 감소;

(f) 근육강도의 증가;

(g) 유선조직의 증가;

(h) 비유의 증가;

(i) 식용 또는 사료흡수력의 증가;

(j) 척추동물의 수명의 증가.
척추동물의 근육의 퇴화 및 감쇠와 같은 장애를 치료하는 방법에 있어서, 이 방법이 상기 척추동물에 청구항 제 52 항의 백신조성물을 투여하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
척추동물의 근육의 퇴화 및 감쇠와 같은 장애를 치료하는 방법에 있어서, 이 방법이 상기 척추동물에 청구항 제 53 항의 백신조성물을 투여하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
척추동물의 근육의 퇴화 및 감쇠와 같은 장애를 치료하는 방법에 있어서, 이 방법이 상기 척추동물에 청구항 제 54 항의 백신조성물을 투여하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
청구항 제 52 항의 백신조성물을 상기 척추동물에 투여하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 척추동물의 GDF11 활성을 조절하는 방법.
청구항 제 53 항의 백신조성물을 상기 척추동물에 투여하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 척추동물의 GDF11 활성을 조절하는 방법.
청구항 제 54 항의 백신조성물을 상기 척추동물에 투여하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 척추동물의 GDF11 활성을 조절하는 방법.
청구항 제 1 항-제 49 항의 어느 한 항에 따른 미오스태틴 펩티드 또는 미오스태틴 다량체를 부호화하는 폴리뉴클레오티드.
청구항 제 50 항에 따른 미오스태틴 면역접합체를 부호화하는 폴리뉴클레오티드.
청구항 제 51 항에 따른 미오스태틴 면역접합체를 부호화하는 폴리뉴클레오티드.
청구항 제 70 항에 따른 폴리뉴클레오티드와, 상기 폴리뉴클레오티드에 동작가능하게 결합되어 상기 폴리뉴클레오티드내의 코드서열이 숙주세포에 전사 및 번역될 수 있는 제어인자로 구성되고, 상기 적어도 하나의 제어인자가 상기 코드서열과 비상동임을 특징으로 하는 재조합체 벡터.
청구항 제 71 항에 따른 폴리뉴클레오티드와, 상기 폴리뉴클레오티드에 동작가능하게 결합되어 상기 폴리뉴클레오티드내의 코드서열이 숙주세포에 전사 및 번역될 수 있는 제어인자로 구성되고, 상기 적어도 하나의 제어인자가 상기 코드서열과 비상동임을 특징으로 하는 재조합체 벡터.
청구항 제 72 항에 따른 폴리뉴클레오티드와, 상기 폴리뉴클레오티드에 동작가능하게 결합되어 상기 폴리뉴클레오티드내의 코드서열이 숙주세포에 전사 및 번역될 수 있는 제어인자로 구성되고, 상기 적어도 하나의 제어인자가 상기 코드서열과 비상동임을 특징으로 하는 재조합체 벡터.
청구항 제 73 항의 재조합체 벡터로 형질전환된 숙주세포.
청구항 제 74 항의 재조합체 벡터로 형질전환된 숙주세포.
청구항 제 75 항의 재조합체 벡터로 형질전환된 숙주세포.
재조합체 미오스태틴 펩티드 또는 미오스태틴 다량체의 제조방법에 있어서, 이 방법이 청구항 제 76 항에 따른 숙주세포의 집단을 제공하는 단계와, 상기 재조합체 벡터에 존재하는 코드서열에 의하여 부호화된 미오스태틴 펩티드 또는 미오스태틴 다량체가 발현되는 조건하에 상기 세포집단을 배양하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 재조합체 미오스태틴 펩티드 또는 미오스태틴 다량체의 제조방법.
재조합 미오스태틴 면역접합체의 제조방법에 있어서, 이 방법이 청구항 제 77 항에 따른 숙주세포의 집단을 제공하는 단계와, 상기 재조합체 벡터에 존재하는 코드서열에 의하여 부호화된 미오스태틴 면역접합체가 발현되는 조건하에 상기 세포집단을 배양하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 재조합 미오스태틴 면역접합체의 제조방법.
재조합 미오스태틴 면역접합체의 제조방법에 있어서, 이 방법이 청구항 제 78 항에 따른 숙주세포의 집단을 제공하는 단계와, 상기 재조합체 벡터에 존재하는 코드서열에 의하여 부호화된 미오스태틴 면역접합체가 발현되는 조건하에 상기 세포집단을 배양하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 재조합 미오스태틴 면역접합체의 제조방법.
청구항 제 70 항의 폴리뉴클레오티드를 척추동물에 투여하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 척추동물의 미오스태틴 면역원에 대한 면역응답을 유발하는 방법.
청구항 제 71 항의 폴리뉴클레오티드를 척추동물에 투여하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 척추동물의 미오스태틴 면역원에 대한 면역응답을 유발하는 방법.
청구항 제 72 항의 폴리뉴클레오티드를 척추동물에 투여하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 척추동물의 미오스태틴 면역원에 대한 면역응답을 유발하는 방법.
제 82 항에 있어서, 유발된 면역응답이 상기 척추동물내에서 내인성 미오스태틴활성을 감소시키며, 적어도 하나의 다음과 같은 생물학적 효과를 보임을 특징으로 하는 방법.

(a) 체중의 증가;

(b) 근육질의 증가;

(c) 근육세포수의 증가;

(d) 근육세포크기의 증가;

(e) 체지방량의 감소;

(f) 근육강도의 증가;

(g) 유선조직의 증가;

(h) 비유의 증가;

(i) 식용 또는 사료흡수력의 증가;

(j) 척추동물의 수명의 증가.
제 83 항에 있어서, 유발된 면역응답이 상기 척추동물내에서 내인성 미오스태틴활성을 감소시키며, 적어도 하나의 다음과 같은 생물학적 효과를 보임을 특징으로 하는 방법.

(a) 체중의 증가;

(b) 근육질의 증가;

(c) 근육세포수의 증가;

(d) 근육세포크기의 증가;

(e) 체지방량의 감소;

(f) 근육강도의 증가;

(g) 유선조직의 증가;

(h) 비유의 증가;

(i) 식용 또는 사료흡수력의 증가;

(j) 척추동물의 수명의 증가.
제 84 항에 있어서, 유발된 면역응답이 상기 척추동물내에서 내인성 미오스태틴활성을 감소시키며, 적어도 하나의 다음과 같은 생물학적 효과를 보임을 특징으로 하는 방법.

(a) 체중의 증가;

(b) 근육질의 증가;

(c) 근육세포수의 증가;

(d) 근육세포크기의 증가;

(e) 체지방량의 감소;

(f) 근육강도의 증가;

(g) 유선조직의 증가;

(h) 비유의 증가;

(i) 식용 또는 사료흡수력의 증가;

(j) 척추동물의 수명의 증가.
척추동물의 근육의 퇴화 및 감쇠와 같은 장애를 치료하는 방법에 있어서, 이 방법이 상기 척추동물에 청구항 제 70 항의 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
척추동물의 근육의 퇴화 및 감쇠와 같은 장애를 치료하는 방법에 있어서, 이 방법이 상기 척추동물에 청구항 제 71 항의 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
척추동물의 근육의 퇴화 및 감쇠와 같은 장애를 치료하는 방법에 있어서, 이 방법이 상기 척추동물에 청구항 제 72 항의 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
청구항 제 1 항에 따른 미오스태틴 펩티드와 반응하는 분리된 항체.