BR0307907A2

BR0307907A2 - gasp1: proteìna contendo domìnio de folistatina

Info

Publication number: BR0307907A2
Application number: BRPI0307907-4A
Authority: BR
Inventors: Jennifer J Hill; Neil M Wolfman
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2002-02-21
Filing date: 2003-02-21
Publication date: 2011-07-05
Also published as: EP1572909A2; WO2003072715A3; WO2003072715A2; US20070134258A1; AU2003217612A1; WO2003072715A8; MXPA04008150A; US7192717B2; JP2010031018A; PL375045A1; KR20040094709A; CA2476887A1; US7541154B2; US20050106154A1; JP2005534616A; US20030162714A1; NO20043886L; US7956038B2; IL163525A0; US7585835B2

Abstract

GASP1: PROTEìNA CONTENDO DOMìNIO DE FOLISTATINA. A presente invenção refere-se ao uso de uma proteína, GASP1, compreendendo pelo menos um domínio de folistatina para modular o nível ou atividade do fator-8 de crescimento e diferenciação (GDF-8). Mais particularmente, a invenção refere-se ao uso de GASP1 para o tratamento de distúrbios que são relacionados com a modulação do nível ou atividade do GDF-8. A invenção é útil para o tratamento de doenças e distúrbios musculares, particularmente aquele em que um aumento no tecido muscular deve ser terapeuticamente benéfico. A invenção é também útil para o tratamento de doenças e distúrbios relacionados com o metabolismo, tecido adiposo e degeneração óssea.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "GASP1:PROTEÍNA CONTENDO DOMÍNIO DE FOLISTATINA".

Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido ProvisórioU.S. ne 60/357.845, depositado em 21 de fevereiro de 2002, e do PedidoProvisório U.S. n9 60/434.644, depositado em 20 de dezembro de 2002.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao uso de proteínas compreen-dendo pelo menos um domínio de folistatina para modular o nível ou ativi-dade do fator-8 de crescimento e diferenciação (GDF-8). Mais particular-mente, a invenção refere-se ao uso de proteínas compreendendo pelo me-nos um domínio de folistatina, excluindo a folistatina propriamente dita, parao tratamento de distúrbios que são relacionados com a modulação do nívelou atividade do GDF-8. A invenção é útil para o tratamento de doenças edistúrbios musculares, particularmente aqueles em que um aumento no teci-do muscular deve ser terapeuticamente benéfico. A invenção é também útilpara o tratamento de doenças e distúrbios relacionados com o metabolismo,tecido adiposo e degeneração óssea.

Antecedentes da Invenção

O fator-8 de crescimento e diferenciação (GDF-8), também co-nhecido como miostatina, é um membro da superfamília do fator-beta detranformação do crescimento (TGF-β) de fatores do crescimento estrutural-mente relacionados, todos dos quais possuem importantes propriedadesfisiológicas reguladoras do crescimento e morfogenéticas (Kingsley et al.(1994) Genes Dev., 8: 133-46; Hoodless et al. (1998) Curr. Topics Microbioí.Immunol., 228: 235-72). O GDF-8 é um regulador negativo da massa mus-cular esquelética, e existe considerável interesse na identificação dos fato-res que regulam sua atividade biológica. Por exemplo, o GDF-8 é altamentemanifestado no músculo esquelético adulto e em desenvolvimento. A muta-ção nula do GDF-8 em camundongos transgênicos é caracterizada por umahipertrofia e hiperplasia marcantes do músculo esquelético (McPherron et al.(1997) Nature, 387:83-90). Aumentos similares na massa muscular esquelé-tica são evidentes nas mutações de ocorrência natural do GDF-8 no gado(Ashmore et al. (1974) Growth, 38: 501-507; Swatland and Kieffer (1994) J.Anim. Sci., 38: 752-757; McPherron and Lee (1997) Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A.,94: 12457-12461; e Kambadur et al. (1997) Genomes Res., 7: 910-915).Recentes estudos têm também mostrado que a debilitação muscular associ-ada com a infecção pelo HIV em seres humanos é acompanhada por au-mentos na expressão da proteína do GDF-8 (Gonzales-Cadavid et al. (1998)Procf Nati Acad. Sei. U.S.A., 95: 14938-43). Além disso, o GDF-8 pode mo-dular a produção de enzimas específicas do músculo (por exemplo, creatinacinase) e modular a proliferação de células mioblásticas (WO 00/43781).

Vários distúrbios humanos e animais são associados com a per-da do tecido muscular ou funcionalmente prejudicá-lo. Até esta data, muitopoucas terapias seguras ou eficazes existem para estes distúrbios. No en-tanto, os sintomas terríveis associados com estes distúrbios podem sersubstancialmente reduzidos mediante o emprego de terapias que aumentama quantidade do tecido muscular nos pacientes que sofrem dos distúrbios.Embora não cure as condições, tais terapias devem significativamente me-lhorar a qualidade de vida para estes pacientes e podem melhorar algunsdos efeitos destas doenças. Assim, existe uma necessidade na técnica paraidentificar novas terapias que possam contribuir para um aumento global notecido muscular nos pacientes que sofrem destes distúrbios.

Além de suas propriedades reguladores do crescimento e mor-fogeneticas no músculo esquelético, o GDF-8 pode também estar envolvidoem vários outros processos fisiológicos (por exemplo, homeostase da glico-se), assim como condições anormais, tais como no desenvolvimento do dia-betes tipo 2 e distúrbios do tecido adiposo, tais como a obesidade. Porexemplo, o GDF-8 modula a diferenciação pré-adipócita em adipócitos (Kimet al. (2001) B.B.R.C. 281: 902-906). Assim, a modulação do GDF-8 podeser útil para o tratamento destas doenças, igualmente.

A proteína do GDF-8 é sintetizada como uma proteína precurso-ra consistindo em um pró-peptídeo amino-terminal e um domínio madurocarbóxi-terminal (McPherron and Lee (1997) Proc. Nat. Acad. Sei, U.S.A.,94: 12457-12461). Antes da clivagem, a proteína do GDF-8 precursora for-ma um homodímero. Os pró-peptídeo amino-terminal é depois clivado a par-tir do domínio maduro. O pró-petídeo clivado pode permanecer não cova-Ientemente ligado ao dímero de domínio maduro, inativando sua atividadebiológica (Miyazino et al. (1988) J. Bioi Chem., 263: 6407-6415; Wakefieldet al. (1988) J. Biol. Chem., 263: 7646-7654; e Brown et al. (1990) GrowthFactors, 3: 35-43). Acredita-se que dois pró-peptídeos do GDF-8 se ligam aodímero maduro do GDF-8 (Thies et al. (2001) Growth Factors, 18: 251-259).Devido a esta propriedade de inativação, o pró-petídeo é conhecido como o"peptídeo associado à latência" (LAP), e o complexo de domínio maduro epró-petídeo é comumente referido como o "complexo latente secundário"(gentry and Nash (1990) Biochemistry, 29:6851-6857; Derynck et al. (1995)Nature, 316-701-705; e Massague (1990) Ann. Rev. Cell Biol., 12: 597-641).Sabe-se também que outras proteínas se ligam ao GDF-8 ou às proteínasestruturalmente relacionadas e inibem sua atividade biológica. Tais proteínas15 inibidoras incluem folistatina (Gamer et al. (1999) Dev. Biol., 208: 222-232). Odomínio maduro do GDF-8 é julgado ser ativo como um homodímero quan-do o pró-petídeo é removido.

Claramente, o GDF-8 está envolvido na regulação de muitosprocessos biológicos críticos. Devido à sua função essencial nestes proces-sos, o GDF-8 pode ser um alvo desejável para a intervenção terapêutica.Em particular, os agentes terapêuticos que inibem a atividade do GDF-8 po-dem ser usados para tratar distúrbios humanos ou animais em que um au-mento no tecido muscular seria terapeuticamente benéfico.

As proteínas conhecidas que compreendem pelo menos um domínio de folistatina desempenham papéis em muitos processos biológi-cos, particularmente na regulação da sinalização da superfamília do TGF-βe na regulação dos processos mediados pela matriz extracelular tais como aaderência celular. A folistatina, o gene relacionado com a folistatina (FLGR,FSRP), e a proteína relacionada com a folistatina (FRP) têm todos sido Iiga-dos à sinalização do TGF-β, ou através da regulação transcricional por TGF-β (Bartholin et al. (2001) Oncogene, 20: 5409-5419; Shibanuma et al. (1993)Eur. J. Biochem. 217: 13-19) ou por sua capacidade de antagonizar os ca-minhos da sinalização do TGF-β (Phillips and de Kretser (1998) Front. Neuro-endocrin., 19: 287-322; Tsuchida et al. (2000) J. Bioi Chem., 275:40788-40796;Patel et al. (1996) Dev. Biol., 178:327-342; Amthor et al. (1996) Dev. Biol., 178:343-362). Os nomes da proteína em parênteses são nomes alternativos.

A proteína de ligação do fator ae crescimento de insulina 7(IGFBP7, mac25), que compreende pelo menos um domínio de foiistatina,se liga com a insulina e bloqueia a subseqüente interação com o receptor deinsulina. Além disso, a IGFBP7 tem sido mostrada se ligar à activina, ummembro da família do TGF-β (Kato (2000) Mol. Med., 6: 126-135).

Agrinas e proteínas relacionadas com a agrina contêm acima denove domínios de foiistatina e são secretadas de células nervosas parapromover a agregação dos receptores de acetilcolina e outras moléculasenvolvidas na formação de sinapses. Foi sugerido que os domínios de fo-iistatina podem servir para localizar fatores de crescimento com a sinapse(Patthy et al. (1993) Trends Neurosci., 16: 76-81).

As osteonectina (SPARC, BM40) e hevina (SC1, mast9, QR1)são proteínas intimamente relacionadas que interagem com as proteínas damatriz celular e regulam o crescimento e aderência celular (Motamed (1999)Int. J. Biochem. Ce//. Biol., 31: 1363-1366; Girard and Springer (1996) J. Biol20 Chem., 271: 4511-4517). Estas proteínas compreendem pelo menos umdomínio de foiistatina.

Outras proteínas de domínio da foiistatina foram descritas oudivulgadas na base de dados do NCBI (National Center for BiotechnologyInformation, Bethesda, Maryland, USA), entretanto suas funções são nomomento desconhecidas. Estas proteínas incluem U19878 (G01639, muitosimilar à tomorregulina-1), T46914, GASP1 humana (proteína 1 do soro as-sociada com o GDF; aqui descrita ; Figura 7), GASP2 humana (WFIKKN;Trexler et al. (2001) Proc Nati Acad. Sei. U.S.A., 98: 3705-3709; Figura 9), ea família de proteoglicano das proteínas testican (SPOCK) (Alliel et al.(1993) Eur. J. Biochem., 214: 347-350). As seqüências de aminoácido e nu-cleotídeo para a GASP1 de camundongo (Figura 6) e GASP2 de camun-dongo (Figura 8) foram também determinadas nas bases de dados Celera(Rockville, MD). Como aqui descrito, a seqüência de nucleotídeo da GASP1de camundongo clonado se compara à seqüência de Celera prognosticada,com a exceção de algumas substituições de base nos códons oscilantes quenão mudaram a seqüência de aminoácido prognosticada (ver a Figura 13).

Sumário da Invenção

Conseqüentemente, a invenção refere-se a proteínas, diferentesda folistatina, compreendendo um aspecto estrutural único, isto é, a presen-ça de pelo menos um domínio de folistatina. A folistatina em si não é abar-cada pela invenção. As proteínas compreendendo pelo menos um domíniode folistatina são especificamente reativas com uma proteína do GDF-8 ma-dura ou um fragmento desta, quer a proteína GDF-8 esteja na forma mono-mérica, uma forma ativa dimérica, quer combinada no complexo latente doGDF-8. As proteínas que compreendem pelo menos um domínio de folistati-na podem se ligar a um epitopo na proteína do GDF-8 madura que resultaem uma redução em uma ou mais das atividades biológicas associadas como GDF-8, em relação a uma proteína do GDF-8 madura que não é ligadapela mesma proteína.

A presente invenção fornece métodos para a modulação dosefeitos do GDF-8 sobre as células. Tais métodos compreendem a adminis-tração de uma quantidade eficaz de uma proteína que compreende pelomenos um domínio de folistatina. A presente invenção também abrangemétodos para expressar uma proteína em uma célula mediante a adminis-tração de uma molécula de DNA que codifica uma proteína compreendendopelo menos um domínio de folistatina.

De acordo com a invenção, as proteínas que compreendem pelomenos um domínio de folistatina podem ser administradas a um paciente,com uma dose terapeuticamente eficaz, para tratar ou prevenir condiçõesmédicas em que um aumento no tecido muscular seria terapeuticamentebenéfico. As modalidades incluem o tratamento de doenças, distúrbios eferimentos que envolvem as células e tecidos que são associados com aprodução, metabolismo ou atividade do GDF-8.

As proteínas compreendendo pelo menos um domínio de folista-tina podem ser preparadas em uma preparação farmacêutica. A preparaçãofarmacêutica pode conter outros componentes que auxiliam na ligação da pro-teína do GDF-8 madura ou seus fragmentos, quer esteja na forma monomérica,na forma ativa dimérica, quer combinada no complexo latente do GDF-8.

Além disso, as proteínas que compreendem peio menos umdomínio de folistatina podem ser usadas como uma ferramenta de diagnós-tico para quantitativa ou qualitativamente detectar a proteína do GDF-8 ma-dura ou seus fragmentos, quer esteja na forma monomérica, na forma ativadimérica, quer combinada no complexo latente do GDF-8. Por exemplo, asproteínas compreendendo pelo menos um domínio de folistatina podem serusadas para detectar a presença, ausência, ou quantidade da proteína doGDF-8 em uma célula, fluido corpóreo, tecido, ou organismo. A presença ouquantidade de proteína do GDF-8 madura detectada pode ser correlaciona-da com uma ou mais condições médicas aqui listadas.

As proteínas que compreendem pelo menos um domínio de fo-listatina podem ser fornecidas em um kit de diagnóstico para detectar aproteína do GDF-8 madura ou fragmentos destes, quer esteja na forma mo-nomérica, na forma ativa dimérica, quer combinada no complexo latente doGDF-8, e auxiliar na correlação dos resultados com uma ou mais das condi-ções médicas aqui descritas. Um tal kit pode compreender pelo menos umaproteína compreendendo pelo menos um domínio de folistatina, quer estejarotulada ou não rotulada, e pelo menos um agente que se liga a estas pro-teínas, tal como um anticorpo rotulado. O kit pode também incluir os pa-drões biológicos apropriados e amostras de controle as quais pode-se com-parar os resultados da detecção experimental. Pode também incluir tampõesou soluções de lavagem e instruções para se usar o kit. Componentes es-truturais podem ser incluídos sobre os quais se pode realizar a experiência,tais como bastões, contas, papéis, colunas, frascos pequenos ou géis.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra a purificação de anticorpo do complexo doGDF-8 a partir do soro de camundongo tipo silvestre. Um gel redutor man-chado de prata mostra as proteínas purificadas do soro de camundongo tiposilvestre usando o anticorpo monoclonal JA 16 covalentemente acoplado àscontas de agarose. Uma purificação de controle (0) com contas acopladas deimitação foi executada em paralelo. Eluições subseqüentes com tampão (eluatode imitação), um peptídeo concorrente, e tampão de amostra SDS revelaramduas faixas de proteína visíveis que foram especificamente eluídas com opeptídeo a partir das contas conjugadas ao JA 16 (indicado por flechas).

A Figura 2 mostra a identificação do GDF-8 maduro e não pro-cessado nas amostras purificadas de afinidade de soro de camundongo normal.

A Figura 2A mostra um espectro MS/MS representativo de um peptídeo deriva-do do GDF-8 (SEQ ID NO: 19) identificado da faixa 12 kDA visível na amostrapurificada de afinidade. Tanto íons de fragmento N-terminal (íons b) quantoíons de fragmento C-terminal (íons y) são visíveis. Notavelmente, os íons defragmento y mais intensos resultam da fragmentação anterior ao resíduo deprolina, uma característica comum dos peptídeos contendo prolina. A Figura2B mostra um Western blot investigado com um anticorpo monoclonal quereconhece a região madura do GDF-8, confirmando a presença do GDF-8nas amostras purificadas de afinidade. As formas tanto maduras quanto nãoprocessadas do GDF-8 são visíveis.

A Figura 3 mostra o pró-peptídeo do GDF-8 e o gene relaciona-do semelhante à folistatina (FLRG) se ligarem ao GDF-8 circulante isoladodo soro de camundongo normal. Os espectros MS/MS representativos dopró-peptídeo do GDF-8 (SEQ ID NO: 23) (Figura 3A) e peptídeos derivadosdo FLRG (SEQ ID NO: 30) (Figura 3C) identificados na faixa 36 kDa sãomostrados. A Figura 3B mostra um Western blot do complexo do GDF-8 pu-rificado de afinidade investigada com um anticorpo policlonal que especifi-camente reconhece a região do pró-peptídeo do GDF-8, confirmando aidentificação espectrométrica de massa desta proteína no complexo doGDF-8. Tanto o pró-peptídeo segmentado quanto o GDF-8 não processadosão visíveis - em exposições mais longas, o GDF-8 não processado podetambém ser visto na amostra eluída SDS. A Figura 3D mostra um Westernblot do complexo de GDF-8 purificado de afinidade investigada com um an-ticorpo monoclonal para o FLRG.A Figura 4 mostra os resultados de uma análise meticulosa deuma purificação do GDF-8 em grande escala que identificou o propeotídeodo GDF-8, o FLRG1 e uma nova proteína como as proteínas de ligação aoGDF-8 principais no soro. Um gel manchado de prata foi dissecado em 13fatias da amostra eluída de peptídeo tanto ao coniroie negativo quanto dosimunoprecipitados JAI6. As proteínas em cada fatia foram digeridas com íripsi-na e identificadas usando nanofluxo-LC-MS/MS e base de dados de pesquisa.

As proteínas únicas para a amostra JA16 incluíram apenas GDF-8 não proces-sado e maduro, pró-peptídeo do GDF-8, FLRG, e um novo inibidor da proteasede múltiplos domínios (proteína 1 do soro associada com o GDF, GASP1).Estas proteínas foram identificadas a partir das regiões observadas do gel.

A Figura 5 mostra que um novo inibidor da protease de múltiplosdomínios, GASP1, é ligado ao GDF-8 no soro. As Figuras 5A (peptídeo de-signado SEQ ID NO: 31) e 5B (peptídeo designado SEQ ID NO: 33) apre-sentam espectros MS/MS representativos de dois peptídeos GASP1, identi-ficados na faixa 3 do gel manchado de prata da Figura 4.

A Figura 6A mostra a seqüência de nucleotídeo prognosticadapara a GASP1 de camundongo. A Figura 6B mostra uma seqüência de nu-cleotídeo alternativa prognosticada para a GASP1 de camudongo. A Figura6C mostra a seqüência de aminoácido prognosticada codificada pelas se-qüências de nucleotídeo apresentadas nas Figuras 6A e 6B. As seqüênciasde proteína codificadas pelas duas seqüências de nucleotídeo são idênticasporque as diferenças de nucleotídeo estão todas nas posições de códonoscilantes. O domínio de folistatina é mostrado em negrito e sublinhado.

A Figura 7A mostra a seqüência de nucleotídeo prognosticadoda GASP1 humana. A Figura 7B mostra a seqüência de aminoácido prog-nosticada correspondente. O domínio de folistatina é mostrado em negrito esublinhado. A Figura 7C mostra a seqüência de nucleotídeo prognosticadada GASP1 humana usando um sítio de partida alternativo. A Figura 7Dmostra a seqüência de aminoácido prognosticada correspondente. O domí-nio de folistatina é mostrado em negrito e sublinhado. O final da seqüência éindicado pelo asterisco.A Figura 8A apresenta a seqüência de nucleotídeo prognostica-do para a GASP2 de camundongo enquanto a Figura 8B mostra a seqüên-cia de aminoácido prognosticada correspondente. O domínio de folistatina émostrado em negrito e sublinhado.

A Figura 9A apresenta a seqüência de nucleotídeo prognostica-do para a GASP2 humana, enquanto a Figura 9B mostra a seqüência deaminoácido prognosticada correspondente. O domínio de folistatina é mos-trado em negrito e sublinhado.

A Figura 10 mostra que a GASP1 de camundongo é expressaem muitos tecidos adultos e durante o desenvolvimento. A figura mostraperfis de expressão do tecido da GASP1 de camundongo. Um fragmento de551 pb e GASP1 foi amplificado a partir de painéis de cDNA de primeiro fi-lamento normalizados da Clontech (Paio Alto, CA). Uma porção de gliceral-deído-3-fosfato desidrogenase (G3PDH) foi amplificada como um controle. Aexpressão de G3PDH é conhecida ser elevada no músculo esquelético ebaixa no testículo. Os painéis de cDNA foram normalizados junto à β-actina,fosfolipase A2, e proteína ribossomal S29, além da G3PDH.

A Figura 11 apresenta proteínas isoladas do soro humano. Asproteínas de um imunoprecipitado JA16 ou uma amostra de controle (O) fo-ram eluídas em uma eluição de mock PBS, uma eluição de peptídeo concor-rente, ou uma eluição SDS. As proteínas nas regiões indicadas do gel foramdigeridas com tripsina e analisadas por LS-MS/MS e pesquisa de base dedados. As proteínas presentes na amostra JA16, mas não na amostra decontrole, eram o GDF-8 maduro (faixa 16), pró-peptídeo do GDF-8 e FLRG(faixa 11), e a GASP1 humana (faixa 4). A Figura 11B mostra um Westernblot de um imunoprecipitado JA16 idêntico investigada com um anticorpoque reconhece o GDF-8 maduro. As faixas que correspondem ao GDF-8maduro e não processado isolado do soro humano são visíveis.

A Figura 12 mostra os espectros de massa representativos deum peptídeo derivado do GDF-8 e as proteínas associadas isoladas das fai-xas 4, 11 e 16 (Figura 11). A seqüência de peptídeo e N-terminal (íons b) eC-terminal (íons y) são mostrados. Uma listagem completa de peptídeosidentificados é fornecida na Tabela 1. Os espectros são apresentados a partirde um peptídeo de GASP1 (SEQ ID NO: 44) (Figura 12A), um peptídeo deFLRG (SEQ ID NO: 41) (Figura 12B), um peptídeo pró-peptídeo do GDF-8(SEQ ID NO: 24) (Figura 12C), e um peptídeo do GDF-8 maduro (SEQ IDNO: 13) (Figura 12D).

A Figura 13 mostra as seqüências de nucleotídeo (SEQ iDNO:48) e de amirioácido (SEQ ID NO: 49) da GASP1 de camundongo clo-nado. Os peptídeos identificados por espectrometria de massa nas amostraspuruficadas de afinidade JA16 são sublinhados. O final da seqüência é indi-cado por asterisco.

A Figura 14A apresenta a estrutura de domínio da GASP1. AGASP1 possui uma seqüência de sinal/sítio de clivagem depois do aminoá-cido 29. Além disso, a GASP1 contém dois domínios de inibidor da serinaprotease Kunitz/BRTI, um domínio de folistatina (incluindo um motivo de ini-bidor da serina protease Kazal) e um domínio de netrina, que podem inibiras metaloproteases. A Figura 14B mostra a árvore filogenética de GASP1 eGASP2 prognosticadas a partir das seqüências genômicas de camundongoe ser humano. A GASP1 de camundongo e ser humano são 90 % idênticas.As GASP1 e GASP2 são 54 % idênticas.

A Figura 15 mostra que a GASP1 recombinantemente produzidase liga separadamente tanto ao GDF-8 quanto ao pró-peptídeo GDF-8. (A)JA16 foi usado para imunoprecipitar o GDF-8 do meio condicionado de cé-lula COS transfectada V5-His de imitação ou GASP1 suplementado comGDF-8 ou pró-peptídeo purificado recombinante. Western blots com anticor-pos policlonais anti-V5 (painel de topo), anti-GDF-8 (painel médio), ou anti-pró-peptídeo foram usadas para determinar se estas proteínas estavam pre-sentes no imunoprecipitado. (B) A proteína GASP1 recombinantemente pro-duzida foi imunoprecipitada por anticorpos de rótulo anti-V5 do meio condi-cionado de V5-His "mock" ou GASP1 suplementado com GDF-8 e/ou pró-peptídeo purificado recombinante. O imunoprecipitado foi analisado porwestern blotting como em (A).

A Figura 16 mostra que a GASP1 inibe a atividade biológica deGDF-8 e a BMP-11 altamente relacionada, mas nenhuma activina ou TGF-β.Várias diluições de meio condicionado de transfectantes V5-His de imitação(círculos abertos) ou GASP1 (quadrados cheios) foram incubadas com (A)10 ng/ml de GDF-8, (B) 10 ng/ml de BMP-11, (C) 10 ng/ml de activina, ou(D) 0,5 ng/ml de TGF-β. Estas amostras foram depois submetidas a um en-saio de atividade repórter Iuciferase em células A204 (A-C) ou RD (D) paradeterminar a atividade dos fatores de crescimento adicionados. A atividadeIuciferase é apresentada em unidades de Iuciferase relativas. A atividaderesultante de cada um dos fatores de crescimento isolados é mostrada peloslosangos cheios e linha tracejada curta. Sem adição de qualquer fator decrescimento, a atividade subordinada no ensaio é baixa, como apresentadopela linha tracejada longa com nenhum símbolo.

A Figura 17 mostra a potência de inibição da GASP1 do GDF-8.A GASP1 purificada foi testada quanto a sua capacidade de inibir 20 ng/mlde miostatina no ensaio repórter Iuciferase (CAGA)12 (SEQ ID NO: 53) emcélulas RD (quadrados cheios). A atividade resultante a partir do GDF-8isolado é mostrada pelos losangos cheios e linha tracejada curta. A ativida-de presente, quando nenhum fator de crescimento é adicionado, é apre-sentada pela linha tracejada longa.Definições

O termo "domínio de folistatina" se refere a um domínio de ami-noácido ou um domínio de nucleotídeo que codifica um domínio de aminoá-cido, caracterizado por repetições ricas em cisteína. Um domínio de folistati-na tipicamente abrange uma extensão de aminoácido de 65 a 90 e contém10 resíduos de cisteína conservados e uma região similar aos domínios doinibidor de serina protease Kazal. Em geral, as regiões de alça entre os re-síduos de cisteína apresentam variabilidade de seqüência nos domínios defolistatina, mas alguma conservação é evidente. A alça entre as quarta equinta cisteínas é geralmente pequena, contendo apenas 1 ou 2 aminoáci-dos. Os aminoácidos na alça entre as sétima e oitava cisteínas são geral-mente as mais altamente conservadas contendo uma seqüência de consen-so de (G,A)-(S,N)-(S,N,T)-(D,N)-(G,N) seguida por um motivo (T,S)-Y. A re-gião entre as nona e décima cisteínas geralmente contém um motivo con-tendo dois resíduos hidrofóbicos (especificamente V, I ou L) separados poroutro aminoácido.

A expressão "proteína compreendendo pelo menos um domíniode folistatina" se refere a proteínas que compreendem pelo menos um, maspossivelmente mais do que um domínio de folistatina. A expressão tambémse refere a qualquer variante de tais proteínas (incluindo fragmentos; proteí-nas com mutações de substituição, adição ou deleção; e proteínas de fusão)que mantém as atividades biológicas conhecidas associadas com as proteí-nas nativas, especialmente aquelas pertencentes à atividade de ligação doGDF-8, incluindo seqüências que foram modificadas com mudanças conser-vadoras ou não conservadoras na seqüência de aminoácido. Estas proteí-nas podem ser derivadas de qualquer fonte, natural ou sintética. A proteínapode ser humana ou derivada de fontes de animal, incluindo bovinos, fran-gos, murinos, ratos, porcos, ovinos, peru, babuínos e peixes. A folistatinaem si não é abarcada pela invenção.

Os termos "GDF-8" ou "proteína do GDF-8" se referem a umfator específico de crescimento e diferenciação. Os termos incluem o com-primento total da forma precursora não processada da proteína, assim comoas formas maduras e de pró-peptídeo resultantes da clivagem pós-transla-cional. Os termos também se referem a qualquer fragmento do GDF-8 quemantém as atividades biológicas conhecidas associadas com a proteína,incluindo seqüências que foram modificadas com mudanças conservadorasou não conservadoras na seqüência de aminoácido. Estas moléculas doGDF-8 podem ser derivadas de qualquer fonte, natural ou sintética. A pro-teína pode ser humana ou derivada de fontes de animal, incluindo bovinos,frangos, murinos, ratos, porcos, ovinos, peru, babuínos e peixes. Váriasmoléculas de GDF-8 foram descritas em McPherron et al. (1997) Proc. NatLAcad. Sei. USA, 94: 12457-12461.

"GDF-8 maduro" se refere à proteína que é clivada a partir dodomínio carbóxi-terminal da proteína precursora do GDF-8. O GDF-8 madu-ro pode estar presente como monômero, homodímero, ou em um complexolatente do GDF-8. Dependendo das condições in vivo ou in vitro, o GDF-8maduro pode estabelecer um equilíbrio entre qualquer uma ou todas destasformas diferentes. Acredita-se ser biologicamente ativo como homodímero.Na sua forma biologicamente ativa, o GDF-8 maduro é também referidocomo "GDF-8 ativo".

"Pró-peptídeo do GDF-8" se refere ao polipeptídeo que é clivado apartir do domínio amino-terminal da proteína precursora do GDF-8. O pró-peptí-deo do GDF-8 é capaz de se ligar ao domínio de ligação do pró-peptídeo noGDF-8 maduro.

"Complexo latente do GDF-8" se refere ao complexo de proteí-nas formado entre o homodímero do GDF-8 maduro e o pró-peptídeo doGDF-8. Acredita-se que dois pró-peptídeos do GDF-8 se associam com asduas moléculas do GDF-8 maduro no homodímero para formar um comple-xo tetramérico inativo. O complexo latente pode incluir outros inibidores doGDF em vez de ou além de um ou mais dos propetídeos do GDF-8.

A frase "atividade do GDF-8" se refere a uma ou mais das ativi-dades fisiologicamente reguladores do crescimento ou morfogenéticas as-sociadas com a proteína do GDF-8 ativa. Por exemplo, o GDF-8 ativo é umregulador negativo do músculo esquelético. O GDF-8 ativo pode tambémmodular a produção de enzimas específicas do músculo (por exemplo, crea-tina cinase), estimular a proliferação da célula mioblástica, e modular a dife-renciação pré-adipócita para adipócitas. O GDF-8 é também julgado au-mentar a sensibilidade à insulina e absorção da glicose nos tecidos periféri-cos, particularmente no músculo esquelético ou adipócitos. Conseqüente-mente, as atividades biológicas do GDF-8 incluem, mas não são limitados ainibição da formação muscular, inibição do crescimento celular do músculo,inibição do desenvolvimento muscular, diminuição da massa muscular, re-gulação das enzimas específicas do músculo, inibição da proliferação dacélula mioblástica, modulação da diferenciação pré-adipócita para adipóci-tos, sensibilidade crescente á insulina, regulações da absorção da glicose,hemostasia da glicose, e modulação do desenvolvimento e manutenção ce-lular neuronal.Os termos "isolado" ou "purificado" se referem a uma moléculaque é substancialmente livre de seu ambiente natural. Por exemplo, umaproteína isolada é substancialmente livre de material celular ou outras pro-teínas contaminantes da fonte celular ou tecidual da qual é derivada. A frase"substancialmente Üvre ae materiai ceiuiar" se refere às preparações onde aproteína isolada é pelo menos de 70 % a 80 % (p/p) pura, peio menos de 80% a 89 % (p/p) púra, pelo menos de 90 a 95 % pura, ou pelo menos 96 %,97 %, 98 %, 99 % ou 100 % (p/p) pura.

O termo "LC-MS/MS" se refere à cromatografia líquida na linhacom um espectrômetro de massa programado para isolar um íon molecularde relação massa/carga particular, fragmentar este íon, e registrar a relaçãomassa/carga dos íons fragmentados. Quando se analisa as amostras depeptídeo esta técnica permite separação a montante das amostras comple-xas através da cromatografia líquida, seguido pela gravação das massas deíon fragmentado e subseqüente determinação da seqüência de peptídeo.

O termo "MS/MS" se refere ao processo de uso de um espectrô-metro de massa para isolar um íon molecular de uma relação massa/cargaparticular, fragmentar este íon, e registrar a relação massa/carga dos íonsfragmentados resultantes. Os íons fragmentados fornecem informação acerca da seqüência de um peptídeo.

O termo "tratar" ou "tratamento" refere-se tanto a tratamento te-rapêutico quanto profilático ou medidas preventivas. Aqueles com necessi-dade de tratamento podem incluir indivíduos já tendo um distúrbio médicoparticular assim como aqueles que podem enfim adquirir o distúrbio (isto é,aqueles que necessitam medidas preventivas). O termo tratamento incluitanto medidas que se dirigem à causa básica de um distúrbio quanto medi-das que reduzem os sintomas de um distúrbio médico sem necessariamenteafetar sua causa. Assim, o melhoramento da qualidade de vida e melhorados sintomas são considerados tratamento, como são as medidas que seopõem à causa de um distúrbio.

O termo "distúrbio médico" refere-se aos distúrbios da homeos-tase muscular, óssea ou da glicose, e incluem distúrbios associados com oGDF-8 e/ou outros membros da superfamília do TGF-β (por exemplo, BMP-11).Exemplos de tais distúrbios incluem, mas não são limitados a eles, doençasdistúrbios metabólicos tais como diabetes dependente de insulina (tipo 1),diabetes melito não-d'ependente de insulina (tipo 2), hiperglicemia, tolerânciaà glicose prejudicada, síndrome metabólica (por exemplo, síndrome X), eresistência à insulina induzida por trauma (por exemplo, queimaduras oudesequilíbrio de nitrogênio), e distúrbios do tecido adiposo (por exemplo,obesidade); distúrbios musculares e neuromusculares tais como distrofiamuscular (incluindo, mas não são limitados a eles, distrofia muscular ligadaao X severa ou benigna, distrofia da cintura pélvica, distrofia facioescapu-loumeral, distrofia miotônica, distrofia muscular distai, oftalmoplegia distrófi-ca progressiva, distrofia oculofaríngea, distrofia muscular de Duchenne, edistrofia muscular congênita tipo Fakuyama); esclerose lateral amiotrófica(ALS); atrofia muscular; atrofia dos órgãos, fragilidade; síndrome do túnel docarpo; doença pulmonar obstrutiva congestiva; miopatia congênita; miotoniacongênita; paralisia periódica familiar; mioglobinúria paroxística; miasteniagrave; síndrome Eaton-Lambert; miastenia secundária; atrofia de desnerva-ção; atrofia muscular paroximal; e sarcopenia, caquexia e outras síndromesda debilitação muscular. Outros exemplos incluem osteoporose, especial-mente na mulher idosa e/ou pós-menopáusica; osteoporose induzida porglicocorticóide; osteopenia; osteoartrite; fraturas relacionadas com a osteo-porose; e ferimento traumático ou crônico ao tecido muscular. Ainda outrosexemplos incluem massa óssea baixa devido à terapia de glicocorticóidecrônica, insuficiência gonática prematura, supressão de androgênio, defici-ência de vitamina D, hiperparatiroidismo secundário, deficiências nutricio-nais, e anorexia nervosa.

O termo "aumento na massa" se refere à presença de umaquantidade maior de músculo após o tratamento com proteínas compreen-dendo pelo menos um domínio de folistatina em relação à quantidade demassa muscular presente antes do tratamento.

O termo "benefício terapêutico" se refere a uma melhora dos sin-tomas de um distúrbio, um retardo da progressão de um distúrbio, ou uma ces-sação na progressão de um distúrbio. O benefício terapêutico é determinadomediante a comparação de um aspecto de um distúrbio, tal como a quantidadede massa muscular, antes e após de pelo menos uma proteína que compre-enda pelo menos um domínio de folistatina seja administrada.

O termo "modulação" se refere à variação de uma propriedadede uma proteína mediante o aumento, diminuição ou inibição da atividade,comportamento, ou quantidade da proteína. Por exemplo, as proteínas com-preendendo pelo menos um domínio de folistatina pode modular o GDF-8 me-diante a inibição de sua atividade.

O termo "modificação da estabilização" é qualquer modificaçãoconhecida na técnica ou aqui apresentada capaz de estabilizar uma proteí-na, intensificar a meia-vida in vitro de uma proteína, intensificar a meia-vidacirculatória de uma proteína e/ou reduzir a degradação proteolítica de umaproteína. Tais modificações da estabilização incluem, mas não são limitadosa elas, proteínas de fusão (incluindo, por exemplo, as proteínas de fusãocompreendendo uma proteína que compreende pelo menos um domínio defolistatina e uma segunda proteína), modificação de um sítio de glicosilação(incluindo, por exemplo, a adição de um sítio de glicosilação a uma proteínacompreendendo pelo menos um domínio de folistatina), e modificação daporção de carboidrato (incluindo, por exemplo, a remoção das porções decarboidrato de uma proteína que compreende pelo menos um domínio defolistatina). No caso de uma modificação da estabilização que compreendeuma proteína de fusão (por exemplo, tal que uma segunda proteína é fundi-da a uma proteína compreendendo pelo menos um domínio de folistatina), asegunda proteína pode ser referida como uma "parte estabilizadora" ou"proteína estabilizadora". Por exemplo, uma proteína de uma proteína hu-mana que compreende pelo menos um domínio de folistatina pode ser fun-dida com uma molécula de IgG, em que IgG atua como a proteína estabili-zadora ou parte estabilizadora. Como aqui usado, além de se referir a umasegunda proteína de uma proteína de fusão, uma "parte estabilizadora"também inclui modificações n/ao proteináceas tais como uma porção decarboidrato, ou polímero não proteináceo.O termo "região Fc de uma molécula IgG" se refere ao domíniode Fc de uma imunoglobulina do IgG isotipo, como é bem conhecido paraaqueles versados na técnica. A região Fc de uma molécula IgG é aquelaparte da molécula IgG (IgGI1 lgG2, lgG3 e lgG4) que é responsável de au-mentar a meia-vida do soro in vivo da molécula IgG.

"Meia-vida in vitro" se refere à estabilidade de uma proteína medidafora do contexto de um organismo vivo. Análises para medir a meia-vida in vitrosão bem conhecidas na técnica e incluem, mas não são limitados a eles,SDS-PAGE, ELISA, análises com base na célula, pulse-chase, Western blo-tting, Northern blotting, etc. Estas e outras análises úteis são bem conheci-das na técnica.

"Meia-vida in vivo" se refere à estabilidade de uma proteína emum organismo. A meia-vida in vivo pode ser medida por vários métodos conheci-dos na técnica incluindo, mas não são limitados a eles, meia-vida no soro in vivo,meia-vida circulatória, e análises apresentadas aqui nos exemplos.

"Meia-vida no soro in vivo" se refere à meia-vida de uma proteí-na que circula no sangue de um organismo. Métodos conhecidos na técnicapodem ser usados para medir a meia-vida no soro in vivo. Por exemplo,proteína radioativa pode ser administrada a um animal e a quantidade deproteína rotulada no soro pode ser monitorada durante um tempo.

Para auxiliar na identificação das seqüências listadas no relató-rio descritivo e figuras, a tabela que segue é fornecida, que lista a SEQ IDNO, a localização da figura, e uma descrição da seqüência.

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Descrição Detalhada da Invenção

Proteínas Compreendendo Pelo Menos Um Domínio de Folistatina

A presente invenção refere-se a proteínas, diferentes da folista-tina, tendo um aspecto estrutural único, isto é, em que elas compreendempelo menos um domínio de folistatina. A folistatina em si não é abarcadapela invenção. Acredita-se que as proteínas contendo pelo menos um domí-nio de folistatina se ligarão e inibirão o GDF-8. Exemplos de proteínas tendopelo menos um domínio de folistatina incluem, mas não são limitados a eles,gene relacionado semelhante a folistatina (FLGR), FRP (flik, tsc 36), agrinas,osteonectina (SPARC, BM40), hevina (SC1, mast9, QR1), IGFBP7 (mac25),e U19878. A GASP1, compreendendo as seqüências de nucleotídeo e ami-noácido fornecidas nas Figuras 6 e 7, e a GASP2, compreendendo as se-qüências de nucleotídeo e aminoácido fornecidas nas Figuras 8 e 9, sãooutros exemplos de proteínas que compreendem pelo menos um domíniode folistatina.

Um domínio de folistatina, como mencionado acima, é definidocomo um domínio de aminoácido ou um domínio de nucleotídeo que codificaum domínio de aminoácido, caracterizado por repetições ricas em cisteína.

Um domínio de folistatina tipicamente abrange uma extensão de aminoácidode 65 a 90 e contém 10 resíduos de cisteína conservados e uma região si-milar aos domínios do inibidor da serina protease Kazal. Em geral, as regi-ões de alça entre os resíduos de cisteína apresentam variabilidade de se-qüência nos domínios de folistatina, mas alguma conservação é evidente. Aalça entre a quarta e quinta cisteínas é geralmente pequena, contendo ape-nas 1 ou 2 aminoácidos. Os aminoácidos na alça entre a sétima e oitavacisteínas são geralmente as mais altamente conservadas contendo uma se-qüência de consenso de (G1A)-(S1N)-(S1N1T)-(D1N)-(G1N) seguida por ummotivo (T1S)-Y. A região entre a nona e décima cisteínas geralmente contémum motivo contendo dois resíduos hidrofóbicos (especificamente V, I ou L)separados por outro aminoácido.

As proteínas compreendendo pelo menos um domínio de folis- tatina, que podem se iigar aü GDF-S1 podem ser isoladas usando uma vari-edade de métodos. Por exemplo, pode-se usar purificação de afinidadeusando o GDF-8, como exemplificado na presente invenção. Além disso,pode-se usar uma triagem de severidade baixa de uma biblioteca de cDNA,ou usar técnicas de PCR degeneradas usando uma sonda direcionada pró- xima a um domínio de folistatina. Quanto mais dados genômicos se tornamdisponíveis, pesquisas de similaridade usando vários perfis de seqüência eprogramas de análise, tais como MotifSearch (Genetics Computer Group,Madisonm, Wl), ProfiIeSearch (GCG), e BLAST (NCBI) podem ser usadaspara encontrar novas proteínas contendo homologia significativa com domí-nios de folistatina conhecidos.

Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que ambos GDF-8ou proteínas compreendendo pelo menos um domínio de folistatina podemconter qualquer número de mudanças conservadoras para as suas respecti-vas seqüências de aminoácido sem alterar suas propriedades biológicas.Tais modificações de aminoácido conservadoras baseiam-se na similaridaderelativa dos substituintes da cadeia lateral do aminoácido, por exemplo, suahidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e similares. As substituiçõesconservadoras exemplares que levam várias das características anterioresem consideração são bem conhecidas por aqueles de versada na técnica eincluem: arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutaminae asparagina; e valina, Ieucina e isoleucina. Além disso, as proteínas quecompreendem pelo menos um domínio de folistatina podem ser usadas paragerar fragmentos funcionais compreendendo pelo menos um domínio defolistatina. É esperado que tais fragmentos se liguem e inibam o GDF-8. Em uma modalidade da invenção, as proteínas compreendendo pelo menos umdomínio de folistatina especificamente se ligam ao GDF-8 maduro ou umfragmento deste, quer estejam na forma monomérica, forma de dímero ativo,quer complexas em um complexo latente do GDF-8, com uma afinidade en-tre 0,001 e 100 nM, ou entre 0,01 e 10 nM, ou entre 0,1 e 1 nM.

Seqüências de Nucleotídeo e Proteína

Embora já não necessário, se desejado, uma pessoa versada natécnica pode determinar as seqüências de aminoácido ou ácido nucléico deuma nova proteína que compreende pelo menos um domínio de folistatina.Por exemplo, a presente invenção fornece as seqüências de aminoácido enucleotíde para as GASP1 e GASP2, como mostrado nas Figuras de 6 a 9.

A presente invenção também inclui variantes, homólogos efragmentos de tais seqüências de ácido nucléico e aminoácido. Por exem-plo, a seqüência de ácido nucléico ou aminoácido pode compreender umaseqüência de pelo menos 70 % a 79 % idêntica à seqüência de ácido nu-cléico ou aminoácido da proteína nativa, ou pelo menos 80 % a 89 % idênti-ca, ou pelo menos 90 % a 95 % idêntica, ou pelo menos 96 % a 100 %idêntica. Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que a região que ligao GDF-8 pode tolerar menos variação de seqüência do que as outras partesda proteína não envolvidas na ligação. Assim, estas regiões de não ligaçãoda proteína podem conter variações substanciais sem significativamentealterar as propriedades de ligação da proteína. No entanto, uma pessoa ver-sada na técnica também reconhecerá que muitas mudanças podem serfeitas para especificamente aumentar a afinidade da proteína com relaçãoao seu alvo. Tais mudanças de aumento da afinidade são tipicamente de-terminadas empiricamente mediante a alteração da proteína, que pode estarna região de ligação, e teste da capacidade de se ligar ao 88 ou da resistên-cia da ligação. Todas tais alterações, quer dentro quer fora da região de li-gação, são incluídas no escopo da presente invenção.

A similaridade ou identidade de seqüência relativa pode ser de-terminada usando os programas "Best Fit" ou "Gap" do Sequence AnalysisSoftware Package® (Version 10; Genetics Computer Group, Inc., Universityof Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wl). O "Gap" utiliza o algorit-mo de Needleman and Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970) para en-contrar o alinhamento de duas seqüências que maximiza o número de se-melhanças e minimiza o número de lacunas. O "BestFit" executa um ali-nhamento ideal do melhor segmento de similaridade entre duas seqüências.Os alinhamentos ideais são observados mediante a inserção de lacunaspara maximizar o número de semelhanças usando o algoritmo de homologiade Smiin and VVaterman (Srnith and Waterrnan, ISSI; Smith, et a!., 19S3).

O Sequence Analysis Software Package descrito acima contémvárias outras ferramentas de análise da seqüência úteis para identificar ho-mólogos das seqüências de nucleotídeo e aminoácido no momento apre-sentadas. Por exemplo, o programa "BLAST" (Altschul, et al., 1990) buscaquanto as seqüências similares a uma seqüência de pergunta (ou peptídeoou ácido nucléico) em uma base de dados especificada (por exemplo, basesde dados de seqüência mantida no NCBI; o "FastA" (Lipman and Pearson,1985; ver também Pearson and Lipman, 1988; Pearson, et al., 1990) exe-cuta uma pesquisa Pearson and Lipman com relação à similaridade entreuma seqüência de pergunta e um grupo de seqüências do mesmo tipo (áci-do nucléico ou proteína); o "TfastA" executa uma pesquisa Pearson and Li-pman com relação à similaridade entre uma seqüência de pergunta de pro-teína e qualquer grupo de seqüências de nucleotídeo (traduz as seqüênciasde nucleotídeo em todas as seis estruturas de leitura antes de executar acomparação); o "FastX" executa uma pesquisa Pearson and Lipman comrelação à similaridade entre uma seqüência de pergunta de nucleotídeo eum grupo de seqüências de proteína, levando o deslocamento em conta. O"TfastX" executa uma pesquisa Pearson and Lipman com relação à similari-dade entre uma seqüência de pergunta de proteína e qualquer grupo de se-qüências de nucleotídeo, levando o deslocamento em conta (traduz ambosfilamentos da seqüência nucléica antes de executar a comparação).Proteínas Modificadas

A invenção abrange os fragmentos de proteínas compreenden-do pelo menos um domínio de folistatina. Tais fragmentos provavelmenteincluirão todo ou uma parte do domínio de folistatina. Os fragmentos podemincluir todas, uma parte, ou nenhuma das seqüências entre o domínio defolistatina e o N-terminal e/ou entre o domínio de folistatina e o C-terminal.É compreendido por uma pessoa versada na técnica que certosaminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos em uma estru-tura de proteína sem adversamente afetar a atividade da proteína, porexemplo, características de ligação de uma proteína que compreende pelomenos um domínio de folistatina. Fica assim contemplado pelos inventoresque várias mudanças podem ser feitas na seqüência de aminoácido dasproteínas compreendendo pelo menos um domínio de folistatina, ou se-qüências de DNA que codificam as proteínas, sem perda apreciável de suautilidade ou atividade biológica. Tais mudanças podem incluir anulações,inserções, truncamento, substituições, fusões, embaralhamento das se-qüências de motivo, e similares.

Na execução de tais mudanças, o índice hidropático de aminoá-cidos pode ser considerado. A importância do índice de aminoácido hidro-pático na conferência da função biológica interativa em uma proteína é deuma forma geral compreendida na técnica (Kyte and Doolittle (1982) J. Mol.Biol., 157: 105-132). É aceito que o caráter hidropático relativo do aminoáci-do contribui com a estrutura secundária da proteína resultante, que por suavez define a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, en-zimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos, e similares.

A cada aminoácido foi designado um índice na base de suascaracterísticas de hidrofobicidade e carga (Kyte and Doolittle, 1982); estas sãoisoleucina (+4,5), valina (+4,2), Ieucina (+3,8), fenilalanina (+2,8), cisteína/cistina(+2,5), metionina (+1,9), alanina (+1,8), glicina (-0,4), treonina (-0,7), serina(-0,8), triptofano (-0,9), tirosina (-1,3), prolina (-1,6), histidina (-3,2), gluta-mato (-3,5), glutamina (-3,5), aspartato (-3,5), asparagina (-3,5), Iisina (-3,9),e arginina (-4,5). Na formação de tais mudanças, a substituição de aminoá-cidos possui índices hidropáticos que podem estar dentro de ±2, dentro de±1 e dentro de ±0,5.

É também compreendido na técnica que a substituição de ami-noácidos semelhantes pode ser feita eficazmente na base da hidrofilicidade.A Patente U.S. número 4.554.101 menciona que a hidrofilicidade médicalocal maior de uma proteína, quando governada pela hidrofilicidade de seusaminoácidos adjacentes, correlaciona com uma propriedade biológica daproteína.

Como detalhado na Patente U.S. número 4.554.101, os seguin-tes valores de hidrofilicidade foram designados para os resíduos de aminoá-cido: argininã (+3,0), Iisina (+3,0), aspartatc (+3,0±1), serina (+0,3), aspara-gina (+0,2), glutamina (+0,2), giicina (0), treonina (-0,4), prolina (-0,5±), a!a-nina (-0,5), histidina (-0,5), cisteína (-1,0), metionina (-1,3), valina (-1,5), Ieu-cina (-1,8), isoleucina (-1,8), tirosina (-2,3), fenilalanina (-2,5), e triptofano(-3,4). Na formação de tais mudanças, a substituição de aminoácidos possuivalores de hidrofilicidade que podem estar dentro de ±2, dentro de ±1 edentro de ±0,5.

As modificações podem ser conservadoras tais que a estruturaou função biológica da proteína não é afetada pela mudança. Tais modifica-ções de aminoácido conservadoras se baseiam na similaridade relativa dossubstituintes da cadeia lateral do aminoácido, por exemplo, sua hidrofobici-dade, hidrofilicidade, carga, tamanho e outros mais. As substituições con-servadoras exemplares que levam várias das características anteriores emconsideração são bem conhecidas por aqueles versados na técnica e inclu-em: arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina easparagina; e valina, Ieucina e isoleucina. A seqüência de aminoácido dasproteínas compreendendo pelo menos um domínio de folistatina pode sermodificada para ter qualquer número de mudanças conservadoras, contantoque a ligação da proteína com o seu antígeno alvo não seja adversamenteafetada. Tais mudanças podem ser introduzidas dentro ou fora da parte deligação da proteína que compreende pelo menos um domínio de folistatina.Por exemplo, as mudanças introduzidas dentro da parte de ligação ao antí-geno da proteína podem ser designadas para aumentar a afinidade da pro-teína em relação a seu alvo.

Modificação da Estabilização

As modificações de estabilização são capazes de estabilizaruma proteína, intensificar a meia-vida in vitro e/ou in vivo de uma proteína,intensificar a meia-vida circulatória de uma proteína e/ou reduzir a degrada-ção proteolítica de uma proteína. Tais modificações de estabilização inclu-em, mas não são limitados a elas, proteínas de fusão, modificação de umsítio de glicosilação, e modificação da porção de carboidrato. Uma proteínaestabilizadora pode ser qualquer proteína que intensifica a estabilidade glo-bal do pró-peptídeo do GDF modificado. Como será reconhecido por umapessoa versada na técnica, tal proteína de fusão pode opcionalmente com-preender um peptídeo articulador entre a parte de pró-peptídeo e a parte deestabilização. Como é bem conhecido na técnica, as proteínas de fusão sãopreparadas tais que a segunda proteína é fundida na estrutura com a primei-ra proteína tal que a proteína transladada resultante compreende tanto aprimeira quanto a segunda proteína. Por exemplo, na presente invenção,uma proteína de fusão pode ser preparada tal que uma proteína que com-preende pelo menos um domínio de folistatina é fundida a uma segundaproteína (por exemplo, uma parte da proteína estabilizadora). Tal proteína de fusão é preparada tal que a proteína transladada resultante contém tantoa parte de pró-peptídeo quanto a parte estabilizadora.

As proteínas compreendendo pelo menos um domínio de folis-tatina podem ser glicosiladas ou ligadas à albumina ou um polímero nãoproteináceo. Por exemplo, as proteínas que compreendem pelo menos umdomínio de folistatina podem ser ligadas a um de uma variedade de políme-ros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, oupolioxialquilenos, da maneira apresentada nas Patentes U.S. números4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ou 4.179.337. Asproteínas são quimicamente modificadas por conjugação covalente a umpolímero para aumentar sua meia-vida de circulação, por exemplo. Os polí-meros, e métodos para ligá-los aos peptídeos, são também apresentadosnas Patentes U.S. números 4.766.106; 4.179.337; 4.495.285 e 4.609.546.

As proteínas compreendendo pelo menos um domínio de folis-tatina podem ser submetidas a peg. Submeter a peg é um processo pormeio do qual polietileno glicol (PEG) é ligado a uma proteína de modo a es-tender a meia-vida da proteína no corpo. Submeter a peg as proteínas com-preendendo pelo menos um domínio de folistatina pode diminuir a dose oufreqüência de administração das proteínas necessárias para uma inibiçãoideal do GDF-8. Revisões da técnica são fornecidas em Bhadra et al. (2002)Pharmazie, 57: 5-29, e em Harris et al. (2001) Clin. Pharmacokinet., 40: 539-551.

As proteínas compreendendo pelo menos um domínio de foiis-tatina podem ser iigaaas a uma região Fc de urna molécula IgG. As proteí-nas que compreendem pelo menos um domínío de foiistatina podem serfundidas adjacentes à região Fc da molécula IgG1 ou ligadas à região Fc damolécula IgG através de um peptídeo articulador. O uso de tais peptídeosarticuladores é bem conhecido na técnica de bioquímica da proteína. A regi-ão Fc pode ser derivada da IgGI ou lgG4, por exemplo.

As proteínas compreendendo pelo menos um domínio de foiis-tatina podem ser modificadas para ter um padrão de glicosilação alterado(isto é, alterado a partir do padrão de glicosilação original ou nativo). Comoaqui usado, "alterado" significa tendo uma ou mais porções de carboidratoanuladas, e/ou tendo um ou mais sítios de glicosilação adicionados à proteí-na original.

A glicosilação de proteínas é tipicamente ou ligada a N ou ligada aO. Ligada a N se refere à ligação da porção de carboidrato à cadeia lateralde um resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto proli-na, são as seqüências de reconhecimento para a ligação enzimática da por-ção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença decada uma destas seqüências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um sítiode glicosilação potencial. A glicosilação ligada a O se refere à ligação de umdos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um ácido de hi-droxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou5-hidroxilisina pode também ser usada.

A adição de sítios de glicosilação às proteínas compreendendopelo menos um domínio de foiistatina é convenientemente executada medi-ante a alteração da seqüência de aminoácido que contém uma ou mais se-qüências de tripeptídeo descritas acima (com relação aos sítios de glicosila-ção ligados a Ν). A alteração pode também ser feita pela adição de, ousubstituição por, um oii mais resíduos de serina ou treonina à seqüência daproteína original (com relação aos sítios de glicosilação ligados a O). Porcomodidade, a seqüência de aminoácido da proteína pode ser alterada atra-vés de mudanças no nível do DNA.

Outro meio de aumentar o número de porções de carboidratonas proteínas é por acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos aosresíduos de aminoácido da proteína. Estes procedimentos são vantajososem que eles não requerem produção do inibidor de peptídeo do GDF emuma célula hospedeira que possui capacidades de glicosilação para a glico-silação ligada a N ou O. Dependendo do modo de acoplamento usado, osaçúcares podem ser ligados a (a) arginina e histidina, (b) grupos de carbo-xila livres, (c) grupos de sulfidrila livres tais como aqueles da cisteína, (d)grupos de hidroxila livres tais como aqueles de serina, treonina ou hidroxi-prolina, (e) resíduos aromáticos tais como aqueles de fenilalanina, tirosina,ou triptofano, ou (f) o grupo de amida de glutamina. Estes métodos são des-critos no WO 87/05330, e em Aplin and Wriston (1981) CRC Crít. Rev. Bio-chem., 22: 259-306.

A remoção de quaisquer porções de carboidrato presentes nasproteínas que compreendem pelo menos um domínio de folistatina pode serexecutada química ou enzimaticamente. A desglicosilação química requer aexposição da proteína ao ácido trifluorometanossulfônico, ou um compostoequivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maioria ou todos osaçúcares exceto o açúcar de ligação (N-acetilglicosamina ou N-acetilgalacto-samina), enquanto se deixa a seqüência de aminoácido intacta.

A desglicosilação química é descrita por Hakimuddin et al.(1987) Arch. Biochem. Biophys., 259: 52; e Edge et al. (1981) Anal. Biochem.,118: 131. A clivagem enzimática das porções de carboidrato sobre os inibi-dores de peptídeo do GDF pode ser obtida mediante o uso de uma varieda-de de endo- e exoglicosidases como descrito por Thotakura ewt al. (1987)Meth. Enzymol., 138: 350.

As proteínas compreendendo pelo menos um domínio de folis-tatina podem ser ligadas à proteína albumina ou um derivado de albumina.Métodos para a ligação de proteínas e polipeptídeos à albumina ou deriva-dos de albumina são bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, a Pa-tente U.S. número 5.116.944.

Composições Farmacêuticas

A presente invencao fornece composicoes contendo proteinasque compreendem peio menos um domínio de foiistaiina. Tais composiçõespodem ser adequadas para uso farmacêutico e administração aos pacien-tes. As composições tipicamente contêm uma ou mais proteínas compreen-dendo pelo menos um domínio de folistatina e um excipiente farmaceutica-mente aceitável. Como aqui usado, a frase "excipiente farmaceuticamenteaceitável" inclui qualquer um e todos os solventes, meio de dispersão, re-vestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e deretardo da absorção, e similares, que são compatíveis com a administraçãofarmacêutica. O uso de tal meio e agentes para substâncias farmaceutica-mente ativas é bem conhecido na técnica. As composições podem conteroutros compostos ativos que fornecem funções terapêuticas suplementares,adicionais ou intensificadas. As composições farmacêuticas podem tambémser incluídas em um recipiente, embalagem ou dispensador juntamente comas instruções para a administração.

Uma composição farmacêutica da invenção é formulada paraser compatível com sua via de administração pretendida. Os métodos paraexecutar a administração são conhecidos por aqueles versados na técnica.A administração pode, por exemplo, ser intravenosa, intramuscular ou sub-cutânea.

As soluções ou suspensões usadas para aplicação subcutâneatipicamente incluem um ou mais dos seguintes componentes: um diluenteestéril tal como água para injeção, solução de salina, óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes sintéticos; agentes an-tibacterianos tais como álcool benzílico ou parabenos de metila; antioxidan-tes tais como ácido ascórbico ou bissulfeto de sódio; agentes de quelaçãotais com ácido etilenodiaminatetraacético; tampões tais como acetatos, ci-tratos ou fosfatos; e agentes para o ajuste da tonicidade tal como cloreto desódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais comoácido clorídrico ou hidróxido de sódio. Tais preparações podem ser incluídasem ampolas, seringas descartáveis ou frascos pequenos de múltiplas dosesfeitos de vidro ou plástico.

As composições farmacêuticas adequadas para injeção incluemsoluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparaçãoimprovisada de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Para administra-ção intravenosa, os veículos adequados incluem soro fisiológico, água bac-teriostática, Cremophor EL® (BASF, Parsippany, NJ) ou salina tamponada de fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição deve ser estéril e deveser fluida na medida em que a capacidade de injetar com seringa facilmenteexista. Deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenagem edeve ser preservada contra a ação de microorganismos contaminantes taiscomo bactérias e fungos. O veículo deve ser um solvente ou meio de dis- persão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol,propileno glicol e polietileno glicol líquido, e similares), e misturas adequadasdestes. A própria fluidez pode ser mantida, por exemplo, mediante o uso deum revestimento tal como lecitina, mediante a manutenção do tamanho departícula requerido no caso de dispersão e mediante o uso de tensoativos. A prevenção da ação de microorganismos pode ser obtida por vários agentesantibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol,ácido ascórbico, timerosal, e similares. Em muitos casos, pode-se incluiragentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol,sorbitol, cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das com-posições injetáveis pode ser efetuada mediante a inclusão na composiçãode um agente que retarde a absorção, por exemplo, monoestearato de alu-mínio e gelatina. .....

Em uma modalidade, as proteínas compreendendo pelo menosum domínio de folistatina são preparadas com veículos que protegerão o composto contra a eliminação rápida do corpo, tal como uma formulação deliberação controlada, incluindo implantes e sistemas de liberação microen-capsulados. Polímeros biodegradáveis e biocompatíveis podem ser usados,tais como acetato de étileno vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, coláge-no, poliortoésteres, e ácido poliláctico. Métodos para a preparação de taisformulações serão evidentes para aqueles versados na técnica. Os materi-ais podem também ser obtidos comercialmente da Alza Corporation andNova Pharrnaceuticais, independentemente. Suspensões iipossômicascontendo proteínas compreendendo pelo menos um domínio de folistatinapodem também ser usadas como veículos farmaceuticamente aceitáveis.Estas podem ser preparadas de acordo com os métodos conhecidos da-queles versados na técnica, por exemplo, como descrito na Patente U.S.número 4.522.811.

Os agentes terapeuticamente úteis, tais com fatores do cresci-mento (por exemplo, BMPs, TGF-β, FGF, IGF), citocinas (por exemplo, in-terleucinas e CDFs), antibióticos, e qualquer outro agente terapêutico bené-fico para a condição sendo tratada, podem opcionalmente ser incluídos ouadministrados simultânea ou seqüencialmente com as proteínas compreen-dendo pelo menos um domínio de folistatina.

É especialmente vantajoso formular composições na forma dedosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosa-gem. A forma unitária de dosagem com aqui usada refere-se a unidadesfisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para o paciente aser tratado; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada decomposto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado emassociação com o veículo farmacêutico requerido. O relatório descritivo paraas formas unitárias de dosagem da invenção é ditado e diretamente depen-dente das características únicas do composto ativo e o efeito terapêuticoparticular a ser obtido, e as limitações inerentes na técnica de compor um talcomposto ativo para o tratamento de indivíduos.Indicações de Tratamento

As proteínas que compreendem pelo menos um domínio de fo-listatina são úteis para prevenir, diagnosticar ou tratar vários distúrbios mé-dicos em seres humanos ou animais. Conseqüentemente, a presente inven-ção fornece um método para o tratamento de doenças e distúrbios relacio-nados às células musculares e tecido, mediante a administração a um paci-ente de uma composição compreendendo pelo menos uma proteína quecompreende pelo menos um domínio de folistatina em uma quantidade sufi-ciente para melhorar os sintomas da doença. Tais distúrbios incluem distro-fias musculares, incluindo, mas não são limitados a eles, distrofia muscularligada ao X severa ou benigna, distrofia da cintura pélvica, distrofia facioes-capuloumeral, distrofia miotônica, distrofia muscular distai, oftalmoplegiadistrófica progressiva, distrofia oculofaríngea, distrofia muscular e Duchen-ne, e distrofia muscular congênita tipo Fakuyama; esclerose lateral amiotró-fica (ALS); atrofia muscular; atrofia dos órgãos, fragilidade; síndrome do tú-nel do carpo; doença pulmonar obstrutiva congestiva; miopatia congênita;miotonia congênita; paralisia periódica familiar; mioglobinúria paroxística;miastenia grave; síndrome Eaton-Lambert; miastenia secundária; atrofia dedesnervação; atrofia muscular paroximal; e sarcopenia, caquexia e outrassíndromes da debilitação muscular. A invenção também refere-se a feri-mento traumático ou crônico do tecido muscular.

Além de fornecer terapia para as doenças e distúrbios muscula-res, a presente invenção também fornece métodos para prevenir ou tratardoenças ou distúrbios metabólicos resultantes da homeostase da glicoseanormal. Tais doenças ou distúrbios incluem doenças e distúrbios metabóli-cos (tais como diabetes melito dependentes de insulina (tipo 1), diabetesmelito não-dependentes de insulina (tipo 2)), hiperglicemia, tolerância à gli-cose prejudicada, síndrome metabólica (por exemplo, síndrome X), obesida-de e resistência à insulina induzida por trauma (por exemplo, queimadurasou desequilíbrio de nitrogênio), distúrbios do tecido adiposo (tais como obe-sidade), ou doença degenerativa óssea (tal como osteoporose, especial-mente na mulher idosa e/ou pós-menopausa; osteoporose induzida por gli-cocorticóide; osteopenia; osteoartrite; e fraturas relacionadas com a osteo-porose). Ainda outros exemplos incluem massa óssea baixa devido à terapiade glicocorticóide crônica, insuficiência gonática prematura, supressão deandrogênio, deficiência de vitamina D, hiperparatiroidismo secundário, defi-ciências nutricionais, e anorexía nervosa.

A homeostase de glicose normal requer a orquestração fina-mente sintonizada de secreção de insulina pelas células beta pancreáticasem resposta às mudanças sutis nos níveis de glicose no sangue. Uma dasações fundamentais da insulina é estimular a absorção de glicose a partir dosangue nos tecidos, especialmente músculo e gordura.

Conseqüentemente, a presente invenção fornece um métodopara tratar diabetes melito e distúrbios relacionados, tais como obesidade ouhiperglicemia, mediante a administração a um paciente de uma composiçãoque compreende pelo menos uma proteína compreendendo pelo menos umdomínio de folistatina em uma quantidade suficiente para melhorar os sin-tomas da doença. A Diabetes melito tipo 2 ou não-dependente de insulina(NIDDM), em particular, é caracterizada por uma tríade de (1) resistência àação de insulina sobre a absorção de glicose nos tecidos periféricos, espe-cialmente músculo esquelético e adipócitos, (2) ação da insulina prejudicadapara inibir a produção de glicose hepática, e (3) secreção da insulina desre-gulada (DeFronzo (1997) Diabetes Rev. 5: 177-269). Portanto, os pacientesque sofrem de diabetes tipo 2 podem ser tratados de acordo com a presenteinvenção mediante á administração da proteína compreendendo pelo menosum domínio de folistatina, que aumenta a sensibilidade à insulina e absor-ção de glicose pelas células.

Similarmente, outras doenças ou distúrbios metabólicos caracte-rizados pela disfunção de insulina (por exemplo, resistência inatividade oudeficiência) e/ou transporte de glicose insuficiente para dentro das célulaspodem ser tratadas de acordo com a presente invenção mediante a admi-nistração de uma proteína que compreende pelo menos um domínio de fo-listatina, que aumenta a sensibilidade à insulina e absorção de glicose pelascélulas.Métodos de Tratamento Usando Proteínas

As proteínas que compreendem pelo menos um domínio de fo-listatina podem ser usadas para inibir ou reduzir uma ou mais atividades as-sociadas com a proteína do GDF-8 (quer na forma monomérica, forma ativa dimérica, quer complexa em um complexo latente do GDF-8), em relação auma proteína do GDF-8 não-ligada pela mesma proteína. Em uma modali-dade, a atividade da proteína do GDF-8 maduro, quando ligada por umaproteína compreendendo pelo menos um domínio de folistatina, é inibidapelo menos 50 %, ou pelo menos 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 72, 76, 78, 80, 82, 84, 86 ou 88 %, ou pelo menos 90, 91, 92, 93 ou 94 %, ou pelo menosde 95 % a 100 % em relação a uma proteína do GDF-8 maduro que não éligada por uma proteína tendo um domínio de folistatina.

As preparações farmacêuticas compreendendo proteínas quecompreendem pelo menos um domínio de folistatina são administradas emquantidades terapeuticamente eficazes. Como aqui usado, uma "quantidadeeficaz" da proteína é uma dosagem que seja suficiente para reduzir a ativi-dade do GDF-8 para se obter um resultado biológico desejado. O resultadobiológico desejado pode ser qualquer benefício terapêutico incluindo umaumento na massa muscular, um aumento na resistência muscular, metabo- lismo melhorado, adiposidade diminuída ou homeostase da glicose melho-rada. Tais melhoras podem ser medidas por uma variedade de métodos in-cluindo aqueles que medem a massa corporal da carne magra e gordura (talcomo análise de escaneamento por raio χ duplo), resistência muscular, lipí-deos no soro, Ieptina no soro, glicose no soro, hemoglobina glicada, tolerân-cia à glicose, e melhora na complicação secundária de diabetes.

Geralmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode vari-ar com a idade do paciente, condição e sexo, assim como a gravidade dacondição médica no paciente. A dosagem pode ser determinada por ummédico e ajustada, quando necessário, para adequar os efeitos observadosdo tratamento. As dosagens apropriadas para administrar pelo menos umaproteína compreendendo pelo menos um domínio de folistatina podem vari-ar de 5 mg a 100 mg, de 15 mg a 85 mg, de 30 mg a 70 mg, ou de 40 mg a60 mg. As proteínas podem ser administradas em uma dose, ou em inter-valos tais como uma vez diariamente, uma vez semanalmente, e uma vezmensalmente. Os planos de dosagem podem ser ajustados dependendo daafinidade da proteína com relação ao GDF-8, a meia-vida da proteína, ou agravidade da condição ao paciente. Geralmente, as composições são admi-nistradas como uma dose de bolo, para maximizar os níveis de circulaçãodas proteínas compreendendo pelo menos um domínio de folistatina para amaior extensão de tempo após a dose. A infusão contínua pode também serusada após a dose de bolo.

A toxicidade e eficácia terapêutica de tais compostos podem serdeterminadas por procedimentos farmacêuticos padrão nas culturas celula-res ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a doseletal em 50 % da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em50 % da população). A relação de dose entre os efeitos tóxicos e terapêuti-cos é o índice terapêutico e pode ser expresso como a relação LD50ZED50. Asproteínas compreendendo pelo menos um domínio de folistatina que apre-sentam grandes índices terapêuticos podem ser usadas.

Os dados obtidos das análises de cultura celular e estudos deanimais podem ser usados na avaliação de uma faixa de dosagem para usoem seres humanos. A dosagem de tais compostos pode ficar dentro de umafaixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou ne-nhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendoda forma de dosagem empregada e a via de administração utilizado. Paraqualquer proteína que compreenda pelo menos um domínio de folistatinausada na presente invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser esti-mada inicialmente das análises de cultura celular. Uma dose pode ser for-mulada em modelos animais para se obter uma faixa de concentração noplasma circulante que inclua a IC50 (isto é, a concentração da proteína deteste que alcance uma meia inibição máxima de sintomas) como determina-do na cultura celular. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo,por cromatografia líquida de desempenho elevado. Os efeitos de qualquerdosagem particular podem ser monitorados por um bioensaio adequado.Exemplos de bioensaios adequados incluem ensaio de ligação da proteí-na/receptor do GDF-8, ensaios de creatina cinase, ensaios com base naabsorção da glicose em adipócitos, e ensaios imunológicas.

Métodos de Administração do DNA

A presente invenção também fornece terapia genética para aprodução in vivo de proteínas compreendendo pelo menos um domínio defolistatina. Tal terapia deve obter seu efeito terapêutico mediante a introdu-ção das seqüências de polinucleotídeo dentro das células ou tecidos tendoos distúrbios como aqui listados.

A liberação das seqüências de polinucleotídeo de proteínas quecompreendem pelo menos um domínio de folistatina pode ser obtida usandoum vetor de expressão recombinante tal como um vírus quimérico ou umsistema de dispersão coloidal. Os Iipossomas alvos podem ser usados paraliberação terapêutica das seqüências de polinucleotídeo. Vários vetores vi-rais que podem ser utilizados para a terapia genética incluem adenovírus,vírus da herpes, vacinia, ou um vírus de RNA tal como um retrovírus. O ve-tor retroviral pode ser um derivado de um retrovírus de murino ou aviário.Exemplos de vetores retrovirais em que um gene estranho isolado pode serinserido incluem, mas não são limitados a: vírus da leucemia de murino Mo-Ioney (MoMuLV), vírus do sarcoma de murino Harvey (HaMuSV)1 vírus dotumor de mama de murino (MuMTV), e vírus do sarcoma de Rous (RSV).Vários vetores retrovirais adicionais podem incorporar múltiplos genes. To-dos estes vetores podem transferir ou incorporar um gene para um marca-dor selecionável de modo que as células transduzidas possam ser identifi-cadas e geradas. Mediante a inserção de uma seqüência de polinucleotídeode pró-peptídeo do GDF de interesse dentro do vetor viral, junto de um outrogene que codifica o ligando para um receptor em uma célula alvo específica,por exemplo, o vetor é agora específico do alvo.

Os vetores retrovirais podem ser produzidos específicos do alvomediante a incorporação, por exemplo, de um açúcar, um glicolipídeo ouuma proteína. O direcionamento ao alvo pode ser executado mediante o usode um anticorpo. Aqueles de versados na técnica reconhecerão que as se-qüências de polinucleotídeo específicas podem ser inseridas dentro do ge-noma retroviral ou ligadas a um invólucro viral para permitir a liberação es-pecífica ao alvo do vetor retroviral contendo o polinucleotídeo das proteínasque compreendem pelo menos um domínio de folistatina. Em uma modali-dade, o vetor é direcionado ao alvo nas células musculares ou tecido mus-cular.

Visto que os retrovírus recombinantes são defectivos, eles re-querem linhagens celulares auxiliares que contenham plasmídeos que codi-fiquem todos os genes estruturais do retrovírus sob o controle de seqüên-cias reguladoras dentro do LTR. Estes plasmídeos são extraviados de umaseqüência de nucleotídeo que permite o mecanismo de acondicionamentoreconhecer um RNA transcrito para encapsulação. As linhagens celularesauxiliares que possuem anulações do sinal de acondicionamento incluem,mas não são limitados a eles, PSI.2, PA317 e PA12, por exemplo. Estaslinhagens celulares produzem vírions vazios, visto que nenhum genoma éacondicionado. Se um vetor retroviral for introduzido dentro de tais célulasem que o sinal de acondicionamento está intacto, mas os genes estruturaissão substituídos por outros genes de interesse, o vetor pode ser embalado eo vírion do vetor produzido.

Alternativamente, outras células de cultura tecidual podem serdiretamente transfectadas com plasmídeos que codificam os genes estrutu-rais retrovirais gag, pol e env, mediante a transfecção convencional de fos-fato de cálcio. Estas células são depois transfectadas com o plasmídeo ve-tor contendo os genes de interesse. As células resultante liberam o vetorretroviral dentro do meio de cultura.

Outro sistema de liberação direcionada ao alvo para um polinu-cleotídeo de uma proteína que compreende pelo menos um domínio de fo-listatina é um sistema de dispersão coloidal. Os sistemas de dispersão co-Ioidal incluem complexos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas,contas, e sistemas com base em lipídeos incluindo emulsões de óleo-em-água, micelas, micelas misturadas, e lipossomas. Os Iipossomas são vesí-culas de membrana artificial que são úteis como veículos de liberação invitro e in vivo. Os RNA1 DNA e vírions intactos podem ser encapsuladosdentro do interior aquoso e ser liberados nas células em uma forma biologi-camente ativa (ver, por exemplo, Fraley, et al. (1981) Trends Biochem. Sci.,6: 77). Os métodos para a transferência genética eficiente usando um veí-culo lipossômico, são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Mannino1 etal. (1988) Biotechniques, 6: 682. A composição do Iipossoma é geralmenteuma combinação de fosfolipídeos, geralmente em combinação com esterói-des, especialmente colesterol. Outros fosfolipídeos ou outros lipídeos po-dem também ser usados. As características físicas dos Iipossomas depen-dem do pH, resistência iônica, e a presença de cátions divalentes.

Exemplos de lipídeos úteis na produção de Iipossoma incluemcompostos de fosfatidila, tais como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfati-dilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolipídeos, cerebrosídeos e gangliosí-deos. Os fosfolipídeos ilustrativos incluem fosfatidilcolina de ovo, dipalmi-toilfosfatidilcolina e distearoilfosfatidilcolina. O direcionamento do alvo dosIipossomas é também possível com base na, por exemplo, organoespecifici-dade, especificidade da célula, e especificidade da organela e é conhecidona técnica.

Existe uma ampla faixa de métodos que podem ser usados paraliberar as células que expressam proteínas compreendendo pelo menos umdomínio de folistatina a um sítio para uso na modulação de uma resposta doGDF-8. Em uma modalidade da invenção, as células que expressam proteí-na de folistatina podem ser liberadas pela aplicação direta, por exemplo,injeção direta de uma amostra de tais células no sítio de dano do tecido.Estas células podem ser purificadas. As tais células podem ser liberadas emum meio ou matriz que parcialmente impede sua mobilidade de modo a lo-calizar as células a um sítio de ferimento. Um tal meio ou matriz pode sersemi-sólido, tal como uma pasta ou gel, incluindo um polímero semelhante agel. Alternativamente, o meio ou matriz pode estar na forma de um sólido,um sólido poroso que permitirá a migração das células dentro da matriz sóli-da, e sustentá-las enquanto se permite a proliferação das células.Métodos de Detecção e Isolamento do GDF-8

As proteínas compreendendo pelo menos um domínio de folis-tatina podem ser usadas para detectar a presença ou nível de GDF-8, invivo ou in vitro. Mediante a correlação da presença ou nível destas proteínascom uma condição médica, uma pessoa versada na técnica pode diagnos-ticar a condição médica associada. As condições médicas associadas quepodem ser diagnosticadas pelas proteínas que compreendem pelo menosum domínio de folistatina são aqui apresentadas.

Tais métodos de detecção são bem-conhecidos na técnica eincluem ELISA, radioimunoensaio, imunoblot, Western blot, imunofluores-cência, imunoprecipitação, e outras técnicas comparáveis. As proteínascompreendendo pelo menos um domínio de folistatina podem ainda ser for-necidas em um kit de diagnóstico que incorpora uma ou mais destas técni-cas para detectar o GDF-8. Um tal kit pode conter outros componentes, em-balagens, instruções, ou outro material para auxiliar a detecção da proteínae uso do kit.

Onde as proteínas que compreendem pelo menos um domíniode folistatina forem destinadas para propósitos de diagnóstico, pode ser de-sejável modificá-las, por exemplo, com um grupo de ligando (tal como biotina)ou um grupo marcador detectável (tal como um grupo fluorescente, um radioi-sótopo ou uma enzima). Se desejável, as proteínas podem ser rotuladas usan-do técnicas convencionais. Os rótulos adequados incluem fluoróforos, cro-móforos, átomos radioativos, reagentes densos de elétrons, enzimas, e Ii-gandos tendo pares de ligação específicos. As enzimas são tipicamentedetectadas por sua atividade. Por exemplo, a peroxidase de rábano silvestreé geralmente detectada por sua capacidade de converter 3,3',5,5'-tetrame-tilbenzidina (TMB) em um pigmento azul, quantificável com um espectrofo-tômetro. Outros pares de ligação adequados incluem biotina e avidina ouestreptavidina, IgG e proteína A, e os pares de ligando receptor conhecidosna técnica. Outras permutações e possibilidades serão facilmente evidentespara aqueles versados na técnica, e são consideradas como equivalentesdentro do escopo da presente invenção.As proteínas compreendendo pelo menos um domínio de folis-tatina ou fragmentos destas podem também ser úteis para o isolamento doGDF-8 em um processo de purificação. Em um tipo de processo, as proteí-nas podem ser imobilizadas, por exemplo, através da incorporação em umacoluna ou resina. As proteínas são usadas para ligar o GDF-8 e depoissubmetidas às condições que resultam na liberação do GDF-8 ligado. Taisprocessos podem ser usados para a produção comercial de GDF-8.

Os exemplos que seguem fornecem as modalidades da inven-ção. Uma pessoa versada na técnica reconhecerá as numerosas modifica-ções e variações que podem ser executadas sem alterar o espírito e escopoda presente invenção. Tais modificações e variações são julgadas seremabarcadas dentro do escopo da invenção. Os exemplos não limitam dequalquer maneira a invenção. Fica entendido que todos os números no re-latório descritivo e reivindicações são modificados pelo termo cerca de,como pequenas mudanças nas dosagens, por exemplo, devem ser conside-rados estarem dentro do escopo da invenção.

Exemplos

Exemplo 1: Purificação de Contas Conjugadas de JA16

Contas ativadas de N-hidroxissuccinimidila (rosário de agarose a4 %, Sigma H-8635, St Louis MO) foram lavadas em MiIIiQ-H2O e incubadaspor 4 horas a 4°C com o anticorpo monoclonal anti-GDF-8 JA16 (3 a 4 μg/μlem 100 mM MOPS, pH 7,5) em uma relação para deixar uma concentraçãofinal de 10 mg de resina JA16/ml. As contas foram lavadas extensivamentecom 100 mM MOPS pH 7,5 e solução salina tamponada de fosfato (PBS)(Ausubel et al, (1999) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons) e armazenadas a 4°C em PBS até o uso. Contas de controle forampreparadas identicamente sem o anticorpo JA16.Exemplo 2: Purificação por Afinidade

Um total de 40 μΙ de contas conjugadas JA16 ou de controleacondicionadas foi incubado com 15 ml de soro de camundongo Balb/Cnormal (Golden West Biologicals, Temecula CA) ou 30 ml de soro humanonormal combinado (ICN Biomedical1 Aurora OH) por 3 horas a 4°C. As con-tas foram lavadas duas vezes em -10 ml de 1 % Triton X-100/PBS gelado,duas vezes em -10 ml de 0,1 % Triton X-100/PBS gelado, e duas vezes em~1 ml de PBS gelado. As proteínas foram eluídas a partir das contas em trêsetapas subseqüentes. Primeira, as contas foram tratadas com uma 'eluição de::mock!", onde 100 μ! de PBS foram adicionados nas contas e incubadas a 4°Cpor 30 minutos. O sobrenadante foi coieiaao e combinado corn 30 μΐ 4x tampãode amostra LDS (Invitrogen, Cailsbad CA). Segunda, as contas foram subme-tidas a uma 'eluição de peptídeo', 100 μΙ de peptídeo concorrente a 1 μg/μl(seqüência: DFGLDSDEHSTESRSSRYPLTVDFEAFGWD-COOH (SEQ IDNO:12)) em PBS foram adicionados às contas e novamente incubadas a4°C por 30 minutos. O sobrenadante foi coletado como antes. Terceira, ascontas foram tratadas com uma técnica de 'eluição SDS', onde 30 μΙ detampão 4x LIDS (Invitrogen) e 100 μΙ de PBS foram adicionados às contas eaquecidos para 80°C por 10 minutos antes da transferência do sobrena-dante para um tubo novo.

Um gel manchado de prata das proteínas liberadas em cadauma das etapas de eluição é mostrado na Figura 1. Duas faixas de proteínano gel manchado de prata apresentadas na Figura 1 de aproximadamente12 e 36 kDa foram especificamente eluídas a partir das contas conjugadasJA16, mas não das contas de controle não-conjugadas.

Exemplo 3: Espectrometria de Massa

As amostras forma reduzidas com agente redutor NuPage 10x(Invitrogen) por 10 minutos a 80°C e alquiladas com 110 μΜ iodoacetamidapor 30 minutos a 22°C no escuro. As amostras foram manipuladas imedia-tamente em géis NuPage Bis-Tris a 10 % em um sistema tampão MES deacordo com as recomendações do fabricante (Invitrogen) e manchadas deprata usando um sistema livre de gluteraldeído (Shevchenko, et al., (1996)Anal. Chem., 68: 850-858). As faixas foram cortadas e digeridas com Se-quencing Grade Modified Trypsin (Promega, Madison Wl) em um AbimedDigest Pro (Langenfeld, Germany) ou ProGest Investigator (Genomics Solu-tions, Ann Arbor Ml). O volume de amostras digeridas foi reduzido por eva-poração e suplementado com ácido acético a 1 % para um volume final de-20 μl. As amostras (5 a 10 μl) foram carregadas em uma coluna de fasereversa C18 de diâmetro interno de 10 cm χ 75 μm acondicionada com umaagulha Picofrit (New Objectives, Woburn MA). Os dados de MS/MS foramcoletados usando um espectrômetro de massa LCQ Deca ou LCQ Deca XP(Finnigan, San Jose CA) e pesquisados junto à base de dados não-redun-dante NCBI usando o programa Sequest (Finnigan). A não ser que de outramaneira mencionada, todas as seqüências de peptídeo listadas neste do-cumento corresponderam aos espectros de MS/MS que foram julgados dealta qualidade por inspeção manual e produziram escores Xcorr > 2,5 no sis-tema de classificação Sequest.

Exemplo 4: Western blots

As proteínas foram transferidas para uma membrana de nitro-celulose de 0,45 μηη (Invitrogen) e bloqueadas com tampão de bloqueio(leite em pó desnatado a 5 % em solução salina Tris-tamponada (TBS: 10 mMTris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCI)) em 4°C durante a noite. Os blots foram de-pois investigados com anticorpo primário diluído 1:1000 com tampão de blo-queio por 1 a 3 horas em temperatura ambiente, lavadas 5x com TBS, in-vestigadas com anticorpo secundário conjugado com rábano silvestre emtampão de bloqueio por 1 a 3 horas em temperatura ambiente, e lavadascomo antes. Os sinais foram detectados por auto-radiografia usando o WestPico Substrate (Pierce).

Exemplo 5: Isolamento do GDF-8

Uma experiência usando os métodos descritos nos Exemplosanteriores resultou no isolamento do GDF-8. Visto que o GDF-8 em sua for-ma reduzida é 12 kDa, especulamos que a proteína na faixa inferior do gelmanchado de prata apresentado na Figura 1 era GDF-8 maduro. Para con-firmar esta hipótese, cortamos esta faixa, a digerimos com tripsina, e obti-vemos espectros de MS/MS dos peptídeos resultantes por LC-MS/MS. Osespectros de MS/MS que correspondem a seus peptídeos trípticos confirma-ram que o GDF-8 maduro foi isolado desta região do gel, como mostrado naFigura 2A e Tabela 1.

A Tabela 1 lista os peptídeos derivados do GDF-8 (SEQ IDN0:13-20), pró-peptídeo do GDF-8 (SEQ ID NO:21-27), FLRG (SEQ IDN0:28-30), e GASP1 (SEQ ID NO:31-35) que foram observados nos imuno-precipitados JA16 do soro de camundongo e humano. O aminoácido imedi-atamente precedente na seqüência de proteína é mostrado em parêntesespara cada peptídeo e o estado de carga ao peptíaeo (z) e o coeficiente aecorrelação do programa Sequest (Xcorr, uma medida de confiança) são lista-dos. Os números da Jistagem das seqüências na tabela referem-se apenasaos peptídeos isolados e suas seqüências. Os aminoácidos precedentesnos parênteses não são incluídos nos peptídeos, mas são fornecidos ape-nas para referência. Todos os espectros foram confirmados por inspeçãomanual.

De maneira interessante, o Western blot também continha umafaixa correspondendo ao GDF-8 de comprimento total não-processado (43kDa), subentendendo que alguma parte desta molécula é secretada no sorosem passar por processamento proteolítico (Figura 2B). A presença deGDF-8 não-processado foi confirmada por espectrometria de massa (dadosnão-mostrados). Assim, o método de purificação por afinidade eficazmenteisolou o GDF-8 do soro de camundongo normal.

Embora o anticorpo JA16 reconheça tanto o GDF-8 quanto aproteína altamente relacionada BMP/GDF-11, não vimos nenhuma evidên-cia de peptídeos BMP-11 em nossas amostras purificadas por afinidade porespectrometria de massa.

TABELA 1: Peptídeos Identificados nos Imunoprecipitados JA16

<table>table see original document page 43</column></row><table>TABELA 1: -continuação-

<table>table see original document page 44</column></row><table>

M* = metionina oxidada.

<table>table see original document page 44</column></row><table>Exemplo 6: Isolamento das Proteínas Ligadas ao GDF-8

Assim que foi confirmado que a técnica de purificação por afini-dade pode bem-sucedidamente isolar o GDF-8 a partir do soro de camun-dongo normal, prosseguiu-se para identificar as proteínas que se ligam aoGDF-8 sob condições nativas. A faixa de 36 kDa sobre o gel manchado deprata mostrado na Figura 1 foi analisada como descrito acima. A espectro-metria de massa identificou duas proteínas nesta região do gel que eramespecíficas da amostra imunopurificada JA16. Estas foram determinadasserem o pró-peptídeo do GDF-8 e o gene relacionado semelhante à folistati-na (FLRG). Os peptídeos identificados de cada uma destas proteínas sãomostrados na Tabela 1 (SEQ ID NO: 13 - 27). Espectros de MS/MS de altaqualidade foram observados para os seis únicos peptídeos do pró-peptídeodo GDF-8 e os três únicos peptídeos do FLRG; os peptídeos representativossão apresentados nas Figuras 3A e 3C. Além dissso, a presença de ambas destas proteínas foi confirmada pelo Western blotting com anticorpos poli-clonais específicos do pró-peptídeo do GDF-8 e FLRG respectivamente (Fi-guras 3B e 3D). Dessa maneira, o GDF-8 circulante parece se ligar ao pró-peptídeo do GDF-8 e ao FLRG in vivo.

Exemplo 7: Isolamento de Novas Proteínas que se Ligam ao GDF-8

Para caracterizar os componentes principais do complexo doGDF-8 circulante in vivo, o GDF-8 nativo e suas proteínas associadas dosoro de camundongo tipo silvestre foram isoladas mediante a purificação porafinidade com um anticorpo monoclonal anti-GDF-8 conjugado com agarose,JA16. As proteínas ligadas ao JA16 foram submetidas às etapas de eluiçãosubseqüentes com tampão de PBS isolado (eluição de mock), um peptídeoque pode competir com o GDF-8 para a ligação ao JA16, e detergente SDS.Estas amostras foram concentradas, manipuladas em um gel SDS-PAGEmonodimensional, e visualizadas pela mancha de prata (Figura 4). Duasfaixas únicas nas amostras purificadas JA16 são visíveis-uma faixa de 12kDa identificada como GDF-8, e uma faixa de 36 kDa contendo tanto pró-peptídeo GDF-8 quanto FLRG.

De modo a determinar se os mesmas podem identificar outrasproteínas que foram ligadas ao GDF-8 in vivo, aumentou-se a purificaçãoem aproximadamente cinco vezes e usou-se a espectrometria de massapara pesquisar as proteínas que estavam presentes no imunocomplexoJA16, mas não no controle negativo. Para alcançar este objetivo, cortou-seregiões do gel manchado de prata correspondentes aos pesos molecularesentre 10 e 200 kDa em 13 fatias de gel, como mostrado na Figura 4. Cadauma destas fatias foi submetida à digestão de tripsina em gel e LC-MS/MS.A comparação dos espectros de MS/MS resultantes com a base de dadosNCBI não-redundantes das proteínas conhecidas não revelou quaisquerproteínas adicionais específicas ao imunoprecipitado JA16, embora as pro-teínas anteriormente descritas (GDF-8 maduro, pró-peptídeo do GDF-8,GDF-8 não-processado, e FLRG) foram todas identificadas nestas amostras(Figura 4). As proteínas antecedentes que foram observadas tanto noimunocomplexo JA16 quanto na amostra de controle negativo incluíramproteínas do soro abundantes, tais como albumina, imunoglobulinas, e pro-teínas complementares. Não houve nenhuma evidência de outros membrosda superfamília do TGF-β, incluindo a proteína altamente relacionadaBMP-11/GDF-11, nas amostras de JA16. Assim, o anticorpo JA16 especifi-camente purificou o GDF-8 nestas experiências.

De maneira interessante, não foi observada nenhuma evidênciade folistatina em imunocomplexos do GDF-8, a despeito do fato que o JA16é capaz de imunoprecipitar um complexo de GDF-8/folistatina in vitro (dadosnão-mostrados). A folistatina foi mostrada inibir a atividade do GDF-8 medi-ante a antagonização da associação do GDF-8 com o receptor de ActRIIB(Lee and McPherron (2001) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 98: 9306-9311).Os resultados sugerem que a folistatina não desempenha um papel principalna regulação da atividade do complexo do GDF-8 circulante sob condiçõesnormais.

Visto que a identificação das proteínas por este procedimento deMS/MS é dependente do conteúdo da base de dados sendo pesquisada,ainda foram analisados os dados da Figura 4 por comparação dos espectrosde MS/MS coletados das 13 amostras com uma base de dados de proteínasprognosticadas da seqüência genômica de çamundongo Celera. Esta análi-se identificou uma proteína adicional específica da amostra purificada porJA16, e é aqui referida como proteína de soro associada ao GDF 1(GASP1). Depois da identificação inicial desta proteína, esta seqüência foiadicionada à base de dados NCBI pela realização pública do seqüencia-mento do genoma sob o número de acesso gij20ôí4039.

Cinco peptídeos correspondentes à seqüência da GASP1 foramidentificados na base dos espectros de MS/MS de alta qualidade (Tabela 1(SEQ ID NO:31-35); Figura 5A e B). Os espectros correspondentes aospeptídeos da GASP1 foram observados na faixa 3, que contém proteínas a70-80 kDa. No entanto, uma faixa específica correspondente a esta proteínanão era visível, provavelmente devido à abundância de imunoglobulinasantecedentes e albumina nesta área (ver a Figura 4). Os escores de Se-quest Xcorr acima de 2,3 são geralmente considerados significativos paraíons 2*. Fortuitamente, um dos peptídeos identificados em nossas experiên-cias (seqüência = ECETDQECETYEK (SEQ ID N5:31)) atravessa a junçãoentre os dois éxons que codificam esta proteína, comprovando a exatidãodo algoritmo de prognóstico do gene de Celera neste exemplo.

As seqüências da transcrição e proteína GASP1 foram prognos-ticadas antes da clonagem efetiva da GASP1 (Figura 6). A GASP1 foi prognos-ticada ser uma proteína de 571 aminoácidos com uma massa molecularprognosticada de 63 kDa. Ela possui uma seqüência de sinal putativo/sítiode clivagem em seu N-terminal e dois sítios possíveis para a N-glicosilaçãonos aminoácidos 314 e 514. A análise da seqüência de proteína GASP1 porPfam e BLAST (de acordo com as técnicas em Altschul et al. (1990) J. Mol.Biol., 215: 403-410; Bateman et al. (2002) NucIeicAcids Res., 30: 276-280)revelou que a GASP1 contém muitos domínios conservados, incluindo umdomínio WAP, um domínio de folistatina/Kazal, um domínio de imunoglobu-lina, dois domínios Kunitz em tandem, e um domínio netrin (Figura 14A). Osdomínios WAP, originalmente identificados na proteína acídica do soro,contêm 8 cisteínas que formam um núcleo de quatro dissulfeto e são fre-qüentemente observadas nas proteínas com atividade antiprotease (Henni-ghausen and Sippel (1982) NucIeicAcids Res., 10: 2677-2684; Seemuller etal. (1986) FEBS Lett., 199: 43-48). Acredita-se que o domínio de folistatinamedia a interação entre GDF-8 e GASP1. A região C-terminal de domínio defolistatina contém unia similaridade com os domínios de inibidor da serinaprotease Kazal. No caso de GASP1, esta região é ainda mais estritamenterelacionada com os domínios Kazal do que na folistatina ou FLRG1 sugerin-do a possibilidade que esta região possa ter uma função inibidora da prote-ase adicional. Os domínios Kunitz, originalmente identificados no inibidor detripsina pancreática bovina, também inibem as serina proteases, dessa ma-neira estabelecendo um provável papel para a GASP1 na regulação destaclasse de proteínas. Além disso, os domínios de netrin foram implicados nainibição das metaloproteases (Banyai and Patthy, 1999; Mott et al., 2000).

Assim, com base na presença destas regiões conservadas, a GASP1 é pro-vável de inibir a atividade das proteases, talvez regulando o processamentodo GDF-8 ou a ativação do complexo do GDF-8 latente.

Pesquisas BLAST junto à base de dados de transcrição de ca-mundongo Celera revelaram uma proteína que possui > 50 % de identidadecom a GASP1, aqui referida como GASP2. A GASP2 contém a mesma es-trutura de domínio como a GASP1, sugerindo que estas proteínas definemuma família de dois membros de inibidores da protease multivalentes (Figu-ra 14B). De maneira interessante, somente os peptídeos correspondentes àGASP1, não a GASP2, foram observados em nossas amostras purificadaspor JA16. Este resultado sugere que as GASP1 e GASP2 provavelmentepossuem diferentes especificidade biológica. Tanto a GASP1 quanto aGASP2 são conservadas em seres humanos (> 90 % de identidade comcamundongo). A seqüência para a GASP1 humana é agora disponível nabase de dados NCBI nr sob o número de acesso gi| 18652308. Contudo, aconcentração do GDF-8 no soro humano é consideravelmente mais baixado que aquela observada no soro de camundongo (Hill et al. (2002) J. Biol.Chem., 277: 40735-40741), a sensibilidade da análise espectrométrica demassa das proteínas deixadas conosco para identificar 3 peptídeos corres-pondentes ao homólogo humano da GASP1 a partir de imunoprecipitaçõesJA16 do soro humano (Tabela 1). Nenhum destes peptídeos foram observa-dos no controle negativo correspondente. Mais uma vez, não houve nenhu-ma evidência de GASP2 humana nestas experiências. Assim, a interaçãoentre a GASP1 e o GDF-8 é conservada entre camundongo e ser humano.

O GDF-8 é produzido quase exclusivamente no músculo esque-lético. De modo a determinar a distribuição ao tecido do GASFI mRNA, umfragmento de 551 pb de GASP1 foi amplificado a partir do cDNA de filamentoprimário produzido de uma variedade de tecidos de camundongo e embriõesrepresentados (Figura 10). Um fragmento de GASP1 de camundongo foi ampli-ficado a partir de painéis de cDNA de filamento primário de camundongo nor-malizados (Clontech, Palo Alto CA) usando o kit Advantage cDNA PCR(CIontech) de acordo com as recomendações do fabricante (iniciador deavanço: 5' TTGGCCACTGCCACCACAATCTCAACCACTT 3' (SEQ ID NO:46);iniciador reverso: 5' TCTCAGCATGGCCATGCCGCCGTCGA 3' (SEQ IDNO:47)). A GASP1 parece ser razoavelmente expressa de forma ampla,com expressão particularmente elevada no músculo esquelético e coração.Expressão significativa é também vista no cérebro, pulmão e testículo. Aocontrário, o fígado e rim expressam níveis relativamente baixos de GASP1mRNA. Desenvolventemente, o nível de GASP1 mRNA permanece razoa-velmente constante, talvez aumentando ligeiramente entre o dia 7 e o dia 11da embriogênese do camundongo.Exemplo 8: GDF-8 no Soro Humano e de Camundongo

A concentração de GDF-8 no soro humano é consideravelmentemais baixa do que a observada no soro de camundongo. Visto que o GDF-8possui potencial como um alvo terapêutico, foi um objetivo determinar acomposição do complexo do GDF-8 circulante em seres humanos. Este co-nhecimento deve determinar a validade do modelo de camundongo e poten-cialmente identificar alvos terapêuticos alternativos. Assim, a purificação porafinidade com base em HA16 do GDF-8 foi repetida usando o soro humano.Devido ao nível mais baixo de GDF-8 no soro humano comparado como ode camundongo, nenhuma faixa correspondente ao GDF-8 e pró-peptídeodo GDF-8/FLRG foi visualizada (Figura 11 A). Entretanto, a Western blottingcom um anticorpo policlonal que reconhece a região madura do GDF-8 re-velou a presença de GDF-8 maduro e não processado nas amostras purifi-cadas por JA16 (Figura 11B).

Tiramos vantagem da sensibilidade elevada da espectrometriade massa para identificar as proteínas que co-purificaram com o GDF-8 ma-duro. As faixas correspondentes às amostras eluídas de peptídeo tanto docontrole negativo quanto das contas conjugadas por JA16 foram cortadasem 16 pedaços. Estas fatias de gel foram submetidas à digestão de tripsinaem gel, nanofluxo LC-MS/MS, e análise com Sequest como anteriormente.

De maneira interessante, as únicas proteínas que foram identifi-cadas especificamente nas amostras de JA16 e não no controle negativoforam o GDF-8 maduro, pró-peptídeo do GDF-8, FLRG humano, e o homó-logo humano de GASP1. Os peptídeos observados de cada uma destasproteínas são listadas na Tabela 1 (SEQ ID NO:36-45) e os espectros de MS/MS representativos são mostrados na Figura 12. Desta maneira o com-plexo do GDF-8 in vivo parece ser conservado entre camundongo e ser hu-mano.

Exemplo 9: Clonagem e Caracterização da GASP1 de camundongo

Após identificar a seqüência da GASP1 prognosticada, foi umobjetivo determinar a seqüência real da GASP1 de camundongo. Com base naseqüência prognosticada Celera, a seqüência que codifica a GASP1 foi amplifi-cada a partir do QUICKCLONE cDNA do coração de camundongo (Clon-tech) por PCR com PfuTurbo polymerase (Stratagene) usando os seguintesiniciadores (fp: 5' CACCATGTGTGCCCCAGGGTATCATCGGTTCTGG 3'(SEQ ID N0:50); rp: 5' TTGCAAGCCCAGGAAGTCCTTGAGGAC 3" (SEQID NO:51)). O produto de PCR desta reação ficaria como uma faixa principalisolada de aproximadamente 1700 pares de base em um gel agarose 1 %. O DNAamplificado foi depois clonado nos sítios TOPO do vetor pcDNA3.1DV5-His-TOPO (Invitrogen) de modo a incluir um rótulo V5-His C-terminal em estrutu-ra de acordo com as recomendações do fabricante. Inserção de cDNA decomprimento total foi sequenciado em ambos os filamentos. A seqüência denucleotídeo do clone de GASP1 de camundongo é apresentada na Figura13. Este clone se comparou com a seqüência Celera prognosticada, com aexceção de algumas substituições de base nos códons oscilatórios que nãomudaram a seqüência de aminoácido prognosticada (isto é, 288C:G; 294G:A; 615G:A; 738A:G; 768C:T; 1407A:G; 1419A:G; e 1584C:G, onde a primei-ra base na posição indicada έ aquela relatada por Gelera e a segunda baseé aquela obtida do seqüenciamenio do cione; ver a Figura 6A e B).

Para determinar o processamento N-terminal da proteína GASP1,submetemos a transfecção as células COS1 com um vetor de expressão demamífero que codifica a GASP1 de camundongo clonada com um rótulo V5-HisC-terminal (GASP1-V5-His). O meio condicionado livre de soro foi colhido 48horas mais tarde e analisado pela análise do "Western blot" com um anticor-po policlonal anti-V5 (Sigma). Mais especificamente, o meio condicionado foicoletado 48 horas após a transfecção das células COS1 com GASP1-V5-His/pcDNA3.1 D-V5-His-TOPO ou vetor vazio usando o reagente FuGENE 6(Roche) em meio de Eagle modificado da Dulbecco livre de soro.

Uma faixa única, operando em aproximadamente 80 kDa foivista, confirmando que a GASP1 é secretada no meio condicionado (dadosnão-mostrados). Aproximadamente 10 ml deste meio condicionado forammanipulados por uma coluna de afinidade His e ainda purificados por cro-matografia de fase inversa. Este esquema de purificação produziu uma faixado tamanho esperado de GASP1 de comprimento total em um gel SDS-PAGE manchado Coomassie. O seqüenciamento de Edman desta faixadeterminou uma seqüência N-terminal de L-P-P-I-R-Y-S-H-A-G-I (SEQ IDNO:52). Desta maneira, os aminoácidos de 1 a 29 da GASP1 constituem aseqüência de sinal que é removida durante o processamento e secreção.

Exemplo 10: Ligação de GASP1 Recombinantemente Produzida ao pró-peptídeo do GDF-8 e GDF-8 Maduro

Logo depois, foi determinado que a GASP1 recombinantementereproduzida tinha o mesmo padrão de ligação ao GDF-8 como a GASP1isolada do soro de camundongo. Para imunoprecipitações com proteínasrecombinantes, 400 μΙ de meio condicionado de células submetidas atransfecção de vetor ou GASP1 foram combinadas com 1,2 μg de GDF-8purificado recombinante e/ou proteína de pró-peptídeo do GDF-8 (Thies etal., 2001). Contas de agarose conjugadas por JA16 (10 μΙ de volume acon-dicionado) ou anti-V5 (30 μΙ) foram incubadas com o meio condicionado su-plementado por duas horas a 4°C e lavadas duas vezes com 1 % Triton ge-lado em solução salina tamponada de fosfato (PBS) e duas vezes com PBS.As contas foram colocadas novamente em suspensão em 50 μΙ de tampão1x LIDS com DTT. Os western blots foram executadas como anteriormentedescrito (Hill et al., 2002).

Para confirmar e ainda caracterizar a interação entre o GDF-8 ea GASP1, incubamos o GDF-8 recombinante purificado e o pró-peptídeo doGDF-8 recombinante purificado com meio condicionado de células COS1submetidas a transfecção com um controle de vetor ou GASP1-V5-His. De-pois imunoprecipitamos o GDF-8 com contas de agarose conjugadas comJA16 e examinamos com relação a co-purificação da GASP1 e pró-peptídeodo GDF-8 usando "western blots" (Figura 15A). Tanto a (faixa 3) quanto opró-peptídeo do GDF-8 (faixa 1) co-imunoprecipitado com o GDF-8, provan-do que o GDF-8 pode interagir com ambas destas proteínas. Nem GASP1nem pró-peptídeo foram detectados nos imunoprecipitados JA16 na ausên-cia de GDF-8 (faixa 4), eliminando a possibilidade de ligação não específicanestas experiências. Quando todas as três proteínas estavam presentes,tanto a GASP1 quanto o pró-peptídeo GDF-8 foram enfraquecidos com oGDF-8, sugerindo a possibilidade de que estas proteínas podem formar umcomplexo terciário (faixa 5). No entanto, esta experiência não elimina a pos-sibilidade de que a GASP1 e o pró-peptídeo sejam ligados no mesmo epito-po nas moléculas de GDF-8 separadas.

Para ainda confirmar a interação entre a GASP1 e o GDF-8,executamos a imunoprecipitação reversa mediante o enfraquecimento daGASP1 a partir do meio condicionado suplementado com proteína recombi-nante do GDF-8 e/ou pró-peptídeo do GDF-8. Para se obter isto, usamosum anticorpo monoclonal conjugado com agarose dirigido contra o epitopoV5 do rótulo V5-His C-terminal na GASP1. Como esperado, o GDF-8 co-imunoprecipitado com GASP1 (Figura 15B, faixas 3 e 5), ainda confirmaramuma interação direta entre estas proteínas. Surpreendentemente, o pró-peptídeo do GDF-8 também co-purificou com a GASP1, mesmo na ausênciado GDF-8 (faixa 4), sugerindo que o pró-peptídeo do GDF-8 pode se ligardiretamente à GASP1. Assim, a GASP1 se liga tanto ao GDF-8 quanto aopro-peptideo do GDF-8 independentemente. isto esta em contraste com oFLRG, uma outra proteína de domínio de folistatína, que se liga exclusivamenteao GDF-8 maduro (Hill et al. (2002) J. Biol. Chem., 277: 40735-40741). A adi-ção tanto de GDF-8 quanto de pró-peptídeo consistentemente apresentoumenos ligação de pró-peptídeo à GASP1 do que quando o pró-peptídeo foiadicionado sozinho. Esta observação sugere que a GASP1 pode não seligar ao complexo latente secundário do GDF-8.

Exemplo 11: Atividade de Inibição Mediada pela GASP1 do GDF-8 e BMP-11,mas não Activina ou TGF-βΙ

Um constructo de Iuciferase repórter, pGL3-(CAGA)12 (SEQ IDNO:53) (Dennler et al. (1998) EMBO J., 17: 3091-3100) foi transientementesubmetido a transfecção em células de rabdomiossarcoma A204 ou RD.Diluições de meio condicionado do vetor ou células submetidas a transfecçãode GASP1 foram incubadas por 30 minutos a 37°C com 10 ng/ml GDF-8, 10ng/ml BMP-11, 10 ng/ml rh activina A (R&D Systems), ou 0,5 ng/ml rhTGF-βΙ (R&D Systems). A atividade de Iuciferase foi medida de acordo comThies et al. (2001) Growth Factors, 18: 251-259 e Zimmers et al. (2002) Sci-ence, 296: 1486-1488. Neste ensaio, células A204 responderam ao GDF-8,BMP-11, e activina, mas não responderam bem ao TGF-βΙ. As células RDresponderam tanto ao GDF-8 quanto ao TGF-βΙ. Assim, usamos célulasA204 para testar a capacidade da GASP1 em inibir os GDF-8, BMP-11 eactivina e as células RD monitorar a atividade do TGF-β e GDF-8. Os resul-tados para o GDF-8 são mostrados a partir das células A204, mas foramsimilares com células RD. Uma curva padrão que mede a dependência daconcentração da atividade Iuciferase por cada um destes fatores do cresci-mento foi gerada para cada experiência (dados não-mostrados). As concen-trações do fator de crescimento usadas caem na região linear desta curvatal que mudanças pequenas na concentração resultam em mudanças men-suráveis na atividade dè luciferase.

Duas proteínas com domínio de folistatina, folistatina e FLRG1inibiram a atividade do GDF-8 em um ensaio repórter transcricional de(CAGA)12 (SEQ ID NO:53) luciferase, mas também inibiram a atividade biológi-ca das proteínas relacionadas, activina e BMP-11. A capacidade da GASP1em inibir a atividade do GDF-8, BMP-11, activina e TGF-βΙ no ensaio re-pórter (CAGA)12 (SEQ ID NO:53) foi também testada.

Várias diluições de meio condicionado das células COS subme-tidas a transfecção com GASP1 rotulada com V5-His ou um controle de vetorforam incubadas com GDF-8 (10 ng/ml), BMP-11(10 ng/ml), activina (10 ng/ml),ou TGF-βΙ (0,5 ng/ml) recombinante purificado e avaliadas com relação a ativi-dade do fator de crescimento nas células rabdomiossarcoma que expressamo constructo repórter (CAGA)12 (SEQ ID NO:53). A GASP1 potencialmenteinibiu a atividade do GDF-8 em uma maneira dependente da concentração(Figura 16A). A GASP1 similarmente inibiu a atividade de BMP-11 neste en-saio (Figura 16B), como pode ser esperado visto que o GDF-8 e BMP-11maduro são altamente conservados e diferem por apenas 11 aminoácidos.

Surpreendentemente, a GASP1 não inibiu a atividade da activina ou doTGF-βΙ (Figura 16C e D), sugerindo um nível muito elevado de especificida-de, que não é demonstrado pela folistatina propriamente dita. Assim, AGASP1 apresenta especificidade em sua inibição do GDF-8 e BMP-11.

A afinidade de GASP1 com relação ao GDF-8 foi avaliada pordeterminar a IC50 para inibição do GDF-8 no ensaio de gene repórter. Aproteína GASP1-V5-His foi purificada do meio condicionado em uma colunade afinidade de cobalto e eluída como descrito acima. As frações contendoa GASP1 foram ainda purificadas por cromatografia de exclusão de tama-nho em PBS usando uma coluna BioSepS3000 (Phenomenex). Como mos-trado na Figura 17, a GASP1 inibiu o GDF-8 com uma IC50 de aproximada-mente 3 nM.

Exemplo 12: Tratamento dos Distúrbios Musculares

A GASP1 pode ser administrada em pacientes que sofrem deuma doença ou distúrbio relacionados com o funcionamento do GDF-8 deacordo com a Tabela 2. Os pacientes tomam a composição de uma vez ouem intervalos, tal como uma vez diariamente, e os sintomas de sua doençaou distúrbio melhoram. Por exemplo, sintomas relacionados com um distúr-bio muscular são melhorados, como medido pela massa muscular, atividademuscular e ou tônus muscular. Isto mostra que a composição da invenção éútil para o tratamento de doenças ou distúrbios relacionados com o funcionamento do GDF-8, tais como distúrbios musculares.<table>table see original document page 56</column></row><table>Os conteúdos inteiros de todas as referências, patentes e pedi-dos de patente publicados citados em todo este pedido são aqui incorpora-dos por referência. A descrição detalhada precedente foi dada apenas parapropósitos de ilustração. Uma ampla faixa de mudanças e modificações po-dem ser feitas nas modalidades descritas acima. Deve portando ser com-preendido que as reivindicações que seguem, incluindo todos os equivalen-tes, são destinadas para definir o escopo da invenção.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> HILL, JENNIFER J.WOLFMAN, NEIL M.

<120> "GASP1: PROTEÍNA CONTENDO DOMÍNIO DE FOLISTATINA".

<130> 08702.0015-00

<140><141 >

<150> 60/357,846<151 >2002-02-21

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<170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1<211> 1716<212> DNA<213> Mus sp.

<400> 1

atgtgtgccc cagggtatca tcggttctgg tttcactggg ggctgctgtt gctgctgctc 60ctcgaggctc cccttcgagg cctagcactg ccacccatcc gatactccca tgcgggcatc 120tgccccaacg acatgaaccc caacctctgg gtggatgccc agagcacctg caagcgagag 180tgtgaaacag accaggaatg tgagacctat gagaaatgct gccccaatgt gtgtgggacc 240aagagctgtg tggcagcccg ctacatggatcccaaggagg ccacatgtga ccatttcatgtgggacggcc agcccgtgtg taagtgcaaatgtgcctctg atggccttac ctactacaacaagggcatca cactgtctgt ggtcacctgtcctccaccgc ctgagaccac ggtgcatcccgacatggcag ccccggccct gctcaaccacactgtgagtt tcctctgtga cgtggtaggccagctggagg accgagaaaa tgttgtcatggtcactaaca ttgcccagct ggtcatctacacctgtacag ctcgaaatgt cgctggtgtcaggggtggtc aggccagggc cacttcagagacagagtgcc tgaagccccc agacagtgagttcgacgccc aggctaacaa ctgcctcactaaccactttg agacctacga ggcctgtatgtgcagcctgc ctgccctgca agggccttgcagccagacag gcctatgcca gtccttcgtctttgaaagcc gtgaggcttg tgaggagtcgcgggcctgca agccccggca aaaacttgttctgggcaggg tctctgagct gaccgaagaggatgaggtct taaaagatga gaagatgggcgtcaccctgc ttcatgtaga ctggacctgtccactcatca tcatggggga ggtcgacggcgtgggggcat cgagcacacg gcgggtcaggtgtgacgtcc tcaaggactt cctgggcttg

<210> 2<211> 1716<212> DNA<213> Mussp.

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<400>2atgtgtgccc cagggtatcactcgaggctc cccttcgaggtgccccaacg acatgaaccctgtgaaacag accaggaatgaagagctgtg tggcagcccgcccaaggagg ccacatgtgatgggacggcc agcccgtgtgtgtgcctctg atggccttacaagggcatca cactgtctgtcctccaccgc ctgagaccacgacatggcag ccccagccctactgtgagtt tcctctgtgacagctggagg accgagagaagtcactaaca ttgcccagctacctgtacag ctcgaaatgtaggggtggtc aggccagggcacagagtgcc tgaagcccccttcgacgccc aggctaacaaaaccactttg agacctacgatgcagcctgc ctgccctgcaagccagacag gcctatgccatttgaaagcc gtgaggcttgcgggcctgca agccccggcactgggcaggg tctctgagctgatgaggtct taaaagatgagtcaccctgc ttcatgtagaccactcatca tcatgggggagtgggggcat cgagcacacgtgtgacgtcc tcaaggactt

<210> 3<211 >571

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<210> 8<211 >1659<212> DNA<213> Mus sp.

<400>8

atgcctgccc cacagccatt cctgcctctg ctctttgtct tcgtgctcat ccatctgacc 60tcggagacca acctgctgcc agatcccgga agccatcctg gcatgtgccc caacgagctc 120agcccccacc tgtgggtcga cgcccagagc acctgtgagc gtgagtgtac cggggaccag 180gactgtgcgg catccgagaa gtgctgcacc aatgtgtgtg ggctgcagag ctgcgtggct 240gcccgctttc ccagtggtgg cccagctgta cctgagacag cagcctcctg tgaaggcttc 300caatgcccac aacagggttc tgactgtgac atctgggatg ggcagccagt ttgtcgctgc 360cgtgaccgct gtgaaaaaga acccagcttc acatgtgctt ctgatggcct tacctattac 420aaccgctgct acatggacgc agaagcctgc ctgcggggtc tccacctgca cgttgtaccc 480tgtaagcaca ttctcagttg gccgcccagc agcccgggac cacccgagac cactgctcgc 540ccaacccctg gggctgctcc catgccacct gccctgtaca acagcccctc accacaggca 600gtgcatgttg gggggacagc cagcctccac tgtgatgtta gtggccgtcc accacctgct 660gtgacctggg agaagcagag ccatcagcgg gagaacctga tcatgcgccc tgaccaaatg 720tatggcaacg tggttgtcac cagtatcgga cagctagtcc tctacaatgc tcagttggag 780gatgcgggcc tgtatacctg cactgcacga aacgctgccg gcctgctgcg ggccgacttt 840cccctttccg ttttacagcg ggcaactact caggacaggg acccaggtat cccagccttg 900gctgagtgcc aggccgacac acaagcctgt gttgggccac ctactcccca tcatgtcctt 960tggcgctttg acccacagag aggcagctgc atgacattcc cagccctcag atgtgatggg 1020gctgcccggg gctttgagac ctatgaggca tgccagcagg cctgtgttcg tggccccggg 1080gatgtctgtg cactgcctgc agttcagggg ccctgccagg gctgggagcc acgctgggcc 1140tacagcccac tgctacagca gtgccacccc tttgtataca gtggctgtga aggaaacagc 1200aataactttg agacccggga gagctgtgag gatgcttgcc ctgtaccacg cacaccaccc 1260tgtcgtgcct gccgcctcaa gagcaagctg gctctgagct tgtgccgcag tgactttgcc 1320atcgtgggga gactcacaga ggtcctggag gagcccgagg ctgcaggcgg catagctcgt 1380gtggccttgg atgatgtgct aaaggacgac aagatgggcc tcaagttctt gggcaccaaa 1440tacctggagg tgacattgag tggcatggac tgggcctgcc catgccccaa cgtgacagct 1500gtcgatgggc cactggtcat catgggtgag gttcgtgaag gtgtggctgt gttggacgcc 1560aacagctatg tccgtgctgc cagcgagaag cgagtcaaga agattgtgga actgctcgag 1620aagaaggctt gtgaactgct caaccgcttc caagactag 1659

<210> 9<211 >552<212> PRT<213> Mus sp.

<400>9

Met Pro Ala Pro Gln Pro Phe Leu Pro Leu Leu Phe Val Phe Val Leu1 5 10 15

Ile His Leu Thr Ser Glu Thr Asn Leu Leu Pro Asp Pro Gly Ser His20 25 30

Pro Gly Met Cys Pro Asn Glu Leu Ser Pro His Leu Trp Val Asp Ala35 40 45

Gln Ser Thr Cys Glu Arg Glu Cys Thr Gly Asp Gln Asp Cys Ala Ala50 55 60

Ser Glu Lys Cys Cys Thr Asn Val Cys Gly Leu Gln Ser Cys Val Ala65 70 75 80

Ala Arg Phe Pro Ser Gly Gly Pro Ala Val Pro Glu Thr Ala Ala Ser85 90 95

Cys Glu Gly Phe Gln Cys Pro Gln Gln Gly Ser Asp Cys Asp Ile Trp100 105 110

Asp Gly Gln Pro Val Cys Arg Cys Arg Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro115 120 125

Ser Phe Thr Cys Ala Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Tyr130 135 140

Met Asp Ala Glu Ala Cys Leu Arg Gly Leu His Leu His Val Val Pro145 150 155 160

Cys Lys His Ile Leu Ser Trp Pro Pro Ser Ser Pro Gly Pro Pro Glu165 170 175Thr Thr Ala Arg Pro Thr Pro Gly-Ala Ala Pro Met Pro Pro Ala Leu180 185 190

Tyr Asn Ser Pro Ser Pro Gln Ala Val His Val Gly Gly Thr Ala Ser195 200 205

Leu His Cys Asp Val Ser Gly Arg Pro Pro Pro Ala Val Thr Trp Glu210 215 220

Lys Gln Ser His Gln Arg Glu Asn Leu Ile Met Arg Pro Asp Gln Met225 230 235 240

Tyr Gly Asn Val Val Val Thr Ser Ile Gly Gln Leu Val Leu Tyr Asn245 250 255

Ala Gln Leu Glu Asp Ala Gly Leu Tyr Thr Cys Thr Ala Arg Asn Ala260 265 270

Ala Gly Leu Leu Arg Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val Leu Gln Arg Ala275 280 285

Thr Thr Gln Asp Arg Asp Pro Gly Ile Pro Ala Leu Ala Glu Cys Gln290 295 300

Ala Asp Thr Gln Ala Cys Val Gly Pro Pro Thr Pro His His Val Leu305 310 315 320

Trp Arg Phe Asp Pro Gln Arg Gly Ser Cys Met Thr Phe Pro Ala Leu325 330 335

Arg Cys Asp Gly Ala Ala Arg Gly Phe Glu Thr Tyr Glu Ala Cys Gln340 345 350

Gln Ala Cys Val Arg Gly Pro Gly Asp Val Cys Ala Leu Pro Ala Val355 360 365

Gln Gly Pró Cys Gln Gly Trp Glu Pro Arg Trp Ala Tyr Ser Pro Leu370 375 380

Leu Gln Gln Cys His Pro Phe Val Tyr Ser Gly Cys Glu Gly Asn Ser385 390 395 400

Asn Asn Phe Glu Thr Arg Glu Ser Cys Glu Asp Ala Cys Pro Val Pro405 410 415

Arg Thr Pro Pro Cys Arg Ala Cys Arg Leu Lys Ser Lys Leu Ala Leu420 425 430

Ser Leu Cys Arg Ser Asp Phe Ala Ile Val Gly Arg Leu Thr Glu Val435 440 445

Leu Glu Glu Pro Glu Ala Ala Gly Gly Ile Ala Arg Val Ala Leu Asp450 455 460

Asp Val Leu Lys Asp Asp Lys Met Gly Leu Lys Phe Leu Gly Thr Lys465 470 475 480

Tyr Leu Glu Val Thr Leu Ser Gly Met Asp Trp Ala Cys Pro Cys Pro485 490 495

Asn Val Thr Ala Val Asp Gly Pro Leu Val Ile Met Gly Glu Val Arg500 505 510

Glu Gly Val Ala Val Leu Asp Ala Asn Ser Tyr Val Arg Ala Ala Ser515 520 525.Glu Lys Arg Val Lys Lys Ile Val Glu Leu Leu Glu Lys Lys Ala Cys530 535 540

Glu Leu Leu Asn Arg Phe Gln Asp545 550

<210> 10

<211 >1695

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

atgcccgccc tacgtccact cctgccgctc ctgctcctcc tccggctgac ctcgggggct 60ggcttgctgc cagggctggg gagccacccg ggcgtgtgcc ccaaccagct cagccccaac 120ctgtgggtgg acgcccagag cacctgtgag cgcgagtgta gcagggacca ggactgtgcg 180gctgctgaga agtgctgcat caacgtgtgt ggactgcaca gctgcgtggc agcacgcttc 240cccggcagcc cagctgcgcc gacgacagcg gcctcctgcg agggctttgt gtgcccacag 300cagggctcgg actgcgacat ctgggacggg cagcccgtgt gccgctgccg cgaccgctgt 360gagaaggagc ccagcttcac ctgcgcctcg gacggcctca cctactacaa ccgctgctat 420atggacgccg aggcctgcct gcggggcctg cacctccaca tcgtgccctg caagcacgtg 480ctcagctggc cgçccagcag cccggggccg ccggagacca ctgcccgccc cacacctggg 540gccgcgcccg tgcctcctgc cctgtacagc agcccctccc cacaggcggt gcaggttggg 600ggtacggcca gcctccactg cgacgtcagc ggccgcccgc cgcctgctgt gacctgggag 660aagcagagtc accagcgaga gaacctgatc atgcgccctg atcagatgta tggcaacgtg 720gtggtcacca gcatcgggca gctggtgctc tacaacgcgc ggcccgaaga cgccggcctg 780tacacctgca ccgcgcgcaa cgctgctggg ctgctgcggg ctgacttccc actctctgtg 840gtccagcgag agccggccag ggacgcagcc cccagcatcc cagccccggc cgagtgcctg 900ccggatgtgc aggcctgcac gggccccact tccccacacc ttgtcctctg gcactacgac 960ccgcagcggg gcggctgcat gaccttcccg gcccgtggct gtgatggggc ggcccgcggc 1020tttgagacct acgaggcatg ccagcaggcc tgtgcccgcg gccccggcga cgcctgcgtg 1080ctgcctgccg tgcagggccc ctgccggggc tgggagccgc gctgggccta cagcccgctg 1140ctgcagcagt gccatccctt cgtgtacggt ggctgcgagg gcaacggcaa caacttccac 1200agccgcgaga gctgcgagga tgcctgcccc gtgccgcgca caccgccctg ccgcgcctgc 1260cgcctccgga gcaagctggc gctgagcctg tgccgcagcg acttcgccat cgtggggcgg 1320ctcacggagg tgctggagga gcccgaggcc gccggcggca tcgcccgcgt ggcgctcgag 1380gacgtgctca aggatgacaa gatgggcctc aagttcttgg gcaccaagta cctggaggtg 1440acgctgagtg gcatggactg ggcctgcccc tgccccaaca tgacggcggg cgacgggccg 1500ctggtcatca tgggtgaggt gcgcgatggc gtggccgtgc tggacgccgg cagctacgtc 1560cgcgccgcca gcgagaagcg cgtcaagaag atcttggagc tgctgyàyaa gcaggcctgc 1620gagctgctca accgcttcca ggactagccc ccgcaggggc ctgcgccacc ccgtcctggt 1680gaataaacgc actcc ·· 1695

<210> 11<211> 548<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 11

15 Met Pro Ala Leu Arg Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Arg Leu1 5 10 15

Thr Ser Gly Ala Gly Leu Leu Pro Gly Leu Gly Ser His Pro Gly Val20 25 30

Cys Pro Asn Gln Leu Ser Pro Asn Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser Thr 35 40 45

Cys Glu Arg Glu Cys Ser Arg Asp Gln Asp Cys Ala Ala Ala Glu Lys50 55 60

Cys Cys Ile Asn Val Cys Gly Leu His Ser Cys Val Ala Ala Arg Phe65 70 75 80

Pro Gly Ser Pro Ala Ala Pro Thr Thr Ala Ala Ser Cys Glu Gly Phe

85 90 95

Val Cys Pro Gln Gln Gly Ser Asp Cys Asp Ile Trp Asp Gly Gln Pro100 105 110

Val Cys Arg Cys Arg Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro Ser Phe Thr Cys

115 120 125

Ala Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Tyr Met Asp Ala Glu130 135 140

Ala Cys Leu Arg Gly Leu His Leu His Ile Val Pro Cys Lys His Val145 150 155 160

Leu Ser Trp Pro Pro Ser Ser Pro Gly Pro Pro Glu Thr Thr Ala Arg

165 170 175

Pro Thr Pro Gly Ala Ala Pro Val Pro Pro Ala Leu Tyr Ser Ser Pro180 185 190

Ser Pro Gln Ala Val Gln Val Gly Gly Thr Ala Ser Leu His Cys Asp195 200 205

Val Ser Gly Arg Pro Pro Pro Ala Val Thr Trp Glu Lys Gln Ser His210 215 220

Gln Arg Glu Asn Leu Ile Met Arg Pro Asp Gln Met Tyr Gly Asn Val225 230 235 240

Val Val Thr Ser· Ile Gly Gln Leu Val Leu Tyr Asn Ala Arg Pro Glu245 250 255

Asp Ala Gly Leu Tyr Thr Cys Thr Ala Arg Asn Ala Ala Gly Leu Leu260 265 270

Arg Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val Val Gln Arg Glu Pro Ala Arg Asp275 280 285

Ala Ala Pro Ser Ile Pro Ala Pro Ala Glu Cys Leu Pro Asp Val Gln290 295 300

Ala Cys Thr Gly Pro Thr Ser Pro His Leu Val Leu Trp His Tyr Asp305 310 315 320

Pro Gln Arg Gly Gly Cys Met Thr Phe Pro Ala Arg Gly Cys Asp Gly325 330 335

Ala Ala Arg Gly Phe Glu Thr Tyr Glu Ala Cys Gln Gln Ala Cys Ala340 345 350

Arg Gly Pro Gly Asp Ala Cys Val Leu Pro Ala Val Gln Gly Pro Cys355 360 365

Arg Gly Trp Glu Pro Arg Trp Ala Tyr Ser Pro Leu Leu Gln Gln Cys370 375 380

His Pro Phe Val Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gly Asn Asn Phe His385 390 395 400

Ser Arg Glu Ser Cys Glu Asp Ala Cys Pro Val Pro Arg Thr Pro Pro405 410 415

Cys Arg Ala Cys Arg Leu Arg Ser Lys Leu Ala Leu Ser Leu Cys Arg420 425 430

Ser Asp Phe Ala Ile Val Gly Arg Leu Thr Glu Val Leu Glu Glu Pro435 440 445

Glu Ala Ala Gly Gly Ile Ala Arg Val Ala Leu Glu Asp Val Leu Lys450 455 460

Asp Asp Lys Met Gly Leu Lys Phe Leu Gly Thr Lys Tyr Leu Glu Val465 470 475 480

Thr Leu Ser Gly Met Asp Trp Ala Cys Pro Cys Pro Asn Met Thr Ala485 490 495

Gly Asp Gly Pro Leu Val Ile Met Gly Glu Val Arg Asp Gly Val Ala500 505 510

Val Leu Asp Ala Gly Ser Tyr Val Arg Ala Ala Ser Glu Lys Arg Val515 520 525

Lys Lys Ile Leu Glu Leu Leu Glu Lys Gln Ala Cys Glu Leu Leu Asn530 535 540

Arg Phe Gln Asp545<210>12<211 >30<212> PRT<213> Seqüência Artificiai

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: peptídeo competidor ilustrado<400> 12

Asp Phe Gly Leu Asp Ser Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Ser Ser1 5 10 15

Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp20 25 30

<210> 13<211> 15<212> PRT<213>Mussp.

<400> 13

Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys1 5 10 15

<210> 14<211> 12<212> PRT<213>Mussp.

<400> 14

Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys1 5 10

<210> 15<211> 14<212> PRT<213> Mus sp.

<400> 15

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg1 5 10

<210>16<211> 15<212> PRT<213> Mussp.

<400> 16

Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys1 5 10 15

<210>17<211> 12<212> PRT<213> Mus sp.

<400 17

Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys

1 5 10

<210> 18<211> 19<212> PRT<213> Mussp.

<400 18

Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile1 5 10 15Ala Pro Lys

<210> 19<211> 12<212> PRT<213> Mus sp.

<400> 19

Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys

1 5 10

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 20

Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys1 5 10

<210> 21<211> 16<212> PRT<213> Mus sp.

<400> 21

Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys1 5 10 15

<210> 22<211 >28<212> PRT<213> Mus sp.<400> 22

Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro1 5 10 15

Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys20 25

<210> 23<211 >16<212> PRT<213>Mussp.

<400> 23

Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys1 5 10 15

<210> 24<211> 10<212> PRT20 <213> Mus sp.

<400> 24

Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val Gln Arg1 5 10<210> 25<211>11<212> PRT<213> Mus sp.

<400> 25

Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg1 5 10

<210> 26<211>11<212> PRT<213> Mus sp.

<400> 26

Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu Arg Pro Val Lys1 5 10

<210> 27<211> 10<212> PRT<213> Mus sp.

<400> 27

Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg1 5 10

<210> 28<211> 18<212> PRT<213> Mus sp.

<400> 28

Pro Gln Ser Cys Leu Val Asp Gln Thr Gly Ser Ala His Cys Val Val

1 5 10 15

Cys Arg

<210> 29<211> 12<212> PRT<213> Mus sp.

<400> 29Asp Ser Cys Asp Gly Val Glu Cys Gly Pro Gly Lys1 5 10

<210> 30<211>9<212> PRT<213> Mus sp.

<400> 30

Ser Cys Ala Gln Val Val Cys Pro Arg1 5

<210> 31<211> 13<212> PRT<213> Mus sp.

<400> 31

Glu Cys Glu Thr Asp Gln Glu Cys Glu Thr Tyr Glu Lys

1 5 10

<210> 32<211>9<212> PRT<213> Mus sp.

<400> 32

Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val Val Arg1 5

<210> 33<211> 11<212> PRT<213> Mus sp.<400> 33

Glu Ala Cys Glu Glu Ser Cys Pro Phe Pro Arg1 5 10

<21Q> 34<211> 8<212> PRT<213> Mus sp.

<400> 34

Ser Asp Phe Val Xle Leu Gly Arg

1 5.

<210> 35<211> 12<212> PRT<213> Mus sp.

<400> 35

Val Ser Glu Leu Thr Glu Glu Gln Asp Ser Gly Arg1 5 10

<210> 36

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys1 5 10 15

<210> 37<211> 14<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 37

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg1 5 10

<210> 38<211> 28<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro

1 5 10 15

Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys20 25

<210> 39<211> 10<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 39

Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val Gln Arg1 5 10

<210> 40<211 >18<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 40Pro Gln Ser Cys Val Val Asp Gln Thr Gly Ser Ala His Cys Val Val1 5 10 15

Cys Arg

<210> 41<211> 13<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 41

Cys Glu Cys Ala Pro Asp Cys Ser Gly Leu Pro Ala Arg1 5 10

<210> 42<211> 12<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 42

Leu Gln Val Cys Gly Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Arg1 5 10

<210> 43<211> 12<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

Val Ser Glu Leu Thr Glu Glu Pro Asp Ser Gly Arg

1 5 10

<210> 44<211> 10<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 44

Cys Tyr Met Asp Ala Glu Ala Cys Ser Lys

1 5 10

<210> 45<211> 10<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 45

Gly Ile Thr Leu Ala Val Val Thr Cys Arg1 5 10

<210> 46<211 >31<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador<400> 46

ttggccactg ccaccacaat ctcaaccact t

<210> 47<211> 26<212> DNA <213> Seqüência Artificial

31

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador<400> 47tctcagcatg gccatgccgc cgtcga

<210> 48<211> 1716<212> DNA<213> Mus sp.

<220><221 > CDS<222> (1 )..(1713)

<400> 48

atg tgt gcc cca

Met Cys Ala Pro1

ttg ctg ctg ctc

Leu Leu Leu Leu20

ate cga tac tcc

Ile Arg Tyr Ser35

ctc tgg gtg gat

Leu Trp Val Asp50

cag gaa tgt gag

Gln Glu Cys Glu65

aag age tgt gtgLys Ser Cys Val

cct gta ggc atg

Pro Val Gly Met100

cag cag ggc tet

ggg tat cat cgg

Gly Tyr His Arg5

ctc gag gct cccLeu Glu Ala Pro

cat gcg ggc ate

His Ala Gly Ile40

gcc cag age acc

Ala Gln Ser Thr55

acc tat gag aaa

Thr Tyr Glu Lys70

gea gcc cgc tac

Ala Ala Arg Tyr85

ccc aag gag gccPro Lys Glu Ala

gag tgt gac ate

ttc tgg ttt cac

Phe Trp Phe His10

ctt cga ggc cta

Leu Arg Gly Leu25

tgc ccc aac gacCys Pro Asn Asp

tgc aag cga gag

Cys Lys Arg Glu60

tgc tgc ccc aat

Cys Cys Pro Asn75

atg gat gtg aaa

Met Asp Val Lys90

aca tgt gac cat

Thr Cys Asp His105

tgg gac ggc cag

tgg ggg ctg ctg

Trp Gly Leu Leu15

gea ctg cca ccc

Ala Leu Pro Pro30

atg aac ccc aac

Met Asn Pro Asn45

tgt gaa aca gac

Cys Glu Thr Asp

gtg tgt ggg acc

Val Cys Gly Thr80

ggg aag aag ggg

Gly Lys Lys Gly95

ttc atg tgc ctg

Phe Met Cys Leu110

ccc gtg tgt aagGln Gln Gly Ser

115

tgc aaa gat cgc

Cys Lys Asp Arg130

ggc ctt acc tac

Gly Leu Thr Tyr145

aag ggc ate acaLys Gly Ile Thr

cct aac acc age

Pro Asn Thr Ser180

gcc tet ccg gag

Ala Ser Fru Glu195

aac cac cct gtc

Asn His Pro Val210

ctc tgt gac gtg

Leu Cys Asp Val225

cag ctg gag gacGln Leu Glu Asp

ggt aat gtg gtg

Gly Asn Val Val260

cag ccc cag gat

Gln Pro Gln Asp275

ggt gtc ctg agg

Gly Val Leu Arg290

gcc agg gcc act

Ala Arg Ala Thr305

aca gag tgc ctg

Glu Cys Asp Ile120

tgt gag aag gag

Cys Glu Lys Glu135

tac aac cgt tgc

Tyr Asn Arg Cys150

ctg tet gtg gtc

Leu Ser Val Val165

cct cca ccg cct

Pro Pro Pro Pro

act ctc ggg ctg

Thr Leu Gly Leu200

cat cag tca gtc

His Gln Ser Val215

gta ggc cgg cct

Val Gly Arg Pro230

cga gag aat gtt

Arg Glu Asn Val245

gtc act aac attVal Thr Asn Ile

gct ggc ata tac

Ala Gly Ile Tyr280

gct gac ttc ccg

Ala Asp Phe Pro295

tca gag age agt

Ser Glu Ser Ser310

aag ccc cca gac

85

Trp Asp Gly Gln

ccc age ttc acc

Pro.Ser Phe Thr140

ttc atg gac gcc

Phe Met Asp Ala155

acc tgt cgt tat

Thr Cys Arg Tyr170

gag acc acg gtg

Glu Thr Thr Val185

gac atg gea gcc

Asp Met Ala Ala

acc gtg ggt gag

Thr Val Gly Glu220

cgg cca gag ctc

Arg Pro Glu Leu235

gtc atg agg ccc

Val Met Arg Pro250

gcc cag ctg gtc

Ala Gln Leu Val265

acc tgt aca gctThr Cys Thr Ala

ttg tcg gtg gtc

Leu Ser Val Val300

ctc aat ggc aca

Leu Asn Gly Thr315

agt gag gac tgt

Pro Val Cys Lys125

tgt gcc tet gatCys Ala Ser Asp

gaa gcc tgc tcc

Glu Ala Cys Ser160

cac ttc acc tgg

His Phe Thr Trp175

cat ccc acc acc

His Pro Thr Thr190

cca gcc ctg ctc

Pro Ala Leu Leu205

act gtg agt ttc

Thr Val Ser Phe

act tgg gag aaa

Thr Trp Glu Lys240

aac cac gtg cgt

Asn His Val Arg255

ate tac aac gtc

Ile Tyr Asn Val270

cga aat gtc gct

Arg Asn Val Ala285

agg ggt ggt cagArg Gly Gly Gln

gct ttt cca gea

Ala Phe Pro Ala320

gga gag gag cagThr Glu Cys Leu Lys Pro Pro Asp Ser Glu Asp Cys Gly Glu Glu Gln325 330 335

aca cgc

tgg cac ttc gac gcc cag gct aac aac tgc ctc act ttc acc

Thr Arg Trp His Phe Asp Ala Gln Ala Asn Asn Cys Leu Thr Phe Thr340 345 350

ttt ggc cac tgc cac cac aat ctc aac cac Ltt gag acc tac gag gc<~·

Phe Gly His Cys His His Asn Leu Asn His Phe Glu Thr Tyr Glu Ala355 360 365

1056

1104

tgt atg ctg gct tgt atg agt ggg cca ttg gcc acc tgc age ctg cct

Cys Met Leu Ala Cys Met Ser Gly Pro Leu Ala Thr Cys Ser Leu Pro370 375 380

1152

gcc ctg caa ggg cct tgc aaa gct tat gtc cca cgc tgg gcc tac aac

Ala Leu Gln Gly Pro Cys Lys Ala Tyr Val Pro Arg Trp Ala Tyr Asn

385 390 395 400

age cag aca ggc cta tgc cag tcc ttc gtc tat ggc ggc tgt gag ggc

Ser Gln Thr Gly Leu Cys Gln Ser Phe Val Tyr Gly Gly Cys Glu Gly

405 410 415

aac ggt aac aac ttt gaa age cgt gag gct tgt gag gag tcg tgt ccc

1200

1248

1296

Asn Gly Asn Asn Phe Glu Ser Arg Glu Ala Cys Glu Glu Ser Cys Pro 420 425 430

ttc ccg agg ggt aac cag cac tgc cgg gcc tgc aag ccc cgg caa aaa 1344

Phe Pro Arg Gly Asn Gln His Cys Arg Ala Cys Lys Pro Arg Gln Lys435 440 445

ctt gtt acc age ttc tgt cgg agt gac ttt gtc ate ctg ggc agg gtc

Leu Val Thr Ser Phe Cys Arg Ser Asp Phe Val Ile Leu Gly Arg Val450 455 460

1392

tet gag ctg acc gag gag caa gac tcg ggc cgt gcc ctg gtg acc gtg 1440

Ser Glu Leu Thr Glu Glu Gln Asp Ser Gly Arg Ala Leu Val Thr Val465 470 475 480

gat gag gtc tta aaa gat gag aag atg ggc ctc aag ttt ctg ggc cgg 1488

Asp Glu Val Leu Lys Asp Glu Lys Met Gly Leu Lys Phe Leu Gly Arg

485 490 495

gag cct ctg gaa gtc acc ctg ctt cat gta gac tgg acc tgt cct tgc 1536

Glu Pro Leu Glu Val Thr Leu Leu His Val Asp Trp Thr Cys Pro Cys500 505 510

ccc aac gtg aca gtg ggt gag aca cca ctc ate ate atg ggg gag gtg 1584

Pro Asn Val Thr Val Gly Glu Thr Pro Leu Ile Ile Met Gly Glu Val515 520 525

gac ggc ggc atg gcc atg ctg aga ccc gat age ttt gtg ggg gea tcg 1632Asp Gly Gly Met Ala Met Leu Arg Pro Asp Ser Phe Val Gly Ala Ser530 535 540

age aca cgg cgg gtc agg aag ctc cgt gag gtc atg tac aag aaa acc

Ser Thr Arg Arg Val Arg Lys Leu Arg Glu Val Met Tyr Lys Lys Thr545 550 555 560

tgt gac gtc ctc aag gac ttc ctg ggc ttg caa tga

Cys Asp Val Leu Lys Asp.Phe Leu Gly Leu Gln565 570

<210> 49<211 >571<212> PRT<213> Mus sp.

^ JAA^ IA

^huu-'

Met Cys Ala Pro Gly Tyr His Arg Phe Trp Phe His Trp Gly Leu Leu1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Leu Arg Gly Leu Ala Leu Pro Pro20 25 30

Ile Arg Tyr Ser His Ala Gly Ile Cys Pro Asn Asp Met Asn Pro Asn35 40 45

Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser Thr Cys Lys Arg Glu Cys Glu Thr Asp50 55 60

Gln Glu Cys Glu Thr Tyr Glu Lys Cys Cys Pro Asn Val Cys Gly Thr65 70 75 80

Lys Ser Cys Val Ala Ala Arg Tyr Met Asp Val Lys Gly Lys Lys Gly85 90 95

Pro Val Gly Met Pro Lys Glu Ala Thr Cys Asp His Phe Met Cys Leu100 105 110

Gln Gln Gly Ser Glu Cys Asp Ile Trp Asp Gly Gln Pro Val Cys Lys115 120 125

Cys Lys Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro Ser Phe Thr Cys Ala Ser Asp130 135 140

Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Phe Met Asp Ala Glu Ala Cys Ser145 150 155 160

Lys Gly Ile Thr Leu Ser Val Val Thr Cys Arg Tyr His Phe Thr Trp165 170 175

Pro Asn Thr Ser Pro Pro Pro Pro Glu Thr Thr Val His Pro Thr Thr180 185 190

Ala Ser Pro Glu Thr Leu Gly Leu Asp Met Ala Ala Pro Ala Leu Leu195 200 205Asn His Pro Val His Gln Ser Val Thr Val Gly Glu Thr Val Ser Phe210 215 220

Leu Cys Asp Val Val Gly Arg Pro Arg Pro Glu Leu Thr Trp Glu Lys225 230 235 240

Gln Leu Glu Asp Arg Glu Asn Val Val Met Arg Pro Asn His Val Arg245 250 255

Gly Asn Val Val Val Thr Asn Ile Ala Gln Leu Val Ile Tyr Asn Val260 265 270

Gln Pro Gln Asp Ala Gly Ile Tyr Thr Cys Thr Ala Arg Asn Val Ala275 280 285

Gly Val Leu Arg Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val Val Arg Gly Gly Gln290 295 300

Ala Arg Ala Thr Ser Glu Ser Ser Leu Asn Gly Thr Ala Phe Pro Ala305 310 315 320

Thr Glu Cys Leu Lys Pro Pro Asp Ser Glu Asp Cys Gly Glu Glu Gln325 330 335

Thr Arg Trp His Phe Asp Ala Gln Ala Asn Asn Cys Leu Thr Phe Thr340 345 350

Phe Gly His Cys His His Asn Leu Asn His Phe Glu Thr Tyr Glu Ala355 360 365

Cys Met Leu Ala Cys Met Ser Gly Pro Leu Ala Thr Cys Ser Leu Pro370 375 380

Ala Leu Gln Gly Pro Cys Lys Ala Tyr Val Pro Arg Trp Ala Tyr Asn385 390 395 400

Ser Gln Thr Gly Leu Cys Gln Ser Phe Val Tyr Gly Gly Cys Glu Gly405 410 415

Asn Gly Asn Asn Phe Glu Ser Arg Glu Ala Cys Glu Glu Ser Cys Pro420 425 430

Phe Pro Arg Gly Asn Gln His Cys Arg Ala Cys Lys Pro Arg Gln Lys435 440 445

Leu Val Thr Ser Phe Cys Arg Ser Asp Phe Val Ile Leu Gly Arg Val450 455 460

Ser Glu Leu Thr Glu Glu Gln Asp Ser Gly Arg Ala Leu Val Thr Val465 470 475 480

Asp Glu Val Leu Lys Asp Glu Lys Met Gly Leu Lys Phe Leu Gly Arg485 490 495

Glu Pro Leu Glu Val Thr Leu Leu His Val Asp Trp Thr Cys Pro Cys500 505 510

Pro Asn Val Thr Val Gly Glu Thr Pro Leu Ile Ile Met Gly Glu Val515 520 525

Asp Gly Gly Met Ala Met Leu Arg Pro Asp Ser Phe Val Gly Ala Ser530 535 540

Ser Thr Arg Arg Val Arg Lys Leu Arg Glu Val Met Tyr Lys Lys Thr545 550 555 560Cys Asp Val Leu Lys Asp Phe Leu Gly Leu Gln565 570

<210> 50<211> 34<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador<400> 50

caccatgtgt gccccagggt atcatcggtt ctgg 34

<210> 51<211> 27<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador<400> 51

ttgcaagccc aggaagtcct tgaggac 27

<210> 52<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência de peptídeo N-terminalilustrativa<400> 52

Leu Pro Pro Ile Arg Tyr Ser His Ala Gly Ile1 5 10

<210> 53<211 >48<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotídeo sintético<400> 53

cagacagaca gacagacaga cagacagaca gacagacaga cagacaga

48

Claims

1. Composição farmacêutica que compreende:i) GASP1, eii) pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que aGASP1 possui uma modificação na estabilização.

3. Composição de acordo com a reivindicação 2, em que a mo-dificação é uma fusão com a região Fc de uma molécula IgG.

4. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que a mo-lécula IgG é IgGI ou lgG4, ou seus derivados.

5. Composição de acordo com a reivindicação 4, em que a mo-lécula IgG é IgG ou um derivado deste.

6. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que a mo-lécula IgG é fundida à GASP1 por um peptídeo articulador.

7. Composição de acordo com a reivindicação 2, em que a mo-dificação compreende um sítio de glicosilação alterado.

8. Composição de acordo com a reivindicação 2, em que a mo-dificação compreende pelo menos uma porção de carboidrato.

9. Composição de acordo com a reivindicação 2, em que a mo-dificação compreende albumina ou um derivado de albumina.

10. Composição de acordo com a reivindicação 2, em que amodificação compreende um polímero não proteináceo.

11. Composição de acordo com a reivindicação 2, em que amodificação compreende submeter a peguilação.

12. Kit de diagnóstico que compreende GASP1 e pelo menosum outro componente do kit selecionado de:i) pelo menos um agente que se liga à GASP1;ii) pelo menos um tampão e/ou solução; eiii) pelo menos um componente estrutural.

13. Célula recombinante que compreende um ácido nucléicoque codifica a GASP1.

14. Célula recombinante de acordo com a reivindicação 13, emque a GASP1 possui uma modificação de estabilização,

15. Método de modular o GDF-8 que compreende a administrarGASP1 e deixar a GASP1 interagir com o GDF-8.

16. Método de tratar um paciente sofrendo de um distúrbio mé-dico, compreendendo a administracao de uma dose terapeuticamente eficazde GASP1 e deixar a GASPI interagir com o GDF-8.

17. Método de tratar um paciente sofrendo de um distúrbio mé-dico, compreendendo a administração de um ácido nucléico que codifica aGASP1, permitindo o ácido nucléico ser submetido a translação na GASP1,e deixar a GASP1 submetida a translação interagir com o GDF-8.

18. Método de expressar um ácido nucléico que codifica aGASP1, compreendendo a administração de um ácido nucléico que codificaa GASP1 a uma célula, deixando o ácido nucléico ingressar na célula, e dei-xar a célula se expressar a GASP1.

19. Método de acordo com a reivindicação 16, 17 ou 18, em quea GASP1 possui uma modificação de estabilização.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que a modifi-cação é uma fusão com a região Fc de uma molécula IgG.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a molé-cula IgG é IgGI ou lgG4, ou seus derivados.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a molé-cula IgG é IgG ou um derivado deste.

23. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a molé-cula IgG é fundida à GASP1 por um peptídeo articulador.

24. Método de acordo com a reivindicação 19, em que a modifi-cação compreende um sítio de glicosilação alterado.

25. Método de acordo com a reivindicação 19, em que a modifi-cação compreende pelo menos uma porção de carboidrato.

26. Método de acordo com a reivindicação 19, em que a modifi-cação compreende albumina ou um derivado de albumina.

27. Método de acordo com a reivindicação 19, em que a modifi-cação compreende um polímero não proteináceo.

28. Método de acordo com a reivindicação 19, em que a modifi-cação compreende submeter a peguilação.

29. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o paci-ente deve terapeuticamente se beneficiar de um aumento na massa ouquantidade do tecido muscular.

30. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o distúr-bio é um distúrbio muscular.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o distúr-bio muscular é uma distrofia muscular.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, em que a distrofiamuscular é selecionada de distrofia muscular ligada ao X severa ou benigna,distrofia da cintura pélvica, distrofia facioescapuloumeral, distrofia miotônica,distrofia muscular distai, oftalmoplegia distrófica progressiva, distrofia ocu-lofaríngea, distrofia muscular de Duchenne, e distrofia muscular congênitatipo Fakuyama.

33. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o distúr-bio é selecionado de esclerose lateral amiotrófica, doença pulmonar obstru-tiva congestiva, miopatia congênita, miotonia congênita, paralisia periódicafamiliar, mioglobinúria paroxismal, miastenia grave, síndrome Eaton-Lambert, miastenia secundária, atrofia de desnervação, atrofia dos órgãos,fragilidade, síndrome do túnel do carpo, atrofia muscular, atrofia muscularparoximal, sarcopenia, caquexia e outras síndromes da debilitação muscular.

34. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o distúr-bio é um distúrbio muscular selecionado de um ferimento traumático no teci-do muscular e um ferimento crônico no tecido muscular.

35. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o distúr-bio é uma doença ou distúrbio metabólico.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, em que o distúr-bio é diabetes melito dependente de insulina (tipo 1), diabetes melito não-dependentes de insulina (tipo 2), hiperglicemia, tolerância a glicose prejudi-cada, síndrome metabólica (por exemplo, síndrome X), resistência a insulinainduzida por trauma (por exemplo, queimaduras ou desequilíbrio de nitrogê-nio) ou obesidade.

37. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o distúr-bio é um distúrbio do tecido adiposo tal como obesidade.

38. Metodo de acordo com a reivindicacao 16, em que o distur-bio é uma doença degenerativa do osso tai como osteoporose, osteoporoseinduzida por glicocorticóide, osteopenia, osteoartrite ou fraturas relacionadascom a osteoporose, ou outros distúrbios incluindo massa óssea baixa devidoà terapia de glicocorticóide crônica, insuficiência gonática prematura, su-pressão de androgênio, deficiência de vitamina D, hiperparatiroidismo se-cundário, deficiências nutricionais, e anorexia nervosa.

39. Método de acordo com a reivindicação 16, em que a GASP1é administrada de uma vez, ou em intervalos diários, semanais ou mensais.

40. Método de acordo com a reivindicação 16, em que a GASP1é administrada em uma dose de 5 mg a 100 mg.

41. Método de acordo com a reivindicação 16, em que a GASP1é administrada em uma dose de 15 mg a 85 mg.

42. Método de acordo com a reivindicação 16, em que a GASP1é administrada em uma dose de 30 mg a 70 mg.

43. Método de acordo com a reivindicação 16, em que a GASP1é administrada em uma dose de 40 mg a 60 mg.

44. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que aGASP1 é selecionada de:i) SEQ ID NO: 5;ii) SEQ ID NO: 7; eiii) mutantes da substituição, adição e/ou anulação de i) ou ii).

45. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que aGASP1 é codificada por uma seqüência de nucleotídeo selecionada de:i) SEQ ID NO: 4;ii) SEQ ID NO: 6;iii) seqüências de nucleotídeo que codificam mutantes dasubstituição, adição e/ou anulação das seqüências codificadas por i) ou ii); eiv) seqüências de nucleotídeo que codificam as mesmasseqüências de aminoácido como são codificadas por i) ou ii).

46. Composição farmacêutica que compreende:i) um fragmento de GASP1 selecionado dea) aminoácidos 174-239 da SEQ ID NO: 5 representando o do-mínio de folistatina;b) aminoácidos 110-175 da SEQ ID NO: 7 representando o do-mínio de folistatina; ec) mutantes da substituição, adição e/ou anulação de a) ou b); eii) pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.

47. Composição de acordo com a reivindicação 46, em que ofragmento de GASP1 é codificado por uma seqüência de nucleotídeo sele-cionado de:i) nucleotídeos 520-717 da SEQ ID NO: 4 que codificam odomínio de folistatina;ii) nucleotídeos 328-525 da SEQ ID NO: 6 que codificam odomínio de folistatina;iii) seqüências de nucleotídeo que codificam mutantes dasubstituição, adição e/ou anulação das seqüências codificadas por i) ou ii); eiv) seqüências de nucleotídeo que codificam as mesmasseqüências de aminoácido como são codificadas por i) ou ii).