KR20010022730A - Ｈｉｖ-1의 모든 아형의 증폭 및 검출시 프라이머 및 프로브로서 사용할 수 있는 핵산 서열 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바이러스 진단, 특히 AIDS를 유발하는 인간의 면역결핍 바이러스(HIV)에 의한 감염 진단에 사용할 수 있는 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 HIV-1 핵산의 증폭 및 검출에서 프라이머 및 프로브로서 사용할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 본 발명에서 제공되는 올리고뉴클레오티드는 HIV 바이러스 게놈의 LTR 부분에 배치되어 있다. 핵산의 증폭 및 검출을 위한 방법에서 본 발명의 서열을 이용하여 HIV-1을 감도 높게 특이적으로 검출할 수 있다는 것을 확인하였다. 본 발명의 서열의 장점은, 본 발명의 서열을 포함하는 프라이머 및 프로브하에 현재 알려진 모든 HIV-1의 아형의 핵산을 높은 정확도 및 감도로 검출할 수 있다는 것이다. 지금까지 광범위한 HIV-1 변종을 검출할 수 있도록 개발된 프라이머쌍 또는 하이브리드화 프로브는 없었다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 서열은 핵산의 증폭 방법에 특히 유용하다.

Description

ＨＩＶ-1의 모든 아형의 증폭 및 검출시 프라이머 및 프로브로서 사용할 수 있는 핵산 서열{NUCLEIC ACID SEQUENCES THAT CAN BE USED AS PRIMERS AND PROBES IN THE AMPLIFICATION AND DETECTION OF ALL SUBTYPES OF HIV-1}
종래 바이러스 진단은 주로 바이러스 항원 또는 이에 대한 특이적 항체의 검출에 기초한 것이지만, 최근에는 바이러스의 게놈 또는 이로부터 유도된 핵산 서열(RNA 및 DNA)을 직접 검출하는 방법으로 관심이 전향되었다. 이들 방법은 일반적으로 핵산 하이브리드화를 기초로 한 것이다. 핵산 하이브리드화는 상보 서열을 포함하는 2가닥 핵산이 적합한 조건하에서 서로 어닐링하여, 2본쇄 구조를 형성하는 능력에 기초한 것이다. 상보쇄가 표지된 경우, 표지를 검출할 수 있는데, 이 표지는 표적 서열의 존재에 대한 지표이다. 특히, 핵산 서열의 증폭에 대한 방법과 함께 이들 방법은 바이러스 진단, 특히 인간 면역결핍 바이러스(HIV)의 검출에 있어서 중요한 도구가 된다.
특히 핵산 증폭 기법은, 혈청학적 방법이 의심스러운 결과를 초래한 경우, 또는 바이러스 감염과 바이러스에 대한 항체 형성 사이에 상당한 기간이 있는 경우에 부가적인 기술로서 유용하다. HIV의 경우에는 일반적으로 바이러스에 노출 후에 3∼6 개월후에 혈청전환이 발생할 수 있다. 따라서, 종래의 면역분석법으로는 항체가 검출되지 않지만, 프로바이러스 DNA 또는 순환성 바이러스 RNA는 검출가능하다. 또한 항바이러스 치료를 모니터링하는데 있어서, 핵산 증폭을 기초로 한 방법은 혈청학적 방법보다 몇가지 장점이 있다. 특히 정량적인 증폭 방법은 치료 전 및 치료 기간 중에 존재하는 바이러스 양의 변화를 평가하는데 있어서 강력한 도구를 제공한다.
핵산 서열의 증폭 및 검출 방법에 있어서 프라이머 및 프로브로서 사용하고자 하는 올리고뉴클레오티드의 선택은 분석의 민감성 및 특이성에 중요하다.
증폭하고자 하는 서열은 일반적으로 소량으로 시료(예를 들어 바이러스로 감염되었을 것으로 의심되는 환자에서 얻은 혈액 시료)에만 존재한다. 프라이머는 시료내에 존재하는 바이러스 핵산을 효과적으로 증폭시킬 만큼 표적 서열에 충분히 상보적이어야 한다. 프라이머가 표적 서열에 적당하게 어닐링되지 않으면(양쇄에서 뉴클레오티드상의 염기의 부정합에 의해서), 증폭이 심하게 방해된다. 이는 분석의 감도에 영향을 주고, 잘못된 음성 시험 결과를 초래할 수 있다. 바이러스 게놈의 이질성으로 인해서, 프라이머 및 프로브가 바이러스의 변종의 일부에서만 존재하는 서열을 인식할 수 있는 경우 잘못된 음성 시험 결과가 얻어질 수 있다. HIV 바이러스는 높은 이질성을 나타낸다. 유전자 변이성은 다른 대륙에서 유래한 분리체 중에서 입증되었지만, 또한 개체간 및 질병의 상이한 단계간에서도 입증되었다. 서열 분석을 바탕으로, HIV-1내 2개의 군을 동정하였다. M군("주요(major)"에서의 M) 및 O군("분리물(outlier)"에서의 O). M군내에서 각각 서열의 계통발생적 개별 세트를 구성하는 아형(A-H)을 지정하고, 추가의 아형을 확인하였다. 이 서열 변형은 게놈 전반에 걸쳐 균일하게 분포되어 있지 않다. 모든 레트로바이러스 게놈과 같이 HIV-1 게놈은 대개 다음과 같은 영역으로 구성되어 있다. HIV-1 게놈의 gag 유전자는 바이러스의 코어 단백질(예를 들어 p24)을 암호화하는 영역이다. env 유전자는 거대 전구체 단백질, 즉 gp160을 암호화하는데, 이 단백질은 외피 단백질 gp120 및 gp41로 프로세싱된다. pol 유전자는 바이러스의 폴리머라제(역전사효소)를 암호화한다. 장말단 반복부(LTR)는 바이러스의 숙주 세포에의 통합에 관여하고 바이러스 유전자의 전사 조절에 관련된 바이러스 게놈의 영역이다. 일부 영역은 다른 영역보다 서열 변이성 경향이 더 크다. 특히 env 도메인에서 서열 변이성은 상이한 아형의 구성원 사이에서 30% 만큼 높을 수 있다. 이상적으로, 프라이머 선택은 해당 프라이머 서열내 균주간 변이성 및 프라이머 부위의 부정합의 결과에 관한 지식에 기초해야 한다. McCutchan 등[J.AIDS, 4, 1241-1250, 1991]은 상이한 HIV-1 분리체의 유전자를 비교하기 위해 PCR을 사용하였다. 고착된 PCR을 사용하여(다양한 센스 프라이머를 불변 안티센스 프라이머와 함께 사용하고, gag, env 및 LTR내 상대적으로 보존된 영역으로부터 프라이머를 선택함), 프라이머 부정합이 얻은 PCR 생성물의 양에 미치는 영향도 조사하였다. 프라이머의 3' 말단에서의 부정합은 때로는 생성물의 양을 100배 이상 감소시켰다.
현재 알려진 모든 HIV-1 아형의 검출은 매우 중요하며, 특히 환자 관리, 혈액 및 혈액 생성물의 안전과 임상 연구 및 유행병학 연구에 중요하다. HIV-1 유도된 핵산 서열의 증폭 및 후속되는 검출을 위한 현재의 분석법은 바이러스 게놈의 gag 영역에서의 서열 증폭을 기초로 한다. 이들 분석법은 유럽 및 미국에서의 주요 아형인 아형 B에 대해 개발되었다. 그러나, 이전에 지리적으로 제한된 기타 아형의 존재는 이들 국가와, 예컨대 아프라카 국가간에 빈번한 여행으로 인하여 증가하고 있다. 따라서, 가능한 HIV-1 바이러스의 여러 변종(바람직하게는 전부)을 검출할 수 있는 민감한 분석법이 필요하다.
HIV-1 유도된 핵산 서열의 신뢰할만한 증폭용으로 적절한 프라이머 세트를 확인하기 위한 연구가 지난 수년동안 진행되어왔다. Engelbrecht 등의 문헌[J.Virol.Meth., 55, 391-400, 1995]에는 env, gag 및 LTR 프라이머쌍을 사용하여 남아프리카 웨스턴 케이프에 존재하는 아형을 검출하기 위한 특이적이고 민감한 PCR 프로토콜 개발 연구를 개시하고 있다. 아형 B, C 및 D에 속하는 것으로 알려진 24개의 균주를 분석하였다. 프라이머쌍의 성능은 상이한 프라이머쌍에 대한 반응 조건의 최적화에 의해 상당히 좌우된다는 것이 밝혀졌다. 덜 엄중한 조건을 사용한 경우(예컨대, LTR 프라이머쌍과 함께 증가된 사이클 시간 및 더 낮은 어닐링 온도가 필요함), 이들 특정 HIV 균주는 모든 프라이머쌍을 이용하여 충분한 민감성 및 재생성으로 검출되었다.
Zazzi 등[J.Med.Virol., 38, 172-174, 1992]은 임상 시료중 HIV-1 DNA의 검출을 위한 2 단계 PCR 반응(네스티드(nested) 프라이머 이용)을 개발하였다. 증폭을 위해 사용되는 프라이머를 gag 유전자 및 LTR 영역으로부터 유도하였다. 이 연구에서 시험된 환자는 모든 인접 영역에 살고 있었으며, 제한된 수의 상이한 바이러스 균주만을 나타내는 것 같다.
LTR 유도된 네스티드(nested) 프라이머를 사용한 정량적 PCR 방법은 Vener 등의 문헌[Bio Techniques, 21, 248-255, 1996]에 개시되어 있다. 이 절차는 오직 HIV-1MN로 감염된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)상에서 시험하였다. 따라서, 상이한 아형의 바이러스를 검출하는데 사용되는 프라이머의 적합성에 관해서는 알 수 없다.
본 발명은 바이러스 진단 분야, 더욱 구체적으로 AIDS를 유발하는 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)에 의한 감염 진단에 사용할 수 있는 핵산 서열에 관한 것이다.
도 1: 다음 프라이머쌍을 사용하여 HIV-1 RNA의 존재(패널 A) 또는 부재(패널 B)하에 증폭 후 얻은 블로팅 후의 증폭 생성물과 증가된 화학발광에 의한 검출.
레인 1:서열 번호 9-서열 번호 10, 레인 2: 서열 번호 9-서열 번호 5, 레인 3: 서열 번호 10-서열 번호 4, 레인 4:서열 번호 10-서열 번호 5, 레인 5; 서열 번호 3-서열 번호 12.
본 발명은 HIV-1 핵산의 증폭 및 검출시 프라이머 및 프로브로서 사용할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 본 발명에서 제공되는 올리고뉴클레오티드 서열은 HIV 바이러스 게놈의 LTR 부분에 위치한다. 핵산의 증폭 및 검출을 위한 방법에서 본 발명의 서열을 이용하면, 민감하고 특이적으로 HIV-1을 검출할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명의 서열의 장점은 주로, 본 발명의 서열을 포함하는 프라이머 및 프로브를 이용하여 현재 공지된 모든 HIV-1의 아형의 핵산을 높은 정확도 및 감도로 검출할 수 있다는 것이다. 지금까지는 이러한 광범위한 HIV-1 변종을 검출할 수 있도록 개발된 프라이머쌍 또는 하이브리드화 프로브가 없었다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 서열은 핵산의 증폭 방법에 특히 유용하다.
핵산을 증폭시키는 각종 기법이 당업계에 공지되어 있다. DNA 표적 세그먼트 증폭 기법의 한 예로는 소위 말하는 "폴리머라제 연쇄 반응"(PCR)이 있다. PCR 기법에서는 특정 표적 분절의 카피수가 사이클의 수에 따라 지수함수적으로 증가한다. 프라이머쌍을 사용하고, 각 사이클에서 DNA 프라이머를 2본쇄 DNA-표적 서열의 2 가닥 각각의 3'쪽에 어닐링시킨다. 프라이머를 각종 모노뉴클레오티드의 존재하에 DNA 폴리머라제로 연장하여 2본쇄 DNA를 다시 형성한다. 2본쇄 DNA의 가닥을 열 변성시켜 서로 분리하고, 각 가닥은 다음 사이클에서 프라이머 어닐링 및 후속되는 신장에 주형으로서 사용한다. PCR 방법은 Saiki 등의 문헌[Science 230, 135, 1985] 및 유럽 특허 EP200362호 및 EP201184호에 개시되어 있다.
핵산 증폭을 위한 또 다른 기법으로는 전사계 증폭 시스템(TAS)이 있다. TAS법은 국제 특허 출원 WO 88/10315에 개시되어 있다. 전사계 증폭 기법은 일반적으로 2개의 올리고뉴클레오티드(이중 하나는 프로모터 서열을 포함함)로 표적 핵산을 처리하여 작용성 프로모터를 포함하는 주형을 형성하는 단계를 포함한다. 이 주형으로부터 다중 카피의 RNA를 전사시켜, 추가의 증폭에 대한 베이스로서 사용할 수 있다.
등온 연속 전사계 증폭법은 이른바 NASBA법("NASBA")라고 부르는 것으로서, 유럽 특허 EP329822에 개시되어 있다. NASBA는 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 T7 프로모터를 비롯한 주형으로부터 RNA의 다중 카피를 전사시킨다. 기타 전사계 증폭 기법은 EP408295에 개시되어 있다. EP408295는 주로 2 효소 전사계 증폭 방법에 관한 것이다. 전사계 증폭 방법, 예컨대 EP329822에 개시된 NASBA 방법은 일반적으로 한 세트의 올리고뉴클레오티드를 사용하는데, 이중 하나는 예컨대 T7 폴리머라제와 같은 DNA 의존성 RNA 폴리머라제가 인식하는 프로모터 서열을 가지고 있다. 일부 변형된 전사계 기법이 당업계에 알려져 있다. 이들 변형은, 예컨대 차단된 올리고뉴클레오티드(프로모터 서열을 보유할 수 있음)의 사용을 포함한다. 이들 올리고뉴클레오티드는, 이들로부터 연장 반응이 진행되는 것을 억제할 수 있도록 차단된다(US5554516). 하나 이상의 "프로모터-프라이머"(프로모터 서열이 보유된 올리고뉴클레오티드 서열)을 전사계 증폭 기법에 사용할 수 있으며, 임의로 프로모터 서열이 제공되지 않는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드의 사용과 조합할 수도 있다. RNA 증폭에서, 전사계 증폭 기법이 바람직한 기법이다. PCR을 사용한 증폭은 RNA 주형에 기초할 수 있다. 실제 PCR은 RNA를 DNA로 카피하기 위한 역전사 단계후에 수행해야 한다(RT-PCR). 그러나, RT-PCR이 바이러스 전사체의 검출에 사용되는 경우, mRNA 유도된 PCR 생성물 및 DNA 유도된 PCR 생성물에 차이가 있어야 한다. RT-PCR 전에 DNAse 처리할 수 있지만(Bitsch, A. et al., J.Infect.Dis 167, 740-743, 1993; Meyer, T. et al., Mol.Cell Probes. 8, 261-271, 1994), 때로는 오염 DNA를 충분히 제거할 수가 없다(Bitsch, A et al., 1993).
RT-PCR과 대조적으로, T7 RNA 폴리머라제에 의한 RNA 전사를 기초로 하는 NASBA(Kievits et al., 1991; Compton, 1991)는 RNA 유도된 증폭 생성물과 DNA 유도된 증폭 생성물 간에 차이가 필요하지 않은데, 그 이유는 기본적인 표적으로서 RNA를 사용하기 때문이다. NASBA는 DNA의 배경에서조차 RNA 표적을 특이적으로 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 임의의 특정 증폭 기법 또는 이의 임의의 특정 변형법에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 (증폭된) HIV 핵산의 존재를 검출하기 위한 각종 방법 및 다수의 상이한 핵산 증폭 기법에 사용할 수 있음은 분명하다. 또한 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 정량적 증폭 방법에 사용될 수 있다. 이러한 정량적 방법의 예는 EP525882호에 개시되어 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 2 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드로 구성된 분자를 의미한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 프라이머 및 프로브로서 사용할 수 있다.
물론, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 서열을 기초로 뉴클레오티드 유사체를 제조할 수 있다. 이러한 유사체는 "PNA"(정상 핵산의 인산염 당 골격 대신에 펩티드 유사 골격이 있는 분자) 등과 같은 또 다른 구조를 구성할 수 있다. 본 발명의 서열을 나타내는 이들 대안적인 구조도 본 발명의 일부임이 명백하다.
본 명세서에서 사용한 용어 "프라이머"는 자연 발생적(예, 제한 단편으로서) 또는 합성적으로 생성된 올리고뉴클레오티드를 의미하는데, 이 프라이머는 뉴클레오티드 및 핵산 중합반응을 위한 제제, 예컨대 DNA 의존성 또는 RNA 의존성 폴리머라제의 존재하에 적절한 조건(예, 완충액, 염, 온도 및 pH)에 있는 경우 핵산 가닥(주형 또는 표적 서열)에 상보적인 프라이머 연장 생성물의 합성 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머는 충분히 길어서 중합반응용 제제의 존재하에 연장 생성물의 합성을 촉진시킬 수 있어야 한다. 전형적인 프라이머는 길이가 약 10개 이상인, 표적 서열에 실질적으로 상보성 또는 상동성이 있는 서열을 포함하지만, 때로는 다소 더 긴 프라이머가 바람직하다. 일반적으로, 프라이머는 약 15∼26개 뉴클레오티드를 포함하지만, 프라이머가 특정 폴리머라제에 대한 프로모터 서열과 같은 추가의 서열을 포함하는 경우에는 더 긴 프라이머를 사용할 수도 있다.
보통 프라이머 세트는 2개 이상의 프라이머를 포함하는데, 하나의 프라이머는 "상방"에, 다른 프라이머는 "하방"에 있는 프라이머로서 함께 증폭물(상기 프라이머를 사용하여 증폭된 서열)을 한정한다.
주로 전사계 증폭 기법에 사용하기 위해서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 프로모터 서열에 결합시킬 수도 있다. 용어 "프로모터 서열"은 인식된 서열에 결합하여 RNA 전사체가 생성된 전사 과정을 개시하는 RNA 폴리머라제가 특이적으로 인식하는 핵산 서열의 영역을 의미한다. 원칙적으로, 개시 서열을 인식할 수 있는 공지되어 있고 이용가능한 폴리머라제에 대해 임의의 프로모터 서열을 사용할 수 있다. 공지된 유용한 프로모터는 박테리오파지 T3, T7 또는 SP6과 같은 특정 박테리오파지 RNA 폴리머라제가 인식하는 프로모터일 수 있다. 프로모터 서열에 결합된 올리고뉴클레오티드는 통상적으로 "프로모터 프라이머"라고 불리운다. 그러나, 프라이머로서의 기능, 예컨대 신장 반응에서의 개시점을 전술한 바와 같이 차단하거나, 또는 전사계 증폭 반응의 일부 양태에서 없앨 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 HIV 게놈의 핵산 서열의 LTR 영역의 서열에 실질적으로 상보적이며, 이 올리고뉴클레오티드는 길이가 10∼50개 뉴클레오티드이며, 다음 서열 또는 이의 상보 서열로 구성된 군에서 선택된 서열 중 적어도 10 뉴클레오티드 단편을 포함한다.
서열 번호 1: G GGC GCC ACT GCT AGA GA
서열 번호 2: G TTC GGG CGC CAC TGC TAG A
서열 번호 3: CGGGCGCCACTGCTA
서열 번호 4: CTG CTT AAA GCC TCA ATA AA
서열 번호 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA
서열 번호 6: TCT GGT AAC TAG AGA TCC CTC
서열 번호 7: TAG TGT GTG CCC GTC TGT
서열 번호 8: AGT GTG TGC CCG TCT GTT
서열 번호 12: GAT GCA TGC TCA ATA AAG CTT GCC TTG AGT
본 발명의 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드는 핵산 염기의 작은 결실부, 첨가부 및/또는 치환부를 포함할 수 있는데, 이러한 변형은 얻은 산출물 및 생성물에 상당한 정도로 부정적인 영향을 주지 않는 범위여야 한다는 것을 인지해야 한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 프로브로서 사용하는 경우, 변형이 프로브의 하이브리드화 효과를 낮추어서는 안된다. 예를 들어, 하나 이상의 프라이머에 프로모터 서열이 제공되는 전사계 증폭 기법의 경우, 프로모터 서열 바로 뒤에 푸린이 풍부한(=G 또는 A) 하이브리드화 서열을 도입시키면 전사에 좋은 영향을 줄 수 있다(C 및 T인 경우에는 불현성 전사가 발생할 수 있음). 이러한 서열을 표적 핵산에 이용할 수 없다면, 프로모터 서열의 마지막 3개 G 잔기 바로 다음에 있는 올리고뉴클레오티드에 퓨린 풍부 서열을 삽입시킬 수 있다. 본 발명의 서열은 DNA 서열로서 반영된다. 이들 서열의 RNA 등가체는 본 발명의 일부이다.
본 발명의 바람직한 올리고뉴클레오티드는 다음의 서열로 구성된 군에서 선택된 서열을 실질적으로 포함하는 올리고뉴클레오티드이다.
서열 번호 1: G GGC GCC ACT GCT AGA GA
서열 번호 2: G TTC GGG CGC CAC TGC TAG A
서열 번호 3: CGGGCGCCACTGCTA
서열 번호 4: CTG CTT AAA GCC TCA ATA AA
서열 번호 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA
서열 번호 6: TCT GGT AAC TAG AGA TCC CTC
서열 번호 7: TAG TGT GTG CCC GTC TGT
서열 번호 8: AGT GTG TGC CCG TCT GTT
서열 번호 9: aat tct aat acg act cac tat agg gAG AGG GGC GCC ACT GCT AGA GA
서열 번호 10: aat tct aat acg act cac tat agg gAG AGG TTC GGG CGC CAC TGC TAG A
서열 번호 11: aat tct aat acg act cac tat agg gCGGGCGCCACTGCTA
서열 번호 12: GAT GCA TGC TCA ATA AAG CTT GCC TTG AGT
서열 번호 9 내지 11은 실제로 서열 번호 1 내지 3이 반영된 서열을 포함한다. 서열 9∼11에서, 서열 번호 1 내지 3은 프로모터 서열(T7 프로모터 서열)에 작동가능하게 결합된다. 이로서 NASBA와 같은 전사계 증폭 기법에서 상방 프라이머로 사용하기에 특히 적절한 서열이 만들어진다.
본 발명의 바람직한 양태는 핵산 증폭에서 세트로서 사용하기 위해서 본 발명의 2 이상의 올리고뉴클레오티드를 조합한 것이다.
HIV-1의 게놈의 LTR 영역내에 배치된 표적 서열의 증폭시 세트로서 사용하기 위한 이러한 올리고뉴클레오티드쌍은 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드로 구성되는데, 여기서 제1 올리고뉴클레오티드는 길이가 10∼50개 뉴클레오티드이고 하기 서열 번호 1 내지 3으로 구성된 군에서 선택된 서열의 적어도 10개의 뉴클레오티드 단편을 포함하며, 제2 올리고뉴클레오티드는 길이가 10∼50개 뉴클레오티드이며 하기 서열 번호 4, 5 및 12로 구성된 군에서 선택된 서열의 적어도 10개의 뉴클레오티드 단편을 포함한다.
서열 번호 1: G GGC GCC ACT GCT AGA GA
서열 번호 2: G TTC GGG CGC CAC TGC TAG A
서열 번호 3: CGGGCGCCACTGCTA
서열 번호 4: CTG CTT AAA GCC TCA ATA AA
서열 번호 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA
서열 번호 12: GAT CGA TGC TCA ATA AAG CTT GCC TTG AGT
올리고뉴클레오티드 중 하나는 증폭 반응에서 "상방 올리고뉴클레오티드", 즉 상방 프라이머로서 사용할 수 있는 반면, 제2 올리고뉴클레오티드는 "하방 올리고뉴클레오티드", 즉 하방 프라이머로서 사용한다. 본 발명의 쌍에 포함된 두 올리고뉴클레오티드를 어닐링할 수 있는 HIV-게놈(또는 이의 상보 서열)에서의 위치는 증폭되는 핵산 서열을 함께 한정한다. 증폭된 서열은 HIV 게놈의 LTR 영역내의 "프라이머 결합 부위" 사이에 배치된다. 증폭 반응에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드 쌍을 사용하여 현재 알려진 모든 아형 HIV로부터 유도된 핵산의 정확하고 신뢰할 만한 증폭을 달성할 수 있다는 것을 밝혀냈다.
본 발명의 가장 바람직한 쌍의 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 1의 서열을 포함하는 제1 프라이머와 서열 번호 5의 서열을 포함하는 제2 프라이머로 구성된다. 전사계 증폭 방법에 사용하기 위해서, 서열 번호 5를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 함께 서열 번호 9를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 바람직하다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 일부는 본 발명의 올리고뉴클레오티드쌍으로 증폭된 핵산 검출시 프로브로서 사용하기에 특히 적절하다. 프로브로서 사용하는 경우, 올리고뉴클레오티드에는 검출가능한 표지가 제공될 수 있다. 프로브로서 특히 적절한 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 검출가능한 표지가 제공된 하기 서열 6 내지 8을 실질적으로 포함한다.
서열 번호 6: TCT GGT AAC TAG AGA TCC CTC
서열 번호 7: TAG TGT GTG CCC GTC TGT
서열 번호 8: AGT GTG TGC CCG TCT GTT
이러한 측면에서 가장 바람직한 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 6에 개시된 서열을 가진 올리고뉴클레오티드이다.
각종 표지 부분이 당업계에 공지되어 있다. 상기 부분은, 예컨대 방사능 하합물, 검출가능한 효소(예, 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)), 헵텐 유사 비오틴, 또는 비색, 형광, 화학발광 또는 전기화학발광 시그널과 같은 검출가능한 시그널을 발생시킬 수 있는 임의의 기타 부분이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 (증폭된) 표적 핵산 간의 하이브리드체를 당업계에 공지된 임의의 기타 방법으로 검출할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용한 전술한 바와 같은 핵산 증폭 방법도 본 발명의 일부임이 분명하다.
또한, 본 발명은 HIV 핵산의 증폭 및 검출을 위한 시험 키트를 제공한다. 상기 시험 키트를 사용하면 HIV 유도된 핵산을 함유할 것으로 예상되는 시료를 정확하고 감도 높게 검색할 수 있다. 이러한 시험 기트는 본 발명의 올리고뉴클레오티드쌍과, 경우에 따라서는 증폭 물질 검출에 대한 프로브로서 사용할 수 있는 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 시험 키트는 적절한 증폭 시약을 포함할 수 있다. 이들 시약은, 예컨대 증폭 반응을 수행하기 위한 적절한 효소이다. NASBA와 함께 사용하기 위해 채택한 키트는, 예를 들어 적절한 양의 역전사 효소, RNase H 및 T7 RNA 폴리머라제를 포함할 수 있다. 상기 효소는 완충된 용액중 키트내에 존재할 수 있지만 냉동 건조된 조성물, 예컨대 냉동 건조된 구형 입자로서 제공될 수 있다. 이러한 냉동 건조된 입자는 PCT 출원 제 EP95/01268에 개시되어 있다. 이 키트에는 증폭 반응을 수행하는데 적절한 완충 조성물을 추가로 공급할 수 있다. 상기 완충액은 키트와 함께 제공된 특정 올리고뉴클레오티드를 이용한 용도 뿐 아니라 키트가 의도한 특정 증폭 기법을 위해 최적화시킬 수 있다. NASBA와 같은 전사계 증폭 기법에서, 상기 완충액은, 예컨대 증폭 반응을 증강시키는 DMSO를 포함할 수 있다(PCT US90/04733에 개시됨).
또한 키트에는 증폭 과정에서의 점검 표지로서 내부 대조군을 제공하여 증폭 절차 중 하자에 기인하여 잘못된 음성 시험 결과가 생기는 것을 예방할 수 있다. 전사계 증폭 기법에서 내부 대조군을 사용하는 것은 PCT 출원 번호 EP93/02248에 개시되어 있다. 최적 대조 서열은 증폭 반응에서 표적 핵산과 경쟁하지 않는 방식으로 선별한다. 또한 키트는 증폭 전에 생물학적 견본으로부터 핵산 분리를 위한 시약을 포함할 수도 있다. 핵산 분리를 위한 적절한 방법은 EP389063호에 개시되어 있다.
실시예 1: HIV-1 게놈 RNA의 증폭 및 검출
다음 절차를 적용하여 다음 실시예에 개시된 바와 같은 시료로부터 HIV-1 게놈 RNA를 증폭 및 검출하였다.
시료 제조 및 핵산 분리
핵산 분리는 Boom 등의 문헌[1990, Journal of Clinical Microbiology 28, 495-503] 및 유럽 특허 제EP0389063호에 개시된 바와 같이 수행하였다. 간단히 요약하면, 건강한 공여체(HBsAg, 항-HIV 및 항-HCV에 대해 음성)로부터 얻은 푸울된 혈장 200 ㎕ 부피를 용해 완충액(47 mM 트리스-HCl, pH7.2, 20 mM EDTA, 1.2% 트리톤 X-100, 4.7 M 구아니딘 티오시아네이트(GuSCN, 스위스 부흐스 플루카)) 900 ㎖에 첨가하였다. 와동시키고 원심분리(30초, 13,000 rpm)한 후에, 문헌[Layne et al., 1992, Virology 189, 695-714]에 특성규명하여 개시된 바와 같이 HIV-1 RNA 아형 B 표준물의 일련의 희석물 또는 HIV-1 양성 견본의 일련의 희석물을 첨가하였다. 활성화된 규소(0.1 N HCl내 현탁액 1 ㎖중 0.4 g)의 첨가시, 현탁액을 보통 정도로 와동시키면서 실온에서 10 분 동안 항온처리하였다. 원심 분리(30∼60초, 13,000 rpm) 후에, 규소 펠렛을 세척 완충액(5.25 M GuSCN, 50 mM 트리스 HCl, pH6.4) 1㎖로 2회 세척하고, 2회 70% 에탄올 세척 단계 및 1회 아세톤 세척 단계를 수행하였다. 이어서, 10 분 동안 56℃ 가열 블록에서 규소 펠렛을 건조하였다. 용출 완충액(1.0 mM 트리스-HCl, pH8.5) 50 ㎕를 첨가하고 10분 동안 56℃에서 항온처리하여 규소로부터 핵산을 용출시켰다. 그 다음, 용출물 5 ㎕를 증폭 반응에 추가 사용하기 위해서 펠렛으로부터 취하였다. 잔류 용출물을 -70℃에 저장하였다.
NASBA 증폭
프라이머 혼합물 10 ㎕, (분리된) 핵산 5 ㎕ 및 효소 혼합물 5 ㎕로 구성된 반응물 20 ㎕에서 증폭시켰다. 프라이머 혼합물은 동결 건조된 어큐스피어(accusphere)를 어큐스피어 희석제 50 ㎕, 물 51.6 ㎕, 2M KCl 8.4 ㎕ 및 각 프라이머(10 μM) 5 ㎕로 재구성하여 만들었다. 혼합물을 사용전에 완전히 와동시켰다. 이 프라이머 혼합물로부터 10 ㎕를 (분리된) HIV-1 RNA(표준물) 5 ㎕에 첨가하였다. 이 혼합물을 65℃에서 5분 동안 항온처리한 후 추가의 5분 동안 41℃에서 항온처리하였다. 이들 항온처리 후에, 효소 혼합물 5 ㎕를 첨가하고, 41℃에서 5분 동안 항온처리하였다. 관을 검출 영역으로 옮기고 41℃에서 90분 동안 항온처리하였다. 증폭 반응 후에, 관을 추가의 사용전까지 20℃에서 저장하였다.
각 증폭 반응물은 다음과 같은 시약을 포함하였다.
40 mM 트리스 HCl, pH8.5
12 mM MgCl2
70 mM KCl
15% v/v 디메틸 설폭시드
5 mM 디티오트레이톨
각각의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 1 mM
뉴클레오시드 rATP, rCTP, rUTP 2 mM
1.5 mM rGTP
0.5 mM ITP
0.105 ㎍/㎕ BSA
0.08 유니트 RNaseH
32 유니트 T7RNA 폴리머라제
6.4 유니트 조류 골수아구증 바이러스 역전사효소(미국 세이카가쿠)
각 프라이머 0.2 μM
375 mM 소르비톨
45.6 mM 슈크로스
28.5 mM 만니톨
0.13 mM 덱스트란 T40
증폭된 생성물 검출
A. 겔 전기영동
아가로스 겔(2% 프로나로스 100 ㎖ 및 0.5 ㎍/㎖ 에티디움 브로마이드)을 사용하여 증폭 생성물의 존재를 분석하고, 1* TAE(40 mM 트리스 아세테이트, 1 mM EDTA, pH 8.0) 작동 완충액을 사용한다. 전기 영동을 약 30 분 동안 100 볼트에서 수행하였다. 에티디움 브로마이드로 염색된 증폭 생성물 밴드를 UV 조사로 가시화하였다. 50℃에서 4 시간 동안 블롯을 항온처리하여 하이브리드화 혼합물(750 mM NaCl, 75 mM 구연산나트륨, 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH6.7), 10 * Denhardts) 중의 비오틴 프로브(3 μM)와 블롯을 하이브리드화시켰다. 하이브리드화 후에, 블롯은 450 mM NaCl, 45 mM 구연산나트륨 pH6.4(2* SSPE) 및 1% 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 용액으로 50℃에서 5분 동안 2회 세척하고, 20 mM Na2HPO4pH 7.4, 360 mM NaCl, 2 mM EDTA 및 0.1% SDS로 실온에서 10분 동안 1회 세척하였다. 이어서, 10 ㎖의 50 mM Na2HPO4, 900 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7.4 및 0.5% SDS 중 2 ㎕ 스트렙타비딘/호스래디쉬 퍼옥시다제 용액(500 U/㎖, 아머샴 라이프 사이언스의 개선된 화학발광 검출 키트에서 얻음)과 함께 30분 동안 항온처리하였다. 2*SSPE, 0.1% SDS로 각각 5분 동안 2회 세척한 다음 실온에서 2*SSPE로 10분 동안 1회 세척한 후에, 블롯을 조직 사이에서 건조하고 아마샴 키트 프로토콜에 따라 필름에 현상 및 노출시켰다.
B. 전기화학발광(ECL) 프로브 하이브리드화
검출 희석액(1.0 mM 트리스/HCl, pH8.5 및 0.2 g/ℓ2-메틸이소티아졸론 HCl) 으로 증폭 생성물을 2회 희석하였다. 이어서, 희석된 증폭 생성물 5 ㎕를 5 μM의 스트렙타비딘 피복된 자기 비이드(평균 크기 2.8 μm ±0.2 μm, 미국 뉴욕주 그레이트 넥 다이날)에 결합된 0.084 μM의 HIV-1 특이적 비오틴 프로브 및 2*1011분자 ECL(트리스[2,2-비피리딘]루테늄[II] 복합체) 표지된 프로브와 함께 총 부피 25 ㎕의 750 mM NaCl, 75 mM 구연산나트륨, pH 6.4(5*SSC)로 30분 동안 41℃에서 항온처리하였다. 음성 대조군으로서, 검출 희석물을 비이드 프로브 및 ECL 프로브 혼합물과 함께 항온처리하였다. 항온처리 과정에서, 관을 매 10분마다 교반하여 비이드를 현탁상태로 유지하였다. 이어서, 분석 완충 용액 300 ㎕(100 mM 트리프로필아민, pH7.5)를 첨가하고, 방출된 ECL 시그널을 읽기 위해서 관을 ECL 검출 기구(오르가논 테크니카 비브이에서 입수가능한 NASBA QR-시스템)에 두었다.
실시예 2: HIV-1 게놈 RNA의 증폭 및 검출
다음 프라이머쌍을 HIV-1 RNA 가닥 104카피(260 nm에서 분광기로 측정함)상에서 시험하였다. RNA를 직접 증폭물에 첨가하였다. 증폭된 생성물 분석은 실시예 1에 개시된 바와 같이 겔 전기영동으로 수행하였다. 결과는 도 1에 도시되어 있다.
본 발명의 모든 프라이머쌍 및 프로브는 유사한 범위로 아형 B로부터 HIV-1 RNA를 증폭 및 검출할 수 있다. 초기 농도가 5.5*109카피/㎖인 HIV-1 RNA 표준물의 일련의 희석물을 사용하여 2개의 프라이머쌍(서열 번호 9/서열 번호 5 및 서열 번호 11/서열 번호 5)에 대해 분석 감도를 확인하였다. 서열 번호 7 및 서열 번호 6에 개시된 서열을 가진 프로브를 사용하여 검출하였다. 증폭 및 검출은 실시에 1에 개시된 바와 같이 수행하였다. 표 1은 2개의 프라이머쌍을 이용하여 얻은 결과를 제시하는 것이다.
HIV-1 RNA 카피 서열 번호 3/ 서열 번호 5 서열 번호 9/서열 번호 5
검출된 수 검출 % 검출된 수 검출 %
200 4:4 100% 4:4 100%
100 8:8 100% 8:8 100%
50 8:8 100% 8:8 100%
25 7:8 87.5% 7:8 87.5%
12 6:8 75% 4:8 50%
6 2:8 25% 4:7 57%
3 0:8 0% 2:7 28.5%
0 0:8 0% 0:7 0%
프라이머쌍은 프라이머쌍 서열 번호 9/서열 번호 5에 대한 검출율이 70%이고 프라이머쌍 서열 번호 3/서열 번호 5에 대한 검출율이 63%로 각각 HIV-1 RNA 표준물에 대하여 대략적으로 동일한 감도를 나타내었다.
실시예 3: 내부 대조군의 존재하에 HIV-1 RNA의 증폭 및 검출
실시예에서, 프라이머쌍 서열 번호 9/서열 번호 5와 서열 번호 7을 포함하는 프로브를 내부 대조군(ic-)RNA의 존재하에 HIV-1 RNA 표준물의 일련의 희석물에서 시험하였다. ic-RNA는 HIV-1 HXB-2의 LTR 서열의 일부를 포함하는 시험관내 전사체이고, 104카피(260 nm에서 분광기로 측정)는 핵산 분리전에 첨가한다. 실시예 1에 개시한 바와 같이 분리, 증폭 및 ECL 검출을 수행하였다. 비교를 위해서 Van Gemen 등의 문헌[1993, Journal of Virological Methods 43, 177-188]에 개시된 바와 같이 HIV-1 gag 영역(P1/P2)에 위치한 프라이머쌍을 사용하여 별도의 증폭 및 검출 단계를 수행하였다. gag계 프라이머쌍이 생성한 증폭 생성물을 검출하는데 사용된 프로브는 다음과 같다.
비오틴 프로브: 5'-TGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGA
ECL 프로브: 5'-GAATGGGATAGAGTGCATCCAGTG
결과는 하기 표 2에 제시되어 있다.
HIV-1 RNA카피/200 ㎕ 서열 번호 9/ 서열 번호 5 LTR GAG P1/P2
검출된 수 검출 % 검출된 수 검출 %
320 9:10 90% nt* nt*
160 5:10 50% 8:10 80%
80 5:10 50% 5:10 50%
40 3:8 38% 4:10 40%
20 3:10 32% 1:10 10%
10 1:10 10% 2:10 20%
0 0:5 0% 1:5 20%
*nt는 시험되지 않음
이 실시예의 LTR 프라이머쌍 및 gag 프라이머쌍은 핵산 분리 전에 첨가된 시험관내 생성된 RNA로 제어되는 분석에서 유사량의 HIV-1 RNA를 검출할 수 있다.
실시예 4: HIV-1 양성 시료에서 HIV-1 RNA의 검출
이 실시예에서, 각종 지리적 위치로부터 얻은 40 HIV-1 양성 시료를 HIV-1 RNA의 존재에 대해 분석하였다. 모든 시료는 실시예 1에 개시된 핵산 분리 방법으로 분리하였다. 프라이머쌍 서열 번호 9/서열 번호 5와 서열 번호 7을 가지는 프라이머 또는 서열 번호 8을 가지는 프라이머를 사용하여 실시예 1에 개시된 바와 같이 증폭 및 검출을 수행하였다.
비교를 위해서 실시예 3에 개시된 gag 프라이머쌍 및 프로브를 사용하여 별도의 증폭 및 검출 단계를 수행하였다. 실시예 1의 방법에 따라 ECL 프로브 하이브리드화로 증폭된 생성물의 존재를 검출하였다. 결과는 표 3에 제시되어 있다.
프라이머쌍 ECL 프로브 검출된 수 검출 %
서열 번호 9/서열 번호 5(LTR) 서열 번호 7 40/40 100%
서열 번호 9/서열 번호 5(LTR) 서열 번호 8 10/10 100%
P1/P2(gag) 29/40 72.5%
본 실시예에 개시된 HIV-1의 LTR 영역으로부터 유도된 2개의 프라이머 프로브를 조합하면 시험하고자 하는 모든 시료로부터 HIV-1을 검출할 수 있다. 대조적으로, gag 분석의 프라이머 프로브 조합으로는 다수의 시료로부터 HIV-1 게놈 RNA를 검출하지 못하였다.
실시예 5: 한정된 아형을 이용한 HIV-1 RNA의 증폭 및 검출
실시예에서, 공지된 외피계 아형의 HIV-1 RNA를 보유하는 33개 시료를 시험하였다. 시료는 세포 배양물에서 증식된 아형의 바이러스에서 유래한다. 변종 M군 아형 A 내지 H 및 변종 O군에서 유래한 세포 배양물 상청액 시료는 HIV-1 음성 인간 혈장에 넣고 실시예 1의 방법으로 처리하였다. 실시예 4에서와 거의 동일한 방법으로 증폭 및 검출하였다. 시험된 각 유형의 총수 중 HIV-1 RNA가 검출된 각 유형의 시료의 수로서 표 4에 제시되어 있다.
HIV-1 유형
프라이머쌍 A B C D E F G H O 총
서열 번호9/서열 번호 5(LTR) 5:5 2:2 2:2 5:5 7:7 1:1 1:1 1:1 9:9 33:33
4:5 2:2 2:2 5:5 6:7 1:1 1:1 1:1 0:9 22:33
HIV-1 RNA는 서열 번호 9/서열 번호 5와 서열 번호 7의 서열을 포함하는 프로브를 사용하여 모두 33개 HIV-1 시료로부터 검출하였다. 대조적으로, 실시예 3에 개시된 바와 같이 gag 프라이머 프로브 조합을 사용한 분석은 O군의 구성원으로부터 HIV-1 RNA를 함유하는 모든 시료와 시료 중 하나로부터 아형 A 및 아형 E를 검출하지 못하였다.
실시예 6 : HIV-1 임상 시료의 증폭 및 검출
본 실시예에서, 아프리카인, 남아메리카인 및 아시아인에게서 유래한 혈청양성 환자로부터 얻은 7개 시료를 HIV-1 게놈 DNA의 존재에 대해 분석하였다. 이들 환자에게서 얻은 혈액 시료가 항-p24 항체(미국 일리노이주 애보트 파크에 소재하는 애보트 래보러터리즈) 및 웨스턴 블롯(젠랩스) 양성이라는 사실에도 불구하고, 모든 견본은 실시예 3에서 얻은 gag 프라이머쌍 및 프로브 조합을 이용한 NASBA HIV-1 RNA QL 분석(오르가논 테크니카 비브이)에 의해 음성을 나타내었으며, 단지 하나의 시료(R9612222)만이 50 ㎕의 시료 부피를 사용한 Quantiplex HIV-1 RNA 2.0(키론) 분석으로 검출 및 정량(29.500 RNA 카피/㎖)하였다. 대조적으로, 동일한 시료 부피를 사용하여 프라이머쌍 서열 번호 9/서열 번호 5와 서열 번호 7의 서열을 가지는 프로브는 7개의 시료중 4개의 시료에서 검출되었다(표 5).
시료 코드 국가 서열 번호 9/서열 번호 5(LTR)
R9610155 대만 양성
R9612222 가나 양성
R9700062 브라질 음성
R9612218 자이레 음성
R9611710 리베리아 양성
R9610718 앤틸리스 양성
R9607884 르완다 음성
LTR 프라이머 프로브 조합이 생략된 시료는 검출되지 않았는데, 그 이유는 Quantiplex HIV-1 RNA 2.0(키론) 분석 정량된 HIV-1 RNA 레벨이 시료 50 ㎕ 당 30 이하의 HIV-1 RNA 카피가 시료 부피 1 ㎖을 사용한 이후 바이러스 적재가 검출 레벨이하로 낮기 때문이다.
＜서열 목록＞
(1) 일반정보:
(i) 출원인:
(A) 명칭 : 악조 노벨 엔.브이.
(B) 거리 : 벨페르베크 76
(C) 도시 : 아르네헴
(E) 국가 : 네덜란드
(F) 우편 번호 (ZIP): 6824 비엠
(ii) 발명의 명칭: HIV-1의 모든 아형의 증폭 및 검출시 프라이머 및 프로브로서 사용할 수 있는 핵산 서열
(iii) 서열의 수: 12
(iv) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC(호환 가능)
(C) 운영 체계: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 페이턴트인 릴리스 #1.0, 버젼 #1.25(EPO)
(2) 서열 번호 1에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 18 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 종류: cDNA
(xi) 서열 번호 1:
[서열 1]
GGGCGCCACT GCTAGAGA 18
(2) 서열 번호 2에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 종류: cDNA
(xi) 서열 번호 2:
[서열 2]
GTTCGGGCGC CACTGCTAGA 20
(2) 서열 번호 3에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 15 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 종류: cDNA
(xi) 서열 번호 3:
[서열 3]
CGGGCGCCAC TGCTA 15
(2) 서열 번호 4에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 종류: cDNA
(xi) 서열 번호 4:
[서열 4]
CTGCTTAAAG CCTCAATAAA 20
(2) 서열 번호 5에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 종류: cDNA
(xi) 서열 번호 5:
[서열 5]
CTCAATAAAG CTTGCCTTGA 20
(2) 서열 번호 6에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 종류: cDNA
(xi) 서열 번호 6:
[서열 6]
TCTGGTAACT AGAGATCCCT C 21
(2) 서열 번호 7에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 18 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 종류: cDNA
(xi) 서열 번호 7:
[서열 7]
TAGTGTGTGC CCGTCTGT 18
(2) 서열 번호 8에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 18 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 종류: cDNA
(xi) 서열 번호 8:
[서열 8]
AGTGTGTGCC CGTCTGTT 18
(2) 서열 번호 9에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 47 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 종류: cDNA
(xi) 서열 번호 9:
[서열 9]
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGAGG GGCGCCACTG CTAGAGA 47
(2) 서열 번호 10에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 49 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 종류: cDNA
(xi) 서열 번호 10:
[서열 10]
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGAGG TTCGGGCGCC ACTGCTAGA 49
(2) 서열 번호 11에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 40 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 종류: cDNA
(xi) 서열 번호 11:
[서열 11]
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGCGGGC GCCACTGCTA 40
(2) 서열 번호 12에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 종류: cDNA
(xi) 서열 번호 12:
[서열 12]
GATGCATGCT CAATAAAGCT TGCCTTGAGT 30

Claims (13)

  1. 서열 번호 1: G GGC GCC ACT GCT AGA GA
    서열 번호 2: G TTC GGG CGC CAC TGC TAG A
    서열 번호 3: CGGGCGCCACTGCTA
    서열 번호 4: CTG CTT AAA GCC TCA ATA AA
    서열 번호 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA
    서열 번호 12: GAT GCA TGC TCA ATA AAG CTT GCC TTG AGT
    서열 번호 6: TCT GGT AAC TAG AGA TCC CTC
    서열 번호 7: TAG TGT GTG CCC GTC TGT
    서열 번호 8: AGT GTG TGC CCG TCT GTT
    로 구성된 군에서 선택된 서열 또는 이의 상보 서열 중 10개 이상의 뉴클레오티드 단편을 포함하고 길이가 10∼50개 뉴클레오티드인, HIV 게놈의 핵산 서열의 LTR 영역 서열에 실질적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 실질적으로 하기 서열 번호 1 내지 서열 번호 12로 구성된 군에서 선택된 서열로 구성되는 것이 특징인 올리고뉴클레오티드:
    서열 번호 1: G GGC GCC ACT GCT AGA GA
    서열 번호 2: G TTC GGG CGC CAC TGC TAG A
    서열 번호 3: CGGGCGCCACTGCTA
    서열 번호 4: CTG CTT AAA GCC TCA ATA AA
    서열 번호 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA
    서열 번호 12: GAT GCA TGC TCA ATA AAG CTT GCC TTG AGT
    서열 번호 6: TCT GGT AAC TAG AGA TCC CTC
    서열 번호 7: TAG TGT GTG CCC GTC TGT
    서열 번호 8: AGT GTG TGC CCG TCT GTT
    서열 번호 9: aat tct aat acg act cac tat agg gAG AGG GGC GCC ACT GCT AGA GA
    서열 번호 10: aat tct aat acg act cac tat agg gAG AGG TTC GGG CGC CAC TGC TAG A
    서열 번호 11: aat tct aat acg act cac tat agg gCGGGCGCCACTGCTA
  3. 핵산 증폭 반응에서, 또는 시료중 HIV 핵산을 검출하기 위한 프로브로서의 제1항 또는 제2항에 기재된 올리고뉴클레오티드의 용도.
  4. 올리고뉴클레오티드 쌍이 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드로 구성되고, 이때 제1 올리고뉴클레오티드는 길이가 10∼50개 뉴클레오티드이고 하기 서열 번호 1 내지 3으로 구성된 군에서 선택된 서열 중 10개 이상의 뉴클레오티드 단편을 포함하며, 제2 올리고뉴클레오티드는 길이가 10∼50개 뉴클레오티드이며 하기 서열 번호 4, 5 및 12로 구성된 군에서 선택된 서열 중 10개 이상의 뉴클레오티드 단편을 포함하는 것이 특징인, HIV-1 게놈의 LTR 영역내에 배치된 표적 서열의 증폭시 한 세트로서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드쌍:
    서열 번호 1: G GGC GCC ACT GCT AGA GA
    서열 번호 2: G TTC GGG CGC CAC TGC TAG A
    서열 번호 3: CGGGCGCCACTGCTA
    서열 번호 4: CTG CTT AAA GCC TCA ATA AA
    서열 번호 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA
    서열 번호 12: GAT GCA TGC TCA ATA AAG CTT GCC TTG AGT
  5. 제3항에 있어서, 길이가 10∼50개 뉴클레오티드이고 하기 서열 번호 1의 서열 중 10개 이상의 뉴클레오티드 단편을 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드와, 길이가 10∼50개 뉴클레오티드이며 하기 서열 번호 5의 서열중 10개 이상의 뉴클레오티드 단편을 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드로 구성된 것이 특징인 올리고뉴클레오티드쌍:
    서열 번호 1: G GGC GCC ACT GCT AGA GA
    서열 번호 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 제1 올리고뉴클레오티드가 DNA 의존성 RNA 폴리머라제가 인식하는 프로모터 서열을 보유하는 것이 특징인 올리고뉴클레오티드쌍.
  7. 제6항에 있어서, 실질적으로 하기 서열 번호 9의 서열을 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드와, 실질적으로 하기 서열 번호 5의 서열을 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드로 구성된 것이 특징인 올리고뉴클레오티드쌍:
    서열 번호 9: aat tct aat acg act cac tat agg gAG AGG GGC GCC ACT GCT AGA GA
    서열 번호 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA
  8. 제1항에 있어서, 검출가능한 표지를 구비하며, 실질적으로 하기 서열 번호 6 내지 서열 번호 8의 서열로 구성되는 것이 특징인 올리고뉴클레오티드.
  9. 제4항에 기재된 올리고뉴클레오티드쌍과 적절한 증폭 시약을 이용하여 시료에 대해 핵산 증폭 반응을 수행하고 임의의 증폭된 핵산의 존재를 검출하는 것이 특징인 시료내 HIV-1 핵산의 검출 방법.
  10. 제9항에 있어서, 임의의 증폭된 핵산 검출이 적절한 하이브리드화 조건하에 올리고뉴클레오티드와 시료를 반응시키는 단계, 및 증폭된 서열과 프로브 사이에 형성된 임의의 하이브리드내 표지의 존재를 검출하는 단계로 수행되는 것이 특징인 시료내 HIV-1 핵산의 검출 방법.
  11. 제9항에 있어서, 사용된 증폭 기법이 전사계 증폭 기법이고 제1 올리고뉴클레오티드는 DNA 의존성 RNA 폴리머라제가 인식하는 프로모터 서열을 보유한 것이 특징인 시료내 HIV-1 핵산의 검출 방법.
  12. - 제1항 또는 제2항에 기재된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드,
    - 검출가능한 표지를 보유하고, 증폭된 핵산 서열의 적어도 일부에 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드,
    -적절한 증폭 시약을 포함하는 시료내 HIV-1을 검출하는 용도의 시험 키트.
  13. 적절한 증폭 시약 및 증폭된 핵산의 검출 수단과 함께 제4항에 기재된 올리고뉴클레오티드쌍을 포함하는 시료내 HIV-1을 검출하는 용도의 시험 키트.
KR1020007001327A 1997-08-08 1998-08-05 Ｈｉｖ-1의 모든 아형의 증폭 및 검출시 프라이머 및프로브로서 사용할 수 있는 핵산 서열 KR100615407B1 (ko)

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