JPH05504475A - 細胞試料において特定の核酸配列を検出する方法 - Google Patents
細胞試料において特定の核酸配列を検出する方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ゲノムDNAを有する水性の細胞試料に含まれている特定の核酸配列
を検出する方法に関するものである。
発明の背景
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を介しご二次的に増幅するために、細胞からD
NAを放出させる数種の方法が報告されている。通常、まず最初に、細胞の成分
を可溶化する洗浄剤及び別にDNAに結合して残っているタン)<り質を消化す
るタンパク質分解酵素で処理することにより、細胞から細胞DNAを精製する。
通常、この工程に続いて、有機溶媒でそのDNAを抽出する。最後1こ、抽出し
たDNAを核酸のエタノール沈澱析出のような工程で残留有機溶媒から分離する
。
最近、PCRは、95℃で水中において細胞を溶解してDNAを放出した組織培
養細胞で行われている(Saikiらの論文、Nature、 324: 16
3−166 (1986))。しかし、この方法は、はとんどの細胞DNAが不
溶性の形態で残るという理由から、十分ではない。また、PCRを用いて、アル
カリとともに加熱し、遠心分離して全血から得た上清に残ったDNAを増幅する
(Koganらの論文、N、 Engl、 J、 Med、、 317:785
−990 (1987))。この方法で困難なのは、PCR反応混合物に加える
ことができる上清液の量、つまり標的DNAの量が、上清液のインヒビターによ
り制限されることである。この問題は、DNA増幅を行う標的が、旧Vのような
感染因子(Ou etらの論文、5cience、239: 295−297
(198B>)又は宿主生物における転入遺伝子(transgene)のよう
な試料細胞の副次的な画分にのみ存在する場合、特1こ重要になる。
発明の要約
現在、ポリラーゼ連鎖反応によって特定の核酸配列の存在を直接分析することが
できる方法で、DNAを細胞から放出させられることが見出された。
本発明の実施態様において、本発明は、最初に、細胞外タンパク質を実質的に含
まない液体培地に細胞を分離することにより、リンフ N+球のような細胞から
ゲノムDNAを放出させることを企図するものである。次いで、この細胞を少な
くとも約105℃の温度に、少なくとも約5分間さらす。
続いて、放出されたゲノムDNAを、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応により、
特定の核酸配列の存在を調べるために分析することができる。
この方法は、二本鎖ゲノム核酸の鎖を分離する工程、分離された一本鎖を、2種
のプライマー、dNTPs及びポリメラーゼ酵素を含むブライマーエクステンシ
ョン反応混合物を用い、プライマーが特定の配列とハイブリッド化し、かつ各プ
ライマーのエクステンション生成物が、酵素によって合成されるような条件下で
処理する工程を含む。
このようにして形成したブライマーエクステンション生成物を、−木調に分離す
る。この−末鎖を、再び前記ブライマーエクステンション混合物を用い、プライ
マーハイブリッド形成及びエクステンションのための同じ条件下で、処理し、ブ
ライマーエクステンション生成物を形成する。増幅生成物の存在は、特定の核酸
配列の存在を示す。好ましい実施態様においては、PCR生成物の検出は、ハイ
ブリッド化条件下で、該生成物を、親和性ラベル化ポリヌクレオチド及びランタ
ン系列元素ラベル化ポリスクレオチドを用いて処理することにより行うことがで
きる。それぞれのラベル化ポリヌクレオチドは、PCR生成物の一本鎖DNAの
異なる部位とハイブリッド化して、親和性ラベル及びランタン系列元素との結合
を有するDNA二本鎖を形成することができる。
このように形成されたラベル化DNA二本鎖を、結合条件下で、DNA二本鎖の
親和性ラベルと結合できる固相親和性吸着剤で処理し、固相ランタン系列元素ラ
ベル化DNA二本鎖を形成する。形成された固相ランタン系列元素の量を測定す
る。
図面の簡単な説明
この記述部分は、図面の内容を構成するものである:図IAは、ポリヌクレオチ
ドプローブS9のラベル化に使用された修飾ンチジン残基を示している。
図IBは、ポリヌクレオチドS9をラベルするのに使用されたユウロピウムキレ
ート化合物(W2014)を示している。修飾シチジン1ナノモルを、0.5モ
ル炭酸塩緩衝液(pH9,8)300μIに溶かした。各アミノ基当たりキレー
ト化合物W2O14のイソチオノアナートをlO〜20当量この混合物に加え、
PHを約10に調整した。約16時間反応させた後、ラベル化S9プローブをカ
ラムクロマトグラフィーで単離した。
図2は、NH,−修飾デオキシシチジンホスホルアミジト(phosphora
midite)の合成に関するスキームを示している。
らなるDNA又はRNAの単一ユニットである。この塩基は、グリコシドの炭素
(ペントースの1′位)を介して糖部分と結合しており、この塩基と糖の化合物
がヌクレオシドである。このヌクレオシドがペントースの3′又は5′位に結合
しているリン酸基を含む場合、これをヌクレオチドという。
mJEN(bp) : 二本鎖DNA分子におけるアデニン(A)とチミン(T
)、又はシトシン(C)とグアニン(G)の共同関係をいう。
る。遺伝子は、RNA又はDNAの何れか一方である。
相補的塩基: DNA又はRNAが二本鎖構造を取る場合に、通常、対になる複
数のヌクレオチドである。
相補的ヌクレオチド配列: DNA又はRNAの一本鎖分子におけるヌクレオチ
ドの配列であって、他の一本鎖のヌクレオチドの配列と、必然的に生じる水素結
合によって特異的にハイブリッド化するのに十分な程、相補的であるものをいう
。
保存された: あるヌクレオチド配列が、前もって選んだ配列の正確な相補体に
対し、選択的にハイブリッド化する場合、ヌクレオチド配列は、前もって選んだ
(参考)配列に関して、保存されている。
ハイブリッド形成じ 相補的な塩基対の間に水素結合が形成されることにより、
実質的に相補的なヌクレオチド配列(核酸の鎮)が対合し、二本鎖又はヘテロ二
本鎖が形成されることをいう。その特異性、すなわち、2種の相補的ポリヌクレ
オチドの間の選択的な相互作用であって、拮抗的に阻害されるものである。
常のヌクレオチドさ置換できる程度に十分類似する、プリン又はビリミヂンをい
この実施態様において、本発明は、細胞から核酸、特にゲノムDNAを放出させ
る方法を提供する。一般に、この方法は下記の工程を組み合わせたものである二
l)ゲノムDNAを有する細胞のような標的細胞を、アルブミン、免疫グロブリ
ン、フィブリノーゲンなどの細胞外タンパク質から、水性培地に分離する工程=
l!)分離した細胞を、少なくとも約105℃の温度に、少なくとも約5分間、
さらす工程である。
そのように放出された核酸を、広い範囲の核酸ハイブリッド形成を要求する分子
生物学的な技術で使用することができる。例えば、ノーインプロット法、サウザ
ンプロット法、ブライマーエクステンション法(PCR)などの技術を使用する
方法を含む、核酸ハイブリッド形成を基礎とする診断法に用いるコントロール試
料又は標準を、本願明細書に記載した方法を用いて製造することができる。また
、細胞から核酸を放出させる本発明の方法は、核酸ハイブリッド形成による診断
法の試料を調製するのにも使用することができる。例えば、細胞から放出された
核酸で、病原体の特定の核酸の存在を分析することができる。
“病原体の特定の”核酸とは、ウィルス、細菌、真核性寄生体などのような病原
体のゲノムの一部を形成するヌクレオチド配列である。典型的なウィルスとして
挙げることができるのは、ヒトT細胞白血病ウィルス(HTLV)のタイプI、
タイプ■、又は旧V−1及び旧V−2のようなヒト免疫不全ウィルス(HIV)
、ポリオウィルス、アデノウィルス、バラインフルエンザウィルス、麻疹ウィ
ルス、流行性耳腺炎ウィルス、呼吸器合胞体(R3)ウィルス、インフルエンザ
ウィルス、ウマ脳を髄炎ウィルス、豚コレラウィルス、ニワトリニーキャッスル
病ウィルス、!I痘ウィルス、狂犬病ウィルス、ネコ及びイヌジステンパーウィ
ルス、ネコ白血病ウィルス、ヒトサイトメガロウィルス、C型肝炎ウィルスなど
がある。細菌性病原体リンゲンス(C,perfr+ngens)、B、アンド
ラン(B、 anthracis)、Y6.ペスチIs。
pestis) 、P、ムルトシダ(P、 murutocida)、V、]レ
ラ(V、 cholerae) 、N、メニンギチテ゛ス(N、 mening
itides) 、N、ゴノルヘア(Nogonorrhea)、H,インフル
エンザ(H。
(Pseudomonas)属などの免疫無防備状轢の患者に日和見感染を引き
起こすものがある。
一部の具体的な寄生体のゲノムのヌクレオチド配列を決定する方法は、当該技術
分野で周知である。実際に、多くの病原体のゲノムのヌクレオチド配列の有用な
部分が報告されている。群及び/又はタイプの特定のヌクレオチド配列を、当該
技術分野で周知なように、所望のアッセイ特異性の水準に応じて使用すること細
胞外タンパク質から細胞を分離する方法は、当該技術分野で周知であり、良く知
られているように、分離する細胞のタイプに対応している。“細胞外タンパク貢
“とは、血液中において細胞に含まれないで存在するタンパク質分子を意味する
。この細胞外タンパク質として挙げることができるのは、免疫グロブリン、アル
ブミン、フィブリノーゲン、トランスフェリン、リポタンパク質、α、−マクロ
グロブリン、ハプトグロブリンなどである。
通常、分離される細胞は、血液中に存在するもの、又はその特定の亜集団にある
ものである。この分離される細胞は、T細胞、B細胞、単核白血球/マクロファ
ージ系列の細胞などのリンパ球であることが好ましい。特に重要な循環する細胞
の亜集団は、細胞表面のCD4レセプターで定義される、すなわちCD4陽性細
胞である。
細胞と接触している水性培地が、約80mg/n 1未満、好ましくは約40m
g/s 1未満の細胞外タンパク質しか含まない場合、その細胞は“分離”され
たという。水溶液中のタンパク質濃度を測定する方法は、周知である(例えば、
lowryらの論文、J、 Biol、 Chew、 193二265−75
(1951)参照)。
好ましい実施態様において、分離された細胞は、実質的に赤血球細胞、及び/又
は細胞遊離のヘモグロビン(生理的な条件下でヘムから誘導されたポルフィリン
化合物を含む)を含まない細胞である。“実質的に含まない”とは、存在するヘ
マチンの量が、標準的なフェノール/エタノール抽出工程で精製されたDNAと
同じ試料でのPCR反応と比較して、PCR反応が約10%より高くは阻害され
ない、好ましくは約5%未満しか阻害されない量をいう。分離された細胞が、赤
血球細胞を実質的に含まず、及び/又は分離された細胞試料にあるすべて細胞が
溶解した場合に、得られる溶液のヘマチン濃度が、10マイクロモル、好ましく
は5マイクロモル、さらに好ましくは1.0マイクロモル、かつ最も好ましくは
0.8マイクロモル未満になる程度にしかヘモグロビンを含まない細胞であるこ
とが好ましい。
循環する白血球及びその亜集団を分離する、多く方法が知られている。好ましい
方法として、密度勾配遠心分離法、ゾーン遠心分離法及びアフィニティークロマ
トグラフィーがある。
遠心分離法により血液からリンパ球を分離するの有用な培地には、水性フィコー
ル(ficoll) (共重合スクロース及びエビクロロヒドリン)、又は水性
フィコール及びナトリウムトリジエート(sod iumtr 1zoate)
があり、このような培地は、前もって混合された形態で、さまざまな販売者(P
harmacia Fine Che+++1cals、 Piscatawa
y、 NJ、を含む。)から入手することができる。
別法として、リンパ球の特異的細胞表面リガンドを認識するレセプター、又はリ
ンパ球の特異的細胞表面レセプターによって認識されるリガンドを使用するアフ
ィニティークロマトグラフィーによって、リンパ球を血液から分離することがで
きる。例えば、リンパ球の亜集団によって発現されるCD4レセプターに対する
抗体分子を、固体マ)IJフックス結合させ、次いで全血又はそのリンパ球を含
む部分と混合することができる。このように形成した固相/液相結合反応混合物
を、固体マトリックス結合抗体分子が、試料中に存在するCD4陽性リンパ球と
結合し、固相複合体を形成するのに十分な、通常、予備的に決めた時間、維持す
る。通常、細胞を溶解させない水性緩衝液、好ましくは等張緩衝液で洗浄するこ
とにより、細胞外タンパク質を含む結合反応混合物の他の成分から、この固相複
合体を分離する。このようにして分離した細胞を、この細胞に結合している抗体
分子から分離し、又は分離せずに、本願明細書に記載したように加熱処理するこ
とができる。
CD4陽性リンパ球の分離に有用な抗体には、にung及びGoldstein
の米国特許第4.381.295号に開示されたものがある。
HIV感染リンパ球を、旧V gp160外膜前駆体タンパク質又は旧V感染リ
ンパ球の表面に発現したHIV gpL20外膜タンパク質と結合するレセプタ
ーとして、CD4を使用して分離することができる。前記のとおりに、CD4レ
セプターを使用して、旧V感染細胞を、固体マトリックスと結合させる。この固
体マトリックスは、続いて赤血球、溶解した赤血球から放出されたヘモグロビン
(細胞に拘束されていないヘモグロビン)及び細胞外タンパク質を含む試料の残
留部分から分離することができるものである。CD4レセプターを製造し、かつ
使用する方法は、国際特許出願No、 PCT/1ls88103592 (公
開No、 wo 891038143)に開示されている。
CD4陽性リンパ球は、固体マトリックスと結合したCD4によって、結合され
ることができるリガンドを使用する類似する方法で分離することができる。有用
なCD4結合リガンドには、HIV gp160外膜前駆体タンパク質及び旧V
gp120外膜タンパク質がある。
有用な固体マトリックスは、当該技術分野で周知である。このような材料として
挙げることができるものには、架橋デキストラン(商標: 5EPHADBX、
入手先:Phamacia Pine Chemicals、 Piscata
way、 N、J、 ) 、アガロース、直径約1ミクロン〜約5mmのポリス
チレンのビーズ(入手先: Abbott Laboratories of
North Chicago、IL) 、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋
ポリアクリルアミド、ニトロセルロース又はナイロンを基本とするウェブ(例え
ば、シート、小板又はかい状物)、オレ管(ore tubes)もしくは、ポ
リスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル又はポリカーボネートから作られ
たような、プレート又はマイクロリフドルプレートのウェルがある。
好ましいマトリックスは、常磁性又は磁性であって、好ましくはポリスチレン、
ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート又はポリプロピレンのような、プラスチック
又は樹脂で被覆されたく埋包された)粒子又はビーズ(例えば、鉄含有粒子)で
ある。ここで磁性とは、磁化され、あるいは磁化されることができ、又は磁場の
影響を受けやすいことをいう。典型的な磁性ビーズには、商標・DYNABE八
DS(Dへna 1社)のものがあり、これは抗体で被覆された超常磁性の直径
4.5ミクロンのポリスチレンビーズである。磁性粒子の磁性特性を利用して、
この粒子に結合した細胞を、細胞外タンパク質から分離する工程の間、保持する
ことができる。
2、細胞の加熱処理
分離した細胞を、少なくとも約105℃で、好ましくは少なくとも約110℃で
、さらに好ましくは少なくとも約115℃で加熱する。通常、この温度は125
℃未満とすることが必要である。
この細胞を、前記温度に、少なくとも約5分間、好ましくは少なくとも約10分
間、さらに好ましくは少なくとも約15分間さらす。通常、約25〜30分間よ
りも長くしないことが必要である。
この加熱は、大気圧を越える蒸気圧のもとで行い、通常この圧力を約10〜約2
0気圧、さらに好ましくは、通常約13〜約17気圧、通常約15気圧とするこ
とが好ましい。
通常、この加熱処理は、試料を殺菌するのに十分な時間、温度及び大気圧を越え
る圧力で、分離された細胞をオートクレーブ処理することにより達成する。好ま
しい実施態様において、この加熱処理は、加熱処理の間に変性して一本鎖になる
放出された核酸が、冷える間にプライマーとハイブリッド化するように、核酸プ
ライマーの存在下で行う。
3、増幅法・ポリヌクレオチドブライマーの調製プライマー、プローブ及び核酸
フラグメント、又はブライマーエクステンションにより合成されるセグメントと
関連して本願明細書で使用される用語“ポリヌクレオチドは、2以上の(好まし
くは3よりも多い)デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む分子
と定義する。その正確な大きさは、使用の最終的な条件に順次依存する、多くの
因子に依存している。
本願明細書で使用される用語“プライマー”とは、核酸制限消化物から精製する
か、又は合成して製造される、合成の開始点として作用することができるポリス
クレオチドをいう。この開始点としての作用は、核酸の鎖と相補的なブライマー
エクステンション生成物の合成を誘導する条件、すなわち、ヌクレオチド、及び
DNAポリメラーゼ、逆転写酵素などの重合因子が存在し、かつ適当な温度及び
pHである条件下に置かれた場合に生じる。このプライマーは、最大効率を得る
ためには一本鎖であることが好ましいが、一方、二本鎖であってもよい。二本鎖
である場合、最初にプライマーを処理して、エクステンション生成物の調製に使
用する前に、その鎖に分離する。このプライマーが、ポリデオキシリボヌクレオ
チドであることが好ましい。プライマーは、重合因子の存在下でエクステンショ
ン生成物の合成を開始させるために十分長くなければならない。プライマーの正
確な長さは、温度及びプライマーの供給源などの多くの因子に依存する。例えば
、標的配列の複雑さに応じて、さらに少ないヌクレオチドを含むこともできるが
、通常、ポリヌクレオチドブライマーは、15〜25又はそれ以上のヌクレオチ
ドを含む。短いプライマー分子は、一般に、より低温を必要とし、鋳型と十分に
安定なハイブリッド複合体を形成する。
本発明のプライマーは、合成又は増幅により検出されるそれぞれの特定配列の異
なる鎮と“実質的に”相補的であるように選択する。このことは、プライマーが
十分に相補的であって、そのそれぞれの鋳型(標的)鎮と選択的にハイブリッド
化するものでなければならないことを意味する。したがって、このプライマー配
列は正確な鋳型の配列を反映しなくともよい。例えば、相補的でないヌクレオチ
ドフラグメントを、その鎮と実質的に相補的であるプライマーの残部を有する、
そのプライマーの5゛末端と結合することができる。このような相補的でないフ
ラグメントは、通常、エンドヌクレアーゼ制附部位をコードする。他方、プライ
マー配列が、合成又は増幅される鎮の配列と十分な相補性を有し、これと選択的
にハイブリッド化し、それによりポリヌクレオチド合成条件下でエクステンショ
ン生成物を形成するならば、相補的でない塩基又は長い配列を、プライマーに散
在させることができる。
このポリスクレオチドブライマーを、例えば、ホスホトリエステル又はホスホジ
エステル法のような適当な方法を用いて調製することができる(Narangら
の論プライマーのヌクレオチド配列の選択は、使用する第2プライマーと関連す
る核酸上のそのハイプリント形成部位などの因子に依存する。数種のプライマー
配列を選択し、標的配列を最終的に検出する際に、本質的に等しく十分に機能す
ることが認められる場合であっても、殆どの適用において、この標的の保存され
た部位からこれらの配列を選択することが懸命である。さらに、このプライマー
配列を、その適当な機能を妨げるヘアピンループを取り得る構造、ならびにプラ
イマー−ブライマーハイブリッドを生じさせ、所望のブライマーエクステンショ
ン反応での効果的な使用を再び妨げる相補的配列について分析しなければならな
い。
しかし、一般に、検出すべき特定の標的配列が与えられた場合、当業者が多くの
プライマー対を設計できると期待することができ、そのうち幾つかのものは、ブ
ライマーエクステンション反応において本質的に等しい効率で機能するであろう
。したがって、本件出願で提供する配列は、本発明の範囲を制限するものではな
く、単にブライマーエクステンション反応を成功させるために、前記の好ましい
基準を満たすことが認められたプライマ一対の例と解釈しなけらばならない。
検出する配列が、二本鎖ゲノムDNAの形態である場合、最初に、通常、融解す
ることにより、−末鎖に変性させる。このDNAを、予備的に選択したヌクレオ
チド配列を有する第1ポリヌクレオチド合成プライマーで、このDNAを処理す
る(と接触させる)ことにより、第1ブライマーエクステンション反応を行う。
第1プライマーは、特定のヌクレオチド配列(好ましくは、その長さが少なくと
も約10ヌクレオチド、さらに好ましくは、その長さが少なくとも約20ヌクレ
オチド)に対してハイブリッド化することにより、第1プライマーエクステンン
ヨン反応を開始することができる。この反応は、第1プライマー(好ましくは前
もって決めた量)を、ゲノムDNAを有する試料の核酸(好ましくは前もって決
めた量)と混合し、第1ブライマーエクステンション反応混合物を形成すること
により達成する。この混合物を、ポリスクレオチド合成条件下に、第1ブライマ
ーエクステンション反応生成物を構成するのに十分な、通常、前もって定める時
間、維持する。次に、この生成物を、予備的に選択したヌクレオチド配列を有す
る第2ポリヌクレオチド合成プライマーで処理することにより、第2プライマー
エクステンンヨン反応を行う。第2プライマーは、第1生成物に見出されるヌク
レオチド配列(好ましくは、その長さが少なくとも約10ヌクレオチド、さらに
好ましくは、その長さが少なくとも約20ヌクレオチド)に対してハイブリッド
化することにより、第2反応を開始することができる。この反応は、第2プライ
マー(好ましくは前もって決めた量)を、第1生成物(好ましくは前もって決め
た量)と混合し、第2プライマーエクステンション反応混合物を形成することに
より達成する。この混合物を、ポリヌクレオチド合成条件下に、第2プライマー
エクステンション反応生成物を構成するのに十分な、通常、前もって定める時間
、維持する。
他の戦略では、その対象を、ゲノムdsDNAのアンチセンス鎮又はmRNAを
逆転写酵素反応することにより生成したポリヌクレオチドのような目的とする特
定の核酸配列のポリスクレオチド相補体(complement)を検出するこ
とに置く。このような相補体を生成する方法は、当該技術分野においては周知で
ある。この相場体に、前記第2ブライマーエクステンション反応を行う。
このブライマーエクステンション反応を、適当な方法を用いて実施する。一般に
、この反応は、好ましくはpH6〜9、さらに好ましくはpH6〜8.5、かつ
最も好ましくはpH約8の緩衝水溶液で行う。モル過剰のプライマー(ゲノム核
酸に関し、通常、プライマー二鋳型−約10’:1)を、鋳型鎮を含む緩衝液と
混合する。
大きなモル過剰は、工程の効率を改善するので好ましい。ポリヌクレオチドブラ
イマーが、長さ約20〜25ヌクレオチドである場合、通常の割合は、ゲノムD
NAの100 ng〜6μg当たり、各プライマーは50 ng〜1μg1好ま
しくは250μgの範囲である。
また、適量のデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTPs)、 dATP、
dCTP、 dGTP及びdTTPも、合成反応混合物に加え、得られた溶液
を約90℃〜1oo℃で、約1〜10分間、好ましくは1〜4分間、加熱する。
加熱時間経過後、溶液をブライマーハイブリッド形成に好ましい、室温に冷やす
。この冷やした混合物に、ブライマーエクステンション反応を誘導又は触媒的に
作用する適当な試薬を加え、この反応を当該技術分野で公知の条件で生じさせる
。この合成反応は、室温から誘導剤がもう十分に機能しなくなる温度までの範囲
で行う。したがって、例えば、DNAポリメラーゼを誘導剤として使用する場合
、一般に温度は約40を未満とする。
誘導剤(酵素を含む)は、ブライマーエクステンション生成物の合成を達成する
よう機能する化合物又はシステムであればよい。この目的に適する酵素として挙
げることができるものに、例えば、E、 coli DNAポリメラーゼL E
、 coliDNΔポリメラーゼ1のフレノウ(Klenow)フラグメント、
T4DNAポリメラーゼ、他の入手可能なりNAポリメラーゼ、逆転写酵素、及
び熱安定性酵素を含む他の酵素があり、これらの酵素は、適当な方法でヌクレオ
チドの結合を促進し、各核酸鎖き相補的なブライマーエクステンション生成物を
形成するものである。
一般に、この合成は各プライマーの3“末端で始まり、合成終了まで鋳型鎮に沿
って5′方向に進み、異なる長さの分子を生成する。しかし、合成を5°末端で
始め、3°方向に進める誘導剤で、前記と同じ方法を用いてもよい。
新j〜く合成された釦及びその相補的核酸鎖は、検出すべき特定の核酸配列の標
識として作用できるように、二本鎖を形成する。
好ましい戦略では、第1及び第2ブライマーエクステンション反応は、ポリメラ
ーゼ連鎖反応(PCR)における第1及び第2ブライマーエクステンション反応
である。
PCRを、同時的なサイクルで、すなわち、特定の混合物により、前記第1及び
第2プライマーエクステンション反応を実施することにより行う。各サイクルは
、ポリヌクレオチドの合成とそれに続く、形成された二本鎖ポリヌクレオチドの
変性を含むものである。特定の核酸配列を増幅する方法及びシステムは、Mul
lisらの米国特許第4.683.195号及び第4.683.202号ならび
にGe1fandらの米国特許’! 4.889.818号に開示されている。
二本鎖核酸配列分子を有する分離さね、加熱処理された細胞の試料に存在する特
定の核酸配列を検出する方法は、下記の工程を有するものである:(a)二本鎖
核酸分子の鎖を分離して、−末鎖の鋳型を形成する工程:(b)−重鎖鋳型を(
1)2種のポリヌクレオチドプライマー及び(■)酵素を含むブライマーエクス
テンション反応混合物で処理する工程であって、(1)2種のポリヌクレオチド
ブライマーは、■のプライマーから合成されたエクステンション生成物が、それ
を相補的核酸鎖から分離する場合に、他のプライマーのエクステンション生成物
の合成の鋳型として役立つことができるように、特定の配列の異なる釦とともに
ハイブリッド化するのに十分なほど相補的であるように選択されたものであり、
(ii)酵素は、前記−末鎖鋳型からブライマーエクステンション生成物を生成
できるものであり、かつ、
前記処理が、プライマーが特定の配列とハイブリッド化し、各プライマーのエク
ステンション生成物が酵素の作用により合成されるような条件下で行われ、前記
生成物が、各−末鎖鋳型と相補的である工程;(C)工程(b)で形成されたブ
ライマーエクステンション生成物を、それらが合成され一本鎖分子を生成する鋳
型から分離する工程:(d)工程(C)で生成された一本鎖分子を工程α))の
ブライマーエクステンション混合物と混合し、ハイブリッド化条件下に、ブライ
マーエクステンション生成物が、工程(C)で形成された一本鎖分子を鋳型とし
て使用して合成される程度の、前もって定めた時間、維持するような処理を行う
工程;(e)工程(d)で形成されたブライマーエクステンション生成物の存在
により、分離された細胞に特定の核酸配列が存在することを検出する工程である
。
増幅された核酸生成物の検出を、広範囲の周知の技術で行うことができる。好ま
しい実施態様において、増幅生成物は、ゲル電気泳動で分子量に基づき分離する
ことができ、次いで分離された生成物を、ゲルに存在する溶解された増幅生成物
の目立たない種を観察できるようにする核酸特異性染料を使用することにより、
視覚化する。ゲル電気泳動で分解した場合に特定の分子量を有する、特定の増幅
生成物の存在は、該ポリヌクレオチドがDNA二本鎖に存在し、PCR反応でプ
ライマーとして作用し、標的ヌクレオチド配列を含む目立たないヌクレオチド配
列を有する核酸の多くのコピーを生成したことを示している。多くの核酸特異性
染料が存在し、それらは電気泳動で分離された核酸を視覚化するのに適している
が、銀染料又は臭化エチジウム染料が好ましい。
増幅核酸を検出するのに適した他の方法には、周知の方法がある。放射性ラベル
を使用する方法が十分に確立されている(参照例: Hames B、 D及び
11gg1ns S。
J、(編集者) <1985>、Nucleic acid hybridiz
ation、 A Practical Approach@IRL
Press 0xford、 llasington DC,) o酵素をプロ
ーブと結合させる方法(参照例=Jablonskiらの論文、Nucleic
Ac+d Re5earch (1986) 14:6115−6128>又
は蛍光性ラベル(Agrawal らの論文、(1986> Nucle+c
Ac1d Re5each 14:6227−6245)又は時間−解像蛍光光
度計を利用する方法(参照例: 5yvaenenらの論文、1lucleic
Ac+d Re5earch(1986)、 14:5037−5048又は0
serらの論文、Nucla+c Ac1d Re5earch 16:118
1−1196)が、ハイブリッド形成を介して核酸を検出する周知の研究方法を
橋成し、これらの方法を増幅標的DNAを含む試料に選択的に適用することがで
きる。さらに、標的DNAとハイブリッド化したラベル化プローブ(Gen P
robe社、 Technical Bulletin (1989))におい
てアクリジニウムエステルの保護を含む化学ルミネセンス分析は、ラベル化核酸
を使用して特に相補的核酸を検出する他の手段を構成する。これら各種の方法は
、十分な標的核酸が与えられれば、標的核酸の存在を、プローブDNA、すなわ
ちポリヌクレオチドプローブ又はプローブと結合した、広い範囲のいずれかの有
効なラベルによって示すことができるということが当該技術分野において確立さ
れている。
DNAに存在するラベル化ヌクレオチド残基は、DNAそれ自体をラベル化し、
したがって、分析する試料に存在する他の核酸から差別化可能にする。DNAに
ふけるラベルの存在の検出及びそれによる特定のDNA配列の検出工程は、PC
R生底物又はPCR生戊生金物む二本鎖の一部として存在しないラベル化dNT
PからDNAを分離する工程を含む。
好ましい実施態様において、親和性に基づく収集分析法(ABCassay m
ethod)を使用して、ポリヌクレオチドPCR生成物を検出する(参照例:
5yvaenenらの論文、(1986) Nucleic Ac1d Re
5earch、 14:5037−5048) oこの方法において、一対のプ
ローブを、標的核酸配列を含むDNA鎮又はPCR生成物に存在するその相補体
とハイブリッド化させる。プローブの1つを、形成されたハイブリッドを固相上
で分離させることができる親和性ラベルと結合させる。一対のプローブの第2
(シグナル)プローブを、ブライマーエクステンション生成物を検出可能にする
ラベル(本願明細書で時折、シグナル発生手段のリポータ−基という。)と結合
させる。通常、このようなラベルには、放射活性原子、化学的に修飾されたヌク
レオチド塩基、ユウロピウムのようなランタン系列元素などがある。
親和性ラベルは、他の分子全体、すなわち抗体のようなレセプター又は抗原のよ
うなリガンドと特異的に(選択的に)結合することができる分子全体をいう。
通常、使用される親和性ラベルにはビオチンがあり、例えば、DNAに対するそ
の結合方法が知られている(Sheldonらの論文、(1986) Proc
、 Nat、 Acad、 5ci−μsA工83: 9085−9089)。
ビオチンは、ストレプトアビジン又はアビジンに強く結合するが、また、抗ビオ
チン抗体も相補的結合剤として利用してもよい。他の親和性ラベルには、その抗
体が簡単に作られ、かつ親和性ラベル対における第2成分として使用することが
できるジニトロフェノールがある。他の小さな分子、例えば、ジゴキシン(また
、抗ジゴキシン抗体を第2成分として使用してもよい。)もこのようなシステム
において、同様に適している。したがって、このようなシステムは、本発明の出
願に従ったDNAを分離し、標的核酸を放出させる手段を提供する。
このABC分析法において、親和性ラベル化オリゴヌクレオチドは、試験対象と
なる特定の核酸とハイブリッド化し、親和性ラベルを含む複合体(DNA二本鎖
)を形成する。次にこのように形成した親和性ラベル化DNA二本鎖を、親和性
ラベルと特異的に結合する試薬を含む親和性吸着剤と結合させる。この試薬は、
固体(水に不溶性)の支持体と機能的に結合する。有用な固体マ) IJフック
ス、当該技術分野で周知のものである。このような材料には、架橋デキストラン
(商標: 5EPIIADEX、入手先: PhaIlacia Fine C
hemicals、 Piscataway、 NJ、 ) 、アKロ
ース、直径約1ミクロン〜約511Iff+のポリスチレンのビーズ(入手先:
AbbottLaboratories of North Chicago
、 IL)、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロ
セルロース又はナイロンを基本とするウェブ(例えば、シート、小板又はかい状
物)、もしくは、ポリスチレン又はポリ塩化ビニルから作られた、チューブ、プ
レート又はマイクロリットルプレートのウェルがある。
シグナルプローブを、検出する特定の核酸配列を含むDNAmとハイブリッド化
させることにより、このDNA二本鎖が検出可能になる。親和性ラベル化プロー
ブとシグナルプローブの双方を、検出する特定の核酸配列を含むDNAとハイブ
リッド化した場合、シグナルプローブ及び親和性ラベルを含むDNA二本鎖が形
成される。
用語“ハイブリッド化条件”及びそれと文法的に等しい用語は、維持する時間と
ともに使用する場合、この混合物の反応物の濃度及び含まれている反応物と関連
してハイブリッド形成反応混合物を、そのポリヌクレオチドが標的(特定の)核
酸配列とアニールし、一本mDNAを形成するのに十分な時間及び温度条件に置
くことを示している。ハイブリッド形成を達成するのに必要とされるこのような
時間及び温度条件は、当該技術分野で周知であるように、ハイブリッド化するポ
リヌクレオチドセグメントの長さ、目的とするハイブリッド形成の緊縮性(st
ringency)及びハイブリッド形成反応混合物においてハイブリッド形成
の速度に影響を与えるであろう塩又は付加的な反応物の存在に依存している。所
定のハイブリッド形成反応混合物でハイブリッド形成条件を最適化する方法が、
当該技術分野で周知である。
通常のハイブリッド化条件には、5〜9のpH値に緩衝化した溶液を使用するこ
と、及び18〜70℃の温度で、0.5分間〜24時間行うことが含まれている
。
ハイブリッド形成を、周知のように均−又は不均一な構成で行うことができる。
均一なハイブリッド形成反応は、溶液において全体的に生じる。そこではポリヌ
クレオチドプローブ及びハイブリッド化される核酸配列(標的)の双方ともが、
溶液中に可溶性の形態で存在する。不均一な反応には、反応培地に不溶性で、プ
ローブ又は標的核酸の何れかと結合しているマトリックスを使用する。
親和性及びシグナルラベルを含むDNA二本鎖を、吸着剤を混合し、この結合反
応混合物を、親和性ラベルが、その親和性吸着剤と結合するのに十分な時間、結
合条件下に維持することにより、親和性吸着剤と結合させる。次いで、結合した
DNA二本鎖を、通常、洗浄することにより結合していない物質と分離する。
“結合条件”とは、pi(値、塩濃度、温度、及び親和性ラベルと親和性吸着剤
の特異的結合因子との特異的(選択的)結合を促進する結合反応混合物のような
パラメーターの組合せをいう。このような条件は、当該技術分野で周知である、
親和性ラベルと親和性吸着剤の特別な組合せに依存する。通常、結合条件は約1
分間〜14時間、好ましくは約5分間〜約90分間の前もって定めた時間内で、
検出できる結合を促進するように選ぶ。
好ましい実施態様において、第1及び篤2ポリヌクレオチド合成プライマーは、
レトロウィルス長終末反復ゲノム部位の一部と相補的であり、これが一対のプラ
イマーを用いることにより、多くのDNAセグメントの増幅を可能にする。
他の好ましい実施態様において、2対のプローブ(1対がそれぞれPCR増幅工
程で生成したDNAの個々の鎖に関するものである)を利用し、これにより所定
のPCR増幅生成物から得られるシグナルを2倍にする。
ともかく、親和性ラベル化オリゴヌクレオチドプローブ及びシグナルラベル化オ
リゴヌクレオチドプローブは、検出するDNA鎖の十分に異なる部位と相補的な
核酸配列を有する。これらのプローブは、双方とも前記鋼とハイブリッド化して
双方のラベルを有するラベル化されたDNA二本鎖を形成する。このブローブー
ハイブリッド形成部位は、隣接する、近接する又は部分的に重複するヌクレオチ
ド塩基により規定することができる。このプローブは、約1〜約20ヌクレオチ
ド塩基離された部位とハイブリッド化するのが好ましい。
dNTPの一部と機能的に結合するか、又は存在する放射活性元素は、DNAブ
ライマーエクステンション生成物の検出を促進する有用なラベル化手段を提供す
る。
通常の放射活性元素は、β線放射を生じるものである。3H,C”、p32及び
353のようなβ線を放射する元素は、β線放射−放射活性元素ラベルに存在す
る。
しかし、また、ヨウ素のアイソトープ125又は131のようなT線放射体も、
ラベル化オリゴヌクレオチドに使用してもよい。
放射能活性ラベル化dNTPsに替わるものは、化学的に修飾さね、金属錯化剤
、ビオチン含有基、蛍光性化合物などを含むdNTPsである。
有用な金属錯化剤は、ランタン系列元素及び芳香族β−ジケトンにより形成され
るランタン系列元素キレート化合物である。ランタン系列元素は、EDTA−類
似化合物のようなキレート形成化合物を介して、核酸又はポリヌクレオチドと結
合し、蛍光性ランタン系列元素複合体を形成する(米国特許第4.374.12
0号及び第4、569.790号、ならびに公開された国際特許出願No、 E
PO139675及びNo、 WO8?102708を参照のこと)。好ましい
ランタン系列元素は、ユウロピウムである。
ビオチン又はアクリジンエステル−ラベル化オリゴヌクレオチド及びポリヌクレ
オチドにおけるそれらの使用が開示されている(米国特許第4.707.404
号、公開された国際特許出願No、 EP0212951及びヨーロッパ特許第
0087636号を参照)。
有用な蛍光性標識化合物には、フルオレセイン(fluorescein) 、
ロダミン(rhodamine) 、タフサスレッド(Texas Red)な
どがある。
特定の核酸配列の存在を検出する他の研究方法では、ブライマーエクステンショ
ン反応で使用されるデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTPs )は、前
記のようなシグナルラベルを含む。
したがって、本発明は、血液試料に含まれている特定の核酸配列を検出する方法
を企図するものであって、この方法は下記の工程を有する:(a)水性培地に、
血液試料から抹消血単核(PBM)細胞を分離し、それにより80mg/悶1未
満の濃度で細胞外タンパク質を含む混合物を形成する工程:(b)前記混合物を
、約り05℃〜約125℃の温度で、少なくとも約10分間加熱し、これにより
、加熱処理試料を形成する工程:(C)加熱処理試料の一部に、特定の核酸配列
の相補体の合成開始を可能にする第1ポリヌクレオチド合成プライマー、及び該
特定の核酸配列の合成開始を可能にする第2ポリヌクレオチド合成プライマーを
使用するポリメラーゼ連鎖反応を少なくとも1回行う工程;
(d)ハイブリッド化条件下で、ポリメラーゼ連鎖反応生成物を、親和性ラベル
化ポリヌクレオ壬ド及びランタン系列元素ラベル化ポリヌクレオチドで処理する
工程:ここで前記の各ポリヌクl/オチドは、ポリメラーゼ連鎖反応生成物の一
本鎖DNAの異なる部位とハイブリッド化して、親和性ラベル及びランタン系列
元素ラベルさの結合を有するDNA二本鎖を形成することができる:(e)前記
DNA二本鎖を、結合条件下で、DNA二本鎖の親和性ラベルと結合できる同和
親和性吸着剤で処理し、次いで、固相ランタン系列元素ラベル化DNA二本鎖を
形成する工程:及び
(f)形成された固相ランタン系列元素ラベル化DNA二本鎖の量を測定する工
程である。
好ましい実施態様では、親和性ラベルはビオチンであり、同和親和性吸着剤は、
水に不溶性の固体マトリックスと結合したストレプトアビジン又はアビジンであ
り、かつランタン系列元素ラベルはユウロピウムである。
C0組換えDNA及び形質転換細胞
さらに本発明は、旧Vウィルスゲノム又はプロウィルスゲノムと機能的に結合し
たトランスファー(シャトル)ベクターを含む組換えDNA bDNA)を企図
するものである。該111Vゲノムは、複製機能不全、すなわち、転写及び翻訳
を介してそれ自身が増殖できないものである。この旧Vゲノムは、コア抗原開始
コドン(gag一部位遺伝子)、ゲノムからmRNAを発生させるウィルススプ
ライスドナーシグナル、及びC1a Iエンドヌクレアーゼ制限部位を1以上含
まないような遺伝子欠損変異を含んでいる。それぞれのこれらの特性は、プラス
ミドpHXB2cGの旧Vゲノムにおいて、ヌクレオチド位置847から112
〜115塩基上流に規定される部位に対応するウィルスゲノムに位置するヌクレ
オチド配列によって規定されている(Muesingらの論文、Nature、
313:450−458<1985)及びBuyaderらの論文、勤y稈と
326 :662−669 (1987)を参照)。
また、前記rDNAで形質転換された細胞をも企図する。この細胞が、そのゲノ
ムの中に統合された単−rDNAを約3未満、好ましくは約2未満、さらに好ま
しくは1個含むのが好ましい。
困旌例
下記の実施例は、本発明の範囲を詳細に説明することを意図するものであって、
その制限を意図するものではない。
1、 HIV−陽性コントロール細胞の調製細胞株CO5−10−11,1は、
ウィルス複製機能を不全にする変異を含むHIV−1ゲノムの単一の完全なコピ
ーを含んでいる。この株は、HIV感染細胞のモデルとして役立ち、かつこれら
の研究で使用された旧V DNAの供給源である。
変異HIV−I DNAヲ、)IIV−1<7)HTLV−111B 0)pH
XB2CG ’:fラスミ)’カラ発生すfた。このプラスミドは、ウィルスコ
ア抗原の開始コドンから41塩基対下流に、メチル化感受性制限エンドヌクレア
ーゼC1a lのための独特な切断部位を含む。遺伝子銀行データライブラリー
は、遺伝子コンピュータ群の配列分析ソフトウェアを増補する(バージョン6.
0.1989年2月、受入れ番号KO3455,ライスコンシン大学、ランタン
、ライスコンシン)。標準的な技術を用いて、ダムE、coliを形質転換し、
形質転換株を増幅し、かつそこからプラスミドDNAを分離することにより、非
メチル化pHXB2cGを生成した。分離されたpHXB2cG 1.2μgを
、C1aIを用いて切断し、次いでこのCla 1部位を取り囲む配列を、pH
8の緩衝液50マイクロリツトル(NaCI 600 mM、 MgCIz 1
2 mM、 EDTA 1 mM、 Tris 10 mM、温度30℃)に溶
かしたエンドヌクレアーゼBa131 (New England Biola
bs) 1単位を用いて除去した(Maniatasらの論文を参照: Mo1
ecular Cloning+ A Laboratory Manual、
[:old Spring Harbor Laboratory、 Co1
d Spring Harbor N、 Y、)@o 1分、2
分、5分、10分、及び30分の時点で、反応の20%を除き、かつフェノール
及びクロロホルムの混合物を用いて抽出することにより、消化を止めた。エタノ
ールにおける沈澱により濃縮した後、T4DNAIJガーゼを使用して、消化さ
れたプラスミドDNA5をつなぎ、閉じた環状分子を生成する。リガーゼを不活
性化した後、欠失されたヌクレオチドを持たない分子を切断するために、つない
だ分子を細菌の個々のコロニーを生育させ、変異プラスミドを分離した。プラス
ミド10は小さな欠損を有し、かつ精製され、さらにDNA配列決定法で特徴を
調べたp)IXB2CGにおいて、ヌクレオチド配列位置847から少なくとも
112塩基対で、かつ115塩基未満で、上流部分を削除することにより、C1
a I制限部位、コア抗原開始コドン及び旧νゲノムからウィルスmRNAを発
生させるスプライスドナーシグナルを除去した。
変異株IOプラスミドDNAIμgを、薬剤6418に対する耐性標識を運ぶp
SV2ネオプラスミド10 ngと七もに、CO5−7細胞1000.000個
(ATCCCRL 1651)に導入し、G418400μg/m Iとして数
週間選択した後、耐性コロニーの細胞を分離した。
いくつかのコロニーは非常に多く生育し、細胞DNAを得た。サウザンプロット
分析法を行った結果、COSクローン10〜11が、旧V gag部位の完全な
コピーを含んでいた。3SSメチオニンを用いたこの細胞株のタンパク質の代謝
的ラベル化、及びAIDSTw3.者の血清を用いた免疫沈澱法(immuno
precipitation)を行った結果、HIv抗原は検出可能な水準では
発現されていなかった。この株を再度クローン化し5、クローン(:OS 10
−11.1を特徴付け、サウザン分析法でハブロイドゲノムにつきHIV標的配
列の単一コピーが含まれていることを検出した。
2、プロウィルス旧V−I DNAを標的きするプライマーの合成下記の配列を
有する2種のプライマー81及びS、を調製した:S、: 5’ GGAACC
CACTGCTTAAGCC3’S2 : 5° GG丁CTGAGGGAT[
:TCTAG 3′各プライマーを、器具製造者のマニュアルにある標準的なプ
ロトコールに記載されているホスホルアミシト化学を用いて、遺伝子アセンブラ
−(Pharmacia LKBBiotechnology)上で合成した。
合成されたそれぞれのオリゴヌクレオチドの分離を、下記の分離用ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を介して行った。すべてのオリゴヌクレオチドを、1.3μ
Mの規模で合成した。
下記のとおりに脱保護を行った。プログラム終了後、支持体をカセット幅の末端
を有するエツペンドルフ管(Eppendorf tube)に入れた。このカ
セットを、エッペンドルフ遠心器において、少なくとも4.000rpn+で簡
単に遠心分離した。濃水酸化アンモニウム溶液1 mlを加え、この管を煮沸台
に置き、55℃に24時間保った。このカセットから水酸化アンモニウム溶液を
除き、新しい管に移し、再度、遠心分離し、全ての水酸化アンモニウム溶液を回
収した。水を加えて、容量を2゜5mlに調整した。次いで、溶出緩衝液として
H2Oを使用し、PD−10カラム(Pharmacia LKB Biote
chnology)上で、脱保護されたオリゴヌクレオチドを操作して、水酸化
アンモニウム溶液を8.0と交換した。このオリゴヌクレオチドを、高速真空装
置(Speed−Vac(Savant))において、蒸発させ乾燥物とした。
オリゴヌクレオチドの精製を、本質的1ごMo1ecular Cloning
−A LaboratoryManual (1982) ” (Ed、 M
aniatis、 T、 Co1d Spring Harbor Labor
atori■刀A Co1d
Sρring )larbor)の詳細に基づき行った。
10%尿素−ポリアクリルアミドゲル(尿素30%、ポリアクリルアミド10%
)を調製し、I XTBEを電気泳動緩衝液とし、340vで30分間前操作を
行った。オリゴヌクレオチドをH,060μIに懸濁し、染料混合物(ホルムア
ミド95%、EDTAlo mM、ブロムフェノールブルー 0.01%、キシ
レノールブルー0.01%)と混合した。過剰量の尿素をI XTBEで置き換
えて除去した。試料をゲルの上部(ゲルの全長を越える。)に加え、このゲルを
、下部の染料バンドがゲルの下部の縁に移動するまで、340vで作用させた(
1.5時間)。このゲルを外して、UV−投影用TLC−シートに置き、対象と
するバンドが位置する長い波長のIIV−ランプを使用した。このバンドを剃刀
の刃を使って注意深く除いた。続いて、このオリゴヌクレオチドを、エピゲルロ
ーシステム(エビ遺伝子)においてI XTBBを使用して、ゲルからDEAE
セルロースに溶出させた。I XTBE !ll液液おいて100vをがけて、
少なくとも2時間後、オリゴヌクレオチドを、このDEAEセルロース沈澱から
溶出させ、Mg[:Ia 10 mMを加えて、良好な回収を確保した。オリゴ
ヌクレオチドをEDTA 100 フィクロモルを加えた20 mM HEPE
S (pH7,5) 1 mlに再慧濁し、溶出液古して同じ緩衝液を用い、2
個の分離NAP−5カラムで処理した。オリゴヌクレオチドの濃度を、ブランク
としてHEPES−EDTA緩衝液を使用し、かつ10. D。
がオリゴヌクレオチド33μg/1mlに対応すると計算して、Uシー分光光度
計において26On+nで測定することにより、測った。
表1に、本発明を説明するために用いた、病原体誘導核酸の検出用プライマー及
びプローブとして使用したオリゴヌクレオチドを示す。
表ル
トロウィルス検出分析法に使用するプライマー及びプローブとまた=二四t
Pi 5’−CAACAATTAGCAGCCGTCCTC5+P2 5’−A
GTにCCTGG入GGGTTAGCTG コ’P3 5’−OJ’H,−CI
ACTTTTAGCCAGCCCCλCCAATGAGGAAT b i o
−プa−ブP4 5’−(IH2−C)4゜GAGGAAAATGT’rTCC
CACATCGACCATT℃ Eu−プo−ブ■y5L四k
P5 5’−TGCAGCT(、GCCCATATCCTGC5+P6 5’−
TAGGGAAGCCA’l’rGTGGCCTCコ1P7 5’−CTAGC
AAGCCCCTCCCATGAGGACC(IH2−C)Cbio−プo−ブ
P8 5’−()fH2−C)、。GGCAAGCTrTCCCCCAATにC
ACTATTCEu−プo−ブKIV−2LT1’l’
P9 5 ’ −CCACGCTTGCTTGCTrAAAにACCTC5+P
IO5’−人TTTTCCTにCCTCGGffl’CCC入λAG 31Pi
) 5’−CTTAAGACAGCAGTACAAATG 5’P14 5 ’
−TにTCCCTGTAATAAACCCG 3 ’Sl 5’−GGAAC
CCACTGCTT〜−CC5’S2 5’−GGTCTG入GGGATCTC
TAG 31511 5’−CACACTAC’I’rGAAGCACTC入入
GGC入入GC(IH2−C)Cb’i o−プローブS9 5’−(IH2−
C)、、ACC八(JGTC入C八C入へC入にACGGにCA Eu−プロー
ブ省略記号 5°、5゛−ブライ7−13°、3゛−プライマー; bio−プ
ローブ、ビオチン化プローブ;Ell−プローブ、ユウロピウム−プローブ塩基
124−291)
4− HIV−I POL (Ratnerらの論文、、 AIDS Res、
、 3:57−69 (1987)塩基4742−4917)
塩基506−605)
3、ユウロピウムでラベル化したポリヌクレオチドポリヌクレオチドS9を、ユ
ウロピウムでラベル化した。このラベル化を、最初に、アミノ修飾デオキシシチ
ジンホスホルアミシト(図IA)を合成し、この修飾デオキシシチジンを含むポ
リヌクレオチドを合成し、さらに、ユウロピウムを得られたポリヌクレオチドに
カップリングすることにより行った。
a、アミノ修飾デオキシシチジンホスホルアミシトの合成このIH2−修飾デオ
キシシチジンホスホルアミシトの合成に関する全体的なスキームを図2に概念的
に示した。ピリジン、テトラヒドロフラン及びアセトニトリルを、水素化カルシ
ウム上で7時間、還流することにより乾燥し、その後、蒸留した。トリエチルア
ミン及びジイソプロピルエチルアミンを固体の水酸化カリウム上で還流し、蒸留
した。
テトラブチルアンモニウムフルオリド(TBAFX3 )+20 )を、乾燥ア
セトニトリルと共蒸発させ、最終濃度を0.5Mとした。
テトライソブロピルジシロシルジコリデート(dichoridate) (T
IPDSiCIz)を、Markiewiczの論文(J、 Chem、 Pe
s、、 241:173−18H1979)の記載に従って合成し、かつ(2−
シアノエトキン)−N、N−ジイソプロピルアミノ−クロロホスピンをC1au
senらの論文(Recl、 Trar、 Ctum、 Pay−Has、 1
04:119−122(1985))の記載に従って合成した。商業的に入手可
能な試薬は、すべてAldrich Chemica1社(Milwaukee
、 Wl)又はSig+na社(SL Louis、 MO)から購入した。
薄層クロマトグラフィー(T1.C)を、予め被覆したンリカゲルプレート(M
erck。
60 P254)上で、下記溶媒系を使用して行った:A、 MeOH/CHC
]3(10:90 V/V); B。
MeO)1/CHCl −(20:80ν/V);C,n−ブaハ/−ル/Nt
137t&H20(65:15:5 V/V)又ハD。
n−ヘキサン/酢酸エチル/トリエチルアミン(60:30:10 V/V)。
短カラムクロマトグラフィー分離をシリカゲル(40〜63μm、 Merck
G 60)を用いて行った。
NMRスペクトルを、内標準としてTMSを、又は外標準として85%リン酸を
用い、ジェオ口(Jeol) JNM 6x400分光計により記録した。
表題の化合物を、乾燥ピリジン(200owl)に溶かしたデオキシシチジンヒ
ドロクロリド(1)(5,27g、 20 mmol)及びTIPDSiCIz
(8,2g+ 26 mmol)から出発して、合成した。室温(RT)で−晩
攪拌した後、反応を前記溶媒系を用いてTLCにより、調mmol)及び乾燥ジ
イソプロピルエチルアミン(5,5a+1.32 mmol)を加えた。この反
応混合物を室温で一晩攪拌し、赤い反応混合物(3)を、飽和NaHCOs溶液
に注ぎかつCHCl5 (3x200 ml)で抽出することにより処理した。
有機相を蒸発させ、トルエンと共蒸発させた。次いで、この残渣を、短シリカゲ
ルカラムクロマトグラフィー(移動相において、エタノール2%を含むCHCl
、)で精製した。
収率: 10.25 g (82%)、溶媒系AにおけるR、 −0,60:
’HNMR; (CDCl2): 7.84<d、 2H,J=8.3 Hz)
; 7.81 (d、 IH,J=7.8Hz) H,: 7.30 (d、
2H,J=8.3Hz)G 5,98
(d、 1)1. J=7.8Hz) H6; 5.90 (t、 IH) H
,’ ; 4−50〜3.70(鶴4H) II、’ +HC’ +Hs’
; 2.60〜2.20 (a2H) Hz’ ; 2.42 (s、 3H)
トシル、1.20〜0.90 (m、 28H)。
International Round Table Nucleoside
s、 Nucleotides and the Biol盾■奄モ≠■
Applications、” Konstanz (F、R,G、)、 32
頁(1986)からのアブストラクト) (7,0g。
14、9 [101)、及び1.6−ジアミツヘキサン(17,3g、 149
aiol)を、乾燥ピリジン(200ml)に溶かした。この反応混合物を6
0℃で、18時間攪拌した。TLCを行っCHCl、との間に分配することによ
り処理した。合わせた有機相を蒸発させ、トルエンと共蒸発させ、シリカゲルで
フラッシュクロマトグラフィーを行って精製し、エタノール15%を含αHC1
,で最初に溶出し、次いでエタノール35%、トリエチルアミン3%を含αHC
l5で溶出した。
収率:6.27 g (74%)−オイル、溶媒系CにおけるR、=0.53:
IHNMR(CDCIs): 7.75 (d、 IH) Hs: e、 t
o (t、 IH) H,’ ; 5.58 (d、 IH) Hs: 4.3
8 (qA IH) Hz ’
; 4.15〜3.70 (m、 3H) H,’ + H,’ ; 3.43
(m、 2H); 2.70 (a 2H); 2.55`2.25
(a 2H) Ht ’ ; 1.65〜1.20 (a 8H); 1.20
〜0.90 (a 28H)。
した。
化合物(4)(6,0g、 10.5 ml)を、乾燥ピリジン(50ml)の
溶かし、乾燥ミリジンとともに共蒸発させ、トリフルオロ酢酸無水物(3,3g
、 15.75 onol)を加えた。
この混合物を室温で30分間攪拌し、標準的な重炭酸塩−クロロホルム抽出法に
より処理した。有機相を蒸発させ、トルエンと共蒸発させ、この残渣を、乾慢テ
トラヒドロフラン(200ml)に溶かした。
この溶液に、アセトニトリル(50ml、 25 mmol)に溶かしたTRA
P 0.5 Mを加え、この混合物を室温で5分間攪拌しまた。この間に、溶媒
系AでTLCを使用して調べた結果、(5)から(6)への完全な転換が起こっ
ていた。
この反応混合物を、再び蒸発させて乾燥物とし、ピリジン(2X 100 ml
)とともに2回、共蒸発させ、乾燥ピリジン(100ml)に溶かした。塩化ジ
メトキシトリチル(4,75g、 14 mmol)を加え、この混合物を室温
で、6時間攪拌した。
標準的に処理した後、有機相を蒸発させ、トルエンとともに共蒸発させ、シリカ
ゲルカラムクロマトグラフィー(移動相としてエタノール3%を含むCHCl、
)で分離した。
収率: 5.11 g (67%)オイル、溶媒系へにおけるRf=0.51
、’HNMR(CDCLs):8.05 (d、 LH) NHCOF−; 7
.70 (d、 2H,Jニア、5 Hz> Is; 6.14 (t、 LH
) H1’@; 5゜
7o (d、 LH,J=7.5 Hz) H@: 4.66 (Q、 l1l
) L ’ ; 3.95〜3.75 (a+、 2H) g4’ 、 Hs
’
;3.37 (t、 2H); 3.29 (t、 2N); 2,50〜2.
23 (m、 28) Hz’ ; 1.62〜1.30 i+s。
8H);1.15〜0.9 (m、 28H)。
ロメタン(50ml)に溶かした。この混合物を、0℃に冷却し、ジイソプロピ
ルエチルアミン(446g、 34.5帥O1)、続いて(2−シアノエトキシ
)−N、 N−ジイソプロピルアミノクロロホスフィン(3,25g、 13.
8 mmol)を加え、該混合物を室温で、30分間攪拌した。この反応に続き
、溶媒系りでTLCを行った。(8)の完全な消費が観察された。この混合物を
重炭酸す)+Jウム冷飽和溶液(200ml)に注ぎ、C)12C12で抽出し
た。合わせた有機相を蒸発させ、トルエンとともに共蒸発させ、短シリh’fル
カラムクロマトクラVイ(”キサ7/CH*C12/EtJ30:50:20V
/V)で精れた。
収率:5.5 g (86%)、 溶媒系りにおけるR T=0.67 、”P
NMR(CDCl2): 149.41及び149.46゜
ラベル化ユウロピウムキレート化合物をオリゴヌクレオチドに結合させるために
、プローブの5゛末端で、アミノ置換シチジンモノヌクレオチド誘導体(+no
dC化合物8化合物8反
用した。オリゴヌクレオチドにラベルを結合させて修飾したヌクレオチドを含む
残渣を伴う合成を、他のB−シアノエチルアミヂトについて使用された方法と類
似した方法で行い、シチジン誘導体く図IA)を遺伝子アセンブラ−上の開いた
位置に配置した。分離されたオリゴヌクレオチドの純度を、FPLCカラム(P
EP RPC llR515、 Pharmacia LKB Biotech
nology)で、グラジェント溶出(緩衝液A, TEAAloo mM.
MeCN 10%: 緩衝液B. TEAA Ioo mM. MeCN 30
%,勾配二〇〜100%B、50分間,流速1 ml/分)で、調べた。この検
出を、260 n111でモニターすることにより行った。
C.ユウロピウムによるオリゴヌクレオチドS9のラベル化Eu 3 +ーキレ
ート化合物をオリゴヌクレオチドに結合させるために、プローブの5゛末端で、
アミノ置換シチジンモノヌクレオチド誘導体く“修飾C”、”a+odc”)で
の延長を利用した。
オリゴヌクレオチドS9の配列は次のとおりである:S9 5° (aodc)
4. ACCAGAGTCACACAACAGACGGGC 3’なお、この
S9は、前記実施例で詳細に説明したように、合成し、かつ精製したものである
。
このオリゴヌクレオチドS9を、蒸留水500μIに懸濁し、この溶液を、蒸留
水と平衡させたNAP−5カラム(Pharmacia LKB Biotec
hnology)を通した。蒸留水で溶出し、溶出液( 1 ml)を集めた後
、これを蒸留水を用いてNAP−10カラム(Pharmacia LKB B
iotechnology)を通し、溶出液(1.5m1)を集めた。
蒸留水をブランクとし、オリゴヌクレオチドの濃度はくμg/ml)を33XA
(Aは、260 nmにおける記録された吸光度)と計算し、UV分光光度計で
260 nmの光学密度を測定することにより、オリゴヌクレオチドS9の濃度
を測った。
オリゴヌクレオチド(10ナノモル)を、サバント(Savant)高速真空濃
縮装置を使用しt、蒸発させて乾燥物とし、蒸留水50μmに再懸濁した。I
M Na.CD3(はぼ2.5μm ;炭酸ナトリウムの最終濃度は50 mM
)を加えることにより、pHを9.5に調節した。次いで、400倍のモル過剰
のEu”キレート化合物W2O14 (ヨーロッパ特許第88850218.4
(公開番号029839 、出願日1988年6月6日、出願人Kwiatk
owskiら)のスキームの化合物13参照:及び図IBにも示されている。)
を加え、この反応混合物を4℃に一晩保った。
続いて、この反応混合物を、DNA Grade 5ephadex G−50
(Pharmacia LKBBiotechnology)のカラム(50
X 1cm)にかけ、EDTA 50 IIIMを含むpH7、 5の10
mMHEPES緩衝液と平衡にし、かつ溶出した。画分(20 X 1 ml>
を集め、260 nmでモニターした。各両分1mlにデルフィアエンハンスメ
ント(Delfia Enhancea+ent)溶液(米国特許第4. 56
5. 790号. 1986年1月21日発行)1mlと混合し、アークス(A
rcus)蛍光計(Phar+t+acia Wallac)を使用して蛍光を
測定することにより、Euのプロフィールを測定した。最初の主要なピークを有
する両分を集め、回収されたユウロピウム修飾オリゴスクレオチドの量を、UV
分光光度計により測定した。
Eu−ラベル化オリゴヌクレオチドS9を希釈して、P.DTA 50 skl
を含むpH7. 5の10 01M HEPES!i衝液中の濃度5.6μI/
mlとし、0、5mlに等分して一20℃で貯蔵した。
ビオチン分子を核酸に結合させるために、DNAプローブの3′末端の終わりか
ら2番目の位置で、アミノ置換シチジンモノヌクレオチド誘導体(“修飾C”)
の残基を使用した。
修飾Cを含むオリゴヌクレオチドSllの配列は次のとおりである:オリゴヌク
レオチド別1を、標準プロトコールに記載されたポスポルアミシト化学を用いて
遺伝子アセンブラ−上で合成した。
このオリゴヌクレオチドSllを、蒸留水500μlに懸濁し、この溶液を、蒸
留水と平衡させたNAP−5カラムに通した。続いて、このカラムを蒸留水で溶
出し、溶出液(1m1)を集めた。集めた溶出液を、同様の方法で、蒸留水を用
いてIIAP−10カラムを通した。蒸留水をブランクとし、UV分光光度計で
260 nmの光学密度を測定することにより、溶離液の濃度を測った。オリゴ
ヌクレオチドの濃度を、μ);7m I + 33 X、260 nmにおける
吸光度の関係を用いて計算した。
次に、この試料を、エツベンドルフ管に移し、サバント高速真空濃縮装置を用い
て、乾怪物にした。蒸留水50μlで再懸濁した後、IM NazCO−(はぼ
2.5μI;炭酸ナトリウムの最終濃度は50 mM>を加えることにより、P
I(を9.5に調節した。適当な量(2〜5 I+!g)のビオチンアミドカプ
ロエートN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(Sigma、分子量454)
を、乾慢N、11−ジメチルポルムアミド(DMF)100μlに溶かした。4
0倍のモル過剰の活性ビオチンアミドカプロニー)N−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステルのDMF溶液を、修飾CオリゴヌクレオチドSll溶液と混合し、室
温で3時間おいた。
この反応生成物を、蒸留水で希釈して500μlとし、EDTA 50 mMを
含むpH7,5の10 mM HEPES緩衝液と平衡にし、NAP−5カラム
をとおした。このカラムを同じ緩衝液で溶出し、この溶出液(1ml)を集め、
同様な方法でEDTA 50μ閘を含むpH7,5の10 mM HEPES緩
衝液を使用して、再びカラム(NAP−10,Pharmacia LKB B
iotechno Iogy)をとおした。最終的な溶出液の容量は1.5a+
lであった。
b、BSAのビオチン化
生血fiフルフミ7 (BSA、 Sig+na A−7906,分子量67、
000 ) 10 mg ヲ、50 mMNa2CO3(pH9,5)溶液1m
lに溶かした。分離容器において、ビオチンアミドカプロエートN−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル(Sig+na、分子量454)を、乾燥N、N−ジメ
チルホルムアミド(DMP) 200μlに溶かした。
50倍モル過剰の活性ビオチンエステルを該BSAに加え、反応を室温で3゛時
間行った。続いて、この反応混合物に、NaCl0,9%及びアジ化ナトリウム
0.5%を含む10 mM tlEPEs緩衝液(pfl 7.5 )を加えて
2.5@Iに希釈し、同じ緩衝液で平衡にし、Pト10カラム(Pharmac
ia LKB Biotechnology)をとおした。この工程を、それぞ
れの操作毎にもとの溶出液の半分を用いて、新しく調製したPD−,10カラム
でビオチン化BSAを再度クロマトグラフィー処理することにより繰り返した。
精製された生成物を、使用するまで+4℃で貯蔵した。
5、ストレブトアビジマイクロタイトレーションの調製ナンク(Nunc)高結
合性プレートを、NaC10,9%及びアジ化ナトリウム0.05%を含む50
mM K28PO4緩衝液(pH9,0)で、100 ng/mlに希釈した
ビオチン化B5A200μl/ウエルで被覆する。次に、このプレートを6回洗
浄しくブレート洗浄器及び洗浄溶液(Dilfia、 Phar+nacia
wallac)) 、アッセイ緩衝液(口11fia。
Pharmacia wallac)で2μl/mlに希釈されたストレブトア
ビジ(BRIl、 Bethesda。
MO>の溶液(ウェル当たり200μl)を加え、そのプレートを室温で3時間
インキュベートし、最後に、使用する前に6回洗浄した。
フィコール−ハイバク5ml (Pharmacia LKB Biotech
nology) 5@Iを、15 ml遠心分離管に入ね、抗凝固処理した血液
(5ml)を、このフィコール−ハイバクの上部に注意深く乗せ、250Orp
mで、20分間、卓上型遠心分離器で遠心分離した。
血漿を除き、リンパ球の帯をパスツールピペットで集めた。このリンパ球を、1
xssc (塩化ナトリウム0.15 Mを含む0.015Mクエン酸ナトリウ
ム緩衝液(pH7,5>10m1に入汰計数した。次に、この細胞を1500
rp@で5分間遠心分離することにより集め、I X5SC1容量で再懸濁し、
最終濃度を細胞106個/slとした。
臨床試料を、溶解工程(実施例7)を行うまで、この濃度で凍結して、維持した
。
COS 10−11.1細胞を使用して、定量的な測定を行うために、健康な提
供者のフィコール精製細胞の解凍懸濁液でこれらの細胞の希釈液を調製した。こ
の調製は、細胞を混合し、エッペンドルフ遠心分離器で遠心分離し、得られたペ
レットを、溶解工程(実施例7)で使用できるように1000.000個/II
IIの濃度に懸濁した。
b、常磁性ビーズ分離
旧V−陰性提供者からの血液1mlに、実施例1に記載された方法と類似する方
法で調製した11937 ミエローマ細胞から誘導し、かつ細胞1個当たり切形
(truncated)プロウィルス旧v−DNAを1ゲノム含む細胞を色々な
数(0,50及び500)で含むリン酸緩衝食塩水1mlに混合した。
適切なコントロールを行うことにより、■937から誘導された細胞を除く全て
の成分を含む管を準備した。混合後、ヒ)CD4レセプターと共有結合した抗体
を含む商業的に入手できるダイナビーズ(Dynabeads、製品番号111
06)を、20倍の過剰(100μl 91%液)で容管に入れ、振盪しながら
30分間インキュベートした。
このビーズを磁石を用いて分離し、最終的に、溶解工程(実施例7参照)に用い
るために、l xSSC0,5mlに懸濁した。
7、溶解工程
細胞斐濁液(総細胞数250.000個)を等量(250μm)ずつ、滅菌した
0、5a+1エツペンドルフ管に入t’L、4.000 rpmで2分間、エッ
ペンドルフ遠心器で遠心分離した。上清を除いた後、蒸留水30μm及び関連す
るプライマ一対(10mkl)IJス HCI ffE衝液(pH7,7)に入
れたもの)の混合物を加え、細胞ペレットを再懸濁した。
)11V−−プロウィルスDNAの存在を確認するため細胞を分析する場合、H
IVのLTR部位とハイブリッド化し、その部位の一部の合成を開始することが
できる、下記プライマーを使用する:
5’ GGAM:CCACTGCTTAAGCC3’ (Sl)及び5’ GG
TCTGAGGGAT(:T[TAG 3’ (S2)次にその細胞を、121
℃で10分間(若干の研究では20分間)、オートクレーブ処理し、実施例8に
従って増幅する。
8増幅工程
この増幅を伴う工程は、試料の交差的な汚染を避けるために、二次的なハイブリ
ッド形成工程用に設計された所から分離された領域で行った。
PCRを介す増幅工程の前に、PCRマスター(Master)混合物を、下記
のように調製した。1@Iにつき、720 ul (2x)の増幅緩衝液(20
sMトリスー11CI、p)18.4 成分NaC] 100 ff1M、 M
gC]、 5 mM、ゼラチン0.4 a+g/ml及び400 dNTP(P
harmacia LKB Biotechnology))400 μM及び
140 μl TAQボリメラーセ(10mトリス−HCl、 pH7,4:成
分KCI 300酬、 DDT 2威1!DTA 100μM、ゼラチン200
μg/m !及びグリセロール50%)を含む。この混合物を、使用するまで氷
の上に置いた。
新しく再懸濁したリンパ球をオートクレブで処理し、次に実施例7に記載したよ
うに氷の上で冷却した。その後、この消化物をエッペンドルフ遠心分離器で簡単
に遠心分離しペレット濃縮水とした。PCRマスター混合物70μlを、容管に
加え、次いで軽質鉱油(Sigma、 M−3516)100μlを加えた。そ
の管にキャップをして、よく混合し、エッペンドルフ装置で再び遠心分離した。
次に、この管をサーモサイクラ−(Perkin−Elmer Cetus)に
移した。この装置には、次の熱サイクルがプログラムされていた:95℃50秒
;55℃2分間;73℃2分間である。これを30サイクル実施した。各ウェル
に鉱油を1滴加えることにより、効果的な熱移動が達成された。
サイクル終了後、試料をサーモサイクラ−から取り出し、ABC分析を行うため
に分離ゾーンに移動した。分離ゾーンに移すまで、管を開けないように注意した
。
9、ハイブリッド形成及び検出
ハイブリッド形成をする前に、溶液を次のように混合した。
ノゾブリッド形成溶液1ml当たり、500μlの2×ハイブリツド形成緩衝液
ストツク(NaCI 1. I M、 EDTA 2204M及U′rween
−200,1%を含む110 mM HEP[ES緩衝液)、蒸留水480μl
、ビオチンイ13SA(5,6μg/m1)10 μlを加えた。
増幅生成物lOμIを、0.5@Iエツペンドルフ管に移した。この移動された
溶液を、95℃で8分間加熱し、氷上で2分間冷却し、(エッペンドルフ遠心分
離器を使用して)遠心分離した。次に、ハイブリッド形成溶液90μlを加え、
混合し、遠心分離した。この混合物をインキュベーター内に、55℃で1時間維
持した。続いて、ハイブリッド形成反応混合物(100μl)を、実施例5で調
製したストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートのウェルに移した。溶
液(アッセイ緩衝液、Delfia Phanoacia Wallac、最終
的なNaCl濃度が1モル/リットルとなるように塩化ナトリウムを供給する。
)100μlを、各ウェルに加え、そのプレートを振盪しながら、室温で1時間
インキュベートした(プレート振盪、PharmaciaWallac)。次い
で、このプレートを洗浄溶液(前記部分参照)を使用し、プレート洗浄器で6回
洗浄した。最後の洗浄溶液を除去した後、各ウェルにエンハンスメント溶液(D
elfia、 Pharmacia 1lallac、 cat、 No、12
44−105) 200 μm加えた。
このデルフィアエンハンス溶液及びその使用については、米国特許第4.565
.790号(1986年1月218発行)に開示されている。簡単に述べると、
2−ナフトイルトリフルオロアセトン(2−NTA) 15μ閣、トリオクチル
ホスフィンオキシト(TOPO)50μm及びトリトン(Triton)X−4
000,1%を含み、フタル酸カリウム水素塩を用いて、pH3,2に調整した
0、1M酢酸緩衝液を含む溶液200μlを加えることにより、ユウロピウムを
放出させ、ラベルの蛍光性を増加させた。このマイクロタイタープレートを、再
び室温で25分間振盪し、次いで、γルクスTR−蛍光計(Pharmacia
Wallac)を使用して蛍光を測定し、時間−解像蛍光を測った。遅延時間
50マイクロ秒と計測時間250マイクロ秒を伴う1秒間の総測定時間で、キセ
ノンフラッシュランプ(100OHz)を使用するシグナル光計数時間解像蛍光
計により、様々な表示時間に蛍光を測定した。この時間解像蛍光計及び関連する
機器を用いる方法は、米国特許第4.058.732号に開示されているもので
あって、試料を短時間のレーザーパルスで励起させ、ノイズ源からの蛍光を遮断
した場合のみに、蛍光を測定するものである。
表2は、フィコール−ハイバク分離(実施例6A)及び実施例7に記載された加
熱処理を組み合わせた場合に得られる標準曲線を示す。この加熱処理は、健康な
供給者から分離されたリンパ球250.000個をバックグラウンドとして希釈
した一連のCO510−11,1細胞について、オートクレーブ処理を10分間
行うことにより、実施した。しかし、この場合、試料をプライマーS、及びS、
(表1)を用いて、PCR増幅を行い、旧Vの特定の核酸を、ABCサンドイッ
チ分析法(実施例9)において、ユウロピウムラベル化59及びビオチン化31
1を使用して検出した。
表2
表2のデータは、この分析法が、1000.000個のバックグラウンドから僅
か5個の細胞にあるHIVを検出するのに十分な程の感度であり、バックグラウ
ンド細胞1000、000個当たり、10−11.I COS細胞5個〜40個
の範囲でほぼ直線的な値を示すことを示している。各データは、3回の独立した
分析の平均値である。細胞を115℃で30分間加熱した場合、同じような結果
が得られた。
表3は、プロウィルスDNAを含む各種濃度のCOS 10−11.1細胞を最
初にヒト血液試料に加え、磁性ビーズ(実施例6B)に共有結合している抗CD
4抗体と反応する表面結合CD4レセプターを介して、分離した場合に得られた
データを示す。
表3
試料 血液に加え、次いで、 加熱処理、PCR1S04細胞を分離した AB
C後のCPSプロウィルスHIV−DNA
を含む■937細胞
実際の臨床試料について本発明の有用性をさらに試験するために、約106個の
細胞を含むリンパ球試料8検体を、IIIV(に感染したそれぞれの人から得た
。これらの試料を、牛胎児血清40%及びDMSOIO%を含む培地中で凍結さ
せ、細胞250゜00個ずつに分割した。PCRを行う前に、82030μIに
再懸濁し、遠心分離(3000rpm、 5分間)してベレット化した。)II
V−1感染者から得たリンパ球試料(試験あたり250.000個)を、実施例
10に記載されたPCHに基づ< ABCハイブリッド形成分析法で複製するこ
とにより試験した。血清が陰性の健康者3人から得た細胞を陰性コントロールと
して使用した。陰性の3検体の平均値から得た二重平均シグナル(5757CP
S)を、この分析の陽性を区別する基準とした。表4は、旧ソ−1感染患者から
得た試料が、この分析において全て強い陽性シグナルを出し、最も低い陽性のシ
グナルが陰性コントロールの6倍以上であることを示している。
表4
臨床試料からのHIV、−1核酸の検出シグナル 平均シグナル
患者# 感染/非感染 (CPS) (CPS) +/−1非感染 5761
2 〃 7759
3 〃 5644
4 感染 81520
78366 80039 +
5 〃 99960
106365 103163 +
6 〃 81520
72400 76960 +
7 ” 93390
166483 129937 +
8 〃 57203
94610 75906 +
9 〃 47054
29227 38140 +
10 〃 204141
210630 207385 +
11 〃 169208
170787 169997 +
同様に、旧V陽性提供者から得た臨床サンプルの一部から、フィコール−ハイバ
ク遠心分離法に従って、細胞を分離し、本発明の方法に従った前処理として、オ
ートクレーブ処理を10分間行った。表5は、陽性を示す全ての試料を明らかに
する、この分析の結果を示すものである(この分析における陰性コントロールは
、5841CPSである。)
陰性コントロール:5841CPS
シグナル 平均シグナル
患者# 感染/非感染 (CPS) (CPS) +/−1感染 111047
164694 137871 +
2 〃 150520
196732 173.626 +
3 ” 274978
177572 226275 +
4 〃 330301
369231 349766 +
5 ” 192594
55667 97256 +
6ノ’105843
88670 97256 +
7 〃 213411
218090 215750 +
8 〃 225451
292718 259084 +
9 ” 119131
127404 123267 +
10 ” 119311
110950 115131 +
11 〃 277111
292253 284682 +
12 〃 130688
194879162784 十
13 ” 289051
238579263815 十
14 〃 216327
25611? 236222 十
15 〃 124181
116829120505 +
16 〃 79010
9976489387 十
17 ” 86005−
70350 78177 +
HTLV−I+ ウィルスを、5゛及び3゛のPCRプライマーとして表1のオ
リゴヌクレオチドP1及びP2、ビオチン化プローブP3、ユウロピウムラベル
化P4 (表1)を用い、実施例7の加熱前処理法を使用して、細胞(AT(:
C零CRL8066)において特異的に検出した。要約すると、細胞を所定の溶
液に入れる前に、細胞(水中に細胞25o、 ooo個)を加熱処理し、遠心分
離した。この溶液には、10mM1−IJス−HCl pH8,4(成分MgC
Iz 2.5 mM、 dNTP’ s 200 mM、ゼラチン0.2 mg
/ml、 NaCl 50 mM)及びPCRプライy−pl及びP2 (表1
)各0.5μMならびにTAロポリメラーゼ1単位(Perki−Elmer
Cetus、 Norwalk、 CT)が含まれ、総容量は100μlであっ
た。
95℃50秒、63℃2分間、73℃2分間のサイクルを27サイクル実施する
プログラムを用いて、サーモサイクラ−(Perkin−Elmer (:et
us)を稼働させた。
ビオチン化プローブP3及びユウロピウムラベル化プローブP4 (表1)を用
いて、11TI、V−11ウィルスを検出した他は、前記工程で調製した総PC
R混合物の10%を、八8[ザンドイッチハイブリッド形成(実施例9)におい
て分析した。
へBCサンドイッチハイブリッド形成と組合わせた加熱前処理は、表6Aに示す
ように通常のリンパ球200.000個を含む試料の感染細胞数が極めて少なく
とも検出を可能にする。
表6A
HTLV−II検出アッセイ
1.2 6.884
24 11.121
48 25.715
72 38.176
96 48.855
144 78.387
192 100.807
1)表示された感染細胞数を、通常のリンパ球200.000個と混合した。
2)前記のとおり時間−解像蛍光計により測定した結果、200.000個の通
常リンパ球により、1分間あたり377の計測数が得られた。表示したUPSは
、バックグラウンド値を引いた後の3試料の平均である。
b、HTLV−1ノ検出
HTLV−I ウィルスを、5゛及び3“のPCRプライマーとして表1のオリ
ゴヌクレオチドP5及びP6、ビオチン化プローブP7及びユウロピウムラベル
化P8 (表1)を用い特異的に検出j−た。
要約すると、細胞試料を溶液に入れる前に、細胞(水中に細胞250.000個
)を加熱処理し、遠心分離した。この溶液には、10mM)IJス−)1[:I
pH8,4(成分Mgc122.5 mM、 dNTP’s 200 ttM
、ゼラチン0.2 mg/ml、 Na1l 50 d)及びPCRプライ7
−P5及びP6 (表1)各0.5u−ならびにTAロポリメラーゼ(Perk
i−ElmerCetus、 Norwalk、 CT) 1単位が含まわへ総
容量は100μlであった。反応混合物を含む管を、95℃50秒、60℃2分
間、73℃2分間のサイクルを30サイクル実施するプログラムを用いて、サー
モサイクラ−(Perkin−Elmer Cetus>でインキュベートした
。
ビオチン化プローブP7及びユウロピウムラベル化プローブP8 (表1)を用
いて、HTLV−1ウィルスを検出した他は、前記工程で生成したPCR混合物
の10%を、ABCサンドイッチハイブリッド形成(実施例9)で分析した。
ABCサントイツナハイブリッド形成と組合わせた加熱前処理は、表6Bに示す
ようにリンパ球の試料において感染細胞数が極めて少なくとも検出を可能にする
。
表6B
HTLV−1臨床試料
試料 IA 11.506
試料 2A 17,507
試料 3A 35,123
試料 4A 288,950
試料 5A(非感染) 1. 240
サケ***DNA 946
10HTLV−It 感染細胞 1,175HVT 102 (ATCC#T
I B 162)の10−100 細胞 60,000
1)前記のとおり時間−解像蛍光計により測定された1分間あたりの計測数。
c、HIV−2の検出
)11V−2ウイルスを、5゛及び3′のPCRプライマーとして表1のオリゴ
ヌクレオチドP9及びPlo、ビオチン化プローブpH及びユウロピウムラベル
化P12(表1)を用い、旧V−2感染MoLT−4細胞(ATCC葬CRL1
582)から分離したDNAにおいて特異的に検出した。要約すると、DNAを
細胞から分離し、実施例7の加熱前処理法を使用して、表示された細胞と同じ量
に希釈した。このDNAを所定の溶液と混合した。この溶液には、10−トリス
−HCl pH8,4Clet分MgCl22.5 mM。
dNTP’ s 200 、ljM 、ゼラチン0.2 mg/m1. NaC
l 50 mM>及びPCRCラブ7−PL及びP2 (表1)各0.5uMな
らびにTAQポリメラーゼ(Perki−Elmer Cetus、 Norw
alk、 CT) 1単位が含まt′L、総容量は100μmであった。反応混
合物を含む管を、95℃50秒、65℃2分間、73℃2分間のサイクルを30
サイクル実施するプログラムを用いて、サーモサイクラ−(Perkin−El
mer (:etus)でインキュベートした。
ビオチン化プローブpH及びユウロピウムラベル化プローブP12(表1)を用
いて、旧シー2ウィルスを検出した他は、前記工程で生成した総PCR混合物の
10%を、ABCサンドイッチハイブリッド形成(実施例9)で分析した。
ABCハイブリッド形成と組合わせた加熱前処理は、表6Cに示すようにDNA
が極めて少なくとも検出を可能にする。分析を行う前に、HIV−2感染MoL
T−4細胞から分離されたDNAを、酵素生産者の指示書に従って制限エンドヌ
クレアーゼEco R1で消化した。
表60
(Cell Equivalent)
1 10.425
5 38.969
10 53.413
25 94.093
50 164.810
100 243.532
250 302.904
g Harbor、 NY (1982))に記載されているフェノール抽出を
使用して、HIV−2感染MoLT−4細胞(ATCC霧CRL1582)から
分離したDNAの細胞当量(2)前記のとおり時間−解像蛍光計により測定され
た1分間あたりの計測数。
c、HIV−1の検出
HIV−1ウイルスを、5′及び3゛のPCRプライマーとして表1のPCRプ
ローブP13及びPL4 、ビオチン化プローブP15及び17ならびにユウロ
ピウムラベル化P16及びPI3(表1)を用い、CO310−11細胞におい
て特異的に検出した。要約すると、DNAを細胞から分離し、実施例7の加熱前
処理法を使用して、表示された細胞当量と同じ量に希釈した。このDNAを所定
の溶液と混合した。この溶液には、10mM)リス−HCl p)I 8.4
(d分MgCl22.5 mM、 dNTP’ s 200.14M 、ゼラチ
ン0.2 m3/m!、 NaC150mM)及びPCRプライマーP13及び
PL4(表1)各0.5μMならびにTAQポリメラーゼ(Perki−Elm
er Cetus、 Norwalk、 CT) 1単位が含まれ、総容量は1
00μmであった。反応混合物を含む管を、95℃50秒、65℃2分間、73
℃2分間のサイクルを30サイクル実施するプログラムを用いて、サーモサイク
ラ−(Perkin−Elmer Cetus)でインキュベートした。
ビオチン化プローブP16及びPI3(表1)を用いて、十及び−PCR増幅鎮
増幅量した他は、前記工程で生成したmPcR混合物の10%を、実施例9に従
ったABCサンドインチハイブリッド形成で分析した。
ABCハイブリッド形成と組合わせた加熱前処理は、表60に示すように各試料
におけるバックグラウンドとして非感染リンパ球250.000個の間にある極
めて数が少ない細胞の検出を可能にした。
(1)非感染リンパ球250.000個を含むサンプルに存在する感染COS
10−11細胞の数。
(2)時間−解像蛍光計により測定された1分間あたりの計測数の試料3検体の
平均値。
13、細胞溶解の温度効果
特定のゲノムDNA配列を検出する能力にあける温度前処理の効果を更に試験す
るために、分離された細胞を115℃で10分間前処理し、実施例10に記載し
た方法を使用して100℃で10分間行った前処理と比較した。この研究の結果
(そのデータを表7に一般的に示した。)によると、100 ℃で前処理を行う
と、平均バックグラウンドを越えるシグナルの発生は無かったが、115℃で前
処理を行うと平均バックグラウンドを越えるシグナルが発生した。したがって、
細胞を115℃で前処理するさ分析法の感度を十分に増加させ、これにより試料
で検出できる特定のゲノムDNA配列の量を低下させることができる。
表7
予備処理の温度の効果9
1 6562’ 39265
’ 3 3711 37823
平均 5909 22560
平均のバック
グラウンド値 8115
78ヱA
1、HIV−1陰性リンパ球のバックグランドで希釈した)IIV−I IIi
性コントロール細胞([:0SIO−11,1細胞) (比率ClXl0’)2
、前記のとおり時間−解像蛍光計により測定された1分間あたりの計測数(CP
M)。
1を血清タンパク質にょるPCR分析法による検出の阻害細胞の特定の核酸配列
を検出する能力に対する血清タンパク質の効果について試験を行った。ヒトリン
パ球250.000個のバックグランドに混合したCOS 10−11.1細胞
50個を含むように、細胞外(血清)タンパク質を実買的に含まない細胞試料を
調製した。異なる量(10μm又は35μりの血清を、幾つかの試料で水と置き
換え、表8に示すようにそれぞれ細胞外血清タンパク質を約29%(V/V)及
び100%(V/V)を含むPCR反応混合物を調製した。実施例1oに記載さ
れているように緩衝液、dNTP、プライマー及びポリメラーゼを加えた後、こ
の試料を115℃で30分間加熱することにより前処理した。オイルを被せ、P
CRを30サイクル行った。表8に示すようにこの研究の結果は、血清タンパク
質の存在が、PCR分析法において陰性コントロール(バックグラウンド)の値
にさえ達成することを阻害する。同じ結果が、血清に代えて血漿を使用しても得
られた。
29%ν/V血清 100%ν/V血清 実質的に#1 #2 #1 #2 含
有せず
667 744 337 4480 47.151438 503 419 6
63 29.285491 603 486 553 33.074532 6
17 414 1889 36.503陰性細胞
1、実施例9に記載された時間−解像蛍光計により測定された1分間あたりの計
測数。
これまでの記載及び実施例は、説明を意図するものであって、制限を行うもので
はない。本発明の思想及び範囲における他の変形が、さらに可能であり、当業者
にとってこのことは容易に明らかになることである。
国際調査報告
Claims (43)
- 1.血液試料に含まれている特定の核酸配列を検出する方法であって、含有する 細胞外タンパク質が80mg/ml未満の水性培地に、ゲノムDNAを有する細 胞を分離する工程、及びこの細胞を少なくとも約105℃の温度に、少なくとも 約5分間さらす工程を含む方法。
- 2.血液試料から細胞を分離する手段として密度勾配遠心分離法を使用する請求 の範囲第1項記載の方法。
- 3.血液試料から細胞を分離する手段として、固体の支持体に付着させた、該細 胞に結合する抗体を使用する請求の範囲第1項記載の方法。
- 4.固体の支持体が、常磁性体である請求の範囲第3項記載の方法。
- 5.固体の支持体がビーズの形態である請求の範囲第3項記載の方法。
- 6.固体の支持体がビーズの形態である請求の範囲第4項記載の方法。
- 7.加熱処理時間が、5〜20分間である請求の範囲第1項記載の方法。
- 8.抗体が、CD4細胞表面レセプターと特異的に反応するものである請求の範 囲第3項記載の方法。
- 9.抗体が、CD8細胞表面レセプターと特異的に反応するものである請求の範 囲第3項記載の方法。
- 10.抗体が、CD2細胞表面レセプターと特異的に反応するものである請求の 範囲第3項記載の方法。
- 11.抗体が、CD3細胞表面レセプターと特異的に反応するものである請求の 範囲第3項記載の方法。
- 12.分離された細胞の加熱処理を、105℃〜125℃の範囲の温度で、少な くとも約10分間行い、これにより加熱処理試料を形成する請求の範囲第1項〜 第11項のいずれか1項記載の方法。
- 13.加熱処理試料の一部に、特定の核酸配列の相補体の合成開始を可能にする 第1ポリヌクレオチド合成プライマー、及び該特定の核酸配列の合成開始を可能 にする第2ポリヌクレオチド合成プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応を 少なくとも1回行う、請求の範囲第12項記載の方法。
- 14.ハイブリッド化条件下で、ポリメラーゼ連鎖反応生成物を、親和性ラベル 化ポリヌクレオチドプローブ及びリポーター基ラベル化ポリヌクレオチドプロー ブ(それぞれのプローブは、ポリメラーゼ連鎖反応生成物の一本鎖DNAの異な る異なる部位とハイブリッド化して、親和性ラベル及びリポーター基との結合を 有するDNA二本鎖を形成することができる。)で処理し、このDNA二本鎖を 、結合条件下で、DNA二本鎖の親和性ラベルと結合できる固相親和性吸着剤で 処理し、次いで、固相リポーター基ラベル化DNA二本鎖を形成し、かつこの固 相リポーター基ラベル化DNA二本鎖の量を測定する、請求の範囲第13項記載 の方法。
- 15.前記親和性ラベルが、ピオチンである請求の範囲第14項記載の方法。
- 16.前記親和性ラベルが、固相抗ジニトロフェニル抗体と結合するジニトロフ ェニル化核酸である請求の範囲第14項記載の方法。
- 17.前記リポーター基が、酵素である請求の範囲第14項記載の方法。
- 18.前記リポーター基が、放射活性アイソトープである請求の範囲第14項記 載の方法。
- 19.放射活性アイソトープが、32P、35S及び125Iからなる群より選 ばれる請求の範囲第18項記載の方法。
- 20.リポーター基が、蛍光性ラベルである請求の範囲第14項記載の方法。
- 21.蛍光性ラベルが、ランタン系列元素である請求の範囲第20項記載の方法 。
- 22.ランタン系列元素がユウロピウムである請求の範囲第21項記載の方法。
- 23.リポーター基が、アクリジニウムエステルである請求の範囲第14項記載 の方法。
- 24.特定の核酸配列が、病原体の特定の核酸配列である請求の範囲第13項記 載の方法。
- 25.病原体の特定の核酸配列が、ヒトレトロウィルス病原体に対応する配列で ある請求の範囲第24項記載の方法。
- 26.プライマー及びプローブが、血液ボーン(borne)病原菌に対し、特 異的である請求の範囲第13項記載の方法。
- 27.プライマー及びプローブが、ヒト免疫不全ウィルスに対し、特異的である 請求の範囲第13項記載の方法。
- 28.プライマー及びプローブが、ヒトリンパ球(lymphotorpic) ウィルスタイプIに対し、特異的である請求の範囲第13項記載の方法。
- 29.第1ポリヌクレオチドプライマーが、下記式に対応するヌクレオチド配列 を有し: TGCAGCTGGCCCATATCCTGC第2ポリヌクレオチドプライマー が、下記式に対応するヌクレオチド配列を有する: TAGGGAAGCCATTGTGGCCTC請求の範囲第28項記載の方法。
- 30.プライマー及びプローブが、ヒトリンパ球(lymphotorpic) ウィルスタイプIIに対し、特異的である請求の範囲第13項記載の方法。
- 31.前記ポリヌクレオチドプライマーが、下記式に対応するヌクレオチド配列 を有し: CAACAATTAGCAGCCGTCCTC第2ポリヌクレオチドプライマー が、下記式に対応するヌクレオチド配列を有する: AGTGCCTGGAGGGTTAGCTG請求の範囲第30項記載の方法。
- 32.前記特定の核酸配列が、HIV−2特異性であり、第1ポリヌクレオチド プライマーが、下記式に対応するヌクレオチド配列を有し:CCACGCTTG CTTGCTTAAAGACCTC第2ポリヌクレオチドプライマーが、下記式 に対応するヌクレオチド配列を有する: ATTTTCCTGCCTCGGTTTCCCAAAG請求の範囲第13項記載 の方法。
- 33.前記特定の核酸配列が、HIV−1特異性であり、第1ポリヌクレオチド プライマーが、下記式に対応するヌクレオチド配列を有し:CTTAAGACA GCAGTACAAATG第2ポリヌクレオチドプライマーが、下記式に対応す るヌクレオチド配列を有する: TGTCCCTGTAATAAACCCG請求の範囲第13項記載の方法。
- 34.前記特定の核酸配列が、HIV−1特異性であり、第1ポリヌクレオチド プライマーが、下記式に対応するヌクレオチド配列を有し:GGAACCCAC TGCTTAAGCC第2ポリヌクレオチドプライマーが、下記式に対応するヌ クレオチド配列を有する: GGTCTGAGGGATCTCTAG請求の範囲第13項記載の方法。
- 35.水性培地のpH値が、6.0〜8.5の範囲である請求の範囲第13項記 載の方法。
- 36.細胞からゲノムDNAを放出させる方法であって、含有する細胞外タンパ ク質が80mg/ml未満の水性培地に、ゲノムDNAを有する細胞を分離する 工程、及びこの分離細胞を少なくとも約105℃の温度に、少なくとも5分間さ らす工程を含む方法。
- 37.水性培地に含まれる細胞外タンパク質が40mg/ml未満である請求の 範囲第36項記載の方法。
- 38.細胞からゲノムDNAを放出させる方法であって、(a)ヘモグロビン及 び赤血球を実質的に含まず、含有する細胞外タンパク質が80mg/ml未満で ある水性培地に、ゲノムDNAを有する細胞を分離する工程;及び(b)この分 離した細胞を、少なくとも105℃の温度で、少なくとも5分間、大気圧を越え る蒸気圧にさらす工程を含む方法。
- 39.温度が110〜125℃の範囲であり、加熱処理時間が15〜30分間で ある請求の範囲第38項記載の方法。
- 40.複製機能不全ヒト免疫不全ウィルスゲノムに機能的に結合したDNAトラ ンスファーベクターを含む組換えDNA分子。
- 41.前記ゲノムが、gag−部位遺伝子を発現できないものである請求の範囲 第40項記載の組換えDNA分子。
- 42.前記ゲノムが、ゲノムからmRNAを生じさせるスプライスドナーシグナ ルを含まない、請求の範囲第40項記載の組換えDNA分子。
- 43.請求の範囲第40項記載の単一組換えDNA分子を、そのゲノムに組込ん だ細胞。
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